ES2270822T3 - Procedimiento para preparar una vacuna del papilomavirus humano con particulas analogas a virus desensambladas y reensambladas. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para fabricar una vacuna del papilomavirus humano que comprende partículas análogas al virus HPV (VLPs), comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) incubar VLPs en una mezcla de disociación que comprende ditiotreitol (DTT) 2-20 mM, una sal presente en un intervalo equivalente a NaCl de 0, 10M a 0, 2M, un tensioactivo no iónico, un agente quelante de metal, y un tampón hasta que se produzca el desensamblaje de las VLPs; (b) retirar el agente reductor de la mezcla de disociación; y (c) reensamblar las VLPs desensambladas.
Description
Procedimiento para preparar una vacuna del
papilomavirus humano con partículas análogas a virus desensambladas
y reensambladas.
Esta Invención revela una vacuna del
papilomavirus (HPV) que contiene partículas análogas a virus (VLPs)
que se han desensamblado en capsómeros y después se han vuelto a
ensamblar en VLPs. Esta invención también se relaciona con
procedimientos de elaboración de esta vacuna originando VLPs de HPV
más homogéneos y una estabilidad de almacenaje enormemente
mejorada.
El Papilomavirus Humano (HPV) infecta el tracto
genital y se ha asociado con diversas displasias, cánceres, y otras
enfermedades. Estas enfermedades son actualmente el objetivo para el
desarrollo de vacunas y las vacunas que contienen partículas
análogas a virus (VLPs) que contienen proteínas L1 o la combinación
de proteínas L1 + L2 figuran actualmente en ensayos clínicos.
Se ha encontrado, sin embargo, que la proteína
L1 recombinante de VLPs de HPV purificada a partir de levaduras no
son estables durante almacenajes a largo plazo, ni en disolución ni
adsorbidas sobre partículas adyuvantes de aluminio.
En el pasado, varios investigadores han
investigado las condiciones de ensamblaje y desensamblaje de VLP de
HPV. Por ejemplo, McCarthy et al., 1998, "Quantitative
Disassembly and Reassembly of Human Papillomavirus Tipo 11 Viruslike
Particles in vitro" J. Virology
72(1):32-41, describe el desensamblaje y
reensamblaje de L1 recombinantes de VLPs 11 de HPV purificadas a
partir de células de insecto para obtener una preparación homogénea
de VLPs. Se usó una incubación prolongada (aproximadamente 16 horas
a 4ºC) con una concentración relativamente alta de agente reductor
a una fuerza iónica fisiológica para desensamblar las VLPs, y se usó
la retirada del agente reductor a una fuerza iónica superior para
reensamblar las VLPs. Este procedimiento, no obstante, consume
bastante tiempo.
Para desarrollar una vacuna útil comercialmente,
se necesita una formulación de almacenaje estable. Sería deseable
tener un procedimiento de tratamiento sencillo, rápido y
cuantitativo para fabricar una formulación de VLP de HPV estable de
almacenaje.
Esta invención se relaciona con un procedimiento
para fabricar partículas análogas a virus (VLPs) del papilomavirus
humano estables.
En algunas formas de realización las VLPs
reensambladas se adsorben sobre un adyuvante de aluminio.
Esta invención también se relaciona con la
fabricación de VLPs mediante un procedimiento que comprende los
pasos de:
- (a)
- incubar VLPs purificadas en una mezcla de disociación con alto contenido en sales que comprende ditiotreitol (DTT) 2-20 mM, una sal presente en un intervalo equivalente a NaCl de 0,5M a 1,25M, un tensioactivo no iónico, un agente quelante de metal, y un tampón hasta que se produzca el desensamblaje de las VLPs;
- (b)
- retirar el agente reductor de la mezcla de disociación; y
- (c)
- reensamblar las VLPs desensambladas; y
- (d)
- adsorber opcionalmente las VLPs de HPV reensambladas sobre adyuvante de aluminio.
Otra forma de realización de esta invención se
relaciona con las VLPs fabricadas mediante un procedimiento que
comprende los pasos de:
- (a)
- incubar VLPs purificadas en una mezcla de disociación con bajo contenido en sales que comprende (DTT) 2-20 mM, una sal presente en un intervalo equivalente a NaCl de 0,10M a 0,2M, un tensioactivo no iónico, un agente quelante de metal, y un tampón hasta que se produzca el desensamblaje de las VLPs;
- (b)
- retirar el agente reductor de la mezcla de disociación; y
- (c)
- reensamblar las VLPs desensambladas; y
- (d)
- adsorber opcionalmente las VLPs de HPV reensambladas sobre adyuvante de aluminio.
La invención también se relaciona con
formulaciones de vacuna que comprenden VLPs fabricadas mediante el
procedimiento anterior, y que se almacenan en un tampón de
formulación. El tampón de formulación comprende una sal, un tampón
de histidina, y un tensioactivo no iónico.
La Figura 1 es un gráfico que muestra el
desensamblaje y reensamblaje de VLPs de HPV 16 según se determinó
mediante análisis de ultracentrifugación analítica.
La Figura 2 es un gráfico que muestra
distribuciones de tamaño de partículas de VLPs de HPV 16
des/reensambla-
das (línea discontinua) y VLPs de HPV 16 no tratadas (línea continua) según se determinó mediante análisis de ultracentrifugación analítica.
das (línea discontinua) y VLPs de HPV 16 no tratadas (línea continua) según se determinó mediante análisis de ultracentrifugación analítica.
La Figura 3 es un gráfico que muestra la
estabilidad de almacenaje acelerada (37ºC) de formulaciones de
vacuna de aluminio-16 de HPV según se determinó
mediante antigenicidad in vitro via análisis BIAcore.
La Figura 4 muestra la estabilidad de almacenaje
acelerada de VLPs de HPV 16 en solución salina fisiológica según se
determinó mediante antigenicidad in vitro via análisis
BIAcore.
La Figura 5 muestra el efecto del tratamiento de
des/reensamblaje sobre la estabilidad térmica de distintas
cantidades de VLPs de HPV 16 según se determinó dirigiendo una
agregación inducida térmicamente mediante turbidez UV (análisis de
puntos de nube).
La Figura 6A-D muestra la
estabilidad de almacenaje acelerada (37ºC) de cuatro tipos distintos
(HPV 16, 11, 6a, 18) de VLPs de HPV des/reensambladas así como VLPs
de HPV control no tratadas en disolución según se determinó mediante
antigenicidad in vitro via análisis BIAcore. La Figura 6A es
HPV 6A; La Figura 6B es HPV 11; La Figura 6C es HPV 16; y La Figura
6D es HPV 18.
Las Figuras 7A-D muestran la
estabilidad de almacenaje acelerada de cuatro tipos distintos (HPV
16, 11, 6a, 18) de VLPs de HPV des/reensambladas así como VLPs de
HPV control no tratadas adsorbidas sobre adyuvante de aluminio. Las
Figuras 7A y 7B son HPV 6A; las Figuras 7C y 7D son HPV 11; las
Figuras 7E y 7F son HPV 16; y las Figuras 7G y 7H son HPV 18.
