JP7221485B2 - ブリンシドフォビルの製剤 - Google Patents
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Description
本願は、以下の米国仮特許出願に基づく優先権およびその恩典を主張し、各米国仮特許出願の内容は、参照により、そのまま本明細書に組み入れられる: 2016年6月28日に出願された米国仮特許出願第62/355,844号、2016年9月14日に出願された米国仮特許出願第62/394,665号、2017年1月13日に出願された米国仮特許出願第62/446,213号、2017年2月28日に出願された米国仮特許出願第62/465,053号、2017年5月17日に出願された米国仮特許出願第62/507,397号および2017年5月31日に出願された米国仮特許出願第62/512,825号。
本開示は、ブリンシドフォビルを含む薬学的組成物(例えば凍結乾燥組成物および/または水性組成物)ならびにそれらの使用方法に関する。
本開示はブリンシドフォビルを含む組成物およびそれらを使用する方法を提示する。本組成物は長期保管用に(例えば粉末として)凍結乾燥することができる。凍結乾燥製剤は(例えばそれを必要とする対象への)静脈内(IV)投与のための生体適合性製剤として(例えば水性糖溶液に)再構成することができる。
ブリンシドフォビル、
増量剤、
緩衝剤、および
水
を含み、pHが約8.0である、薬学的組成物。
[本発明1002]
前記増量剤が、マンニトールまたはスクロースである、本発明1001の薬学的組成物。
[本発明1003]
前記増量剤が、マンニトールである、本発明1001の薬学的組成物。
[本発明1004]
前記緩衝剤が、リン酸ナトリウム、L-アルギニン、またはトロメタミンである、本発明1001の薬学的組成物。
[本発明1005]
前記緩衝剤が、L-アルギニンである、本発明1001の薬学的組成物。
[本発明1006]
前記ブリンシドフォビルが、約10.0mg/mLの濃度で存在する、本発明1001の薬学的組成物。
[本発明1007]
前記増量剤が、約2.5~9%(w/v)の濃度で存在する、本発明1001の薬学的組成物。
[本発明1008]
前記増量剤が、約2.5%(w/v)の濃度で存在する、本発明1001の薬学的組成物。
[本発明1009]
前記増量剤が、約5%(w/v)の濃度で存在する、本発明1001の薬学的組成物。
[本発明1010]
前記緩衝剤が、約100~200mMの濃度で存在する、本発明1001の薬学的組成物。
[本発明1011]
前記緩衝剤が、約100mMの濃度で存在する、本発明1001の薬学的組成物。
[本発明1012]
前記pHが、HClおよび/またはNaOHを用いて調節される、本発明1001の薬学的組成物。
[本発明1013]
約10.0mg/mLの濃度のブリンシドフォビル、
約25~50mg/mLの濃度のマンニトール、
約17.4mg/mLの濃度のL-アルギニン、および
水
を含み、pHが約8.0である、本発明1001の薬学的組成物。
[本発明1014]
約17.8mMの濃度のブリンシドフォビル、
約137.5~275mMの濃度のマンニトール、
約100mMの濃度のL-アルギニン、および
水
を含み、pHが約8.0である、本発明1001の薬学的組成物。
[本発明1015]
水を除去するために凍結乾燥される、本発明1001の薬学的組成物。
[本発明1016]
約13~19重量%のブリンシドフォビル、
約48~65重量%のマンニトール、および
約22~33重量%のアルギニン
を含む、凍結乾燥粉末。
[本発明1017]
pHが約8.0である、本発明1016の凍結乾燥粉末。
[本発明1018]
ブリンシドフォビル、
増量剤、
緩衝剤、および
水性糖アルコール溶液、水性糖溶液、リンゲル液、または塩化ナトリウム溶液
を含む、水性薬学的組成物。
[本発明1019]
前記水性糖溶液が、約5重量%のデキストロースを含む溶液である、本発明1018の薬学的組成物。
[本発明1020]
前記塩化ナトリウム溶液が、0.9重量%の塩化ナトリウムである、本発明1018の薬学的組成物。
[本発明1021]
約1.0mg/mLの濃度のブリンシドフォビル、
約2.5~5mg/mLの濃度のマンニトール
約1.74mg/mLの濃度のL-アルギニン、および
約50mg/mLの濃度のデキストロース
を含み、pHが約8.0である、本発明1018の水性薬学的組成物。
[本発明1022]
約1.78mMの濃度のブリンシドフォビル、
約13.75~27.5mMの濃度のマンニトール、
約10mMの濃度のL-アルギニン、および
約287mMの濃度のデキストロース
を含み、pHが約8.0である、本発明1018の水性薬学的組成物。
[本発明1023]
約0.5mg/mLの濃度のブリンシドフォビル、
約1.25~2.5mg/mLの濃度のマンニトール
約0.87mg/mLの濃度のL-アルギニン、および
約50mg/mLの濃度のデキストロース
を含み、pHが約8.0である、本発明1018の水性薬学的組成物。
[本発明1024]
約0.89mMの濃度のブリンシドフォビル、
約6.85~13.7mMの濃度のマンニトール、
約5mMの濃度のL-アルギニン、および
約287mMの濃度のデキストロース
を含み、pHが約8.0である、本発明1018の水性薬学的組成物。
[本発明1025]
前記水性糖アルコール溶液、水性糖溶液、リンゲル液、または水性塩化ナトリウム溶液の体積が、約100mLまたは約200mLである、本発明1018の薬学的組成物。
[本発明1026]
約100mgのブリンシドフォビル、
約250~500mgのマンニトール、
約174mgのアルギニン、
約5gのデキストロース、および
約100mLの水
を含み、pHが約8.0である、本発明1018の水性薬学的組成物。
[本発明1027]
約200mgのブリンシドフォビル、
約500~1000mgのマンニトール、
約348mgのアルギニン、
約10gのデキストロース、および
約200mLの水
を含み、pHが約8.0である、本発明1018の水性薬学的組成物。
[本発明1028]
約50mgのブリンシドフォビル、
約125~250mgのマンニトール、
約87mgのアルギニン、
約5gのデキストロース、および
約100mLの水
を含み、pHが約8.0である、本発明1018の水性薬学的組成物。
[本発明1029]
約100mgのブリンシドフォビル、
約250~500mgのマンニトール、
約174mgのアルギニン、
約10gのデキストロース、および
約200mLの水
を含み、pHが約8.0である、本発明1018の水性薬学的組成物。
[本発明1030]
前記ブリンシドフォビル、前記増量剤、および前記緩衝剤が、予め凍結乾燥されている、本発明1018の薬学的組成物。
[本発明1031]
静脈内投与に適している、本発明1018の薬学的組成物。
[本発明1032]
無菌である、本発明1018の薬学的組成物。
[本発明1033]
約0.5mg/mL~約1.0mg/mLの濃度のブリンシドフォビル、約2.5mg/mL~約5mg/mLの濃度の増量剤、約0.87mg/mL~約1.74mg/mLの濃度の緩衝剤、および約50mg/mLの濃度のデキストロースを含み、pHが約8.0である、静脈内投与用の水性薬学的組成物。
[本発明1034]
ウイルス感染を有する対象を処置する方法であって、その必要がある対象に有効量の本発明1018または1033の水性薬学的組成物を投与する工程を含む、前記方法。
[本発明1035]
前記ウイルス感染が、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、またはそれらの組合せから選択される、本発明1034の方法。
[本発明1036]
前記対象への投与が溶血をもたらさない、本発明1034の方法。
[本発明1037]
前記対象への投与が胃腸毒性をもたらさない、本発明1034の方法。
[本発明1038]
ウイルス感染を有する対象を処置する方法であって、約0.5mg/mL~約1.0mg/mLの濃度のブリンシドフォビル、約2.5mg/mL~約5mg/mLの濃度の増量剤、約0.87mg/mL~約1.74mg/mLの濃度の緩衝剤、および約50mg/mLの濃度のデキストロースを含み、pHが約8.0である静脈内投与用薬学的組成物を、該対象に投与する工程を含む、前記方法。
[本発明1039]
ある量のブリンシドフォビル、増量剤、および緩衝剤を水に溶解することで第1溶液を形成させる工程、
該第1溶液を凍結乾燥することで凍結乾燥粉末を形成させる工程、ならびに
該凍結乾燥粉末を水性糖アルコール溶液、水性糖溶液、リンゲル液、または塩化ナトリウム溶液に溶解することで薬学的製剤を形成させる工程
を含むプロセスによって調製される、ウイルス感染を処置するための水性薬学的製剤。
[本発明1040]
ウイルス感染を処置するための医薬の製造における、ブリンシドフォビル、増量剤、緩衝剤、および水性糖アルコール溶液または水性糖溶液を含む水性薬学的組成物の使用。
[本発明1041]
ウイルス感染の処置における、ブリンシドフォビル、増量剤、緩衝剤、および水性糖アルコール溶液または水性糖溶液を含む水性薬学的組成物の使用。
他の特徴および利点は当業者には明白になるであろう。また、下記の発明の詳細な説明でも、それらを示す。
本開示は、ブリンシドフォビルを含む薬学的組成物(例えば凍結乾燥組成物または水性組成物)およびそれらの使用方法に関係する。本開示は、本明細書に記載する再構成された凍結乾燥薬学的組成物を含む薬学的製剤にも関係する。本組成物および製剤は静脈内投与用であることができる。いくつかの態様において、本開示の組成物または製剤のIV投与は溶血をもたらさない。本製剤は、例えば基礎疾患ゆえに、または不十分な経口吸収ゆえに、薬物の経口投与が可能でないか、実質的に不可能な場合にも、使用することができる。
凍結乾燥前製剤
いくつかの態様において、ブリンシドフォビルは凍結乾燥(例えば冷凍乾燥)に先だって水に溶解される。ブリンシドフォビルは、例えば増量剤および緩衝剤などと共に溶解することができる。構成成分の溶解は別々にまたは同時に行うことができ、任意の順序で行うことができる。
凍結乾燥前製剤を凍結乾燥することで、BCV、増量剤および緩衝剤の凍結乾燥製剤(例えば粉末)を生産することができる。凍結乾燥製剤は、長期間にわたって安定であることができ、患者への投与に先だって再構成することができる。いくつかの態様において、凍結乾燥製剤は無菌である。
上で議論した凍結乾燥粉末は、患者へのIV投与に先だって、例えば水などの水性溶媒への溶解によって、再構成することができる。いくつかの態様において、水性溶媒は糖アルコールまたは糖(例えばデキストロース)を含有する水である。いくつかの態様において、水性溶媒は5%デキストロース水溶液である。水性溶媒もまた、(例えば無菌凍結乾燥製剤のように)無菌であることができ、それを必要とする患者への投与に適しうる。いくつかの態様において、本開示の凍結乾燥粉末の再構成は本開示の水性組成物を与える。
ブリンシドフォビル、緩衝剤および増量剤に加えて、本開示の薬学的組成物は、追加の薬学的に許容される担体を含有することができる。そのような薬学的に許容される担体には、所望する特定の剤形に応じて、ありとあらゆる溶媒、希釈剤、または他の液状媒体、分散助剤もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張化剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、固形結合剤、潤滑剤などを含めることができる。「Remington's Pharmaceutical Sciences」第16版、E.W.Martin(Mack Publishing Co、ペンシルバニア州イーストン、1980)には、薬学的組成物の製剤化に使用されるさまざまな担体およびそれらを調製するための公知の技法が開示されている。従来の担体媒質は、それが、例えば何らかの望ましくない生物学的効果を生むことまたは薬学的組成物の他の任意の構成成分と他の形で有害な相互作用をすることなどによって、活性化合物(すなわちブリンシドフォビル)と不適合でない限り、いずれも、その使用は本開示の範囲内にあると考えられる。薬学的に許容される担体として役立ちうる材料のいくつかの例として、ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖;トウモロコシデンプンおよびバレイショデンプンなどのデンプン;セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース;粉末状トラガント;麦芽;ゼラチン;タルク;カカオ脂および坐剤ワックスなどの賦形剤;ラッカセイ油、綿実油などの油;サフラワー油、ゴマ油;オリーブ油;トウモロコシ油およびダイズ油;グリコール;例えばプロピレングリコール;オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル;寒天;水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝化剤;アルギン酸;パイロジェンフリー水;等張食塩水;リンゲル液;エチルアルコールおよびリン酸緩衝剤溶液、ならびに他の非毒性適合性潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムが挙げられるが、それらに限定されるわけではなく、製剤者の判断に応じて、着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味料、香味剤および芳香剤、保存剤および酸化防止剤も、組成物中に存在することができる。
いくつかの態様において、本開示は、ウイルス感染を有する対象を処置する方法であって、対象に本開示の組成物を投与する工程を含む、方法を提供する。いくつかの態様において、本開示の組成物は、対象に静脈内投与される。
いくつかの態様において、本開示の組成物の投与は溶血をもたらさない。いくつかの態様において、本開示の組成物の投与は胃腸毒性をもたらさない。
いくつかの態様において、処置されるウイルス感染は、ポリオーマウイルス(BK、ジョン・カニングハム(John Cunningham)ウイルス(JCV)、メルケル細胞ウイルス(MCV)、KIポリオーマウイルス(KIV)、WUポリオーマウイルス(WUV)、シミアンウイルス40(SV40)を含む)、パピローマウイルス(ヒトパピローマウイルス、ワタオウサギパピローマウイルス、ウマパピローマウイルスおよびウシパピローマウイルスを含む)、ヘルペスウイルス(例えば単純ヘルペスウイルス)、アデノウイルス、エプスタイン・バー・ウイルス(EBV)、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)またはそれらの組合せから選択される。
