ES2270822T3

ES2270822T3 - Procedimiento para preparar una vacuna del papilomavirus humano con particulas analogas a virus desensambladas y reensambladas.

Info

Publication number: ES2270822T3
Application number: ES00918248T
Authority: ES
Inventors: David B. Volkin; Henryk Mach; Li Shi
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1999-03-26
Filing date: 2000-03-22
Publication date: 2007-04-16
Anticipated expiration: 2020-03-22
Also published as: DE122007000033I1; LU91326I2; AU778937B2; DE122007000034I1; NL300269I2; AR023166A1; CY2007009I2; NL300268I1; KR20020013516A; LU91327I9; CY1105779T1; DE60030698D1; WO2000057906A1; LU91328I2; ATE339222T1; CY2007010I2; US6245568B1; CA2368391A1; LU91326I9; CY2007009I1

Abstract

Un procedimiento para fabricar una vacuna del papilomavirus humano que comprende partículas análogas al virus HPV (VLPs), comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) incubar VLPs en una mezcla de disociación que comprende ditiotreitol (DTT) 2-20 mM, una sal presente en un intervalo equivalente a NaCl de 0, 10M a 0, 2M, un tensioactivo no iónico, un agente quelante de metal, y un tampón hasta que se produzca el desensamblaje de las VLPs; (b) retirar el agente reductor de la mezcla de disociación; y (c) reensamblar las VLPs desensambladas.

Description

Procedimiento para preparar una vacuna del papilomavirus humano con partículas análogas a virus desensambladas y reensambladas.

Breve descripción de la invención

Esta Invención revela una vacuna del papilomavirus (HPV) que contiene partículas análogas a virus (VLPs) que se han desensamblado en capsómeros y después se han vuelto a ensamblar en VLPs. Esta invención también se relaciona con procedimientos de elaboración de esta vacuna originando VLPs de HPV más homogéneos y una estabilidad de almacenaje enormemente mejorada.

Antecedentes de la invención

El Papilomavirus Humano (HPV) infecta el tracto genital y se ha asociado con diversas displasias, cánceres, y otras enfermedades. Estas enfermedades son actualmente el objetivo para el desarrollo de vacunas y las vacunas que contienen partículas análogas a virus (VLPs) que contienen proteínas L1 o la combinación de proteínas L1 + L2 figuran actualmente en ensayos clínicos.

Se ha encontrado, sin embargo, que la proteína L1 recombinante de VLPs de HPV purificada a partir de levaduras no son estables durante almacenajes a largo plazo, ni en disolución ni adsorbidas sobre partículas adyuvantes de aluminio.

En el pasado, varios investigadores han investigado las condiciones de ensamblaje y desensamblaje de VLP de HPV. Por ejemplo, McCarthy et al., 1998, "Quantitative Disassembly and Reassembly of Human Papillomavirus Tipo 11 Viruslike Particles in vitro" J. Virology 72(1):32-41, describe el desensamblaje y reensamblaje de L1 recombinantes de VLPs 11 de HPV purificadas a partir de células de insecto para obtener una preparación homogénea de VLPs. Se usó una incubación prolongada (aproximadamente 16 horas a 4ºC) con una concentración relativamente alta de agente reductor a una fuerza iónica fisiológica para desensamblar las VLPs, y se usó la retirada del agente reductor a una fuerza iónica superior para reensamblar las VLPs. Este procedimiento, no obstante, consume bastante tiempo.

Para desarrollar una vacuna útil comercialmente, se necesita una formulación de almacenaje estable. Sería deseable tener un procedimiento de tratamiento sencillo, rápido y cuantitativo para fabricar una formulación de VLP de HPV estable de almacenaje.

Descripción detallada de la invención

Esta invención se relaciona con un procedimiento para fabricar partículas análogas a virus (VLPs) del papilomavirus humano estables.

En algunas formas de realización las VLPs reensambladas se adsorben sobre un adyuvante de aluminio.

Esta invención también se relaciona con la fabricación de VLPs mediante un procedimiento que comprende los pasos de:

(a): incubar VLPs purificadas en una mezcla de disociación con alto contenido en sales que comprende ditiotreitol (DTT) 2-20 mM, una sal presente en un intervalo equivalente a NaCl de 0,5M a 1,25M, un tensioactivo no iónico, un agente quelante de metal, y un tampón hasta que se produzca el desensamblaje de las VLPs;

(b): retirar el agente reductor de la mezcla de disociación; y

(c): reensamblar las VLPs desensambladas; y

(d): adsorber opcionalmente las VLPs de HPV reensambladas sobre adyuvante de aluminio.

Otra forma de realización de esta invención se relaciona con las VLPs fabricadas mediante un procedimiento que comprende los pasos de:

(a): incubar VLPs purificadas en una mezcla de disociación con bajo contenido en sales que comprende (DTT) 2-20 mM, una sal presente en un intervalo equivalente a NaCl de 0,10M a 0,2M, un tensioactivo no iónico, un agente quelante de metal, y un tampón hasta que se produzca el desensamblaje de las VLPs;

(b): retirar el agente reductor de la mezcla de disociación; y

(c): reensamblar las VLPs desensambladas; y

La invención también se relaciona con formulaciones de vacuna que comprenden VLPs fabricadas mediante el procedimiento anterior, y que se almacenan en un tampón de formulación. El tampón de formulación comprende una sal, un tampón de histidina, y un tensioactivo no iónico.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es un gráfico que muestra el desensamblaje y reensamblaje de VLPs de HPV 16 según se determinó mediante análisis de ultracentrifugación analítica.

La Figura 2 es un gráfico que muestra distribuciones de tamaño de partículas de VLPs de HPV 16 des/reensambla-
das (línea discontinua) y VLPs de HPV 16 no tratadas (línea continua) según se determinó mediante análisis de ultracentrifugación analítica.

La Figura 3 es un gráfico que muestra la estabilidad de almacenaje acelerada (37ºC) de formulaciones de vacuna de aluminio-16 de HPV según se determinó mediante antigenicidad in vitro via análisis BIAcore.

La Figura 4 muestra la estabilidad de almacenaje acelerada de VLPs de HPV 16 en solución salina fisiológica según se determinó mediante antigenicidad in vitro via análisis BIAcore.

La Figura 5 muestra el efecto del tratamiento de des/reensamblaje sobre la estabilidad térmica de distintas cantidades de VLPs de HPV 16 según se determinó dirigiendo una agregación inducida térmicamente mediante turbidez UV (análisis de puntos de nube).

La Figura 6A-D muestra la estabilidad de almacenaje acelerada (37ºC) de cuatro tipos distintos (HPV 16, 11, 6a, 18) de VLPs de HPV des/reensambladas así como VLPs de HPV control no tratadas en disolución según se determinó mediante antigenicidad in vitro via análisis BIAcore. La Figura 6A es HPV 6A; La Figura 6B es HPV 11; La Figura 6C es HPV 16; y La Figura 6D es HPV 18.