Las Figuras 8A-F son
comparaciones de la estabilidad térmica y la distribución de tamaño
hidrodinámico de VLPs de HPV 6a, HPV11 y HPV 16
desensambladas/reensambladas, preparadas a partir de un
procedimiento de desensamblaje en condiciones fisiológicas próximas
(procedimiento de baja salinidad) o a concentraciones de sal
superiores (procedimiento de alta salinidad). Estas propiedades
físicas de las VLPs de HPV redeterminaron mediante análisis de
puntos de nube y análisis de ultracentrifugación analítica. En el
procedimiento de baja salinidad, las VLPs de HPV se desensamblan en
NaCl 0,166 M, solución TRIS 10 mM (pH 8,2) mientras en el
procedimiento de alta salinidad, las VLPs de HPV se desensamblan en
NaCl 0,63 M, Fosfato 35 mM, y solución TRIS 100 mM (pH 8,2). Ambas
soluciones contienen además EDTA y polisorbato 80. Las Figuras 8A y
8B muestran los datos del punto de nube y la ultracentrifugación
analítica de las VLPs de HPV 6A; Las Figuras 8C y 8D muestran los
mismos análisis con las VLPs de HPV 11; Las Figuras 8E y 8F muestran
los mismos análisis con las VLPs de HPV 16.
Las Figuras 9A-D son la
distribución por tamaño de partícula y afinidad de superficie de
VLPs de HPV no tratadas y des/reensambladas según se midió mediante
análisis SEC-HPLC. La Figura 9A es HPV 6a; la Figura
9B es HPV 11; la Figura 9C es HPV 16; y la Figura 9D es HPV 18.
Esta invención se relaciona con un procedimiento
para producir VLPs de HPV más estables que se ha encontrado que
contribuyen significativamente a la estabilidad global de una
formulación e vacuna del HPV. Las VLPs de HPV se producen, se
desensamblan presumiblemente en capsómeros, se reensamblan en VLPs,
y se usan como ingrediente activo en una vacuna de formulación.
De acuerdo con esta invención, se puede usar
cualquier tipo de VLPs de HPV como la porción antigénica de la
vacuna de formulación. Las VLPs pueden contener sólo proteína L1, o
pueden contener sendas proteínas L1 y L2. Las proteínas pueden ser
de una composición de aminoácidos de tipo silvestre, o pueden
contener mutaciones. Se prefieren las VLPs que contienen sólo
proteína L1, que es de una composición de aminoácidos de tipo
silvestre.
Los HPVs preferidos son aquellos asociados a la
enfermedad, incluyendo pero sin limitarse a: HPV 1, HPV 2, HPV 3,
HPV 4, HPV 6a, HPV 6b, HPV 7, HPV 10, HPV 11, HPV 16, y HPV 18, HPV
34, HPV 39, HPV 41-44 y HPV 51-55.
Los HPVs preferidos incluyen HPV 6a, HPV 6b, HPV 11, HPV 16, y HPV
18. Además, las formulaciones de esta invención son apropiadas para
combinaciones de tipos de HPV, incluyendo vacunas multivalentes que
contiene una pluralidad de antígenos de HPV, tales como una
combinación de HPV 6, 11, 16 y 18.
Se prefiere que las VLPs se fabriquen mediante
técnicas de recombinantes, como se conoce en la técnica. Se prefiere
particularmente que la célula huésped usada para fabricar las VLPs
sea una célula de levadura, aunque otros tipos celulares, tales como
células bacterianas, de insecto o de mamífero se conocen y se usan
actualmente como huéspedes. Sin querer estar limitados por la
teoría, parece que el estatus de los puentes disulfuro en la
proteína L1 de una VLP puede variar dependiendo de la célula huésped
usada para expresar la L1 recombinante así como el subsiguiente
procedimiento de purificación. McCarthy et al. 1998,
supra describe algunos trímeros de L1 de uniones cruzadas
disulfuro en VLPs recombinantes producidas en células de insecto.
Por otra parte, de acuerdo con esta invención, el estatus del puente
disulfuro en la proteína L1 de VLPs producidas en levaduras puede
variar y por tanto requerir distintas condiciones para un
desensamblaje y reensamblaje óptimos.
Para algunas formulaciones, se desea un producto
adsorbido sobre aluminio. Generalmente en este caso, la
concentración de VLPs de HPV que están adsorbidas sobre aluminio es
de aproximadamente 10-200 mcg/ml para cada tipo de
VLP de HPV. Esto se puede ajustar, dependiendo de factores tales
como la antigenicidad del tipo particular de HPV, y de la presencia
de múltiples tipos de HPVs en una vacuna de tipo "cóctel".
Después de producir las VLPs en las células
huésped recombinantes y de purificarlas, se desensamblan
incubándolas en una mezcla de disociación. El desensamblaje se
conduce básicamente mediante la reducción de puentes disulfuro con
ditiotreitol (DTT) en un intervalo relativamente amplio de ambientes
con fuerza iónica que varían desde el fisiológico (también referido
como "procedimiento de baja salinidad") hasta NaCl 1,25 M
((también referido como "procedimiento de alta salinidad"). La
mezcla de disociación comprende un agente reductor, una sal, un
tensioactivo no iónico, un agente quelante de metal y un tampón.
El agente reductor es ditiotreitol (DTT), aunque
se sabe que pueden usarse otros agentes reductores. En el pasado, se
han usado otros agentes reductores (tales como
beta-mercaptoetanol, \beta-ME)
para desensamblar partículas de HPV (ver, p.ej. McCarthy et
al, supra), pero han empleado una concentración
relativamente alta de agente reductor (5%, o 713 mM de
\beta-ME). Por el contrario, una característica de
la presente invención es el uso de una concentración relativamente
baja de agente reductor.
Para los objetos de la especificación y las
reivindicaciones, el término "concentración relativamente baja de
agente reductor" significa desde aproximadamente 2 mM hasta 20 mM
si se usa DTT como agente reductor, o si se emplea un agente
reductor alternativo, la cantidad del agente reductor alternativo
que tendría aproximadamente el mismo efecto que al emplear DTT
2-20 mM. Una cantidad preferida de agente reductor
es aproximadamente DTT 10 mM.
Otro componente importante de la mezcla de
disociación es la sal. Generalmente, la fuerza iónica de la mezcla
de disociación se mantiene por la presencia de sales. Se puede usar
casi cualquier sal que pueda contribuir al control de la fuerza
iónica. Son sales preferidas que se pueden usar para ajustar la
fuerza iónica cualquier sal fisiológicamente aceptable, tales como
NaCl, KCl, Na_{2}SO_{4}, (NH_{4})_{2}SO_{4},
fosfato sódico, citrato sódico y mezclas de los mismos. Son sales
particularmente preferidas: NaCl, KCl, Na_{2}SO_{4}, y
especialmente NaCl.
En una forma de realización de baja salinidad de
esta invención, la mezcla de disociación debería tener una fuerza
iónica que sea aproximadamente fisiológica. Para objetos de esta
especificación y reivindicaciones, el término "aproximadamente
fisiológica" cuando se refiere a una sal, significa
0,10-0,20 M, y preferiblemente sobre
0,15-0,18 M, y más preferiblemente sobre 0,16 M
cuando reemplea NaCl como sal. Para otras sales que se pueden usar,
está dentro de la habilidad del artesano el calcular la molaridad
que sería equivalente de una solución aproximadamente fisiológica de
NaCl.
