NO347263B1

NO347263B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av en Faktor IX formulering for intravenøs injeksjon

Info

Publication number: NO347263B1
Application number: NO20082180A
Authority: NO
Inventors: Chandra A Webb; Julie Zerfas
Original assignee: Wyeth Llc
Priority date: 2005-11-01
Filing date: 2006-10-27
Publication date: 2023-08-14
Also published as: UA97234C2; PE20151284A1; ES2627684T3; LUC00035I2; AU2006308921B2; DK1942868T3; EP3225233A1; NZ567685A; US20200138952A1; RU2432157C2; NO20082180A; CN101351190A; US20070135343A1; FR20C1005I1; CR9958A; IL190843A0; HK1245090B; LUC00035I1; MY184364A; DK1942868T5

Description

[0001] Foreliggende oppfinnelse angår fremstilling av en Faktor IX formulering for intravenøs injeksjon.

[0002] Når helblod blandes med en medikamentløsning, så som i den intravenøse (IV) linje under administrering av et IV-injiserbart medikament, kan det finne sted "myntrulldannelse" eller erytrocyttaggregering (også betegnet agglutinasjon av røde blodceller) hvis medikamentløsningen ikke inneholder tilstrekkelig ionestyrke. Erytrocyttaggregering finner sted for eksempel med 5% dekstrose i vann (en vanlig storvolum-parenteralløsning) og med mange farmasøytiske produkter med lav ionestyrke.

[0003] Farmasøytiske produkter er ofte lyofiliserte, og det er derfor nødvendig å rekondisjonere disse med en løsning før parenteral injeksjon. Når imidlertid lyofiliserte produkter rekondisjoneres med løsninger med lav ionestyrke, kan det resulterende preparatet også forårsake erytrocyttaggregering. Selv om rekondisjonering av lyofiliserte kaker med normal saltløsning (0,9% NaCl), i motsetning til sterilt vann for injeksjon (sWFI), vil gi ytterligere ionestyrke, kan den resulterende medikamentløsning være hypertonisk og kan ha uønskede bivirkninger ved injeksjon.

[0004] I WO 2005/058283 A2 beskrives en metode for å fremstille farmasøytiske formuleringer for intravenøs injeksjon, hvor fremgangsmåten omfatter tilsetning av 50 mM natriumkloridløsning (2,92 mg /ml) til lyofiliserte formuleringer omfattende rekombinant faktor Vila, glycylglycin, polysorbat 20, sukrose og histidin. Van Den Berg et Al, Blood vol.96, nr.11 Del 1 angår agglutinasjon av røde blodlegemer indusert av BeneFix™. WO2005089712 angår lyofiliseringsmetode for å forbedre eksipientkrystallisering.

[0005] Således er det fortsatt behov for en løsning som kan anvendes til rekondisjonering av lyofiliserte kaker eller til fortynning av farmasøytiske løsninger under tilveiebringelse av et resulterende preparat for injeksjon som er isotonisk med hensyn til plasma, og har tilstrekkelig ionestyrke til at det ikke forårsaker erytrocyttaggregering.

[0006] Oppfinnelsen tilveiebringer den oppdagelse at erytrocyttagglutinasjon forårsakes av løsninger med lav ionestyrke som kommer i kontakt med blod. Når således farmasøytiske formuleringer fremstilles for intravenøs injeksjon ved rekondisjonering eller fortynning i løsninger med lav ionestyrke, så som 5% dekstrose, 3% dekstran eller sWFI, kan de resulterende preparater ha den nødvendige osmolaritet til at de er omtrent isotoniske i forhold til blod, men de har ofte ikke en ionestyrke tilstrekkelig til å forhindre agglutinasjon. Når, på den annen side, farmasøytiske formuleringer fremstilles for intravenøs injeksjon ved rekondisjonering eller fortynning med løsninger med høy ionestyrke så som saltløsning (0,9% NaCl eller 154 mM NaCl), kan det resulterende preparatet ha en tilstrekkelig ionestyrke til å forhindre agglutinasjon, men det kan ha en osmolaritet som er hypertonisk i forhold til blod, hvorved det forårsakes dehydratisering av røde blodceller (RBC), venøs inflammasjon og/eller eventuelt tromboflebitt hvis gjentatte injeksjoner er hyppige eller kroniske.

[0007] Oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for fremstilling av en Faktor IX formulering for intravenøs injeksjon, som angitt i krav 1, fremgangsmåten omfatter tilsetning av en 36 mM til 44 mM natriumklorid-løsning til en lyofilisert Faktor IX formulering, noe som resulterer i en formulering fremstilt for intravenøs injeksjon, hvori den lyofiliserte formuleringen, hvis rekonstituert i vann, inneholder ikke mer enn 5 mM av et ioniserende salt, og hvor den fremstilte formulering er omtrent isotonisk i forhold til plasma, og har en osmolaritet som er fra 270 mOsm/L til 330 mOsm/L, eller er svakt hypotonisk hypotonisk med hensyn til plasma og har en osmolaritet som er fra 220 mOsm/L til 270 mOsm/L, eller svakt hypertonisk i forhold til plasma, og har en osmolaritet som er fra 330 mOsm/L til 600 mOsm/L og, hvor den fremstilte formulering har en tilstrekkelig ionestyrke til å forhindre erytrocyttagglutinasjon etter intravenøs injeksjon.

Ytterligere fordelaktige trekk ved den foreliggende oppfinnelse vil fremkomme av de tilhørende uselvstendige kravene. Trekk som ikke er omfattet av kravene er ikke en del av foreliggende oppfinnelse.

[0008] Den fremstilte formulering er omtrent isotonisk i forhold til plasma, for eksempel når den har en osmolaritet som er fra ca.270 mOsm/l til ca.330 mOsm/l. Den fremstilte formulering er svakt hypotonisk i forhold til plasma, for eksempel når den har en osmolaritet som er fra ca.220 mOsm/l til ca.270 mOsm/l. Den fremstilte formulering er svakt hypertonisk i forhold til plasma, for eksempel når den har en osmolaritet som er fra ca.330 mOsm/l til ca.600 mOsm/l.

[0009] Ved ett aspekt har den fremstilte formulering en ionestyrke som er tilstrekkelig til å forhindre erytrocyttagglutinasjon når den for eksempel har minst ca. 40 mekv/l av Na<+>- og Cl--ioner. Ved et annet aspekt har den fremstilte formulering en ionestyrke som er tilstrekkelig til å forhindre erytrocyttagglutinasjon når den for eksempel har en ionestyrke, målt i konduktivitet, som er minst ca.2,5 mS/cm. Ved et annet aspekt har den fremstilte formulering en ionestyrke som er tilstrekkelig til å forhindre erytrocyttagglutinasjon når den for eksempel har en ionestyrke, målt i konduktivitet, som er minst ca.4,0 mS/cm.

[0010] Ved ett aspekt omfatter natriumkloridløsningen som tilsettes, ca.40 mM natriumklorid. Ved ett aspekt består natriumkloridløsningen som tilsettes, i det vesentlige av en 40 mM natriumkloridløsning.

[0011] Ved ett aspekt inneholder ikke den farmasøytiske formulering, før tilsetning av natriumkloridløsningen, noen merkbar mengde av et ioniserende salt. En merkbar mengde av et ioniserende salt kan for eksempel være en mengde som er større enn ca.5 mM. Hvis den farmasøytiske formulering er en lyofilisert formulering, inneholder den ikke en merkbar mengde av et ioniserende salt hvis den ikke inneholder mer enn for eksempel 5 mM av et ioniserende salt når den lyofiliserte formulering er rekondisjonert i vann.

[0012] Ved ett aspekt omfatter den farmasøytiske formulering, før tilsetning av natriumkloridløsningen: histidin, glycin, sakkarose og polysorbat. Ved et annet aspekt omfatter den farmasøytiske formulering, før tilsetning av natriumkloridløsningen: histidin, glycin, sakkarose, polysorbat og Faktor IX, relaterte analoger til disse og derivater derav. Ved et annet aspekt omfatter den farmasøytiske formulering, før tilsetning av natriumkloridløsningen: histidin, glycin, sakkarose, polysorbat og Faktor IX (innbefattende rekombinant Faktor IX (rFIX)). Slik det er anvendt her, kan Faktor IX innbefatte modifiserte versjoner av Faktor IX, innbefattende for eksempel PEGylert Faktor IX, proteinfusjoner omfattende Faktor IX så som albumin-Faktor IX eller immunoglobulin (hele eller domener derav)-Faktor IX og glykosylert Faktor IX.

[0013] Ved ett aspekt, hvor den farmasøytiske formulering er en lyofilisert formulering, omfatter formuleringen, før tilsetning av natriumkloridløsningen, målt som om den var rekondisjonert i vann (i et volum som er det samme som fyllvolumet, dvs. volumet av formuleringen før lyofilisering): (a) fra ca.5 mM til ca.

30 mM histidin; (b) fra ca.0,1M til ca.0,3M glycin; (c) fra ca.0,5 til ca.2 prosent sakkarose; og (d) fra ca.0,001 til ca.0,05 prosent polysorbat (eller fra ca.0,005 til ca. 0,05 prosent). Ved ett aspekt kan formuleringen videre omfatte, målt som om den var rekondisjonert i vann, (e) fra ca.0,1 mg/ml til ca.100 mg/ml eller mer av Faktor IX, eller fra ca.0,4 mg/ml til ca.20 mg/ml Faktor IX, eller fra ca.10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000 IE/ml (internasjonale enheter/ml) eller mer av Faktor IX.

[0014] Ved ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en metode for forhindring av erytrocytt-agglutinasjon forårsaket av intravenøs injeksjon, hvor metoden omfatter rekondisjonering eller fortynning av en farmasøytisk formulering med en 36 mM til 44 mM natriumkloridløsning slik at den rekondisjonerte eller fortynnede farmasøytiske formulering har en ionestyrke tilstrekkelig til å forhindre erytrocyttagglutinasjon når den rekondisjonerte eller fortynnede farmasøytiske formulering blir administrert til et individ ved intravenøs injeksjon.

