KR20080065689A - 약물 재구성 또는 희석을 위한 염화나트륨 용액 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 주사시 제형이 적혈구 응집, 용혈 및/또는 세포 수축을 유발하지 않도록 하는 주사용 약제학적 제형을 제조하는 방법을 제공한다. 응집을 예방하기 위해, 즉각 주사용의 약제학적 제형은 충분한 이온 강도를 가질 필요가 있다. 용혈 또는 세포 수축을 예방하기 위해, 즉각 주사용의 약제학적 제형은 혈장에 대해 거의 등장성일 필요가 있다. 본 발명은 응집을 예방하기에 충분한 이온 강도 및 유의적인 용혈 또는 세포 탈수 또는 수축을 예방하는데 요구되는 긴장성 둘다를 갖는 주사용 약제학적 제형을 제조하는 방법을 제공하다. 본 발명의 방법은 동결건조된 케이크(또는 기타 비액체 약제학적 제형)를 용액으로 재구성하거나 약제학적 제형 용액을 희석시키기 위한 약 25mM 내지 약 150mM의 염화나트륨 용액의 용도를 포함한다.
염화나트륨, 희석, 약제학적 제형, 이온 강도, 동결건조된 케이크

Description

약물 재구성 또는 희석을 위한 염화나트륨 용액{Sodium chloride solution for drug reconstitution or dilution}
본 출원은 2005년 11월 1일자로 출원된 미국 특허원 제60/732,221호에 대한 우선권을 주장하고, 이의 전반적인 내용은 본원에 참조로서 인용된다.
본원에 인용된 모든 특허, 특허원 및 특허공보는 이의 전체 내용이 본원에 참조로서 인용된다. 본원에 기재되고 청구된 본 발명때까지 당업자에게 공지된 상황을 보다 완전하게 기술하기 위해 전반적인 이들 공보의 기재가 참조로서 인용된다.
당해 특허 문헌의 기재 내용중 일부는 저작권 보호를 받는 구성요소를 포함한다. 저작권자는 어떤 누군가가 특허상표청 파일 또는 기록에 나타난 바와 같은 특허문헌 또는 특허 기재를 복사 재현하는데 반대하지 않지만 그밖에 모든 것에 대해서는 저작권을 보유한다.
IV 주사용 약물 투여동안에 정맥내(IV) 라인에서와 같이 전혈이 약물 용액과 혼합되는 경우, 약물 용액이 충분한 이온 강도를 갖지 않는다면 경화 또는 적혈구 응집(또한 적혈구 세포 응집으로도 통칭됨)이 발생할 수 있다. 적혈구 응집은 예 를 들어, 물중의 5% 덱스트로스(통상적인 대형 용적의 비경구 용액) 및 이온강도가 낮은 많은 약품에서 발생한다.
약품은 흔히 동결건조되고 따라서 비경구 주사전에 용액으로 재구성될 필요가 있다. 그러나, 동결건조된 제품이 저이온 강도 용액으로 재구성되는 경우, 수득한 제제는 또한 적혈구 응집을 유발할 수 있다. 주사용 멸균수(sWFI)와는 반대로 통상의 식염 용액(0.9% NaCl)을 사용한 동결건조된 케이크의 재구성이 부가적인 이온 강도를 제공하지만 수득한 약물 용액은 고장성일 수 있고 주사시 바람직하지 못한 부작용을 가질 수 있다.
따라서, 동결건조된 케이크를 재구성하거나 약제학적 용액을 희석시켜 혈장에 대해 등장성이고 적혈구 응집을 유발하지 않기에 충분한 이온 강도를 갖는 주사용 제제를 수득하기 위해 사용될 수 있는 용액이 여전히 요구된다.
발명의 요약
본 발명은 저이온 강도의 용액이 혈액과 접촉하여 적혈구 응집이 유발된다는 것을 발견하였다. 따라서, 약제학적 제형이 5% 덱스트로스, 3% 덱스트란, 또는 sWFI와 같은 이온 강도가 낮은 용액중에서 재구성 또는 희석에 의해 정맥내 주사용으로 제조되는 경우, 수득한 제제는 혈액과 거의 등장성이 되는데 요구되는 몰삼투압 농도를 가질 수 있지만 이들은 흔히 응집을 예방하는데 충분한 이온 강도를 갖지 못한다. 다른 한편, 약제학적 제형이 식염수(0.9% NaCl 또는 154 mM NaCl)와 같은 고이온 강도 용액으로 재구성 또는 희석에 의해 정맥내 주사용으로 제조되는 경우, 수득된 제제는 응집을 예방하기에 충분한 이온 강도를 가질 수 있지만 혈액에 대해 고장성인 몰삼투압 농도를 가져 적혈구 세포(RBC)의 탈수, 정맥 염증 및/또는 주사가 빈번하게 또는 이따금씩 반복되는 경우 혈전성정맥염을 유발할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 정맥내 주사용 약제학적 제형을 제조하는 방법을 제공하고, 당해 방법은 약 25 mM 내지 약 150 mM 염화나트륨 용액을 약제학적 제형에 첨가하여 정맥내 주사용으로 제조된 제형을 수득하는 단계를 포함하고, 이때, 제조된 제형은 혈장에 대해 거의 등장성이거나 혈장에 대해 약간 저장성이거나 약간 고장성이며 충분한 이온 강도를 가져 적혈구 응집(또는 적혈구 응집)이 예방된다.
제조된 제형은 예를 들어, 이것이 약 270 mOsm/L 내지 약 330 mOsm/L인 몰삼투압 농도를 가질 때 혈장에 대해 거의 등장성이다. 제조된 제형은 예를 들어, 이것이 약 220 mOsm/L 내지 약 270 mOsm/L인 몰삼투압 농도를 갖는 경우 혈장에 대해 약간 저장성이다. 제조된 제형은 예를 들어, 이것이 약 330 mOsm/L 내지 약 600 mOsm/L인 몰삼투압 농도를 가질 때 혈장에 대해 약간 고장성이다.
한 측면에서, 제조된 제형은 예를 들어, 이것이 Na+ 및 Cl- 이온 약 25 mEq/L 이상을 갖는 경우 적혈구 응집을 예방하기에 충분한 이온 강도를 갖는다. 또 다른 측면에서 제조된 제형은 이것이 예를 들어, 약 40mEq/L 이상의 Na+ 및 Cl- 이온을 갖는 경우 적혈구 응집을 예방하기에 충분한 이온 강도를 갖는다. 또 다른 측면에서, 제조된 제형은 이것이 예를 들어, Na+ 및 Cl- 이온 약 40 mEq/L 이상 내지 Na+ 및 Cl- 이온 약 150 mEq/L 이하를 갖는 경우 적혈구 응집을 예방하기에 충분한 이온 강도를 갖는다. 또 다른 측면에서, 제조된 제형은 이것이 예를 들어, 약 2.5 mS/cm 이상의 전도성으로 측정된 바와 같은 이온 강도를 갖는 경우 적혈구 응집을 예방하기에 충분한 이온 강도를 갖는다. 또 다른 측면에서, 제조된 제형은 이것이 예를 들어, 약 4.0 mS/cm 이상의 전도성으로 측정된 바와 같은 이온 강도를 갖는 경우 적혈구 응집을 예방하기에 충분한 이온 강도를 갖는다.
주사용으로 제조되는 약제학적 제형은 예를 들어, 비액체 제형 또는 용액 제형일 수 있다. 비액체 제형은 따라서 염화 나트륨 농도가 약 25-150 mM, 25-100 mM, 25-80 mM, 25-40 mM, 25-35 mM, 25-30 mM, 또는 약 40 mM인 염화나트륨 용액에 의해 용액으로 재구성될 수 있다. 액체 또는 용액 제형은 따라서 염화나트륨 농도가 약 25-150 mM, 25-100 mM, 25-80 mM, 25-40 mM, 25-35 mM, 25-30 mM, 또는 약 40 mM인 염화나트륨 용액에 의해 희석될 수 있다. 예를 들어, 비액체 제형은 동결건조된 제형일 수 있다.
한 측면에서, 첨가되는 염화나트륨 용액은 약 40 mM 내지 약150 mM의 염화나트륨을 포함한다. 한 측면에서, 첨가되는 염화나트륨 용액은 약 40 mM 내지 약 150 mM 염화나트륨으로 필수적으로 이루어진다. 한 측면에서, 첨가되는 염화나트륨 용액은 약 40mM 염화나트륨을 포함한다. 한 측면에서, 첨가되는 염화나트륨 용액은 40 mM의 염화나트륨 용액으로 필수적으로 이루어진다. 한 측면에서, 첨가되는 염화나트륨 용액은 염화나트륨 용액이 약 40 mM ± 10 mM 염화나트륨을 갖는 용액으로 필수적으로 이루어진다.
한 측면에서, 염화나트륨 용액 첨가전에 약제학적 제형은 감지할만한 양의 이온화 염을 함유하지 않는다. 이온화 염의 감지할만한 양은 예를 들어, 약 5 mM 초과일 수 있다. 또 다른 측면에서, 이온화 염의 감지할만한 양은 예를 들어, 약 25mM 초과의 양일 수 있다. 약제학적 제형이 동결건조된 제형이고 예를 들어, 동결건조된 제형이 물중에 재구성될 때 예를 들어 5mM 또는 25mM 초과의 이온화 염을 함유하지 않는 경우 이것은 감지할만한 양의 이온화 염을 함유하지 않는다.
한 측면에서, 염화나트륨 용액의 첨가 전에, 약제학적 제형은 히스티딘, 글라이신, 슈크로스 및 폴리소르베이트를 포함한다. 또 다른 측면에서, 염화나트륨 용액 첨가전에, 약제학적 제형은 히스티딘, 글라이신, 슈크로스, 폴리소르베이트 및 치료학적 단백질을 포함한다. 여기서, 치료학적 단백질은 예를 들어, 응고 장애의 치료 또는 혈전형성 치료를 위해 사용되는 단백질일 수 있고, 이는 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 XIII, 항체, 이의 관련 유사체 및 이의 유도체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 또 다른 측면에서, 염화나트륨 용액의 첨가전에, 약제학적 제형은 히스티딘, 글라이신, 슈크로스, 폴리소르베이트 및 인자 IX(재조합 인자 IX(rFIX)를 포함함)를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 인자 IX는 예를 들어, PEG화된 인자 IX, 알부민-인자 IX 또는 면역글로불린(전체 또는 이의 도메인)-인자 IX와 같은 인자 IX를 포함하는 단백질 융합체 및 글리코실화된 인자 IX를 포함하는 변형된 버젼의 인자 IX를 포함할 수 있다.
염화나트륨 용액의 첨가전에, 약제학적 제형이 동결건조된 제형인 한 측면에서, 제형이 물(충전 용적과 동일한 용적, 즉 동결건조 전 제형의 용적)중에서 재구 성되는 경우 측정시, 제형은 (a) 약 5 mM 내지 약 30 mM 히스티딘; (b) 약 0.1M 내지 약 0.3M 글라이신; (c) 약 0.5 내지 약 2 % 슈크로스; 및 (d) 약 0.001 내지 약 0.05 % 폴리소르베이트(또는 약 0.005 내지 약 0.05 %)를 포함한다. 한 측면에서, 제형이 물중에 재구성되는 경우 측정시,, 제형은 추가로 (e) 약 0.1 mg/mL 내지 약 100 mg/mL 이상의 치료학적 단백질, 또는 약 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000 또는 2000 IU/mL (국제 단위/mL) 이상의 치료학적 단백질을 포함할 수 있다. 당해 제형은 이것이 물중에 재구성되는 경우 측정시, (e) 약 0.1 mg/mL 내지 약 100 mg/mL 이상의 인자 IX, 또는 약 0.4 mg/mL 내지 약 20 mg/mL의 인자 IX, 또는 약 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000 또는 2000 IU/mL (국제 단위/mL) 이상의 인자 IX를 추가로 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 정맥내 주사로부터 유발되는 적혈구 응집을 예방하기 위한 방법을 제공하고 이때 당해 방법은 약제학적 제형을 약 25 mM 내지 약 150 mM의 염화나트륨 용액으로 재구성하거나 희석시켜 재구성되거나 희석된 약제학적 제형이 정맥내 주사로 피검체에 투여되는 경우 적혈구 응집을 예방하기에 충분한 이온 강도를 갖도록 함을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 정맥내 주사용의 동결건조된 약제학적 제형을 제조하는 방법을 제공하고 당해 방법은 동결건조된 약제학적 제형을 약 25 mM 내지 약 150 mM 염화나트륨 용액으로 재구성하여 재구성 후 제형이 적혈구 응집을 예방하기에 충분한 이온 강도 및 거의 등장성(또는 약간 저장성 또는 약간 고장성)인 몰삼투압 농도를 갖도록 함을 포함한다.