Alternativamente, la disociación puede tener
lugar en un ambiente de alta salinidad. Usado aquí, "alta
salinidad" significa al menos 0,5 M de sal, y al menos 10 mM de
agentes tamponadores. Un intervalo preferido para la alta salinidad
es de 0,5 a 1,25 M, si la sal usada es NaCl, y un intervalo más
preferido es de 0,60 a 1 M. Para otras sales, está dentro de la
habilidad del artesano el determinar la molaridad que sería
equivalente de una solución de 0,5 M a 1,25 M de NaCl.
El uso afortunado de un procedimiento de
desensamblaje de alta salinidad fue bastante inesperado - informes
documentados tales como Brady et al., 1977 Virology
23: 717-724, Belnap et al., 1995 J. Mol.
Biol. 259: 249-263 y la solicitud de la patente
publicada WO 99/13056 limitan la concentración de sal a menos de 0,5
M de NaCl. Sin embargo, se ha encontrado que el uso de un
desensamblaje de alta salinidad es conveniente en que la alta
salinidad limita la posible agregación de proteínas, provoca una
mejor recuperación de masa proteica, y además permite que se inicie
el tratamiento de des/reensamblaje en el paso de cromatografía para
la purificación final, reduciendo de este modo el número de pasos de
procesado necesarios durante la purificación.
Sorprendentemente se ha encontrado que una
solución de alta salinidad preferida (tal como NaCl 1,0 M, tampón
TRIS 10 mM, pH 8,2, EDTA 2 mM, polisorbato 80 al 0,03% y DTT
2-20 mM) provoca una recuperación de masa de
proteína de HPV de aproximadamente el 100% en el procedimiento.
También se prefiere otra solución de alta salinidad (NaCl 0,63 M,
tampón fosfato 35 mM, tampón TRIS 100 mM, pH 8,2, EDTA 2 mM,
polisorbato 80 al 0,03% y DTT 2-20 mM).
Para comprender y caracterizar mejor el efecto
de la concentración de alta salinidad sobre la eficacia del
desensamblaje de la VLP de HPV, se llevaron a cabo estudios
comparativos bajo condiciones de desensamblaje de alta (NaCl
0,5-1,0 M) y baja (fisiológica) salinidad. Se
monitorizaron los cambios en la intensidad de difusión de luz
estática para evaluar el desensamblaje de VLP. Se observó que los
resultados eran bastante similares para sendas concentraciones de
alta salinidad y salinidad fisiológica - el desensamblaje total de
VLP tuvo lugar aproximadamente a los dos minutos de la adición de
DTT (20 mM). Además la cinética de desensamblaje parece estar
controlada por la concentración de agente reductor en lugar de por
la concentración de sal, correlacionándose la mayor concentración de
agente reductor con un desensamblaje más rápido a una temperatura y
pH dados.
Se examinaron otras propiedades biofísicas de
las VLPs desensambladas y reensambladas en sales fisiológicas o en
alta concentración. La estabilidad térmica y las distribuciones de
tamaño hidrodinámico para VLPs de desensamblaje/reensamblaje
generadas bajo condiciones de alta y baja salinidad son similares.
Sin embargo, la recuperación de masa proteica total fue
relativamente mayor (próxima al 100%) para VLPs de HPV
desensamblaje/reensamblaje generadas con procedimientos de alta
salinidad.
Otro componente de la mezcla de disociación es
un tensioactivo no iónico. El tensioactivo no iónico se puede
seleccionar entre el grupo constituido por: polisorbato 80,
Polisorbato 20, alquil éteres de polioxietileno, Triton
X-100®, Triton X-114®,
NP-40®, Span 85 y un miembro de la serie Plurónica
de tensioactivos no iónicos. Se prefiere particularmente el
Polisorbato 80. Una concentración preferida de Polisorbato es de
aproximadamente 0,01-0,50%, y preferiblemente de
aproximadamente 0,01-0,10%, y especialmente sobre el
0,03%.
Debería controlarse el pH de la mezcla de
disociación mediante la presencia de un tampón. El desensamblaje de
VLPs de HPV puede tener lugar en un intervalo amplio de pH básicos
tales como desde 7,0 hasta 10. Un pH preferido es
8,0-8,5, y preferiblemente sobre 8,2. Un tampón
preferido es TRIS 5-100 mM, preferiblemente
5-15 mM, aunque se pueden usar otros tampones tales
como el fosfato. Generalmente se prefiere el TRIS, ya que
proporciona un buen control del pH y la fuerza iónica en las
condiciones de la mezcla de disociación. Opcionalmente se puede
añadir tampón fosfato 0-50 mM.
También está presente en la mezcla de
disociación un agente quelante de metales para asegurar el
desensamblaje completo de VLPs. Un agente quelante de metales
preferido es EDTA de 0,5 a 5 mM, y preferiblemente sobre 2 mM,
aunque también se pueden usar otros agentes quelantes conocidos.
Una mezcla de disociación particularmente
preferida comprende aproximadamente 300 mcg/ml de proteína de VLP de
HPV en un tampón TRIS 10 mM, pH 8,2, que contiene adicionalmente
NaCl 0,16M-0,18M, DTT 10 ó 20 mM, EDTA 2 mM y
Polisorbato 80 al 0,03%. Alternativamente, la mezcla de disociación
contiene la misma cantidad de proteína en NaCl 0,63M, fosfato 35 mM,
tampón TRIS 100 mM, pH 8,2, DTT 10 ó 20 mM, EDTA 2 mM y Polisorbato
80 al 0,03%.
Una ventaja para el procedimiento de esta
invención es que el paso de desensamblaje es bastante rápido, y
solamente requiere incubación de las VLPs en la mezcla de
disociación durante menos de una hora aproximada a temperatura
ambiente, y se pueden usar tiempos tan cortos como
30-40 minutos. Si se desea, el paso de disociación
(así como otros pasos del procedimiento de
desensamblaje/reensamblaje) se puede desarrollar en condiciones
estériles. Por ejemplo, los componentes del tampón deben ser
filtrados de forma estéril, y usarse con soluciones de proteína
estéril. Además, las VLPs de HPV des/reensambladas en solución deben
filtrase de forma estéril antes de usarse o antes de la adsorción
sobre adyuvante de aluminio.
Después de que se complete el desensamblaje de
VLPs, debería eliminarse el agente reductor. Esto se puede llevar a
cabo mediante el uso de una etapa de diálisis o una etapa de
diafiltración/ultrafiltración. La etapa de diálisis comprende una
diálisis contra una solución de sal (de fuerza fisiológica o, si se
usó el procedimiento de alta salinidad, una concentración mayor de
sal tal como 1M), tensioactivo no iónico, y tampón similar a la
presente en la mezcla de disociación, pero a un pH menor del que
está presente en la mezcla de disociación. Los intervalos de pH
recomendados en esta etapa de diálisis son de aproximadamente
6,5-7,5, y preferiblemente sobre 7,0. Una solución
de diálisis preferida comprende NaCl 0,16-0,18 M,
polisorbato 80 al 0,01-0,03%, fosfato 10 mM a pH
7,0. Otro ejemplo de una diálisis recomendada es una diálisis 1:100
(tres cambios, uno cada 30 minutos) contra una solución de NaCl
0,166 M, tampón fosfato 10 mM, pH 7,0. Alternativamente, una
solución preferida es NaCl 1,0 M, tampón fosfato 10 mM, y
polisorbato 80 al 0,03%, pH 7,0.