いくつかの態様において、本開示の製剤(例えばIV製剤)は、BCV約1mg~1000mgの用量で投与される。例えば製剤は、BCV約10mg~200mgの用量で投与することができる。いくつかの態様において、IV製剤は、約5mg、約10mg、約15mg、約20mg、約25mg、約30mg、約35mg、約40mg、約45mg、約50mg、約55mg、約60mg、約65mg、約70mg、約75mg、約80mg、約85mg、約90mg、約95mg、約100 約105mg、約110mg、約115mg、約120mg、約125mg、約130mg、約135mg、約140mg、約145mg、約150mg、約155mg、約160mg、約165mg、約170mg、約175mg、約180mg、約185mg、約190mg、約195mg、または約200mgのBCVで投与することができる。
本明細書に記載する態様の理解を促進するために、好ましい態様と特別な術語への言及を使ってそれらを説明する。本明細書において使用される専門用語には、特定の態様を説明するという目的しかなく、本発明の範囲を限定する意図はない。この開示の全体を通して使用される単数形「a」、「an」および「the」は、文脈上そうでないことが明らかである場合を除き、複数の指示対象を包含する。したがって、例えば「組成物」(a composition)への言及は、単一の組成物だけでなく、複数のそのような組成物も包含し、「治療剤」(a therapeutic agent)または「活性化合物」(an active compound)への言及は、1種または複数種の治療剤および/または薬剤(例えばブリンシドフォビル)ならびに当業者に公知のそれらの等価物への言及である。本明細書において使用される百分率および比はすべて、別段の表示がある場合を除き、重量による。
シドフォビル(CDV)の脂質コンジュゲートであるブリンシドフォビル(CMX001、BCV)は、高いアンメットメディカルニーズがある二本鎖DNAウイルスが引き起こす感染および疾患の防止および処置に使用することができる。本開示は、ブリンシドフォビルのIV製剤を、経口薬を服用することができない患者にBCVを送達する方法としてだけでなく、経口投与で観察される有害GI事象を潜在的に低減または回避するための方法としても、教示する。
ならびにその薬学的に許容される任意の塩を包含すると理解される。下記の例の一部では、ブリンシドフォビルを「試験物質」(test item)という。
いくつかの態様において、ブリンシドフォビルは、水性条件下で(例えば酸性pHにおいて)脱アミノ化されて、対応するウラシル誘導体を生成することができる。その脱アミノ化生成物を以下に示す。
実施例4に示すとおり、緩衝剤としてアルギニンを含み、増量剤としてマンニトールを含む凍結乾燥前製剤は、白色の均一な固形物を与え、凍結乾燥時のメルトバックはごくわずかしかない。さらに、緩衝剤としてアルギニンを含み、増量剤としてマンニトールを含む凍結乾燥前製剤から得られる凍結乾燥製品は、試験した他の製剤とは対照的に、再構成時に、わずかな泡立ちしか示さなかった。例えば、緩衝剤としてリン酸ナトリウムまたはpH調節水を含む製剤は再構成時に泡立ちを示し、泡が消失するまでに一般的には数分(例えば30分超)を要した。同様に、増量剤としてスクロースを含む製剤も再構成時に泡立ちを呈することが見いだされ、泡が消失するまでに一般的には数分(例えば30分超)を要した。
実施例1に示すとおり、20%メタノールを含有するpH6.0~8.0の50mMリン酸緩衝液中のブリンシドフォビル試料原液(50μg/mL)を2~8℃で保管したところ、pH7.0以下の試料については、沈殿が観察された。しかし、それより高いpH(例えばpH=7.5およびpH=8.0)で調製された試料は、この実験の時間経過の全体を通して、外観に観察しうる変化を示さなかった(例えば沈殿は観察されなかった)。40℃で保管した試料については、どのpHの試料についても、外観の物理的変化は観察されず、40℃では試験したpH条件のいずれについても、ブリンシドフォビル濃度の変動はごくわずかしか観察されなかった。
いくつかの態様において、溶血を引き起こさないこと(すなわち赤血球を破壊しないこと)は、薬物(例えば静脈内投与用薬物)にとって有利である。
ラットにおけるBCVに関する最大耐用量および7日間用量範囲探索研究(DRF)を、実施例8に提示する。提示した結果は、ラットにおける急性範囲探索研究を詳述している。いくつかの態様において、このデータは、さらなる毒性研究において投与すべき用量を合理的に設定することを可能にするための情報を生成させるために使用することができる。
ラットへの静脈内注入(2時間)に続いてブリンシドフォビルの最大耐用量(MTD)を決定するために、第1相を計画した。第1相は、一般にBCVへの曝露から48±時間の期間内に全身の臨床徴候に現れうるあらゆる急性毒性(例えば「毒性症候群」(toxic syndrome))を評価するための単回用量漸増アームを包含した。理論に束縛されることは望まないが、この用量漸増アームでは、過量の明白な徴候または症状を、すべて同定することができる。
ブリンシドフォビルの毒性ならびにブリンシドフォビルおよびその代謝産物の一つであるシドフォビルの血漿毒物動態学的プロファイルを評価するために、反復用量範囲探索(DRF)相(第II相)である第2相を計画した。動物およびヒトに静脈内投与された場合、シドフォビルが腎毒性の原因になることは公知である。1日目、3日目、および7日目に静脈内注入(2時間)によって投与された2つの用量レベル(1mg/kgおよび15mg/kg)のブリンシドフォビルの最初と最後の投薬に続いて、毒物動態学的パラメータを評価した。
この研究の第2相において、ブリンシドフォビルのピーク濃度は、一般に、2時間IV注入の終了時に観察され、急速に減少した。一般に、平均ブリンシドフォビルCmaxおよび平均ブリンシドフォビルAUCは、1mg/kgから15mg/kgへの用量の増加にほぼ比例して増加した。ただし、1mg/kg投与後は、わずかな濃度値でAUCが決定された。7日目のブリンシドフォビルCmax値およびブリンシドフォビルAUClast値は、1日目と比較して7日目では値が低くなる傾向を示した(7日目/1日目蓄積比(AR)が0.44~0.54)。さらに、ブリンシドフォビルTKパラメータに性差は観察されなかった。理論に束縛されることは望まないが、代謝産物シドフォビルへの曝露は、ブリンシドフォビル用量の増加に比例するほどには増加せず、TKパラメータに明白な性差も、反復投与後のTKパラメータの変化もなかった。この研究の条件下では、1日目、4日目および7日目の2時間IV注入による1mg/kgまたは15mg/kgブリンシドフォビルの単回投薬は、十分に忍容された。
ラットにおけるIV BCVによる反復投与亜慢性研究を実施例10に詳述する。理論に束縛されることは望まないが、この研究では、ある範囲の用量で投与されたブリンシドフォビルの蓄積生物学的効果(例えば臨床、マクロおよびミクロ)を調査する。効果は、標的器官、効果の性質など、定性的である場合も、効果が観察される血漿中レベルまたは組織中レベルなど、定量的である場合もある。この研究では毒性および回復または進行の可能性を明らかにすることができる。
[14C]ブリンシドフォビルの単回静脈内(IV、2時間注入)投与または経口(PO、胃管法)投与の施行に続いて、雄Sprague Dawley(SD)ラットおよびLong-Evans(LE)ラットにおける総放射能の組織分布を特徴づける研究を行った。加えて、[14C]ブリンシドフォビルの単回静脈内(IV、2時間注入)投与に続く雄Sprague Dawleyラットにおける総放射能の排泄の速度および程度(物質収支)ならびに薬物動態(PK)を検査した。
IV投与後の排泄
雄SDラットにおいて、15mg/kgでの[14C]ブリンシドフォビルの2時間IV注入後の放射能排出の主要経路は尿中であり、これは、168時間の収集期間で、投与した用量の平均51.2%を占めた。投与した用量の平均42.2%が糞便中に回収された。第1群雄ラットにおける尿と糞便を合わせた放射能の総回収率は、168時間の収集期間で、用量の平均93.5%であった。放射能の尿中排泄および糞便中排泄の大半(約86%)は、投与後最初の24時間に起こった。
15mg/kgでの雄SDラットへの2時間IV注入投与(第2群)後の血漿における[14C]ブリンシドフォビル総放射能のCmaxは10.3μg当量/mLであって、これは2時間のTmax(すなわち注入の終了時)に起こり、濃度は投与後72時間で0.045μg当量/mLまで減少した。[14C]ブリンシドフォビル総放射能のAUClastは64.4μg当量・時間/mL、t1/2は13.0時間であった。
15mg/kgでの雄LEラットへのPO投与後の血漿における[14C]ブリンシドフォビル総放射能のCmaxは、8時間のTmaxにおいて、1.5μg当量/mLであり、濃度は投与後24時間で0.180μg当量/mLまで減少した。[14C]ブリンシドフォビル総放射能のAUClastは21.0μg当量・時間/mLであり、データポイントが不十分なため、t1/2は決定することができなかった。
Long-EvansラットおよびSprague-Dawleyラットへの[14C]ブリンシドフォビルの2時間静脈内注入または経口胃管法後に、AUCall血液対血漿比は1.1~1.4の範囲にあった。個々の時点については、血液対血漿比は0.64から1.5の範囲にあり、中央値は1.00であった。理論に束縛されることは望まないが、どちらの投与経路後でも、血液と血漿の間の放射能の分布が類似していることから、血漿から血球への[14C]ブリンシドフォビルの分布の制約はごくわずかであることが示された。
非有色組織と有色組織との間で放射能の組織分布を比較したところ、有色組織(すなわち眼ぶどう膜系および有色皮膚)における濃度は、非有色組織に観察される濃度と類似していることが明らかになったことから、[14C]ブリンシドフォビル薬物由来放射能とメラニンとの特異的な結びつきはないことが示唆された。
下記実施例11に示すとおり、ブリンシドフォビルを健常対象に経口および静脈内の両方で投与した。IVブリンシドフォビル投与は、10mgで、経口投与された100mgのブリンシドフォビルと類似する曝露を与えることがわかった。したがって本開示は、ブリンシドフォビルの静脈内投与を教示する。いくつかの態様において、ブリンシドフォビルのIV投与時に、薬物関連有害事象(例えば胃腸事象)は観察されない。いくつかの態様では、段階的検査異常(graded lab abnormalities)(例えば溶血毒性および腎毒性)が観察されない。
この項には、全体を通してよく使用されうる用語および概念の略号および定義を掲載する。
AUC 時間-濃度曲線下面積
AUCall すべての時点を含む時間-濃度曲線下面積
AUCinf_obs 観測値を無限大に外挿した時間-濃度曲線下面積
AUClast 定量下限を上回るデータを持つ最後の時点を含む時間-濃度曲線下面積
BQL 定量限界未満
℃ 摂氏度
c(BCV) 液状製剤または水性製剤におけるブリンシドフォビルの濃度
c(増量剤) 液状製剤または水性製剤における増量剤の濃度
ca Circa(およそ)
Cmax 観測された最大濃度
cpm カウント毎分
%CV パーセント変動係数
DMA N,N-ジメチルアセトアミド
dpm 壊変毎分
EDTA エデト酸二ナトリウム
FVC カニューレが挿入された大腿静脈
g グラム
h 時間
HPLC 高速液体クロマトグラフィー
HPbCD ヒドロキシプロピルベータ-シクロデキストリン
IV 静脈内
kg キログラム
L リットル
LE Long-Evans
LLOQ 定量下限
LSC 液体シンチレーション計数
MB 物質収支
MBq メガベクレル
mCi/mmol ミリキュリー/ミリモル
MCID MicroComputer Image Device
MDC Molecular Dynamicsカウント
mg ミリグラム
mSv ミリシーベルト
μg equiv/g マイクログラム当量/グラム組織
min 分
mL ミリリットル
mm ミリメートル
n 観測数
NA 該当なし(Not Applicable)
NI 同定せず(Not Identified)
NC 算出せず(Not Calculated)
NS 試料採取せず(Not Sampled)
NMP N-メチル-2-ピロリドン
PEG ポリエチレングリコール
PG プロピレングリコール
PK 薬物動態
PO per os(経口投与)
ROA 投与経路
SD Sprague Dawleyまたは標準偏差
t1/2 最終排出半減期
Tmax Cmaxの時刻
ULOQ 定量上限
QWBA 定量的全身オートラジオグラフィー
ブリンシドフォビルの静脈内投与用製剤を開発するために、さまざまな素の(plain)液状製剤(すなわち凍結乾燥前製剤またはバルク製剤)を調製し、試験した。
媒体および製剤の調製:ブリンシドフォビル製剤用の媒体を、有機賦形剤、5×リン酸ナトリウム緩衝液保存物(pH6.0、6.5、7.0、7.5および8.0)ならびに等張化剤およびEDTAの保存溶液から調製した。固形ブリンシドフォビルを媒体に溶解してc(BCV)=6.4mg/mLの濃度を得た。外観(2~8℃で保管したときの沈殿を含む)を評価し、pHを測定した。この研究の結果を表1に要約する。
1製剤は周囲温度で調製し、1日目の時点までは周囲温度に保った。1日目に溶血アッセイを実行した後、試料を2~8℃で保管した。2N:沈殿は観察されなかった。3Y:沈殿が観察された。4N/A:該当なしまたは測定せず
100mMリン酸および69mMデキストロースを含む製剤媒体(媒体/製剤#57)を調製し、a)平衡溶解度およびb)濾過性に関してさらに試験した。
媒体#57の2つの試料をブリンシドフォビルで飽和させた。一方の試料媒体は、さらなるpH調節を行わずにブリンシドフォビルで飽和させ(これにより製剤pHは6.9になる)、もう一つの試料のpHは水酸化ナトリウム溶液(1N)を使ってpH=8.0に再調節した。ブリンシドフォビルを溶解するとpHは低pH値に向かってドリフトし、次にそれが、ブリンシドフォビル溶解度を平衡に達するまで変化させた。結果として、さらにブリンシドフォビルを加えるには、pHを目標pHに近づける必要があった。pH調節した試料では、平衡溶解度条件でのブリンシドフォビルの濃度に到達しなかった。試料に約300mg/mLの追加ブリンシドフォビル固体を補足した後、固形ブリンシドフォビルの添加を停止した。
製剤#57の濾過性をc(BCV)=20、10および0.5mg/mLで試験した。c(BCV)=20mg/mLの試験溶液はNaOH溶液(1N)を使ってpH=8.0に調節し、D5Wによる希釈でそれより濃度の低い試験溶液を調製するために、保存溶液として応用した。試験溶液をシリンジフィルタ(25mm、0.2μm PESメンブレン)で濾過した(フィルタ通過量(filter pass)5mL)。濾過の容易さを観察し、pHおよびブリンシドフォビル回収率(HPLCアッセイ)を、濾過前段階および濾過後段階で記録した。有意なpHの変化、ブリンシドフォビルの損失または不純物の導入は、いずれも観察されなかった(表4)。
ブリンシドフォビル製剤を調製するための配合プロセスを開発し、等張化剤(デキストロース)非含有製剤について指定した。安定性研究および試験のために、以下のブリンシドフォビル製剤を最大0.5Lのスケールで調製した。
10mg/mLブリンシドフォビル、200mMリン酸ナトリウム、pH=8.0、69mMデキストロース
15mg/mLブリンシドフォビル、200mMリン酸ナトリウム、pH=8.0、69mMデキストロース
10mg/mLブリンシドフォビル、200mMリン酸ナトリウム、pH=8.0(等張化剤非含有)
