ES2762230T3 - Formulaciones de vacuna contra el HPV que comprenden un adyuvante de aluminio y métodos de producción de las mismas - Google Patents

Formulaciones de vacuna contra el HPV que comprenden un adyuvante de aluminio y métodos de producción de las mismas Download PDF

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Abstract

Una formulación de vacuna contra el papilomavirus humano, que comprende: a) una cantidad terapéuticamente efectiva de partículas similares al virus (VLP) de HPV que están adsorbidas en un adyuvante de aluminio; b) manitol y sacarosa; y c) opcionalmente una sal; en donde la formulación comprende: a) VLP de HPV de al menos un tipo de HPV adsorbidas en un adyuvante de aluminio, en donde las VLP de cada tipo de HPV están presentes en una concentración de 10-200 μg/ml y en donde las VLP se seleccionan del grupo que consiste en: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV26, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV53, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59, HPV66, HPV68, HPV73 y HPV82; y b) del 1 % al 10 % p/v de manitol; y del 0,5 % al 10 % de sacarosa. en donde la formulación está congelada o liofilizada; y en donde la formulación es estable durante 1 mes a 25 °C después del estrés de un proceso de liofilización o congelación-descongelación.

Description

DESCRIPCIÓN
Formulaciones de vacuna contra el HPV que comprenden un adyuvante de aluminio y métodos de producción de las mismas
Campo de la invención
La presente invención proporciona formulaciones del antígeno del papilomavirus humano (HPV) que muestran una mayor estabilidad del antígeno después de la congelación y/o liofilización. Más específicamente, la invención proporciona formulaciones de vacuna contra el HPV estables que comprenden partículas similares al virus HPV (VLP) unidas a un adyuvante de sal de aluminio y métodos para producirlas.
Antecedentes de la invención
La administración conjunta de vacunas con compuestos que pueden mejorar la respuesta inmunitaria contra el antígeno de interés, conocidos como adyuvantes, se ha estudiado ampliamente. Además de intensificar la respuesta inmunitaria contra el antígeno de interés, se pueden usar algunos adyuvantes para disminuir la cantidad de antígeno necesaria para provocar la respuesta inmunitaria deseada o disminuir el número de inyecciones necesarias en un régimen clínico para inducir una respuesta inmunitaria duradera y proporcionar protección contra la enfermedad. Hace ya más de 60 años que se determinó que los compuestos a base de aluminio poseen actividad adyuvante (para una revisión, véase Lindblad, E.B. Immunol and Cell Biol. 82: 497-505 (2004); Baylor et al. Vaccine 20: S18-S23 (2002)). Los adyuvantes de aluminio generalmente se consideran seguros cuando se usan en las dosis apropiadas. Debido en parte a su bajo costo y su larga historia de uso en pacientes humanos, los adyuvantes de sal de aluminio son los adyuvantes más frecuentemente utilizados en las vacunas humanas. Los ejemplos de formulaciones de vacuna con un adyuvante de aluminio incluyen los documentos WO2008/112125, US2008/226729, Kazzaz J et al J. de Controlled Release 110:566-573, CA246690 y WO2006/067943.
Las vacunas adyuvadas con sal de aluminio se formulan normalmente como líquidos que son extremadamente sensibles a los cambios de temperatura, como el calentamiento o la congelación. La congelación de las vacunas que contienen sal de aluminio causa un daño irreversible a la estructura física de la sal de aluminio, lo que da como resultado la aglomeración de partículas adyuvantes. Esto conduce a la pérdida de actividad adyuvante y, en última instancia, a una pérdida de potencia de la vacuna. Por esta razón, tales formulaciones de vacuna deben mantenerse dentro de un intervalo estrecho de temperatura, preferiblemente entre 2 °C y 8 °C, lo que requiere una cadena de frío robusta durante el transporte y almacenamiento de la vacuna. El mantenimiento de la cadena de frío no siempre es económicamente factible, especialmente en los países en desarrollo. Además, la congelación accidental de vacunas adyuvadas con sal de aluminio es un problema común tanto en países desarrollados como en vías de desarrollo (Clapp et al., J. Pharm. Sci. 100(2): 388-401 (2011); Matthias et al., Vaccine 25(20): 3980-86 (2007)). Los envíos de vacunas congeladas deben descartarse con un costo enorme. También es preocupante la posibilidad que existe de administrar inadvertidamente a los pacientes la vacuna de baja potencia previamente congelada, lo que lleva a una disminución de la eficacia.
Se han propuesto varios enfoques para abordar los problemas asociados con el mantenimiento de la temperatura adecuada para las vacunas que contienen sal de aluminio. Una posible solución es evitar la congelación mediante la adición de componentes de formulación como propilenglicol, polietilenglicol o glicerol (Braun, L. J. et al., Vaccine 27: 4609-4614 (2009); Braun et al., Vaccine 27: 72-79 (2009)). Braun et al., supra, han demostrado que el propilenglicol puede prevenir la aglomeración adyuvante inducida por congelación en ciertas vacunas, incluso a concentraciones demasiado bajas para evitar la congelación.
El uso de formulaciones de vacuna liofilizadas en lugar de líquidas puede aliviar algunos problemas asociados con el transporte y el almacenamiento de una vacuna; sin embargo, el proceso de liofilización también está asociado con la agregación de partículas adyuvantes y la pérdida de potencia (Maa et al., J. Pharm. Sci. 92(2): 319-332 (2003)). Clausi et al. (J. Pharm. Sci. 97: 2049-61 (2008)) y Randolph et al. (WO 2008/118691) han demostrado que la agregación de adyuvante de aluminio durante la congelación y la liofilización puede mitigarse mediante la adición de altas concentraciones (por ejemplo, 15 %) de trehalosa a la formulación. Wolff et al. (Colloids & Surfaces A: Physiochem Eng. Aspects 330: 116-126 (2008)) también sugieren el uso de altas concentraciones de trehalosa para proteger las vacunas que contienen aluminio del estrés por frío. También propuestos por Wolff et al. como componentes de formulación candidatos para prevenir la agregación adyuvante de aluminio fueron PVP K 25, HES 450 y 200, sacarosa y sorbitol. Mizuno et al. (Patente EP n.° 0 130 619 B1) proponen el uso de al menos un aminoácido o una sal del mismo en combinación con al menos un sacárido y al menos una sustancia coloidal.
Sería útil desarrollar formulaciones de vacuna líquidas en las que el antígeno de la vacuna se adsorba en un adyuvante de aluminio, en el que la formulación pueda retener sus propiedades físicas e inmunológicas al congelarse o liofilizarse.
Sumario de la invención
La invención proporciona formulaciones de antígeno del papilomavirus humano (HPV) que muestran una mayor estabilidad del antígeno. Más específicamente, la invención proporciona formulaciones de vacuna contra e1HPV estables que comprenden partículas similares al virus HPV (VLP) de al menos un tipo de HPV que se adsorben en un adyuvante de sal de aluminio y además comprenden una combinación de sacarosa y manitol y, opcionalmente, una sal. Las formulaciones de vacuna de la invención son estables después de la congelación-descongelación y liofilización. También se proporcionan formulaciones de vacuna contra el HPV liofilizadas y congeladas que comprenden VLP de HPV de al menos un tipo de HPV adsorbidas en un adyuvante de sal de aluminio, sacarosa y manitol.
La invención también se refiere a una formulación de HPV como se describió anteriormente en la que la formulación comprende: (a) VLP de HPV de al menos un tipo de HPV adsorbidas en un adyuvante de aluminio, en la que las VLP de cada tipo de HPV están presentes en una concentración de 10-200 pg/ml y en la que las VLP se seleccionan del grupo que consiste en: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV26, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV53, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59, HPV66, HPV68, HPV73 y HPV82; y (b) de 1 % a 10 % p/v de manitol; y de 0,5 % a 10 % de sacarosa. Las formulaciones de la invención también pueden comprender componentes adicionales que incluyen, pero no se limitan a, sal, histidina y un tensioactivo. La invención también proporciona formulaciones de vacuna contra el HPV congeladas o liofilizadas como se describe en la presente memoria.
También se proporcionan métodos para preparar las formulaciones de vacuna estables de la invención. Con ese fin, la invención proporciona un método para producir una formulación de vacuna contra e1HPV congelada estable que comprende:(a) formular una formulación de vacuna contra el HPV líquida que comprende (i) VLP de HPV de al menos un tipo de HPV adsorbidas en un adyuvante de sal de aluminio, en la que las VLP de al menos un tipo de HPV están presentes en una concentración de 10-200 pg/ml y en la que las VLP se seleccionan del grupo que consiste en: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV26, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV53, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59, HPV66, HPV68, HPV73 y HPV82; (ii) de 1 % a 10 % p/v de manitol; y (iii) de 0,5 % a 10 % de sacarosa; y (b) congelar la formulación líquida para producir una formulación de vacuna congelada. Se proporcionan realizaciones adicionales de los métodos de la invención en las que la formulación congelada se seca para producir una formulación liofilizada.
Como se usa en toda la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “uno/a” y “el/la” incluyen la referencia plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Como se usa en toda la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, se aplican las siguientes definiciones y abreviaturas:
El término “SWFI” se refiere a agua estéril para inyección.
El término “BWFI” se refiere al agua bacteriostática para inyección, que es agua estéril que comprende un conservante antimicrobiano.
El término “API” se refiere a un principio farmacéutico activo, p. ej. VLP de HPV, que es un componente de las formulaciones divulgadas en la presente memoria que es biológicamente activo (es decir, capaz de inducir una respuesta inmunitaria apropiada) y confiere un beneficio terapéutico o profiláctico a una persona o animal que lo necesite. Como se usa en la presente memoria, un API es un principio activo de vacuna.
“Formulación” se refiere a una composición que contiene un ingrediente farmacéutico o biológico activo, junto con uno o más componentes de adición. En la presente memoria, el término “formulación” se usa indistintamente con las expresiones “composición farmacéutica”, “composición de vacuna” y “formulación de vacuna”. Las formulaciones pueden ser líquidas o sólidas (por ejemplo, liofilizadas). Los componentes adicionales que pueden incluirse según corresponda incluyen excipientes, aditivos, diluyentes, tampones, azúcares, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina), quelantes, tensioactivos, polioles, agentes de carga, estabilizadores, lioprotectores, solubilizantes, emulsionantes, sales, adyuvantes, agentes potenciadores de la tonicidad (tales como haluros de metales alcalinos, preferiblemente cloruro de sodio o potasio, manitol, sorbitol), vehículos de suministro y conservantes antimicrobianos farmacéuticamente aceptables.
Los componentes de formulación aceptables para preparaciones farmacéuticas no son tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas. Normalmente, la “formulación” es una dosis única de API, que puede administrarse a un solo paciente o animal que lo necesite. El término “multidosis” se refiere a una formulación que contiene más de una dosis de un API que puede administrarse a un paciente más de una vez. Una formulación multidosis normalmente comprende un conservante antimicrobiano. En la presente memoria, el término “formulación” se usa indistintamente con los términos “composición”, “composición biológica” y “composición farmacéutica”.
El término “torta” se refiere a un gránulo seco que resulta cuando una formulación líquida ha sido liofilizada o secada por congelación, como se describe en la presente memoria. La apariencia de la torta es parcialmente indicativa del impacto del proceso de liofilización en las propiedades de la formulación liofilizada. Como se usa en la presente memoria, “torta seca” se refiere a una torta que comprende 20 % o menos de contenido de humedad residual. En algunas realizaciones de la invención, el contenido de humedad de la torta seca es 15 % o menos, 10 % o menos, o 5 % o menos. En realizaciones alternativas, el contenido de humedad de la torta seca está dentro de un intervalo de 0,1 % a 10 %, 0,1 % a 6 %, 0,5 % a 10 % o 0,5 % a 6 %.
La expresión “tiempo de reconstitución” se refiere al tiempo que se requiere para rehidratar una formulación seca (liofilizada) (torta) para que la formulación líquida reconstituida resultante se clarifique y la torta se haya disuelto.
La expresión “cantidad terapéuticamente efectiva” se refiere a una cantidad del principio activo (es decir, proteína o anticuerpo terapéutico) suficiente para producir el efecto terapéutico deseado en un ser humano o animal, p. ej. la cantidad necesaria para tratar, curar, prevenir o inhibir el desarrollo y la progresión de la enfermedad o los síntomas de la misma y/o la cantidad necesaria para mejorar los síntomas o provocar la regresión de la enfermedad. Tal cantidad terapéuticamente efectiva puede variar dependiendo de la estructura y potencia del principio activo y el modo de administración contemplado. Un experto en la materia puede determinar fácilmente una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo o proteína dados.
El término “tratamiento” se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos individuos, como humanos y animales, que ya tienen el trastorno o la afección a tratar, así como aquellos propensos a tener el trastorno o aquellos en los que se debe prevenir el trastorno. Como se usa en la presente memoria, “tratamiento” también incluye la reducción de la probabilidad de contraer el trastorno, la reducción de la gravedad del trastorno en los que ya están afectados y la inducción de la regresión del trastorno o síntomas del mismo.
Un “vehículo farmacéuticamente aceptable” significa un agente de relleno líquido, diluyente o sustancia encapsulante que puede usarse de manera segura en la administración sistémica. Dependiendo de la ruta particular de administración, se puede usar varios vehículos farmacéuticamente aceptables, bien conocidos en la técnica. Estos vehículos pueden seleccionarse de un grupo que incluye azúcares, almidones, celulosa y sus derivados, malta, gelatina, talco, sulfato de calcio, aceites vegetales, aceites sintéticos, polioles, ácido algínico, soluciones tamponadas con fosfato que incluyen solución salina tamponada con fosfato, emulsionantes, solución salina isotónica y agua apirógena. En particular, los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden contener diferentes componentes tales como un tampón, agua estéril para inyección, solución salina normal o solución salina tamponada con fosfato, sacarosa, histidina, sales y polisorbato. Los términos y expresiones tales como “fisiológicamente aceptable”, “diluyente” o “excipiente” se pueden usar indistintamente.
Las abreviaturas adicionales empleadas en la presente memoria son: FAP = producto acuoso congelado, form. = formulación; F/T = congelación-descongelación; 1X F normal/T = 1X congelación-descongelación, como se describe en el Ejemplo 1, 3X F normal/T = 3X congelación-descongelación, como se describe en el Ejemplo 1, 1X F/T ultrarrápida = congelación-descongelación ultrarrápida, como se describe en el Ejemplo 1 (también denominada en la presente memoria F/T FF 1X), His = histidina; HPV = papilomavirus humano; h = hora(s); lio = liofilización o liofilizada, según lo dicte el contexto; min. = minuto(s); mM = milimolar; PS20 = Polisorbato 20; PS80 = Polisorbato 80; recon. = reconstitución; seg. = segundo(s), DLS = dispersión dinámica de la luz; NaCl = cloruro de sodio; vol. = volumen; VLP = partícula similar a virus; WFI = agua para inyección; p/v = peso por volumen.
Breve descripción de los dibujos
La FIGURA 1 muestra las composiciones de tampones utilizados en los estudios de congelación-descongelación y liofilización descritos en la presente memoria. Había 6 tampones (Tampón A a Tampón F) y 3 variaciones de cada tampón que comprenden cantidades variables de sal (0, 150 y 320 mM de cloruro de sodio), como se muestra, dando como resultado 18 composiciones de tampón diferentes (B-1 a B-18). Además de los excipientes enumerados, cada uno de los tampones contenía 10 mM de histidina y Polisorbato 80 al 0,01 %, pH 6,2.