Si es necesario, se puede añadir al tampón usado
detergente no iónico adicional tal como polisorbato 80 para eliminar
el DTT para mantener un nivel suficiente de detergente no iónico con
la proteína durante el procedimiento.
Alternativamente, se podría usar la solución de
reensamblaje descrita en lo que sigue para eliminar el DTT.
A mayores volúmenes, se puede usar un plan
escalable de diafiltración o ultrafiltración en lugar del
procedimiento de diálisis.
El siguiente paso es reensamblar VLPs. Esto se
puede llevar a cabo durante la etapa de diálisis descrita
anteriormente, durante la etapa de diafiltración/ultrafiltración
descrita anteriormente, o durante una etapa de diálisis separada o
adicional, y puede llevar desde varias horas hasta 24 horas. Si se
usa una diálisis separada, la diálisis se lleva a cabo usando un
tampón de reensamblaje que comprende: sal de fuerza iónica en el
intervalo de NaCl de 0,5-1,35 M, una fuente de ión
metálico, un tampón a pH 6,0-6,5.
Preferiblemente la sal es la misma sal que se ha
usado en las etapas previas, aunque su concentración es
preferiblemente mayor. Por ejemplo, si se usa NaCl, debería estar
presente a una concentración de 0,5-1,35 M, y
preferiblemente sobre 1,0 M.
La fuente de iones metálicos debería ser una
fuente de Ca^{+2} o de Mg^{+2}, tal como CaCl_{2}, o
MgCl_{2}, y está presente presumiblemente para proporcionar
estabilidad a las VLPs reensambladas. También se puede usar Zinc,
pero habitualmente es menos conveniente que los otros iones. Se
prefiere CaCl_{2}. La cantidad de ión metálico que debería estar
presente es una concentración de aproximadamente
1-10 mM, preferiblemente sobre 2 mM.
Se añaden glicina o citrato de sodio como un
componente del tampón de reensamblaje y/o un controlador del pH. Las
cantidades oscilan aproximadamente entre 20-70 mM,
preferiblemente sobre 50 mM.
El tampón puede ser la combinación de glicina y
fosfato, o citrato y fosfato, o citrato solo. No se recomienda el
uso de tampón fosfato solo. Un tampón de reensamblaje preferido es
NaCl 1M, Ca^{+2} 2 mM, citrato 50 mM, pH 6,2 y polisorbato 80 al
0,03%.
Si es necesario, se puede añadir al tampón de
reensamblaje detergente no iónico adicional tal como polisorbato 80
para mantener un nivel suficiente de detergente no iónico con la
proteína durante el procedimiento.
A mayores volúmenes, se puede usar un plan
escalable de diafiltración o ultrafiltración en lugar del
procedimiento de diálisis.
Finalmente, cualquier reactivo remanente se
puede eliminar mediante diálisis usando un tampón de diálisis final.
Un ejemplo contiene sal (preferiblemente NaCl), y tensioactivo no
iónico, y opcionalmente, histidina. La sal, si es NaCl, está
presente preferiblemente sobre 0,25M-1M, más
preferiblemente sobre 0,5M. La histidina puede estar presente a
2-50 mM, preferiblemente sobre 5-20
mM con un pH de 6,0-6,5, y preferiblemente un pH
sobre 6,2. El tensioactivo no iónico, tal como polisorbato 80 o
polisorbato 20 puede estar presente al 0,01-0,03%.
Un intercambio de tampón preferido alternativo es NaCl 0,5M y
polisorbato 80 al 0,03%.
Estas etapas de diálisis múltiple usadas para
des/reensamblar las VLPs de HPV se pueden desarrollar también con
equipos de mayor escala tales como sistemas de diafiltración y/o
ultrafiltración. Si es necesario, se puede añadir a cualquiera de
los tampones de des/reensamblaje detergente no iónico adicional tal
como polisorbato 80 para mantener un nivel suficiente de detergente
no iónico con la proteína durante el procedimiento.
Si se desea, las VLPs de HPV des/reensambladas
se pueden adsorber sobre un adyuvante de aluminio usando técnicas
conocidas.
Opcionalmente, se puede además aumentar la
estabilidad de la formulación de la VLP reensamblada mediante la
adición de excipientes poliméricos polianiónicos. Usado durante la
especificación y las reivindicaciones, el término "polímero
polianiónico" trata de referirse a compuestos que tienen una
cadena larga simple, o a aquellos con múltiples cadenas unidas
transversalmente; cualquiera tipo que posea múltiples cargas
negativas a lo largo de la(s) cadena(s) cuando está en
disolución. Los ejemplos de polímeros polianiónicos incluyen:
proteínas, polianiones, péptidos y ácidos
poli-nucleicos. Se pueden seleccionar estabilizantes
específicos entre el grupo constituido por: carboximetil celulosa
(particularmente de 10-800 cps), heparina
(6-30 KDa), ácidos poli-amino
(2-100 KDa) tales como poli (Glu), poli (Asp), y
poli (Glu, Phe), glutatión oxidado
[Glu-Cys-Gly]_{2} (613 Da),
poli-nucleótidos tales como ácido policitidílico
(200-700 KDa), y ácido poliadenílico
(200-700 KDa), RNA, DNA, y sero albúminas.
La concentración del excipiente polimérico
polianiónico, cuando está presente, es del aproximadamente 0,01% al
aproximadamente 0,5%, particularmente sobre
0,05-0,1% (por peso/volumen), aunque la adición de
incluso una cantidad diez veces menor de excipientes polianiónicos
(por ejemplo, albúmina al 0,01%, DNA o heparina) aún proporciona una
estabilidad aumentada a formulaciones de VLP de
HPV-aluminio no tratadas.
Una formulación de vacuna típica incluye:
1) producto adsorbido sobre aluminio que
contiene 10-200 mcg/ml de cada tipo de VLP de HPV y
solución salina 0,15-0,32 M; 2) histidina
5-10 mM, pH 6,2; y 3) tensioactivo no iónico al
0,005-0,03%.
Las formulaciones de vacuna de HPV de este
procedimiento resultantes son estables a 2-8ºC hasta
temperatura ambiente durante al menos 6 meses (estudio en curso)
como se ilustra en la Figura 7.
Otro aspecto de esta invención es el uso de un
tampón de formulación para proporcionar vacunas estables, de
almacenaje a largo plazo, fabricadas con las VLPs
desensambladas/reensambladas. El tampón de formulación comprende
NaCl 0,15-0,32M, histidina 5-10 mM,
pH 6,2, polisorbato 80 al 0,005-0,015%. Estas
formulaciones de vacuna son estables en varios intervalos de
temperatura (desde 4 hasta 30ºC) durante al menos seis meses. Se
presentan los siguientes ejemplos no limitantes para ilustra mejor
la invención.