한 측면에서, 동결건조된 제형은 염화나트륨 용액으로 재구성하고 이때 재구성을 위해 사용되는 염화나트륨 용액은 동결건조전 제형의 용적(즉, 충전 용적) 미만이다. 이러한 방식으로, 본 발명은 주사될 제제의 용적을 감소시키는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 동결건조된 제형은 염화나트륨 용액으로 재구성되고 이때 재구성을 위해 사용되는 염화나트륨 용액의 용적은 동결건조전 용적(즉, 충전 용적)을 초과한다. 이러한 방식으로, 본 발명은 주사될 제형의 등장성을 유지하기 위한 방법을 제공한다.
예를 들어, 동결건조된 제형은 동결건조전 제형 용적이 4ml인 경우 5ml의 염화나트륨을 사용한 재구성과 같이 동결건조전 제형 용적을 초과하는 염화나트륨 용액 용적으로 재구성될 수 있다. 예를 들어, 4ml의 물중에 재구성된 동결건조된 4ml의 용적은 10mM 히스티딘, 260mM 글라이신, 1% 슈크로스, 0.005% 폴리소르베이트를 함유하고 약 300 mOsm/L인 등장성 용액이다. 그러나, 동결건조된 제형이 4ml의 40mM NaCl(80 mOsm/L) 용액으로 재구성되는 경우, 수득한 제형은 약간 고장성의 용액(300 mOsm/L + 80 mOsm/L = 380 mOsm/L)을 갖는다. 그러나, 동결건조된 제형이 5 mL의 40 mM NaCl 용액으로 재구성되는 경우, 수득한 용액은 약 8 mM (8 mOsm/L) 히스티딘, 208 mM (208 mOsm/L) 글라이신, 0.8% (24 mOsm/L) 슈크로스, 0.004% (무시할만한 몰삼투압 농도) 폴리소르베이트 및 40 mM (80 mOsm/L) NaCl이고 약 320 mOsm/L이다. 따라서, 충전 용적을 초과하는 염화나트륨 용적과 거의 등장성인 동결건조전 제형을 재구성함에 의해 본 발명은 여전히 거의 등장성인 수득 한 용액을 제공할 수 있다. 다른 말로, 충전 용액과 거의 동일한 또는 미만인 염화나트륨 용액 용적으로 거의 등장성인 동결건조전 제형의 재구성으로 약간 고장성인 용액을 수득할 수 있다. 이를 피하기 위해, 본 발명은 동결건조전 제형의 용적을 초과하는 용적으로 염화나트륨 용액을 사용하여 동결건조된 제형을 재구성함에 의해 등장성을 유지하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 재구성 후 동결건조된 제형의 등장성을 유지하는 방법을 제공하고 당해 방법은 동결건조전 제형의 용적을 적어도 20% 초과하는 용적으로 동결건조된 제형을 재구성함을 포함하고 이때, 동결건조전 제형은 거의 등장성이어서 재구성된 제형은 거의 등장성이고 적혈구 응집을 예방하기에 충분한 이온 강도를 갖는다. 동결건조전 용적 보다 큰 용적으로 동결건조된 제형을 재구성함에 의해 동결건조된 케이크의 몰삼투압 농도에 대한 기여도가 동결건조전과 비교 하여 재구성으로부터 용적의 증가와 직비례하여 감소한다. 예를 들어, 용적 X중의 300 mOsm/L의 긴장성을 갖는 동결건조전 제형이 용적 X 보다 20% 초과인 용적 Y의 용액중에서 재구성되는 경우 300 mOsm/L은 용적 Y에서 240 mOsm/L이다(용적의 20% 증가로 삼투압이 20% 감소한다). 용적 Y의 용액이 염화나트륨 용액인 경우, 염화나트륨 용액의 긴장성에 대한 당해 기여도는 당해 용액중 염화나트륨 농도의 2배이다. 예를 들어, 용적 Y의 용액이 40mM인 경우, 재구성된 용액은 240 mOsm/L + 80 mOsm/L의 긴장성을 갖고 이는 거의 등장성이고 적혈구 응집을 예방하기에 충분한 이온 강도를 갖는다.
하나의 측면에서, 본 발명은 정맥내 주사용 동결건조된 인자 IX 제형을 제조 하는 방법을 제공하고 이때, 당해 방법은 약 25 mM 내지 약 150 mM 염화나트륨 용액을 동결건조된 인자 IX 제형에 첨가하여 정맥내 주사용으로 제조된 제형을 수득함을 포함하고, 이때 제조된 제형은 혈장에 대해 거의 등장성이거나 약간 저장성 또는 약간 고장성이고 적혈구 응집을 예방하기에 충분한 이온 강도를 갖는다. 한 측면에서, 동결건조된 인자 IX 제형은 물중에서 재구성되는 경우 측정시,, (a) 약 5 mM 내지 약 30 mM 히스티딘; (b) 약 0.1M 내지 약 0.3M 글라이신; (c) 약 0.5 내지 약 2 % 슈크로스; (d) 약 0.001 내지 약 0.05 % 폴리소르베이트; 및 (e) 약 0.4 mg/mL 내지 약 20 mg/mL의 인자 IX, 또는 약 0.1 mg/mL 내지 약 100 mg/mL 또는 몇몇 다른 가용성 양의 인자 IX 또는 약 10 IU/mL 내지 약 500 IU/mL의 인자 IX, 또는 약 10 IU/mL 내지 약 5000 IU/mL의 인자 IX를 포함한다. 한 측면에서, 약 40 mM 염화나트륨 용액을 동결건조된 인자 IX 제형에 첨가한다. 한 측면에서, 약 5 mL의 약 40 mM 염화나트륨을 동결건조된 인자 IX 제형에 첨가한다. 한 측면에서, 동결건조된 IX 제형은 물중에 재구성되는 경우 측정시, 약 10mM 히스티딘, 약 0.26M 글리신, 약 1% 슈크로스 및 약 0.05%의 폴리소르베이트를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 동결건조된 케이크가 약 5mL의 물중에 재구성되는 경우, 용액이 (i) 약 5 mM 내지 약 30 mM 히스티딘; (ii) 약 0.1M 내지 약 0.3M 글라이신; (iii) 약 0.5 내지 약 2 % 슈크로스; (iv) 약 0.001 내지 약 0.05 % 폴리소르베이트; 및 (v) 약 0.4 mg/mL 내지 약20 mg/mL의 인자 IX, 또는 약 0.1 mg/mL 내지 약 100 mg/mL 또는 몇몇 다른 가용성 양의 인자 IX 또는 약 50 IU/mL 내지 약 500 IU/mL의 인자 IX, 또는 약 10 IU/mL 내지 약 5000 IU/mL의 인자 IX를 포함하는, 동결건조된 케이크를 함유하는 바이알; (b) 25 mM 내지 약 150 mM의 염화나트륨 용액 및 (c) 동결건조된 케이크를 염화나트륨 용액으로 재구성하여, 재구성 후 수득한 용액이 거의 등장성이고 정맥내 주사시 적혈구 응집을 예방하기에 충분한 이온 강도를 갖도록 하기 위한 지침서를 포함하는 약제학적 키트를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 동결건조된 케이크가 4ml의 물중에 재구성되는 경우, 용액이 (i) 약 10 mM 히스티딘; (ii) 약 0.26M 글라이신; (iii) 약 1 % 슈크로스; (iv) 약 0.005 % 폴리소르베이트 80; 및 (v) 약 50 IU/mL 내지 약 5000 IU/mL의 인자 IX를 포함하는, 동결건조된 케이크를 포함하는 바이알; (b) 약 40 mM 염화나트륨 용액; 및 (c) 바이알중 동결건조된 케이크를 약 5ml의 약 40mM 염화나트륨 용액으로 재구성하여, 재구성후 수득한 용액이 (i) 약 7 또는 8 내지 약 10 mM 히스티딘; (ii) 약 200 내지 약 210 mM 글라이신; (iii) 약 0.7% 내지 약 0.9% 슈크로스; (iv) 약 0.004% 폴리소르베이트 80; (v) 약 50 IU/mL 내지 약 5000 IU/mL의 인자 IX; 및 (vi) 약 40 mM의 NaCl을 포함하도록 하기 위한 지침서를 포함하는 약제학적 키트를 제공한다.
도 1은 실시예 3에 기재된 실험으로부터의 적혈구 침강 결과를 보여준다. 적혈구 침강은 EDTA중에 수거된 사람 혈액이 시험 용액과 1:4로 혼합된 변형된 웨스터그렌(Westergren) 방법(실시예 2 참조)을 적용하여 60분에 측정하였다. 60분 후에, 2개의 마크와 적혈구"혈장 접촉면간의 거리 mm를 측정하였다. 수평 막대는 평균을 나타내고 수직 괄호는 총 12명의 공여자로부터의 표준 오차를 나타낸다. 당해 결과는 각각 3명의 공여자로부터의 혈액을 평가하는 4개의 독립적인 실험으로부터 조합되었다.
도 2는 NaCl 용액으로 재구성된 BeneFIX® 제형에 대한 적혈구 침강 평가를 보여준다. 40 mM NaCl 용액이 현재 시판되는 BeneFIX® 제품 또는 새로운 BeneFIX® (동결건조 전 충전 용액이 4ml로 구성되고 10 mM 히스티딘, 260 mM 글라이신, 1% 슈크로스, 0.005% 폴리소르베이트 80의 농도를 갖는 BeneFIX®-R; 동결건조 후 이것이 5ml의 40mM 염화나트륨 중에 재구성되어 재구성 후 BeneFIX®-R은 40 mM NaCl, 8 mM 히스티딘, 208 mM 글라이신, 0.8% 슈크로스 및 0.004% 폴리소르베이트를 포함한다)의 제형을 재구성하기 위해 사용되는 경우 적혈구 응집을 예방하기에 충분하다.
본 발명은 적혈구 응집, 용혈 및/또는 세포 수축을 유발하지 않는 주사용 약제학적 제형(특히, 정맥내 주사용 제제)을 제조하기 위한 방법을 제공한다. 응집을 예방하기 위해, 주사용 약제학적 제형은 충분한 이온 강도를 가질 필요가 있다. 용혈 또는 세포 수축을 예방하기 위해, 주사용 약제학적 제형은 혈장에 대해 거의 등장성일 필요가 있다. 본 발명은 응집을 예방하기 위해 충분한 이온 강도 및 상당한 용혈 또는 세포 탈수 또는 수축을 예방하기 위해 요구되는 긴장성 둘다를 갖는 주사용 약제학적 제형을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 동결건조된 케이크(또는 비액체 약제학적 제형)를 재구성하거나 약제학적 제형 용액을 희석시키기 위해 약 25 mM 내지 약 150 mM인 염화나트륨 용액의 사용을 포함한다. 염화나트륨 용액이 재구성 또는 희석을 위해 사용되든지 간에, 특정 염화나트륨 용액의 첨가로 혈장 또는 혈액에 대해 거의 등장성이고 주사시, 특히 정맥내 주사시 적혈구 응집을 예방하기에 충분한 이온 강도를 갖는 주사용 약제학적 제제를 수득한다.
용어
본원에 사용된 바와 같이, 용액의 몰 농도는 용매의 kg당 용질의 몰 수 이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용액의 몰 농도는 용액 리터당 용질의 몰 수 이다.
본원에 사용된 바와 같이, 삼투몰은 이상적인 용액에서 용매의 비점을 1.86K까지 감소시키는 입자의 수(아보가드로 수)를 형성시키는 물질의 양이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용액의 몰삼투압 농도는 용매의 kg당 용질의 삼투몰 수이다. 몰삼투압 농도는 용액중에 존재하는 입자 수의 척도이고 입자의 크기 또는 분자량과는 무관하다. 이것은 입자 농도에만 의존하는 용액의 성질을 사용하여 측정될 수 있다. 이들 성질은 증기압 감소, 비점 감소, 융점 증가 및 삼투압 증가이고 총체적으로 총체적 성질로서 언급된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용액의 몰삼투압 농도는 용액의 리터당 용질의 삼투몰 수이다.