La FIGURA 2 muestra gráficos de los datos de antigenicidad in vitro para cada uno de los tipos de HPV en las formulaciones de prueba 4 valente en función de la concentración de cloruro de sodio y las condiciones de congelación y descongelación para cada tampón de prueba (Tampón A a Tampón F). Véase el Ejemplo 2. Se proporcionan gráficos para el HPV tipo 6 (panel A), el HPV tipo 11 (panel B), e1HPV tipo 16 (panel C) y e1HPV tipo 18 (panel D). Las formulaciones de la vacuna contra el h Pv se sometieron a congelación ultrarrápida usando una explosión de nitrógeno líquido una vez (“F/T FF 1X”) o congelación normal una vez (“F/T 1X”) o 3 veces (“F/T 3X”), como se describe en el Ejemplo 1.
La FIGURA 3 muestra gráficos de los datos de antigenicidad in vitro para cada uno de los tipos de HPV en las formulaciones de prueba 4 valente en función de la concentración de cloruro de sodio después de la liofilización. Véase el Ejemplo 2. Los resultados se muestran para el HPV tipo 6 (panel A), e1HPV tipo 11 (panel B), e1HPV tipo 16 (panel C) y el HPV tipo 18 (panel D) en las formulaciones de HPV 4 valente que comprenden del Tampón A al Tampón F. Cada una de las composiciones se sometió a liofilización con congelación realizada bien por congelación ultrarrápida (“Lio FF”) usando una explosión de nitrógeno líquido o usando un estante de liofilización preenfriado (“Lio PC”), como se describe en el Ejemplo 1.
La FIGURA 4 muestra gráficos de los datos de antigenicidad in vitro para cada uno de los tipos de HPV en función de la concentración de cloruro de sodio y las condiciones de liofilización en diversas composiciones de tampón después del almacenamiento durante 1 mes a 45 °C. También se incluyen las respectivas formulaciones líquidas no liofilizadas que se sometieron a almacenamiento durante 1 mes a 45 °C. Los datos proporcionados corresponden a las mismas formulaciones de prueba, en las mismas condiciones que las que se muestran en la Figura 2, después del almacenamiento durante 1 mes a 45 °C.
La FIGURA 5 proporciona un gráfico de mediciones de osmolalidad (mOsm/kg) para formulaciones de prueba de HPV 4-valentes en Tampón A a Tampón F con 0, 150 o 320 mM de cloruro de sodio. Véase el ejemplo 3.
La FIGURA 6 muestra gráficos de mediciones del tamaño de partícula (promedio Z, nm) para cada una de las formulaciones de prueba de HPV 4-valentes en varios tampones en función de la concentración de cloruro de sodio después de las condiciones de descongelación y liofilización. Para todos los gráficos, los resultados representados representan Tampón A (rombo blanco), Tampón B (cuadrado blanco), Tampón C (triángulo negro), Tampón D (x negra), Tampón E (triángulo blanco) y Tampón F (círculo negro) Se muestran los resultados de las formulaciones de prueba después de la congelación-descongelación (“F/T 1X”), congelacióndescongelación 3X (“F/T 3X”), congelación ultrarrápida (“F/T 1X FF”), liofilización con congelación realizada por congelación ultrarrápida (“Lio FF”) y liofilización utilizando un estante de liofilización preenfriado (“Lio PC”). También se proporcionan resultados para formulaciones de control que no se sometieron a congelacióndescongelación ni a liofilización. Véase el Ejemplo 4.
La FIGURA 7 muestra la apariencia de la torta para formulaciones de HPV 4-valentes liofilizadas en varios tampones (Tampón A a Tampón F) que comprenden 0, 150 o 320 mM de cloruro de sodio. Las formulaciones se liofilizaron con congelación ultrarrrápida (“congelado ultrarrápido”) o se liofilizaron en un estante de liofilización preenfriado (“preenfriado”). Los resultados proporcionados representan el promedio de 3 viales para cada formulación de prueba en el punto temporal T=0. También se muestran los aspectos de la torta de las mismas formulaciones después del almacenamiento durante 1 mes a 45 °C. Véase el Ejemplo 1, Tabla 2, para obtener una descripción de los atributos de calidad para las tortas secas. Véase el Ejemplo 5.
La FIGURA 8 proporciona el tiempo de reconstitución para formulaciones de HPV 4-valentes liofilizadas en varios tampones (Tampón A a Tampón F) que comprenden 0, 150 o 320 mM de cloruro de sodio después de la adición de agua estéril para inyección. Las formulaciones se liofilizaron con congelación ultrarrápida (“congelado ultrarrápido”) o se liofilizaron en un estante de liofilización preenfriado (“preenfriado”). Los resultados proporcionados corresponden a 2 viales para cada formulación de prueba. También se muestran los tiempos de reconstitución después de la adición de agua estéril para inyección para las mismas formulaciones después del almacenamiento durante 1 mes a 45 °C. Véase el Ejemplo 5.
La FIGURA 9 proporciona el tiempo de prueba de agitación para formulaciones de HPV 4-valentes liofilizadas en varios tampones (Tampón A a Tampón F) que comprenden 0, 150 o 320 mM de cloruro de sodio después de la adición de agua estéril para inyección. Las formulaciones se liofilizaron con congelación ultrarrápida (“congelado ultrarrápido”) o se liofilizaron en un estante de liofilización preenfriado (“preenfriado”). Los resultados proporcionados corresponden a 3 viales para cada formulación de prueba. Véase el Ejemplo 5.
La FIGURA 10 proporciona la antigenicidad in vitro para los tipos de HPV 16 (panel A) y 18 (panel B) en las formulaciones de prueba 4 valente (Tampón B a Tampón D) después del almacenamiento durante varios puntos temporales a -70 °C. Las formulaciones de prueba se almacenaron después de someterlas a procesos de congelación-descongelación (F/T) o liofilización (LIO), como se describe en el Ejemplo 1. Se muestra la potencia de Biacore (%) en función del tiempo de almacenamiento. Véanse los ejemplos 1 y 6.
La FIGURA 11 proporciona la antigenicidad in vitro para los HPV tipo 16 (panel A) y HPV18 (panel B) en las formulaciones de prueba 4 valente (Tampón B a Tampón D), después del almacenamiento durante varios puntos temporales a 25 °C. Las formulaciones de prueba se almacenaron después de ser sometidas a procesos de congelación-descongelación o liofilización. Véase el Ejemplo 6.
La FIGURA 12 proporciona la antigenicidad in vitro para cada uno de los tipos de HPV en las formulaciones de prueba 4 valente (Tampón B a Tampón D) después del almacenamiento a 37 °C durante varios puntos temporales. Las formulaciones de prueba se almacenaron después de que se sometieron a procesos de congelación-descongelación o liofilización. Véase el Ejemplo 6. Se proporcionan gráficos para e1HPV tipo 6 (panel A), el HPV tipo 11 (panel B), el HPV tipo 16 (panel c ) y el HPV tipo 18 (panel D).
La FIGURA 13 muestra la apariencia de la torta para formulaciones de HPV 4-valentes liofilizadas (Tampón B a Tampón D) después del almacenamiento durante varios meses a diversas temperaturas de almacenamiento. Los resultados proporcionados representan el promedio de 3 viales para cada formulación de prueba. Véase el Ejemplo 1, Tabla 2, para obtener una descripción de los atributos de calidad de las tortas secas. Véase el Ejemplo 10. Los datos se proporcionan para el almacenamiento a 2-8 °C (panel A), 25 °C (panel B), 37 °C (panel C) y -70 °C (panel D).
La FIGURA 14 muestra el aspecto de la torta para formulaciones liofilizadas de 1X MAA (Tampón B a Tampón D) después del almacenamiento durante varios meses a diversas temperaturas de almacenamiento. Los resultados proporcionados representan el promedio de 3 viales para cada formulación de prueba. Véase el Ejemplo 1, Tabla 2, para obtener una descripción de los atributos de calidad de las tortas secas. Véase el Ejemplo 10. Los datos se proporcionan para el almacenamiento a 2-8 °C (panel A), 25 °C (panel B), 37 °C (panel C) y -70 °C (panel D). La FIGURA 15 proporciona el tiempo de prueba de agitación para formulaciones de HPV 4 valente liofilizadas (Tampón B a Tampón D) después del almacenamiento durante varios meses a varias temperaturas de almacenamiento. Los resultados proporcionados corresponden a 3 viales para cada formulación de prueba. Véase el Ejemplo 10. Los datos se proporcionan para el almacenamiento a 2-8 °C (panel A), 25 °C (panel B), 37 °C (panel C) y -70 °C (panel D).
Descripción detallada de la invención
Las formulaciones de vacuna comúnmente contienen adyuvantes de aluminio, que se utilizan para intensificar la respuesta inmunitaria al antígeno. Las vacunas adyuvadas con aluminio son extremadamente sensibles a los cambios de temperatura, como el calentamiento o la congelación. Para evitar problemas de disminución de la potencia y/o eficacia como se describió anteriormente, existe la necesidad de métodos para producir formulaciones de vacuna térmicamente estables que comprendan un adyuvante de sal de aluminio que sea inmunológicamente activo. Con ese fin, la presente invención proporciona formulaciones de vacuna estables líquidas y sólidas congeladas y liofilizadas que comprenden al menos un antígeno adsorbido en un adyuvante de sal de aluminio y una combinación de manitol y sacarosa. En aspectos preferidos de la invención, el antígeno es una partícula similar al virus (VLP) del papilomavirus humano (HPV).
Como se ha señalado anteriormente, la presente invención proporciona una formulación de vacuna contra el papilomavirus humano que comprende (a) partículas similares al virus (VLP) de1HPV de al menos un tipo de HPV que se adsorben en un adyuvante de aluminio; y (b) un tampón que comprende manitol y sacarosa. Las formulaciones de vacuna opcionalmente comprenden un tensioactivo no iónico y/o una sal tal como NaCl.
Las formulaciones de vacuna líquidas contra el HPV de acuerdo con la invención son capaces de retener sus características físicas e inmunológicas tras (1) la congelación y descongelación; (2) la liofilización de la formulación líquida; (3) la reconstitución de la formulación seca y (4) la reconstitución de la formulación seca después del almacenamiento durante un mes o más a temperatura ambiente o temperatura elevada. Por consiguiente, la invención proporciona una formulación de vacuna contra el HPV como se describe a lo largo de la memoria descriptiva en diversas realizaciones, que se congela, liofiliza o reconstituye.
En realizaciones preferidas de este aspecto de la invención, la formulación de la vacuna contra e1HPV comprende (a) partículas similares al virus (VLP) del HPV de al menos un tipo de HPV adsorbidas en un adyuvante de aluminio, en las que las VLP de cada tipo de HPV están presentes en una concentración de 10-200 pg/ml y en las que las VLP se seleccionan del grupo que consiste en: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV26, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV53, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59, HPV66, HPV68, HPV73 y HPV82; (b) de 1 % a 10 % p/v de manitol; y (c) de 0,5 % a 10 % de sacarosa. En realizaciones adicionales, la formulación de vacuna contra el HPV comprende además un tensioactivo no iónico. En una realización adicional, la formulación de vacuna comprende componentes como se define en cualquier realización anterior y además comprende una sal.
Realizaciones adicionales de la invención proporcionan una formulación de HPV como se definió anteriormente, en la que la cantidad de manitol presente en la formulación es del 4 % al 10 % y la cantidad de sacarosa es del 1 % al 5 %.
Se proporcionan realizaciones adicionales de este aspecto de la invención en las que la formulación comprende componentes como se define en cualquier formulación anterior y además comprende de 5 mM a 100 mM de histidina. En realizaciones preferidas, la formulación comprende 10 mM de histidina.
En realizaciones adicionales, la invención se refiere a una formulación de vacuna contra e1HPV como se define en cualquier realización anterior, en las que la formulación comprende adicionalmente un tensioactivo. En ejemplos de realizaciones de la invención, la formulación de vacuna comprende 0,001 % a 0,04 % de tensioactivo. En algunas realizaciones, el tensioactivo es PS20 o PS80.
En otra realización más de este aspecto de la invención, la formulación de vacuna contra e1HPV comprende VLP de HPV de al menos un tipo de HPV adsorbidas en un adyuvante de sal de aluminio, en las que las VLP de al menos un tipo de HPV están presentes en una concentración de 10-200 pg/ml y en las que las VLP se seleccionan del grupo que consiste en: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV26, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV53, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59, HPV66, HPV68, HPV73 y HPV82; (b) de 5 % a 6 % p/v de manitol; y (c) de 2 % a 4 % de sacarosa. En una realización adicional, la formulación de vacuna comprende además 10 mM de histidina, NaCl de 0,30 a 0,35 M y/o PS80 al 0,01 %.
Componentes de la formulación
Como se señaló anteriormente, de acuerdo con la invención, se ha demostrado que una combinación de manitol y sacarosa protege las formulaciones de vacuna con adyuvante de aluminio del estrés inducido por congelación, descongelación o liofilización. Con ese fin, la invención proporciona formulaciones de vacuna, p. ej. formulaciones de vacuna de VLP del HPV, en las que los componentes de la formulación son como se define en cualquiera de las realizaciones anteriores y el manitol está presente en cualquiera de las siguientes cantidades: 1 % a 10 % p/v, 2 % a 10 % p/v, 3 % a 10 % p/v, 4 % a 10 % p/v, 5 % a 10 % p/v, 1 % a 9 % p/v, 2 % a 9 % p/v, 3 % a 9 % p/v , 4 % a 9 % p/v, 5 % a 9 % p/v 1 % a 8 % p/v, 2 % a 8 % p/v, 3 % a 8 % p/v, 4 % a 8 % w/v, 5 % a 8 % w/v, 1 % a 7 % w/v, 2 % a 7 % w/v, 3 % a 7 % w/v, 4 % a 7 % w/v, 1 % a 6 % p/v, 2 % a 6 % p/v, 3 % a 6 % p/v, o 4 % a 6 % p/v. En realizaciones alternativas de la invención, los componentes de la formulación de la vacuna son como se describe en cualquier realización anterior y la cantidad de manitol es 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % o 10 % p/v. En realizaciones preferidas, las composiciones comprenden 4 %, 5 % o 6 % p/v de manitol.
En otras realizaciones de la invención, la formulación de la vacuna contra e1HPV comprende componentes como se define en cualquiera de las realizaciones anteriores y sacarosa en cualquiera de las siguientes cantidades: 0,5 % a 10 % p/v, 1 % a 10 % p/v, 2 % a 10 % p/v, 3 % a 10 % p/v, 4 % a 10 % p/v, 0,5 % a 9 % p/v, 1 % a 9 % p/v, 2 % a 9 % p/v, 3 % a 9 % p/v, 4 % a 9 % p/v, 1 % a 8 %, 2 % a 8 %, 3 % a 8 %, 4 % a 8 %, 1 % a 7 %, 2 % a 7 %, 3 % a 7 %, 4 % a 7 %, 1 % a 6 %, 2 % a 6 %, 3 % a 6 %, 4 % a 6 % p/v de sacarosa. En realizaciones alternativas, la composición de vacuna comprende 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % o 10 % p/v de sacarosa. En realizaciones preferidas, las composiciones comprenden 2 %, 3 %, 4 % o 5 % p/v de sacarosa.
En realizaciones específicas de la invención, las formulaciones de vacuna contra e1HPV comprenden componentes como se define en cualquier realización anterior o cualquier realización descrita a continuación, y además comprenden de 5 mM a 100 mM de histidina. En realizaciones adicionales, la concentración de histidina en la composición es de 5 mM a 90 mM, 5 mM a 80 mM, 5 mM a 75 mM, 5 mM a 60 mM, 5 mM a 50 mM, 10 mM a 90 mM, 10 mM a 75 mM, 10 a 60 mM, 10 mM a 50 mM, 20 mM a 90, 20 mM a 75 mM, 20 a 60 mM o 20 mM a 50 mM. En realizaciones alternativas, la composición de vacuna comprende histidina 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM o 50 mM. En una realización preferida, la formulación de vacuna comprende 10 mM de histidina.