Ejemplo
1
Se usó una solución congelada de proteína L1
recombinante de VLP de HPV 16 derivada de levadura (mayor del 95% de
pureza proteínica) en NaCl 0,5 M, polisorbato 80 al 0,003%, pH
pretendido de aproximadamente 6,2, para la mayoría de estos
experimentos. Las VLPs de HPV 6a y VLPs de HPV 11 estaban en NaCl
0,5 M y polisorbato 80 al 0,03%. Las VLPs de HPV 18 estaban en NaCl
0,5 M y polisorbato 80 al 0,01%. Algunos de los estudios utilizaron
VLPs de HPV 6a, 11 y 16 en tampón fosfato 75 mM a pH 7 que contenía
NaCl 1,25 M.
Para liberar VLPs de HPV del adyuvante de
aluminio, se desarrolló un procedimiento de disolución de aluminio
que incluía la dilución de la formulación de
HPV-aluminio en una solución de alta salinidad que
contenía citrato y polisorbato 80. Las muestras de VLP de HPV del
procedimiento de disolución de aluminio están directamente sujetas a
un ensayo de antigenicidad in vitro que usa análisis
BIAcore.
Ensayo de antigenicidad in vitro .
Las muestras de VLP de HPV del procedimiento de disolución de
aluminio estuvieron en una disolución estabilizante de pH
6-6,5 y fuerza iónica elevada (aproximadamente NaCl
0,5-1M, citrato sódico 0,1M) que contenía polisorato
80 al 0,02%. Las muestras se someten directamente a un análisis
BIAcore sin dilución adicional (utilizando anticuerpo neutralizador
específico de un tipo de VLP de HPV). Las muestras en disolución
(sin adyuvante de aluminio) se diluyeron hasta una concentración
objetivo en NaCl 0,5-1M aproximadamente antes del
análisis BIAcore. Todos los datos de antigenicidad in vitro
se refieren a una muestra control de VLP de HPV congelada (sin
aluminio adsorbido).
Análisis de concentración de proteína. Se
determinó la concentración de proteína de VLPs de HPV en las
soluciones en masa y en las muestras formuladas (después de la
disolución del aluminio) mediante la medida de espectros de
absorbancia UV a temperatura ambiente usando un espectrofotómetro HP
8452A Diode Array y una cubeta con una longitud de paso de 1 cm.
Los volúmenes de muestra usados fueron de 100-250
microlitros. La concentración de proteína se calculó usando una
técnica de análisis de derivada segunda de componente múltiple. Para
algunos experimentos, la concentración de proteína también se
determinó mediante análisis colorimétrico
BCA.
BCA.
Análisis de tamaño hidrodinámico. Se
determinó el tamaño hidrodinámico de VLPs de HPV no tratadas y
des/reen-
sambladas mediante dispersión de luz dinámica, ultracentrifugación analítica y SEC-HPLC.
sambladas mediante dispersión de luz dinámica, ultracentrifugación analítica y SEC-HPLC.
Las medidas de dispersión de luz dinámica se
desarrollaron a temperatura ambiente usando un Sistema de Dispersión
de Luz Malvern 4700 a 90ºC. El tamaño hidrodinámico aparente de VLPs
de HPV se determinó como diámetro hidrodinámico
medio-Z cada uno de los valores representa la media
de cinco medidas de la misma muestra.
Se desarrollaron experimentos de velocidad de
sedimentación usando una ultracentrífuga analítica Beckman XLI con
detección de UV a 280 nm. Se usaron dos procedimientos distintos
para determinar el coeficiente de sedimentación que incluyen modos
de velocidad fija y variable.
Las medidas de SEC-HPLC se
desarrollaron a temperatura ambiente usando un Sistema
Waters/Millenium 2690 con detectores de UV y de fluorescencia. Se
usó una columna PL-GFC 4000 \ring{A}
(preacondicionada con VLPs de HPV) a una tasa de flujo de 0,4
ml/minuto usando NaCl 750 mM, y tampón fosfato 25 mM (pH 7) como
fase móvil.
Análisis al microscopio electrónico. Se
desarrolló Microscopía Electrónica de Transmisión (MET) usando
tinción negativa. Las muestras se fijaron y tiñeron con ácido
fosfotúngstico y se examinaron en un Microscopio Electrónico de
Transmisión JEOL 1200 EX. Se tomaron micrografías de áreas
aleatorias con muestras preparadas múltiples veces a una
magnificación de entre 30000x y 40000x. Se introdujo una
magnificación adicional 3 veces superior al efectuar las impresiones
a partir de los negativos.
Estudios de estabilidad de almacenaje a
tiempo real y acelerados. Se llevaron a cabo estudios de la
estabilidad de almacenaje de la formulación
HPV-aluminio. La temperatura de los estudios de
estabilidad generalmente fue de 2-8, 15, 25, 30 y
37ºC. Datos previos de integridad conformacional con dicroísmo
circular y espectrocopía de fluorescencia han mostrado que al
incrementar la temperatura sobre los 40-45ºC, se
inducen cambios conformacionales significativos en la proteína L1 de
la VLP de HPV, una condición que sin duda necesita evitarse en
estudios de estabilidad de almacenaje acelerados.
También se evaluó la estabilidad térmica de la
VLP de HPV con ensayos de turbidez que se llevaron a cabo usando un
espectrofotómetro HP 8452A Diode Array equipado con un sistema de
software para UV y visible HP 845X y un sistema de control de la
temperatura. Se siguió la dispersión de luz de las disoluciones
(debido a la agregación de proteínas) a 350 nm bajo el modo cinético
del programa aumentando la temperatura desde 24ºC hasta 74ºC a un
ritmo controlado.
Prueba de potencia en ratón.- Se evaluó
la inmunogenicidad in vivo de VLPs de HPV en ratones BALB c.
Se adsorbieron muestras de VLPs de HPV sobre adyuvante de aluminio,
se diluyeron a varias concentraciones objetivo con adyuvante de
aluminio y se inyectaron a ratones. Se recogieron sueros y se
analizaron en busca de niveles de anticuerpo mediante la prueba
ELISA.
Ejemplo
2
Como se ve en la Figura 1, las VLPs de HPV 16 se
desensamblan después de la incubación en un tampón a pH 8,2 que
contiene TRIS o fosfato 10 mM, NaCl 0,166 M, EDTA 2 mM, y DTT 2 mM a
temperatura ambiente durante 20 minutos (curva del medio). La
muestra de HPV 16 desensamblado muestra un pico en el menor valor S
esperado para capsómeros de L1, sugiriendo un tamaño de pentámeros
de proteína L1 de HPV. La curva superior muestra que el HPV 16
desensamblado (capsómeros) se reensambló después en VLPs haciendo
diálisis en un tampón a pH 6,2 que contenía fosfato sódico 10 mM,
NaCl de 0,5 a 1 M, cloruro cálcico 2 mM en presencia de glicina o
citrato. La curva inferior muestra las VLPs de HPV 16 no
tratadas.