等張化剤としてデキストロースを含有するブリンシドフォビル製剤を、安定性研究Iおよび注入媒体適合性評価に適用した。対応する製剤調製の概略は以下のとおりである。
1.対応するリン酸ナトリウム種をDI水にメスフラスコを使って溶解することにより、500mM(2.5×)一塩基性リン酸ナトリウム溶液および500mM(2.5×)二塩基性リン酸ナトリウム溶液を調製した。
2. pHを制御しながら500mM(2.5×)の一塩基性リン酸ナトリウム溶液と二塩基性リン酸ナトリウム溶液とを混合することで、pH=8.0の500mM(2.5×)リン酸ナトリウム緩衝剤溶液を調製した。
3.固形デキストロースをpH=8.0の500mM(2.5×)リン酸ナトリウム溶液に溶解し、適量の水を用いて、400mM(2×)リン酸ナトリウム、138mM(2×)デキストロース、pH=8.0の媒体保存溶液を調製した。
4.ブリンシドフォビルを、媒体保存溶液(400mM(2×)リン酸ナトリウム、138mM(2×)デキストロース溶液、pH=8.0)に、所望の最終濃度の2倍になるように、メスフラスコを使って溶解した。pHを制御しながら、水酸化ナトリウム溶液を加えることで、溶液をpH=8.0に調節した。適量のDI水を用いて、pH=8.0の、200mM(1×)リン酸ナトリウム、69mM(1×)デキストロースを含有する、所望のブリンシドフォビル濃度の製剤を得た。
安定性研究IIならびに吸着評価および材料適合性評価に関連する実験の大部分には、デキストロースを欠くブリンシドフォビル製剤を適用した。等張化剤非含有製剤は次のように調製した。
1.対応するリン酸ナトリウム種を水に溶解すること(メスフラスコ)によって、400mM(2×)一塩基性リン酸ナトリウム溶液および400mM(2×)二塩基性リン酸ナトリウム溶液を調製した。
2. pHを制御しながら400mM(2×)の一塩基性リン酸ナトリウム溶液と二塩基性リン酸ナトリウム溶液とを混合することで、pH=8.0の400mM(2.5×)リン酸ナトリウム緩衝剤溶液(媒体溶液)を調製した。
3.ブリンシドフォビルを、媒体溶液(pH=8.0の400mM(2×)リン酸ナトリウム)に、所望の最終濃度の2倍になるように、500mLメスフラスコを使って溶解した。1N水酸化ナトリウム溶液をVNaOH[mL]=1.65×mBCV[g]の体積で加えた。適量のDI水を用いて、pH=8.0の200mMリン酸ナトリウム緩衝剤中に所望のブリンシドフォビル濃度の製剤を得た。
4.より低いブリンシドフォビル濃度を調製するために、調製した製剤を対応する媒体で所望の強度まで希釈した。
計画およびセットアップ:この研究では、製剤57の化学的安定性および物理的安定性を評価した。化学的分解の試験は、加速因子/ストレス因子として熱を適用する加速安定性研究セットアップにおいて行った。アレニウス分析を実行して、より低温でのAPI半減期および分解速度を得た。物理的安定性は所望の保管温度(2~8℃)で評価し、ベンチマーク/リファレンス条件も、同様に研究に含めた。この研究のセットアップを以下に指定する。
試験溶液:
10mg/mLブリンシドフォビル、200mMリン酸ナトリウム、69mMデキストロース、pH=8.0、
15mg/mLブリンシドフォビル、200mMリン酸ナトリウム、69mMデキストロース、pH=8.0、
媒体対照1: 200mMリン酸ナトリウム、69mMデキストロース、pH=8.0(75℃のみ)、
媒体対照2: 200mMリン酸ナトリウム、pH=8.0(75℃のみ)。
安定性試験ステーション温度:
加速安定性研究: 50℃、60℃、65℃、70℃、75℃、
物理的分解およびベンチマーク安定性研究: 2~8℃、25℃。
時点:
加速安定性研究: 初期、2日、6日、9日、14日、
物理的分解およびベンチマーク安定性研究:初期、14日および28日、
媒体対照:初期、1日、5日、8日および14日。
試験:
ブリンシドフォビル製剤:外観、pH、c(BCV)回収率(HPLC)、純度(HPLC)および液中粒子計数(物理的分解およびベンチマーク安定性研究)、
媒体対照:外観およびpH。
1溶液の黄色は0~10の尺度で表した(0、無色;5、暗黄色;10、黄褐色)。23つの複製物の平均値。3BCV回収率=c(BCV)n日目/c(BCV)0日目×100%。
1溶液の黄色は0~10の尺度で表した(0、無色;5、暗黄色;10、黄褐色)。23つの複製物の平均値。3BCV回収率=c(BCV)n日目/c(BCV)0日目×100%。初期時点を100%と定義した。
両被験製剤に関する物理的/ベンチマーク安定性の結果を、それぞれ表11および表12に要約する。研究中に異なる温度および異なる時点で得られたクロマトグラムを比較することによって、異なる温度における製剤の純度を決定した。1ヶ月で6%(2~8℃)および8%(25℃)の分解が観察されたが、その間、ブリンシドフォビルの純度は99%のままであった。これは、ブリンシドフォビルの質量欠損(mass deficit)を示す。
13つの複製物の平均値。2積分領域: 2.00~13.00分。3BCV回収率=c(BCV)n日目/c(BCV)0日目×100%。初期時点を100%と定義した。
13つの複製物の平均値。2積分領域: 2.00~13.00分。3BCV回収率=c(BCV)n日目/c(BCV)0日目×100%。初期時点を100%と定義した。
計画およびセットアップ:液状ブリンシドフォビル製剤の化学的および物理的分解特性を評価するために計画された安定性研究Iを、デキストロースの非存在下で繰り返した。溶液の変色(潜在的メイラード褐変)およびpHシフトはデキストロースの存在と相関する可能性があり、それが、ブリンシドフォビル分解に関して、分解経路に影響を及ぼし、観察された分解速度を損なったかもしれない。この反復分析のための研究セットアップでは、被験製剤および安定性試験ステーションパラメータに関して変更を加えた。厳密なパラメータを以下に指定する。
試験溶液:
15mg/mLブリンシドフォビル、200mMリン酸ナトリウム、pH=8.0、
媒体対照1: 200mMリン酸ナトリウム、pH=8.0。
安定性試験ステーション温度:
加速安定性研究: 50℃、60℃、70℃および75℃
物理的分解およびベンチマーク安定性研究: 2~8℃および25℃。
時点:
加速安定性研究:初期、3日、6日、10日、14日、
物理的分解およびベンチマーク安定性研究:初期、14日および28日、
試験:
ブリンシドフォビル製剤:外観、pH、c(BCV)回収率(HPLC)、純度(HPLC)および液中粒子計数(物理的分解およびベンチマーク安定性研究試料のみ)、
媒体対照:外観、pHおよび液中粒子計数(物理的分解およびベンチマーク安定性研究試料のみ)。
a3つの複製物の平均値。b積分領域: 0.00~13.00分。cこの時点のデータは乾燥機の故障によって損なわれていたので、以下のグラフ表現または計算には含めなかった。
研究対象の製剤および媒体対照に関する物理的/ベンチマーク安定性の結果を、それぞれ表13および表14に要約する。
13つの複製物の平均値。3BCV回収率=c(BCV)n日目/c(BCV)0日目×100%。初期時点を100%と定義した。
計画およびセットアップ:バイアルおよび/またはストッパーへのブリンシドフォビルの吸着について試験するために、ブリンシドフォビルに関する吸着評価を行った。そのために、影響があるかもしれないさまざまな保管条件(例えばバイアルの向き)を評価した。ブリンシドフォビルの溶液を製剤強度(10mg/mL)および低濃度(0.2mg/mL)で研究した。
1処理を受けた試料の3つの複製物の平均値。2BCV回収率=c(BCV)n日目/c(BCV)0日目×100%。初期時点を100%と定義した。BCV回収率は、処理ありの試料および処理なしの試料について、初期時点を100.00%と定義した。3処理なしの試料については該当なし。4初期時点の試料はどの条件にも付さなかった。
a処理を受けた試料の3つの複製物の平均値。bBCV回収率=c(BCV)n日目/c(BCV)0日目×100%。初期時点を100%と定義した。BCV回収率は、処理ありの試料および処理なしの試料について、初期時点を100.00%と定義した。c初期時点の試料はどの条件にも付さなかった。
一連の材料を製剤との適合性について試験した。これには、製造段階、前臨床毒性材料学および臨床試験からの材料を試験することが含まれる。適用された適合性試験では、1)吸着または沈殿によるブリンシドフォビルの潜在的損失(外観、HPLCによるブリンシドフォビル回収率)および2)安定性を損ないうるpHのシフトを評価する。試験した材料には、注入媒体、滅菌用フィルタ、製品バイアルおよびストッパー、試験動物(ラット)のための注入システムならびに臨床応用のための注入バッグおよびIVシステムが含まれる。
本開示の製剤を滅菌フィルタ適合性について評価した。試験ブリンシドフォビル製剤のアリコートを、以下のように、対応するシリンジフィルタで濾過した。
A: フィルタ: 0.2μm、25mm、シリンジフィルタ、Supor(登録商標)メンブレン(PES)、無菌;試験溶液: 10mg/mLブリンシドフォビル、200mMリン酸ナトリウム、pH=8.0;試験体積: 10mL。
B: フィルタ: 0.2μm、25mm、シリンジフィルタ、Posidyne(登録商標)メンブレン、無菌;試験溶液: 10mg/mLブリンシドフォビル、200mMリン酸ナトリウム、pH=8.0;試験体積: 10mL。
C: フィルタ: 0.22μm、33mm、シリンジフィルタ、Durapore(登録商標)PVDFメンブレン、γ線照射品;試験溶液: 2mg/mLブリンシドフォビル、4mMリン酸ナトリウム、pH=約8、およそ5%のデキストロース(5%デキストロース溶液を含む、10mg/mLブリンシドフォビル、200mMリン酸ナトリウム、pH=8.0の50倍希釈液);試験体積: 50mL。
本開示の製剤を滅菌フィルタ適合性について評価した。試験製剤(5mL、10mg/mLブリンシドフォビル、200mMリン酸ナトリウム、pH=8.0)を、一組のAfton滅菌Ready-To-Fill(登録商標)バイアルに分注した。バイアルにWest NovaPure(登録商標)ストッパーで栓をして、Afton Ready-To-Fill(登録商標)滅菌シールでクリンプし、上向きおよび下向きに周囲条件で6時間保管した。充填溶液の試料を充填前およびそれぞれの条件下で6時間保管した後に収集した。収集した試料をそれぞれの外観、pHおよびc(BCV)について評価した。試験したバイアルおよびストッパーと6時間接触した後の被験製剤について、外観、pHまたはc(BCV)に有意な変化は観察されなかった。接触に続いて新たな不純物が導入されることはなかった。
注入システムアセンブリ(ラット)
以下のブリンシドフォビル製剤の、ラットへの投与のための注入システムアセンブリ(シリンジ、テザー、カテーテルおよびシリンジポンプからなる)との適合性を試験した。
a)0.2mg/mLブリンシドフォビル、4mMリン酸ナトリウム、pH=約8.0、およそ4.90%のデキストロース、
b)1.5mg/mLブリンシドフォビル、30mMリン酸ナトリウム、pH=約8.0、およそ4.25%のデキストロース。
1. バルク試験溶液(0.2mg/mL BCV、4mMリン酸ナトリウム、pH=約8.0、およそ4.90%のデキストロースおよび1.5mg/mL BCV、30mMリン酸ナトリウム、pH=約8.0、およそ4.25%のデキストロース)の外観、pHおよびc(BCV)を接触前に評価した。
2. およそ5mLの試験溶液をシリンジに吸い込んでから、そのシリンジを、組み立てられた注入システム(Vascular Access Harness(VAH)テザーキット、ラットジャケット用VAHポートおよびカテーテル)に接続した。
3. 注入システムに、手動で試験溶液を充填した。およそ200μLの試験溶液を注入システムから押し出し、外観およびc(BCV)の評価のために、ライン端(end-of-line)試料として収集した(t0)。
4. 試験注入システムのシリンジをシリンジポンプにマウントし、2.4mLの総吐出体積に対して流速を1.2mL/時(20μL/分)に設定した(120分)。
5. 実験の間、フロースルー全体を収集した。各時点(t10min、t105min)において、ライン端試料(およそ200μL)を分析のために収集した。
6. バルクフロースルーのpHは実験の最後(t120min)に測定した。それ以前の時点で取得した試料の体積(200μL)は標準的なpH測定にとっては小さすぎたからである。
この研究の結果を表21に要約する。
a3つの複製物の平均値。bBCV回収率=c(BCV)n分目/c(BCV)接触前×100%、接触前試料を100%と定義した。n.a.:データなしまたは該当なし。
注入バッグ適合性
標準的ミニ注入バッグ(100mL)を以下の製剤との材料適合性試験に付した。
15mg/mLブリンシドフォビル、200mMリン酸ナトリウム、pH=8.0。
注入バッグへの希釈後の被験製剤強度はおよそ次のとおりである:
0.1mg/mLブリンシドフォビル、5.3mMリン酸ナトリウム、pH≒8.0(5%デキストロース中)、
1.0mg/mLブリンシドフォビル、13.3mMリン酸ナトリウム、pH≒8.0(5%デキストロース中)。
試験臨床注入バッグを以下のとおり指定する。
注射用5%デキストロース(USP)、100mL VIAFLEX注入バッグ。
2種の注入システム(2つのインターリンク(INTERLINK)インジェクションサイト、雄ルアーロック(Luer-lok)アダプタを持つBaxter Non-DEHP CONTINUO-FLO溶液セット、および15ミクロンフィルタ、1つの非無針(non needle free)インジェクションサイトを持つBrown Rate Flow(登録商標)レギュレーターIVセット)を、以下の製剤との適合性について試験した。
15mg/mLブリンシドフォビル、200mMリン酸ナトリウム、pH=8.0。
注入バッグへの希釈後の被験製剤強度はおよそ次のとおりである:
0.1mg/mLブリンシドフォビル、5.3mMリン酸ナトリウム、pH=約8.0(5%デキストロース中)、1.0mg/mLブリンシドフォビル、13.3mMリン酸ナトリウム、pH=約8.0(5%デキストロース中)。
1. 開発されたブリンシドフォビル製剤(15mg/mLブリンシドフォビル、200mMリン酸ナトリウム、pH8.0)を、上述の注入バッグ(リザーバ機能)に注入することで、c(BCV)=0.1mg/mLまたは1.0mg/mLの試験溶液を得た。c(BCV)(t24h, バッグ)の評価のために、試料を注入バッグから収集した。
2. 注入バッグを周囲温度で24時間インキュベート(「熟成」)してから、評価(外観、pH、c(BCV))のために、別の試料(t0, バッグ)を注入バッグから収集した。
3. 被験注入システムを注入バッグに取り付け、手動で注入バッグから溶液を充填した。分析のためにおよそ1mL(3つ一組)の試験溶液をライン端(end-of-line)試料として収集した(t0, eol)。
4. 試験注入システムを閉じ、周囲温度で次の時点まで保管した。およそ17mLの試験溶液(注入システムの体積)を排液してから、もう一つのライン端試料(1mL、3つ一組)を分析のために収集した(t10min, eol、t3h, eolおよびt6h, eol)。