[0015] Ved ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en metode for fremstilling av en lyofilisert farmasøytisk formulering for intravenøs injeksjon, hvor metoden omfatter rekondisjonering av den lyofiliserte farmasøytiske formulering med en 36 mM til 44 mM natriumkloridløsning slik at formuleringen etter rekondisjonering har en ionestyrke tilstrekkelig til å forhindre erytrocytt-agglutinasjon, og en osmolaritet som er omtrent isotonisk (eller svakt hypertonisk eller svakt hypotonisk).

[0016] Ved ett aspekt blir den lyofiliserte formulering rekondisjonert med natriumkloridløsningen, hvor volumet av natriumkloridløsningen som anvendes for rekondisjonering, er mindre enn volumet av formuleringen før lyofilisering (dvs. fyllvolum). På denne måten tilveiebringer oppfinnelsen en metode for reduksjon av volumet av formuleringen som skal injiseres.

[0017] Ved ett aspekt blir den lyofiliserte formulering rekondisjonert med natriumkloridløsningen, hvor volumet av natriumkloridløsningen som anvendes for rekondisjonering, er større enn volumet av formuleringen før lyofilisering (dvs. fyllvolum). På denne måten tilveiebringer oppfinnelsen en metode for å opprettholde isotonisiteten av formuleringen som skal injiseres.

[0018] En lyofilisert formulering kan for eksempel rekondisjoneres med et volum av natriumkloridløsning som er større enn volumet av formuleringen før lyofilisering, så som rekondisjonering med 5 ml natriumklorid, hvor formuleringsvolumet før lyofilisering er 4 ml. For eksempel er en lyofilisert 4 ml formulering rekondisjonert i 4 ml vann en isotonisk løsning inneholdende 10 mM histidin, 260 mM glycin, 1% sakkarose, 0,005% polysorbat, som er ca.300 mOsm/l. Men hvis den lyofiliserte formulering rekondisjoneres med 4 ml av en 40 mM NaCl- (80 mOsm/l) løsning, vil den resulterende formulering ha en svakt hypertonisk løsning (300 mOsm/l 80 mOsm/l = 380 mOsm/l). Men hvis den lyofiliserte formulering rekondisjoneres med 5 ml av en 40 mM NaCl-løsning, er den resulterende løsningen ca.8 mM (8 mOsm/l) histidin, 208 mM (208 mOsm/l) glycin, 0,8% (24 mOsm/l) sakkarose, 0,004% (ubetydelig osmolaritet) polysorbat og 40 mM (80 mOsm/l) NaCl, som er ca.320 mOsm/l. Således kan oppfinnelsen, ved rekondisjonering av en pre-lyofiliseringsformulering som er omtrent isotonisk, med et volum av natriumkloridløsning som er større enn fyllvolumet, gi en resulterende løsning som fortsatt er omtrent isotonisk. Med andre ord kan rekondisjonering av en pre-lyofiliserings-formulering som er omtrent isotonisk, med et volum natriumkloridløsning som er mindre enn eller omtrent lik fyllvolumet, resultere i en løsning som er svakt hypertonisk. For å unngå dette, tilveiebringer oppfinnelsen en metode for å opprettholde isotonisitet ved rekondisjonering av en lyofilisert formulering med en natriumkloridløsning i et volum som er større enn volumet av formuleringen før lyofilisering.

[0019] Ved ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en metode for å opprettholde isotonisitet av en lyofilisert formulering etter rekondisjonering, hvor metoden omfatter rekondisjonering av en lyofilisert formulering i et volum som er minst 20% større enn volumet av formuleringen før lyofilisering, hvor formuleringen før lyofilisering er omtrent isotonisk, slik at den rekondisjonerte formulering er omtrent isotonisk og har en tilstrekkelig ionestyrke til å forhindre erytrocyttagglutinasjon. Ved rekondisjonering av en lyofilisert formulering i et volum større enn dens pre-lyofiliserings-volum, reduseres bidraget til osmolaritet av den lyofiliserte kake i direkte proporsjon til økningen av volum fra rekondisjonering sammenlignet med før lyofilisering. For en pre-lyofiliseringsformulering med en tonisitet på 300 mOsm/l i et volum X, hvis rekondisjonert i en løsning med volum Y som er 20% større enn volum X, blir for eksempel 300 mOsm/l således 240 mOsm/l i volum Y (en 20% reduksjon i osmolaritet på grunn av en 20% økning i volum). Hvis løsningen med volum Y er en natriumkloridløsning, er bidraget mot tonisitet av natriumkloridløsningen to ganger konsentrasjonen av natriumklorid i løsningen. Hvis for eksempel løsningen med volum Y er 40 mM, har den rekondisjonerte løsningen en tonisitet på 240 mOsm/l pluss 80 mOsm/l, som er omtrent isotonisk, og som har en tilstrekkelig ionestyrke til å forhindre erytrocyttaggregering.

[0020] Ved ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en metode for fremstilling av en lyofilisert Faktor IX-formulering for intravenøs injeksjon, hvor metoden omfatter tilsetning av en 36 mM til 44 mM natriumkloridløsning til den lyofiliserte Faktor IX-formulering, noe som resulterer i en formulering tilberedt for intravenøs injeksjon, hvor den tilberedte formulering er omtrent isotonisk i forhold til plasma, eller er svakt hypotonisk eller svakt hypertonisk i forhold til plasma, og hvor den tilberedte formulering har en tilstrekkelig ionestyrke til å forhindre erytrocyttagglutinasjon. Ved ett aspekt omfatter den lyofiliserte Faktor IX-formulering, målt som om den var rekondisjonert i vann, (a) fra ca.5 mM til ca.30 mM histidin; (b) fra ca.0,1M til ca.0,3M glycin; (c) fra ca.0,5 til ca.2 prosent sakkarose; (d) fra ca.

0,001 til ca.0,05 prosent polysorbat; og (e) fra ca.0,4 mg/ml til ca.20 mg/ml Faktor IX, eller fra ca.0,1 mg/ml til ca.100 mg/ml eller en annen oppløselig mengde av Faktor IX, eller fra ca.10 IE/ml til ca.500 IE/ml Faktor IX, eller fra ca.

10 IE/ml til ca.5000 IE/ml Faktor IX. Ved ett aspekt tilsettes en ca.40 mM natriumkloridløsning til den lyofiliserte Faktor IX-formulering. Ved ett aspekt tilsettes ca.5 ml av natriumkloridløsningen på ca.40 mM til den lyofiliserte Faktor IX-formulering. Ved ett aspekt omfatter den lyofiliserte Faktor IX-formulering, hvis målt som om den er rekondisjonert i vann, ca.10 mM histidin, ca.0,26M glycin, ca. 1% sakkarose og ca.0,005% polysorbat.

Det vises nå til tegningene.

[0021] Figur 1 viser erytrocyttsedimenteringsresultater fra forsøk beskrevet i Eksempel 3. Erytrocyttsedimentering ble målt etter 60 minutter ved anvendelse av en tilpasning av den modifiserte Westergren-metode (se Eksempel 2), hvor humant blod tappet i EDTA ble blandet 1:4 med testløsningene. Etter 60 minutter ble distansen i mm mellom nullmerket og erytrocytt:plasma-grenseflaten målt. Horisontale staver representerer gjennomsnittet, og vertikale haker ("brackets") standardavvik ut fra totalt 12 donorer. Resultatene ble samlet fra 4 uavhengige forsøk som hvert evaluerte blod fra 3 donorer.

[0022] Figur 2 viser en erytrocyttsedimenteringsevaluering av BeneFIX®-formuleringer rekondisjonert med NaCl-løsninger. En 40 mM NaCl-løsning er tilstrekkelig til å forhindre erytrocyttagglutinasjon når den anvendes til å rekondisjonere enten det for tiden markedsførte BeneFIX®-produkt eller en ny formulering av BeneFIX® (BeneFIX®-R hvor fyll-løsningen før lyofilisering besto av 4 ml og hadde konsentrasjoner på 10 mM histidin, 260 mM glycin, 1% sakkarose, 0,005% polysorbat 80; og etter lyofilisering ble den rekondisjonert i 5 ml 40 mM natriumklorid, slik at etter rekondisjonering omfatter BeneFIX®-R 40 mM NaCl, 8 mM histidin, 208 mM glycin, 0,8% sakkarose og 0,004% polysorbat).

Oppfinnelsen tilveiebringer metoder for fremstilling av farmasøytiske formuleringer for injeksjon (spesielt preparater klargjort for intravenøs injeksjon) som ikke forårsaker erytrocyttagglutinasjon, hemolyse og/eller celleskrumping. For å forhindre agglutinasjon er det nødvendig at en farmasøytisk formulering som er klar for injeksjon, har tilstrekkelig ionestyrke. For å forhindre hemolyse eller celleskrumping er det nødvendig at en farmasøytisk formulering som er klar for injeksjon, er omtrent isotonisk i forhold til plasma. Oppfinnelsen tilveiebringer metoder som fremstiller farmasøytiske formuleringer for injeksjon som har både den tilstrekkelige ionestyrke til å forhindre agglutinasjon, og den nødvendige tonisitet for å forhindre betydelig hemolyse eller celledehydratisering eller -skrumping. Foreliggende metoder involverer anvendelse av natriumkloridløsninger som er 36 mM til 44 mM for rekondisjonering av lyofiliserte kaker (eller andre ikke-flytende farmasøytiske formuleringer) i løsning, eller for fortynning av farmasøytiske formuleringsløsninger. Enten natriumklorid-løsningener blir anvendt for rekondisjonering eller for fortynning, resulterer tilsetning av spesielle natriumkloridløsninger i et farmasøytisk preparat for injeksjon som er omtrent isotonisk i forhold til plasma eller blod og har tilstrekkelig ionestyrke til å forhindre erytrocytt-aggregering ved injeksjon, spesielt ved intravenøs injeksjon.

Betegnelser

[0023] Slik det er anvendt her, er “molaliteten” av en løsning antallet mol av et oppløst materiale pr. kg. løsningsmiddel.

[0024] Slik det er anvendt her, er “molariteten” av en løsning antallet mol av oppløst materiale pr. liter løsning.