본원에 사용된 바와 같이, 주사용으로 준비되거나 제조되는 약제학적 제형은 피검체에 투여되도록 의도된 임의의 약물일 수 있다. 예를 들어, 약제학적 제형은 동결건조된 케이크, 용액, 분말 또는 고체일 수 있다. 제형이 액체 형태가 아닌 경우 본 발명의 NaCl 용액으로 재구성된다. 제형이 액체 형태인 경우, 당해 제형은 본 발명의 NaCl로 희석되거나 이와 혼합된다.
이온 강도
이온 강도는 전해질 용액(액체에 용해된 양전하 및 음전하 이온과의 액체)의 특성이다. 이것은 전형적으로 전해질 이온들간에 평균 정전기 상호작용으로서 표현된다. 전해질 이온 강도는 각 이온의 몰 농도(용매의 단위 질량당 물질의 양)를 이의 일치되는 원자가로 곱하는 경우 수득되는 총값의 절반이다.
이온 강도는 전해질의 농도와 밀접하게 관련되고 특정 이온상의 전하가 전해질중의 다른 이온(소위 이온 대기)에 의해 얼마나 효과적으로 보호되거나 안정화되는지를 지적한다. 이온 강도와 전해질 농도간의 주요 차이는 이온중 일부가 보다 고도로 하전된 경우 전자가 보다 높게 나타난다는 것이다. 예를 들어, 완전히 해리된(분해) 황산마그네슘(Mg2+SO4 2-) 용액은 동일 농도의 염화나트륨 (Na+Cl-) 용액 보다 4배 더 높은 이온 강도를 갖는다. 2개 사이의 또 다른 차이는 이온 강도가 유리 이온의 농도를 반영하지만 단지 얼마나 많은 염이 용액에 첨가되는지는 반영하지 않는 다는 것이다. 때때로, 염은 용해될 수 있지만 각각의 이온은 함께 쌍으로 여전히 결합되어 있고 용액내 비하전된 분자와 유사하다. 이 경우에, 이온 강도는 염 농도 보다 훨씬 낮다.
본 발명에 대해, 약제학적 제제는 등장성일 뿐만 아니라 RBC 응집을 예방하기에 충분한 이온 강도를 갖도록 주사용으로 제조된다. 주사용 제제(즉, 본 발명의 NaCl 용액으로 재구성된 동결건조된 케이크 또는 본 발명의 NaCl 용액으로 희석된 약물 용액)의 충분한 이온 강도는 예를 들어, 리터당 약 25 이상의 밀리당량(mEq/L)의 Na+ 및 Cl- 이온을 가질 수 있다. 하나의 양태에서, 충분한 이온 강도는 약 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 약 40 mEq/L 이상의 Na+ 및 Cl- 이온이다.
이온 강도는 또한 용액의 전도성 측면에서 기재될 수 있다. 전도성은 전류를 통하게 하는 물질 또는 용액의 능력이다. 장치에 의해 전도성을 측정하는 원리는 단순한다. 2개의 기판을 샘플중에 놓고 당해 기판을 가로질러 전위를 적용하고(통상적으로 싸인 파동 전압) 전류를 측정한다. 저항률(R)의 역수인 전도성(G)은 옴스 법칙에 따라 전압 및 전류값으로부터 측정한다. G = I/R = I (amps) / E (볼트)
용액내 이온에 대한 전하가 전류의 전도를 촉진시키기 때문에, 용액의 전도성은 당해 용액의 이온 농도에 비례한다. 그러나, 몇몇 상황에서, 전도성은 직접 농도와는 관련이 없을 수 있다. 그러나, 염화나트륨 용액에 대해 전도성은 이온 농도에 직비례한다. 전도성의 기본 단위는 이전에는 mho로 호칭되었던 지멘스(siemens)(S)이다. 시험 샘플의 기하학적 구조가 전도성 수치에 영향을 주기 때문에 표준 측정은 전극 차원에서의 변화를 상쇄시키기 위해 비전도성(specific conductivity) 단위(S/cm)로 나타낸다. 비전도성(C)은 단순히 측정된 전도성(G) 및 전극 셀 상수(L/A)(여기서, L은 전극 사이의 액체 칼럼 길이이고 A는 전극 면적이다)의 산물이다. C = G x (L/A). 셀 상수가 1 cm-1인 경우, 비전도성은 용액의 측정된 전도성과 동일하다. 전극 형태가 다양하다 하더라도 전극은 항상 등가의 이론적 셀로 나타낼 수 있다.
따라서, 한 양태에서, 주사용 제제의 충분한 이온 강도는 예를 들어, 약 4 mS/cm이상의 전도성을 가질 수 있다. 또 다른 양태에서, 주사용 용액의 충분한 이온 강도는 약 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 또는 약 3.9 mS/cm 이상이다.
또한 용액이 적혈구 응집을 예방하기에 충분한 이온 강도를 갖는지에 관한 작동적 정의를 사용하여 "충분한 이온 강도"와 같은 용어를 설명할 수 있다. 예를 들어, 이것은 시험 용액을 전혈에 첨가하고 적혈구 침강 길이를 관찰하는 실험을 기초로 할 수 있다(실시예 2 참조; 적응 변형된 웨스터그렌 방법). 한 양태에서, 시험 용액이 전혈과 4:1의 비율로 혼합되어 60분에서 약 10mm 미만으로 침강하는 경우(예를 들어, 실시예 2, 도 1 및 도 2 참조), 시험 용액은 적혈구 응집을 예방하기에 충분한 이온 강도를 갖는다. 또 다른 양태에서, 시험 용액이 전혈과 4:1의 비율로 혼합되어 60분에서 약 5mm 미만으로 적혈구가 침강하는 경우, 시험 용액은 적혈구 응집을 예방하기에 충분한 이온 강도를 갖는다.
용액 몰삼투압 농도
본 발명의 방법은 혈액에 대해 거의 등장성인 주사용 약제학적 제제를 제공한다. 약제학적 제제가 혈액에 대해 거의 등장성인지 여부를 결정하기 위해 희석제를 포함하는 용액의 모든 화학적 성분에 대한 몰삼투압 농도를 계산한다. 주사용 약제학적 제제(비경구 용액)의 몰삼투압 농도는 사람 신체의 혈액 세포 및 혈관에 역효과를 나타낼 수 있다. 긴장성은 유체 및 용해되거나 희석된 약물에 대해 계산될 수 있고 이는 유체 리터당 밀리삼투압 몰(mOsm/L)의 수치로서 나타낸다. 당해 수치는 또한 몰삼투압 농도로서 공지되어 있다. 혈액의 몰삼투압 농도는 285 내지 310mOsm/L이다. 저장성 또는 고장성 용액이 혈액내로 주사되는 경우, 유체가 세포 안으로 또는 밖으로 이동하여 다양한 역효과를 유발할 수 있다.
용액 몰삼투압 농도는 부분적으로 삼투성 및 삼투압의 개념을 기초로 한다. 삼투성은 혈관 또는 세포막과 같은 반투과성을 막을 통한 용질(용해된 입자)의 확산 또는 유체의 이동이다. 삼투압은 막을 통한 분자의 수송을 촉진시키고 삼투압 몰농도로 나타내고 혈액 또는 혈장과 같은 생물학적 유체와 비교하여 저삼투성(저장성), 동일 삼투성(등장성) 또는 고삼투성(고장성)인 것으로서 언급된다. 용어 긴장성 및 삼투압은 흔히 동의어로 고려된다.
삼투압은 삼투성 기울기(즉, 막의 2개 측면상에서의 상이한 입자 농도)에 응답하여 반투과성 막을 통한 물의 이동을 차단하는데 요구되는 하이드로스태틱(또는 하이드롤릭) 압력이다. 혈청 몰삼투압 농도는 삼투압측정기를 사용하여 측정될 수 있거나 용액내에 존재하는 용질의 농도의 합으로서 계산될 수 있다. 연구실에서 측정되는 수치는 통상 몰삼투압 농도로서 언급된다. 용질 농도로부터 계산되는 수치는 연구소에 의해 몰삼투압 농도로서 보고된다. 삼투성의 차이는 이들 2개 수치간의 차이이다.
본원에서, 긴장성 및 삼투압은 동의어로 고려되어야만 하고 광범위로 이해되어야만 한다. 긴장성은 효과적인 몰삼투압 농도를 의미할 수 있고 세포막을 포함하는, 막에 걸쳐 있는 삼투력을 나타내는 능력을 갖는 용액내 용질의 농도의 합과 동일하다. 엄밀한 의미에서, 몰삼투압 농도는 특정 용액의 성질이고 임의의 막과는 무관하다. 긴장성은 특정 막에 대한 용액의 성질이다. 그러나, 본 발명은 혈액 또는 혈장과 같은 생물학적 용액에 대해 등장성인 용액을 언급하고 이러한 언급은 특정 용액이 혈액 또는 혈장 또는 다른 생물학적 용액에 대해 혈액 또는 혈장과 등장성임을 의미하는 것임을 포함한다.
긴장성의 작동적 정의를 사용하여 당해 용어를 설명할 수 있다. 이것은 시험 용액을 전혈에 첨가하고 당해 결과를 관찰하는 실험을 기초로 할 수 있다. 전혈에서 RBC가 팽윤되고 파열되는 경우, 시험 용액은 정상 혈장에 비해 저장성인 것으로 일컬어진다. RBC가 수축하고 톱니모양이 되는 경우, 시험 용액은 정상 혈장에 비해 고장성인 것으로 일컬어진다. RBC가 동일한 상태로 유지되는 경우, 시험 용액은 혈장에 대해 등장성인 것으로 일컬어진다. RBC 세포막은 표준 막이다. 예를 들어, 정상 식염수(즉, 0.9% 염화나트륨)에 놓인 전혈은 팽윤되지 않을 것이고 따라서 정상 식염수는 등장성인 것으로 일컬어진다.
등장성 용액의 특성
본 발명은 피검체 주사용 약제학적 제제를 제조하거나 준비하기 위한 방법을 제공하고 이때, 당해 제형은 (1) 혈액(또는 혈장 또는 다른 생물학적 유체)에 대해 거의 등장성이거나 상당한 용혈, 혈전증 또는 혈관 자극을 유발할 정도로 고장성이거나 저장성이 아니고 (2) 적혈구 응집을 예방하기에 충분한 이온 강도를 갖는 용액으로 제조된다.
한 양태에서, 주사용인 등장성 (혈액에 대해) 약제학적 제형은 약 270mOsm/L 초과 및 약 330mOsm/L 미만인 긴장성 또는 몰삼투압 농도를 갖는다. 한 양태에서, 주사용의 등장성 약제학적 제형은 약 270mOsm/L 초과 및 약 328mOsm/L 미만인 긴장성 또는 몰삼투압 농도를 갖는다.
0.9% 염화나트륨 및 5% 덱스트로스와 같은 용액이 등장성이긴 하지만 이들이 많은 약제학적 제형을 재구성하거나 희석시키는데 사용되는 경우 수득한 용액은 적혈구 응집을 예방하기에 충분한 이온 강도(5% 덱스트로스때문에)를 가질 수 없거나 너무 높은 이온 강도를 가져 수득한 용액이 고장성이 되도록 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 (a) 적혈구 응집을 완화시키기에 충분한 이온 강도 및 용혈을 예방하기에 충분한 긴장성을 제공하는 최소 농도의 염화나트륨 및 (c) 고장성 용액이 될 정도로 크지 않은 수득된 긴장성을 제공하는 최대 농도의 염화나트륨을 함유하는, 희석 또는 재구성용 용액을 사용하는 것이다. 추가로, 본 발명의 방법은 약제학적 제제에 대한 실질 주사 용적을 유지시키면서 충분한 이온 강도 및 혈액에 대해 등장성을 제공할 수 있는, 희석 또는 재구성을 위한 용액을 사용한다.
저장성 용액의 특성
본 발명은 피검체 주사용 약제학적 제제를 제조하는 방법을 제공하고 이때, 당해 제형은 혈액에 대해 저장성이 아니거나 상당한 용혈을 유발할 정도로 저장성이 아닌(즉, 혈액에 대해 약간 저장성인) 용액으로 제조된다. 한 양태에서, 혈액에 대해 약간 저장성인 것으로 고려되는 주사용 약제학적 제제는 약 270mOsm/L 미만 및 약 240mOsm/L 초과인 긴장성 또는 몰삼투압 농도를 가질 수 있다. 한 양태에서, 혈액에 대해 약간 저장성인 것으로서 고려되는 주사용 약제학적 제형은 약 270mOsm/L 미만 및 220mOsm/L 초과의 긴장성 또는 몰삼투압 농도를 가질 수 있다.