Las Figuras 7A-D muestran la estabilidad de almacenaje acelerada de cuatro tipos distintos (HPV 16, 11, 6a, 18) de VLPs de HPV des/reensambladas así como VLPs de HPV control no tratadas adsorbidas sobre adyuvante de aluminio. Las Figuras 7A y 7B son HPV 6A; las Figuras 7C y 7D son HPV 11; las Figuras 7E y 7F son HPV 16; y las Figuras 7G y 7H son HPV 18.

Las Figuras 8A-F son comparaciones de la estabilidad térmica y la distribución de tamaño hidrodinámico de VLPs de HPV 6a, HPV11 y HPV 16 desensambladas/reensambladas, preparadas a partir de un procedimiento de desensamblaje en condiciones fisiológicas próximas (procedimiento de baja salinidad) o a concentraciones de sal superiores (procedimiento de alta salinidad). Estas propiedades físicas de las VLPs de HPV redeterminaron mediante análisis de puntos de nube y análisis de ultracentrifugación analítica. En el procedimiento de baja salinidad, las VLPs de HPV se desensamblan en NaCl 0,166 M, solución TRIS 10 mM (pH 8,2) mientras en el procedimiento de alta salinidad, las VLPs de HPV se desensamblan en NaCl 0,63 M, Fosfato 35 mM, y solución TRIS 100 mM (pH 8,2). Ambas soluciones contienen además EDTA y polisorbato 80. Las Figuras 8A y 8B muestran los datos del punto de nube y la ultracentrifugación analítica de las VLPs de HPV 6A; Las Figuras 8C y 8D muestran los mismos análisis con las VLPs de HPV 11; Las Figuras 8E y 8F muestran los mismos análisis con las VLPs de HPV 16.

Las Figuras 9A-D son la distribución por tamaño de partícula y afinidad de superficie de VLPs de HPV no tratadas y des/reensambladas según se midió mediante análisis SEC-HPLC. La Figura 9A es HPV 6a; la Figura 9B es HPV 11; la Figura 9C es HPV 16; y la Figura 9D es HPV 18.

Esta invención se relaciona con un procedimiento para producir VLPs de HPV más estables que se ha encontrado que contribuyen significativamente a la estabilidad global de una formulación e vacuna del HPV. Las VLPs de HPV se producen, se desensamblan presumiblemente en capsómeros, se reensamblan en VLPs, y se usan como ingrediente activo en una vacuna de formulación.

De acuerdo con esta invención, se puede usar cualquier tipo de VLPs de HPV como la porción antigénica de la vacuna de formulación. Las VLPs pueden contener sólo proteína L1, o pueden contener sendas proteínas L1 y L2. Las proteínas pueden ser de una composición de aminoácidos de tipo silvestre, o pueden contener mutaciones. Se prefieren las VLPs que contienen sólo proteína L1, que es de una composición de aminoácidos de tipo silvestre.

Los HPVs preferidos son aquellos asociados a la enfermedad, incluyendo pero sin limitarse a: HPV 1, HPV 2, HPV 3, HPV 4, HPV 6a, HPV 6b, HPV 7, HPV 10, HPV 11, HPV 16, y HPV 18, HPV 34, HPV 39, HPV 41-44 y HPV 51-55. Los HPVs preferidos incluyen HPV 6a, HPV 6b, HPV 11, HPV 16, y HPV 18. Además, las formulaciones de esta invención son apropiadas para combinaciones de tipos de HPV, incluyendo vacunas multivalentes que contiene una pluralidad de antígenos de HPV, tales como una combinación de HPV 6, 11, 16 y 18.

Se prefiere que las VLPs se fabriquen mediante técnicas de recombinantes, como se conoce en la técnica. Se prefiere particularmente que la célula huésped usada para fabricar las VLPs sea una célula de levadura, aunque otros tipos celulares, tales como células bacterianas, de insecto o de mamífero se conocen y se usan actualmente como huéspedes. Sin querer estar limitados por la teoría, parece que el estatus de los puentes disulfuro en la proteína L1 de una VLP puede variar dependiendo de la célula huésped usada para expresar la L1 recombinante así como el subsiguiente procedimiento de purificación. McCarthy et al. 1998, supra describe algunos trímeros de L1 de uniones cruzadas disulfuro en VLPs recombinantes producidas en células de insecto. Por otra parte, de acuerdo con esta invención, el estatus del puente disulfuro en la proteína L1 de VLPs producidas en levaduras puede variar y por tanto requerir distintas condiciones para un desensamblaje y reensamblaje óptimos.

Para algunas formulaciones, se desea un producto adsorbido sobre aluminio. Generalmente en este caso, la concentración de VLPs de HPV que están adsorbidas sobre aluminio es de aproximadamente 10-200 mcg/ml para cada tipo de VLP de HPV. Esto se puede ajustar, dependiendo de factores tales como la antigenicidad del tipo particular de HPV, y de la presencia de múltiples tipos de HPVs en una vacuna de tipo "cóctel".

Desensamblaje

Después de producir las VLPs en las células huésped recombinantes y de purificarlas, se desensamblan incubándolas en una mezcla de disociación. El desensamblaje se conduce básicamente mediante la reducción de puentes disulfuro con ditiotreitol (DTT) en un intervalo relativamente amplio de ambientes con fuerza iónica que varían desde el fisiológico (también referido como "procedimiento de baja salinidad") hasta NaCl 1,25 M ((también referido como "procedimiento de alta salinidad"). La mezcla de disociación comprende un agente reductor, una sal, un tensioactivo no iónico, un agente quelante de metal y un tampón.

El agente reductor es ditiotreitol (DTT), aunque se sabe que pueden usarse otros agentes reductores. En el pasado, se han usado otros agentes reductores (tales como beta-mercaptoetanol, \beta-ME) para desensamblar partículas de HPV (ver, p.ej. McCarthy et al, supra), pero han empleado una concentración relativamente alta de agente reductor (5%, o 713 mM de \beta-ME). Por el contrario, una característica de la presente invención es el uso de una concentración relativamente baja de agente reductor.

Para los objetos de la especificación y las reivindicaciones, el término "concentración relativamente baja de agente reductor" significa desde aproximadamente 2 mM hasta 20 mM si se usa DTT como agente reductor, o si se emplea un agente reductor alternativo, la cantidad del agente reductor alternativo que tendría aproximadamente el mismo efecto que al emplear DTT 2-20 mM. Una cantidad preferida de agente reductor es aproximadamente DTT 10 mM.