[0025] Slik det er anvendt her, er et “osmol” mengden av en substans som i ideell løsning gir det antall partikler (Avogadros tall) som vil nedsette frysepunktet for løsningsmidlet med 1,86K.

[0026] Slik det er anvendt her, er “osmolaliteten” av en løsning antallet osmol oppløst materiale pr. kg. løsningsmiddel Osmolalitet er et mål for antallet partikler som finnes i løsning, og er uavhengig av størrelsen eller vekten av partiklene. Den kan måles bare ved anvendelse av en egenskap hos løsningen som bare er avhengig av partikkelkonsentrasjonen. Disse egenskaper er damptrykknedsettelse, frysepunktdepresjon, kokepunktforhøyning og osmotisk trykk, og omtales kollektivt som kolligative egenskaper.

[0027] Slik det er anvendt her, er “osmolariteten” av en løsning antallet osmol oppløst materiale pr. liter løsning.

[0028] Slik det er anvendt her, kan en “farmasøytiske formulering” som er klargjort eller tilberedt for injeksjon, være hvilket som helst medikament ment for administrering til et individ. For eksempel kan en farmasøytisk formulering være en lyofilisert kake, en løsning, et pulver eller et fast stoff. Formuleringen blir, hvis den ikke er i væskeform, rekondisjonert i løsning med en NaCl-løsning ifølgebeskrivelsen. Hvis formuleringen er i væskeform, blir formuleringen fortynnet eller blandet med en NaCl-løsning ifølgebeskrivelsen.

Ionestyrke

[0029] Ionestyrke er en karakteregenskap hos en elektrolyttløsning (en væske med positivt og negativt ladde ioner oppløst i den). Den uttrykkes typisk som de gjennomsnittlige elektrostatiske interaksjoner mellom en elektrolytts ioner. En elektrolytts ionestyrke er halvparten av det totale oppnådd ved å multiplisere molaliteten (mengden av substans pr. masseenhet løsningsmiddel) for hvert ion med kvadratet av dets valens.

[0030] Ionestyrke er nær relatert til konsentrasjonen av elektrolytter, og indikerer hvor effektivt ladningen på et spesielt ion skjermes eller stabiliseres av andre ioner (den såkalte ioniske atmosfære) i en elektrolytt. Hovedforskjellen mellom ionestyrke og elektrolyttkonsentrasjon er at førstnevnte er høyere hvis noen av ionene har større ladning. For eksempel har en løsning av fullstendig dissosiert (nedbrutt) magnesiumsulfat (Mg<2+>SO4<2->) 4 ganger høyere ionestyrke enn en løsning av natriumklorid (Na<+>Cl-) med samme konsentrasjon. En annen forskjell mellom de to er at ionestyrke gjenspeiler konsentrasjonen av frie ioner og ikke bare hvor mye salt som er tilsatt til en løsning. Noen ganger kan et salt oppløses, men de respektive ioner er fortsatt bundet sammen parvis, slik at det ligner uladde molekyler i løsning. I dette tilfellet er ionestyrken meget lavere enn saltkonsentrasjonen.

[0031] For oppfinnelsen fremstilles farmasøytiske preparater for injeksjon slik at de ikke bare er isotoniske, men også har en tilstrekkelig ionestyrke til å forhindre RBC-agglutinasjon. En tilstrekkelig ionestyrke for et preparat som er klart for injeksjon (dvs. en lyofilisert kake som er rekondisjonert med en NaClløsning ifølge oppfinnelsen, eller en medikamentløsning som er fortynnet med en NaCl-løsning ifølge oppfinnelsen) kan for eksempel ha minst ca.36, 37, 38, 39 eller minst ca.40 mEq/L Na<+>- og Cl--ioner.

[0032] Ionestyrke kan også beskrives som en løsnings konduktivitet.

Konduktivitet er evnen hos et materiale eller en løsning til å lede elektrisk strøm. Prinsippet ved hvilket instrumenter måler konduktiviteten, er enkel - to plater anbringes i prøven, et potensial blir påført over platene (normalt en sinusbølgespenning) og strømmen måles. Konduktivitet (G), det inverse av resistivitet (R) blir bestemt ut fra spenning- og strømverdiene i henhold til Ohm's lov. G = I/R = I (amp) / E (volt)

[0033] Siden ladningen hos ioner i løsning gjør ledningsevnen for elektrisk strøm lettere, er konduktiviteten av en løsning proporsjonal med dens ionekonsentrasjon. I noen situasjoner vil imidlertid konduktiviteten kanskje ikke samsvare direkte med konsentrasjon. Når det imidlertid gjelder natriumkloridløsninger, er konduktiviteten direkte proporsjonal med ionekonsentrasjonen.

Basisenheten for konduktivitet er siemens (S), tidligere betegnet mho. Siden geometrien for en testprøve påvirker konduktivitetsverdiene, uttrykkes standardiserte målinger i spesifikke konduktivitetsenheter (S/cm) for å kompensere for variasjoner i elektrodedimensjoner. Spesifikk konduktivitet (C) er ganske enkelt produktet av målt konduktivitet (G) og elektrode-cellekonstanten (L/A), hvor L er lengden av kolonnen av væske mellom elektroden og A er arealet av elektrodene. C = G x (L/A). Hvis cellekonstanten er 1 cm<-1>, er den spesifikke konduktivitet den samme som den målte konduktivitet for løsningen. Selv om elektrodeformen varierer, kan en elektrode alltid representeres ved en ekvivalent teoretisk celle.

[0034] Ved én utførelsesform kan således en tilstrekkelig ionestyrke for et preparat som er klart for injeksjon, for eksempel ha minst omtrent en konduktivitet på ca.4 mS/cm eller høyere. Ved en annen utførelsesform er den tilstrekkelige ionestyrke for en løsning som er klar for injeksjon, minst ca. 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8 eller minst ca.3,9 mS/cm.

[0035] En operasjonell definisjon av hvorvidt en løsning har en tilstrekkelig ionestyrke til å forhindre erytrocyttagglutinasjon kan også anvendes til å forklare betegnelsen “tilstrekkelig ionestyrke”. For eksempel kan dette være basert på et forsøk på tilsetning av en testløsning til helblod og observering av distansen for erytrocyttsedimentering (se Eksempel 2; tilpasset, modifisert Westergren-metode). Hvis, ved én utførelsesform, en testløsning ved blanding med helblod i et forhold på 4:1 gir en erytrocyttsedimentering etter 60 minutter som er mindre enn ca.10 mm (se for eksempel Eksempel 2, figurer 1 og 2), har testløsningen en tilstrekkelig ionestyrke til å forhindre erytrocyttagglutinasjon. Hvis, ved en annen utførelsesform, en testløsning ved blanding med helblod i et forhold på 4:1 tilveiebringer en erytrocyttsedimentering etter 60 minutter som er mindre enn ca.5 mm, har testløsningen en tilstrekkelig ionestyrke til å forhindre erytrocyttagglutinasjon.

Løsningers osmolaritet

[0036] Fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen tilveiebringer farmasøytiske preparater for injeksjon som er omtrent isotoniske i forhold til blod. For å bestemme om hvorvidt et farmasøytisk preparat er omtrent isotonisk i forhold til blod, beregner man osmolariteten for alle kjemiske komponenter av en løsning innbefattende fortynningsmidlet. Den osmolare konsentrasjon av farmasøytiske preparater for injeksjon (parenterale løsninger) kan utøve ugunstige effekter på blodcellene og blodkarene i menneskekroppen. Tonisitet kan beregnes for fluider og oppløste eller fortynnede medikasjoner, som uttrykkes i en numerisk verdi på milliosmol pr. liter fluid (mOsm/l). Denne verdien er også kjent som osmolaritet. Osmolariteten for blod er i området mellom 285 og 310 mOsm/l. Når hypotoniske eller hypertoniske løsninger injiseres i blod, går fluid inn i eller ut av celler, noe som kan forårsake en rekke negative effekter.

[0037] Løsningers osmolaritet er delvis basert på prinsippene for osmose og osmotisk trykk. Osmose er diffusjon av oppløste materialer (oppløste partikler) eller overføring av fluid gjennom semipermeable membraner så som blodkar eller cellemembraner. Osmotisk trykk, som letter transporten av molekyler over membraner, uttrykkes i osmolare konsentrasjoner og omtales som hypo-osmotisk (hypotonisk), iso-osmotisk (isotonisk) eller hyper-osmotisk (hypertonisk) sammenlignet med biologiske fluider så som blod eller plasma. Betegnelsen “tonisitet” og “osmotisk trykk” anses ofte som å være synonyme.

[0038] Det osmotiske trykket er det hydrostatiske (eller hydrauliske) trykk som er nødvendig for å motstå bevegelse av vann gjennom en semipermeabel membran som respons overfor en "osmotisk gradient" (dvs. ulike partikkelkonsentrasjoner på de to sidene av membranen). Serum-osmolalitet kan måles ved anvendelse av et osmometer, eller det kan beregnes som summen av konsentrasjonene av de oppløste materialer som finnes i løsningen. Verdien målt i laboratoriet omtales vanligvis som osmolaliteten. Verdien beregnet ut fra konsentrasjonene av oppløst materiale angis av laboratoriet som osmolariteten. Det osmolare gap er forskjellen mellom disse to verdier.

[0039] Her i dokumentet skal tonisitet og osmotisk trykk betraktes synonymt, og skal forstås i vid betydning. Tonisitet kan bety den effektive osmolalitet, og er lik summen av konsentrasjonene av de oppløste materialer i en løsning som har kapasitet til å utøve en osmotisk kraft over en membran, innbefattende en cellemembran. I den egentlige betydning er osmolalitet en egenskap hos en spesiell løsning og er uavhengig av en hver membran. Tonisitet er en egenskap hos en løsning med referanse til en spesiell membran. Imidlertid skal oppfinnelsen referere til løsninger som er isotoniske med hensyn til biologiske løsninger så som blod eller plasma, og denne henvisning skal innbefatte den betydning at den spesielle løsning er isotonisk med blod eller plasma med hensyn til en cellemembran hos en celle i blodet eller plasmaet eller annen biologisk løsning.