저장성 용액의 예는 멸균수와 함께 주사용으로 제조된 많은 약제학적 제제를 포함한다. 저장성 용액이 주사되는 경우, 유체 이동이 일어나고 물은 정맥의 내피 세포 및 혈액 세포로 이동한다. 너무 많은 물을 흡수하는 세포는 터질 수 있으므로 저장성 용액의 주사는 정맥 자극, 정맥염 및 용혈을 유발할 수 있다.
고장성 용액의 특성
본 발명은 피검체 주사용 약제학적 제제를 제조하기 위한 방법을 제공하고, 당해 제제는 혈액에 대해 고장성이 아니거나 상당한 혈전증 및/또는 혈관 자극을 유발할 정도로 고장성이 아닌(즉, 약간 고장성인) 용액으로 제조된다. 한 양태에서, 약간 고장성인 것으로 고려되는 즉각 주사용 약제학적 제제는 약 340mOsm/L 초과 및 약 600mOsm/L 미만인 긴장성 또는 몰삼투압 농도를 가질 수 있다. 한 양태에서, 약간 고장성인 것으로 고려되는 주사용 약제학적 제제는 약 340 초과 및 약 375, 400, 425, 450, 475, 500, 또는 약 575 mOsm/L 미만의 긴장성 또는 몰삼투압 농도를 가질 수 있다. 일반적으로, 고장성 용액은 약 340mOsm/L 초과의 긴장성을 나타낸다. 약 600mOsm/L 초과의 몰삼투압 농도를 가진 용액은 주사시 주의깊게 사용되어야만 한다.
목적하지 않는 고장성 용액의 예는 10% 덱스트로스와 함께 주사용으로 제조된 많은 약제학적 제제 또는 몰삼투압 농도에 영향을 미치는 다중 첨가제를 갖는 약제학적 제제를 포함한다. 고장성 용액이 주사되는 경우, 유체 이동성이 일어나고 물은 정맥의 내피 세포 및 혈액 세포로부터 유출된다. 너무 많은 물을 상실한 세포는 수축할 수 있으므로 고장성 용액의 주사는 정맥 자극, 정맥염 및 혈전증을 유발할 수 있다.
pH
혈액 pH 범위는 중성인 것으로 고려되는 약 7.35 내지 약 7.45이다. pH가 7미만인 약제학적 제제는 산성 약물로서 고려되고 pH가 4.1 미만인 것들은 강산성인 것으로 고려된다. pH가 7.5 초과인 약물은 염기성 또는 알칼리성 약물인 것으로 고려되고 pH가 9.0 초과인 것들은 강염기성 또는 강알칼리성인 것으로 고려된다. 강산성 또는 강염기성 약물 용액은 정맥염 및 혈전증을 유발할 수 있다. 따라서, 한 양태에서, 본 발명은 동결건조된 약물 제형을 재구성하거나 액체 약물 제형을 정맥 주사용의 제제로 희석시키기 위한 염화나트륨 용액을 제공하고 이때, 주사용으로 준비된 제제는 (1) 4.1 미만 또는 9.0 초과의 pH를 갖지않고 (2) 적혈구 응집을 예방하기에 충분한 이온 강도를 갖고 (3) 혈액에 대해 거의 등장성(또는 약간 고장성 또는 저장성)이어서 용혈 또는 톱니바퀴 모양 형성이 RBC에 일어나지 않는다. 그러나, 용액의 pH는 용액이 적혈구 응집을 예방하기에 충분한 이온 강도를 갖는지의 여부에 대한 고려 대상이 아니다. 다시 말해서, 동결건조된 제형이 물과 재구성되어 pH가 4.1 미만 또는 9.0 초과인 경우 이것은 적혈구 응집을 예방하기 위한 재구성용 염화나트륨 용액의 사용을 막지 못한다.
몰삼투압 농도의 계산
임의의 약제학적 제제의 몰삼투압 농도는 하기의 방정식을 사용하여 계산될 수 있다: 몰삼투압 농도 = (물질(g/L)의 분자량으로 나눈 물질의 중량) x 1000( 밀리몰삼투압 농도를 위해). 용어 "종"은 용해되는 경우 형성되는 다수의 이온 또는 화학적 종을 언급한다.
주사용으로 준비되거나 제조되는 약제학적 제형
본 발명은 피검체 주사용 약물 제품을 제조하기 위해 동결건조된 약물 제품을 용액으로 재구성하기 위한 방법을 제공한다. 재구성된 약물 제품은 충분한 이온 강도 및 혈액에 대해 거의 등장성인 긴장성을 가짐에 의해 주사용으로 제조된다.
본 발명의 방법은 또한 피검체 주사용으로 약물 용액을 제조하기 위해 약물 용액을 희석시키는 것에 관한 것이다. 희석된 약물 용액은 충분한 이온 강도를 갖고 혈액에 대해 거의 등장성이 되도록 함에 의해 주사용으로 제조된다.
한 양태에서, 동결건조되거나 무수 약물 제품/제형이 물중에 재구성되는 경우 약 100mOsm/L 내지 약 360mOsm/L의 몰삼투압 농도를 갖는다. 본 발명은 약 25mM 내지 약 150mM 염화나트륨 용액을 사용하는 재구성 방법을 제공하기 때문에, 염화나트륨 용액으로 재구성되는 동결건조된 약물 제품의 예상되는 배합 몰삼투압 농도를 기준으로 특정 염화나트륨 용액을 사용해야만 한다. 따라서, 예를 들어, 동결건조된 약물 제품이 물에 재구성되어 약 300mOsm/L의 몰삼투압 농도를 갖는 경우 재구성을 위한 NaCl 용액은 약 25mM 내지 약 30mM이어먀만 한다. 또 다른 예에서, 동결건도된 약물 제품이 물에 재구성되어 약 100mOsm/L의 몰삼투압 농도를 갖는 경우 재구성을 위한 NaCl 용액은 약 25mM 내지 약 130mM이어야만 한다.
한 양태에서, 본 발명의 방법에 의해 주사용으로 제조되는 약물 제품(동결건조되거나 용액중이든간에)은 HES(하이드록시에틸 전분)을 함유하지 않는다. HES-함유 제제가 이온 강도 때문에 NaCl 용액으로 재구성 또는 희석되지만 시험관내 실험에서 적혈구 침강 및 응집을 유발할 수 있다. 또 다른 실험에서, 본 발명의 방법에 의해 주사용으로 제조되는 약물 제품은 덱스트란을 함유하지 않는데 그 이유는 적응되고 변형된 웨스터그렌 방법(실시예 2 참조)으로부터 NaCl의 첨가가 덱스트란이 유발할 수 있는 증진된 침강의 효과를 상쇄시키지 못함을 보여주기때문이다.
한 양태에서, 본 발명은 정맥내 주사용 약제학적 제제를 제조하는 방법을 제공하고 이때, 약제학적 제제는 1차 벌킹제를 포함하는 동결건조된 케이크이다. 1차 벌킹제는 예를 들어, 대부분 비이온화될 수 있다. 비이온화 벌킹제는 만니톨, 글라이신, 슈크로스, 락토스, 기타 디사카라이드, 치료학적 단백질 또는 제형 자체의 활성분 또는 당업자에게 공지된 또 다른 벌킹제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 비이온화 벌킹제의 농도는 용액이 응집을 예방하기에 충분한 이온 강도를 가질지에 대해 유의적으로 영향을 주지 않는다. 그러나, 이의 농도는 몰삼투압 농도에 영향을 미침에 따라서 이들의 농도는 긴장성에 대해 효과를 가질 수 있다. 예를 들어, 글라이신의 농도는 몰삼투압 농도에 기여하는 것과 동일함에 따라서 10 mM 글라이신은 10 mOsm/L에 해당한다.
활성 성분을 포함하는 약물 제형중의 단백질 성분은 용액의 이온 강도 또는 용액의 몰삼투압 농도에 유의적인 영향을 주지 못한다. 예를 들어, 단백질의 분자량이 50,000인 경우 주사될 1-2ml 용액내 단백질은 2.5mg이다. 이것은 0.05mM에 해당하고 따라서 당해 단백질은 몰삼투압 농도에 인지할만한 기여를 하지 못한다.
또한 약제학적 제제는 폴리소르베이트-80과 같은 계면활성제를 함유한다. 폴리소르베이트-80 및 기타 계면활성제는 큰 분자량의 분자이고 따라서 0.001% 내지 0.01%와 같은 제제 중에 통상 존재하는 양은 너무 적어서 몰삼투압 농도 또는 이온 강도에 인지될 정도로 기여하지 못한다. 기타 계면활성제는 Brij® 35, Brij® 30, Lubrol-pxTM Triton X-10, Pluronic® F127, 및 나트륨 도데실 설페이트(SDS)를 포함한다.
약제학적 제제중에 소량으로 존재하여 몰삼투압 농도 또는 이온성에 인지할만한 영향을 미칠 수 없는 기타 큰 분자량의 분자는 중합체이고 질적으로 이들은 덱스트란 설페이트와 같은 염이 아니다. 중합체의 예는 덱스트란, 폴리(비닐 알콜) (PVA), 하이드록시프로필 메틸셀룰로스(HPMC), 겔라틴, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 폴리비닐피롤리돈(PVP)을 포함한다.
또한 약제학적 제형은 흔히 0-2, 0-5 또는 0-10% 이상의 양으로 슈크로스 또는 기타 폴리올을 함유한다. 예를 들어, 제형이 벌킹제를 포함하지 않는 경우 5 내지 10% 슈크로스가 사용될 수 있다. 일반적으로, 제형이 동결건조되고 제형의 양이 본원에서 % 또는 몰농도의 양으로 한정되는 경우 이것은 동결건조전 용액(즉, 충전 양)의 % 및 몰농도에 대한 것이다. 따라서, 용액이 1% 슈크로스를 갖는 경우 이것은 29.2mM에 해당한다. 슈크로스는 용액중에서 감지할만하게 이온화하거나 해리되지 않기 때문에 29mM의 슈크로스는 29 mOsm/L에 해당한다. 용액중에서 감지할정도로 이온화하거나 해리하지 않는 기타 당 또는 폴리올은 글리세롤, 자일리톨, 소르비톨, 만니톨(또한 벌크제로서 사용될 수 있음), 글루코스, 이노시톨, 라피노스, 말토트리오스, 락토스 및 트레할로스를 포함한다.
약제학적 제형은 또한 벌킹제를 함유할 수 있다. 벌킹제는 예를 들어, 아세테이트, 시트레이트, 글라이신, 히스티딘, 포스페이트(나트륨 또는 칼륨), 디에탄올아민 및 트리스를 포함한다. 완충제는 용액의 pH를 허용되는 범위로 유지하는 제제를 포함한다. 글라이신, 히스티딘 및 디에탄올아민과 같은 완충제는 대부분 비이온화성이고 따라서 이들의 농도는 몰삼투압 농도에 해당하여 주사용 제형이 거의 등장성인지를 고려하는 경우 명심해야만 한다. 아세테이트 및 시트레이트와 같은 완충제는 보통 염이고 따라서 이온화하여 이들의 농도는 용액 몰삼투압 농도에 대한 이들의 기여도를 계산할 때 가중된다.
약제학적 제형은 단백질, 핵산, 바이러스 및 화학적 화합물을 포함하는 활성 성분을 필수적으로 함유할 수 있다. 이들 분자는 대부분 주사될 용액의 이온 강도 또는 몰삼투압 농도에 인지할만한 영향을 주지 않는다. 흔히 소형 분자 화합물이 약제학적 염인 것과 같이 이들 분자가 염인 경우, 이들은 이온 강도 및/또는 몰삼투압 농도에 인지할만한 영향을 미칠 수 있다.
특정 아미노산은 또한 몇몇 약제학적 제형에 존재하고 냉동보호제, 동결보호체 및/또는 벌킹제로서 사용된다. 히스티딘과 같은 몇몇 아미노산은 대부분 비이온성이고 주사용 제형이 혈액에 대해 거의 등장성이 되도록 용액의 몰삼투압 농도를 계산하는 경우 제제중에 아미노산의 농도만을 명심해야 한다.