Cualquiera de las composiciones de vacuna descritas en la presente memoria puede comprender opcionalmente un tensioactivo. Se pueden agregar tensioactivos para reducir y/o prevenir la agregación o para prevenir y/o inhibir el daño a las proteínas durante las condiciones de procesamiento, tales como purificación, filtración, liofilización, transporte, almacenamiento y suministro. Los tensioactivos que son útiles en las formulaciones de la invención incluyen, pero no se limitan a: tensioactivos no iónicos tales como ésteres de ácido graso de polioxietilen sorbitán (polisorbatos, vendidos con el nombre comercial Tween® (Uniquema Americas LLC, Wilmington, DE)) incluyendo Polisorbato-20 (monolaurato de polioxietilen sorbitá), polisorbato-40 (monopalmitato de polioxietilen sorbitán), polisorbato-60 (monoestearato de polioxietilen sorbitán) y polisorbato-80 (monooleato de polioxietilen sorbitán); polioxietilen alquil éteres tales como Brij® 58 (Uniquema Americas LLC, Wilmington, DE) y Brij® 35; poloxámeros (por ejemplo, poloxámero 188); Triton® X-100 (Union Carbide Corp., Houston, TX) y Triton® X-114; NP40; Span 20, Span 40, Span 60, Span 65, Span 80 y Span 85; copolímeros de etileno y propilenglicol (p. ej., la serie Pluronic® de tensioactivos no iónicos como Pluronic® F68, Pluronic® 10R5, Pluronic® F108, Pluronic® F127, Pluronic® F38, Pluronic® L44, Pluronic® L62 (BASF Corp., Ludwigshafen, Alemania) y dodecilsulfato de sodio (SDS).
En ejemplos de realizaciones de la invención, el tensioactivo es un tensioactivo no iónico seleccionado del grupo que consiste en: Polisorbato 20, Polisorbato 80, Brij®35, Pluronic® F-68 y Triton®. En algunas realizaciones preferidas, el tensioactivo es Polisorbato 20 o Polisorbato 80.
La cantidad de tensioactivo que se incluirá en las formulaciones de la invención es una cantidad suficiente para realizar la función deseada, es decir, una cantidad mínima necesaria para evitar la agregación de proteínas, para prevenir o inhibir la formación de partículas, para reducir la cantidad de agregación de la formulación liofilizada o congelada o la formulación reconstituida después de la adición de un diluyente como BWFI a un nivel aceptable, para facilitar la reconstitución o proporcionar una ventaja de estabilidad durante el transporte y/o procesamiento. Normalmente, el tensioactivo está presente en una concentración de 0,001 % a 0,5 % (peso/vol). En realizaciones preferidas de este aspecto de la invención, el tensioactivo está presente en la formulación (antes de la liofilización) en una cantidad de 0,005 % a 0,4 %; en realizaciones más preferidas, el tensioactivo está presente en una cantidad de 0,01 % a 0,3 %. En realizaciones particularmente preferidas, el tensioactivo está presente en una cantidad de 0,01 %.
En ejemplos de realizaciones de la invención, el tensioactivo es un tensioactivo no iónico seleccionado del grupo que consiste en: Polisorbato 20, Polisorbato 80, Brij®35, Pluronic® F-68 y Triton®. En algunas realizaciones preferidas, el tensioactivo es Polisorbato 20 o Polisorbato 80. En realizaciones particularmente preferidas, la formulación de vacuna contra el HPV comprende PS80 al 0,01 %.
La invención también incluye formulaciones de vacuna que comprenden componentes como se define en cualquier realización anterior y además comprenden una sal, que puede contribuir al control de la fuerza iónica de la formulación. Las sales que se pueden usar en las formulaciones de vacuna contra e1HPV de la invención incluyen, pero no se limitan a, NaCl, KCl, Na2SO4, (NH4)2SO4, fosfato de sodio y citrato de sodio. La sal debe estar presente en la formulación en una concentración de 0,10M a 1M. Sin embargo, no se prefieren concentraciones muy altas debido a las limitaciones prácticas de la inyección parental de formulaciones con alto contenido de sal. En cambio, se prefieren concentraciones de sal más moderadas, tales como concentraciones más fisiológicas de 0,15 M a 0,5 M con NaCl 0,15 M-0,32 M. En realizaciones alternativas de la invención, las formulaciones de vacuna contra e1HPV no comprenden sal.
El pH de las composiciones de vacuna de la invención, como se describe en cualquier realización anterior o cualquier realización descrita a continuación, está preferiblemente en el intervalo de 5,5 a 7,5. En realizaciones específicas de la invención, el pH de la composición es 5,5, 5,75, 6,0, 6,1, 6,2, 6,25, 6,3, 6,4, 6,5, 6,75, 7,0, 7,25 o 7,5. En realizaciones adicionales, el pH es de 5,5 a 7,0, 5,5 a 6,5, 6,0 a 7,5, 6,0 a 7,0, 6,5 a 7,0, 6,0 a 6,5, 6,0 a 6,9, 6,2 a 6,75, o 6,0 a 6,75.
En algunas circunstancias, puede ser deseable proporcionar una formulación de vacuna contra e1HPV multidosis que comprenda más de una dosis de vacuna en el mismo vial. Si se desea una formulación multidosis, se debe usar un conservante antimicrobiano para destruir o prevenir el crecimiento de microorganismos, como bacterias y hongos. Las formulaciones de vacuna multidosis que contienen conservantes antimicrobianos proporcionan varias ventajas sobre las formulaciones de dosis única, incluida la posibilidad de extraer múltiples dosis de la vacuna del vial sin la preocupación de que la primera extracción haya introducido inadvertidamente contaminación microbiana (Meyer et al., J. Pharm. Sci. 96(12):3155-3167 (2007)). Los conservantes antimicrobianos preferidos para usar en las formulaciones de vacuna contra el HPV de la invención incluyen un conservante antimicrobiano seleccionado del grupo que consiste en: m-cresol, fenol y alcohol bencílico (ver Bryan et al., patente US-7.709.010).
Las formulaciones de la invención son preferiblemente estables durante al menos 1 mes a temperatura ambiente o inferior. La estabilidad de la formulación se prueba mediante diversos métodos utilizados para determinar las propiedades biofísicas (como la agregación mediante un método para medir el tamaño de partícula mediante la dispersión dinámica de la luz (DLS) y las afinidades de unión (como los ensayos de potencia con Biacore) del API antes y después de la congelación o liofilización y/o después de las condiciones de almacenamiento En algunas realizaciones de la invención, las formulaciones son estables durante 1 mes, 3 meses, 6 meses o más de 6 meses a temperatura ambiente o por debajo de esta (por ejemplo, 20-25 °C) después del estrés del proceso de liofilización o congelación-descongelación. En otras realizaciones, las formulaciones son estables durante 6 meses, más de 6 meses o más de un año cuando se almacenan por debajo de la temperatura ambiente (por ejemplo, -70 °C o entre 2-8 °C). En otras realizaciones, las formulaciones son estables durante más de 1 mes o 3 meses a 37 °C después de la liofilización o el estrés del proceso de congelación-descongelación. En realizaciones preferidas, las formulaciones de la invención están en la categoría de indicadores de los viales de vacuna (IVV) IVV30 (es decir estables durante 193 días a 25 °C o 30 días a 37 °C). Véase los ejemplos para la descripción del sistema IVV. En la presente memoria se muestra que una combinación de manitol y sacarosa en las formulaciones de la invención permite que las composiciones de la vacuna de VLP contra el HPV mantengan la estabilidad a -70 °C o 2­ 8 °C durante más de 6 meses después de los procedimientos de liofilización o congelación-descongelación. También se muestra que las formulaciones de la invención que comprenden una combinación de manitol y sacarosa mantienen su potencia durante >6 meses a 25 °C o 3 meses a 37 °C después de la liofilización.
Las formulaciones de la presente invención pueden comprender además componentes adicionales y vehículos farmacéuticamente aceptables que incluyen, pero no se limitan adyuvantes, que se pueden agregar para aumentar la respuesta inmunitaria del sistema inmunitario del paciente al API (VLP de1HPV), un tampón, un estabilizador, un solubilizante, un modificador de tonicidad, un agente quelante, dextrano, sulfato de dextrano, dextrano T40, dietanolamina, guanidina, cloruro de calcio, citrato de sodio, albúmina, gelatina, polietilenglicol (PEG), lípidos y heparina. El experto en la materia puede determinar fácilmente qué excipientes adicionales deberían incluirse en una formulación de vacuna deseada, dependiendo de su función en la formulación, así como del modo proyectado de administración, dosificación y otros factores tales como el tiempo y la temperatura de almacenamiento esperados de la formulación. El experto en la materia reconoce que la cantidad de excipientes adicionales puede variar y puede determinar fácilmente una cantidad adecuada que sea segura para la administración a humanos o animales y efectiva para la función deseada.
Partículas similares al virus HPV
Hasta la fecha se han identificado más de 80 tipos de HPV, muchos de los cuales se han asociado con patologías que van desde verrugas proliferativas benignas hasta carcinomas malignos del cuello uterino (para una revisión, véase McMurray et al., Int. J. Exp. Pathol. 82(1): 15-33 (2001)). Los tipos de HPV 6 y 11 se denominan de “bajo riesgo” y son los tipos de HPV que se asocian más comúnmente con verrugas benignas, condiloma acuminado no maligno y/o displasia de bajo grado de la mucosa genital o respiratoria. Aproximadamente el 90 % de las verrugas genitales son causadas por estos dos tipos de HPV. Por el contrario, el h Pv 16 y e1HPV 18 se denominan tipos de HPV de “alto riesgo” porque se asocian más frecuentemente con y carcinomas invasivos in situ de cuello uterino, vagina, vulva y canal anal. Más del 70 % de los carcinomas cervicales son causados por infecciones con HPV16 y HPV18. Junto con los tipos oncogénicos menos prevalentes HPV 31, 33, 45, 52 y 58, estos tipos representan más del 90 % del cáncer cervical (Schiffman et al., J. Natl. Cancer Inst. 85(12): 958-64 (1993)).
Los papilomavirus son virus de ADN icosaédrico pequeños (50-60 nm), no envueltos, que codifican hasta ocho genes tempranos (E1-E7) y dos tardíos (L1-L2). La proteína L1 es la principal proteína de la cápside y tiene un peso molecular de 55-60 kDa. La expresión de la proteína L1 o una combinación de las proteínas L1 y l2 en levaduras, células de insectos, células de mamíferos o bacterias conduce al autoensamblaje de partículas similares a virus (VLP) (para una revisión, véase Schiller y Roden, en Papillomavirus Reviews: Current Research on Papillomaviruses; Lacey, ed. Leeds, Reino Unido: Leeds Medical Information, pp 101-12 (1996)). Las VLP son morfológicamente similares a los viriones auténticos y son capaces de inducir altos títulos de anticuerpos neutralizantes tras la administración a animales o humanos. Debido a que las VLP no contienen el genoma viral potencialmente oncogénico, presentan una alternativa segura al uso de virus vivos en el desarrollo de vacunas contra el HPV (para una revisión, véase Schiller y Hidesheim, J. Clin. Virol 19: 67-74 (2000)). Por esta razón, los genes L1 y L2 se han identificado como dianas inmunológicas para el desarrollo de vacunas profilácticas y terapéuticas para la infección y la enfermedad por HPV.
Por consiguiente, las composiciones de vacuna de la presente invención comprenden VLP de HPV compuestas de proteínas L1 recombinantes o L1 L2 recombinantes de al menos un tipo de HPV. La proteína HPV L1 o HPV L1 L2 se puede expresar de forma recombinante mediante la clonación molecular del ADN de L1 o L1 L2 en un vector de expresión que contiene un promotor adecuado y otros elementos reguladores de la transcripción apropiados, y transferirse a células hospedadoras procariotas o eucariotas para producir proteína recombinante. Las técnicas para tales manipulaciones están perfectamente descritas por Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, (1989)). Las VLP pueden autoensamblarse cuando la proteína L1 se expresa de forma recombinante en una célula hospedadora.
Las proteínas L1 del HPV recombinantes de la presente invención pueden ser cualquier secuencia de proteína L1 de longitud completa que se pueda encontrar en la naturaleza o cualquier proteína L1 mutada o truncada que sea capaz de autoensamblarse en VLP. Las secuencias de proteínas L1 para usar en la presente invención pueden determinarse aislando ADN de una o más muestras clínicas que contienen un tipo de HPV de elección, determinando la secuencia de la secuencia de ADN de L1 de HPV y traduciendo la secuencia de ADN en una secuencia de aminoácidos usando el código genético. Se pueden encontrar muchos ejemplos de secuencias de L1 adecuadas para su uso en la presente invención en la bibliografía. Véase, por ejemplo, las patentes US-5.820.870; US-7.250.170; US-7.276.243; y US-5.437.951; Kirii et al. (Virology 185(1): 424-427 (1991)). Las proteínas L1 adicionales que son útiles en las composiciones y formulaciones de la presente invención incluyen fragmentos biológicamente activos y/o mutantes de una secuencia de L1 del h Pv , que incluyen, pero no se limitan necesariamente a, sustituciones, deleciones, adiciones, truncamientos amino terminales y truncamientos carboxi terminales de aminoácidos, de modo que estas mutaciones proporcionan proteínas L1 o fragmentos de proteínas que son capaces de formar una VLP. Véase, por ejemplo, la Publicación Internacional WO 2006/114312 y patente US-6.599-508.
Las células hospedadoras apropiadas para la expresión de L1 recombinante o L1 L2 recombinante de1HPV y el posterior autoensamblaje de VLP incluyen, pero no se limitan a, células de levadura, células de insecto, células de mamífero o bacterias. En ejemplos de realizaciones de la invención, las VLP se producen en células de levadura tales como una levadura seleccionada del grupo que consiste en: Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyvermyces fragilis, Kluveromyces lactis, y Schizosaccharomyces pombe. La expresión de VLP de HPV en células de levadura ofrece las ventajas de ser rentable y adaptarse fácilmente al crecimiento a gran escala en fermentadores.
La presente invención también incluye formulaciones que comprenden formas mutantes de VLP de HPV, tales como VLP de HPV que comprenden fragmentos biológicamente activos y/o mutantes de una proteína L1 o L2 de HPV, que incluyen pero no se limitan necesariamente a sustituciones, deleciones, adiciones, truncamientos amino terminales y truncamientos carboxi terminales de aminoácidos de manera que estas mutaciones proporcionan proteínas o fragmentos de proteínas de uso terapéutico o profiláctico y serían útiles para el desarrollo de la vacuna de VLP contra el HPV. Cualquier forma mutante de una proteína L1 del HPV debe ser capaz de formar VLP y provocar una respuesta inmunitaria contra el tipo de HPV deseado cuando se administra a un paciente humano.
Además, un experto en la materia reconocerá que la proteína L1 o L1 L2, que se usa para autoensamblar las VLP para su inclusión en las formulaciones divulgadas en la presente memoria, puede estar codificada por un polinucleótido de L1 o L2 del HPV de tipo silvestre de longitud completa, o puede estar codificado por un fragmento o mutante de la secuencia de tipo silvestre conocida. Las secuencias de polinucleótidos de tipo silvestre que codifican el ARNm que expresa la proteína L1 o L2 de HPV están disponibles en la técnica. Cualquier polinucleótido mutante codificará una proteína o un fragmento de proteína que al menos imita sustancialmente las propiedades farmacológicas de una proteína L1 o L2 del HPV, incluida la capacidad de formar VLP que pueden provocar una respuesta inmunitaria contra el tipo de HPV de interés cuando se administran a un humano. Cualquiera de estos polinucleótidos incluye, pero no se limita necesariamente a: sustituciones, deleciones, adiciones, truncamientos amino terminales y truncamientos carboxi terminales de nucleótidos.