Ejemplo
3
La Figura 2 muestra Distribuciones del tamaño de
partícula de VLPs de HPV 16 que se desensamblaron y reensamblaron
como se describe en el Ejemplo 2 (línea discontinua) y de VLPs de
HPV 16 no tratadas (línea continua) según se determinó mediante
análisis de ultracentrifugación analítica. Los datos revelan que las
VLPs de HPV 16 des/reensambladas son más grandes y tiene una
distribución más homogénea, a juzgar por las posiciones y anchuras
de los picos, respectivamente. El análisis de microscopía
electrónica (ME) confirma el análisis de ultracentrifugación
analítica; muestra que las VLPs des/reensambladas son más homogéneas
y están presentes como partículas más redondeadas de tamaño uniforme
con udiámetro medio de aproximadamente 80-85 nm (no
se muestran los datos de ME). Las muestras no tratadas parecen ser
más pequeñas y con una forma más heterogénea y una distribución del
tamaño con un tamaño medio de alrededor de 50-68 nm.
De manera similar, un conjunto posterior de datos muestra que las
VLPs de HPV 16 no tratadas tienen un tamaño medio de aproximadamente
40 nm, mientras las VLPs de HPV 16 reensambladas tienen un tamaño
medio de aproximadamente 60 nm.
Ejemplo
4
Las VLPs de HPV 16 des/reensambladas así como
las VLPs de HPV 16 no tratadas se adsorbieron sobre adyuvante de
aluminio (a 160 mcg/ml de proteína y 450 mcg/ml de Al) y se
formularon en NaCl 0,32 M, histidina 10 mM, polisorbato 80 al
0,015%, pH 6,2. Se evaluó la antigenicidad in vitro de las
muestras en tiempos identificados mediante análisis BIAcore.
En la Figura 3, se muestran las VLPs de HPV 16
desensambladas y reensambladas con círculos rellenos y cuadrados
vacíos; y las no tratadas son rombos rellenos. El Ensayo 1 contenía
citrato y el Ensayo 2 tiene glicina en el tampón de reensamblaje.
Los datos demuestran que el procedimiento de des/reensamblaje
provoca un aumento significativo y acusado en la estabilidad de
almacenaje acelerada de las VLPs de HPV 16 adsorbidas sobre
adyuvante de aluminio en comparación con las VLPs de HPV no
tratadas. No se observó pérdida de antigenicidad in vitro de
las VLPs de HPV des/reensambladas adsorbidas de aluminio en
experimentos similares desarrollados a 25ºC y a 4ºC tres
meses
después.
después.
Ejemplo
5
80 mcg/l de VLPs de HPV 16 des/reensambladas así
como VLPs de HPV 16 no tratadas se incubaron en NaCl 0,15 M,
histidina 10 mM, polisorbato 80 al 0,015%, pH 6,2 a 37ºC. Se evaluó
la antigenicidad in vitro de las muestras en tiempos
identificados mediante análisis BIAcore. Los datos demuestran que el
procedimiento de des/reensamblaje provoca un aumento significativo
en la estabilidad de almacenaje acelerada de las VLPs de HPV 16 en
comparación con las VLPs de HPV no tratadas. Esto se muestra en la
Figura 4, en la que las VLPs desensambladas y reensambladas son
círculos vacíos y cuadrados vacíos; las VLPs no tratadas son rombos
rellenos. El Ensayo 1 contiene citrato y el Ensayo 2 tiene glicina
en el tampón de reensamblaje.
\newpage
Ejemplo
6
Se aplicó un protocolo estándar de puntos de
nube a las muestras: calentamiento desde 24ºC hasta 74ºC a un ritmo
controlado monitorizando la densidad óptica de la disolución a 350
nm. Como se muestra en la Figura 5, se analizaron tres conjuntos
distintos de VLPs de HPV 16 (conjuntos 1,2,3) antes (líneas
discontinuas y símbolos vacíos) y después (líneas continuas y
símbolos rellenos) del tratamiento de des/reensamblaje. Entre estas
muestras, el conjunto 1 de VLPs de HPV 16 se probó tres veces. Los
datos demuestran que el procedimiento de des/reensamblaje provoca
un aumento significativo de la estabilidad intrínseca de las VLPs de
HPV 16 contra la agregación inducida por calor. Además de los
aumentos de la estabilidad térmica, el tratamiento del procedimiento
de des/reensamblaje provoca un perfil de estabilidad más consistente
y homogéneo.
Ejemplo
7
Se evaluó además la antigenicidad in
vitro de las no tratadas y las des/reensambladas con un conjunto
VLPs de HPV 16 en las que sendas VLPs no tratadas y
des/reensambladas se evaluaron antes y después de la adsorción al
adyuvante de aluminio. Se midió la antigenicidad in vitro
mediante análisis BIAcore y la concentración de proteína mediante
espectroscopia de fluorescencia y prueba colorimétrica BCA. La
relación de antígeno a proteína se determinó después para sendas
VLPs de HPV 16 no tratadas y des/reensambladas. La antigenicidad
in vitro de las VLPs de HPV 16 des/reensambladas aumentó
aproximadamente en un 50%. Por ejemplo, la relación de antígeno a
proteína para VLPs de HPV 16 des/reensambladas frente a las no
tratadas fue de 1,7 con un intervalo de 1,5-1,9.
Esta observación fue confirmada mediante análisis EIA (media de 1,6
e intervalo de 1,4-1,8) y análisis IVRP (media de
1,4 e intervalo de 1,3-1,5).
Se evaluó la inmunogenicidad in vivo de
VLPs de HPV 16 no tratadas y de las adsorbidas sobre aluminio
des/reen-
sambladas con una prueba de potencia en ratones. Esta prueba genera un valor de ED50 que representa la dosis (mcg) de VLPs de HPV en las que más del 50% de los ratones serotransforman. La inmunogenicidad in vivo de las VLPs de HPV 16 des/reensambladas fue equivalente a, o mejor que, las VLPs de HPV 16 no tratadas. Un experimento muestra un valor ED de 0,034-0,062 para dos muestras des/reensambladas frente a un valor de ED de 0,146 para la muestra no tratada. En un segundo experimento con ratón, se obtuvo un valor e ED < 0,0125 para tres muestras de VLPs de HPV des/reensambladas frente a un valor de ED de 0,074 para la muestra no tratada.
sambladas con una prueba de potencia en ratones. Esta prueba genera un valor de ED50 que representa la dosis (mcg) de VLPs de HPV en las que más del 50% de los ratones serotransforman. La inmunogenicidad in vivo de las VLPs de HPV 16 des/reensambladas fue equivalente a, o mejor que, las VLPs de HPV 16 no tratadas. Un experimento muestra un valor ED de 0,034-0,062 para dos muestras des/reensambladas frente a un valor de ED de 0,146 para la muestra no tratada. En un segundo experimento con ratón, se obtuvo un valor e ED < 0,0125 para tres muestras de VLPs de HPV des/reensambladas frente a un valor de ED de 0,074 para la muestra no tratada.