BeneFIX®
BeneFIX®은 특징이 광범위하게 분석되었고 감염성 제제가 없는 것으로 나타난 유전학적으로 조작된 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주에 의해 제조된다. 보관 세포 은행에는 혈액 또는 혈장 제품이 없다. CHO 세포주는 동물 또는 사람 공급원으로부터 유래된 임의의 단백질을 함유하지 않는 규정 세포 배양 배지내로 재조합 인자 IX(rFIX)를 분비하고 재조합 인자 IX는 모노클로날 항체 단계를 필요로 하지 않는 크로마토그래피 정제 과정에 의해 정제되고 고순도의 활성 제품이 수득된다. 겉보기 분자량이 70,000을 초과하는 분자(대형 단백질 및 바이러스 입자와 같은)를 보유하는 능력을 갖는 막 여과 단계는 추가의 바이러스 안정성 때문에 포함된다. BeneFIX®은 주로 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 평가에 의한 단순한 성분이다. 효능(국제 단위, I.U.(IU))은 인자 IX 농축물에 대한 세계 보건 기구(WHO) 국제 표준에 대해 시험관내 1단계 응고 분석을 사용하여 결정한다. 하나의 국제 단위는 1ml의 풀된 정상 사람 혈장중에 존재하는 인자 IX 활성의 양이다. BeneFIX®의 비활성은 단백질의 밀리그램당 180IU 이상이다. BeneFIX®는 사람 혈액으로부터 유래하지 않고 방부제 또는 첨가된 동물 또는 사람 성분을 함유하지 않는다.
BeneFIX®은 멸균 비발열성 동결건조된 분말 제제로서 제형화된다. BeneFIX®은 정맥내(IV) 주사용으로 의도된다. 이것은 국제 단위(IU)로 나타낸 표지된 양의 인자 IX 활성을 함유하는 1회용 바이엘로 시판되고 있다. 각각의 바이엘은 예를 들어, 명목적으로 250, 500, 또는 1000 IU (또는 그 이상, 2000IU를 포함)의 응고 인자 IX(재조합)를 함유한다. 멸균수로 동결건조된 약물 제품을 재구성한 후, 500 및 1000 IU 용량 강도에서 부형제의 농도는 10 mM L-히스티딘, 1% 슈크로스, 260 mM 글라이신, 0.005% 폴리소르베이트 80이다. 250IU 용량 강도에서 재구성 후 농도는 다른 2개의 용량 강도의 농도 절반이다. 500 및 1000 IU 용량 강도는 재구성 후 등장성이고 250 IU 용량 강도는 재구성 후 다른 2개의 용량 강도의 절반의 긴장성을 갖는다. 모든 용량 강도는 재구성 시 청명한 무색 용액을 생성시킨다.
하나의 양태에서, 본 발명은 피검체에 주사될 BeneFIX®을 제조하는 방법을 제공하고, 이때, BeneFIX®은 염화나트륨 용액으로 재구성되고 염화나트륨 용액은 약 25mM 초과 및 약 150mM 미만이다. 하나의 양태에서, BeneFIX®을 재구성하는데 사용되는 염화나트륨 용액은 약 40mM이다. 하나의 양태에서, 동결건조된 BeneFIX®의 하나의 바이엘은 약 4-5mL의 25mM 내지 150mM 염화나트륨 용액으로 재구성된다.
새롭게 제형화된 BeneFIX® (BeneFIX®-R)
물중에 재구성된 BeneFIX®의 낮은 이온 강도 때문에, 다양한 새로운 제형이 제조된다(새롭게 제형화된 BeneFIX® (BeneFIX®-R)). 당해 목표는 BeneFIX® 제형에 충분한 이온 강도를 부가하여 RBC 응집에 대한 잠재력을 완화시키는 것이다. BeneFIX®의 이온 강도를 증가시키기 위해, 재구성 용액으로서 sWFI를 대체함에 의해 염화나트륨을 재구성된 제품에 혼입시킬 수 있다. 또한, BeneFIX®는 NaCl을 동결건조전 제형에 첨가함에 의해 제형화되어 이로써 재구성은 여전히 물로 성취될 수 있지만 염 용액의 동결건조는 보다 어렵고 단순히 NaCl 용액으로 동결건조된 케이크를 단순히 재구성하는 것이 보다 실제적이다. 이것은 또한 응집을 예방하기 위해 sWFI로 재구성되는 경우 충분한 이온 강도를 갖지 못하는 다른 동결건조된 약제학적 제제에 대해서도 사실이다.
하나의 양태에서, BeneFIX®-R은 BeneFIX® (10 mM L-히스티딘, 260 mM 글라이신, 1% 글루코스, 0.005% 폴리소르베이트 80)와 동일한 제형으로 동결건조될 수 있고 단지 rFIX 농도는 상이하다. BeneFIX®-R 벌크 약물 제품은 예를 들어, 바이알당 4ml로 10 mM L-히스티딘, 260 mM 글라이신, 1% 슈크로스, 0.005% 폴리소르베이트 80으로 충전되고 동결건조될 수 있다. BeneFIX®-R이 40mM NaCl과 같이 25 내지 150mM NaCl 용액으로 바이알당 5ml로 재구성되는 경우, 부형제의 농도는 현 BeneFIX® 동결건조전 제형과 비교하는 경우 20%까지 감소된다. 이러한 전략으로 (1) 등장성이고, (2) RBC 응집에 대한 잠재력을 감소시키기에 충분한 이온 강도를 갖고 (3) 고용량의 rFIX에 대해 주사 용적을 감소시키는 제형이 수득된다. BeneFIX®-R에 바이알 용량 강도당 예를 들어, 250, 500, 1000, 및 2000 IU의 rFIX가 제공될 수 있다. 따라서, 5 mL의 25-150 mM NaCl 용액으로 재구성 후, 수득한 BeneFIX®-R 제형 용액은 약 7 내지 약 9mM 히스티딘; 약 188 내지 약 220 mM 글라이신; 약 0.7% 내지 약 0.9% 슈크로스; 및 약 0.004% 폴리소르베이트 80일 수 있다. 바이알중 rFIX 양, 예를 들어 250, 500, 1000, 또는 2000 IU에 의존하여, 5 mL의 NaCl 용액에서의 재구성은 각각 rFIX의 농도가 약 50, 100, 200, 또는 400 IU/mL이 되게한다. 5 mL의 40 mM NaCl 용액중에 재구성된 BeneFIX®-R 제형의 몰삼투압 농도는 약 320 mOsm/L이다.
주사용으로 제조된 제형의 예
재조합 인자 IX는 또한 본원에 기재된 제형을 포함한 모든 목적을 위해 참조로서 인용되는 미국 특허 제6,372,716호에 기재된 제형으로 동결건조될 수 있다. 당해 특허에 기재된 제제는 본 발명과 함께 사용될 수 있고, 여기서, 당해 제제는 활성 성분으로서 rFIX를 갖는 것으로 제한되지 않는다. 따라서, 예를 들어, 주사용으로 제조하기 위해 25 mM-150 mM 염화나트륨 용액으로 재구성될 수 있는 동결건조된 제형은 글라이신, 폴리소르베이트, 슈크로스, 히스티딘 및 활성 성분을 포함하는 제형을 포함한다. 활성 성분은 필수적으로 예를 들어, 임의의 단백질, 바이러스, 핵산 또는 화학적 화합물일 수 있다. 글라이신은 예를 들어, 약 0.1M 내지 0.3M의 농도를 가질 수 있다. 폴리소르베이트는 예를 들어, 약 0.001 내지 약 0.05%의 농도를 가질 수 있다. 슈크로스는 예를 들어, 약 0.5% 내지 약 2%의 농도를 가질 수 있다. 히스티딘은 예를 들어, 약 5 mM 내지 약 30 mM의 농도를 가질 수 있다.
하나의 양태에서, 25-150mM 염화나트륨 용액으로 재구성될 동결건조된 제형은 약 0.1 내지 0.3M 글라이신, 약 0.5 내지 2% 슈크로스, 0.001 내지 약 0.05% 폴리소르베이트, 약 5 내지 약 30 mM 히스티딘, 및 약 0.1 내지 약 20 mg/mL의 활성 성분을 포함한다. 활성 성분은 예를 들어, rFIX일 수 있다. 또 다른 양태에서, 25-150 mM 염화나트륨 용액으로 재구성될 rFIX 동결건조된 제형은 약 0.13 내지 약 3 mg/ml rFIX 또는 약 50 내지 약 600 IU/mL의 rFIX, 약 0.26M 글라이신, 약 10 mM 히스티딘, 약 1% 슈크로스, 및 약 0.005% 폴리소르베이트를 포함한다.
하기된 실시예는 본 발명의 한 측면을 설명하기 위해 제공되고 본 발명을 제한할 목적으로 포함된 것이 아니다.
실시예 1: BeneFIX®-연관된 RBC 응집에 대한 항-응집제 및 제형 성분의 효과
버터플라이 카테터 라인 및 주사기에서 BeneFIX®-관련 RBC 응집이 몇차례 보고된 바 있다. 혈우병 개 기원의 혈액에서의 최근 연구는 응집이 제형 완충액중에 재조합 사람 FIX의 부재하에 발생함을 입증한다. 따라서, 본 연구는 표준 항응고제, 다양한 BeneFIX® 성분 및 이온 강도가 BeneFIX®-관련 응집 현상에 영향을 주는지의 여부를 조사하였다.
혈액은 익명의 사람 지원자 풀로부터 수득하였고 표준 항응고제, 예를 들어, 에틸렌디아민 테트라-아세트산(EDTA), 나트륨 시트레이트 또는 헤파린을 함유하는 베큐테이너 튜브(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)에 수거하였다.
응집에 대해 시험하기 위해, 베큐테이너 튜브에서 혈액 샘플을 먼저 누테이터상에서 연속으로 혼합하였다. 혈액, 12.5 mL을 48웰 세포 배양 플레이트중에서 시험 용액 87.5 mL로 희석시키고 400배 확대의 역상 대조 현미경하에서 관찰하기 전에 2분동안 실온에서 항온처리하였다. 각각의 웰은 비디오 녹화하여 이미지를 포착하고 하기 표 1에 기재된 다음의 기준에 따라 RBC 응집을 스코어하였다.
RBC 응집 스코어링 키
스코어 응집 표현형
0 응집 부재, 대부분 개별 세포이고 거의 드물게 2개 세포.
1 대부분 개별 세포, 전반적으로 소형 응집이 분산되어 있다.
2 많은 소형 응집체, 몇몇 개별 세포가 여전히 존재함.
3 대부분 소형 내지 중형 응집체이고 드물게 개별 세포가 존재함.
4 대부분의 세포가 응집한다.
RBC 응집에 대한 표준 항응고제의 효과: 제1 연구는 3개의 공여자 기원의 혈액 샘플에 대한 분석을 포함했다. 혈액은 각각의 공여자에 대해 EDTA, 헤파린 및 나트륨 시트레이트 베큐테이너 튜브에 수거하였다. 시험 제품은 하기의 NaCl 농도 각각에서 재구성된 BeneFIX®, 100 IU/mL을 포함했다:: 0 mM (sWFI), 20 mM, 40 mM, 60 mM, 및 77 mM NaCl. 또한, 수중 덱스트로스 5% (D5W)는 양성 대조군으로서 포함시켰다. 당해 샘플은 혈액 대 BeneFIX® 또는 혈액 대 D5W의 비율을 1:8로 하여 희석시켰다. 이미지를 포착하고 디지털 저장하고 차폐시키고 응집에 대해 스코어하였다. sWFI로 재구성된 BeneFIX®로의 혈액 첨가 2분 후 사용된 항고제의 유형에 상관없이 3명의 공여자 모두 기원의 샘플에서 응집이 나타났다. 증가하는 NaCl 농도를 사용하여, 응집 반응을 약화시켰다. 혈액이 D5W로 첨가되었을 때 응집이 명백하게 나타났다.