En realizaciones específicas de la invención, las VLP de al menos un tipo de HPV incluyen un tipo de HPV seleccionado del grupo que consiste en: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV26, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV53, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59, HPV66, HPV68, HPV73 y HPV82. Sin embargo, cualquier tipo de HPV que esté asociado con una afección o trastorno patológico es adecuado para su inclusión en las formulaciones proporcionadas en la presente memoria. En algunas realizaciones de la invención, las formulaciones son formulaciones de vacuna monovalentes que comprenden VLP de un solo tipo de HPV, p. ej. HPV tipo 16, 18, 31, 45 o cualquiera de los tipos de HPV enumerados anteriormente o cualquier otro tipo de HPV asociado con una afección patológica. En realizaciones alternativas, las formulaciones son bivalentes; por ejemplo, formulaciones que comprenden VLP de HPV de tipo 16 y 18. En realizaciones alternativas, las formulaciones son 3valente, 4-valente, 5-valente, 6-valente, 7-valente, 8-valente, 9-valente o 10-valente. En algunas realizaciones preferidas, la formulación es 4-valente, por ejemplo, una formulación que comprende VLP de HPV de los tipos 6, 11, 16 y 18. En realizaciones alternativas preferidas, las formulaciones comprenden VLP de HPV de los tipos 6, 11, 16, 18, 31, 33, 45, 52 y 58.
La cantidad de partículas similares a virus de cada tipo de HPV a incluir en las formulaciones de la presente invención es una cantidad terapéuticamente efectiva, que dependerá de la inmunogenicidad del producto génico expresado. En general, una dosis inmunológica o profilácticamente efectiva comprende de 10 |jg a 100 |jg, y preferiblemente de 20 jg a 80 jg de VLP.
La concentración de VLP del HPV que se incluirá en las formulaciones de la invención variará, pero generalmente se prefiere una concentración de 20 jg/ml a 200 jg/ml para cada tipo de VLP de1HPL presente en la formulación. Más preferiblemente, la concentración de VLP del HPV, para cada tipo de HPV en la formulación, es de 40 jg/ml a 160 jg/ml.
Adyuvantes de sal de aluminio
Como se ha señalado anteriormente, se sabe desde hace mucho tiempo que el aluminio estimula la respuesta inmunitaria contra los antígenos administrados conjuntamente. Las formulaciones de vacuna de la invención se adsorben en adyuvante de aluminio. Se prefiere que el adyuvante de aluminio de las composiciones proporcionadas en la presente memoria no esté en forma de un precipitado de aluminio. Las vacunas precipitadas con aluminio pueden aumentar la respuesta inmunitaria frente a un antígeno diana, pero se ha demostrado que son preparaciones altamente heterogéneas y no han tenido resultados uniformes (véase Lindblad E.B. Immunology and Cell Biology 82: 497-505 (2004)). Las vacunas adsorbidas en aluminio, por el contrario, se pueden producir de forma estandarizada, lo cual es una característica esencial de las preparaciones de vacuna para la administración en humanos. Además, se cree que la adsorción física de un antígeno deseado en el adyuvante de aluminio tiene un papel importante en la función adyuvante, quizás en parte al permitir una eliminación más lenta del sitio de inyección o al permitir una absorción más eficiente del antígeno por las células presentadoras de antígeno.
El adyuvante de aluminio de la presente invención puede estar en forma de hidróxido de aluminio (Al(OH)3), fosfato de aluminio (APO4), hidroxifosfato de aluminio, sulfato hidroxifosfato de aluminio amorfo (AAHS) o el llamado “alumbre” (KAl(SO4)-12H2O) (véase Klein et al., Analysis of aluminum hydroxyphosphate vaccine adjuvants by (27)A1 mAs NMR., J. Pharm. Sci. 89(3): 311-21 (2000)). En ejemplos de realizaciones de la invención proporcionadas en la presente memoria, el adyuvante de aluminio es hidroxifosfato de aluminio o AAHS. Se prefiere que, en estas realizaciones, el adyuvante de aluminio comprenda fosfato y aluminio presente en una relación molar de 0,1 a 1,3 de fosfato (PO4) a aluminio (Al). En realizaciones alternativas preferidas de este aspecto de la invención, la relación entre fosfato y aluminio está dentro del intervalo de 0,1 a 0,70. Se prefiere más que el adyuvante de aluminio comprenda fosfato y aluminio presente en una relación molar de 0,2 a 0,5 PO4/AL En realizaciones alternativas de este aspecto de la invención, el adyuvante de aluminio es hidróxido de aluminio.
En algunas realizaciones de la invención, el adyuvante de aluminio está en forma de AAHS (denominado en la presente memoria intercambiable como adyuvante de aluminio Merck (MAA)). MAA lleva carga cero a pH neutro, mientras que Al(OH)3 lleva una carga positiva neta y AlPO4 normalmente lleva una carga negativa neta a pH neutro. MAA tiene una mayor capacidad para unirse a VLP de HPV que AlOH. Además, las VLP adsorbidas en MAA pueden inducir una mayor respuesta inmunitaria humoral en ratones que las VLP adsorbidas en Al(OH)3. Caulfield et al., Human Vaccines 3: 139-146 (2007). Aunque sin desear quedar ligado a teoría alguna, es posible que la carga neta del adyuvante de aluminio pueda afectar a su capacidad para unirse al antígeno VLP, con adyuvantes fuertemente cargados que no pueden unirse al antígeno tan fuertemente como los adyuvantes cargados neutros. Por esta razón, se prefiere que el adyuvante de aluminio de las composiciones farmacéuticas de la presente invención tenga una carga superficial de punto cero a pH neutro. Un experto en la materia podrá variar el tampón, la concentración de sal y/o el porcentaje de fosfato libre para permitir una carga superficial de punto cero a pH neutro.
Un experto en la materia podrá determinar una dosis óptima de adyuvante de aluminio que sea segura y efectiva para aumentar la respuesta inmunitaria a los tipos de HPV diana. Para una discusión sobre el perfil de seguridad del aluminio, así como las cantidades de aluminio incluidas en las vacunas autorizadas por la FDA, véase Baylor et al., Vaccine 20: S18-S23 (2002) Generalmente, una dosis efectiva y segura de adyuvante de aluminio varía de 150 a 600 jg/dosis (concentración de 300 a 1200 jg/ml). En realizaciones específicas de las formulaciones y composiciones de la presente invención, hay entre 200 y 300 jg de adyuvante de aluminio por dosis de vacuna. En realizaciones alternativas de las formulaciones y composiciones de la presente invención, hay entre 300 y 500 jg de adyuvante de aluminio por dosis de vacuna.
Métodos de fabricación
En otro aspecto de la invención, se proporciona un método para preparar una formulación de vacuna contra e1HPV liofilizada que es resistente al estrés inducido por el proceso de liofilización, en el que la formulación de vacuna contra el HPV es capaz de retener las características físicas y/o inmunológicas de la formulación líquida. Por lo tanto, la invención proporciona un método para preparar una formulación estable de vacuna contra e1HPV liofilizada que comprende: (a) formular una formulación de vacuna líquida contra el HPV que comprende (i) VLP de1HPV de al menos un tipo de HPV adsorbido en un adyuvante de sal de aluminio, en la que las VLP de al menos un tipo de HPV está presente en una concentración de 10-200 pg/ml y en la que las VLP se seleccionan del grupo que consiste en: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV26, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV53, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59, HPV66, HPV68, HPV73 y HPV82; (ii) de 1 % a 10 % p/v de manitol; y (iii) de 0,5 % a 10 % de sacarosa; (b) congelar la formulación líquida para producir una formulación congelada y (c) secar la formulación congelada para proporcionar una formulación de vacuna contra el HPV liofilizada. En realizaciones preferidas de este aspecto de la invención, el manitol está presente en una concentración que varía del 4 % al 7 % p/v y la sacarosa está presente en una concentración del 1 % al 5 % p/v. Como alternativa, cualquiera de las formulaciones de vacuna contra el HPV descritas en la presente memoria puede usarse en el método descrito anteriormente.
En una realización adicional de este aspecto de la invención, la formulación líquida de la vacuna contra e1HPV comprende además 10 mM de histidina, de 0,30M a 0,35M de NaCl y/o PS80 al 0,01 %. En realizaciones alternativas, el método comprende (a) formular una formulación de vacuna contra e1HPV líquida como se define en cualquier realización del primer aspecto de la invención, (b) congelar la formulación líquida para producir una formulación de vacuna contra el h Pv congelada y (c) secar la formulación para proporcionar una formulación de vacuna liofilizada o secada por congelación.
El proceso de liofilización (también conocido como “secado por congelación”) comprende dos etapas, concretamente (1) congelación y (2) secado. La etapa de congelación de los métodos divulgados en la presente memoria, que es la primera etapa en el proceso de liofilización, se lleva a cabo a temperaturas inferiores a Tg' para un producto amorfo o inferiores a Teu (temperatura eutéctica) para un producto en estado cristalino durante un período de tiempo suficiente para permitir la transformación de la formulación líquida en un estado sólido. El período de tiempo requerido para transformar la formulación líquida en un estado sólido depende en parte del volumen de llenado total en el recipiente utilizado para liofilizar la formulación. Cuando se usan volúmenes de llenado más grandes, el tiempo requerido para transformar la formulación líquida en un estado sólido será mayor que cuando se usan volúmenes de llenado relativamente más pequeños para una formulación comparable.
Al final de la etapa de congelación, el agua presente en la formulación líquida se convierte en hielo y normalmente menos del 20 % de agua (p/p) está presente como líquido. Además, la velocidad de enfriamiento determina el tamaño de los cristales de hielo y la estructura de la torta. La congelación lenta, por ejemplo, generalmente da como resultado la formación de una torta porosa con cristales de hielo más grandes. Un experto en la materia puede determinar fácilmente la temperatura de congelación apropiada para llevar a cabo los métodos de la invención.
La segunda etapa del proceso de liofilización consiste en el secado. La etapa de secado se puede optimizar en función de la formulación particular, la temperatura del estante, el cierre del recipiente y la presión de la cámara. Puede ser ventajoso incorporar etapas adicionales en el proceso de liofilización, por ejemplo, se puede agregar una etapa de congelación previa, una etapa de secado adicional o una etapa de recocido al ciclo de liofilización para preparar las formulaciones de vacuna contra el HPV liofilizadas de la invención. Un experto en la materia puede optimizar el ciclo de liofilización de acuerdo con procedimientos conocidos para una formulación particular de la invención (véase, p. ej. WO2011/017070).
En otra realización de este aspecto de la invención, el proceso comprende una etapa adicional en la que la formulación de la vacuna se reconstituye con un diluyente para proporcionar una formulación líquida reconstituida. Los diluyentes útiles para reconstituir las formulaciones liofilizadas de la invención incluyen cualquier líquido que sea un vehículo seguro, estable y farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones de las invenciones, las formulaciones se reconstituyen con SWFI y/o BWFI. SWFI que contiene un estabilizador, un solubilizante, un modificador de tonicidad, como NaCl, MgCh o CaCl2 etc., y sus mezclas también son útiles en los métodos descritos en la presente memoria.
En otro aspecto de la invención, se proporciona un método para preparar una formulación de vacuna contra e1HPV congelada que es resistente al estrés inducido por la congelación y descongelación, en el que la formulación de vacuna contra el HPV es capaz de retener las características físicas y/o inmunológicas de la formulación líquida. Por lo tanto, la invención proporciona un método para preparar una formulación de vacuna contra e1HPV congelada estable que comprende: (a) formular una formulación de vacuna contra el HPV líquida que comprende (i) VLP de HPV de al menos un tipo de HPV adsorbidas en un adyuvante de sal de aluminio, en la que las v Lp de al menos un tipo de HPV está presente en una concentración de 10-200 pg/ml y en la que las VLP se seleccionan del grupo que consiste en: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV26, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV53, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59, HPV66, HPV68, HPV73 y HPV82; (ii) de 1 % a 10 % p/v de manitol; y (iii) de 0,5 % a 10 % de sacarosa; y (b) congelar la formulación líquida para producir una formulación congelada. En realizaciones preferidas de este aspecto de la invención, el manitol está presente en una concentración que varía del 4 % al 7 % p/v y la sacarosa está presente en una concentración del 1 % al 5 % p/v; en realizaciones preferidas alternativas, el manitol está presente en un intervalo de 5 % a 6 % p/v y la sacarosa está presente en una concentración de 2 % a 4 % p/v. Como alternativa, cualquiera de las formulaciones de vacuna contra e1HPV descritas en la presente memoria puede usarse en el método descrito anteriormente.
En una realización adicional de este aspecto de la invención, la formulación de vacuna líquida contra e1HPV comprende además 10 mM de histidina, de 50 mM a 350 mM de NaCl y/o PS80 al 0,01 %. En realizaciones alternativas, el método comprende (a) formular una formulación de vacuna contra e1HPV líquida como se define en cualquier realización del primer aspecto de la invención, y (b) congelar la formulación líquida para producir una formulación de vacuna contra el HPV congelada.
Métodos de uso
La presente invención también proporciona el uso de prevenir o reducir la probabilidad de infección de un paciente humano por un HPV que comprende la administración de una composición de vacuna como se describe en la presente memoria.
En realizaciones específicas del uso proporcionado en la presente memoria, la composición farmacéutica que se administra al paciente comprende v Lp de los tipos 6, 11, 16 y 18 de HPV. En realizaciones adicionales, las composiciones comprenden además VLP de los tipos 31, 33, 45, 52 y 58 de HPV. En otras realizaciones, las composiciones comprenden VLP de HPV de tipo 16 de HPV y además comprenden VLP de al menos un tipo de HPV adicional seleccionado del grupo que consiste en: HPV6, HPV11, HPV18, HPV26, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV53, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59, HPV66, HPV68, HPV73 y HPV82.
Las composiciones de vacuna de la presente invención se pueden usar solas a las dosis apropiadas que permiten la inhibición óptima de la infección por HPV con una toxicidad potencial mínima. Además, puede ser deseable la administración conjunta o la administración secuencial de otros agentes.
Las formulaciones y composiciones de la presente invención pueden administrarse a un paciente mediante inyección intramuscular, inyección subcutánea, introducción intradérmica o impresión a través de la piel. También se contemplan otros modos de administración como la administración intraperitoneal, intravenosa o por inhalación. En realizaciones preferidas de la invención, las vacunas y las composiciones farmacéuticas se administran por administración intramuscular.
En algunas realizaciones de esta invención, las composiciones y formulaciones farmacéuticas de HPV divulgadas en la presente memoria se administran a un paciente en diversas combinaciones de estimulación/refuerzo para inducir una respuesta inmunitaria intensificada y duradera. En este caso, se administran dos composiciones farmacéuticas en un régimen de “estimulación y refuerzo”. Por ejemplo, la primera composición se administra una o más veces, luego, después de una cantidad de tiempo predeterminada, por ejemplo, 2 semanas, 1 mes, 2 meses, seis meses u otro intervalo apropiado, se administra una segunda composición una o más veces.
Preferiblemente, las dos o más composiciones farmacéuticas de HPV usadas en un régimen clínico comprenden VLP del mismo tipo de HPV o combinación de tipos de HPV. Sin embargo, también puede ser deseable seguir un régimen clínico en el que se administran dos composiciones farmacéuticas de HPV diferentes a un paciente con un intervalo de tiempo apropiado que separa las dos administraciones de vacuna. Por ejemplo, una composición de vacuna que comprende VLP de HPV 16 y 18 puede administrarse en un punto temporal, seguida de una composición de vacuna contra el HPV que comprende VLP del HPV 31, 33, 45, 52 y 58 en un segundo punto temporal, después de un tiempo transcurrido predeterminado. En tales casos, cada una de las dos composiciones diferentes de vacuna contra el HPV puede administrarse al paciente una vez, o más de una vez, separadas por un período de tiempo apropiado.