凍結乾燥前製剤を下記表24に示すとおり調製し、凍結乾燥プロセスに付した。
DSC分析によって判明したパラメータを含むブリンシドフォビル製剤の凍結乾燥に、確率された凍結乾燥サイクルを適用した(表28参照)。このサイクルは、凍結工程、アニーリング工程、一次乾燥工程、および二次乾燥工程から構成された。例示的な凍結乾燥サイクルにおける設定温度、ランプ速度、各工程の工程時間、およびロード時間を表26に要約する。
再構成溶液の体積を決定するために、凍結乾燥製品バイアルを、凍結乾燥の前後に重量測定した。凍結乾燥製品をDI水で再構成した。溶媒の添加後に、バイアルを静かに旋回させ、再構成外観および再構成時間を記録した。再構成製品をそのpHおよびブリンシドフォビル回収率(HPLCによって決定)についてさらに分析した。再構成ランク付けのために、泡立ちの強さおよび泡消失時間を記録することによって、記載のパラメータを補完した。製剤1~8に関する再構成評価の結果を表30に要約する。
ブリンシドフォビルの凍結乾燥薬物製品を開発するために、5つの異なる作業を履行した: i)凍結乾燥実行可能性評価、ii)凍結乾燥プロセス開発、iii)短期安定性研究、iv)安定性試験のための薬物製品バッチの調製、およびv)材料適合性評価。
異なる凍結乾燥サイクルによる凍結乾燥に続く再構成後の製剤をさらに評価するために、液状充填溶液を調製し、以下に概説するように評価した。凍結乾燥サイクル#1、#2および#5については
a)c(BCV)=10mg/mL(pH=8.0にpH調節)のブリンシドフォビル保存溶液、
b)10×緩衝剤保存溶液またはDI水(pH=8.0にpH調節)および
c)12.5%(w/v)マンニトール保存溶液(pH=8.0にpH調節)
d)DI水
を含む液状充填溶液を調製した。
a)ブリンシドフォビル(固形物)、
b)マンニトール(固形物)、
c)10×アルギニン保存溶液(pH=8.0にpH調節)、
d)NaOH溶液(1M)および
e)DI水
を含む液状充填溶液を調製した。
*3本のバイアルの平均値。サイクル#1~2については、およその消失時間を記録した(常時観察)。サイクル#5~7については、泡立ちの強さを再構成の10分後、20分後および30分後に評価した。<20は、泡立ち消失時間が10分区間と20分区間の間にあったことを示す。<30は泡立ち消失時間が20分区間と30分区間の間にあったことを示す。泡立ちが30分を超えてもまだ続いている場合は、消失時間を>30分で示した。
再構成された溶液の物理的および化学的安定性を評価するために、製剤1、3、3a、3b、3cおよび7のそれぞれの外観およびpHを、再構成時(t0)、1日後(t24h)および2日後(t48h)のc(BCV)の回収率と共に、周囲温度で評価した。c(BCV)の回収率はHPLCによって決定した。
各製剤の外観およびpHを、再構成時(t0)、2日後(t2日)、7日後(t7日)、10日後(t10日)および14日後(t14日)におけるc(BCV)の回収率と共に評価することにより、製剤1、3および3aの安定性を25℃および60℃で評価した。加えて、泡立ちの強さを再構成の10分後、20分後および30分後に評価した。
*3本のバイアルの平均値。泡立ちの強さを、再構成の10分後、20分後および30分後に評価した。<20は、泡立ち消失時間が10分区間と20分区間の間にあったことを示す。<30は泡立ち消失時間が20分区間と30分区間の間にあったことを示す。泡立ちが30分を超えてもまだ続いている場合は、消失時間を>30分で示した。
a処理を受けた試料の3つの複製物の平均値。
bBCV回収率=c(BCV)n日目/c(BCV)0日目×100%。
**T=25℃におけるt0用の試料とT=60℃におけるt0用の試料とは同一である。注: HPLC試料の変動性は試料間のアッセイ変動性の説明になる。バイアル間の変動性は薬物製品バイアル間の変動性の説明になる。
*3本のバイアルの平均値。泡立ちの強さを、再構成の10分後、20分後および30分後に評価した。<20は、泡立ち消失時間が10分区間と20分区間の間にあったことを示す。<30は泡立ち消失時間が20分区間と30分区間の間にあったことを示す。泡立ちが30分を超えてもまだ続いている場合は、消失時間を>30分で示した。a処理を受けた試料の3つの複製物の平均値。bBCV回収率=c(BCV)n日目/c(BCV)0日目×100%。**T=25℃におけるt0用の試料とT=60℃におけるt0用の試料とは同一である。注: HPLC試料の変動性は試料間のアッセイ変動性の説明になる。バイアル間の変動性は薬物製品バイアル間の変動性の説明になる。
a処理を受けた試料の3つの複製物の平均値。bBCV回収率=c(BCV)n日目/c(BCV)0日目×100%。**T=25℃におけるt0用の試料とT=60℃におけるt0用の試料とは同一である。注: HPLC試料の変動性は試料間のアッセイ変動性の説明になる。バイアル間の変動性は薬物製品バイアル間の変動性の説明になる。
凍結乾燥前製剤の調製:製剤3aを以下の手順に従って配合した。適量にする前に、pH制御下で、塩酸(35~37%)を使って、DI水中のアルギニンの1M緩衝剤溶液のpHを、8に調節した。次に、マンニトールを緩衝剤溶液に加えてから、BCVを加えた。その結果生じた溶液のpHを水酸化ナトリウムを使って8に調節した。DI水を用いて、別のメスフラスコで、前記溶液を適量にした。次に、それら2つの溶液を混合し、無菌濾過することで、所望の製剤3aを得た。この手順により、9.9mg/mLのc(BCV)観測値を持つ製剤3aを得た。
*3本のバイアルの平均値。泡立ちの強さを、再構成の10分後、20分後および30分後に評価した。<20は、泡立ち消失時間が10分区間と20分区間の間にあったことを示す。<30は泡立ち消失時間が20分区間と30分区間の間にあったことを示す。泡立ちが30分を超えてもまだ続いている場合は、消失時間を>30分で示した。a走査範囲=25℃~150℃、ランプ速度=10℃/分。b処理を受けた試料の3つの複製物の平均値。
凍結乾燥製剤3a用の液状充填溶液を、注入媒体ならびに製造段階および臨床段階からの一連の材料との適合性について試験した。注入媒体適合性試験の結果を表38に要約する。研究の終了時点で、沈殿、pHシフトおよび有意なブリンシドフォビル回収率の損失はいずれも観察されなかった。
製剤3aを注入媒体(5%デキストロース)溶液で希釈することで、c(BCV)=0.5mg/mLおよび1.0mg/mLの溶液を得た。外観、pHおよびブリンシドフォビル回収率(HPLCによって決定)を、試験溶液を調製した時点(t0)ならびに2時間後(t2h)、8時間後(t8h)および24時間後(t24h)に評価した。
液状製剤3aを、無菌的加工用の2種のシリンジフィルタとの適合性について試験した。10mLの液状製剤3aを、フィルタa(0.2μm、25mm、シリンジフィルタ、Posidyne(登録商標)メンブレン)またはフィルタb(0.2μm、25mm、シリンジフィルタ、Supor(登録商標)メンブレン(PES))のうちの一方で濾過し、濾液の最初と最後の10%を、外観、pHおよびブリンシドフォビルの回収率について評価した。
液状製剤3aをバイアルおよびストッパーとの適合性について試験した。バイアルに5mLの液状製剤3aを充填し、栓をし、クリンプし、上向きおよび下向きにして周囲条件で6時間保管した。試験に使用したバイアルは透明な20mLクラスAホウケイ酸ガラス製セラムバイアルであり、ストッパーはFluroTec(登録商標)コーティングが施された20mm Novapure(登録商標)ストッパーである。
a3つの複製物の平均値。bBCV回収率=c(BCV)n時間目/c(BCV)充填前×100%。t0におけるBCV回収率の値を100%と定義した。
液状製剤3aを100mL注入バッグとの適合性について調べた。5%デキストロース注入媒体中の製剤3aの溶液を、2つの異なる製剤強度(1.0mg/mLおよび0.1mg/mLブリンシドフォビル)で調製し、注入バッグに入れて周囲温度で保管した。注入バッグからの試料とバッグ外で希釈した標準からの試料とを、研究の開始時点(t0)、8時間後(t8h)および24時間後(t24h)において、外観、pHおよびブリンシドフォビル回収率(HPLCによって決定)について評価した。この注入バッグ適合性評価の結果を表38に要約する。
ブリンシドフォビル製剤(10mg/mLブリンシドフォビル、100mMアルギニン、5%マンニトール、pH=8.0)を、2種の注入システム(Baxter、Non-DEHP CONTINU-FLO;B Braun、Rate Flow(登録商標)レギュレーターIVセット)との適合性について試験した。液状製剤を既述のように注入バッグ中に希釈し(被験最終濃度: 1.0mg/mLおよび0.1mg/mL)、24時間後にブリンシドフォビル回収率の分析のために注入バッグからアリコートを収集した(t0,バッグ)。次に、注入システムを注入バッグに取り付け、手動で注入バッグから溶液を充填した。分析のためにアリコートをライン端試料(t0, eol)として収集した。時点間ではIVラインを閉じ、注入剤を注入システム中に留まらせ、周囲温度で保管した。試験時点では、およそ17mL(IVシステムのおよその容積)の注入剤溶液を排液することで、バッグリザーバからIVシステム中の溶液を置き換えた。この置き換えに続いて、新たなライン端試料を評価のために収集した(t10min, eol、t3h, eolおよびt6h, eol)。それらの試料を、外観、pH、およびブリンシドフォビル回収率について評価した。この注入システム適合性試験の結果を表42に要約する。
本開示のバルク液状製剤および凍結乾燥製剤を安定性についてさらに試験した。アルギニン、マンニトール、および10mg/mLの濃度のブリンシドフォビルを含む液状製剤を10mLガラス製バイアル中に保ち、栓をし(ゴム製ストッパーまたは20mmセラムストッパー)、シールし(アルミニウムシール)、最長12ヶ月にわたって約5℃または約25℃に保った。保管した製剤の外観、pHおよびブリンシドフォビル含量を、不純物および粒状物と共に、さまざまな時間区間(すなわち2週間後、1ヶ月後、2ヶ月後、3ヶ月後、6ヶ月後、9ヶ月後および12ヶ月後)でモニターした。不純物はHPLCによって評価した。それら不純物を、本明細書では、それぞれの相対保持時間によって同定する。10mg/mLのブリンシドフォビルを含む凍結乾燥粉末の溶液について、同じ実験を繰り返した。凍結乾燥製剤については、20mmゴム製ストッパー付きの20mLガラス製バイアルを使用した。さらにまた、凍結乾燥粉末(すなわち凍結乾燥ケーキ)の外観を記録した。
序論
ラット用の試験物質の各濃度はラット全血と1:4の比で別々に混合し、一方、ヒト用の試験物質の各濃度はヒト全血と1:4の比で別々に混合した。これらの試料に加えて、対照試料[媒体対照(媒体+全血、ラット用1およびヒト用1)、陽性対照(1%サポニン+全血)、無処理全血対照および陰性対照(食塩水+全血)を、溶血(上清ヘモグロビン濃度)について分析した。
試験は以下に示す2相で行った。
*チューブ1(各濃度用に個別のチューブ)およびチューブ3~6に1.0mLを添加。
aチューブ1~2(各濃度用に個別のチューブ)に250μLを添加。
bチューブ3に250μLを添加。
cチューブ4に250μLを添加。
dチューブ2に1.0mLを添加し、チューブ6に250μLを添加。
e溶血に関する試験物質アッセイ:
チューブ1Aは0.2mg/mLを含有。
チューブ1Bは0.5mg/mLを含有。
チューブ1Cは1.6mg/mLを含有。
f試験物質干渉対照:
チューブ2Aは0.2mg/mLを含有。
チューブ2Bは0.5mg/mLを含有。
チューブ2Cは1.6mg/mLを含有。
g溶血に関する媒体対照
h溶血に関する陽性対照;陽性対照として1%サポニンを使用した。
i溶血に関する無処理全血対照
j溶血に関する陰性対照
+ チューブに添加
- チューブへの添加なし
注:各相のチューブ3~6は、各相につき1回行った。
*チューブ1(各濃度用に個別のチューブ)およびチューブ3~6に1.0mLを添加。
aチューブ1~2(各濃度用に個別のチューブ)に250μLを添加。
bチューブ3に250μLを添加。
cチューブ4に250μLを添加。
dチューブ2に1.0mLを添加し、チューブ6に250μLを添加。
e溶血に関する試験物質アッセイ:
チューブ1Aは0.2mg/mLを含有。
チューブ1Bは0.5mg/mLを含有。
チューブ1Cは1.6mg/mLを含有。
f試験物質干渉対照:
チューブ2Aは0.2mg/mLを含有。
チューブ2Bは0.5mg/mLを含有。
チューブ2Cは1.6mg/mLを含有。
g溶血に関する媒体対照
h溶血に関する陽性対照;陽性対照として1%サポニンを使用した。
i溶血に関する無処理全血対照
j溶血に関する陰性対照
+ チューブに添加
- チューブへの添加なし
注:各相のチューブ3~6は、各相につき1回行った。
投与製剤に関する対照物質は、2リン酸ナトリウム(2 sodium phosphate)緩衝剤溶液(400mM、pH=8.0)、1.0N水酸化ナトリウム溶液、滅菌注射用水および5%デキストロース溶液とした。
次の3工程を含め、保存溶液から配合して、ブリンシドフォビル注入可能液状保存製剤を、15mg/mLブリンシドフォビルになるように調製した:(1)2×リン酸ナトリウム緩衝剤溶液(400mM、pH=8.0)を調製した;(2)1.0N水酸化ナトリウム溶液を購入した;固形ブリンシドフォビル、1.0N水酸化ナトリウム溶液、2×リン酸ナトリウム緩衝剤溶液およびWFI(注射用水)から、ブリンシドフォビル注入可能液状保存製剤(15mg/mLブリンシドフォビル、200mMリン酸ナトリウム、pH=8.0)を調製した。
ラットからの全血(約20mL)(試験のために4匹からの試料をプールした)をK2EDTA抗凝固剤の存在下で収集し、混合するために上下反転させた。
ラット用の試験物質の各濃度はラット全血と1:4の比で別々に混合し、一方、ヒト用の試験物質の各濃度はヒト全血と1:4の比で別々に混合した。これらの試料に加えて、対照試料[媒体対照(媒体+全血、ラット用1およびヒト用1)、陽性対照(1%サポニン+全血)、無処理全血対照および陰性対照(食塩水+全血)を、溶血(上清ヘモグロビン濃度)について分析した。
ラン基準:
1%サポニン陽性対照は、そのアッセイランを許容できるとみなすには、>(陰性対照+0.5g/dL)のヘモグロビン値を示さなければならない。
試験物質+食塩水試料は、そのアッセイランが有効であるとみなされるには、<(陰性対照+0.5g/dL)のヘモグロビン値を示さなければならない。
ラット全血中のブリンシドフォビルは、0.2、0.5、および1.6mg/mLで、以下に要約するように、それぞれ0.0、0.25および1.35g/dLの平均ヘモグロビン濃度を呈した(表47、48、49および50)。
*(HgB血漿)/(正常HgB全血×希釈倍率)*100として算出。
13g/dL(本発明者らのHCDによる)の正常全血ラットヘモグロビン値に基づく。
*(HgB血漿)/(正常HgB全血×希釈倍率)*100として算出。
14g/dL(Mayoオンラインデータによる)の正常全血ヒト女性ヘモグロビン値に基づく。
*(HgB血漿)/(正常HgB全血×希釈倍率)*100として算出