[0040] En operasjonell definisjon av tonisitet kan anvendes til å forklare betegnelsen. Denne kan være basert på et forsøk på tilsetning av en testløsning til helblod og observering av resultatet. Hvis RBC i helblod sveller og sprekker, sies testløsningen å være hypotonisk sammenlignet med normalt plasma. Hvis RBC krymper og blir takket, sies det at testløsningen er hypertonisk sammenlignet med normalt plasma. Hvis RBC forblir som de er, sies det at testløsningen er isotonisk med plasma. RBC-cellemembranen er referansemembranen. For eksempel vil ikke helblod anbrakt i normal saltløsning (dvs.0,9% natriumklorid) svelle, og følgelig sies det at normal saltløsning er isotonisk.

Karakteristika for isotoniske løsninger

[0041] Oppfinnelsen tilveiebringer metoder for tilberedning eller klargjøring av farmasøytiske formuleringer for injeksjon i et individ, hvor formuleringene tilberedes i løsninger som (1) er omtrent isotoniske i forhold til blod (eller plasma eller annet biologisk fluid) eller er ikke så hypertoniske eller hypotoniske at de forårsaker noen betydelig hemolyse, trombose eller karirritasjon, og (2) har tilstrekkelig ionestyrke til å forhindre erytrocyttaggregering.

[0042] Ved én utførelsesform har isotoniske (i forhold til blod) farmasøytiske formuleringer som er klare for injeksjon, en tonisitet eller osmolaritet som er høyere enn ca.270 mOsm/l og lavere enn ca.330 mOsm/l. Ved én utførelsesform har de isotoniske farmasøytiske formuleringer som er klare for injeksjon, en tonisitet eller osmolaritet som er høyere enn ca.270 mOsm/l og lavere enn ca.328 mOsm/l.

[0043] Selv om løsninger så som 0,9% natriumklorid og 5% dekstrose er isotoniske, når de anvendes til rekondisjonering eller fortynning av mange farmasøytiske formuleringer, vil den resulterende løsningen kanskje ikke ha tilstrekkelig ionestyrke til å forhindre erytrocyttagglutinasjon (som for 5% dekstrose), eller den kan ha for stor ionestyrke slik at den resulterende løsningen er hypertonisk. Således anvender fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen løsninger for fortynning eller rekondisjonering som inneholder en minimumskonsentrasjon av natriumklorid til å gi (a) en tilstrekkelig ionestyrke til å dempe erytrocyttaggregering, og (b) en tilstrekkelig tonisitet til å forhindre hemolyse, og en maksimumskonsentrasjon av natriumklorid til å gi (c) en resulterende tonisitet som ikke er så stor at det fås hypertoniske løsninger. Videre anvender fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen løsninger for fortynning eller rekondisjonering som kan gi en tilstrekkelig ionestyrke og isotonisitet i forhold til blod, mens det også opprettholdes et praktisk injeksjonsvolum for det farmasøytiske preparatet.

Karakteristika for hypotoniske løsninger

[0044] Oppfinnelsen tilveiebringer metoder for fremstilling av farmasøytiske formuleringer for injeksjon i et individ, hvor formuleringene tilberedes i løsninger som ikke er hypotoniske i forhold til blod, eller som ikke er så hypotoniske (dvs. svakt hypotoniske i forhold til blod) at de forårsaker noen betydelig hemolyse. Ved én utførelsesform kan de farmasøytiske formuleringer som er klare for injeksjon, og som anses for å være svakt hypotoniske i forhold til blod, ha en tonisitet eller osmolaritet som er lavere enn ca.270 mOsm/l og høyere enn ca.240 mOsm/l. Ved én utførelsesform kan de farmasøytiske formuleringer som er klare for injeksjon, og som anses for å være svakt hypotoniske i forhold til blod, ha en tonisitet eller osmolaritet som er lavere enn ca.270 mOsm/l og høyere enn ca. 220 mOsm/l.

[0045] Eksempler på hypotoniske løsninger innbefatter mange farmasøytiske preparater som er klargjort for injeksjon med sterilt vann. Når hypotoniske løsninger blir injisert, finner det sted et fluidskifte, og vann trekkes inn i endotelcellene i venen og i blodceller. Celler som absorberer for mye vann, kan briste, og således kan injeksjon av hypotoniske løsninger forårsake veneirritasjon, flebitt og hemolyse.

Karakteristika for hypertoniske løsninger

[0046] Oppfinnelsen tilveiebringer metoder for fremstilling av farmasøytiske preparater for injeksjon i et individ, hvor preparatene tilberedes i løsninger som ikke er hypertoniske i forhold til blod, eller som ikke er så hypertoniske (dvs. svakt hypertoniske) at de forårsaker betydelig trombose og/eller karirritasjon. Ved én utførelsesform kan de farmasøytiske formuleringer som er klare for injeksjon, og som anses for å være svakt hypertoniske, ha en tonisitet eller osmolaritet som er høyere enn ca.340 mOsm/l og lavere enn ca.600 mOsm/l. Ved én utførelsesform kan de farmasøytiske formuleringer som er klare for injeksjon, og som anses for å være svakt hypertoniske, ha en tonisitet eller osmolaritet som er høyere enn ca.340 og lavere enn ca.375, 400, 425, 450, 475, 500 eller ca.575 mOsm/l. Generelt viser hypertoniske løsninger en tonisitet som er høyere enn ca.

340 mOsm/l. Løsninger med en osmolaritet som er høyere enn ca.600 mOsm/l, bør anvendes med forsiktighet i injeksjoner.

[0047] Eksempler på uønskede hypertoniske løsninger innbefatter mange farmasøytiske formuleringer som er klargjort for injeksjon med 10% dekstrose, eller farmasøytiske preparater som har multiple additiver som påvirker osmolariteten. Når hypertoniske løsninger blir injisert, finner det sted et fluidskifte, og vann trekkes ut av endotelcellene i venen og blodcellene. Celler som taper for meget vann, kan skrumpe inn, og således kan injeksjon av hypertoniske løsninger forårsake veneirritasjon, flebitt og trombose.

pH

[0048] pH i blod er i området fra ca.7,35 til ca.7,45, som anses som nøytralt. Farmasøytiske preparater med en pH-verdi på under 7 anses for å være sure medikamenter, og preparater med en pH-verdi på under 4,1 anses som meget sure. Medikamenter med en pH-verdi høyere enn 7,5 anses som basiske eller alkaliske medikamenter, og medikamenter med pH-verdi høyere enn 9,0 anses som meget basiske eller alkaliske. Meget sure eller meget alkaliske medikamentløsninger kan forårsake flebitt og trombose. Ved én utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen således natriumkloridløsninger for rekondisjonering av lyofiliserte medikamentformuleringer eller for fortynning av flytende medikamentformuleringer for klargjøring av disse formuleringer for intravenøs injeksjon, hvor de klargjorte preparater for injeksjon (1) ikke har en pH som er lavere enn 4,1 eller høyere enn 9,0, (2) har en tilstrekkelig ionestyrke til å forhindre erytrocyttaggregering, og (3) er omtrent isotoniske (eller svakt hypertoniske eller hypotoniske) i forhold til blod, slik at hemolyse eller takking ikke finner sted for RBC. Imidlertid er pH i en løsning ikke en betraktning med hensyn til hvorvidt løsningen har en tilstrekkelig ionestyrke til å forhindre erytrocyttaggregering. Hvis, med andre ord, en lyofilisert formulering rekondisjonert med vann har en pH som er lavere enn 4,1 eller høyere enn 9,0, forhindrer dette ikke anvendelse av en natriumkloridløsning for rekondisjonering for å forhindre erytrocyttagglutinasjon.

Beregning av osmolaritet

[0049] Osmolariteten av hvilket som helst farmasøytisk preparat kan beregnes ved anvendelse av følgende formel: Osmolaritet = (vekt av substans (g) dividert med molekylvekten av substansen (g/l)) multiplisert med antallet forbindelser multiplisert med 1000 for milliosmolaritet. Betegnelsen “forbindelser” angir antallet ioner eller kjemiske forbindelser dannet når oppløsing finner sted.

[0050] Farmasøytiske formuleringer klare eller tilberedt for injeksjon

[0051] Oppfinnelsen tilveiebringer metoder for rekondisjonering av lyofiliserte medikamentprodukter i løsning for tilberedning av medikamentproduktet for injeksjon i et individ. Det rekondisjonerte medikamentprodukt er klart for injeksjon ved at det har en tilstrekkelig ionestyrke og en tonisitet som er omtrent isotonisk i forhold til blod.

[0052] Fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen angår også fortynning av medikamentløsninger for tilberedning av medikamentløsningen for injeksjon i et individ. Den fortynnede medikamentløsning er klar for injeksjon ved at den har en tilstrekkelig ionestyrke, og ved at den er omtrent isotonisk i forhold til blod.

[0053] På grunn av at oppfinnelsen tilveiebringer metoder for rekondisjonering ved anvendelse av fra 36 mM til 44 mM natriumklorid-løsninger, bør utøveren anvende en spesiell natriumkloridløsning basert på den forventede kombinerte osmolaritet av det lyofiliserte medikamentprodukt rekondisjonert i natriumkloridløsningen.

[0054] Ved én utførelsesform inneholder et medikamentprodukt (enten lyofilisert eller i løsning) for fremstilling for injeksjon ved foreliggende metoder, ikke HES (hydroksyetylstivelse). HES-inneholdende formuleringer kan, til tross for rekondisjonering eller fortynning med NaCl-løsninger for ionestyrke, forårsake erytrocyttsedimentering og agglutinasjon i in vitro-forsøk. Ved en annen utførelsesform inneholder et medikamentprodukt for fremstilling for injeksjon ved foreliggende metoder ikke dekstraner, på grunn av at adapterte modifiserte Westergren-metoder (se Eksempel 2) viser at tilsetning av NaCl ikke vil motvirke effekten av forbedret sedimentering som dekstraner kan forårsake.