예비 스크리닝된 공여자에서 RBC 응집에 대한 NaCl의 효과: 공여자 샘플은 헤파린화된 베큐테이너 튜브에 수거하였다. 몇몇 이전의 샘플에서 자발적 응집이 관찰되었기 때문에 모든 공여자는 초기에 154 mM NaCl을 사용하여 스크리닝하였다. 응집이 관찰된 경우 샘플은 추가의 분석으로부터 제외시켰다. 각각 공여자 기원의 나머지 샘플은 2개의 제형중 하나로 1:8로 희석시켰다: (1) sWFI로 재구성된 100 IU/mL BeneFIX®, 및 (2) 154 mM NaCl로 재구성된 100 IU/mL BeneFIX®. 이미지를 포착하고 디지털 저장하고 차폐시키고 응집에 대해 스코어하였다. 응집은 sWFI로 재구성된 BeneFIX®에서 나타난 반면 154mM NaCl을 사용한 재구성은 응집 반응을 감소시키거나 제거하였다(스코어에 대해 표 2 참조).
응집 스코어
공여자 154 mM NaCl 예비-스크리닝 대조군 BeneFIX®+ sWFI BeneFIX®+ 154 mM NaCl
7 0 2 1
11 0 3 0
8 0 3 0
28 0 3 0
41 0 3 1
제형 성분 및 BeneFIX® 농도의 효과: BeneFIX®의 몇몇 제형은 RBC 응집에 대한 상이한 성분의 영향을 확인하기위해 평가하였다. 154mM NaCl의 존재 또는 부재하에 8개의 상이한 혼합물을 제조하여 총 16개의 혼합물을 제조하였다(표 3). 12명의 공여자는 자발적 응집에 대해 스크리닝하였고 2명은 추가의 연구로부터 제외시켰다. 10개의 나머지 공여자 샘플중 5개의 혈액 샘플은 첫 번째 8개 제형(샘플 1-A에서 1-H까지)을 위해 사용하였고 나머지 5개의 공여자 샘플은 두 번째 8개의 제형(샘플 2-I에서 2-P까지)을 위해 사용하였다. 샘플은 이전과 같이 1:8로 희석하고 이미지를 포착하여 이전에 기재한 바와 같이 스코어하였다.
제형 디자인 매트릭스 (+/-는 성분의 존재/부재를 지적한다)
세트/샘플 ID BeneFIX®농도 (IU/mL) 글라이신 (GLY) 260 mM 슈크로스 10mg/mL Tween-80 (폴리소르베이트-80) 0.005% 히스티딘 (HIS) 10 mM NaCl 154mM
1-A, BeneFIX® 100 + + + + -
1-B, BeneFIX® 100 + + + + +
1-C, BeneFIX® 300 + + + + -
1-D, BeneFIX® 300 + + + + +
1-E, BeneFIX® 600 + + + + -
1-F, BeneFIX® 600 + + + + +
1-G, BeneFIX®부재 - + + + + -
1-H, BeneFIX®부재 - + + + + +
2-I, BeneFIX®, GLY 부재 100 - + + + -
2-J, BeneFIX®, GLY 부재 100 - + + + +
2-K, 슈크로스 부재 100 + - + + -
2-L, 슈크로스 부재 100 + - + + +
2-M, BeneFIX®, Tween-80 부재 100 + + - + -
2-N, Tween-80 부재 100 + + - + +
2-O, BeneFIX® HIS 부재 100 + + + - -
2-P, BeneFIX® HIS 부재 100 + + + - +
표 3에 열거된 실험에 대한 응집 스코어는 하기 표 4A 및 4B에 나타낸다. 활성 성분 또는 부형제이든지간에 BeneFIX®제제의 어떠한 특정 성분도 응집과 관련되어 있지 않았다. 예상된 바와 같이, 글라이신의 제거는 용액의 저장성으로 인해 RBC 용해를 유발하였다. 그러나, 154 mM NaCl을 사용한 재구성은 시험관내 응집 및 용해를 감소시키거나 제거하였다.
응집 스코어 - BeneFIX® 농도를 다양화시킴
샘플 공여자 ID 1-A 1-B 1-C 1-D 1-E 1-F 1-G 1-H
6 4 1 2 1 4 1 3 2
14 3 0 2 3 3 1 2 4
19 4 1 3 0 3 1 3 1
40 1 0 2 1 2 2 3 1
43 3 0 3 1 4 0 3 3
평균 스코어 3 0.4 2.4 1.2 3.2 1 2.8 2.2
응집 스코어 - 부형제 효과
샘플 공여자 ID 2-I 2-J 2-K 2-L 2-M 2-N 2-O 2-P
1 용해 1 2 0 3 1 3 0
11 4 0 4 1 3 1 2 0
18 용해 1 4 1 3 2 3 2
34 용해 0 2 0 2 2 3 2
45 용해 1 4 1 4 3 2 3
평균 스코어 용해 0.6 3.2 0.6 3 1.8 2.6 1.4
예비 스크리닝된 공여자에서 RBC 응집에 대한 보다 낮은 농도의 NaCl의 효과: 공여자 샘플은 헤파린화된 베큐테이너 튜브에 수거하였다. 응집이 몇몇 이전의 샘플에서 관찰되었기 때문에 모든 공여자는 초기에 154mM NaCl로 스크리닝하였다. 응집이 관찰되는 경우 샘플은 추가의 분석으로부터 제외시켰다. 각각의 공여자로부터의 나머지 샘플은 이전과 같이 3개의 제형중 하나로 1:8로 희석하였다: (1) sWFI를 사용한 100 IU/mL BeneFIX®; (2) 40mM NaCl을 사용한 100 IU/mL BeneFIX®; 또는 (3) 77mM NaCl을 사용한 100 IU/mL BeneFIX®. 이미지를 포착하고 수거하고 이전과 같이 스코어하였다. 당해 결과는 하기 표 5에 나타낸다. 응집은 물로 재구성된 BeneFIX®의 모든 5개의 샘플에서 나타나는 반면 40mM 또는 77mM NaCl을 사용한 BeneFIX®의 재구성은 응집 반응을 감소시키거나 제거하였다.
응집 스코어
공여자 번호 154 mM NaCl BeneFIX®+ sWFI BeneFIX®+ 40 mM NaCl BeneFIX®+ 77 mM NaCl
8 0 3 1 2
34 0 3 2 1
39 0 4 3 1
40 0 3 0 1
47 0 3 1 1
평균 스코어 0 3.2 1.4 1.2
분석: RBC 응집은 혈액 대 재구성된 BeneFIX® 용적 비가 1:8이 되도록 BeneFIX®와 혼합되는 경우 헤파린, EDTA 또는 나트륨 시트레이트로 항응고된 혈액에서 발생했다. 어떠한 유형의 항응고제도 응집에 대해 어떠한 효과를 나타내지 않았고 따라서 헤파린은 후속 평가에서 항응고제로서 사용하였다. 몇몇 샘플에서, 응집은 0.9% NaCl 단독의 존재하에서 발생하였다(응집에 대한 네가티브 대조군). 따라서, 후속 평가는 0.9% NaCl 대조군과 함께 어떠한 응집을 나타내지 않는 샘플에 대해서만 수행하였다.
sWFI 또는 NaCl 용액중에서 재구성된 BeneFIX® 의 3개의 농도 (100, 300, 또는 600 IU/mL)의 효과 및 BeneFIX®의 개개의 성분의 효과를, 혈액 대 BeneFIX® 용적 비가 1:8인 헤파린 항응고된 혈액과 혼합되는 경우 RBC 응집에 대해 평가하였다. 재조합 사람 FIX 단백질을 포함하는 어떠한 특정 성분의 제거는 응집 반응에서 어떠한 효과를 나타내지 않았다. 이것은 광범위한 상이한 약제학적 제형이 정맥내 주사용의 NaCl 용액으로 준비(재구성되거나 희석됨)될 수 있음을 지적한다. 글라이신의 제거는 RBC 용해를 유발하였다. 그러나, 재구성을 위한 40 mM (0.234% NaCl, 주사가능한), 77 mM (0.45% NaCl, 주사가능한) 또는 154 mM NaCl (0.9% NaCl, 주사가능한)의 사용은 응집 반응 및 용해를 감소시키거나 제거하였다.
따라서, 이들 결과는 BeneFIX® 제형의 어떠한 특정 성분도 관찰된 응집과 관련이 없음을 보여준다. BeneFIX® 제형으로부터 글라이신의 제거 및 물과의 재구성이 용해를 유발하는 저장성 용액을 생성시키지만 몰삼투압 농도 및 긴장성은 이온 강도 및 응집과 명백한 관련성이 있다. 당해 결과는 응집이 sWFI에서 재구성된 재조합 인자 IX(rFIX)의 낮은 이온 강도와 관련이 있고 NaCl과의 재구성은 응집을 약화시키거나 제거함을 보여준다. 따라서, NaCl 용액을 사용한 기타 약제학적 제형의 재구성은, NaCl 용액의 농도가 154mM 미만일지라도 정맥내 주사시 응집 및 용해 둘다를 예방할 수 있다.
실시예 2: 약제학적 제제 또는 제형에 의해 유도된 적혈구 응집을 평가하기 위해 적혈구 침강율 측정에 대한 변형된 웨스터그렌 방법의 적용
현재 판매되는 BeneFIX® 제형은 비이온성 제형이다. sWFI에 재구성된 BeneFIX® 제형의 투여동안에, 환자 혈액이 정맥내 튜빙에서와 같이 재구성된 BeneFIX®와 혼합되는 경우 적혈구 응집(즉, 응집(agglutination))이 드물게 관찰되었다. 본 발명은 적혈구 응집이 제형과 관련이 있지만 rFIX와는 관련이 없고 약 40mM 이상의 NaCl을 함유하는 희석제를 사용하여 예방된다는 발견을 제공한다. 약 40mM 이상의 NaCl을 함유하는 통상의 희석제의 디자인을 보조하기 위해, 시험관내 적혈구 응집을 평가하기 위해 확립된 방법인 적혈구 침강을 측정하는데 사용될 수 있는 정량적인 분석을 디자인하였다. 혈액이 정상 식염수에서 4:5로 희석되는 변형된 웨스터그렌 방법을 적용하여 식염수 또는 시험 용액(즉, 통상적인 희석제)과 1:4 또는 1:8로 희석된 혈액에서의 응집을 평가하였다.
사람 혈액은 건강한 성인 지원자로부터 수득하였고 EDTA를 함유하는 튜브에 수거하였다. 침강 실험을 위한 혈액 샘플의 적합성을 입증하기 위해, 화학적으로 규명된 적혈구 침강 율 ESR60을 변형된 웨스터그렌 방법에 의해 측정하였다. 간략하게, 잘 혼합된 혈액을 154mM NaCl과 4:5로 희석하고 약하게 잘 혼합하고 즉시, 통상적인 10-튜브 랙에 위치한 자가 영점 조정 웨스터그렌 튜브상으로 로딩하였다. 60분후에 튜브 탑에서 영점 마크에서 혈장:적혈구 접촉면까지의 거리 mm를 측정하고 기록하였다. ESR60 결과는 공개된 통상의 표준값과 비교하였다(문헌참조: Morris, M.W. et al., Basic examination of blood, in Henry, J.B., ed., Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, Philadelphia, PA, WB Saunders, 2001: 479-519).
약제학적 제형과 관련된 적혈구 응집을 평가하기 위해 적응 변형된 웨스터그렌 방법의 적합성 여부를 확인하기 위해 2개의 실험을 수행하였다. 사람 혈액 샘플은 정상적인 한계치내인 ESR60 값을 갖기 때문에 이들 분석에 사용하기에 적합하다. 이들 샘플은 제1 실험에서 1:4로 희석하고 제2 실험에서는 1:8로 희석하였다.
제1 실험에서, 적혈구 침강은 sWFI 또는 10mM NaCl로 재구성된 5% 덱스트란 70 또는 BeneFIX®에 의해 증진시켰다. 5분 이내에, 응집체는 sWFI로 재구성된 3% 덱스트란 70 또는 BeneFIX®로 희석된 혈액이 로딩된 튜브에서 육안으로 확인되었다. 60분까지, 당해 튜브에서 적혈구 침강이 식염수 대조군과 비교하여 현저히 증진되었다(표 6). 90분까지, 10 mM NaCl에서 재구성된 BeneFIX®로 희석된 한 공여자 기원의 혈액은 2개의 상 침강 패턴을 나타내었고 명백한 적혈구:혈장 접촉면이 영점 마크에서 8mm 떨어져 위치하였고 또 다른 접촉면은 밀접하게 팩킹된 지점 사이에 있었고 덜 밀접하게 팩깅된 적혈구는 영점 마크로부터 149mm에 위치하였다.