Ejemplo
8
Se incubaron 80 mcg/ml de VLPs de HPV en una
disolución que contenía NaCl 0,32 M, histidina 10 mM, polisorbato 80
al 0,015%, pH 6,2 a 37ºC. Se evaluó la antigenicidad in vitro
de las muestras mediante análisis BIAcore en los tiempos indicados
en la Figura 6. Los datos indican que el tratamiento de
des/reensamblaje provoca un aumento acusado de la estabilidad para
las VLP de HPV tipos 6a, 11 y 16 en disolución durante la prueba de
estabilidad de almacenaje acelerada. Las VLPs de HPV 18 no tratadas
muestran un perfil de estabilidad similar al de las VLPs
des/reensambladas para los otros tres tipos. No se observa aumento
significativo de la estabilidad con el tratamiento de las VLPs de
HPV 18 debido probablemente a la incapacidad del tratamiento de
des/reensamblaje para afectar a las VLPs de HPV 18 (no se muestran
los datos). Las muestras usadas para este estudio se generan con
procedimientos de desensamblaje de baja salinidad. La recuperación
de masa proteica para los cuatro tipos a través del tratamiento de
des/reensamblaje fue aproximadamente del 85-95% para
VLPs de HPV 11, 16 y 18 y aproximadamente del 60-70%
para VLPs de HPV 6a. El rendimiento a través del tratamiento de
des/reensamblaje parece verse afectado por la calidad del conjunto
específico de VLP de HPV en términos de agregación de VLP. El
rendimiento de masa proteica a través del tratamiento de
des/reensamblaje aumenta hasta casi el 100% cuando el procedimiento
de desensamblaje tiene lugar bajo condiciones de alta salinidad. El
análisis de las VLPs de HPV des/reensambladas mediante
ultracentrifugación analítica sugiere que el tratamiento de
des/reensamblaje provoca un reensamblaje casi cuantitativo de
capsómeros en las VLPs.
La Figura 7 muestra la estabilidad acelerada y
de almacenaje de VLPs de HPV adsorbidas sobre adyuvante de aluminio
en las que se adsorbieron 400 mcg/ml de VLPs de HPV sobre 450 mcg/ml
de adyuvante de aluminio y se incubaron en una disolución que
contenía NaCl 0,32 M, histidina 10 mM, polisorbato 80 al 0,015%, pH
6,2 a 4ºC, 15ºC, 25ºC, 30ºC y 37ºC. Se evaluó la antigenicidad in
vitro de las muestras mediante análisis BIAcore en los tiempos
indicados en la figura después del tratamiento en una disolución de
citrato para liberar al antígeno del adyuvante de aluminio. Los
datos indican que el tratamiento de des/reensamblaje provoca un
aumento acusado de la estabilidad para las VLP de HPV tipos 6a, 11 y
16 adsorbidas sobre aluminio durante la prueba de estabilidad de
almacenaje acelerada. Las VLPs de HPV 18 no tratadas muestran un
perfil de estabilidad similar al de las VLPs des/reensambladas para
los otros tres tipos. No se observa aumento significativo de la
estabilidad con el tratamiento de las VLPs de HPV 18
desensambladas/reensambladas.
Ejemplo
9
Se evaluaron las muestras mediante análisis de
puntos de nube y análisis de ultracentrifugación analítica. En el
procedimiento de baja salinidad, las VLPs de HPV se desensamblan en
NaCl 0,166 M, solución TRIS 10 mM (pH 8,2) mientras en el
procedimiento de alta salinidad, las VLPs de HPV se desensamblan en
NaCl 0,63 M, fosfato 35 mM y solución TRIS 100 mM (pH 8,2). Ambas
soluciones contienen también EDTA y polisorbato 80. Los datos, como
se ve en la Figura 8, muestran que las VLPs de HPV
desensambladas/reensambladas preparadas mediante los procedimientos
de baja y alta salinidad son similares atendiendo a su estabilidad
térmica y distribución de tamaño hidrodinámico para VLPs de HPV
tipos 11, 6a y 16.
Se analizaron VLPs de HPV (tipos 11, 16 y 6a)
des/reensambladas (Figura 9, línea continua) y no tratadas (línea
discontinua) en una columna de exclusión 4000A GPC. Se obtuvo un
pico sencillo a partir de las VLPs de HPV des/reensambladas
comparadas con una distribución más heterogénea de las VLPs de HPV
no tratadas. Los picos de monómero de las VLPs de HPV
des/reensambladas tiene un volumen de dilución menor que los picos
de monómero de las VLPs de HPV no tratadas, sugiriendo un tamaño de
partícula relativamente mayor para las VLPs des/reensambladas. Las
áreas de pico totales relativamente mayores de las VLPs de HPV
des/reensambladas indican una tasade recuperación superior de las
VLPs des/reensambladas, sugiriendo que las VLPs des/reensambladas
tienen menor afinidad a la columna que las VLPs no tratadas. Las
VLPs de HPV 18 no tratadas muestran un perfil de SEC HPLC similar al
de las VLPs des/reensambladas para los otros tres tipos.
Claims (29)
1. Un procedimiento para fabricar una vacuna del
papilomavirus humano que comprende partículas análogas al virus HPV
(VLPs), comprendiendo el procedimiento las etapas de:
- (a)
- incubar VLPs en una mezcla de disociación que comprende ditiotreitol (DTT) 2-20 mM, una sal presente en un intervalo equivalente a NaCl de 0,10M a 0,2M, un tensioactivo no iónico, un agente quelante de metal, y un tampón hasta que se produzca el desensamblaje de las VLPs;
- (b)
- retirar el agente reductor de la mezcla de disociación; y
- (c)
- reensamblar las VLPs desensambladas.
2. Un procedimiento para fabricar una vacuna del
papilomavirus humano que comprende partículas análogas al virus HPV
(VLPs), comprendiendo el procedimiento las etapas de:
- (a)
- incubar VLPs en una mezcla de disociación que comprende ditiotreitol (DTT) 2-20 mM, una sal presente en un intervalo equivalente a NaCl de 0,50M a 1,25M, un tensioactivo no iónico, un agente quelante de metal, y un tampón hasta que se produzca el desensamblaje de las VLPs;
- (b)
- retirar el agente reductor de la mezcla de disociación; y
- (c)
- reensamblar las VLPs desensambladas.
3. Un procedimiento de acuerdo con la
Reivindicación 1 ó 2 en el que la sal de la mezcla de disociación se
selecciona entre NaCl, KCl, Na_{2}SO_{4},
(NH_{4})_{2}SO_{4}, fosfato sódico, citrato sódico y
mezclas de los mismos, y es preferible NaCl.
4. Un procedimiento de acuerdo con la
Reivindicación 3 en el que la sal de la mezcla de disociación es
NaCl.
5. Un procedimiento de acuerdo con la
Reivindicación 1, 2, 3 ó 4 en el que el tensioactivo no iónico de la
mezcla de disociación se selecciona entre polisorbato 80,
Polisorbato 20, alquil éteres de polioxietileno, Triton
X-100®, Triton X-114®,
NP-40®, Span 85 y un tensioactivo Plurónico no
iónico.