13g/dL(本発明者らのHCDによる)の正常全血ラットヘモグロビン値に基づく。
*(HgB血漿)/(正常HgB全血×希釈倍率)*100として算出。
14g/dL(Mayo Clinicオンラインデータによる)の正常全血ヒト女性ヘモグロビン値に基づく。
1A=0.2mg/mLでの溶血に関する試験物質アッセイ
1B=0.5mg/mLでの溶血に関する試験物質アッセイ
1C=1.6mg/mLでの溶血に関する試験物質アッセイ
2A=0.2mg/mLでの試験物質干渉対照
2B=0.5mg/mLでの試験物質干渉対照
2C=1.6mg/mLでの試験物質干渉対照
3=溶血に関する媒体対照
4=溶血陽性対照;1%サポニンを陽性対照として使用。
5=溶血に関する無処理全血対照
6=溶血に関する陰性対照
SD=標準偏差
この2相研究の目的は、単回2時間静脈内注入によってラットに投与した場合のブリンシドフォビルの最大耐用量(MTD)を決定すること、ならびに1日目、4日目および7日目に2時間静脈内注入によってラットに投与した場合の、ブリンシドフォビルの単回および反復毒物動態学的プロファイルを評価することであった。
この研究は、2つの相から構成された。第1相は最大耐用量(MTD)研究であり、第2相は反復用量範囲探索(DRF)研究であった。
2、4、10または15mg/kgのブリンシドフォビルを2時間IV注入によって投与された動物はすべて、それぞれの予定された安楽死まで、生き残った。
1mg/kg/日および15mg/kg/日のブリンシドフォビルを7日間にわたって合計3回投与された動物はすべて、それぞれの予定された安楽死まで生き残った。
第1相では、各動物に2時間静脈内注入によってブリンシドフォビルの単回投与を施行した。最大耐用量(MTD)を決定するために、各用量区間において、ナイーブ動物に漸増用量を投与した。MTDデータを使って第2相のための用量を選択した。
この研究における動物の数は、統計学的理由、規制上の理由および科学的理由から、必要最小限であるとみなした。
この研究の第1相の出発用量は2mg/kgとした。
第1相(MTD)では、最大4つの用量レベルのブリンシドフォビルを、ナイーブ雌雄ラットにおける漸増単回投与として静脈内注入(2時間)によって投与した。各投薬の後に2~3日の観察期間をおいた。最大耐用量(MTD)が同定されるか、または事前に得られた15mg/kgの溶血の証拠に基づいて投与可能な最大容量(MFD)が達成されるまで、先の用量に対する応答に基づいて、それぞれ後続の用量レベルを増加させて、ナイーブ動物に投与した。
経路
2時間での静脈内注入。20mL/kg/2時間の定用量での処置。注入カテーテル埋め込み手順。
動物を研究に供する前に、試験施設のSOPに従って、埋め込まれた大腿静脈カテーテルを開存性について評価した。
20mL/kg/2時間(10mL/kg/時間)。
個々の動物の濃度は、最も新しく記録された定期測定の体重から算出した。
第1相において、各動物は静脈内注入(2時間)によって投与される単回投与を受けた後、各用量区間後に、2~3日の観察期間を設けた。単回静脈内(2時間)注入に続いて、動物からはそれぞれのジャケットおよび投与セットが取り除かれ、動物を食塩水維持には戻さなかった。
大腿静脈/大静脈中の外科的に埋め込まれたカニューレ。
投与開始の1~2日前に、ロック溶液を各動物に埋め込まれたカテーテルから(可能であれば)引き抜き、テザーおよび注入投与セットを接続する前に、カテーテルを食塩水でフラッシュした。動物のカテーテルを接続した後、1日目の投薬までは、動物に無菌食塩水(0.9%NaCl、USP)を、較正されたMedfusionシリンジポンプによって、0.5mL/時間の速度で注入した。
各注入日についてアカウンタビリティー(投与された実際の用量の確認)を算出し、日々の調節のために精査した。各相で、投与開始に先だって、および投薬の終了後に、ポンプを精度についてチェックした。
第2相ではブリンシドフォビルの血漿中濃度を決定するために血液試料を得た。
各時点において各動物から尾静脈経由でおよそ0.4mLの全血を得た。動物は血液収集前に絶食させなかった。加工に先だち、施設SOPに従って、K2EDTA抗凝固剤が入っているチューブに血液を収集し、氷(wet ice)上に正立させた。遠心分離(およそ2000g、およそ2~8℃で10分間)によって血漿を分離した。研究番号、動物番号、時点、試料採取の日および試料タイプを適当にラベルした1本のクライオチューブに、およそ0.10mLの血漿を移した。残りの血漿を第2のクライオチューブに移し、バックアップ試料としてとっておいた。各血液試料の収集後およそ2時間以内に、血漿をおよそ-80±10℃で、分析まで凍結しておいた。最終血液収集後に動物を安楽死(CO2吸入)させた。
検査には、全身状態、皮膚および毛皮、眼、鼻、口腔、腹部および外生殖器の観察ならびに呼吸の評価を含めた。
第1相:動物をそれぞれのケージから取り出し、試験前に2回、および各投与前に、体重を測定した。
血液試料(およそ0.25mL)をK2EDTA抗凝固剤が入っているチューブに収集し、Siemens ADVIA 120血液分析装置を使って以下の項目について分析した:ヘモグロビン濃度(HGB);ヘマトクリット(HCT);赤血球数(RBC);血小板数(PLT);平均赤血球容積(MCV);平均赤血球ヘモグロビン量(MCH);平均赤血球ヘモグロビン量濃度(MCHC);赤血球分布幅(RDW);総白血球数(WBC);網状赤血球数(RETIC);白血球分画(検証のために手作業による白血球分画を行い、必要であれば絶対値を算出した);好中球(ANEU);リンパ球(ALYM);好酸球(AEOS);好塩基球(ABASO);単球(AMONO);大無染色細胞(ALUC)。
血液試料(およそ1mL)を抗凝固剤が入っていないチューブに収集し、凝固させ、遠心分離することで血清を得て、Siemens ADVIA 1800化学分析装置を使って以下の項目について分析した:アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)(速度論的方法-改変Bergmeyer法);アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)(速度論的方法-改変Bergmeyer法);アルカリホスファターゼ(ALKP)(速度論的方法-Tietz法AMP緩衝剤);血中尿素窒素(BUN)(酵素法-ウレアーゼによるRoch-Ramek法);クレアチニン(CREAT)(Jaffe法アルカリ性媒質中のピクリン酸);グルコース(GLU)(グルコースヘキソキナーゼII法);コレステロール(CHOL)(酵素法エステラーゼ/オキシダーゼ-Trinder法エンドポイント);トリグリセリド(TRIG)(Fossati三工程酵素法-Trinder法エンドポイント);総タンパク質(TP)(ビウレット法);アルブミン(ALB)(ブロモクレゾールグリーン法);総ビリルビン(TBILI)(バナジン酸(Vandate)による酸化);ナトリウム(NA+)(イオン選択性電極);カリウム(K+)(イオン選択性電極);塩化物(Cl-)(イオン選択性電極);カルシウム(Ca++)(Michaylova & Ilkova法、アルセナゾIII);無機リン(PHOS)(リンモリブデン酸-UV法)。
第1相:観察期間の完了後はすべての動物を二酸化炭素吸入に続く瀉血によって安楽死させ、肉眼的検査なしで廃棄した。
グロブリン(GLOB)は、総タンパク質-アルブミンとして算出した。
アルブミン/グロブリン比(A/G)は、アルブミン/グロブリンとして算出した。
研究実施に関する詳細を、限定するわけではないが試験動物、研究材料、研究計画、投与、観察および結果を含めて、下記表54に要約する。
各ラットが試料採取日ごとに2回試料採取されるように、複合的採血計画を使用した。血液試料は表54に示すスキームに従って収集した。血液は、抗凝固剤が入っているチューブに、無麻酔の動物から尾静脈経由で収集し、氷上に正立させた。動物は血液収集前に絶食させなかった。遠心分離(およそ2~8℃において、およそ2000gで10分間)によって血漿を分離し、個別にラベルしたクライオチューブに移した。収集した血液試料が入っているすべてのクライオチューブに、研究番号、動物番号、時点、試料採取の日および試料タイプに関して適当にラベルした。各血液試料の収集後およそ2時間以内にすべての血漿試料を得て、分析までおよそ-80℃(±10℃)で凍結しておいた。
ラット血漿バイオアナリシスはPyxant Laboratoriesによって行われた。タンパク質沈殿抽出後のLC-MS/MS分析に基づく方法を使って、ブリンシドフォビルおよびシドフォビルの濃度について、血漿試料を分析した。ブリンシドフォビルおよびシドフォビルに関する較正範囲は、ラット血漿の50μLアリコートに関して、それぞれ1.00~1500ng/mLおよび5.00~750ng/mL(Pyxant研究番号3025)であった。ISRのための試料分析は、この非GLP研究の一部として行わなかった。
毒物動態分析
平均プロファイル(Mean Profile)を作成するために、定量限界未満(BLQ)である試料濃度はすべて0に設定した。
統計解析は、算術平均、標準偏差、算術平均の%CVを含む記述統計解析に限定した。
NA、該当なし;NR、データポイントが不十分であったため報告できない
第1相
用量1(2mg/kg):どちらの雄動物でも臨床徴候は頻呼吸および背弯姿勢からなり、立毛、部分閉眼および活動減少は伴う場合も伴わない場合もあった。
1mg/kg/日または15mg/kg/日でのブリンシドフォビルの投薬は、雄動物でも雌動物でも、ブリンシドフォビル関連臨床徴候を何ももたらさなかった。ブリンシドフォビルによる処置に関連する体重(第2相のみ評価)または摂食量への影響はなかった。
ブリンシドフォビルに関連する血液学的所見は、15mg/kgでの雄および雌における網状赤血球のわずかな減少(それぞれ-33%および-30%対照;雄のみ統計学的に有意)に限られ、これには、雄での平均細胞ヘモグロビン濃度(MCHC)の増加(+2.1%対照、統計学的に有意)が伴った。赤血球量(ヘモグロビン、ヘマトクリット、赤血球数)の減少は、7日間の投与相の終了時に無視できる程度であった(-4.2%対照まで)。赤血球量に対する網状赤血球減少の影響がごくわずかであるのは、ラットにおける赤血球の寿命(約45~68日)が、網状赤血球(2~5日)と比較して長いことが原因であると考えられた。赤血球量の減少は、継続投与によってさらに顕著になると予想されるだろう。網状赤血球の減少により、造血組織における赤血球生成の減少が示された。摂食量にも体重にも減少がなく、臨床状態の不良もないので、それらは、この薬物クラス(ヌクレオチド類似体)では予想外ではない赤血球生成のブリンシドフォビル関連抑制による可能性が高かった。
肉眼的所見は数少なく、孤発的に発生し、対照動物における発生率と類似する発生率で発生するか、用量関係を欠くか、先天異常と考えられた(動物番号3048)ので、ブリンシドフォビル関連とはみなさなかった。雄動物番号3048は左精嚢も左腎臓も有しなかった。左腎臓が存在しないことは、この動物における血中尿素窒素(BUN)、クレアチニンおよびリンの上昇と相関した。
1mg/kgおよび15mg/kgの単回投与および反復投与に続くブリンシドフォビルに関する濃度-時間データを、表59および表60に要約する。
Phoeneix WinNonlin分析のための入力ファイルに使用した平均血漿中ブリンシドフォビル濃度-時間情報は、表63に含まれている。ラットへの静脈内注入としてのブリンシドフォビルの単回投与および週2回投与に続くブリンシドフォビルのTKパラメータを表56に要約する。排出相を特徴づけるにはデータポイントが不十分であったため、最終半減期(t1/2)、CLおよびVssは決まらなかった。
1mg/kgおよび15mg/kgの単回投与および反復連日投与に続く、シドフォビルに関する濃度-時間データを、表59~表60に要約する。
Phoenix WinNonlin分析のための入力ファイルに使用した平均血漿中シドフォビル濃度-時間情報は、表64に含まれている。ラットへの静脈内注入としてのシドフォビルの単回投与および週2回投与に続くシドフォビルのTKパラメータを表58に要約する。
aバイオアナリシスの結果がBLQである試料にはゼロを帰属させた。
aバイオアナリシスの結果がBLQである試料にはゼロを帰属させた。
この研究の目的は、[14C]ブリンシドフォビルの単回静脈内(IV、2時間注入)投与または単回経口(PO、胃管法)投与の施行に続いて、雄Sprague Dawley(SD)ラットおよびLong-Evans(LE)ラットにおける総放射能の組織分布を特徴づけることであった。加えて、[14C]ブリンシドフォビルの単回静脈内(IV、2時間注入)投与後の雄Sprague Dawleyラットにおける総放射能の排泄の速度および程度(物質収支)ならびに薬物動態(PK)を検査した。この研究で収集して残った血漿および排泄物は、異なるプロトコールで行われる代謝産物プロファイルおよび同定実験のために-70℃で保管した。
この研究では、4群の雄SDラット(白色種)および3群の雄LEラット(有色種)、合計39匹を利用した。動物はすべてHilltop Lab Animals, Inc.(ペンシルバニア州スコットデール)から入手した。ラットは投与時点で体重が214~265gであった。第1群、第2群、第3群および第4群のラットには、15mg/kgの目標用量で、[14C]ブリンシドフォビルの単回2時間(h)IV注入を施行した。第5群のラットには、2mg/kgの目標用量で[14C]ブリンシドフォビルの単回2時間IV注入を施行した。第6群および第7群のラットには、15mg/kgの目標用量で[14C]ブリンシドフォビルの単回経口胃管法投与を施行した。3種の投与製剤(1つは高用量IV用、1つは低用量IV用、そして1つはPO投与用)が、投与日に、QPSにおいて調製された。第1群、第2群、第3群および第4群のIV製剤は、pH8.0(±0.1)の5%デキストロース溶液中の10mMリン酸ナトリウム緩衝剤の媒体を含有した。第5群のIV製剤は、pH8.0(±0.1)の5%デキストロース溶液中の16mMリン酸ナトリウム緩衝剤の媒体を含有し、PO投与製剤は、pH8.0(±0.1)の12.5mMリン酸ナトリウム緩衝剤の媒体を含有した。第5群のIV投与製剤と、第6群および第7群のPO投与製剤とは、最終緩衝剤濃度がすべての投与製剤においておよそ10mMになるように、濃度の高い緩衝剤を含有した。
Hilltop Lab Animals, Inc.(ペンシルバニア州スコットデール)から入手した16匹の成体雄SDラットおよび23匹の成体雄LEラットを、この研究に供した。第1~5群のラットは、IV注入用に留置大腿静脈カニューレ(FVC)を有するように、外科的に改変した。動物の体重範囲、供給源、ベンダーおよび受領日は生データに記録した。研究に供した動物に、尾に油性マーカーを使って固定識別番号を割り当て、使用しない予備の動物は、研究に供した動物の投薬が成功した後に、ストックに戻した。ランダム化はカニューレ開存性およびQPS SOPによって行った。