BeneFIX® 또는 3% 덱스트란중에서 1:4로 희석된 사람 혈액의 적혈구 침강 (영점 마크로부터 침강 거리 mm를 측정하였다)
공여자 및 희석 시간 식염수 0 mM NaCl 10 mM NaCl 20 mM NaCl 30 mM NaCl 40 mM NaCl 50 mM NaCl 60 mM NaCl 77 mM NaCl 154 mM NaCl 3% 덱스트란 70
공여자 5
60 분 2 135 nd 2 2 2 1 1 2 1 132
90 분 3 145 nd 4 3 3 3 2 2 2 159
120 분 4 150 nd 5 4 4 4 3 4 3 167
150 분 6 153 nd 7 6 5 5 5 5 5 169
공여자 22
60 분 0 161 4 3 0 0 0 0 0 nd 145
90 분 3 164 149 3 3 3 2 2 3 nd 166
120 분 4 166 151 6 4 4 4 3 4 nd 171
150 분 7 167 152 8 6 5 5 5 6 nd 172
NaCl 농도는 BeneFIX®을 재구성하는데 사용되는 농도이다.
제2 실험에서, 적혈구 침강은 5% 덱스트로스, MFR-927(rFIX가 부재인 BeneFIX®에 대한 제형 완충액) 및 10mM NaCl로 재구성된 BeneFIX®에 의해 증진되었다(표 7). 제1 실험같지 않게, 당해 튜브내 침강은 최대 또는 거의 최대의 침강이 15분 내지 30분에 도달할 정도로 신속하였다.
MFR-927, BeneFIX® 또는 5% 덱스트로스중에서 1:8로 희석된 사람 혈액의 적혈구 침강 (영점 마크에서 침강 거리 mm를 측정하였다)
공여자 및 & 희석 시간 식염수 MFR-927 10 mM NaCl 25 mM NaCl 30 mM NaCl 40 mM NaCl 50 mM NaCl 60 mM NaCl 77 mM NaCl 5% 덱스트로스
공여자 56
15 분 0 >180 ~155 1 0 0 0 0 0 175
30 분 0 >180 177 2 1 0 0 0 0 178
45 분 1 >180 180 3 2 1 1 1 1 179
60 분 2 >180 >180 3 2 1 1 1 1 180
공여자 57
15 분 0 >180 180 1 1 0 0 0 0 179
30 분 1 >180 >180 2 2 1 0 1 1 >180
45 분 1 >180 >180 3 3 1 2 1 1 >180
60 분 2 >180 >180 4 3 2 3 2 2 >180
NaCl 농도는 BeneFIX®을 재구성하는데 사용되는 농도이다; MFR-927은 rFIX가 부재인 BeneFIX®을 위한 제형 완충액이다.
이들 실험의 결과는 적혈구 침강을 측정하기 위해 사용되는 변형된 웨스터그렌 방법이 약제학적 제제 또는 제형에 의해 유도된 적혈구 응집을 평가하는데 적용될 수 있음을 입증한다. 예를 들어, 시험 용액과 1:4로 희석된 혈액을 로딩한 지 60분후에 웨스터그렌 튜브에서 적혈구 침강의 측정은 응집을 증진시키는 제제(즉, 5% 덱스트로스, 3% 덱스트란 70, MFR-927, 및 sWFI중에서 재구성된 BeneFIX® )와 응집시키지 않는 제제(즉, 식염수 및 25mM 이상의 NaCl를 함유하는 희석제에 재구성된 BeneFIX®)를 구분하기에 충분하다.
실시예 3: 제형 관련 적혈구 응집을 완화시키기 위해 새롭게 제형화된 BeneFIX®에 대한 희석액에서 40mM NaCl의 적합성
현재 시판되는 BeneFIX®의 비이온성 제형은 환자 혈액이 정맥내 튜빙에서 BeneFIX®와 혼합되는 경우 투여동안에 발생할 수 있는 시험관내 적혈구 응집과 관련되어 있다. 본 발명은 적혈구 응집이 제형과 관련이 있지만 재조합 인자 IX와는 관련이 없고 응집이 40mM 이상의 NaCl를 함유하는 희석제로 BeneFIX®를 재구성함에 의해 예방될 수 있다는 발견을 제공한다.
본 실시예의 목적은 새롭게 제형화된 BeneFIX® (BeneFIX®-R) 제제를 재구성하기 위한 40mM 희석제 강도를 시험하기 위한 것이다. 특히, 실험은 10% 정도로 40mM 로부터 벗어나 있는 NaCl 농도가 제형 관련 적혈구 응집을 예방하기에 충분한지의 여부를 측정하기 위해 디자인되었고 당해 적혈구 응집은 적혈구 침강율(ESR)를 측정하기 위한 적응 변형된 웨스터그렌 방법에 의해 평가되었다. 또한, 적혈구 침강에 대한 NaCl 농도의 강도는 BeneFIX®-R의 높고(즉 2000 IU) 낮은(즉, 250 IU) 용량 바이알에서 평가하였다.
적혈구 침강에 대한 BeneFIX®-R 제형, MFR-927, 및 3% 덱스트란 70의 효과는 실시예 2에 기재된 바와 같이 변형된 웨스터그렌 방법을 적용하여 실온에서 측정하였다. 연구 디자인은 표 8에 개시되어 있다.
실시예 3에 대한 연구 디자인
그룹 처리 실험 수 평가된 공여자 샘플의 총 수 평가된 혈액 희석
1 식염수 4 12 1:4
2 MFR-927 4 12 1:4
3 BeneFIX®R (55 IU/mL); 36 mM NaCl 4 12 1:4
4 BeneFIX®R (55 IU/mL); 40 mM NaCl 4 12 1:4
5 BeneFIX®R (55 IU/mL); 44 mM NaCl 4 12 1:4
6 BeneFIX®R (440 IU/mL); 36 mM NaCl 4 12 1:4
7 BeneFIX®R (440 IU/mL); 40 mM NaCl 4 12 1:4
8 BeneFIX®R (440 IU/mL); 44 mM NaCl 4 12 1:4
9 3% 덱스트란 70 4 12 1:4
실험날에, BeneFIX®-R의 높고(약 2000IU rFIX를 함유하는 동결건조된 BeneFIX®-R의 바이알) 및 낮은 용량의 바이알(약 250IU rFIX를 함유하는 동결건조된 BeneFIX®-R의 바이알)을 5 mL의 36 mM, 40 mM, 또는 44 mM NaCl을 사용하기 직전에 재구성하였다. 포지티브 대조군 용액 3% (w/v) 덱스트란 70을 멸균 듈베코 변형된 칼슘- 및 마그네슘 부재 인산 완충 식염수 (PBS-CMF; pH 7.4)에서 제조하였다. 사람 혈액은 공여자로부터 수득하였고 EDTA를 함유하는 베큐테이너 튜브에 수거하였다. 혈액 샘플은 수거 3시간 이내에 적혈구 침강을 위해 사용하였다.
전혈은 시험 용액중에 1:4로 희석하고(즉, 400 mL의 전혈을 1.2ml의 시험 용액에 첨가하였다), 잘 혼합하고 이어서 통상의 랙에 완전히 수직으로 유지된 자가-영점 조정 1회용 유리 웨스터그렌 튜브상에 로딩하였다. 60분 후, 튜브의 정상에서 혈장 적혈구 접촉면까지의 거리 mm인 적혈구 침강을 측정하고 기록하였다.
모든 12명의 공여자로부터의 결과는 유사하였다. rFIX (MFR-927)가 부재인 현재 시판되는 BeneFIX® 제형 완충액 및 표준 포지티브 대조군 용액인 rFIX (MFR-927)가 부재인 and 3% 덱스트란 70은 NaCl 시험 용액중에서 혼합된 혈액에 비해 증진된 적혈구 침강을 나타내었다(도 1 참조). 완충액중의 NaCl 농도(36 mM, 40 mM, 또는 44 mM) 또는 제품중의 rFIX 농도에 상관없이, BeneFIX®-R은 이것이 NaCl 희석제로 재구성되는 한 적혈구 침강을 증진시키지 않았다.
당해 연구 결과는 BeneFIX®-R 희석제중에서 40mM보다 10% 높거나 낮은 NaCl 농도가 증진된 적혈구 침강 또는 응집(응집)을 예방하기에 충분함을 입증한다. 당해 결과는 또한 제형-관련 적혈구 응집에 대한 NaCl의 완화 효과가 활성 성분(즉, rFIX)의 농도에 의해 영향받지 않음을 보여준다.
실시예 4: BeneFIX®의 재구성용 완충액에서 RBC 응집을 유발하는데 있어서 이온 강도의 역할
사람 혈액은 표준 헤파린화된 수거 튜브내로 4명의 상이한 공여자로부터의 정맥 천자에 의해 수거하였다. RBC 응집 형성은 2.6ml의 완충액 또는 재구성된 BeneFIX® 단백질을 주사기로 흡인함에 이어서 헤파리된화된 0.6ml을 흡인하여 시험하였다. 응집체의 혼합/침강 작용은 시간 경과에 따라 주사기에서 관찰되었고 디지털 카메라를 사용하여 사진 촬영으로 기록하였다.
현재 동결건조전 BeneFIX® 제형의 조성물은 rFIX, 약 10 mM 히스티딘, 약 260 mM 글라이신, 약 1% 슈크로스, 및 약 0.005% 폴리소르베이트-80, pH 6.8이다. BeneFIX® 제형을 동결건조시키고 주사전에 sWFI중에 재구성하였다. 본래에, 슈크로스는 응집의 원인인 것으로 의심되었다. 따라서, 시험 완충액은 1%, 0.5%, 또는 0% 슈크로스로 제형화하였다. 각각의 슈크로스 시험 완충액은 주사기에 흡인함에 이어서 소량의 헤파린화된 혈액을 흡인하였다. RBC의 응집 및 후속의 신속 침강은 3개의 완충액에 대해 동일한 것으로 밝혀졌고 이것은 BeneFIX® 제형의 슈크로스 함량이 관찰된 응집을 해명하지 못함을 시사한다. 멸균수에서 보다 차라리 정상 식염수로 재구성된 BeneFIX®은 어떠한 응집을 유발하지 않았다. 이들 데이터는 BeneFIX® 제형의 이온 강도가, BeneFIX®이 물중에 재구성되는 경우 응집을 예방하기에 충분하지 않음을 지적한다.
응집을 제거하기 위해 요구되는 최소 이온 강도를 측정하기 위해, BeneFIX®은 다양한 농도의 NaCl (0, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 및 137 mM)을 갖는 용액으로 재구성하였다(또는 BeneFIX®의 동결건조전 제형은 다양하게 염화나트륨을 포함하도록 할 수 있지만 염화나트륨 제형을 동결건조시키기 위한 방법은 염화나트륨을 갖지 않는 제형을 동결건조시키는 것에 비해 보다 어렵다. BeneFIX®은 또한 154 mM NaCl을 함유하는 정상 식염수중에 재구성하였다. RBC 응집 및 침강 작용은 당해 모든 용액에서 조사하였다. 표 9는 기타 공통된 정맥내 용액과 함께 당해 용액의 일부에 대한 몰삼투압 농도 및 이온강도(전도성으로 나타냄)를 보여준다. 염화나트륨의 BeneFIX® 제형으로의 첨가시, 동결건조 전에 직접 첨가하거나 염화나트륨 용액으로 동결건조물을 재구성하든지간에 NaCl은 완전히 등가 농도의 Na+ 및 Cl- 이온으로 해리되는 것으로 예상된다. 따라서, 제형 완충액 + NaCl의 이온 강도(Na+ 및 Cl-의 mEq/L (밀리당량/L))으로 나타냄)는 제형 완충액이 기타 이온을 함유하지 않는 다면 NaCl의 농도와 등가인 것으로 추측된다.