6. Un procedimiento de acuerdo con la
Reivindicación 5 en el que el tensioactivo no iónico es polisorbato
80 al 0,01-0,5%.
7. Un procedimiento de acuerdo con cualquier
reivindicación anterior en el que el tampón de la mezcla de
disociación es TRIS o tampón fosfato, a pH 7-10.
8. Un procedimiento de acuerdo con cualquier
reivindicación anterior en el que el agente quelante de la mezcla de
disociación es EDTA 0,5-5 mM.
9. Un procedimiento de acuerdo con cualquier
reivindicación anterior en el que la etapa (a) tiene lugar durante
menos de una hora a temperatura ambiente.
10. Un procedimiento de acuerdo con la
Reivindicación 9 en el que la etapa (a) tiene lugar durante
30-40 minutos a temperatura ambiente.
11.Un procedimiento de acuerdo con cualquier
reivindicación anterior en el que la etapa (b) comprende una etapa
de diálisis o diafiltración/ultrafiltración.
12. Un procedimiento de acuerdo con la
Reivindicación 11 en el que la etapa de diálisis comprende una
diálisis o diafiltración/ultrafiltración contra una solución de sal
fisiológica o una concentración mayor de sal, tensioactivo no
iónico, y tampón a un pH inferior del que está presente en la mezcla
de disociación.
13. Un procedimiento de acuerdo con la
Reivindicación 11 en el que la etapa de diálisis comprende una
diálisis o diafiltración/ultrafiltración en un tampón de
reensamblaje, comprendiendo dicho tampón de reensamblaje: sal de
fuerza iónica en el intervalo de NaCl de 0,5-1,35 M,
una fuente de ión metálico, y un tampón a pH
6,0-6,5.
14. Un procedimiento de acuerdo con cualquier
reivindicación anterior en el que la etapa (c) comprende una
diálisis o diafiltración/ultrafiltración en un tampón de
reensamblaje, comprendiendo el tampón de reensamblaje: sal de fuerza
iónica en el intervalo de NaCl de 0,5-1,35 M, una
fuente de ión metálico, y un tampón a pH
6,0-6,5.
15. Un procedimiento de acuerdo con la
Reivindicación 14 en el que la fuente de ión metálico es una fuente
de Ca+^{2} ó de Mg+^{2}.
16. Un procedimiento de acuerdo con la
Reivindicación 15 en el que la fuente de ión metálico es CaCl_{2},
o MgCl_{2} a 0,5-5,0 mM.
17. Un procedimiento de acuerdo con la
Reivindicación 13, 14 ó 15 en el que el tampón comprende a) glicina
y fosfato, b) citrato y fosfato; o c) citrato.
18. Un procedimiento de acuerdo con la
Reivindicación 17 en el que el tampón de reensamblaje comprende NaCl
1 M, Ca+^{2} 2 mM, citrato 50 M, pH 6,2 y polisorbato 80 al
0,03%.
19. Un procedimiento de acuerdo con cualquier
reivindicación anterior que además comprende: (d) purificar además
con una etapa de diálisis que comprende un tampón final que
comprende: NaCl 0,25-1,25 M y un detergente no
iónico.
20. Un procedimiento de acuerdo con la
Reivindicación 19 en el que el tampón final además comprende un
tampón de histidina a pH 6,0-6,5.
21. Un procedimiento de acuerdo con la
Reivindicación 19 ó 20 en el que el detergente no iónico es
polisorbato 80 ó polisorbato 20.
22. Un procedimiento de acuerdo con cualquier
reivindicación anterior que además comprende adsorber las VLPs
des/reensambladas sobre adyuvante de aluminio.
23. Un procedimiento de acuerdo con cualquier
reivindicación anterior en el que las VLPs se seleccionan entre HPV
6a, HPV 6b, HPV 11, HPV 16, y HPV 18, y combinaciones de las
mismas.
24. Un procedimiento para fabricar vacuna del
papilomavirus humano que comprende partículas análogas al virus HPV
(VLPs), comprendiendo el procedimiento las etapas de:
- (a)
- incubar VLPs en una mezcla de disociación de baja salinidad durante 30-40 minutos, comprendiendo la mezcla de disociación: NaCl 0,16-0,18 M, DTT 2-20 mM, Polisorbato 80 al 0,01-0,03%, EDTA 0,5-5 mM y tampón TRIS 5-15 mM, a pH 8,2 para producir VLPs desensambladas;
- (c)
- reensamblar las VLPs desensambladas usando diálisis contra un tampón de reensamblaje, comprendiendo el tampón de reensamblaje:; NaCl 1,0 M, CaCl_{2} 2 mM; y un tampón de pH 6,2 seleccionado entre el grupo constituido por: citrato sódico 50 mM, glicina 50 mM y fosfato; y citrato 50 mM; y
- (d)
- purificar después las VLPs reensambladas usando diálisis contra un tampón final que comprende NaCl 0,5 M, e histidina 10 mM, pH 6,2.
25. Un procedimiento de acuerdo con la
Reivindicación 24 que además comprende, como etapa (b), eliminar el
DTT de la mezcla de disociación usando una diálisis contra un tampón
que comprende NaCl 0,16-0,18 M, polisorbato 80 al
0,01-0,03% y fosfato 10 mM a pH 7,0.
26. Un procedimiento de acuerdo con la
Reivindicación 24 ó 25, que además comprende:
- (e)
- adsorber las VLPs reensambladas de la etapa (d) sobre adyuvante de aluminio.
27. Un procedimiento para fabricar una vacuna
del papilomavirus humano (HPV) de almacenaje estable que comprende
partículas análogas al virus HPV (VLPs), comprendiendo el
procedimiento las etapas de:
- (a)
- incubar VLPs en una mezcla de disociación de alta salinidad durante 30-40 minutos, comprendiendo la mezcla de disociación: NaCl 0,5-1,25 M, DTT 2-20 mM, Polisorbato 80 al 0,01-0,03%, EDTA 0,5-5 mM y tampón TRIS 5-100 mM, y fosfato 0-50 mM a pH 8,2 para producir VLPs desensambladas;
- (c)
- reensamblar las VLPs desensambladas usando diálisis contra un tampón de reensamblaje, comprendiendo el tampón de reensamblaje: NaCl 1,0-1,35 M, CaCl_{2} 2 mM; y un tampón de pH 6,2 seleccionado entre el grupo constituido por: citrato sódico 50 mM, glicina 50 mM y fosfato; y citrato 50 mM; y
- (d)
- purificar después las VLPs reensambladas usando diálisis contra un tampón final que comprende NaCl 0,5 M, e histidina 10 mM, pH 6,2.
28. Un procedimiento de acuerdo con la
Reivindicación 27, que además comprende, como etapa (b), eliminar el
DTT de la mezcla de disociación usando una diálisis contra un tampón
que comprende al menos NaCl 1 M, polisorbato 80 al
0,01-0,03% y fosfato 10 mM a pH 7,0.
29. Un procedimiento de acuerdo con la
Reivindicación 27 ó 28, que además comprende:
- (e)
- adsorber las VLPs reensambladas de la etapa (d) sobre adyuvante de aluminio.
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