投与体積を決定するために使用した動物の体重は、投薬日の投与前に測定した。用量アッセイ結果、動物の体重および目標投与パラメータをDebra LIMSに入力し、各動物に関する目標投与体積をDebra LIMSによって決定した。動物には、15mg/kg(第1~4群)または2mg/kg(第5群)の目標経口用量で[14C]ブリンシドフォビルの単回2時間IV注入を与えるか、15mg/kg(第6群および第7群)の目標経口用量で[14C]ブリンシドフォビルの経口胃管投与を行った。各ラットに投与された実際の用量は、個々の動物の体重データを使用するDebra LIMSにより、空の投与シリンジ/針または投与後の針/注入ラインの重量を投与前のシリンジ/針または針/注入ライン全体の重量から差し引くことによって、決定された。平均投与前放射能濃度(dpm/g投与溶液)に、投与された投与溶液の正味の重量をかけることで、各動物に投与された放射能の量を算出した。実際の用量を表67に提示する。
a経口(PO)製剤の比活性は14.2689μCi/mg [14C]ブリンシドフォビルであった。PO製剤の投与調製物活性は42.2151μCi/gであった。
b静脈内(IV)注入製剤の比活性は13.5694(15mg/kgの場合)および101.5100(2mg/kgの場合)μCi/mg [14C]ブリンシドフォビルであった。IV製剤の投与調製物活性は10.1074μCi/g(15mg/kgの場合)および82.8740μCi/g(2mg/kgの場合)であった。
c試料収集のためにIV注入中に終了させた動物。これらの動物は平均用量計算からは省いた。
d第4群において投与されたすべての動物に関する平均188.836μCi/kgを線量見積もりに使用した。注: SD=標準偏差;MB=物質収支;PK=薬物動態;QWBA=定量的全身オートラジオグラフィー
この研究中は、各群について以下に述べるように、尿、糞便、血液/血漿、ケージ残渣試料、および屠殺体を収集した。
排泄物収集のために3匹の雄白色ラットを第1群(IV注入)に割り当てた。
血漿および血液を分析するために、以下に列挙する時点において、第2群(IV注入)の各動物から血液を収集した。
各動物を、それぞれの最終時点において、血液収集直後に、QWBA分析のために安楽死させた。以下に列挙するように、各群1時点あたり1匹のラットを安楽死させた。
第3群(IV)-2時間(注入終了時)、24時間および168時間
第4群(IV)-1時間、2時間(注入終了時)、4時間、8時間、24時間、72時間、96時間、168時間および840時間
第5群(IV)-2時間(注入終了時)、8時間、24時間および72時間
第6群(PO)-2時間、24時間および168時間
第7群(PO)-0.5時間、1時間、2時間、4時間、8時間、24時間、72時間、96時間、168時間および840時間
屠殺体およびケージ残渣試料は、試料分析まで-20℃で保管し、残った血漿および排泄物は-70℃で凍結保管した。
血液、血漿および排泄物のLSC分析
糞便をホモジナイズし、総放射能含量について分析した。各ラットについて重量測定した糞便検体をおよそ3体積の水(糞便検体の重量のおよそ3倍)中でホモジナイズした。各ホモジネートの総重量を決定し、重量測定した3つ一組のアリコート(約0.5g)をPackardサンプルオキシダイザー中で燃焼させてから、LSC分析を行った。個々のアリコートの実際の重量およびホモジナイゼーションに使用した溶媒の量を記録した。前もって重量測定しておいた各糞便ホモジネートの一部を、Combusto-Pad(登録商標)が入っているCombusto-Cone(登録商標)に入れて、換気フード中で一晩乾燥させ、サンプルオキシダイザー中で完全に燃焼させた。
耳介、肢遠位部、毛髪および尾を各凍結屠殺体から除去し、各凍結屠殺体を、およそ2%(w/v)カルボキシメチルセルロースの水性懸濁液に包埋し、ブロック状に凍結した。そのブロックをおよそ-20℃で保管してから薄切した。各ブロック状屠殺体を、およそ-20℃に維持された凍結ミクロトーム(Leica CM3600 Cryomacrocut(ドイツ国ヌスロッホ)およびVibratome 9800(ミズーリ州セントルイス))のオブジェクトステージにマウントし、薄切前に[14C]-グルコースが1つの濃度(およそ0.05μCi/mL)で添加された血漿である内部標準(3)を凍結ブロックに入れて、それらを切片の厚さの品質管理に使用した。-20℃に設定した全身凍結ミクロトームを使って、いくつかの全身切片(およそ40μm厚)を、矢状面に、関心対象のさまざまなレベルでとった。凍結屠殺体の矢状切片(20~50μm厚)を、蛍光体イメージングプレートに曝露した。標準を使って組織中のイメージの領域を濃度に変換した。主要組織、器官および生体液のすべてが表された。切片は粘着テープ(Scotch 8210、米国3M Corp.)上に収集し、凍結ミクロトーム中で少なくとも48時間脱水してから、マウンティングおよび曝露のために取り出した。
この研究でのラットには目につく異常は観察されなかった。
第1群雄SDラットにおける総放射能に関する個々の動物の排泄データおよび平均排泄データの要約を表68に提示する。
第2群雄SDラットについて、血漿中総放射能濃度対時間データ、PKパラメータおよび血液対血漿比を、表69に報告する。
第3群~第7群雄SDおよびLEラットに関する血中対血漿中濃度比を表70に報告する。第3~7群から得られた血中および血漿中濃度対時間プロファイルの比較を、図3に提示する。
ND=未決定、血中および/または血漿中BQL
NS=この時点で収集した試料なし
雄白色ラット(第3群;n=3)および雄有色ラット(第4群;n=9)における[14C]ブリンシドフォビルの組織分布の要約を、それぞれ表71および表72に提示する。
BQL=LLOQを下回る値;NI=許容できる切片上に同定されない
LLOQ=0.00048400μCi/g/0.0135694μCi/μg=0.036μg当量/g組織
ULOQ=20.97300000μCi/g/0.0135694μCi/μg=1545.610μg当量/g組織
[14C]ブリンシドフォビル由来の放射能は、15mg/kgでの2時間IV注入後に、白色雄ラットの大半の組織によく分布し(n=1匹、投与開始の2時間、24時間および168時間後)、大半の組織が、注入の終了時点では血液/血漿中よりわずかに低いものの、その後の時点については血液/血漿中より高い濃度を有した。排泄管組織中濃度および消化管組織中濃度は、すべての時点において、血液/血漿中よりはるかに高かった。血液における[14C]ブリンシドフォビル由来の放射能の最も高い濃度観測値は6.9μg当量/gであり、これは2時間時点(注入終了時およびこのまばらな試料採取群での最初の収集時点)で観察された。[14C]ブリンシドフォビル由来の放射能のCmaxは、大半の組織(37中35の組織)において、投与後2時間(最初の試料採取時点)に見いだされ、その時点で、組織の大半が、1.0~6.0μg当量/gである濃度を有した。
[14C]ブリンシドフォビル由来の放射能は、15mg/kgでの2時間IV注入後に、有色雄ラットの大半の組織によく分布し(n=1匹、投与開始から1時間後、2時間後、4時間後、8時間後、24時間後、72時間後、96時間後、168時間後、および840時間後)、大半の組織が、早い時点(注入開始後4時間まで)では血液/血漿中よりわずかに低いものの、その後の時点については血液/血漿中より高い濃度を有した。AUCに基づく組織:血漿(T/P)比(AUC組織:AUC血漿;表78)は、大半の組織について、血漿中より高い組織中濃度を表す>1の値を示す。排泄管組織中濃度および消化管組織中濃度は、すべての時点において、血液/血漿中よりはるかに高かった。血液における[14C]ブリンシドフォビル由来の放射能の最も高い濃度観測値は5.3μg当量/gであり、これは2時間時点(注入終了時およびこの頻回試料採取群での2つめの収集時点)で観察された。[14C]ブリンシドフォビル由来放射能のCmaxは、大半の組織(38中33の組織)では、投与後2時間において見いだされ、その時点でほとんどの組織が1.0~6.0μg当量/gである濃度を有した。
2mg/kgの単回2時間IV注入を施行した雄有色ラットにおける[14C]ブリンシドフォビルの組織分布(n=1匹、投与開始の2時間、8時間、24時間および72時間後)の要約を、表73に提示する。
BQL=値はLLOQ未満である。
LLOQ=0.00048400μCi/g/0.10151μCi/μg=0.005μg当量/g組織
ULOQ=20.97300000μCi/g/0.10151μCi/μg=206.610μg当量/g組織
雄白色ラット(第6群;n=3)および雄有色ラット(第7群;n=10)における[14C]ブリンシドフォビルの組織分布の要約を、それぞれ表75および表76に提示する。薬物動態パラメータを表77に記載する。
BQL=値はLLOQ未満である。
LLOQ=0.00048400μCi/g/0.01427μCi/μg=0.034μg当量/g組織
ULOQ=20.97300000μCi/g/0.01427μCi/μg=1469.727μg当量/g組織
BQL=値はLLOQ未満である。
LLOQ=0.00048400μCi/g/0.01427μCi/μg=0.034μg当量/g組織
ULOQ=20.97300000μCi/g/0.01427μCi/μg=1469.727μg当量/g組織
ND=未決定;データから値を決定することができない。
aこれらの組織/器官に関するt1/2値は、不十分なデータポイントから得られ、かつ/または結果として得られるr2値は許容基準(≧0.85)外であるため、これらの値は推定値とみなすべきである。
[14C]ブリンシドフォビル由来の放射能は、15mg/kgでの単回経口投与後に、白色雄ラットの大半の組織によく分布し(n=1、投与後2時間、24時間および168時間)、大半の組織が、早い時点(投与後2時間)では血液/血漿中よりわずかに低いものの、その後の時点については血液/血漿中より高い濃度を有した。排泄管組織中濃度および消化管組織中濃度は、すべての時点において、血液/血漿中よりはるかに高かった。血液における[14C]ブリンシドフォビル由来の放射能の最も高い濃度観測値は0.200μg当量/gであり、これは2時間時点(このまばらな試料採取群での最初の収集時点)で観察された。[14C]ブリンシドフォビル由来の放射能のCmaxは、大半の組織(37中31の組織)において、投与後24時間(2回目の試料採取時点)に見いだされ、その時点で、組織の大半が、0.10~0.50μg当量/gである濃度を有した。
[14C]ブリンシドフォビル由来の放射能は、15mg/kgでの単回経口投与後に、有色雄ラットの大半の組織によく分布し(n=1匹、投与の0.5時間後、1時間後、2時間後、4時間後、8時間後、24時間後、72時間後、96時間後、168時間後、および840時間後)、大半の組織が、注射後24時間までの時点では血液/血漿中よりわずかに低いものの、その後の時点については血液/血漿中より高い濃度を有した。排泄管組織中濃度および消化管組織中濃度は、すべての時点において、血液/血漿中よりはるかに高かった。AUCに基づく組織:血漿(T/P)比(表78)は、大半の組織について、血漿中より高い組織中濃度を表す>1の値を示す。血液における[14C]ブリンシドフォビル由来の放射能の最も高い濃度観測値は1.1μg当量/gであり、これは8時間において観察された。[14C]ブリンシドフォビル由来放射能のCmaxは、大半の組織(38中20の組織)では、投与後8時間において見いだされ、その時点でほとんどの組織が0.20~0.40μg当量/gである濃度を有した。
BQL=定量限界未満
LLOQ=0.036μg当量/g(第4群IV)
LLOQ=0.034μg当量/g(第7群PO)
ND=未決定、不十分なデータ
10mgおよび25mgのブリンシドフォビルを健常対象に投与した。IVブリンシドフォビル投与は、10mgで、経口投与された100mgのブリンシドフォビルと類似する曝露を与えることがわかった。 どちらのIVブリンシドフォビル用量(10mgおよび25mg)も一般的に安全であり、忍容性は高いことがわかった。薬物関連有害事象、胃腸有害事象および段階的検査異常(例えば溶血毒性および腎毒性)はいずれも観察されなかった。
要約
Sprague-Dawley CD(登録商標)ラット(15匹/性別/群)に、0(2×リン酸ナトリウム緩衝剤溶液)、1、4または15mg/kg/投与のブリンシドフォビルを、週に2回、2時間静脈内注入によって、29日間にわたって合計9回投与した。投与速度はすべての群で10mL/kg/時間とした。処置相の最後に、最大10匹/性別/群を安楽死させ、剖検に付した。残りの動物(最大5匹/性別/群)は、任意のブリンシドフォビル関連効果の進行または可逆性を決定する目的で、14日回復相のためにとっておいた。ブリンシドフォビルおよびブリンシドフォビル代謝産物(シドフォビル、CDV)の毒物動態学的分析のために、サテライト動物(最大3匹/性別/群)にも同様に投与を行い、1日目および29日目に、一連の血液試料を各動物から収集した。この研究中に評価したパラメータは、生存率、臨床観察、眼科学、体重、摂食量、臨床病理学(投与終結時および回復終了時)、器官重量、肉眼的観察および顕微鏡的病理学であった。
この研究では以下の略号を使用する。
M 雄
F 雌
~ およそ
mg/kg 体重1キログラムあたりの試験物質のミリグラム数
mL/kg 体重1キログラムあたりの投与製剤のミリリットル数
mL/kg/時間 1時間あたり体重1キログラムあたりの投与製剤のミリリットル数
mg/mL 投与製剤1ミリリットルあたりの試験物質のミリグラム数
IV 静脈内
MTD 最大耐用量
DRF 用量範囲探索
適当な量の一塩基性リン酸ナトリウム溶液(400mM)と二塩基性リン酸ナトリウム溶液(400mM)とを混合することによって、2×リン酸ナトリウム緩衝剤溶液の媒体溶液(400mM、pH8.0±0.04)を調製した。必要な場合は、溶液のpHを一塩基性リン酸ナトリウム溶液(400mM)で調節した。この溶液を、層流フード内で、0.22μm Millex(登録商標)-GP(PES)フィルタを通して無菌容器に濾過した。
安定性分析により、この研究で使用した濃度を挟む濃度(0.05mg/mLおよび2.0mg/mL)では、ブリンシドフォビル製剤は、室温で保管した場合に、24時間は安定であり、2~8℃で冷蔵保管した場合には8日間安定であることが証明された。15.0mg/mLのブリンシドフォビル保存溶液は、室温(名目上20℃)で保管した場合は24時間、また2~8℃で保管した場合は8、14および28日間、安定であった。
各週用に調製した各投与製剤(対照を含む)の中央領域から、調製日に、2つの試料(各5mL)を採取した。一方の試料は、用量確認分析のために、2つ一組にして分析し、一方の試料は冷蔵(2~8℃)してとっておいた(初期結果が研究許容計画基準(名目の±10%)外であったため、第1週および第2週については、第2群のとっておいた試料を再分析した)。
すべての投与製剤試料を、分析または最終処分まで冷蔵(2~8℃)保管した。
ブリンシドフォビルを2時間にわたる静脈内注入として投与した。動物を20mL/kg/2時間の定用量で処置した。
投薬のおよそ1~3週間前に注入用のカテーテルを埋め込んだ。予備を含むすべての動物にカテーテルを外科的に埋め込んだ。