Ejemplo 1
Materiales y métodos.
(a) Preparación de la muestra. La vacuna cuadrivalente del papilomavirus humano (tipos 6, 11, 16, 18), recombinante, conocida como GARDASIL® (Merck and Co. Inc., Whitehouse Station, NJ), se utilizó como una vacuna de ejemplo en los estudios descritos en la presente memoria. GARDASIL® es una vacuna cuadrivalente recombinante no infecciosa preparada a partir de partículas similares a virus (VLP) altamente purificadas de la proteína principal de la cápside (L1) de los tipos de HPV 6, 11, 16 y 18. Las muestras de GARDASIL® utilizadas en este estudio (referida en la presente memoria como “vacuna contra el HPV 4-valente” o “vacuna cuadrivalente contra el HPV”) consistió en lotes de envase final fabricados como se describió anteriormente (Lowe, R. S. et al., J. Infect. Dis. 176: 1141-45 (1997); Cook, J. C. et al., Protein Expres Purif. 17: 477-84 (1999) En resumen, las proteínas L1 del HPV específicas de tipo se produjeron por fermentaciones separadas en Sacharomyces cerevisiae recombinante y se autoensamblaron en VLP. Las VLP se purificaron mediante una serie de métodos químicos y físicos. Cada una de las VLP acuosas purificadas se adsorbieron en adyuvante de sulfato de hidroxifosfato de aluminio de Merck (MAA) preformado individualmente. Los componentes de la vacuna monovalente se formularon en 10 mM de histidina, Polisorbato 80 al 0,01 % y 0,33 M de cloruro de sodio. Las cuatro vacunas monovalentes individuales (adsorbentes adyuvantes) se combinaron en concentraciones de proteínas de 40, 80, 80 y 40 pg/ml para los tipos 6, 11, 16 y 18 de HPV, respectivamente, para formar la forma de dosificación cuadrivalente de GARDASIL®.
Para los estudios de estabilidad a largo plazo, las muestras de HPV se prepararon como se describió anteriormente. Además, se prepararon muestras que comprendían 1X MAA sin antígeno. Para preparar muestras de 2X MAA, la solución salina tamponada (6,1 mM de fosfato de sodio y 120 mM de cloruro de sodio) y la solución de sulfato de aluminio y potasio al 5,44 % se combinaron en un tanque. Se añadió hidróxido de sodio 1,0 N al tanque para precipitar el adyuvante y llevar el pH a un objetivo de 7,7-7,8 a 2-8 °C. La solución con pH ajustado se concentró 3 veces por recirculación a través de filtros de corte de peso molecular (MWCO) nominal de 200.000 y luego se diafiltró contra un objetivo de 2,1 volúmenes de solución salina fisiológica (cloruro de sodio al 0.9 %) para reducir el contenido de iones de potasio y sulfato. Después de la diafiltración, el adyuvante se diluyó a una concentración objetivo de aluminio de 900 pg/ml (2X MAA) con solución salina fisiológica y solución de borato de sodio al 1,4 %. El 2X MAA se diluyó adicionalmente 1:1 con solución salina fisiológica (cloruro de sodio al 0,9 %) para preparar el 1X MAA utilizado en este estudio.
(b) Composición de los tampones. Las formulaciones de vacuna contra el HPV que contienen los tipos de HPV cuadrivalente unidos a MAA se intercambiaron con 18 tampones utilizando un proceso de sedimentación/decantación. Todos los tampones tenían la formulación base 10 mM de histidina, Polisorbato 80 al 0,01 %, pH 6,2 con diferentes composiciones de excipientes, como se muestra en la Figura 1.
A continuación, se muestra una breve descripción de los tampones utilizados en este estudio, junto con la identificación de los números de tampón (“Código de tampón”) (Tabla 1):
Tabla 1: Com osiciones de tam ón
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Para los estudios de estabilidad a largo plazo, las formulaciones de vacuna contra e1HPV que contienen los tipos de HPV cuadrivalente unidos al adyuvante MAA e 1X MAA solo se intercambiaron con 5 de los tampones anteriores. (Tampón B a Tampón D con 0 o 320 mM de NaCl (es decir, tampones B-14, B-3, B-15, B-4 y B-16). El tampón B-2 no se probó a largo plazo estudios de estabilidad).
(c) Estudio de congelación-descongelación. Las formulaciones de vacuna contra e1HPV que comprenden los tampones B-1 a B-18 (véase la Tabla 1) se sometieron a congelación ultrarrápida (FF) utilizando una explosión de nitrógeno líquido a -115 °C durante 15 minutos o una congelación normal a -70 °C durante 1 hora. La congelación ultrarrápida se completó con ciclos de 1X (1X FF) y la congelación normal se completó con ciclos de 1X y 3X. Las formulaciones de prueba se llenaron en viales de vidrio de 3 ml con un volumen de llenado de 0,6 ml. Las muestras de vacuna congeladas se descongelaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de los ciclos de congelación y descongelación, se analizó la potencia de las muestras y se realizaron otros ensayos de caracterización.
Para los estudios de estabilidad a largo plazo, las formulaciones de vacuna contra e1HPV y las formulaciones con 1X MAA descritas anteriormente se sometieron a congelación normal a -70 °C y las formulaciones congeladas se almacenaron a -70 °C durante aproximadamente 24 horas. Las formulaciones de prueba se llenaron en viales de vidrio de 3 ml con un volumen de llenado de 0,6 ml. Las muestras de vacuna congeladas se descongelaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Después del ciclo de congelación y descongelación, los viales se mantuvieron a 2-8 °C durante 1 mes antes de someterlos a estudios de estabilidad a largo plazo. Se analizó la potencia de las muestras y se realizaron otros ensayos de caracterización en varios puntos temporales tanto para formulaciones de HPV como para formulaciones de 1X MAA.
(d) Estudio de liofilización. Las formulaciones de HPV que comprenden los tampones B-1 a B-18 (véase la Tabla 1) se sometieron a liofilización con congelación realizada mediante congelación ultrarrápida (FF) usando una explosión de nitrógeno líquido a -115 °C durante 15 minutos o usando un estante de liofilización preenfriado. Las muestras de vacuna se mantuvieron en viales de vidrio de 3 ml con un volumen de llenado de 0,6 ml. Las muestras de vacuna congeladas se liofilizaron usando parámetros del proceso de liofilización estándar. Brevemente, las muestras se cargaron en un estante preenfriado a -50 °C en el liofilizador y el estante se mantuvo a -50 °C durante 1 hora. Luego se realizó una etapa de recocido a -20 °C (en rampa a una velocidad de 0,5 °C/min) durante 2 horas. Luego, el estante se enfrió nuevamente a -50 °C (en rampa a una velocidad de 0,5 °C/min) y se mantuvo durante 2,5 horas. El secado primario se realizó calentando el estante a -20 °C a 1 °C por minuto a una presión de 100 mTorr durante 48 horas. El secado secundario se realizó a una temperatura de 10 °C durante 4 horas a 0,5 °C/min. Después de la liofilización, los viales se rellenaron con gas nitrógeno, se taponaron a vacío parcial y se descargaron. Las muestras de vacuna liofilizadas se almacenaron congeladas para su posterior análisis.
Para estudios de estabilidad a largo plazo, las formulaciones de vacuna contra e1HPV y las formulaciones 1X MAA se sometieron a liofilización con congelación realizada utilizando un estante de liofilización preenfriado. Las muestras de vacuna se llenaron como se describió anteriormente. Las muestras de vacunas congeladas se liofilizaron usando parámetros del proceso de liofilización estándar como se describió anteriormente. Los viales de vacuna liofilizados se almacenaron congelados hasta que se sometieron a estudios de estabilidad a largo plazo.
(e) Estudio de estabilidad acelerada. Los estudios de estabilidad se llevaron a cabo en condiciones de temperatura acelerada para todas las formulaciones de vacuna contra el HPV 4-valente que comprenden tampones B-1 a B-18 (véase la Tabla 1). Las muestras de prueba del HPV 4-valente liofilizadas en diversos tampones de formulación junto con las formulaciones de HPV 4-valente líquidas no liofilizadas respectivas se colocaron en condiciones de temperatura acelerada a 45 °C durante 1 mes. Se eligió esta temperatura porque la tasa de inactivación de las VLP del HPV es muy sensible a la temperatura. Las muestras se almacenaron en cámaras de estabilidad certificadas. Al final del estudio de estabilidad, las muestras se analizaron por su apariencia física, y luego se evaluó su potencia y otros estudios de caracterización después de la reconstitución.
(f) Ensayos de antigenicidad in vitro. Para liberar el HPV del adyuvante de aluminio, se desarrolló un método de disolución de aluminio que incluía la dilución de las formulaciones de HPV-aluminio en una solución con alto contenido de sal que contiene citrato y Polisorbato 80. Siguiendo el método de disolución de aluminio, las muestras de VLP de HPV se sometieron directamente a un ensayo de antigenicidad in vitro utilizando un instrumento de resonancia de plasmón superficial.
La antigenicidad in vitro de las VLP de HPV se determinó midiendo la afinidad de las VLP por los anticuerpos de neutralización específicos del HPV utilizando una técnica de resonancia de plasmón superficial en un instrumento Biacore® 2000 o 3000 (GE Healthcare Biosciences AB, Piscataway, NJ). El anticuerpo anti-HPV se inmovilizó uniéndose al Fcy del anticuerpo de ratón de rata acoplado químicamente a la superficie de un chip sensor Biacore CM5. La interacción del antígeno VLP del HPV en la fase de flujo con el anticuerpo en la superficie del chip sensor se registró en función del cambio en el índice de reflexión del chip sensor inducido por la unión del anticuerpo al antígeno. Las muestras de VLP de HPV de los estudios de formulación con adyuvante de aluminio se compararon directamente con una solución madre congelada recién descongelada de la misma VLP de HPV (patrón de referencia) para determinar la antigenicidad in vitro.
(g) Dispersión dinámica de la luz (DLS). Las mediciones del tamaño de partícula se realizaron a temperatura ambiente utilizando un instrumento de dispersión de luz dinámica DynaPro® (Wyatt Technology Corp., Santa Bárbara, CA). El instrumento se calibró utilizando patrones de tamaño de látex polimérico. Las muestras de VLP de HPV obtenidas usando el método de disolución de aluminio descrito anteriormente se sometieron directamente a mediciones de DLS. El análisis acumulativo de la función de autocorrelación para variaciones de intensidad dispersas debido al movimiento browniano de las VLP en solución arrojó coeficientes de difusión promedio (Koppel, D. E. J. Chem. Phys. 37: 4814-20 (1972)). El valor del diámetro hidrodinámico promedio Z se obtuvo basándose en los coeficientes de difusión promedio usando la ecuación de Stokes-Einstein. El tamaño hidrodinámico aparente de las partículas de antígeno se registró como diámetro hidrodinámico promedio Z (Dh) Todos los datos presentados aquí son los promedios de cinco mediciones de la misma muestra.
(h) Dispersión de la luz estática (SLS). Las mediciones del tamaño de partícula se realizaron a temperatura ambiente utilizando un instrumento de dispersión de la luz estática Malvern® Mastersizer 2000 (Malvern Instruments; Worcestershire, Reino Unido). La técnica de difracción láser se usa para medir el tamaño de las partículas. El instrumento se calibró utilizando patrones de tamaño de látex polimérico. Las muestras 1X MAA se diluyeron en agua y luego se sometieron a mediciones de SLS. El tamaño de partícula (0,5) en micrómetros (pm), recuperado a través de la distribución de intensidad media como factor de dirección de dispersión, se trazó en función de varias condiciones de prueba (F/T FF 1X y LIO junto con el control respectivo).
(i) Mediciones de la osmolalidad. Para este estudio se utilizó un microosmómetro Advanced® Modelo 3300 (Advanced Instruments Inc., Norwood, MA). Este instrumento utiliza 20 pl de muestra para medir la osmolalidad de la muestra mediante la depresión del punto de congelación. El sobreenfriamiento de la muestra se inició mediante la inserción de un soporte desechable especialmente diseñado que contiene la muestra en la sonda del termistor del instrumento, que estaba en una posición fija. Después de un pulso inducido por solenoide y la posterior congelación de la muestra, un microprocesador relacionó el calor de fusión liberado con el punto de congelación de la muestra y la osmolalidad se mostró en una pantalla digital. La calibración del instrumento se realizó ejecutando 2-5 muestras en cada uno de los dos niveles de calibración (50 y 850 mOsm/kg). La calibración interna fue realizada automáticamente por el instrumento después de que se estableció una repetibilidad aceptable. Después de la calibración del instrumento, se midió el estándar de referencia Clinitrol™ 290 (290 mOsm/kg), suministrado por Advanced Instruments. Las muestras de prueba de formulaciones de HPV se midieron siguiendo el patrón de referencia.
(j) Apariencia física de la torta seca. Promover la elegancia farmacéutica deseada durante los esfuerzos de desarrollo del producto generalmente incluye establecer el intervalo de estándares aceptables de apariencia del producto. La evaluación de los atributos de la torta seca implica una descripción de los atributos físicos, como el color, la densidad, la uniformidad y la evidencia de contracción, colapso o fusión. La apariencia de las formulaciones de la vacuna contra el HPV liofilizada se evaluó subjetivamente en función de los atributos de calidad que se especifican a continuación (Tabla 2).
Tabla 2.
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(k) Tiempo de reconstitución. La tasa de reconstitución es una característica del producto que depende de la formulación. El tiempo de reconstitución de las formulaciones de vacuna seca contra e1HPV se determinó controlando el tiempo para la disolución completa de la torta liofilizada tras la adición de agua estéril para inyección, como se indica por la presencia de una suspensión homogénea. Se añadieron aproximadamente 0,5 a 0,6 ml de WFI estéril a cada una de las formulaciones de vacuna contra el HPV liofilizadas basadas en los niveles de excipientes de la formulación. Para mantener las concentraciones deseadas de las VLP de HPV, el volumen final de las formulaciones después de la reconstitución se mantuvo cerca de 0,6 ml.
(l) Prueba de agitación. Se realizó una prueba de agitación en las vacunas adsorbidas con aluminio para determinar si las formulaciones de la vacuna se congelaron durante las desviaciones de la cadena de frío. La congelación de las formulaciones de vacuna altera irreversiblemente la estructura del aluminio y reduce notablemente la inmunogenicidad de la vacuna. La congelación de una vacuna a base de aluminio conduce a la ruptura de la estructura reticular, lo que resulta en una aglomeración del contenido de aluminio y una sedimentación más rápida. Una velocidad de sedimentación más rápida es la base de una prueba de agitación positiva, que intenta comparar la velocidad de sedimentación en los viales de prueba y control. La potencia de la vacuna se confirma si el vial de prueba, que se sabe que está previamente congelado o liofilizado, muestra una velocidad de sedimentación similar a la de un vial de control que no se había congelado ni liofilizado previamente. Si se observa una velocidad de sedimentación más rápida para el vial de prueba en relación con el vial de control, la vacuna se considera insegura para su uso debido a la presencia de aluminio aglomerado.
Para medir la velocidad de sedimentación, los viales de prueba y los viales de control se mezclaron para obtener una suspensión homogénea de las formulaciones de vacuna. Después de mezclar, los viales se reservaron y se midió el tiempo de sedimentación. Si la vacuna no se había mezclado de manera uniforme o si todavía los sedimentos/floculación se asentaban en el fondo a una velocidad más rápida, se podría concluir que el vial de prueba se congeló/liofilizó, lo que podría haber dañado la estructura del aluminio para formar grandes partículas de aluminio aglomeradas. Todas las formulaciones de vacuna contra el HPV que se congelaron o descongelaron o liofilizaron y reconstituyeron se analizaron mediante una prueba de agitación para evaluar su calidad.