Otro componente importante de la mezcla de disociación es la sal. Generalmente, la fuerza iónica de la mezcla de disociación se mantiene por la presencia de sales. Se puede usar casi cualquier sal que pueda contribuir al control de la fuerza iónica. Son sales preferidas que se pueden usar para ajustar la fuerza iónica cualquier sal fisiológicamente aceptable, tales como NaCl, KCl, Na_{2}SO_{4}, (NH_{4})_{2}SO_{4}, fosfato sódico, citrato sódico y mezclas de los mismos. Son sales particularmente preferidas: NaCl, KCl, Na_{2}SO_{4}, y especialmente NaCl.

En una forma de realización de baja salinidad de esta invención, la mezcla de disociación debería tener una fuerza iónica que sea aproximadamente fisiológica. Para objetos de esta especificación y reivindicaciones, el término "aproximadamente fisiológica" cuando se refiere a una sal, significa 0,10-0,20 M, y preferiblemente sobre 0,15-0,18 M, y más preferiblemente sobre 0,16 M cuando reemplea NaCl como sal. Para otras sales que se pueden usar, está dentro de la habilidad del artesano el calcular la molaridad que sería equivalente de una solución aproximadamente fisiológica de NaCl.

Alternativamente, la disociación puede tener lugar en un ambiente de alta salinidad. Usado aquí, "alta salinidad" significa al menos 0,5 M de sal, y al menos 10 mM de agentes tamponadores. Un intervalo preferido para la alta salinidad es de 0,5 a 1,25 M, si la sal usada es NaCl, y un intervalo más preferido es de 0,60 a 1 M. Para otras sales, está dentro de la habilidad del artesano el determinar la molaridad que sería equivalente de una solución de 0,5 M a 1,25 M de NaCl.

El uso afortunado de un procedimiento de desensamblaje de alta salinidad fue bastante inesperado - informes documentados tales como Brady et al., 1977 Virology 23: 717-724, Belnap et al., 1995 J. Mol. Biol. 259: 249-263 y la solicitud de la patente publicada WO 99/13056 limitan la concentración de sal a menos de 0,5 M de NaCl. Sin embargo, se ha encontrado que el uso de un desensamblaje de alta salinidad es conveniente en que la alta salinidad limita la posible agregación de proteínas, provoca una mejor recuperación de masa proteica, y además permite que se inicie el tratamiento de des/reensamblaje en el paso de cromatografía para la purificación final, reduciendo de este modo el número de pasos de procesado necesarios durante la purificación.

Sorprendentemente se ha encontrado que una solución de alta salinidad preferida (tal como NaCl 1,0 M, tampón TRIS 10 mM, pH 8,2, EDTA 2 mM, polisorbato 80 al 0,03% y DTT 2-20 mM) provoca una recuperación de masa de proteína de HPV de aproximadamente el 100% en el procedimiento. También se prefiere otra solución de alta salinidad (NaCl 0,63 M, tampón fosfato 35 mM, tampón TRIS 100 mM, pH 8,2, EDTA 2 mM, polisorbato 80 al 0,03% y DTT 2-20 mM).

Para comprender y caracterizar mejor el efecto de la concentración de alta salinidad sobre la eficacia del desensamblaje de la VLP de HPV, se llevaron a cabo estudios comparativos bajo condiciones de desensamblaje de alta (NaCl 0,5-1,0 M) y baja (fisiológica) salinidad. Se monitorizaron los cambios en la intensidad de difusión de luz estática para evaluar el desensamblaje de VLP. Se observó que los resultados eran bastante similares para sendas concentraciones de alta salinidad y salinidad fisiológica - el desensamblaje total de VLP tuvo lugar aproximadamente a los dos minutos de la adición de DTT (20 mM). Además la cinética de desensamblaje parece estar controlada por la concentración de agente reductor en lugar de por la concentración de sal, correlacionándose la mayor concentración de agente reductor con un desensamblaje más rápido a una temperatura y pH dados.

Se examinaron otras propiedades biofísicas de las VLPs desensambladas y reensambladas en sales fisiológicas o en alta concentración. La estabilidad térmica y las distribuciones de tamaño hidrodinámico para VLPs de desensamblaje/reensamblaje generadas bajo condiciones de alta y baja salinidad son similares. Sin embargo, la recuperación de masa proteica total fue relativamente mayor (próxima al 100%) para VLPs de HPV desensamblaje/reensamblaje generadas con procedimientos de alta salinidad.

Otro componente de la mezcla de disociación es un tensioactivo no iónico. El tensioactivo no iónico se puede seleccionar entre el grupo constituido por: polisorbato 80, Polisorbato 20, alquil éteres de polioxietileno, Triton X-100®, Triton X-114®, NP-40®, Span 85 y un miembro de la serie Plurónica de tensioactivos no iónicos. Se prefiere particularmente el Polisorbato 80. Una concentración preferida de Polisorbato es de aproximadamente 0,01-0,50%, y preferiblemente de aproximadamente 0,01-0,10%, y especialmente sobre el 0,03%.

Debería controlarse el pH de la mezcla de disociación mediante la presencia de un tampón. El desensamblaje de VLPs de HPV puede tener lugar en un intervalo amplio de pH básicos tales como desde 7,0 hasta 10. Un pH preferido es 8,0-8,5, y preferiblemente sobre 8,2. Un tampón preferido es TRIS 5-100 mM, preferiblemente 5-15 mM, aunque se pueden usar otros tampones tales como el fosfato. Generalmente se prefiere el TRIS, ya que proporciona un buen control del pH y la fuerza iónica en las condiciones de la mezcla de disociación. Opcionalmente se puede añadir tampón fosfato 0-50 mM.

También está presente en la mezcla de disociación un agente quelante de metales para asegurar el desensamblaje completo de VLPs. Un agente quelante de metales preferido es EDTA de 0,5 a 5 mM, y preferiblemente sobre 2 mM, aunque también se pueden usar otros agentes quelantes conocidos.

Una mezcla de disociación particularmente preferida comprende aproximadamente 300 mcg/ml de proteína de VLP de HPV en un tampón TRIS 10 mM, pH 8,2, que contiene adicionalmente NaCl 0,16M-0,18M, DTT 10 ó 20 mM, EDTA 2 mM y Polisorbato 80 al 0,03%. Alternativamente, la mezcla de disociación contiene la misma cantidad de proteína en NaCl 0,63M, fosfato 35 mM, tampón TRIS 100 mM, pH 8,2, DTT 10 ó 20 mM, EDTA 2 mM y Polisorbato 80 al 0,03%.

Una ventaja para el procedimiento de esta invención es que el paso de desensamblaje es bastante rápido, y solamente requiere incubación de las VLPs en la mezcla de disociación durante menos de una hora aproximada a temperatura ambiente, y se pueden usar tiempos tan cortos como 30-40 minutos. Si se desea, el paso de disociación (así como otros pasos del procedimiento de desensamblaje/reensamblaje) se puede desarrollar en condiciones estériles. Por ejemplo, los componentes del tampón deben ser filtrados de forma estéril, y usarse con soluciones de proteína estéril. Además, las VLPs de HPV des/reensambladas en solución deben filtrase de forma estéril antes de usarse o antes de la adsorción sobre adyuvante de aluminio.