[0055] Ved én utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen metoder for fremstilling av et farmasøytisk preparat for intravenøs injeksjon hvor det farmasøytiske preparatet er en lyofilisert kake omfattende et primært svellemiddel. Det primære svellemiddel kan for eksempel være hovedsakelig ikke-ioniserende. Ikke-ioniserende svellemidler innbefatter, men er ikke begrenset til, mannitol, glycin, sakkarose, laktose, andre disakkarider, terapeutiske proteiner eller selve den aktive bestanddel i en formulering, eller andre svellemidler kjent for fagfolk på området. Konsentrasjonene av ikke-ioniserende svellemidler påvirker ikke i noen betydelig grad hvorvidt en løsning har en tilstrekkelig ionestyrke til å forhindre agglutinasjon. Imidlertid har konsentrasjonene av dem en effekt på osmolaritet, og derfor kan konsentrasjonene av dem ha en effekt på tonisitet. Konsentrasjonen av glycin er for eksempel ekvivalent med dets bidrag til osmolaritet, og således er 10 mM glycin ekvivalent med 10 mOsm/l.

[0056] Proteinbestanddeler i en medikamentformulering, innbefattende aktive bestanddeler, påvirker ikke i noen betydelig grad ionestyrken i en løsning eller osmolariteten av en løsning. Anta for eksempel en molekylvekt på 50000 for et protein, og at 2,5 mg av proteinet i en 1-2 ml løsning skal injiseres. Dette er ekvivalent med 0,05 mM, og således bidrar proteinet ikke i noen vesentlig grad til osmolariteten.

[0057] Farmasøytiske preparater inneholder også ofte overflateaktive midler, så som polysorbat-80. Polysorbat-80 og andre overflateaktive midler er molekyler med høy molekylvekt, slik at mengder som vanligvis er til stede i preparater, så som 0,001% til 0,01%, er for små til at de i noen vesentlig grad bidrar til osmolaritet eller ionestyrke. Andre overflateaktive midler innbefatter Brij<® >35, Brij<® >30, Lubrol-px™, Triton X-10, Pluronic<® >F127 og natriumdodekylsulfat (SDS).

[0058] Andre molekyler med høy molekylvekt som kan være til stede i små mengder i farmasøytiske formuleringer som ikke i noen vesentlig grad påvirker osmolaritet eller ionisitet, er polymerer, med den kvalifikasjon at de ikke er salter slik som dekstransulfat. Eksempler på polymerer innbefatter dekstran, poly(vinylalkohol) (PVA), hydroksypropylmetylcellulose (HPMC), gelatin, polyetylenglykol (PEG) og polyvinylpyrrolidon (PVP).

[0059] Farmasøytiske formuleringer inneholder også ofte sakkarose eller andre sukkerarter eller polyoler, ofte i en mengde på 0-2, 0-5 eller 0-10% eller høyere. For eksempel kan 5-10% sakkarose anvendes når formuleringen ikke omfatter et svellemiddel. Hvor en formulering blir lyofilisert og mengder av formuleringen er identifisert her som prosentandeler eller molaritetsmengder, er dette med henvisning til prosentandeler og molaritet av en løsning før lyofilisering (dvs. fyllmengder). Når således en løsning har 1% sakkarose, er dette ekvivalent med 29,2 mM. Fordi sakkarose ikke i noen vesentlig grad ioniseres eller dissosieres i løsning, er 29 mM sakkarose ekvivalent med 29 mOsm/l. Andre sukkerarter eller polyoler som ikke i noen vesentlig grad ioniseres eller dissosieres i løsning, innbefatter glycerol, xylitol, sorbitol, mannitol (kan også anvendes som svellemiddel), glukose, inositol, raffinose, maltotriose, laktose og trehalose.

[0060] Farmasøytiske formuleringer også kan inneholde bufringsmidler. Bufringsmidler innbefatter for eksempel acetat, citrat, glycin, histidin, fosfat (natrium eller kalium), dietanolamin og Tris. Bufringsmidler innbefatter midler som opprettholder en løsnings pH i et akseptabelt område. Bufringsmidler så som glycin, histidin og dietanolamin er hovedsakelig ikke-ioniserende, og således er konsentrasjonene av dem ekvivalent med osmolariteten og bør has i minne når man overveier om hvorvidt en formulering som er klar for injeksjon, er omtrent isotonisk. Bufringsmidler så som acetat og citrat er vanligvis salter og er derfor ioniserende, og konsentrasjonene av dem er multiplisert med hensyn til beregning av deres bidrag til en løsnings osmolaritet.

[0061] Farmasøytiske formuleringer kan i det vesentlige innbefatte hvilken som helst aktiv bestanddel, innbefattende proteiner, nukleinsyrer, virus og kjemiske forbindelser. Disse molekyler påvirker som oftest ikke i noen vesentlig grad ionestyrken eller osmolariteten av en løsning som skal injiseres. Hvis disse molekyler er salter, slik som ofte små molekylforbindelser er farmasøytiske salter, kan de i vesentlig grad påvirke ionestyrken og/eller osmolariteten.

[0062] Visse aminosyrer finnes også i noen farmasøytiske formuleringer, og anvendes som kryobeskyttelsesmidler, lyobeskyttelsesmidler og/eller svellemidler. Noen aminosyrer, så som histidin, er hovedsakelig ikke-ioniserende, og således bør konsentrasjonen av en aminosyre i en formulering bare has i minne ved beregning av osmolariteten av en løsning, slik at en formulering som er klar for injeksjon, er omtrent isotonisk i forhold til blod.

BeneFIX®

[0063] BeneFIX® produseres av en genteknologisk konstruert Kinesisk hamster-ovarie- (CHO) cellelinje som i stor utstrekning er karakterisert og vist å være fri for infeksiøse midler. De lagrede cellebanker er frie for blod- eller plasmaprodukter. CHO-cellelinjen utskiller rekombinant Faktor IX (rFIX) i et definert celledyrkningsmedium som ikke inneholder noen proteiner avledet fra animalske eller humane kilder, og den rekombinante Faktor IX blir renset ved en kromatografi-renseprosess som ikke krever et monoklonalt antistoff-trinn og gir et aktivt produkt med høy renhet. Et membranfiltreringstrinn som har evnen til å holde tilbake molekyler med tilsynelatende molekylvekter >70000 (så som store proteiner og viruspartikler), er innbefattet for ytterligere viral sikkerhet. BeneFIX® er overveiende en enkelt komponent ifølge evaluering ved hjelp av SDS-polyakrylamid-gel-elektroforese. Styrken (i internasjonale enheter, I.E. (IE)) blir bestemt ved anvendelse av et in vitro-ettrinns-koagulasjonsforsøk mot Verdens Helseorganiasjon (WHO) Internasjonal Standard for Faktor IX-konsentratet. Én internasjonal enhet er mengden av Faktor IX-aktivitet som finnes i 1 ml blandet, normalt humant plasma. Den spesifikke aktiviteten av BeneFIX® er større enn eller lik 180 IE pr. milligram protein. BeneFIX® er ikke avledet fra humant blod, og inneholder ingen konserveringsmidler eller tilsatte animalske eller humane komponenter.

[0064] BeneFIX® er formulert som et sterilt, ikke-pyrogent, lyofilisert pulverpreparat. BeneFIX® er ment for intravenøs (IV) injeksjon. Det er tilgjengelig i enkeltbruks-medisinglass inneholdende den merkede mengden av Faktor IX-aktivitet, uttrykt i internasjonale enheter (IE). Hvert medisinglass inneholder for eksempel nominelt 250, 500 eller 1000 IE (eller mer, innbefattende 2000 IE) koagulasjonsfaktor IX (rekombinant). Etter rekondisjonering av det lyofiliserte medikamentprodukt med sterilt vann, er konsentrasjonene av tilsetningsmidler i dosestyrkene 500 og 1000 IE 10 mM L-histidin, 1% sakkarose, 260 mM glycin, 0,005% polysorbat 80. Konsentrasjonene etter rekondisjonering i 250 IE dosestyrken er halvparten av konsentrasjonene av de andre to dosestyrker.

Dosestyrkene på 500 og 1000 IE er isotoniske etter rekondisjonering, og dosestyrken på 250 IE har halvparten av tonisiteten av de andre to dosestyrker etter rekondisjonering. Alle dosestyrker gir en klar, fargeløs løsning ved rekondisjonering.

[0065] Det beskrives metoder for tilberedning av BeneFIX® for injeksjon til et individ, hvor BeneFIX® rekondisjoneres i en natriumkloridløsning, hvor natriumkloridløsningen er ca.40 mM.

Omformulert BeneFIX® (BeneFIX®-R)

[0066] På grunn av den lave ionestyrken av BeneFIX® rekondisjonert i vann, ble det utført forskjellige omformuleringer (Omformulert BeneFIX® (BeneFIX®-R)). Målet var å tilsette tilstrekkelig ionestyrke til BeneFIX®-formuleringen til å dempe potensialet for RBC-agglutinasjon. For å øke ionestyrken av BeneFIX® kan natriumklorid innføres i det rekondisjonerte produkt ved at sWFI erstattes som rekondisjoneringsløsning. Alternativt kan BeneFIX® omformuleres ved tilsetning av NaCl til pre-lyofiliserings-formuleringen, slik at rekondisjonering fremdeles kan oppnås med vann, men lyofilisering av saltløsninger er vanskeligere, og det er mer praktisk ganske enkelt å rekondisjonere lyofiliserte kaker med NaCl-løsninger. Dette gjelder også for andre lyofiliserte farmasøytiske preparater som ikke har en tilstrekkelig ionestyrke når de blir rekondisjonert med sWFI for å forhindre agglutinasjon.

[0067] Ved én utførelsesform kan BeneFIX®-R lyofiliseres i samme formulering som BeneFIX® (10 mM L-histidin, 260 mM glycin, 1% sakkarose, 0,005% polysorbat 80), og bare rFIX-konsentrasjonen vil avvike. BeneFIX®-R medikamentmasseprodukt kan deretter fylles, for eksempel med 4 ml pr. medisinglass, med 10 mM L-histidin, 260 mM glycin, 1% sakkarose, 0,005% polysorbat 80, og lyofiliseres. Når BeneFIX®-R rekondisjoneres til 5 ml pr. medisinglass med en 36-44 mM NaCl-løsning, så som med 40 mM NaCl, reduseres konsentrasjonen av tilsetningensmidler med 20% sammenlignet med den nåværende BeneFIX®-formulering før lyofilisering. Denne strategi resulterer i en formulering som (1) er isotonisk, (2) har tilstrekkelig ionestyrke til å redusere potensialet for RBC-agglutinasjon, og (3) reduserer injeksjonsvolumet for høyere doser av rFIX. BeneFIX®-R kan tilveiebringes med dosestyrker på for eksempel 250, 500, 1000 og 2000 IE rFIX pr. medisinglass. Således kan den resulterende BeneFIX®-R-formuleringsløsning, etter rekondisjonering med 5 ml av en 36-44 mM NaCl løsning, inneholde fra ca.7 til ca.9 mM histidin; fra ca.188 til ca.220 mM glycin; fra ca.0,7% til ca.0,9% sakkarose; og ca.0,004% polysorbat 80.