Ejemplo 2
Antigenicidad in vitro
La antigenicidad in vitro de las formulaciones de vacuna contra el HPV 4- valente que comprenden VLP de HPV se evaluó usando un ensayo de unión de anticuerpos de neutralización (Resonancia de plasmón superficial, Biacore). El análisis de la bioactividad del antígeno se determinó utilizando los instrumentos Biacore 2000 y Biacore 3000 (GE Healthcare Biosciences AB, Piscataway, NJ). El ensayo con Biacore se realizó para las formulaciones de prueba de vacuna contra el HPV 4-valente que se congelaron o descongelaron o liofilizaron. Las formulaciones de HPV 4-valente liofilizadas se reconstituyeron con agua estéril para inyección como se describe en el EJEMPLO 1 antes de la disolución del aluminio. Todas las formulaciones de prueba comprendían VLP de HPV tipo 6, 11, 16 y 18 suspendidas en tampones B-1 a B-18 diluidos con tampón de disolución.
Se analizó la antigenicidad in vitro de los 4 tipos de antígenos VLP de HPV en cada formulación de vacuna contra el HPV 4-valente mediante análisis Biacore. Las condiciones de Biacore utilizadas fueron las descritas en Mach et al. (J. Pharm. Sci. 95: 2195-2206 (2006)), con modificaciones. Todas las muestras se trataron con el método de disolución de aluminio descrito en el EJEMPLO 1 para liberar los antígenos VLP de HPV del adyuvante de aluminio antes del análisis en el ensayo Biacore. La muestra de VLP de HPV de los estudios de aluminio adyuvante se compara directamente con una solución madre congelada de la misma VLP de HPV para determinar la antigenicidad in vitro. La solución madre congelada recién descongelada de la VLP de HPV sirvió como referencia del ensayo Biacore. Las muestras de HPV disuelto en aluminio se usaron directamente o se diluyeron más para igualar las concentraciones de las referencias de solución madre congelada para cada tipo de HPV antes de la medición del ensayo Biacore. Los datos del ensayo Biacore de las formulaciones de prueba de HPV, tanto las formulaciones congeladas y descongeladas como las liofilizadas de todos los tampones (B-1 a B-18) se normalizaron con formulaciones de HPV de control en los mismos tampones (B-1 a B-18), que no fueron congeladas-descongeladas ni liofilizadas. Los valores de Biacore dados fueron el promedio de dos mediciones por formulación de muestra.
Los datos normalizados de Biacore para cada tipo de HPV en cada una de las formulaciones de prueba de HPV después de 1X congelación-descongelación, 3X congelación-descongelación y 1X congelación ultrarrápida se muestran en la Figura 2. Todas las formulaciones de la vacuna contra el HPV 4-valente que se sometieron al proceso de congelación-descongelación fueron completamente potentes y poseían respuestas Biacore casi idénticas a los patrones de referencia para los cuatro tipos de HPV probados, excepto el tampón de formulación B-2 (Tampón B 0 mM de NaCl), que no tenía sal ni excipientes. El impacto sobre la antigenicidad para todos los tipos de HPV fue más pronunciado para el Tampón B en ausencia de sal y excipientes (B-2) cuando se realizó 3X congelacióndescongelación. No hubo diferencias significativas en la antigenicidad para todos los tipos de HPV entre las muestras 1X congelación normal-descongelación y las muestras 1X congelación ultrarrápida-descongelación. A partir de los datos, se puede concluir que la presencia de sal, excipientes o ambos son necesarios para retener la antigenicidad de los tipos de HPV para resistir el estrés asociado con la congelación-descongelación.
Los datos de Biacore normalizados para cada tipo de HPV en cada una de las diversas formulaciones de vacuna contra el HPV después de la liofilización usando un estante preenfriado o congelación ultrarrápida durante el proceso de liofilización (véase el Ejemplo 1) se proporcionan en la Figura 3. Los resultados de Biacore indicaron que la antigenicidad para todos los tipos de HPV disminuyó para el Tampón B (B-2, B-8 y B-14) que no tenía ningún excipiente, mientras que la antigenicidad para el resto de los tampones de formulación fue idéntica a los patrones de referencia. No hubo diferencias significativas en la antigenicidad para todos los tipos de HPV entre las muestras de congelación preenfriadas y las muestras de congelación ultrarrápida durante la liofilización. La formulación de la vacuna contra el HPV en el Tampón B-2 y sus correspondientes tampones de sal (B-8 y B-14) no pudieron soportar el proceso de liofilización. Se observó una caída en la antigenicidad para todos los tipos de HPV en la formulación de Tampón B (B-2, B-8 y B-14). La caída de antigenicidad fue significativamente mayor en ausencia de sal (B-2) y mejoró con el aumento de la concentración de sal. En los tampones que contenían 5 % de manitol y sal (Tampón A 150 mM de NaCl (B-7) y Tampón A 320 mM de NaCl (B-13)), se observó una caída en la antigenicidad del 10-15 % para todos los tipos de HPV. Como se ve en la Figura 3, todos los tampones que no tenían una combinación de excipientes en su formulación no pudieron soportar el estrés asociado con el proceso de liofilización. Los tampones de formulación C y D que comprendían una combinación de excipientes, manitol y sacarosa, pudieron mantener la integridad de las VLP de HPV y, por lo tanto, conservaron la antigenicidad de la vacuna incluso después del proceso de liofilización. Esto sugiere un papel de estos excipientes en combinación como estabilizador de la vacuna en comparación con las formulaciones de Tampón E (solo sacarosa) o Tampón A (solo manitol).
Las formulaciones de vacuna liofilizadas contra el HPV 4-valente (B-1 a B-18) utilizadas en los estudios de liofilización descritos anteriormente se almacenaron en forma sólida liofilizada a 45 °C durante 1 mes para evaluar la estabilidad durante el almacenamiento de las vacunas liofilizadas. Las formulaciones de vacuna líquida contra el HPV 4-valente no liofilizadas (B-1 a B-18) se usaron como los controles respectivos en la evaluación de la estabilidad durante el almacenamiento de las formulaciones de vacuna contra e1HPV liofilizadas. Después del almacenamiento durante 1 mes a 45 °C, se evaluó la apariencia física de las formulaciones liofilizadas y luego se reconstituyeron como se describe en el Ejemplo 1 con agua estéril para inyección. Las muestras de prueba se evaluaron para determinar la antigenicidad usando Biacore como se describe en el Ejemplo 1. Los datos de Biacore normalizados para cada tipo de HPV en cada una de las diversas formulaciones de vacuna contra e1HPV después de 1 mes de almacenamiento a 45 °C se proporcionan en la Figura 4. La antigenicidad para todos los tipos de HPV en las formulaciones líquidas de HPV 4-valente no liofilizadas en varios tampones fue de alrededor del 20-40 % después de 1 mes de almacenamiento a 45 °C, lo que indica que los antígenos VLP de HPV no eran estables en las formulaciones líquidas en las condiciones de almacenamiento dadas. Por otro lado, las formulaciones de HPV liofilizadas en el Tampón C (B-3, B-9, B-15) en ambos tipos de procesos liofilizados (Lio PC y Lio FF) que se almacenaron a 45 °C durante un mes, exhibieron valores de antigenicidad significativamente más altos que sus contrapartes líquidas no liofilizadas. Las formulaciones de HPV liofilizadas que contenían sacarosa sola en su formulación, Tampón E (B-5, B-11 y B-17) se colorearon después de 1 mes de almacenamiento a 45 °C debido a la inestabilidad de la sacarosa (degradación). Se pensó que las muestras degradadas de sacarosa inhibían la unión del anticuerpo contra el HPV al chip inmovilizado, lo que causaba fallos en el instrumento y, por lo tanto, la falta de algunos de los puntos de datos en la Figura 4. Los resultados indican que el Tampón C (B-3) y sus correspondientes tampones que contienen sal (B-9 y B-15) pudieron retener la antigenicidad de las VLP de HPV al 80-90 % para la mayoría de los tipos de HPV incluso después de 1 mes de almacenamiento a 45 °C. Se observó una caída en la antigenicidad para el Tampón D sin sal (B-4), mientras que sus correspondientes tampones que contienen sal (B-10 y B-16) retuvieron la antigenicidad para la mayoría de los tipos de HPV incluso después de 1 mes de almacenamiento a 45 °C. Por lo tanto, basándose en el perfil de estabilidad, se puede concluir que los tampones que contenían combinaciones de manitol y sacarosa proporcionaron un producto de vacuna estable con la antigenicidad deseada.
Ejemplo 3
Mediciones de la osmolalidad.
Las mediciones de la osmolalidad se realizaron en todas las formulaciones de HPV 4-valente de control en varios tampones (B-1 a B-18) antes del proceso de congelación, descongelación o liofilización. Los resultados indican que hay un aumento en los valores de osmolalidad con el aumento en la concentración de sal para todos los tampones (Figura 5). La contribución a la osmolalidad proviene principalmente de los excipientes (manitol, sacarosa y glicina) y la sal (cloruro de sodio) y no de la histidina, los antígenos de HPV o MAA (como se ve en el caso del tampón B-2, que tiene la menor osmolalidad). La osmolalidad de la vacuna contra el HPV 4-valente que estaba en el tampón de formulación B-14 (similar a la formulación actual de Gardasil®) fue de alrededor de 585 mOsm (Figura 5). Los tampones B-13 a B-18 (véase la Tabla 1), con la excepción del tampón B-14, tenían excipientes con alta concentración de sal que contribuyeron a una mayor tonicidad para esas formulaciones. Por el contrario, los tampones B-1 a B-12, con la excepción de los tampones B-9 y B-10, tenían excipientes con baja concentración de sal que contribuían a valores bajos de tonicidad. La combinación de sal y excipientes desempeña un papel importante en la definición de la tonicidad de la formulación de la vacuna contra e1HPV 4-valente dada.
Ejemplo 4
Mediciones del tamaño de partícula.
Las mediciones del tamaño de partícula se realizaron en todas las formulaciones de vacuna contra e1HPV 4-valente que incluían las formulaciones de congelación-descongelación (después de 1X, 3X ciclos de congelación normaldescongelación y 1X ciclo de congelación ultrarrápida-descongelación, como se describe en el Ejemplo 1 (c)) y formulaciones liofilizadas (después de la liofilización con congelación ultrarrápida o liofilización en un estante de liofilización preenfriado, como se describe en el Ejemplo 1 (d)) de todos los tampones (Tampón A a Tampón F), así como las formulaciones de la vacuna contra el HPV 4-valente de control en los mismos tampones (Tampón A a Tampón F) que no se congelaron, descongelaron ni liofilizaron. Todas las muestras se trataron con el método de disolución de aluminio descrito en el Ejemplo 1 (f) para liberar los antígenos VLP de HPV del adyuvante de aluminio antes de las mediciones del tamaño de partícula. La distribución del tamaño de partícula es la medida promedio de la distribución del tamaño de todas los VLP de HPV presentes en la solución después de la disolución del aluminio. En la Figura 6 se muestran los valores promedio z que corresponden a la distribución del tamaño de partícula para todas las formulaciones de HPV 4-valente en diversas composiciones de tampón.
Como se ve en la Figura 6, el tamaño de partícula fue ligeramente mayor para las formulaciones de HPV 4-valente de control y congelación-descongelación (1x , 3X y 1X FF) en todos los tampones que no contenían sal (Tampón A a Tampón F con 0 mM de cloruro de sodio) que aquellos que contienen sal (Tampón A a Tampón F con 150 o 320 mM de cloruro de sodio), con la excepción del Tampón D con 150 mM de cloruro de sodio (B-10, véase Figura 1), que mostró las mayores mediciones de tamaño de partícula. En presencia de sal, todas las formulaciones de HPV 4-valente, incluidas las formulaciones de HPV 4-valente de control, tenían la distribución del tamaño de partícula dentro del intervalo de 80 a 100 nm que normalmente se espera de las VLP de HPV presentes en el tampón de disolución. Entre las diferentes formulaciones de prueba evaluadas, aquellas con Tampón C y Tampón D, que comprenden una combinación de excipientes (manitol y sacarosa), se vieron menos afectadas por el estrés de las condiciones de congelación y descongelación, en cuanto a la distribución del tamaño de partícula de las VLP en comparación con aquellas formulaciones que no comprendían una combinación de excipientes manitol y sacarosa. En el caso de las formulaciones de vacuna contra el HPV 4-valente liofilizadas, las distribuciones del tamaño de partícula para las VLP de HPV fueron mayores para los tampones que no contenían excipientes o solo manitol como excipiente en su composición de formulación (Tampón A y Tampón B, véase Figura 6) en comparación con las otras formulaciones de la vacuna contra el HPV 4-valente (Tampón C a Tampón F) que se liofilizaron y también cuando se comparaban con sus respectivas formulaciones de vacuna contra el HPV 4-valente control no liofilizadas. El aumento del tamaño de partícula fue significativo para las formulaciones de vacuna contra e1HPV 4-valente liofilizadas en Tampón A y Tampón B en presencia de cloruro de sodio. Las distribuciones del tamaño de partícula para las VLP de h Pv en las formulaciones liofilizadas que comprenden Tampón C, Tampón D y Tampón F estaban dentro del intervalo normal de 80-100 nm, independientemente de la concentración de sal y fueron comparables con las respectivas formulaciones de HPV 4-valete control no liofilizadas. La formulación de HPV 4-valente liofilizada que solo tenía sacarosa como excipiente (Tampón E) tenía una distribución de tamaño de partícula más grande para las VLP de HPV en ausencia de cloruro de sodio (Tampón E con 0 mM de cloruro de sodio) y una distribución del tamaño de partícula normal el intervalo de 80-100 nm para las VLP de HPV en presencia de cloruro de sodio (Tampón E con 150 o 320 mM de cloruro de sodio).
En general, las formulaciones de la vacuna contra el HPV 4-valente en Tampón A, Tampón B, Tampón D y Tampón E que no contenían cloruro de sodio en su composición de tampón no pudieron soportar el estrés del proceso de congelación, descongelación y liofilización, incluso cuando estos tampones tenían tensioactivo en su composición de tampón. Por lo general, se sabe que los tensioactivos evitan la agregación de proteínas que sufren estrés debido al proceso de congelación, descongelación y liofilización (Bhambhani et al., Am. Pharm Rev. 13(1): 31-38 (2010); Chang et al., J. Pharm. Sci. 12: 1325-30 (1996)). Por otro lado, las formulaciones de la vacuna contra e1HPV 4-valente que estaban en Tampón C y Tampón D, que contenían una combinación de excipientes en su composición de tampón con o sin cloruro de sodio, fueron bastante estables a las condiciones de estrés del proceso de congelación, descongelación y liofilización. La presencia de esta combinación de excipientes (manitol y sacarosa) en estos tampones con o sin cloruro de sodio fue capaz de preservar la integridad de las VLP de HPV que están unidas al MAA durante las condiciones del proceso de congelación, descongelación y liofilización.