Después de que se complete el desensamblaje de VLPs, debería eliminarse el agente reductor. Esto se puede llevar a cabo mediante el uso de una etapa de diálisis o una etapa de diafiltración/ultrafiltración. La etapa de diálisis comprende una diálisis contra una solución de sal (de fuerza fisiológica o, si se usó el procedimiento de alta salinidad, una concentración mayor de sal tal como 1M), tensioactivo no iónico, y tampón similar a la presente en la mezcla de disociación, pero a un pH menor del que está presente en la mezcla de disociación. Los intervalos de pH recomendados en esta etapa de diálisis son de aproximadamente 6,5-7,5, y preferiblemente sobre 7,0. Una solución de diálisis preferida comprende NaCl 0,16-0,18 M, polisorbato 80 al 0,01-0,03%, fosfato 10 mM a pH 7,0. Otro ejemplo de una diálisis recomendada es una diálisis 1:100 (tres cambios, uno cada 30 minutos) contra una solución de NaCl 0,166 M, tampón fosfato 10 mM, pH 7,0. Alternativamente, una solución preferida es NaCl 1,0 M, tampón fosfato 10 mM, y polisorbato 80 al 0,03%, pH 7,0.

Si es necesario, se puede añadir al tampón usado detergente no iónico adicional tal como polisorbato 80 para eliminar el DTT para mantener un nivel suficiente de detergente no iónico con la proteína durante el procedimiento.

Alternativamente, se podría usar la solución de reensamblaje descrita en lo que sigue para eliminar el DTT.

A mayores volúmenes, se puede usar un plan escalable de diafiltración o ultrafiltración en lugar del procedimiento de diálisis.

Reensamblaje

El siguiente paso es reensamblar VLPs. Esto se puede llevar a cabo durante la etapa de diálisis descrita anteriormente, durante la etapa de diafiltración/ultrafiltración descrita anteriormente, o durante una etapa de diálisis separada o adicional, y puede llevar desde varias horas hasta 24 horas. Si se usa una diálisis separada, la diálisis se lleva a cabo usando un tampón de reensamblaje que comprende: sal de fuerza iónica en el intervalo de NaCl de 0,5-1,35 M, una fuente de ión metálico, un tampón a pH 6,0-6,5.

Preferiblemente la sal es la misma sal que se ha usado en las etapas previas, aunque su concentración es preferiblemente mayor. Por ejemplo, si se usa NaCl, debería estar presente a una concentración de 0,5-1,35 M, y preferiblemente sobre 1,0 M.

La fuente de iones metálicos debería ser una fuente de Ca^{+2} o de Mg^{+2}, tal como CaCl_{2}, o MgCl_{2}, y está presente presumiblemente para proporcionar estabilidad a las VLPs reensambladas. También se puede usar Zinc, pero habitualmente es menos conveniente que los otros iones. Se prefiere CaCl_{2}. La cantidad de ión metálico que debería estar presente es una concentración de aproximadamente 1-10 mM, preferiblemente sobre 2 mM.

Se añaden glicina o citrato de sodio como un componente del tampón de reensamblaje y/o un controlador del pH. Las cantidades oscilan aproximadamente entre 20-70 mM, preferiblemente sobre 50 mM.

El tampón puede ser la combinación de glicina y fosfato, o citrato y fosfato, o citrato solo. No se recomienda el uso de tampón fosfato solo. Un tampón de reensamblaje preferido es NaCl 1M, Ca^{+2} 2 mM, citrato 50 mM, pH 6,2 y polisorbato 80 al 0,03%.

Si es necesario, se puede añadir al tampón de reensamblaje detergente no iónico adicional tal como polisorbato 80 para mantener un nivel suficiente de detergente no iónico con la proteína durante el procedimiento.

Intercambio de tampón

Finalmente, cualquier reactivo remanente se puede eliminar mediante diálisis usando un tampón de diálisis final. Un ejemplo contiene sal (preferiblemente NaCl), y tensioactivo no iónico, y opcionalmente, histidina. La sal, si es NaCl, está presente preferiblemente sobre 0,25M-1M, más preferiblemente sobre 0,5M. La histidina puede estar presente a 2-50 mM, preferiblemente sobre 5-20 mM con un pH de 6,0-6,5, y preferiblemente un pH sobre 6,2. El tensioactivo no iónico, tal como polisorbato 80 o polisorbato 20 puede estar presente al 0,01-0,03%. Un intercambio de tampón preferido alternativo es NaCl 0,5M y polisorbato 80 al 0,03%.

Estas etapas de diálisis múltiple usadas para des/reensamblar las VLPs de HPV se pueden desarrollar también con equipos de mayor escala tales como sistemas de diafiltración y/o ultrafiltración. Si es necesario, se puede añadir a cualquiera de los tampones de des/reensamblaje detergente no iónico adicional tal como polisorbato 80 para mantener un nivel suficiente de detergente no iónico con la proteína durante el procedimiento.

Si se desea, las VLPs de HPV des/reensambladas se pueden adsorber sobre un adyuvante de aluminio usando técnicas conocidas.

Opcionalmente, se puede además aumentar la estabilidad de la formulación de la VLP reensamblada mediante la adición de excipientes poliméricos polianiónicos. Usado durante la especificación y las reivindicaciones, el término "polímero polianiónico" trata de referirse a compuestos que tienen una cadena larga simple, o a aquellos con múltiples cadenas unidas transversalmente; cualquiera tipo que posea múltiples cargas negativas a lo largo de la(s) cadena(s) cuando está en disolución. Los ejemplos de polímeros polianiónicos incluyen: proteínas, polianiones, péptidos y ácidos poli-nucleicos. Se pueden seleccionar estabilizantes específicos entre el grupo constituido por: carboximetil celulosa (particularmente de 10-800 cps), heparina (6-30 KDa), ácidos poli-amino (2-100 KDa) tales como poli (Glu), poli (Asp), y poli (Glu, Phe), glutatión oxidado [Glu-Cys-Gly]_{2} (613 Da), poli-nucleótidos tales como ácido policitidílico (200-700 KDa), y ácido poliadenílico (200-700 KDa), RNA, DNA, y sero albúminas.

La concentración del excipiente polimérico polianiónico, cuando está presente, es del aproximadamente 0,01% al aproximadamente 0,5%, particularmente sobre 0,05-0,1% (por peso/volumen), aunque la adición de incluso una cantidad diez veces menor de excipientes polianiónicos (por ejemplo, albúmina al 0,01%, DNA o heparina) aún proporciona una estabilidad aumentada a formulaciones de VLP de HPV-aluminio no tratadas.