Avhengig av mengden av rFIX i et medisinglass, for eksempel 250, 500, 1000 eller 2000 IE, vil rekondisjonering i 5 ml av en NaCl-løsning resultere i en rFIX-konsentrasjon på henholdsvis ca.50, 100, 200 eller 400 IE/ml. Osmolariteten av BeneFIX®-R-formuleringen rekondisjonert i 5 ml av en 40 mM NaCl-løsning er ca.

320 mOsm/l.

Eksempler på formuleringer for tilberedning for injeksjon

[0068] Rekombinant Faktor IX kan også være lyofilisert i formuleringer beskrevet i US-patent nr.6 372716.

[0069] Ved én utførelsesform omfatter en lyofilisert formulering for rekondisjonering med 26-44 mM natriumkloridløsning, ca. 0,1 til 0,3M glycin, ca.

0,5 til 2% sakkarose, 0,001 til ca.0,05% polysorbat, ca.5 til ca.30 mM histidin og ca. 0,1 til ca.20 mg/ml. av rFIX. Ved en annen utførelsesform omfatter en lyofilisert rFIX-formulering for rekondisjonering med 36-44 mM natriumkloridløsning ca.0,13 til ca.3 mg/ml rFIX eller ca.50 til ca.600 IE/ml rFIX, ca. 0,26M glycin, ca.10 mM histidin, ca.1% sakkarose og ca.0,005% polysorbat.

EKSEMPLER IFØLGE OPPFINNELSEN

[0070] Eksemplene beskrevet nedenfor er gitt for å illustrere aspekter ved foreliggende oppfinnelse, og er ikke medtatt for det formål å begrense oppfinnelsen.

Eksempel 1: Virkninger av anti-koagulanter og formuleringskomponenter på BeneFIX<®>-assosiert RBC-agglutinasjon

[0071] Det er leilighetsvis rapportert om BeneFIX®-assosiert RBC-agglutinasjon i butterfly-kateterledninger og sprøyter. Nyere undersøkelser av blod fra hemofili-hunder viser at agglutinasjonen finner sted i fravær av rekombinant human FIX i formuleringsbufferen. Således undersøkte foreliggende studie om hvorvidt standard-antikoagulanter, forskjellige BeneFIX®-komponenter samt ionestyrke påvirker det BeneFIX®-assosierte agglutinasjonsfenomen.

[0072] Blod ble tappet fra en pulje av anonyme frivillige mennesker og ble tappet i Vacutainer-rør (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) inneholdende en standard-antikoagulant, så som etylendiamin-tetraeddiksyre (EDTA), natriumcitrat eller heparin.

[0073] For testing med henblikk på agglutinasjon ble blodprøvene i Vacutainer-røret først kontinuerlig blandet på en pendelblander ("nutator"). Blod, 12,5 μl, ble fortynnet i 87,5 μl av en testløsning i en 48-brønns celledyrkningsplate og fikk inkuberes ved romtemperatur i 2 minutter før observasjon under et invertert fase-kontrastmikroskop ved 400x forstørrelse. Hver brønn ble videofilmet for å sikre stillbilder for bedømmelse av RBC-agglutinasjon i henhold til følgende kriterier oppført nedenfor i tabell 1.

Tabell 1: RBC-agglutinasjons-bedømmelsesnøkkel

[0074] Virkninger av standard-antikoagulanter på RBC-agglutinasjon: Den første undersøkelse innbefattet analyse av blodprøver fra tre donorer. Blod ble tappet i EDTA-, heparin- og natriumcitrat-Vacutainer-rør for hver donor.

Testartiklene innbefattet BeneFIX®, 100 IE/ml, rekondisjonert i hver av følgende NaCl-konsentrasjoner: 0 mM (sWFI), 20 mM, 40 mM, 60 mM og 77 mM NaCl. I tillegg ble dekstrose 5% i vann (D5W) medtatt som positiv kontroll. Prøvene ble fortynnet i et forhold mellom blod og BeneFIX®, eller blod og D5W, på 1:8. Bilder ble tatt, lagret digitalt, maskert og bedømt med hensyn til agglutinasjon. To minutter etter tilsetning av blod til BeneFIX® rekondisjonert med sWFI, kunne det sees agglutinasjon i prøvene fra alle tre donorer uansett typen antikoagulant som ble anvendt. Etter hvert som det ble anvendt økende konsentrasjoner av NaCl, ble agglutinasjonsresponsen svekket. Markert agglutinasjon kunne sees når blod ble tilsatt til D5W.

[0075] Virkninger av NaCl på RBC-agglutinasjon i for-screenede donorer: Donorprøver ble tappet i hepariniserte Vacutainer-rør. På grunn av at spontan agglutinasjon var blitt observert i noen tidligere prøver, ble alle donorer innledningsvis screenet ved anvendelse av 154 mM NaCl. Hvis agglutinasjon ble observert, ble prøven utelatt fra ytterligere forsøk. De gjenværende prøver fra hver donor ble fortynnet 1:8 i én av to formuleringer: (1) 100 IE/ml BeneFIX® rekondisjonert med sWFI, og (2) 100 IE/ml BeneFIX® rekondisjonert med 154 mM NaCl. Bilder ble tatt, lagret digitalt, maskert og bedømt med henblikk på agglutinasjon. Agglutinasjon ble sett med BeneFIX®-rekondisjonert sWFI, mens rekondisjonering med 154 mM NaCl reduserte eller eliminerte agglutinasjonsreaksjonen (se tabell 2 for poeng).

Tabell 2: Agglutinasjonspoeng

[0076] Effekt av formuleringskomponenter og BeneFIX®-konsentrasjon: Flere formuleringer av BeneFIX® ble evaluert for å bestemme virkningen av forskjellige komponenter på RBC-agglutinasjon. Åtte forskjellige blandinger, med og uten 154 mM NaCl, ble tillaget, totalt 16 blandinger (Tabell 3). Tolv donorer ble screenet med henblikk på spontan agglutinasjon, og to ble utelatt fra ytterligere undersøkelse. Blodprøver fra fem av de ti gjenværende donorer ble anvendt for de første 8 formuleringer (prøver 1-A til og med 1-H), og de andre fem donorprøver ble anvendt for de andre 8 formuleringer (prøver 2-I til og med 2-P). Prøvene ble fortynnet 1:8 som før, og det ble tatt bilder som ble bedømt som beskrevet tidligere.

Tabell 3: Formuleringsdesign-matriks

(+/- indikerer tilstedeværelse/fravær av en bestanddel)

[0077] Agglutinasjonspoeng for forsøket oppført i Tabell 3 er vist nedenfor i Tabeller 4A og 4B. Ingen spesiell komponent, enten den aktive bestanddel eller et tilsetningsmiddel, av BeneFIX®-preparatet ble forbundet med agglutinasjon. Som forventet, forårsaket fjerning av glycin RBC-lyse på grunn av hypotonisitet av løsningen. Imidlertid reduserte eller fjernet rekondisjonering med 154 mM NaCl in vitro-agglutinasjonen og lysen.

Tabell 4A: Agglutinasjonspoeng - Variering av BeneFIX®-konsentrasjonen

Tabell 4B: Agglutinasjonspoeng - Tilsetningsmidler virkninger

[0078] Virkninger av lavere konsentrasjoner av NaCl på RBC-agglutinasjon i for-screenede donorer: Donorprøver ble tappet i hepariniserte Vacutainer-rør. På grunn av at agglutinasjon var blitt observert i noen tidligere prøver, ble alle donorer innledningsvis screenet med 154 mM NaCl. Hvis agglutinasjon ble observert, ble prøven utelukket fra ytterligere forsøk. De gjenværende prøver fra hver donor ble fortynnet 1:8 som før i én av tre formuleringer: (1) 100 IE/ml BeneFIX® med sWFI; (2) 100 IE/ml BeneFIX® med 40 mM NaCl; eller (3) 100 IE/ml BeneFIX® med 77 mM NaCl. Bilder ble tatt, samlet og bedømt som før. Resultatene er gitt i Tabell 5 nedenfor. Agglutinasjon kunne sees i alle fem prøver med BeneFIX® rekondisjonert med vann, mens rekondisjonering av BeneFIX® med 40 mM eller 77 mM NaCl reduserte eller fjernet agglutinasjonsreaksjonen.

Tabell 5: Agglutinasjonspoeng

[0079] Analyse: RBC-agglutinasjon fant sted i blod anti-koagulert med heparin, EDTA eller natriumcitrat ved blanding med BeneFIX® i et volumforhold mellom blod og rekondisjonert BeneFIX® på 1:8. Ingen effekt av anti-koagulanttype kunne sees på agglutinasjonen; derfor ble heparin anvendt som antikoagulant ved påfølgende evalueringer. I noen prøver fant agglutinasjon sted i nærvær av 0,9% NaCl alene (negativ kontroll for agglutinasjon). Derfor ble påfølgende evalueringer utført bare med prøver som ikke viste noen agglutinasjon med 0,9% NaCl-kontroll.