Ejemplo 5
Características de las formulaciones de HPV 4-valente liofilizadas
(a) Apariencia física de la torta seca
La apariencia física de todas las tortas liofilizadas se fotografió justo después de la liofilización (T=0) y después de 1 mes de almacenamiento a 45 °C. La apariencia de las tortas fue visualizada por dos analistas y, según la morfología, el color y otros atributos de calidad, las tortas se clasificaron como se describe en el Ejemplo 1 (véase la Tabla 2). En general, se obtuvieron tortas sólidas blancas secas para todas las formulaciones de HPV 4-valente. La Figura 7 describe la apariencia física de todas las formulaciones de HPV liofilizadas en varios tampones basados en 3 viales por cada formulación. Se observaron tortas elegantes para tampones B-1, B-3, B-4, B-6 y B-13 y tortas ligeramente colapsadas o agrietadas o encogidas para los tampones B-7, B-8, B-9, B- 10, B-14, B-15 y B-16. Se observaron tortas completamente colapsadas para los tampones B-5, B-11, B-12, B-17 y B-18 después de la liofilización, ya sea usando congelación ultrarrápida o un estante preenfriado. Además, se observó una torta completamente colapsada para la formulación en el tampón B-2 después de la liofilización usando congelación ultrarrápida. Los resultados de este estudio indican que la apariencia física de la torta dependía de los excipientes de la formulación. En las formulaciones que contenían sacarosa sola (B-5, B-11 y B-17), o sacarosa en combinación con glicina y sal (B-12 y B-18), las tortas se colapsaron completamente después de la liofilización, ya sea mediante congelación ultrarrápida o un estante preenfriado. A diferencia de las formulaciones que comprenden sacarosa sola, se observaron tortas elegantes para formulaciones que comprenden manitol solo o sacarosa en combinación con manitol o glicina sin la presencia de sal. La calidad de las tortas para formulaciones que contenían los excipientes combinados de manitol y sacarosa disminuyó con el aumento de la concentración de sal.
La apariencia física de todas las formulaciones de HPV liofilizadas en varios tampones también se registró después del almacenamiento a 45 °C durante 1 mes. Los resultados indican que la morfología o la apariencia física de las tortas liofilizadas no cambiaron después de 1 mes de almacenamiento a 45 °C, a excepción de las formulaciones en los tampones B-5, B-11 y B-17 (Tampón E) que se volvieron de color amarillo a color marrón debido a la inestabilidad de la sacarosa a temperatura elevada. No se observó cambio de color para las formulaciones que comprendían una combinación de sacarosa y manitol o glicina. La Figura 7 describe la apariencia física de todas las formulaciones de HPV liofilizadas en varios tampones que se almacenaron durante 1 mes a 45 °C.
(b) Tiempo de reconstitución.
Las formulaciones de vacuna contra el HPV 4-valente liofilizadas se reconstituyeron con agua estéril para inyección (WFI) basándose en la cantidad de excipientes presentes. El volumen de w Fi que se agregó a cada formulación osciló entre 0,50 y 0,60 ml. El volumen final después de la reconstitución fue de aproximadamente 0,6 ml. El tiempo de reconstitución se controló usando un cronómetro y se registró el tiempo para la disolución completa (en este caso suspensión homogénea) para cada una de las formulaciones de vacuna contra e1HPV después de la liofilización. Los tiempos de reconstitución se muestran en la Figura 8 para muestras que se reconstituyeron justo después de la liofilización y para muestras que se almacenaron a 45 °C durante 1 mes.
La mayoría de las formulaciones tuvieron un tiempo de reconstitución rápido de menos de 15 segundos, mientras que el tampón de formulación que contenía sacarosa sola, Tampón E (B-5, B-11 y B-17) tuvo un tiempo de reconstitución más lento de 90 segundos o más. La misma tendencia se observó para las muestras que se almacenaron a 45 °C durante 1 mes. Las formulaciones en Tampón E (B-5, B-11 y B-17) que contenían sacarosa sola eran de color amarillo a marrón cuando se almacenaban a 45 °C durante un mes. Tras la reconstitución de estas muestras, el color amarillo a marrón de la formulación aún se mantenía debido a la degradación de la sacarosa durante el almacenamiento a alta temperatura durante un mes.
(c) Prueba de agitación.
Después de la reconstitución de todas las formulaciones de vacuna contra e1HPV 4-valente liofilizadas, se realizó una prueba de agitación para verificar la calidad de la formulación de la vacuna. Se midió el tiempo hasta que las partículas de aluminio se asentaran en el fondo del vial para cada una de las formulaciones de prueba. El tiempo de prueba de agitación para todas las formulaciones de HPV 4-valente se muestra en la Figura 9. El tampón de formulación que no contenía excipientes, pero sí sal (Tampón B con 150 o 320 mM de cloruro de sodio) tuvo un tiempo de sedimentación más rápido, lo que indica que las partículas de aluminio se habían aglomerado. En todas las demás formulaciones, el tiempo de sedimentación fue superior a 10-15 minutos, lo que indica que las partículas de aluminio no se habían aglomerado. La presencia de excipientes en la formulación de la vacuna contra e1HPV 4-valente evita la aglomeración de las partículas de aluminio incluso después del estrés de la congelación, descongelación y liofilización.
Estudios de estabilidad a largo plazo (Ejemplos 6-9)
Se realizaron estudios de estabilidad a largo plazo en diversas condiciones de temperatura de almacenamiento para las formulaciones de prueba de HPV y 1X MAA. Las muestras de prueba de HPV 4-valente liofilizadas y descongeladas y las muestras de prueba 1X MAA en diversos tampones de formulación se colocaron en diversas condiciones de temperatura de almacenamiento (-70 °C, 2-8 °C, 25 °C y 37 °C) durante más de 6 meses con puntos temporales de muestreo en T = 0, T = 1 mes, T = 3 meses y T = 6 meses (véase la Tabla 3 para el diseño del estudio). Al final de cada punto temporal de estabilidad, se analizó la potencia y la apariencia física de las muestras y se realizaron otros estudios de caracterización.
Para el punto temporal de 6 meses, las muestras se almacenaron a la hora especificada durante 198 días (> 6 meses) para permitir la determinación de la categoría del indicador de los viales de vacuna (IVV), que se basa en la estabilidad frente al calor. El sistema IVV, implementado por la Organización Mundial de la Salud (OMS), utiliza etiquetas de indicador químico de tiempo y temperatura en los viales de las vacunas como una forma de detectar la exposición acumulativa de una vacuna al calor con el tiempo. Las etiquetas permiten a los trabajadores de la salud determinar si una vacuna ha estado expuesta a temperaturas a las que ya no es potente en función de un cambio de color del IVV y, por lo tanto, debe descartarse. La velocidad a la que la etiqueta cambia de color se modifica en función de su categoría de IVV, de modo que la velocidad de cambio de color de IVV es una aproximación del tiempo y la sensibilidad a la temperatura de una vacuna.
Las categorías de IVV, según lo definido por la OMS, son las siguientes: IVV30 (alta estabilidad): estable durante 193 días a 25 °C, estable durante 30 días a 37 °C; IVV14 (estabilidad media): estable durante 90 días a 25 °C, estable durante 14 días a 37 °C; IVV7 (estabilidad moderada): estable durante 45 días a 25 °C, estable durante 7 días a 37 °C; IVV2 (baja estabilidad):estable durante 2 días a 37 °C.
Tabla 3.
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Ejemplo 6
Antigenicidad in vitro
La antigenicidad in vitro de las formulaciones de prueba de la vacuna contra e1HPV 4-valente se evaluó utilizando un ensayo de unión de anticuerpos de neutralización (Resonancia de plasmón superficial, Biacore). Las muestras de prueba de HPV 4-valente liofilizadas y descongeladas se almacenaron a -70 °C, 2-8 °C, 25 °C y 37 °C, como se describe en el Ejemplo 1, durante un período de más de 6 meses para evaluar la estabilidad durante el almacenamiento de las formulaciones de la vacuna contra el HPV en varios tampones. Los análisis de bioactividad del antígeno se realizaron en cada momento del estudio de estabilidad a largo plazo. La preparación de las muestras para el análisis Biacore fue como se describe en el Ejemplo 2. Todas las formulaciones de prueba comprendieron VLP de HPV tipo 6, 11, 16 y 18 suspendidas en Tampón B a Tampón D diluido con tampón de disolución. Los datos de Biacore de las formulaciones de HPV de prueba se normalizaron con formulaciones de HPV de control en los mismos tampones que no se congelaron ni descongelaron ni liofilizaron. Los valores de Biacore presentados fueron el promedio de dos mediciones por formulación de muestra.
Los datos normalizados de Biacore indican que las formulaciones de la vacuna contra e1HPV en el Tampón C y el Tampón D que se sometieron al proceso de congelación-descongelación seguido de almacenamiento a -70 °C durante más de 6 meses fueron completamente potentes y poseían respuestas Biacore casi idénticas a los patrones de referencia para los cuatro Tipos de HPV probados (véase la Figura 10 para ver datos representativos de los tipos de HPV 16 y 18). La formulación de la vacuna contra el HPV en el Tampón B (Tampón 14) mostró una ligera pérdida de potencia a los 6 meses para los cuatro tipos de HPV. A partir de los datos, se puede concluir que la presencia de sal, excipientes y/o ambos son necesarios para retener la antigenicidad de los tipos de HPV para resistir el estrés asociado con la congelación-descongelación y el almacenamiento.
Los resultados de Biacore de las formulaciones de HPV liofilizadas que se almacenaron a -70 °C durante más de 6 meses indicaron que la antigenicidad para todos los tipos de HPV disminuyó para el Tampón B (Tampón 14) en todos los puntos temporales, incluido el punto temporal T = 0 en comparación con las formulaciones de HPV en Tampón C y Tampón D (véase la Figura 10 para ver la fecha representativa de los tipos de HPV 16 y 18). Esto puede verse como una amplificación de la caída de potencia observada en condiciones de congelacióndescongelación en la formulación de Tampón 14 después de 6 meses de almacenamiento a -70 °C. Debido a que el Tampón 14 comprende solo sal (es decir, sin excipientes), no pudo soportar el proceso de liofilización (caída de potencia en el punto temporal T = 0). La antigenicidad para todos los tipos de HPV en las formulaciones de prueba que comprenden sacarosa y manitol (Tampón C y Tampón D) fue idéntica a los patrones de referencia, lo que indica que estos tampones pudieron mantener la integridad de las VLP de HPV y, por lo tanto, conservaron la antigenicidad de la vacuna cuando se almacenaron a -70 °C durante más de 6 meses después del proceso de liofilización. Esto aclara fuertemente el papel de estos excipientes en combinación como estabilizador de la vacuna en las condiciones de prueba dadas.
Todas las formulaciones de la vacuna contra el HPV 4-valente (Tampón B a Tampón D) que se sometieron al proceso de congelación-descongelación, excepto la formulación que comprende el Tampón 14, fueron completamente potentes y poseían respuestas Biacore casi idénticas a las de los patrones de referencia para los cuatro tipos de HPV probados después del almacenamiento a 2-8 °C durante más de 6 meses (datos no mostrados). Se observó una ligera caída en la potencia de la formulación en Tampón 14 congelada-descongelada en el punto temporal de 6 meses para todos los tipos de HPV, similar a la observada después del almacenamiento a -70 °C durante más de 6 meses. Por lo tanto, la estabilidad de los antígenos del HPV en varios tampones que contienen sal, excipientes o combinación de ambos no se vio afectada por el proceso de congelación-descongelación y el almacenamiento a largo plazo.
Los resultados de Biacore de las formulaciones de HPV liofilizadas que se almacenaron a 2-8 °C durante más de 6 meses indicaron que la antigenicidad para todos los tipos de HPV disminuyó para el Tampón B (Tampón 14) en todos los puntos temporales, incluyendo T = 0, en comparación con las formulaciones de HPV en Tampón C y Tampón D (datos no mostrados). Los resultados para la composición de Tampón 14, que carece de sacarosa y manitol, fueron similares a los obtenidos después del almacenamiento a -70 °C como se discutió anteriormente, y respaldan la conclusión de que la formulación no podría soportar el estrés por liofilización y el almacenamiento posterior debido a la falta de estabilizadores. A diferencia de los resultados obtenidos con el Tampón B, la antigenicidad para todos los tipos de HPV en las formulaciones de prueba con Tampón C y Tampón D fue idéntica a la de los patrones de referencia. Los datos indican que las formulaciones de prueba liofilizadas en Tampón C y Tampón D fueron estables al almacenamiento durante más de 6 meses a 2-8 °C, lo que demuestra que la combinación de excipientes manitol y sacarosa en los tampones pudo mantener la integridad de las VLP de HPV. Los resultados ilustran que la formulación que contiene Tampón 14, que comprendía sal, pero no manitol o sacarosa, no pudo soportar el estrés de la liofilización.
Todas las formulaciones de vacuna contra el HPV 4-valente (Tampón B a Tampón D) que se sometieron al proceso de congelación-descongelación seguido de almacenamiento a 25 °C durante más de 6 meses fueron completamente potentes y poseían respuestas Biacore casi idénticas a las de los patrones de referencia para e1HPV tipos 6, 11 y 16 probados en varios puntos temporales (en la Figura 11 se proporcionan resultados representativos para los tipos HPV16 y HPV18). La antigenicidad del HPV 18 disminuyó en las formulaciones que comprenden Tampón 15 y Tampón 16 en los puntos temporales de 3 y 6 meses. También se observó una caída en la antigenicidad para el HPV18 en formulaciones que contienen Tampón 3 y Tampón 4, pero la caída fue considerablemente menor en el punto temporal de 6 meses que la observada para las formulaciones que contienen Tampón 15 y Tampón 16. Los resultados indican que, en las condiciones especificadas anteriormente, la presencia de excipientes en las formulaciones de HPV tipo 18 congeladas y descongeladas no se pudo soportar el estrés térmico durante el período de tiempo especificado.
Los resultados de Biacore de las formulaciones de HPV liofilizadas que se almacenaron a 25 °C durante más de 6 meses indicaron que la antigenicidad para todos los tipos de HPV disminuyó para el Tampón B (Tampón 14) en todos los puntos temporales, incluido T = 0 en comparación con las formulaciones de HPV en Tampón C y Tampón D (en la Figura 11 se proporcionan resultados representativos para los tipos de HPV 16 y 18). La caída en la antigenicidad para el Tampón B fue significativa más allá del punto temporal T = 0, lo que podría deberse a la inestabilidad térmica después de la liofilización de los tipos de HPV a 25 °C. Para las formulaciones que comprenden Tampón C y Tampón D, la antigenicidad se conservó y mostraban una respuesta Biacore casi idéntica a la de los patrones de referencia para los cuatro tipos de HPV probados en varios puntos temporales. La estabilidad durante el almacenamiento observada para las formulaciones de HPV liofilizadas (Tampón C y Tampón D) más de 6 meses a 25 °C demuestra que la combinación de excipientes, manitol y sacarosa en los tampones de formulación fue capaz de soportar tanto el estrés térmico como el de la liofilización, manteniendo así la integridad de las VLP de HPV. Los resultados Biacore muestran que la pérdida de potencia en las condiciones de prueba estaba directamente influenciada por la temperatura de almacenamiento, observándose una mayor pérdida de potencia a una temperatura de almacenamiento más alta.
Todas las formulaciones de vacuna contra el HPV 4-valente (Tampón B a Tampón D) que se sometieron al proceso de congelación-descongelación mostraron una caída en la potencia para todos los tipos de HPV después de 1 mes de almacenamiento a 37 °C (Figura 12). Por lo tanto, los resultados indican que la presencia de excipientes en las formulaciones de HPV congeladas y descongeladas no pudieron soportar el estrés térmico después de 1 mes a 37 °C. Los resultados de Biacore de las formulaciones de HPV liofilizadas que se almacenaron a 37 °C durante 3 meses indicaron que la antigenicidad para todos los tipos de HPV disminuyó para el Tampón B (Tampón 14) en todos los puntos temporales, incluyendo T = 0. En el punto temporal de 3 meses, se observaron respuestas Biacore casi idénticas para todos los tipos de HPV en formulaciones de prueba que comprenden el Tampón C (Tampón 3 y Tampón 15) y el Tampón D (Tampón 4) en comparación con los patrones de referencia, lo que indica que se mantuvo la antigenicidad. Sin embargo, se observó una caída en la potencia para los tipos de HPV en las formulaciones que comprenden Tampón 16 en el punto temporal de 3 meses. La estabilidad durante el almacenamiento de las formulaciones de HPV liofilizadas más allá de 1 mes a 37 °C respalda la conclusión de que la combinación de excipientes manitol y sacarosa en los tampones de formulación pudo soportar el estrés térmico y de liofilización. Nuevamente, la pérdida de potencia en las condiciones de prueba venía influenciada por la temperatura de almacenamiento, observándose una mayor pérdida de potencia a temperaturas de almacenamiento más altas. En general, la velocidad de reacción definida por la equivalencia de IVV (indicadores de viales de vacuna) en el experimento actual debe estar en una categoría de IVV 30, que es un indicador de alta estabilidad.