Una formulación de vacuna típica incluye:

1) producto adsorbido sobre aluminio que contiene 10-200 mcg/ml de cada tipo de VLP de HPV y solución salina 0,15-0,32 M; 2) histidina 5-10 mM, pH 6,2; y 3) tensioactivo no iónico al 0,005-0,03%.

Las formulaciones de vacuna de HPV de este procedimiento resultantes son estables a 2-8ºC hasta temperatura ambiente durante al menos 6 meses (estudio en curso) como se ilustra en la Figura 7.

Otro aspecto de esta invención es el uso de un tampón de formulación para proporcionar vacunas estables, de almacenaje a largo plazo, fabricadas con las VLPs desensambladas/reensambladas. El tampón de formulación comprende NaCl 0,15-0,32M, histidina 5-10 mM, pH 6,2, polisorbato 80 al 0,005-0,015%. Estas formulaciones de vacuna son estables en varios intervalos de temperatura (desde 4 hasta 30ºC) durante al menos seis meses. Se presentan los siguientes ejemplos no limitantes para ilustra mejor la invención.

Ejemplo 1

Se usó una solución congelada de proteína L1 recombinante de VLP de HPV 16 derivada de levadura (mayor del 95% de pureza proteínica) en NaCl 0,5 M, polisorbato 80 al 0,003%, pH pretendido de aproximadamente 6,2, para la mayoría de estos experimentos. Las VLPs de HPV 6a y VLPs de HPV 11 estaban en NaCl 0,5 M y polisorbato 80 al 0,03%. Las VLPs de HPV 18 estaban en NaCl 0,5 M y polisorbato 80 al 0,01%. Algunos de los estudios utilizaron VLPs de HPV 6a, 11 y 16 en tampón fosfato 75 mM a pH 7 que contenía NaCl 1,25 M.

Liberación de VLPs de HPV de adyuvante de aluminio para subsiguientes análisis in vitro

Para liberar VLPs de HPV del adyuvante de aluminio, se desarrolló un procedimiento de disolución de aluminio que incluía la dilución de la formulación de HPV-aluminio en una solución de alta salinidad que contenía citrato y polisorbato 80. Las muestras de VLP de HPV del procedimiento de disolución de aluminio están directamente sujetas a un ensayo de antigenicidad in vitro que usa análisis BIAcore.

Ensayo de antigenicidad in vitro . Las muestras de VLP de HPV del procedimiento de disolución de aluminio estuvieron en una disolución estabilizante de pH 6-6,5 y fuerza iónica elevada (aproximadamente NaCl 0,5-1M, citrato sódico 0,1M) que contenía polisorato 80 al 0,02%. Las muestras se someten directamente a un análisis BIAcore sin dilución adicional (utilizando anticuerpo neutralizador específico de un tipo de VLP de HPV). Las muestras en disolución (sin adyuvante de aluminio) se diluyeron hasta una concentración objetivo en NaCl 0,5-1M aproximadamente antes del análisis BIAcore. Todos los datos de antigenicidad in vitro se refieren a una muestra control de VLP de HPV congelada (sin aluminio adsorbido).

Análisis de concentración de proteína. Se determinó la concentración de proteína de VLPs de HPV en las soluciones en masa y en las muestras formuladas (después de la disolución del aluminio) mediante la medida de espectros de absorbancia UV a temperatura ambiente usando un espectrofotómetro HP 8452A Diode Array y una cubeta con una longitud de paso de 1 cm. Los volúmenes de muestra usados fueron de 100-250 microlitros. La concentración de proteína se calculó usando una técnica de análisis de derivada segunda de componente múltiple. Para algunos experimentos, la concentración de proteína también se determinó mediante análisis colorimétrico
BCA.

Análisis de tamaño hidrodinámico. Se determinó el tamaño hidrodinámico de VLPs de HPV no tratadas y des/reen-
sambladas mediante dispersión de luz dinámica, ultracentrifugación analítica y SEC-HPLC.

Las medidas de dispersión de luz dinámica se desarrollaron a temperatura ambiente usando un Sistema de Dispersión de Luz Malvern 4700 a 90ºC. El tamaño hidrodinámico aparente de VLPs de HPV se determinó como diámetro hidrodinámico medio-Z cada uno de los valores representa la media de cinco medidas de la misma muestra.

Se desarrollaron experimentos de velocidad de sedimentación usando una ultracentrífuga analítica Beckman XLI con detección de UV a 280 nm. Se usaron dos procedimientos distintos para determinar el coeficiente de sedimentación que incluyen modos de velocidad fija y variable.

Las medidas de SEC-HPLC se desarrollaron a temperatura ambiente usando un Sistema Waters/Millenium 2690 con detectores de UV y de fluorescencia. Se usó una columna PL-GFC 4000 \ring{A} (preacondicionada con VLPs de HPV) a una tasa de flujo de 0,4 ml/minuto usando NaCl 750 mM, y tampón fosfato 25 mM (pH 7) como fase móvil.

Análisis al microscopio electrónico. Se desarrolló Microscopía Electrónica de Transmisión (MET) usando tinción negativa. Las muestras se fijaron y tiñeron con ácido fosfotúngstico y se examinaron en un Microscopio Electrónico de Transmisión JEOL 1200 EX. Se tomaron micrografías de áreas aleatorias con muestras preparadas múltiples veces a una magnificación de entre 30000x y 40000x. Se introdujo una magnificación adicional 3 veces superior al efectuar las impresiones a partir de los negativos.

Estudios de estabilidad de almacenaje a tiempo real y acelerados. Se llevaron a cabo estudios de la estabilidad de almacenaje de la formulación HPV-aluminio. La temperatura de los estudios de estabilidad generalmente fue de 2-8, 15, 25, 30 y 37ºC. Datos previos de integridad conformacional con dicroísmo circular y espectrocopía de fluorescencia han mostrado que al incrementar la temperatura sobre los 40-45ºC, se inducen cambios conformacionales significativos en la proteína L1 de la VLP de HPV, una condición que sin duda necesita evitarse en estudios de estabilidad de almacenaje acelerados.

También se evaluó la estabilidad térmica de la VLP de HPV con ensayos de turbidez que se llevaron a cabo usando un espectrofotómetro HP 8452A Diode Array equipado con un sistema de software para UV y visible HP 845X y un sistema de control de la temperatura. Se siguió la dispersión de luz de las disoluciones (debido a la agregación de proteínas) a 350 nm bajo el modo cinético del programa aumentando la temperatura desde 24ºC hasta 74ºC a un ritmo controlado.

Prueba de potencia en ratón.- Se evaluó la inmunogenicidad in vivo de VLPs de HPV en ratones BALB c. Se adsorbieron muestras de VLPs de HPV sobre adyuvante de aluminio, se diluyeron a varias concentraciones objetivo con adyuvante de aluminio y se inyectaron a ratones. Se recogieron sueros y se analizaron en busca de niveles de anticuerpo mediante la prueba ELISA.