動物を研究に供する前に、試験施設のSOPに従って、埋め込まれた大腿静脈カテーテルを開存性について評価した。
20mL/kg/2時間(10mL/kg/時間)。
個々の動物の濃度は、最も新しく記録された定期測定の体重から算出した。
試験/対照物質を、29日間にわたる合計9回の個別投与で週に2回、2時間静脈内注入によって投与した。試験/対照物質投与は、最終剖検の前日まで継続した。回復動物は、最後の投与後、14日間の観察期間のために保持した。
大腿静脈/大静脈中の外科的に埋め込まれたカニューレまたは末梢尾静脈経由。
投与開始の1~2日前に、ロック溶液を各動物に埋め込まれたカテーテルから(可能であれば)引き抜き、テザーおよび注入投与セットを接続する前に、カテーテルを食塩水でフラッシュした。動物のカテーテルを接続した後、1日目の投薬までは、動物に無菌食塩水(0.9%NaCl、USP)を、較正されたMedfusionシリンジポンプによって、0.5mL/時間の速度で注入した。
各注入日についてアカウンタビリティー(投与された実際の用量の確認)を各シリンジの投与前の重量と投与後の重量とに基づいて算出し、日々の調節のために精査した。データは研究ファイルに保っておく。投与開始前に、ポンプを、研究と同じ速度で同じ長さの投与を使って、食塩水で精度についてチェックし、投与後アカウンタビリティーを、研究全体を通してポンプ性能をモニターするために使用した。
系統/種
白色ラット(非近交系)VAF/Plus(登録商標);CD(登録商標)(Sprague-Dawley由来)[Crl:CD(登録商標)(SD)BR]
合計170匹(雄85匹および雌85匹)を受け取り、144匹(雄72匹および雌72匹)を試験に供した。
試験前期間はおよそ4週間であった。研究に対する適性を確認するために試験前験期間中にすべての動物を検査した。動物を5日間安定化し終えるまでは試験前手順を行わなかった。
およそ10週
雄: 290.6g~422.4g。雌: 203.8g~294.7g。
研究に必要な数よりも多くの動物を購入し、安定化した。試験前の理学的検査およびカテーテル開存性に基づいて研究に適していないとみなした動物は、群割り当てのためのランダム選択の前に排除した。研究に適しているとみなした動物を、各群の体重平均が同等になるように、コンピュータランダムソートプログラムによって、各性別につき18匹の4群に分布させた。試験前眼科所見ゆえに、数匹の毒性試験動物をサテライト動物と交換したが、同じ群内に残した。試験に供した個々の動物の重量は、性別ごとの平均重量の±20%以内であった。
各ラットには、一意の番号でプログラムされたBMDS IMI-1000埋め込み型高周波トランスポンダ(マイクロチップ)を埋め込んだ。この番号を、試験施設によって割り当てられた動物番号と相互参照した。この番号+研究番号は、各動物について一意の識別番号を含んだ。加えて、用量レベル識別用に色分けされていて、研究番号と施設が割り当てた動物番号情報とを含むケージカードを、各ケージに設けた。
動物を、獣医学的ケアを必要とする可能性がある任意の状態について技術スタッフがモニターし、必要に応じて処置した。種々の非試験物質関連獣医師評価は研究責任者によって精査され、研究ファイルに記録される。
およそ0.40mLの全血を各時点において各動物の尾静脈から得た。動物は血液収集前に絶食させなかった。血液をK2EDTA抗凝固剤が入っているチューブに収集し、氷上に正立させた。遠心分離(およそ2000g、およそ2~8℃で10分間)によって血漿を分離した。研究番号、動物番号、時点、試料採取の日および試料タイプに関して適当にラベルした1本のクライオチューブに、およそ0.150mLの血漿を移した。残りの血漿を第2のクライオチューブに移し、バックアップ試料としてとっておいた。各血液試料の収集後およそ2時間以内に血漿を得て、およそ-80±10℃で分析まで凍結しておいた。最終血液収集後に動物を安楽死(CO2吸入)させた。
すべての試料チューブを凍結(-80±10℃)保管し、分析のためにコロラド州コロラドスプリングスのPyxant Labに搬送(凍結、ドライアイス上)した。
バイオアナリシス用試料は、Pyxant Labsにおいて、バリデートされた液体クロマトグラフィー-トリプル四重極質量分析(LC-MS/MS)アッセイを使って分析された。
ケージ中の動物を、死亡および重篤な毒性効果または薬理学的効果の徴候について毎日2回観察した。健康状態が極端に悪いか、瀕死状態の疑いがある動物を、さらなるモニタリングおよび安楽死の可能性のために同定した。
投与完了の直後および2時間後に、健康不良または毒性効果もしくは薬理学的効果の任意の徴候(例えば全身状態、外観、活動、挙動、呼吸などの異常)について、観察を行った。
動物をそれぞれのケージから取り出し、試験前に一度、そして研究期間中は週に1回、検査した。検査には、全身状態、皮膚および毛皮、眼、鼻、口腔、腹部および外生殖器の観察ならびに呼吸の評価を含めた。
試験前にすべての動物を検査した。生き残ったすべての毒性試験動物を、投与の終了時および回復の終了時に検査した。試験前検査で正常範囲内にあった動物だけを試験に供した。
動物をそれぞれのケージから取り出し、試験前に2回、処置期間中は各投与の前日、および回復期間中は週に1回、体重を測定した。最終空腹時体重は予定の冒険区間の直前に得た。福祉上の理由で安楽死させた動物は剖検の前に重量を測定した。
処置の1週間前から毎週、摂食量を測定(重量測定)した。
眼窩静脈叢(眼球後静脈叢)から軽いイソフルラン麻酔下で得た血液を使って、投与終了時に最大10匹の毒性試験動物/性別/群について、および回復の終了時に最大5匹の回復動物/性別/群について、血液学、凝固および臨床化学パラメータを、分析した。各血液収集区間の前に、動物を一晩絶食させた。
血液試料(およそ0.25mL)をK2EDTA抗凝固剤が入っているチューブに収集し、Siemens ADVIA 120血液分析装置を使って以下の項目について分析した:ヘモグロビン濃度(HGB);ヘマトクリット(HCT);赤血球数(RBC);血小板数(PLT);平均赤血球容積(MCV);平均赤血球ヘモグロビン量(MCH);平均赤血球ヘモグロビン量濃度(MCHC);赤血球分布幅(RDW);総白血球数(WBC);網状赤血球数(RETIC);白血球分画(検証のために手作業による白血球分画を行い、必要であれば絶対値を算出した);好中球(ANEU);リンパ球(ALYM);好酸球(AEOS);好塩基球(ABASO);単球(AMONO);および大無染色細胞(ALUC)。
血液試料(およそ1.0mL)をクエン酸ナトリウム抗凝固剤が入っているチューブに収集し、Diagnostica Stago ProductsのSTA Compact(登録商標)力学的凝固検出システムを使って、以下の項目について分析した:プロトロンビン時間(PT)および活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)。
抗凝固剤を含まないチューブに血液試料(およそ1.0mL)を収集し、凝固させ、遠心分離することで血清を得て、Siemens ADVIA 1800化学分析装置を使って以下の項目について分析した。
クレアチニン(CREAT)(Jaffe法アルカリ性媒質中のピクリン酸);グルコース(GLU)(グルコースヘキソキナーゼII法);コレステロール(CHOL)(酵素法エステラーゼ/オキシダーゼ-Trinder法エンドポイント);トリグリセリド(TRIG)(Fossati三工程酵素法-Trinder法エンドポイント);総タンパク質(TP)(ビウレット法);アルブミン(ALB)(ブロモクレゾールグリーン法);総ビリルビン(TBILI)(バナジン酸(Vandate)による酸化);ナトリウム(NA+)(イオン選択性電極)カリウム(K+)(イオン選択性電極);塩化物(Cl-)(イオン選択性電極);カルシウム(Ca++)(Michaylova & Ilkova法、アルセナゾIII);および無機リン(PHOS)(リンモリブデン酸-UV法)。
代謝ケージに収容した毒性研究用動物から、尿を一晩(およそ16時間)氷冷容器に収集した。
外観(APP);比重(Sp.G.)(臨床屈折計Atago Uricon-N);体積(VOL)。
安楽死の方法
福祉上の理由で安楽死させた動物または予定の屠殺区間に入った動物は、イソフルラン吸入に続く瀉血によって安楽死させた。毒物動態学用動物はCO2吸入によって安楽死させた。
剖検は、動物を29日間処置した後に最大10匹の毒性研究動物/性別/群で行い、また14日間の無処置回復期間後に最大5匹の毒性研究動物/性別/群で行った。剖検前に動物を一晩絶食させた。剖検スケジュールは、各群から両性の動物の検査が、剖検期間全体を通して一日の類似する時間帯に行われることが保証されるように設定した。
完全な肉眼的検査をすべての動物に行った。肉眼的検査には、肉眼的形態異常の存在に関する外表面およびすべての開口部;脳および脊髄の外表面;頭蓋腔、胸腔、腹腔、骨盤腔および首の器官および組織;ならびに屠殺体の残りの部分の検査を含めた。
以下に示す器官は、生き残った毒性研究動物および回復研究動物のすべてについて、予定の屠殺区間において重量測定した。重量測定に先だち、器官を注意深く切離し、脂肪および他の隣接組織を均一に除去するために、適正にトリミングした。乾燥を回避するために、器官は、切離後可能な限りすぐに、重量測定した。対器官は一緒に重量測定した。
以下に列挙する組織をすべての動物から得て、保存した。加えて、表示した組織のスライドを調製し、顕微鏡で検査した。肉眼的検査では認められず組織学的加工中に見られた異常は、いずれも記録した。
a定性的検査(白血球分画なし)。
b直腸は顕微鏡検査しなかった。
c雄の乳腺およびGALTは、ルーチン切片中に存在する場合にのみ評価した。
d固定後に重量測定。
e前立腺と精嚢は一緒に重量測定した。
すべての組織を10%中性緩衝ホルマリン(NBF)中に保存した。眼および精巣はまず改変ダビッドソン液に入れてから、10%NBF中に保った。肺を10%NBFで満たしてから、より大きな体積の同じ固定液に浸漬した。大腿骨からのスメア調製物は風乾し、無水メタノール中で固定した。
固定後に、すべての動物からの組織および器官を通常どおりに加工し、パラフィンに包埋し、4~7ミクロンのミクロトーム設定で切断し、ガラススライドにマウントし、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、光学顕微鏡で検査した。骨はDecalcifier II(商標)中で脱灰した。
「FD」:死体で発見;「S1」:予定された安楽死1;「WE」:福祉上の理由で安楽死させた;「Z1」:回復安楽死1。
徴候を示す各動物について臨床観察を提示して、徴候のタイプ、発生した日または週およびその徴候の持続時間に関する情報の詳細を、適宜、提供する。「AM」:午前の観察;「PM」:午後の観察;「Unsched」:予定外の観察;「投与後」:投与完了直後;「2時間PD」:投与完了2時間後。
所見を示した各動物について観察結果を提示する。観察は別段の表示がある場合を除き、両側性であった。
摂食量(g/日)は
消費された食品のグラム数÷日数
として算出した。
消費された食品のグラム数÷動物日(animal day)a
として算出した。
a各消費期間について各動物がケージ中で終日生きていた日の和。動物が死んだ場合、その死亡日は動物日として数えない。例えば、4匹の動物が5日間ケージ中にいれば20動物日になり、1匹が3日目に死んだ場合は、動物日は1になる。
以下の略号を使用した:「ACMO」:手作業による観察によって無効となった自動カウント;「CS」:凝固検体;「NSAD」:試料なし動物死亡(No sample animal died)。
以下の略号を使用した:「CS」:凝固検体;「NS」:検体なし;「NSAD」:試料なし動物死亡;「NVIR」:結果に再現性がないため無効。
分析限界未満のBUN値(<10)は計算から除外する。分析限界未満のTBILI値(<0.2)は計算から除外する。
総タンパク質-アルブミン
として算出した。
アルブミン÷グロブリン
として算出した。
体積、pHおよび比重についてのみ、群平均を提示する。
器官重量は、絶対値、剖検の日に記録された重量を用いる最終体重に対する相対値、および脳重量に対する相対値として提示した。
組織学注記に別段の明記がある場合を除き、検査した器官/組織は、規定(required)の(ルーチン)切片であった。
ごくわずか 変化は辛うじて認識できる程度であり、かつ/または極めて少ない/極めて小さい病巣または区域が冒されている。
わずか 変化は、より容易に目につくが、冒された少ない/小さい病巣または区域として明白であるに過ぎない。
中等度 変化は明らかに存在し、はっきりわかるサイズおよび/または数である。
顕著 変化は、切片の多くの区域に数多く存在し、かつ/または突出したサイズである。
重度 変化は組織のかなりの部分を冒し、かつ/またはサイズが大きい。
研究中には以下にあげる研究計画からの逸脱が起こった。しかし、理論に束縛されることは望まないものの、これらの逸脱は研究の妥当性または完全性を損なわなかったとみなした。
*TK用動物
A=確認不可能な時間にわたる漏れがカテーテルに見いだされた。
B=明白な理由なし。
C=尾静脈カテーテル障害;福祉上の理由から投与停止。
予備混合物の分析により、試験物質は媒体中で室温(名目上20℃)において少なくとも24時間および2~8℃(この研究において使用した保管条件下)において少なくとも8日間は安定であることが確認された。処置期間中に行った分析により、1日目の1mg/mL(第2群)製剤を除けば、適当な濃度の投与溶液が投与されたことが確認された。1日目の1mg/mL投与溶液は名目値の86.7%であった。理論に束縛されることは望まないが、メニスカスにおける相互作用により、投与製剤分析のために収集された体積が分析結果を低下させたと結論した。以後の週1回の調製物については分析のために収集する体積を増やし、適当な濃度であることを確認した。
1日目のブリンシドフォビル処置動物では、ブリンシドフォビルのピーク血漿中濃度は、注入開始後1~2時間に見いだされ、1~15mg/kgの範囲の用量に対して、平均濃度は215ng/mL~3670ng/mLの範囲にあった。ブリンシドフォビルの血漿中濃度は、4mg/kg用量群および15mg/kg用量群については8時間時点でも定量可能なままであったが、1mg/kg用量群については2時間時点までしか定量可能でなかった。1日目に、ブリンシドフォビルの血漿中濃度は、用量が1mg/kgから15mg/kgまで増加するにつれて増加した。
NC=算出せず;1mg/kg用量群については、定量可能な2つのデータポイントだけを使ってAUClast値が算出された。
NC=算出せず;1mg/kg用量群については、定量可能な2つのデータポイントだけを使ってAUClast値が算出された。
1日目のブリンシドフォビル処置動物において、1mg/kg用量群(ラット6匹中0匹)および4mg/kg用量群(ラット6匹中1匹)では、一般に、投与開始後に収集された最初の試料(注入開始後1時間)で、代謝産物CDVの個々の血漿中濃度を定量することはできなかった。しかし、15mg/kg用量群では、ラット6匹中5匹で、1時間試料収集時点において、CDVの個々の血漿中濃度を定量することができた。