[0080] Virkningene av tre konsentrasjoner av BeneFIX<® >(100, 300 eller 600 IE/ml) og av hver individuell komponent av BeneFIX®, rekondisjonert i sWFI eller NaCl-løsning, ble deretter evaluert med henblikk på RBC-agglutinasjon når de var blandet med heparin-antikoagulert blod i et volumforhold mellom blod og BeneFIX® på 1:8. Eliminering av en hver spesiell komponent, innbefattende det rekombinante humane FIX-protein, hadde ingen virkning på agglutinasjonsresponsen. Dette indikerer at et vidt område av forskjellige farmasøytiske formuleringer kan klargjøres (rekondisjoneres eller fortynnes) med NaCl-løsninger for intravenøs injeksjon. Fjerning av glycin resulterte i RBC-lyse. Imidlertid reduserte eller fjernet anvendelse av 40 mM (0,234% NaCl, injiserbart), 77 mM (0,45% NaCl, injiserbart) eller 154 mM NaCl (0,9% NaCl, injiserbart) for rekondisjonering agglutinasjonsresponsen og lysen.

[0081] Således viser disse resultater at ingen spesiell komponent av BeneFIX®-formuleringen er relatert til den observerte agglutinasjon. Selv om fjerning av glycin fra BeneFIX®-formuleringen og rekondisjonering med vann resulterer i en hypotonisk løsning som forårsaker lyse, er osmolaritet og tonisitet et annet anliggende enn ionestyrke og agglutinasjon. Resultatene viser at agglutinasjon er forbundet med den lave ionestyrke av den rekondisjonerte rekombinante Faktor IX (rFIX) i sWFI, at og rekondisjonering med NaCl svekker eller eliminerer agglutinasjon. Således kan rekondisjonering av andre farmasøytiske formuleringer med NaCl-løsninger, selv NaCl-løsninger som har en konsentrasjon under 154 mM, forhindre både agglutinasjon og lyse ved intravenøs injeksjon.

Eksempel 2: Tilpasning av den modifiserte Westergren-metode for måling av erytrocyttsedimenteringshastighet for å bedømme erytrocyttaggregering fremkalt ved farmasøytiske midler eller formuleringer

[0082] Den for tiden markedsførte BeneFIX®-formulering er en ikke-ionisk formulering. Under administrering av BeneFIX®-formuleringen rekondisjonert i sWFI har det vært sjeldent forekommende observasjoner av erytrocyttaggregering (dvs. agglutinasjon) når en pasients blod blir blandet med den rekondisjonerte BeneFIX®, så som i intravenøse slanger. Oppfinnelsen tilveiebringer den oppdagelse at erytrocyttaggregering er forbundet med formuleringen, ikke rFIX, og forhindres ved anvendelse av fortynningsmidler som inneholder minst ca.40 mM NaCl. For å understøtte utformingen av vanlige fortynningsmidler inneholdende minst ca.40 mM NaCl, ble det utformet et kvantifiserbart forsøk som kan anvendes til å måle erytrocyttsedimentering, som er en etablert metode for å bedømme erytrocyttaggregering in vitro. Den modifiserte Westergren-metode, hvor blod blir fortynnet 4:5 i normal saltløsning, ble tilpasset for å bedømme aggregering i blod som var blitt fortynnet 1:4 eller 1:8 enten med saltløsning eller testløsninger (dvs. passende ("custom") fortynningsmidler).

[0083] Humant blod ble tappet fra friske voksne frivillige og oppsamlet i rør inneholdende EDTA. For å demonstrere egnetheten av blodprøver for sedimenteringsforsøk ble den klinisk definerte erytrocyttsedimenteringshastighet ESR60 målt ved hjelp av den modifiserte Westergren-metode. Kort angitt ble godt blandet blod fortynnet 4:5 med 154 mM NaCl, forsiktig blandet godt og deretter umiddelbart påsatt på et selv-nullstillende Westergren-rør som var blitt anbrakt i et passende 10-rørs stativ. Distansen i mm fra nullmerket ved toppen av røret til plasma:erytrocytt-grenseflaten etter 60 minutter ble målt og registrert. ESR60-resultatene ble sammenlignet med publiserte normale referanseverdier (Morris, M.W. et al., Basic examination of blood, i Henry, J.B., red., Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, Philadelphia, PA, WB Saunders, 2001: 479-519).

[0084] To forsøk ble utført for å vise egnetheten av den tilpassede, modifiserte Westergren-metode til å bedømme erytrocyttaggregering forbundet med farmasøytiske formuleringer. Humane blodprøver var egnet for anvendelse i disse forsøk på grunn av at alle hadde ESR60-verdier som var innenfor normale grenser. Disse prøver ble fortynnet 1:4 i det første forsøket, og fortynnet 1:8 i det andre.

[0100] I det første forsøket ble erytrocyttsedimentering forøket med 5% dekstran 70 eller BeneFIX® rekondisjonert med sWFI eller 10 mM NaCl. I løpet av 5 minutter var aggregater synlige i rørene som var blitt ifylt blod fortynnet med enten 3% dekstran 70 eller BeneFIX® rekondisjonert i sWFI. Etter 60 minutter var erytrocyttsedimentering i disse rør markert forbedret sammenlignet med saltløsning-kontroll (Tabell 6). Etter 90 minutter hadde blod fra én donor som var fortynnet i BeneFIX® rekondisjonert i 10 mM NaCl, et tofase-sedimenteringsmønster med en klar erytrocytt:plasma-grenseflate lokalisert 8 mm fra nullmerket, og en annen grenseflate mellom tettpakkede og mindre tettpakkede erytrocytter lokalisert 149 mm fra nullmerket.

Tabell 6: Erytrocyttsedimentering av humant blod fortynnet 1:4 i BeneFIX® eller 3% dekstran

(Sedimenteringsdistanse i mm målt fra nullmerket)

NaCl-konsentrasjoner er slike som anvendes til rekondisjonering av BeneFIX®

[0101] I det andre forsøket ble erytrocyttsedimentering forbedret med 5% dekstrose, “MFR-927” (formuleringsbufferen for BeneFIX® som mangler rFIX) og BeneFIX® rekondisjonert med 10 mM NaCl (Tabell 7). I motsetning til det første forsøk, var sedimentering i disse rør rask, idet maksimal eller nesten maksimal sedimentering ble nådd etter 15 til 30 minutter.

Tabell 7: Erytrocyttsedimentering av humant blod fortynnet 1:8 i MFR-927, BeneFIX® eller 5% dekstrose

(Sedimenteringsdistanse i mm målt fra nullmerket)

NaCl-konsentrasjoner er slike som anvendes til rekondisjonering av BeneFIX®; MFR-927 er formuleringsbufferen for BeneFIX® som mangler rFIX.

[0102] Resultatene av disse forsøk viser at den modifiserte Westergrenmetode som anvendes til å måle erytrocyttsedimentering, kan tilpasses for å bedømme erytrocyttaggregering fremkalt av farmasøytiske preparater eller formuleringer. For eksempel er måling av erytrocyttsedimentering i Westergrenrør 60 minutter etter ifylling av blod fortynnet 1:4 med testløsninger tilstrekkelig til å skjelne midler som forsterker aggregering (dvs.5% dekstrose, 3% dekstran 70, MFR-927 og BeneFIX® rekondisjonert i sWFI), fra dem som ikke forsterker den (dvs. saltløsning og BeneFIX® rekondisjonert i fortynningsmidler inneholdende ca.

25 mM eller mer NaCl).

Eksempel 3: Tilstrekkelighet av 40 mM NaCl i fortynningsmiddel for reformulert BeneFIX® for å bedre formulerings-assosiert erytrocyttaggregering

[0103] Den ikke-ioniske formulering av for tiden markedsført BeneFIX® er forbundet med in vitro-erytrocyttaggregering, som kan finne sted under administrering når pasientblod blir blandet med BeneFIX® i intravenøse slanger. Oppfinnelsen tilveiebringer den oppdagelse at erytrocyttaggregering er forbundet med formuleringen, ikke rekombinant Faktor IX, og aggregering kan forhindres ved rekondisjonering av BeneFIX® med fortynningsmidler som inneholder minst 40 mM NaCl.

[0104] Et mål med dette eksemplet er å teste robustheten av et 40 mM fortynningsmiddel for rekondisjonering av reformulerte BeneFIX® (BeneFIX®-R)-preparater. Spesifikt ble det utformet forsøk for å bestemme om hvorvidt NaClkonsentrasjoner som avviker fra 40 mM med så meget som 10%, er tilstrekkelig til å forhindre formulerings-assosiert erytrocyttaggregering, som ble bedømt ved den adapterte, modifiserte Westergren-metode til å måle erytrocyttsedimenteringshastighet (ESR). I tillegg ble robustheten av NaCl-konsentrasjonen ved erytrocyttsedimentering bedømt i medisinglass med både høy (dvs.2000 IE) og lav (dvs.250 IE) dose av BeneFIX®-R.

[0105] Effekten av BeneFIX®-R formuleringer, MFR-927 og 3% dekstran 70 på erytrocyttsedimentering ble målt ved romtemperatur ved anvendelse av en adaptasjon av den modifiserte Westergren-metode, som beskrevet i eksempel 2. Undersøkelsens utformning er angitt i tabell 8.

Tabell 8: Undersøkelsesutformning for eksempel 3

[0106] På forsøksdagen ble både høy- (medisinglass med lyofilisert BeneFIX®-R inneholdende ~2000 IE rFIX) og lavdose-medisinglass med BeneFIX®-R (medisinglass med lyofilisert BeneFIX®-R inneholdende ~250 IE rFIX) rekondisjonert umiddelbart før anvendelse med 5 ml 36 mM, 40 mM eller 44 mM NaCl. Den positive kontroll-løsningen 3% (vekt/volum) dekstran 70 ble tilberedt i sterile Dulbeccos modifiserte, kalsium- og magnesiumfrie fosfatbufrede saltløsning (PBS-CMF; pH 7,4). Humant blod ble tappet fra donorer og oppsamlet i Vacutainer-rør inneholdende EDTA. Blodprøver ble anvendt for erytrocyttsedimenteringsforsøk innen 3 timer etter tapping.

[0107] Helblod ble fortynnet 1:4 i testløsninger (dvs. at 400 μl helblod ble tilsatt til 1,2 ml testløsning), blandet godt og deretter fylt i selv-nullstillende engangs-Westergren-glassrør som ble holdt absolutt vertikalt i et passende stativ. Erytrocyttsedimentering etter 60 minutter, som er distansen i mm fra nullmerket ved toppen av røret til plasma-erytrocytt-grenseflaten, ble målt og registrert.