Ejemplo 2

Desensamblaje y reensamblaje de VLPs de HPV 16 determinados mediante análisis de ultracentrifugación analítica

Como se ve en la Figura 1, las VLPs de HPV 16 se desensamblan después de la incubación en un tampón a pH 8,2 que contiene TRIS o fosfato 10 mM, NaCl 0,166 M, EDTA 2 mM, y DTT 2 mM a temperatura ambiente durante 20 minutos (curva del medio). La muestra de HPV 16 desensamblado muestra un pico en el menor valor S esperado para capsómeros de L1, sugiriendo un tamaño de pentámeros de proteína L1 de HPV. La curva superior muestra que el HPV 16 desensamblado (capsómeros) se reensambló después en VLPs haciendo diálisis en un tampón a pH 6,2 que contenía fosfato sódico 10 mM, NaCl de 0,5 a 1 M, cloruro cálcico 2 mM en presencia de glicina o citrato. La curva inferior muestra las VLPs de HPV 16 no tratadas.

Ejemplo 3

Distribuciones del tamaño de partícula de VLPs de HPV 16 des/reensambladas

La Figura 2 muestra Distribuciones del tamaño de partícula de VLPs de HPV 16 que se desensamblaron y reensamblaron como se describe en el Ejemplo 2 (línea discontinua) y de VLPs de HPV 16 no tratadas (línea continua) según se determinó mediante análisis de ultracentrifugación analítica. Los datos revelan que las VLPs de HPV 16 des/reensambladas son más grandes y tiene una distribución más homogénea, a juzgar por las posiciones y anchuras de los picos, respectivamente. El análisis de microscopía electrónica (ME) confirma el análisis de ultracentrifugación analítica; muestra que las VLPs des/reensambladas son más homogéneas y están presentes como partículas más redondeadas de tamaño uniforme con udiámetro medio de aproximadamente 80-85 nm (no se muestran los datos de ME). Las muestras no tratadas parecen ser más pequeñas y con una forma más heterogénea y una distribución del tamaño con un tamaño medio de alrededor de 50-68 nm. De manera similar, un conjunto posterior de datos muestra que las VLPs de HPV 16 no tratadas tienen un tamaño medio de aproximadamente 40 nm, mientras las VLPs de HPV 16 reensambladas tienen un tamaño medio de aproximadamente 60 nm.

Ejemplo 4

Estabilidad acelerada (37ºC) de formulaciones de vacuna de VLP de HPV-aluminio determinada mediante análisis BIAcore

Las VLPs de HPV 16 des/reensambladas así como las VLPs de HPV 16 no tratadas se adsorbieron sobre adyuvante de aluminio (a 160 mcg/ml de proteína y 450 mcg/ml de Al) y se formularon en NaCl 0,32 M, histidina 10 mM, polisorbato 80 al 0,015%, pH 6,2. Se evaluó la antigenicidad in vitro de las muestras en tiempos identificados mediante análisis BIAcore.

En la Figura 3, se muestran las VLPs de HPV 16 desensambladas y reensambladas con círculos rellenos y cuadrados vacíos; y las no tratadas son rombos rellenos. El Ensayo 1 contenía citrato y el Ensayo 2 tiene glicina en el tampón de reensamblaje. Los datos demuestran que el procedimiento de des/reensamblaje provoca un aumento significativo y acusado en la estabilidad de almacenaje acelerada de las VLPs de HPV 16 adsorbidas sobre adyuvante de aluminio en comparación con las VLPs de HPV no tratadas. No se observó pérdida de antigenicidad in vitro de las VLPs de HPV des/reensambladas adsorbidas de aluminio en experimentos similares desarrollados a 25ºC y a 4ºC tres meses
después.

Ejemplo 5

Estabilidad acelerada (37ºC) de VLPs de HPV en disolución en solución salina fisiológica determinada mediante análisis BIAcore

80 mcg/l de VLPs de HPV 16 des/reensambladas así como VLPs de HPV 16 no tratadas se incubaron en NaCl 0,15 M, histidina 10 mM, polisorbato 80 al 0,015%, pH 6,2 a 37ºC. Se evaluó la antigenicidad in vitro de las muestras en tiempos identificados mediante análisis BIAcore. Los datos demuestran que el procedimiento de des/reensamblaje provoca un aumento significativo en la estabilidad de almacenaje acelerada de las VLPs de HPV 16 en comparación con las VLPs de HPV no tratadas. Esto se muestra en la Figura 4, en la que las VLPs desensambladas y reensambladas son círculos vacíos y cuadrados vacíos; las VLPs no tratadas son rombos rellenos. El Ensayo 1 contiene citrato y el Ensayo 2 tiene glicina en el tampón de reensamblaje.

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Ejemplo 6

Efecto del tratamiento del procedimiento de des/reensamblaje sobre la estabilidad térmica de distintos conjuntos de VLPs de HPV 16 determinado mediante monitorización de la formación de turbidez inducida térmicamente (agregación) mediante espectroscpía de UV (análisis de puntos de nube)

Se aplicó un protocolo estándar de puntos de nube a las muestras: calentamiento desde 24ºC hasta 74ºC a un ritmo controlado monitorizando la densidad óptica de la disolución a 350 nm. Como se muestra en la Figura 5, se analizaron tres conjuntos distintos de VLPs de HPV 16 (conjuntos 1,2,3) antes (líneas discontinuas y símbolos vacíos) y después (líneas continuas y símbolos rellenos) del tratamiento de des/reensamblaje. Entre estas muestras, el conjunto 1 de VLPs de HPV 16 se probó tres veces. Los datos demuestran que el procedimiento de des/reensamblaje provoca un aumento significativo de la estabilidad intrínseca de las VLPs de HPV 16 contra la agregación inducida por calor. Además de los aumentos de la estabilidad térmica, el tratamiento del procedimiento de des/reensamblaje provoca un perfil de estabilidad más consistente y homogéneo.

Ejemplo 7

Se evaluó además la antigenicidad in vitro de las no tratadas y las des/reensambladas con un conjunto VLPs de HPV 16 en las que sendas VLPs no tratadas y des/reensambladas se evaluaron antes y después de la adsorción al adyuvante de aluminio. Se midió la antigenicidad in vitro mediante análisis BIAcore y la concentración de proteína mediante espectroscopia de fluorescencia y prueba colorimétrica BCA. La relación de antígeno a proteína se determinó después para sendas VLPs de HPV 16 no tratadas y des/reensambladas. La antigenicidad in vitro de las VLPs de HPV 16 des/reensambladas aumentó aproximadamente en un 50%. Por ejemplo, la relación de antígeno a proteína para VLPs de HPV 16 des/reensambladas frente a las no tratadas fue de 1,7 con un intervalo de 1,5-1,9. Esta observación fue confirmada mediante análisis EIA (media de 1,6 e intervalo de 1,4-1,8) y análisis IVRP (media de 1,4 e intervalo de 1,3-1,5).