다양한 용액의 특성 분석
용액 대략적으로 계산된 몰삼투압 농도 (mOsm/L) 대략적으로 계산된 전도성(mS/cm) pH
BeneFIX®제형 300 0 (관찰된 전도성은 <0.2 mS/cm) 6.8
BeneFIX®제형 + 10 mM NaCl 320 1 6.8
BeneFIX®제형 + 20 mM NaCl 340 2 6.8
BeneFIX®제형 + 40 mM NaCl 380 4 6.8
BeneFIX®제형 + 80 mM NaCl 460 7 6.8
BeneFIX®제형 + 137 mM NaCl 574 12.8 6.8
BeneFIX®제형 + 154 mM NaCl 607 14.4 6.8
0.9% 염화나트륨 (154 mM NaCl에 해당함; 154 mEq/L의 Na+ 및 Cl- 이온) 308 14.4 6.0
5% 덱스트로스 주사 250 0 4.5
주사기내에서 표 9의 용액과 혈액의 접촉시 RBC 응집이 각각 관찰됨에 따라 주사기를 약하게 혼합하고 뒤집어서 혈액이 침강하는 것을 관찰하였다. 응집 형성은 약 40mM 이상의 NaCl로 재구성된 모든 BeneFIX®의 제형에서 관찰되지 않았다(이전의 실시예에서 약 36 mM NaCl이 또한 응집을 예방하기에 충분함을 주지한다). 40mM 이상의 NaCl을 함유하는 당해 용액에서 혈액 세포의 작용은 정상 식염수에서의 작용과 구분될 수 없었다.
혈액 침강은 뒤집은지 15분 후에 감소하는 농도의 NaCl(40mM에서 개시)로 희석된(동결건조전인 경우)/재구성된 BeneFIX® 제형을 함유하는 일련의 주사기에서 시험하였다. 응집 형성 및 후속 침강 속도 측면에서 일관된 농도 의존적 반응이었다- 완충액에서 NaCl의 농도가 감소함에 따라 응집이 증가하고 침강이 신속하게 발생하였다. 25mM이하의 NaCl을 함유하는 완충액중의 하나의 혈액 샘플과 30mM 이하의 NaCl을 함유하는 완충액중에서의 또 다른 혈액 샘플에서 명백한 응집이 육안으로 확인되었다. 40mM 이상의 NaCl을 갖는 모든 완충액 제제에서 혈액 세포의 작용은 정상 식염수 또는 정상 식염수에서 재구성된 BeneFIX®에서의 작용과 구분할 수 없었다. 40 mM NaCl로 재구성된 BeneFIX®은 4mS/cm로 계산된 전도도에 상응한다.
각각 ml당 주사용수중에서 50mg의 물 함유 덱스트로스 USP를 함유하는 5% 덱스트로스 주사 용액은 250mOsm/L로 계산된 몰삼투압 농도를 갖고 0 ms/cm로 계산된 이온 강도를 갖는다. 통상적으로 정맥내로 투여되는 당해 용액은 물중에 재구성된 BeneFIX® 제형과 함께 관찰되는 것과 유사하게 또한 RBC 응집을 유발하고 혈액 침강이 매우 신속하였다.
따라서, 이들 결과는 물중에 재구성된 BeneFIX®에 의해 유발된 RBC 응집이 BeneFIX®의 제형으로 인해 낮은 이온 강도(0 mEq/L으로 계산된 이온 강도, <0.2 mS/cm으로 측정된 전도도)임을 지적한다. 이러한 문제점은 40mM 이상의 NaCl을 갖는 NaCl 용액중에서 재구성함에 의해 보정하여 재구성된 주사용 용액이 약 40mEq/L 이상으로 계산된 이온 강도를 갖도록 한다(응집을 예방하기에 충분한 이온 강도는 또한 약 4mS/cm 이상의 전도성으로서 계산될 수 있다).

Claims (36)

  1. 약 25mM 내지 약 150mM의 염화나트륨 용액을 약제학적 제형에 첨가하여 정맥내 주사용으로 제조된 제형을 수득함을 포함하고, 이때 제조된 제형이 혈장에 대해 거의 등장성이거나 혈장에 대해 약간 저장성이거나 약간 고장성이며 적혈구 응집을 예방하기에 충분한 이온 강도를 갖는, 정맥내 주사용 약제학적 제형의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 제조된 제형이 혈장에 대해 거의 등장성이고 약 270 mOsm/L 내지 약 330 mOsm/L인 몰삼투압 농도를 갖는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 제조된 제형이 혈장에 대해 약간 저장성이고 약 220 mOsm/L 내지 약 270 mOsm/L인 몰삼투압 농도를 갖는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 제조된 제형이 혈장에 대해 약간 고장성이고 약 330 mOsm/L 내지 약 600 mOsm/L인 몰삼투압 농도를 갖는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제조된 제형이 Na+ 및 Cl- 이온에 대해 약 25 mEq/L 이상의 이온 강도를 갖는 방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제조된 제형이 Na+ 및 Cl- 이온에 대해 약 30 mEq/L 이상의 이온 강도를 갖는 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제조된 제형이 Na+ 및 Cl- 이온에 대해 약 36 mEq/L 이상의 이온 강도를 갖는 방법.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제조된 제형이 Na+ 및 Cl- 이온에 대해 약 40 mEq/L 이상의 이온 강도를 갖는 방법.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제조된 제형이 Na+ 및 Cl- 이온에 대해 약 40 mEq/L 내지 약 150 mEq/L의 이온 강도를 갖는 방법.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제조된 제형이 2.5 mS/cm 이상의 전도성으로 측정된 바와 같은 이온 강도를 갖는 방법.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제조된 제형이 4.0 mS/cm 이상의 전도성으로 측정된 바와 같은 이온 강도를 갖는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 주사용으로 제조된 약제학적 제형이 동결건조된 제형인 방법.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 주사용으로 제조된 약제학적 제형이 용제인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 염화나트륨 용액이 약 40 mM 내지 약 150 mM인 방법.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 염화나트륨 용액이 약 36 mM 내지 약 44 mM인 방법.
  16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 염화나트륨 용액이 약 40mM인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 염화나트륨 용액의 첨가 전에, 약제학적 제형이 감지할만한 양의 이온화 염을 함유하지 않는 방법.
  18. 제10항에 있어서, 동결건조된 제형이 물에 재구성되는 경우 5mM 이상의 이온 화 염을 함유하지 않는 방법.
  19. 제10항에 있어서, 동결건조된 제형이 물에 재구성되는 경우 25mM 이상의 이온화 염을 함유하지 않는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 염화나트륨 용액의 첨가 전에, 약제학적 제형이 히스티딘, 글라이신, 슈크로스 및 폴리소르베이트를 포함하는 방법.
  21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 염화나트륨 용액의 첨가 전에, 약제학적 제형이 히스티딘, 글라이신, 슈크로스, 폴리소르베이트 및 치료학적 단백질을 포함하는 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 염화나트륨 용액의 첨가 전에, 약제학적 제형이 히스티딘, 글라이신, 슈크로스, 폴리소르베이트 및 인자 IX를 포함하는 방법.
  23. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 염화나트륨 용액의 첨가전에, 약제학적 제형이 물에 재구성되는 경우,
    (a) 약 5 mM 내지 약 30 mM 히스티딘;
    (b) 약 0.1M 내지 약 0.3M 글라이신;
    (c) 약 0.5 내지 약 2 % 슈크로스; 및
    (d) 약 0.001 내지 약 0.05 % 폴리소르베이트를 포함하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 염화나트륨 용액의 첨가 전에, 약제학적 제형이 물에 재구성되는 경우
    (e) 약 50 IU/mL 내지 약 2000 IU/mL의 인자 IX를 추가로 포함하는 방법.
  25. 약 25mM 내지 약 150mM의 염화나트륨 용액을 동결건조된 인자 IX 제형에 첨가하여 정맥내 주사용의 제형을 수득함을 포함하고, 이때 제조된 제형이 혈장에 대해 거의 등장성이거나 혈장에 대해 약간 저장성 또는 약간 고장성이고 적혈구 응집을 예방하기에 충분한 이온 강도를 갖는, 정맥내 주사용의 동결건조된 인자 IX 제형을 제조하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 동결건조된 인자 IX 제형이 물에 재구성되는 경우,
    (a) 약 5 mM 내지 약 30 mM 히스티딘;
    (b) 약 0.1M 내지 약 0.3M 글라이신;
    (c) 약 0.5 내지 약 2 % 슈크로스; 및
    (d) 약 0.001 내지 약 0.05 % 폴리소르베이트를 포함하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 약 40 mM 염화나트륨 용액이 동결건조된 인자 IX 제형에 첨가되는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 약 40mM 염화나트륨 용액 약 5ml가 동결건조된 인자 IX 제형에 첨가되는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 인자 IX 제형이 동결건조전 약 4ml의 용적을 갖는 방법.
  30. 제26항에 있어서, 동결건조된 인자 IX 제형이 물에 재구성되는 경우 약 10 mM 히스티딘, 0.26M 글라이신, 1% 슈크로스, 0.005% 폴리소르베이트, 및 인자 IX를 포함하는 방법.
  31. (a) 동결건조된 케이크가 5mL의 물중에 재구성되는 경우, 용액이 (i) 약 5 mM 내지 약 30 mM 히스티딘; (ii) 약 0.1M 내지 약 0.3M 글라이신; (iii) 약 0.5 내지 약 2 % 슈크로스; (iv) 약 0.001 내지 약 0.05 % 폴리소르베이트; 및 (v) 약 50 IU/mL 내지 약 2000 IU/mL의 인자 IX를 포함하는, 동결건조된 케이크를 함유하는 바이알;
    (b) 25 mM 내지 약 150 mM의 염화나트륨 용액 및
    (c) 동결건조된 케이크를 염화나트륨 용액으로 재구성하여, 재구성 후 수득한 용액이 거의 등장성이고 정맥내 주사시 적혈구 응집을 예방하기에 충분한 이온 강도를 갖도록 하기 위한 지침서
    를 포함하는 약제학적 키트.
  32. (a) 동결건조된 케이크가 4ml의 물중에 재구성되는 경우, 용액이 (i) 약 10 mM 히스티딘; (ii) 약 0.26M 글라이신; (iii) 약 1 % 슈크로스; (iv) 약 0.005 % 폴리소르베이트 80; 및 (v) 약 50 IU/mL 내지 약 2000 IU/mL의 인자 IX를 포함하는, 동결건조된 케이크를 함유하는 바이알;
    (b) 약 40 mM 염화나트륨 용액; 및
    (c) 바이알중 동결건조된 케이크를 약 5ml의 약 40mM 염화나트륨 용액으로 재구성하여, 재구성후 수득한 용액이 (i) 약 7 내지 약 9 mM 히스티딘; (ii) 약 200 내지 약 210 mM 글라이신; (iii) 약 0.7% 내지 약 0.9% 슈크로스; (iv) 약 0.004% 폴리소르베이트 80; (v) 약 50 IU/mL 내지 약 2000 IU/mL의 인자 IX; 및 (vi) 약 40 mM의 NaCl을 포함하도록 하기 위한 지침서
    를 포함하는 약제학적 키트.
  33. 동결건조된 케이크가 5ml의 물에 재구성되는 경우 용액이
    (i) 약 5 mM 내지 약 30 mM 히스티딘;
    (ii) 약 0.1M 내지 약 0.3M 글라이신;
    (iii) 약 0.5 내지 약 2 %의 슈크로스;
    (iv) 약 0.001 내지 약 0.05 %의 폴리소르베이트 및
    (v) 약 50 IU/mL 내지 약 2000 IU/mL의 인자 IX
    를 포함하는 동결건조된 케이크.
  34. 동결건조된 케이크가 4ml의 물중에 재구성되는 경우 용액이
    (i) 약 10 mM 히스티딘;
    (ii) 약 0.26M 글라이신;
    (iii) 약 1 % 슈크로스;
    (iv) 약 0.005 % 폴리소르베이트 80; 및
    (v) 약 50 IU/mL 내지 약 2000 IU/mL의 인자 IX를 포함하는 동결건조된 케이크.
  35. 동결건조된 케이크가 5ml의 물에 재구성되는 경우 용액이
    (i) 약 5 mM 내지 약 30 mM 히스티딘;
    (ii) 약 0.1M 내지 약 0.3M 글라이신;
    (iii) 약 0.5 내지 약 2 %의 슈크로스;
    (iv) 약 0.001 내지 약 0.05 %의 폴리소르베이트 및
    (v) 약 50 IU/mL 내지 약 2000 IU/mL의 인자 IX를 포함하는 동결건조된 케이크를 함유하는 바이알.
  36. 동결건조된 케이크가 4ml의 물중에 재구성되는 경우 용액이
    (i) 약 10 mM 히스티딘;
    (ii) 약 0.26M 글라이신;
    (iii) 약 1 % 슈크로스;
    (iv) 약 0.005 % 폴리소르베이트 80; 및
    (v) 약 50 IU/mL 내지 약 2000 IU/mL의 인자 IX를 포함하는 동결건조된 케이크를 함유하는 바이알.
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