[0108] Det var lignende resultater fra alle 12 donorer. For tiden markedsført BeneFIX®-formuleringsbuffer som manglet rFIX (MFR-927) og 3% dekstran 70, en standard positiv kontroll-løsning, viste forbedret erytrocyttsedimentering sammenlignet med blod som var blitt blandet i NaCl-testløsninger (se figur 1). Uansett NaCl-konsentrasjon i bufferen (36 mM, 40 mM eller 44 mM) eller rFIX-konsentrasjon i produktet, forøket ikke BeneFIX®-R erytrocyttsedimenteringen så lenge den var rekondisjonert med et NaCl-fortynningsmiddel.

[0109] Resultatene fra denne undersøkelsen viser at NaCl-konsentrasjoner som var 10% høyere eller lavere enn 40 mM i BeneFIX®-R-fortynningsmidlene, er tilstrekkelige til å forhindre forøket erytrocyttsedimentering eller -aggregering (agglutinasjon). Resultatene viser også at den forbedrende effekt av NaCl på formulerings-assosiert erytrocyttaggregering ikke var påvirket av konsentrasjonen av den aktive bestanddel (dvs. rFIX).

Eksempel 4: Ionestyrkens rolle i bufferen for rekondisjonering av BeneFIX® ved bevirkning av RBC-agglutinasjon

[0110] Humant blod ble tappet ved venepunktur fra fire forskjellig donorer i standard hepariniserte tapperør. Dannelse av RBC-agglutinater ble testet ved opptrekking av 2,6 ml buffer eller rekondisjonert BeneFIX®-protein i sprøyter, fulgt av 0,6 ml heparinisert blod. Agglutinatenes blandings-/sedimenteringsadferd ble observert i disse sprøyter over tid og registrert fotografisk ved anvendelse av digitalkamera.

[0111] Preparatet fra den aktuelle BeneFIX®-formulering før lyofilisering er rFIX, ca.10 mM histidin, ca.260 mM glycin, ca.1% sakkarose og ca.0,005% polysorbat-80, pH 6,8. BeneFIX®-formuleringen lyofiliseres og rekondisjoneres i sWFI før injeksjon. Opprinnelig hadde man mistanke om at sakkarosen var årsaken til agglutinasjon. Således ble testbuffere formulert med 1%, 0,5% eller 0% sakkarose. Hver sakkarose-testbuffer ble trukket opp i sprøyter, fulgt av en liten mengde heparinisert blod. Agglutinasjonen av RBC og påfølgende rask sedimentering ble funnet å være identisk for de tre buffere, noe som tydet på at sakkaroseinnholdet i BeneFIX®-formuleringen ikke forklarte den observerte agglutinasjon. BeneFIX® rekondisjonert i normal saltløsning, i stedet for i sterilt vann, forårsaket ingen agglutinasjon. Disse data indikerer at ionestyrken i BeneFIX®-formuleringen ikke er tilstrekkelig til å forhindre agglutinasjon når BeneFIX® rekondisjoneres i vann.

[0112] For å bestemme minimums-ionestyrken som trengtes for å fjerne agglutinasjon, ble BeneFIX® rekondisjonert (eller pre-lyofiliserings-formuleringen av BeneFIX® kan varieres til å innbefatte natriumklorid, selv om metoder for lyofilisering av natriumkloridformuleringer er vanskeligere sammenlignet med lyofilisering av formuleringer som ikke innbeholder natriumklorid) med løsninger med varierende konsentrasjoner av NaCl (0, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 og 137 mM). BeneFIX® ble også rekondisjonert i normal saltløsning inneholdende 154 mM NaCl. RBC-agglutinasjon og -sedimenteringsadferd ble undersøkt i alle disse løsninger. Tabell 9 viser osmolaliteten og ionestyrkene (uttrykt som konduktivitet) for noen av disse løsninger sammen med andre vanlige intravenøse løsninger. Ved tilsetning av natriumklorid til BeneFIX®-formuleringen, enten ved direkte tilsetning før lyofilisering eller ved rekondisjonering av et lyofilisat med en løsning av natriumklorid, vil det være forventet at NaCl fullstendig vil dissosieres til en ekvivalent konsentrasjon av Na<+>- og Cl--ioner. Således vil ionestyrken (uttrykt i mekv/l (milliekvivalenter/l) av Na<+ >og Cl-) av en formuleringsbuffer pluss NaCl være forutsett å være ekvivalent med NaCl-konsentrasjonen hvis formuleringsbufferen ikke inneholder andre ioner.

Tabell 9: Karakterisering av forskjellige løsninger

[0113] Ved kontakt mellom blod og løsningene i tabell 9 i sprøyter ble RBC-agglutinasjon individuelt observert, og deretter ble sprøytene forsiktig blandet og invertert for å observere bunnfelling av blodet. Agglutinatdannelse ble ikke observert i alle formuleringer av BeneFIX® rekondisjonert med minst ca.40 mM NaCl (bemerk i det foregående eksempel at ca.36 mM NaCl også var tilstrekkelig til å forhindre agglutinasjon). Blodcellers oppførsel i disse løsninger inneholdende minst 40 mM NaCl kunne ikke skjelnes fra oppførselen i normal saltløsning.

[0114] Blodsedimentering ble testet i en serie av sprøyter inneholdende BeneFIX®-formulering fortynnet (hvis pre-lyofilisering)/rekondisjonert (hvis lyofilisert) i minkende konsentrasjoner av NaCl (idet man startet med 40 mM) 15 minutter etter inversjon. Det var en konsekvent konsentrasjonsavhengig respons når det gjaldt agglutinatdannelse og påfølgende sedimenteringshastighet - økende agglutinasjon og hurtigere sedimentering med minkende konsentrasjon av NaCl i bufferen. Åpenbar agglutinasjon var synlig for én blodprøve i buffer inneholdende ≤ 25 mM NaCl og for en annen blodprøve i buffer inneholdende ≤ 30 mM NaCl. I alle bufferpreparater med ≥ 40 mM NaCl kunne blodcellers oppførsel ikke skjelnes fra oppførselen i normal saltløsning eller BeneFIX® rekondisjonert i normal saltløsning. BeneFIX® rekondisjonert med 40 mM NaCl svarer til en beregnet konduktivitet på 4 mS/cm.

[0115] 5% Dekstrose-injeksjonsløsningen, hvorav hver ml inneholder 50 mg vannholdig dekstrose USP i vann for injeksjon - har en beregnet osmolalitet på 250 mOsm/l og en beregnet ionestyrke på 0 mS/cm. Denne løsningen, som vanligvis administreres intravenøst, bevirket også RBC-agglutinasjon og meget rask blodsedimentering i likhet med den som ble observert med BeneFIX®-formulering rekondisjonert i vann.

[0116] Således indikerer disse resultater at RBC-agglutinasjon forårsaket av BeneFIX® rekondisjonert i vann skyldes BeneFIX®-formuleringens lave ionestyrke (0 mekv/l beregnet ionestyrke, <0,2 mS/cm målt konduktivitet). Dette problem kan korrigeres ved rekondisjonering i NaCl-løsninger som inneholder ≥ 40 mM NaCl slik at den rekondisjonerte løsning for injeksjon har en beregnet ionestyrke på ca.

40 mekv/l (den tilstrekkelige ionestyrke til å forhindre agglutinasjon kan også beregnes som en konduktivitet på ca.4 mS/cm eller høyere) eller høyere.

Claims

PATENTKRAV

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en Faktor IX formulering for intravenøs injeksjon,

k a r a k t e r i s e r t v e d at den omfatter tilsetning av en 36 mM til 44 mM natriumklorid-løsning til en lyofilisert Faktor IX formulering, noe som resulterer i en formulering fremstilt for intravenøs injeksjon, hvori den lyofiliserte formuleringen, hvis rekonstituert i vann, inneholder ikke mer enn 5 mM av et ioniserende salt, og hvor den fremstilte formulering er omtrent isotonisk i forhold til plasma, og har en osmolaritet som er fra 270 mOsm/L til 330 mOsm/L, eller er svakt hypotonisk hypotonisk med hensyn til plasma og har en osmolaritet som er fra 220 mOsm/L til 270 mOsm/L, eller svakt hypertonisk i forhold til plasma, og har en osmolaritet som er fra 330 mOsm/L til 600 mOsm/L og,

hvor den fremstilte formulering har en tilstrekkelig ionestyrke til å forhindre erytrocyttagglutinasjon etter intravenøs injeksjon.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,

k a r a k t e r i s e r t v e d at den fremstilte formulering har en ionestyrke på minst 40 mekv Na<+>- og Cl--ioner pr. liter.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,

k a r a k t e r i s e r t v e d at den fremstilte formulering har en ionestyrke, målt i konduktivitet, som er minst 2,5 mS/cm.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1,

k a r a k t e r i s e r t v e d at den fremstilte formulering har en ionestyrke, målt i konduktivitet, som er minst 4,0 mS/cm.

5. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 4,

k a r a k t e r i s e r t v e d at natriumkloridløsningen er 40 mM.

6. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helt av kravene 1-5,

k a r a k t e r i s e r t v e d at den lyofiliserte formulering, hvis rekondisjonert i vann, ikke inneholder mer enn 25 mM av et ioniserende salt.

7. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 6,

k a r a k t e r i s e r t v e d at den farmasøytiske formulering, før tilsetning av natriumkloridløsningen, omfatter histidin, glycin, sakkarose og polysorbat.

8. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 7,

k a r a k t e r i s e r t v e d at den farmasøytiske formulering, før tilsetning av natriumkloridløsningen, hvis rekondisjonert i vann, omfatter:

(a) fra 5 mM til 30 mM histidin;

(b) fra 0,1M til 0,3M glycin;

(c) fra 0,5 til 2 prosent sakkarose; og

(d) fra 0,001 til 0,05 prosent polysorbat.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8,

k a r a k t e r i s e r t v e d at den farmasøytiske formulering, før tilsetning av natriumkloridløsningen, hvis rekondisjonert i vann, videre omfatter:

(e) fra 50 IE/ml til 2000 IE/ml Faktor IX.