Se evaluó la inmunogenicidad in vivo de VLPs de HPV 16 no tratadas y de las adsorbidas sobre aluminio des/reen-
sambladas con una prueba de potencia en ratones. Esta prueba genera un valor de ED50 que representa la dosis (mcg) de VLPs de HPV en las que más del 50% de los ratones serotransforman. La inmunogenicidad in vivo de las VLPs de HPV 16 des/reensambladas fue equivalente a, o mejor que, las VLPs de HPV 16 no tratadas. Un experimento muestra un valor ED de 0,034-0,062 para dos muestras des/reensambladas frente a un valor de ED de 0,146 para la muestra no tratada. En un segundo experimento con ratón, se obtuvo un valor e ED < 0,0125 para tres muestras de VLPs de HPV des/reensambladas frente a un valor de ED de 0,074 para la muestra no tratada.

Ejemplo 8

Estabilidad acelerada (37ºC) de VLPs de HPV no tratadas y des/reensambladas en disolución y sobre adyuvante de aluminio determinada mediante análisis BIAcore

Se incubaron 80 mcg/ml de VLPs de HPV en una disolución que contenía NaCl 0,32 M, histidina 10 mM, polisorbato 80 al 0,015%, pH 6,2 a 37ºC. Se evaluó la antigenicidad in vitro de las muestras mediante análisis BIAcore en los tiempos indicados en la Figura 6. Los datos indican que el tratamiento de des/reensamblaje provoca un aumento acusado de la estabilidad para las VLP de HPV tipos 6a, 11 y 16 en disolución durante la prueba de estabilidad de almacenaje acelerada. Las VLPs de HPV 18 no tratadas muestran un perfil de estabilidad similar al de las VLPs des/reensambladas para los otros tres tipos. No se observa aumento significativo de la estabilidad con el tratamiento de las VLPs de HPV 18 debido probablemente a la incapacidad del tratamiento de des/reensamblaje para afectar a las VLPs de HPV 18 (no se muestran los datos). Las muestras usadas para este estudio se generan con procedimientos de desensamblaje de baja salinidad. La recuperación de masa proteica para los cuatro tipos a través del tratamiento de des/reensamblaje fue aproximadamente del 85-95% para VLPs de HPV 11, 16 y 18 y aproximadamente del 60-70% para VLPs de HPV 6a. El rendimiento a través del tratamiento de des/reensamblaje parece verse afectado por la calidad del conjunto específico de VLP de HPV en términos de agregación de VLP. El rendimiento de masa proteica a través del tratamiento de des/reensamblaje aumenta hasta casi el 100% cuando el procedimiento de desensamblaje tiene lugar bajo condiciones de alta salinidad. El análisis de las VLPs de HPV des/reensambladas mediante ultracentrifugación analítica sugiere que el tratamiento de des/reensamblaje provoca un reensamblaje casi cuantitativo de capsómeros en las VLPs.

La Figura 7 muestra la estabilidad acelerada y de almacenaje de VLPs de HPV adsorbidas sobre adyuvante de aluminio en las que se adsorbieron 400 mcg/ml de VLPs de HPV sobre 450 mcg/ml de adyuvante de aluminio y se incubaron en una disolución que contenía NaCl 0,32 M, histidina 10 mM, polisorbato 80 al 0,015%, pH 6,2 a 4ºC, 15ºC, 25ºC, 30ºC y 37ºC. Se evaluó la antigenicidad in vitro de las muestras mediante análisis BIAcore en los tiempos indicados en la figura después del tratamiento en una disolución de citrato para liberar al antígeno del adyuvante de aluminio. Los datos indican que el tratamiento de des/reensamblaje provoca un aumento acusado de la estabilidad para las VLP de HPV tipos 6a, 11 y 16 adsorbidas sobre aluminio durante la prueba de estabilidad de almacenaje acelerada. Las VLPs de HPV 18 no tratadas muestran un perfil de estabilidad similar al de las VLPs des/reensambladas para los otros tres tipos. No se observa aumento significativo de la estabilidad con el tratamiento de las VLPs de HPV 18 desensambladas/reensambladas.

Ejemplo 9

Estabilidad térmica y distribución de tamaño hidrodinámico de VLPs de HPV 6a, HPV 11 y HPV 16, preparadas mediante los procedimientos de desensamblaje de baja y alta salinidad

Se evaluaron las muestras mediante análisis de puntos de nube y análisis de ultracentrifugación analítica. En el procedimiento de baja salinidad, las VLPs de HPV se desensamblan en NaCl 0,166 M, solución TRIS 10 mM (pH 8,2) mientras en el procedimiento de alta salinidad, las VLPs de HPV se desensamblan en NaCl 0,63 M, fosfato 35 mM y solución TRIS 100 mM (pH 8,2). Ambas soluciones contienen también EDTA y polisorbato 80. Los datos, como se ve en la Figura 8, muestran que las VLPs de HPV desensambladas/reensambladas preparadas mediante los procedimientos de baja y alta salinidad son similares atendiendo a su estabilidad térmica y distribución de tamaño hidrodinámico para VLPs de HPV tipos 11, 6a y 16.

Ejemplo 10 Distribución del tamaño de partícula y afinidad de superficie de VLPs de HPV medidas mediante análisis SEC-HPLC

Se analizaron VLPs de HPV (tipos 11, 16 y 6a) des/reensambladas (Figura 9, línea continua) y no tratadas (línea discontinua) en una columna de exclusión 4000A GPC. Se obtuvo un pico sencillo a partir de las VLPs de HPV des/reensambladas comparadas con una distribución más heterogénea de las VLPs de HPV no tratadas. Los picos de monómero de las VLPs de HPV des/reensambladas tiene un volumen de dilución menor que los picos de monómero de las VLPs de HPV no tratadas, sugiriendo un tamaño de partícula relativamente mayor para las VLPs des/reensambladas. Las áreas de pico totales relativamente mayores de las VLPs de HPV des/reensambladas indican una tasade recuperación superior de las VLPs des/reensambladas, sugiriendo que las VLPs des/reensambladas tienen menor afinidad a la columna que las VLPs no tratadas. Las VLPs de HPV 18 no tratadas muestran un perfil de SEC HPLC similar al de las VLPs des/reensambladas para los otros tres tipos.

Claims

1. Un procedimiento para fabricar una vacuna del papilomavirus humano que comprende partículas análogas al virus HPV (VLPs), comprendiendo el procedimiento las etapas de:

(a): incubar VLPs en una mezcla de disociación que comprende ditiotreitol (DTT) 2-20 mM, una sal presente en un intervalo equivalente a NaCl de 0,10M a 0,2M, un tensioactivo no iónico, un agente quelante de metal, y un tampón hasta que se produzca el desensamblaje de las VLPs;

(b): retirar el agente reductor de la mezcla de disociación; y

(c): reensamblar las VLPs desensambladas.