NC=算出せず;1mg/kg用量群については、定量可能な2つのデータポイントだけを使ってAUClast値を算出した。
NC=算出せず;1mg/kg用量群については、定量可能な2つのデータポイントだけを使ってAUClast値が算出された。
29日目でのTK試料の収集に先だって動物4107を安楽死させたので、15mg/kg用量群についてはN=5。
投与相
この研究では予定外の死が3例あったが、それらはいずれもブリンシドフォビル関連とはみなさなかった。2匹(毒性試験動物番号2595および1005)の死因は、ブリンシドフォビル関連ではないと決定された。3匹目(TK用動物番号4107)の死因は決定することができなかった。
ブリンシドフォビル関連死はなかった。
投与相
4mg/kgおよび15mg/kgのブリンシドフォビルの投与は、一部の動物(両性)に断続的な臨床徴候をもたらした。断続的な臨床徴候は、頻呼吸および背弯姿勢からなり、立毛、部分閉眼、活動減少、不規則呼吸および/または平坦姿勢を伴う場合も伴わない場合もあった。検証のために手作業による白血球分画を行い、必要であれば絶対値を算出した。これらの徴候は一般に注入に続いて22日目と29日目の間に見られ、発生率は用量に関連した。
処置相中に観察された臨床徴候はすべて、回復期間の最初の日までに完全に回復した。回復相中にブリンシドフォビル関連臨床徴候はなかった。
投与回復相の終了時に眼科学に対するブリンシドフォビル関連効果はなかった。
体重または体重変化に対するブリンシドフォビル関連効果はなかった。
投与相
1週目、2週目、3週目および/または4週目に≧1mg/kg/投与を投与された雄(4週目の-16%同時対照まで)および3週目および4週目に15mg/kg/投与を投与された雌(3週目の-9.8%同時対照まで)では、摂食量に、ごくわずかな統計学的に有意なブリンシドフォビル関連減少があった。摂食量の減少は体重または体重増加には影響がなかった。
回復期間中はどの動物の摂食量にもブリンシドフォビル関連効果がなかったので、処置相中に観察された摂食量のブリンシドフォビル関連減少は、完全に可逆的であった。
血液学:投与相
試験物質に関連する血液学的変化はなかった。
14日間の回復後に試験物質関連の血液学的所見はなかった。
凝固時間に対する試験物質関連効果はなかった。
14日間の回復後に、すべての値は対照と同等であった。
投与相
試験物質関連臨床化学変化はなかった。
14日間の回復後に試験物質関連の臨床化学所見はなかった。
投与相
尿検査に対する試験物質関連効果はなかった。
14日間の回復後に、すべての値は対照と同等であった。
≧4mg/kg/投与を投与した雄では、対照と比較して、ブリンシドフォビルに関連する、ごくわずか~軽度の用量依存的な精巣重量の低下が存在した(表94)。精巣重量の低下は顕微鏡的に生殖細胞欠乏と相関した。15mg/kg/投与の雄は、精巣上体重量がごくわずかに低下していた。しかし、理論に束縛されることは望まないが、相関する顕微鏡所見はなかったので、この重量低下は、偶発的であり、精巣における顕微鏡的変化とは無関係であるとみなした。
aブリンシドフォビル処置群についての平均値と対照群についての平均値との間に統計的有意差。- =CMX00関連ではない;NA=該当なし。
aブリンシドフォビル処置動物についての平均値と対照動物についての平均値との間に統計的有意差。- =CMX00関連ではない;NA=該当なし。
この研究の投与相中に予定外の死が3例あった。対照雄と1mg/kg/投与を投与した雌の2匹は、ブリンシドフォビルとは無関係な原因により、投与相中に死亡するか、安楽死させた。3匹目は、15mg/kg/投与を投与された毒物動態学用の雄であり、投与相中に安楽死させたが、死因は決定することができなかった。回復相中にブリンシドフォビル関連死はなかった。
ブリンシドフォビル関連所見
投与期間の終了時にブリンシドフォビル関連肉眼所見は観察されなかった。
大半の肉眼所見は注入静脈における炎症に関連し、対照を含むすべての群に存在した。これらの所見には、カテーテル出口作製部位の痂皮または肥厚および注入静脈に関連する異常内容物、腫瘤、肥厚および/または浮腫、腎臓の異常色および腫瘤、肝臓の不規則表面または腫瘤ならびに肺における暗いまたは青白い区域および腫瘤が含まれた。顕微鏡的にはこれらの所見は炎症および壊死と相関した。リンパ節および脾臓の腫大および異常色は、顕微鏡的には、反応性リンパ系プロセス(reactive lymphoid process)(リンパ節および脾臓における濾胞細胞充実度の向上)、炎症部位からの血液の排液(リンパ節における赤血球増加/赤血球貪食)または髄外造血(脾臓)と相関した。これらの変化はすべて、注入部位/手順に関連する炎症に伴う全身性反応であるとみなした。
試験物質関連所見
回復期間の終了時に、ブリンシドフォビル関連肉眼所見は、15mg/kg/投与の雄における精巣および精巣上体に限定されていた。
注入手順に関連する主な肉眼所見には、注入静脈の異常内容物、腫瘤、肥厚および/または浮腫、脾腫および腎リンパ節腫大が含まれた。これらの所見は、顕微鏡的には、注入静脈の炎症および膿瘍形成ならびにリンパ器官における濾胞性細胞充実度および形質細胞増加と相関した。副腎腫大は、皮質過形成(生理的ストレスに関連)と相関した。
ブリンシドフォビルに関連する顕微鏡所見は、≧4mg/kg/投与の雄における精巣、精巣上体および/または精嚢、≧4mg/kg/投与の雄および雌における腸管、ならびに15mg/kg/投与の雄および雌における皮脂腺に存在した。
ブリンシドフォビル関連所見
雄性生殖器官(精巣、精巣上体、精嚢)
≧4mg/kg/投与の雄の精巣にはブリンシドフォビルに関連する生殖細胞欠乏が存在した(表96)。これらの変化は両側性であり、4mg/kg/投与ではごくわずか~わずか、15mg/kg/投与ではわずか~中等度であり、重症度の等級分けは一般に、欠乏の影響を受ける細胞タイプの数を反映した。4mg/kg/投与では生殖細胞欠乏が、精原細胞から前細糸期精母細胞までの一様でない喪失を特徴とした。15mg/kg/投与では、生殖細胞欠乏が精原細胞から太糸期精母細胞までの一様でない喪失を特徴とし、後期細管(late stage tubule)における太糸期精母細胞の多少の残留および後期細管における生殖細胞の時折の活発な変性(occasional active degeneration)をしばしば伴った。
≧4mg/kg/投与において、雄および雌の小腸(十二指腸、空腸および/または回腸)には、陰窩上皮の単細胞壊死(ごくわずか~中等度)が存在し、それは重症度および/または発生率に関して用量依存的であった(表97)。この変化は、時折、ごくわずかな陰窩上皮過形成を伴った。15mg/kg/投与の雄および雌の大腸(盲腸および/または結腸)の腺上皮にも、ごくわずかな単細胞壊死が存在した。
a, b重症度グレードの発生数は十二指腸、空腸および回腸aならびに盲腸および結腸bについて記録された最も高いグレードを表す。
c十二指腸は1匹では自己融解し、読み取れなかった。
d発生数には予定外の死1例(動物番号2595)が含まれる。
- =所見がない。
15mg/kg/投与の雄および雌には皮脂腺萎縮(わずか~顕著)が存在した(表98)。顕著な重症度は、顕微鏡的に皮脂腺の非存在を示し、残りの付属器(毛包)には変化がなかった。
媒体対照群およびブリンシドフォビルを投与した動物には、注入手順に関連する顕微鏡所見が観察された。理論に束縛されることは望まないが、多くの所見は、カテーテル周囲血栓、縫合糸肉芽腫およびカテーテル静脈における内膜増殖(Weber, 2011)ならびに肺における血管周囲好酸性炎症細胞浸潤(Morton, 1997)を含む、カテーテル挿入によく付随するものであった。一部の動物には、カテーテル静脈中の細菌コロニーによる慢性活動性炎症、膿瘍形成および血栓症、ならびにカテーテル出口作製部位における表皮壊死および/または炎症路(inflammatory tract)および膿瘍があった。慢性活動性炎症、膿瘍形成、梗塞および/または壊死は、他の器官、主として腎臓および肝臓にも、時折、存在した。理論に束縛されることは望まないが、これらの変化は、カテーテル静脈の細菌感染の結果である可能性が高かった。感染に対する免疫応答を示す所見には、骨髄における細胞充実度の総合的向上または顆粒球の増加、リンパ節における濾胞性細胞充実度の向上および形質細胞増加ならびに脾臓における濾胞性細胞充実度の向上、マクロファージの増加および/または髄外造血が含まれた。リンパ器官における他の所見、例えば細胞充実度の低下および壊死、ならびに副腎における皮質過形成および腟粘液分泌が、ストレスに関連するとみなした。
腎臓
4mg/kg/投与の投与を受けた雄1匹(動物番号3048)および雌1匹(動物番号3560)において、腎臓の皮質尿細管上皮に好酸性球状物質が存在した。関連する炎症性または変性性の変化はなかった。これらの球状物質は、鉄に関するプルシアンブルーおよび赤血球に関する一般染色としてのマルチウス・スカーレット・ブルー(Martius Scarlet Blue)では、陰性染色を呈した。
回復期間の終了時に、≧4mg/kg投与の雄では、精巣の成熟欠乏と共に、最終剖検動物において同定された細胞集団の継続的な欠乏があった(表99)。15mg/kg/投与では、この変化は、一般に伸長途上の精子細胞(elongating spermatid)だけを残す大半の生殖細胞集団の欠乏を特徴とし、しばしば多巣性細管萎縮を伴った。4mg/kg/投与では、初期段階細管からXIII期細管において、精原細胞、精母細胞および円形精子細胞の一様でない喪失があった。
15mg/kg/投与では、回復動物の雄および雌数匹が、骨髄における細胞充実度のごくわずか~わずかな低下を有した(表100)。これは投与期間の終了時には観察されなかった所見である。
a重症度グレードの発生数は胸骨髄または大腿骨髄について記録された最も高いグレードを表す。
- =所見がない。
回復期間の終了時には、投与期間の終了時に観察された上述のものと類似する一連の手順関連顕微鏡観察結果が存在した。これらは注入カテーテルの感染に関連し、理論に束縛されることは望まないが、ブリンシドフォビルには関連しないとみなした。
要約
10mg、25mgおよび50mgのブリンシドフォビルを健常被験者に投与した。IVブリンシドフォビル投与は、10mgで、経口投与された100mgのブリンシドフォビルと類似する曝露を与えることがわかった。 どちらのIVブリンシドフォビル用量(10mgおよび25mg)も一般的に安全であり、忍容性は高いことがわかった。薬物関連有害事象、胃腸有害事象および段階的検査異常(例えば溶血毒性および腎毒性)はいずれも観察されなかった。
この二重盲検研究では、逐次単回用量漸増コホートにおいてIV BCVまたは偽薬を与えるために、被験者を3:1にランダム化した(下記表101および102)。血漿中PK試料を7日にわたって収集し、HPLC-MSによってアッセイした。血漿中BCV PKパラメータを非コンパートメント分析によって決定し、用量比例性を評価した。安全性評価を14日にわたって収集した。
この分析のためのデータは健常被験者における2つの単回投与BCV研究によって得た。第1の研究は、24人の被験者が登録されて、各期間に1回、BCV経口懸濁液100mgの2つの製剤が絶食下で与えられる、2期間クロスオーバー生物学的同等性研究であった。PBMCが第1期間に収集された12人の被験者からのデータをこの分析に含めた。これらの被験者は100%女性、31~59歳、58~88kgであった。上に概説した第2の研究には40人の被験者が登録され、IV BCVまたは偽薬が投与された。2時間または4時間IV注入としてBCV 50mgが投与された18人の被験者からのデータをこの分析に含めた。これらの被験者は、100%男性、18~46歳、64~106kgであった。一連のPBMC試料を14日にわたって収集し、HPLC-MS-MSによってアッセイした。PBMC CDV-PP PKパラメータを非コンパートメント分析によって決定した。
CmaxおよびAUC∞を幾何平均(%CVb)[最小-最大]として提示する。
Tmaxは、コホート1~3(2時間注入)の場合で2時間、および2.5~4時間(4時間注入)であった。
1. BCV 50mg 4時間注入被験者2人および偽薬被験者1人においてALT>2×ULN;1例のALT上昇がAEとみなされた。
2.コホート3では、被験者4人に5例の薬物関連AE。
3.コホート4では、被験者5人に9例の薬物関連AE。
データは幾何平均(CVb%)[最小,最大]として提示する。
研究CMX001-108についてはAUCinfの代わりにAUClastを提示する。
データを幾何平均(CVb%)[最小-最大]として提示する。
ND:大半のCDV濃度が定量下限未満であったので実施せず。
外挿されたAUCパーセントが高いので、AUCinfおよびt1/2は報告しない。
2時間IV注入または4時間IV注入として投与されたBCV 50mgの単回投与は、BCV 100mg経口懸濁液に匹敵する細胞内CDV-PP曝露を送達した(表107)。PBMC CDV-PP曝露は注入継続時間に逆相関した(表107)。
本開示を上述の具体的態様との関連で説明したが、その数多くの代替態様、変更態様および他の変形は、当業者には明らかであるだろう。そのような代替態様、変更態様および変形はすべて、本開示の要旨および範囲に含まれるものとする。
Claims (13)
- ブリンシドフォビル、
マンニトール、
L-アルギニン、および
水
を含み、pHが約8.0である、ウイルス感染を有する対象を処置するのに使用するための薬学的組成物。 - 前記ブリンシドフォビルが、約10.0mg/mLの濃度で存在する、請求項1記載の薬学的組成物。
- 前記マンニトールが、約2.5~9%(w/v)の濃度で存在する、請求項1記載の薬学的組成物。
- 前記マンニトールが、約2.5%(w/v)の濃度で存在する、請求項1記載の薬学的組成物。
- 前記マンニトールが、約5%(w/v)の濃度で存在する、請求項1記載の薬学的組成物。
- 前記L-アルギニンが、約100~200mMの濃度で存在する、請求項1記載の薬学的組成物。
- 前記L-アルギニンが、約100mMの濃度で存在する、請求項1記載の薬学的組成物。
- 前記pHが、HClおよび/またはNaOHを用いて調節される、請求項1記載の薬学的組成物。
- ブリンシドフォビルが約10.0mg/mLの濃度で存在し、
マンニトールが約25~50mg/mLの濃度で存在し、
L-アルギニンが約17.4mg/mLの濃度で存在する、請求項1記載の薬学的組成物。 - ブリンシドフォビルが約17.8mMの濃度で存在し、
マンニトールが約137.5~275mMの濃度で存在し、
L-アルギニンが約100mMの濃度で存在する、請求項1記載の薬学的組成物。 - 前記ウイルス感染が、ポリオーマウイルス、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、またはそれらの組合せから選択される、請求項1記載の薬学的組成物。
- 溶血をもたらさない、請求項1記載の薬学的組成物。
- 胃腸毒性をもたらさない、請求項1記載の薬学的組成物。
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