Ejemplo 7
Mediciones de la osmolalidad.
La osmolalidad de las formulaciones de HPV liofilizadas y las formulaciones de 1X MAA liofilizadas que se almacenaron a 2-8 °C durante 1 mes se midió como se describe en el Ejemplo 1. Los resultados indican que hubo un aumento en los valores de osmolalidad para las formulaciones que comprenden tampones que contienen sal (Tampón 14, Tampón 15 y Tampón 16), tanto para las formulaciones de HPV y 1X MAA (datos no mostrados). La contribución a la osmolalidad proviene principalmente de los excipientes (manitol y sacarosa) y la sal (cloruro de sodio) y no de la histidina, los antígenos del HPV o el adyuvante 1X MAA. La combinación de sal y excipientes desempeña un papel importante en la definición de la tonicidad de la formulación de la vacuna contra e1HPV 4-valente dada.
Ejemplo 8
Mediciones del tamaño de partícula
Dispersión de la luz estática.
Se usó una técnica de dispersión de la luz estática para medir el tamaño de partícula en todas las formulaciones 1X MAA que contenían una concentración de 0 o 320 mM de NaCl (Tampón A a Tampón F) como se describe en el Ejemplo 1. Los tamaños de las partículas para estas formulaciones 1X MAA, que fueron sometidas a congelación ultrarrápida-descongelación (F/T FF IX) o liofilizadas (LIO FF) se compararon con las formulaciones de control en los mismos tampones (Tampón A a Tampón F) que no se congelaron ni se liofilizaron.
El tamaño de partícula de 1X MAA en las formulaciones de control (con y sin sal) fue de alrededor de 4 a 9 pm, con la excepción del Tampón E (Tampón 5; 0 mM de cloruro de sodio), que tenía un tamaño de partícula significativo de 25 pm (datos no mostrados). La agregación significativa de 1X MAA, como se ilustra por el incremento del tamaño de partícula, sugiere la adición de sal (en comparación con el Tampón 5 (0 mM de cloruro de sodio) con Tampón 17 (320 mM de sal)) para prevenir la agregación de MAA en las condiciones congelación-descongelación y liofilización, respectivamente. Además, se observó la capacidad de la combinación del excipiente manitol y sacarosa (en comparación con el Tampón 5 (solo sacarosa) con el Tampón 4 y el Tampón 3 (combinación de sacarosa y manitol en ausencia de sal)) para prevenir la agregación de MAA. En todas las condiciones de prueba, se observó una menor cantidad de agregación en ausencia de sal para formulaciones que contenían 6 % de manitol y 4 % de sacarosa. Esta observación fue concordante con la tendencia de la estabilidad durante el almacenamiento a largo plazo observada para los antígenos de HPV en presencia de sacarosa y manitol, lo que demuestra la capacidad de las formulaciones que comprenden esta combinación para soportar el estrés de congelación-descongelación y liofilización.
Dispersión dinámica de la luz.
El tamaño de partícula también se midió usando una técnica de dispersión dinámica de la luz en todas las formulaciones de vacuna contra el HPV 4-valente liofilizadas y descongeladas después del almacenamiento a varias temperaturas durante 1 mes como se describe en el Ejemplo 1. El tamaño de partícula también se midió para las formulaciones de vacuna de control contra el HPV en los mismos tampones (Tampón B a Tampón D) que no se congelaron ni descongelaron ni liofilizaron. Todas las muestras se trataron con el método de disolución de aluminio descrito en el Ejemplo 1 para liberar los antígenos VLP de HPV del adyuvante de aluminio antes de las mediciones del tamaño de partícula. La distribución del tamaño de partícula es la medición promedio de la distribución del tamaño de todas las VLP de HPV presentes en la solución después de la disolución de aluminio.
Los resultados indican que la distribución del tamaño de partícula para las formulaciones de HPV congeladas y descongeladas almacenadas a varias temperaturas durante 1 mes fueron comparables a las formulaciones de control que no se congelaron ni descongelaron ni liofilizaron, excepto la formulación de HPV en Tampón 14 almacenada a 37 °C durante 1 mes (datos no mostrados). Se observó un gran tamaño de partícula para esta formulación (Tampón 14) almacenada a 37 °C durante 1 mes, lo que podría deberse a la inestabilidad térmica de las VLP de HPV después del estrés de la congelación-descongelación. Estos datos concuerdan con la conclusión de que esta formulación no podría soportar el estrés de congelación-descongelación debido a la falta de excipientes distintos de la sal. Para las formulaciones de prueba de HPV liofilizadas almacenadas a varias temperaturas durante 1 mes, el tamaño de partícula fue comparable a las formulaciones de control que no se congelaron ni descongelaron ni liofilizaron, a excepción de la formulación de HPV que comprende Tampón 14 almacenada a 2-8 °C durante 1 mes. Se observó un gran tamaño de partícula para esta formulación, lo que indica que esta formulación no pudo soportar el estrés de liofilización. Entre las diversas formulaciones de HPV evaluadas, aquellas con Tampón C y Tampón D, que comprenden una combinación de excipientes (manitol y sacarosa), se vieron menos afectadas por el estrés de las condiciones de congelación y descongelación en cuanto a la distribución del tamaño de partícula de las VLP en comparación con aquellas formulaciones (Tampón B) que no comprendían una combinación de los excipientes manitol y sacarosa.
En general, los resultados indican que la presencia de esta combinación de excipientes (manitol y sacarosa), con o sin cloruro de sodio, pudo conservar la integridad de las VLP de HPV que estaban unidas al MAA durante las condiciones del proceso de congelación-descongelación y liofilización.
Ejemplo 9
Características de las formulaciones de HPV 4-valente liofilizadas y formulaciones 1X MAA
Apariencia física de la torta seca.
La apariencia física de todas las tortas liofilizadas se fotografió después de la liofilización (T=0) y en cada punto temporal durante el transcurso del estudio de estabilidad a varias temperaturas. La apariencia de las tortas fue visualizada por dos analistas y, basándose en la morfología, el color y otros atributos de calidad, las tortas se clasificaron como se describe en el Ejemplo 1. En general, se obtuvieron tortas sólidas blancas secas para todas las formulaciones de HPV 4-valente, así como para las formulaciones 1X MAA (véase las Figuras 13 y 14). La apariencia física de cada una de las formulaciones de HPV liofilizadas fue comparable a la apariencia física de las formulaciones de 1X MAA liofilizadas para todos los puntos temporales y temperaturas de almacenamiento. Se observaron tortas elegantes para las formulaciones que contenían Tampón 3 y Tampón 4, y tortas ligeramente colapsadas o agrietadas o encogidas para las formulaciones que contenían Tampón 15 y Tampón 16. Se observaron tortas completamente colapsadas para las formulaciones que contenían Tampón 14 después de la liofilización. No se observó ningún cambio de color para ninguna de las formulaciones debido a la degradación térmica de los excipientes. Los resultados de este estudio indican que la apariencia física de la torta dependía de los excipientes de la formulación y no de la temperatura de almacenamiento ni de la duración del almacenamiento. La calidad de las tortas para formulaciones que contenían una combinación de los excipientes de manitol y sacarosa disminuyó con el aumento de la concentración de sal.
Tiempo de reconstitución.
Las formulaciones de vacuna contra el HPV 4-valente liofilizadas y las formulaciones de 1X MAA se reconstituyeron con WFI estéril en función de la cantidad de excipientes presentes. El volumen de WFI que se agregó a cada formulación osciló entre 0,50 y 0,60 ml. El volumen final después de la reconstitución fue de aproximadamente 0,6 ml. El tiempo de reconstitución se controló usando un cronómetro y se registró el tiempo para la disolución completa (en este caso, suspensión homogénea) para cada una de las formulaciones de vacuna contra e1HPV liofilizada, así como para las formulaciones liofilizadas de 1X MAA. El tiempo de reconstitución para todas las formulaciones de HPV liofilizadas fue comparable al de todas las formulaciones de 1X MAA liofilizadas para todos los puntos temporales y temperaturas de almacenamiento (datos no mostrados). Casi todas las formulaciones tuvieron un tiempo de reconstitución rápido de menos de 60 segundos, independientemente de la temperatura de almacenamiento y la duración del almacenamiento.
Prueba de agitación.
Después de la reconstitución de todas las formulaciones de vacuna contra e1HPV 4-valente liofilizadas y formulaciones 1X MAA, se realizó una prueba de agitación para verificar la calidad de la formulación de vacuna/adyuvante. Se midió el tiempo para que las partículas de aluminio se depositen en el fondo del vial para cada una de las formulaciones de prueba que se congelaron o descongelaron o liofilizaron. Los resultados indican que todas las formulaciones de HPV 4-valente que contenían sal (Tampón 14, Tampón 15 y Tampón 16) tuvieron un tiempo de sedimentación más rápido que las formulaciones sin sal, lo que indica que las partículas de aluminio se habían aglomerado (véase la Figura 15). Para las formulaciones de HPV 4-valente que contenían manitol y sacarosa en ausencia de sal (Tampón 3 y Tampón 4), el tiempo de sedimentación fue superior a 15 minutos, lo que indica que las partículas de aluminio no se habían aglomerado. Por lo tanto, la presencia de excipientes en la formulación de la vacuna contra el HPV 4-valente evita la aglomeración de las partículas de aluminio incluso después del estrés de la congelación, descongelación y liofilización. El tiempo de almacenamiento y la temperatura no tuvieron ningún impacto significativo en los resultados de la prueba de agitación.
Los resultados de la prueba de agitación para las formulaciones 1X MAA indican que el estrés de la congelacióndescongelación no afectó al tiempo de sedimentación en ningún momento dado ni a ninguna temperatura de almacenamiento, ya que todas las formulaciones de prueba que contenían excipientes y sal tuvieron un tiempo de sedimentación de más de 15 minutos, mientras que la formulación que contenía solo sal (Tampón 14) tuvo un tiempo de sedimentación ligeramente más rápido, aunque no significativamente diferente del resto de las formulaciones (datos no mostrados). Para las formulaciones liofilizadas de 1X MAA que contenían manitol y sacarosa en ausencia de sal (Tampón 3 y Tampón 4), el tiempo de sedimentación fue superior a 15 minutos, lo que indica que las partículas de aluminio no se habían aglomerado. Por lo tanto, la presencia de excipientes en las formulaciones de 1X MAA evitó la aglomeración de las partículas de aluminio después del estrés de la liofilización. El tiempo de almacenamiento y la temperatura no tuvieron ningún impacto significativo en los resultados de la prueba de agitación.

Claims (21)

REIVINDICACIONES
1. Una formulación de vacuna contra el papilomavirus humano, que comprende:
a) una cantidad terapéuticamente efectiva de partículas similares al virus (VLP) de HPV que están adsorbidas en un adyuvante de aluminio;
b) manitol y sacarosa; y
c) opcionalmente una sal;
en donde la formulación comprende:
a) VLP de HPV de al menos un tipo de HPV adsorbidas en un adyuvante de aluminio, en donde las VLP de cada tipo de HPV están presentes en una concentración de 10-200 pg/ml y en donde las VLP se seleccionan del grupo que consiste en: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV26, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV53, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59, HPV66, HPV68, HPV73 y HPV82; y
b) del 1 % al 10 % p/v de manitol; y del 0,5 % al 10 % de sacarosa.
en donde la formulación está congelada o liofilizada; y
en donde la formulación es estable durante 1 mes a 25 °C después del estrés de un proceso de liofilización o congelación-descongelación.
2. La formulación de la reivindicación 1, que comprende además de 0,15 M a 0,32 M de NaCl.
3. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que comprende además de 5 mM a 20 mM de histidina.
4. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende además una concentración de peso a volumen del 0,01 % al 0,03 % de un tensioactivo seleccionado del grupo que consiste en Polisorbato 20 y Polisorbato 80.
5. La formulación de la reivindicación 4, en la que el tensioactivo es Polisorbato 80 que está presente en una concentración de peso a volumen del 0,01 %.
6. La formulación de cualquier reivindicación anterior, en la que el manitol está presente en una concentración de peso a volumen del 4 % al 7 % y la sacarosa está presente en una concentración de peso a volumen del 1 % al 5 %.
7. La formulación de la reivindicación 6, en la que el adyuvante de aluminio se selecciona del grupo que consiste en hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio e hidroxifosfato de aluminio.
8. La formulación de la reivindicación 7, en la que las VLP de HPV son de los tipos 6, 11, 16 y 18 de HPV.
9. La formulación de la reivindicación 8, que comprende además VLP de HPV de al menos un tipo de HPV adicional seleccionado del grupo que consiste en: 31, 33, 45, 52 y 58.
10. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la formulación está liofilizada.
11. La formulación de la reivindicación 1, en donde la formulación es estable durante 3 meses a 25 °C después del estrés del proceso de liofilización o congelación-descongelación.
12. La formulación de la reivindicación 11, en donde la formulación es estable durante 6 meses a 25 °C o 30 días a 37 °C después del estrés del proceso de liofilización o congelación-descongelación.
13. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la formulación es estable durante 3 meses a 37 °C después del estrés del proceso de liofilización o congelación-descongelación.
14. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la formulación es estable durante más de 6 meses a 2-8 °C después del estrés del proceso de liofilización o congelación-descongelación.
15. Un método para producir una formulación estable de vacuna contra el HPV liofilizada, que comprende:
(a) formular una formulación líquida de vacuna contra el HPV que comprende (i) VLP de HPV de al menos un tipo de HPV adsorbidas en un adyuvante de sal de aluminio, en donde las VLP de al menos un tipo de HPV están presentes en una concentración de 10-200 pg/ml y en donde las VLP se seleccionan del grupo que consiste en: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV26, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV53, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59, HPV66, HPV68, HPV73 y HPV82; (ii) del 1 % al 10 % p/v de manitol; y (iii) del 5 % al 10 % de sacarosa;
(b) congelar la formulación líquida para producir una formulación congelada y
(c) secar la formulación congelada para proporcionar una formulación de vacuna contra e1HPV liofilizada.
16. El método de la reivindicación 15, en el que la formulación líquida comprende además de 5 mM a 20 mM de histidina.
17. El método de la reivindicación 16, en el que la formulación líquida comprende además de 50 mM a 350 mM de NaCl.
18. El método de la reivindicación 17, en el que la formulación líquida comprende además Polisorbato 80 que está presente en una concentración de peso a volumen del 0,005 % al 0,03 %.
19. El método de la reivindicación 18, en el que la formulación líquida comprende VLP de HPV de los tipos de HPV 16 y 18.
20. El método de la reivindicación 19, en el que la formulación líquida comprende además VLP de HPV de los tipos de HPV 6 y 11.
21. Un método para producir una formulación estable de vacuna contra el HPV congelada, que comprende:
(a) formular una formulación líquida de vacuna contra el HPV que comprende (i) VLP de HPV de al menos un tipo de HPV adsorbidas en un adyuvante de sal de aluminio, en donde las VLP de al menos un tipo de HPV están presentes en una concentración de 10-200 pg/ml y en donde las VLP se seleccionan del grupo que consiste en: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV26, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV53, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59, HPV66, HPV68, HPV73 y HPV82; (ii) del 1 % al 10 % p/v de manitol; y (iii) del 5 % al 10 % de sacarosa; y
(b) congelar la formulación líquida para producir una formulación congelada.
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