2. Un procedimiento para fabricar una vacuna del papilomavirus humano que comprende partículas análogas al virus HPV (VLPs), comprendiendo el procedimiento las etapas de:

(a): incubar VLPs en una mezcla de disociación que comprende ditiotreitol (DTT) 2-20 mM, una sal presente en un intervalo equivalente a NaCl de 0,50M a 1,25M, un tensioactivo no iónico, un agente quelante de metal, y un tampón hasta que se produzca el desensamblaje de las VLPs;

(b): retirar el agente reductor de la mezcla de disociación; y

(c): reensamblar las VLPs desensambladas.

3. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 1 ó 2 en el que la sal de la mezcla de disociación se selecciona entre NaCl, KCl, Na_{2}SO_{4}, (NH_{4})_{2}SO_{4}, fosfato sódico, citrato sódico y mezclas de los mismos, y es preferible NaCl.

4. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 3 en el que la sal de la mezcla de disociación es NaCl.

5. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 1, 2, 3 ó 4 en el que el tensioactivo no iónico de la mezcla de disociación se selecciona entre polisorbato 80, Polisorbato 20, alquil éteres de polioxietileno, Triton X-100®, Triton X-114®, NP-40®, Span 85 y un tensioactivo Plurónico no iónico.

6. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 5 en el que el tensioactivo no iónico es polisorbato 80 al 0,01-0,5%.

7. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior en el que el tampón de la mezcla de disociación es TRIS o tampón fosfato, a pH 7-10.

8. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior en el que el agente quelante de la mezcla de disociación es EDTA 0,5-5 mM.

9. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior en el que la etapa (a) tiene lugar durante menos de una hora a temperatura ambiente.

10. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 9 en el que la etapa (a) tiene lugar durante 30-40 minutos a temperatura ambiente.

11.Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior en el que la etapa (b) comprende una etapa de diálisis o diafiltración/ultrafiltración.

12. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 11 en el que la etapa de diálisis comprende una diálisis o diafiltración/ultrafiltración contra una solución de sal fisiológica o una concentración mayor de sal, tensioactivo no iónico, y tampón a un pH inferior del que está presente en la mezcla de disociación.

13. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 11 en el que la etapa de diálisis comprende una diálisis o diafiltración/ultrafiltración en un tampón de reensamblaje, comprendiendo dicho tampón de reensamblaje: sal de fuerza iónica en el intervalo de NaCl de 0,5-1,35 M, una fuente de ión metálico, y un tampón a pH 6,0-6,5.

14. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior en el que la etapa (c) comprende una diálisis o diafiltración/ultrafiltración en un tampón de reensamblaje, comprendiendo el tampón de reensamblaje: sal de fuerza iónica en el intervalo de NaCl de 0,5-1,35 M, una fuente de ión metálico, y un tampón a pH 6,0-6,5.

15. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 14 en el que la fuente de ión metálico es una fuente de Ca+^{2} ó de Mg+^{2}.

16. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 15 en el que la fuente de ión metálico es CaCl_{2}, o MgCl_{2} a 0,5-5,0 mM.

17. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 13, 14 ó 15 en el que el tampón comprende a) glicina y fosfato, b) citrato y fosfato; o c) citrato.

18. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 17 en el que el tampón de reensamblaje comprende NaCl 1 M, Ca+^{2} 2 mM, citrato 50 M, pH 6,2 y polisorbato 80 al 0,03%.

19. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior que además comprende: (d) purificar además con una etapa de diálisis que comprende un tampón final que comprende: NaCl 0,25-1,25 M y un detergente no iónico.

20. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 19 en el que el tampón final además comprende un tampón de histidina a pH 6,0-6,5.

21. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 19 ó 20 en el que el detergente no iónico es polisorbato 80 ó polisorbato 20.

22. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior que además comprende adsorber las VLPs des/reensambladas sobre adyuvante de aluminio.

23. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación anterior en el que las VLPs se seleccionan entre HPV 6a, HPV 6b, HPV 11, HPV 16, y HPV 18, y combinaciones de las mismas.

24. Un procedimiento para fabricar vacuna del papilomavirus humano que comprende partículas análogas al virus HPV (VLPs), comprendiendo el procedimiento las etapas de:

(a): incubar VLPs en una mezcla de disociación de baja salinidad durante 30-40 minutos, comprendiendo la mezcla de disociación: NaCl 0,16-0,18 M, DTT 2-20 mM, Polisorbato 80 al 0,01-0,03%, EDTA 0,5-5 mM y tampón TRIS 5-15 mM, a pH 8,2 para producir VLPs desensambladas;

(c): reensamblar las VLPs desensambladas usando diálisis contra un tampón de reensamblaje, comprendiendo el tampón de reensamblaje:; NaCl 1,0 M, CaCl_{2} 2 mM; y un tampón de pH 6,2 seleccionado entre el grupo constituido por: citrato sódico 50 mM, glicina 50 mM y fosfato; y citrato 50 mM; y

(d): purificar después las VLPs reensambladas usando diálisis contra un tampón final que comprende NaCl 0,5 M, e histidina 10 mM, pH 6,2.

25. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 24 que además comprende, como etapa (b), eliminar el DTT de la mezcla de disociación usando una diálisis contra un tampón que comprende NaCl 0,16-0,18 M, polisorbato 80 al 0,01-0,03% y fosfato 10 mM a pH 7,0.

26. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 24 ó 25, que además comprende:

(e): adsorber las VLPs reensambladas de la etapa (d) sobre adyuvante de aluminio.

27. Un procedimiento para fabricar una vacuna del papilomavirus humano (HPV) de almacenaje estable que comprende partículas análogas al virus HPV (VLPs), comprendiendo el procedimiento las etapas de:

(a): incubar VLPs en una mezcla de disociación de alta salinidad durante 30-40 minutos, comprendiendo la mezcla de disociación: NaCl 0,5-1,25 M, DTT 2-20 mM, Polisorbato 80 al 0,01-0,03%, EDTA 0,5-5 mM y tampón TRIS 5-100 mM, y fosfato 0-50 mM a pH 8,2 para producir VLPs desensambladas;

(c): reensamblar las VLPs desensambladas usando diálisis contra un tampón de reensamblaje, comprendiendo el tampón de reensamblaje: NaCl 1,0-1,35 M, CaCl_{2} 2 mM; y un tampón de pH 6,2 seleccionado entre el grupo constituido por: citrato sódico 50 mM, glicina 50 mM y fosfato; y citrato 50 mM; y

28. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 27, que además comprende, como etapa (b), eliminar el DTT de la mezcla de disociación usando una diálisis contra un tampón que comprende al menos NaCl 1 M, polisorbato 80 al 0,01-0,03% y fosfato 10 mM a pH 7,0.

29. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 27 ó 28, que además comprende: