KR20020013516A

KR20020013516A - 분해되어 재조립된 바이러스-유사 입자를 함유하는 사람파필로마바이러스 백신

Info

Publication number: KR20020013516A
Application number: KR1020017012229A
Authority: KR
Inventors: 볼킨데이비드비; 마흐헨릭; 쉬리
Original assignee: 폴락 돈나 엘.; 머크 앤드 캄파니 인코포레이티드
Priority date: 1999-03-26
Filing date: 2000-03-22
Publication date: 2002-02-20
Also published as: DE122007000033I1; LU91326I2; AU778937B2; DE122007000034I1; NL300269I2; AR023166A1; CY2007009I2; NL300268I1; LU91327I9; CY1105779T1; DE60030698D1; WO2000057906A1; LU91328I2; ATE339222T1; CY2007010I2; US6245568B1; CA2368391A1; LU91326I9; CY2007009I1; DK1165126T3

Abstract

바이러스-유사 입자(VLP)를 함유하는 사람 파필로마바이러스 백신 제형물은, VLP를 분해 및 재조립 공정으로 처리함으로써 보다 안정하게 제조될 수 있고, 보존 기간이 증가된다. 또한, VLP를 장기간 안정하게 저장하기 위한 제형물 완충제가 제공된다.

Description

분해되어 재조립된 바이러스-유사 입자를 함유하는 사람 파필로마바이러스 백신{Human papillomavirus vaccine with disassembled and reassembled virus-like particles}

사람 파필로마바이러스(HPV)는 생식관을 감염시키고, 각종 이형성증, 암, 및 기타 질환과 관련이 있다. 이러한 질환이 현재 백신 개발을 위한 목표이며, L1 또는 L1 + L2 단백질의 조합을 함유하는 바이러스-유사 입자를 함유하는 백신이 현재 임상 시험중이다.

그러나, 효모로 부터 정제된 재조합 L1 단백질 HPV VLP는, 용액중에 장기간 보관하거나 알루미늄 애주번트 입자상에 흡착시켜 장기간 보관하는 동안에 안정하지 못하다.

과거에, 다수의 연구자들이 HPV VLP 조립 및 재조립의 상태를 연구해왔다. 예를 들면, 문헌[McCarthy et al, 1998 "Quantitative Disassembly and Reassembly of Human Papillomavirus Type 11 Viruslike Particles in Vitro" J. Virology 72(1):32-41]에는 균질한 VLP 제제를 수득하기 위한, 곤충 세포로 부터 정제된 재조합 L1 HPV 11 VLP의 분해 및 재조립이 기술되어 있다. 생리학적 이온 농도에서 비교적 고농도의 환원제를 사용한 장기간의 항온처리(4℃에서 약 16시간)를 사용하여 VLP를 분해하고, 고이온 농도에서 환원제를 제거하여 VLP를 재조립한다. 그러나, 이러한 방법은 매우 시간-소모적이다.

상업적으로 유용한 백신을 개발하기 위하여, 저장 안정성 제형물이 필요하다. 저장 안정성 HPV VLP 제형물을 제조하는데 있어 비교적 단순하고, 신속한 정량적 처리 방법을 사용하는 것이 바람직할 것이다.

본 발명은, 캡소미어로 분해된 후 VLP로 재조립된 바이러스-유사 입자를 함유하는 사람 파필로마바이러스(HPV) 백신에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 보다 균질한 HPV VLP를 포함하고 저장 안정성이 크게 향상된 이러한 백신을 제조하는 방법에 관한 것이다.

도 1은 분석적 초원심분리 분석에 의해 측정된, HPV 16 VLP의 분해 및 조립을 보여주는 그래프이다.

도 2는 분석적 초원심분리 분석에 의해 측정된, 분해/재조립된 HPV 16 VLP(점선) 및 미처리된 HPV 16 VLP(실선)의 입자 크기 분포를 보여주는 그래프이다.

도 3은 BIAcore 분석을 통한 시험관내 항원성에 의해 측정된, HPV 16-알루미늄 백신 제형물의 촉진된 저장 안정성(37℃)을 보여주는 그래프이다.

도 4는 BIAcore 분석을 통한 시험관내 항원성에 의해 측정된, 생리학적 염 용액에서의 HPV 16 VLP의 촉진된 저장 안정성을 보여준다.

도 5는 UV 혼탁도(구름점 분석)에 의한 열-유도된 응집을 모니터링하여 측정된, 상이한 롯트(lot)의 HPV 16 VLP의 열 안정성에 미치는 분해/재조립 처리의 효과를 보여준다.

도 6A 내지 6D는 BIAcore 분석을 통한 시험관내 항원성에 의해 측정된, 4개의 상이한 유형(HPV 16, 11, 6a, 18)의 분해/재조립된 HPV VLP, 및 미처리된 대조용 HPV VLP의 용액에서의 촉진된 저장 안정성(37℃)을 보여준다. 도 6A는 HPV 6A이고, 도 6B는 HPV 11이고, 도 6C는 HPV 16이고, 도 6D는 HPV 18이다.

도 7A 내지 7D는, 알루미늄 애주번트에 흡착된 4개의 상이한 유형(HPV 16,11, 6a, 18)의 분해/재조립된 HPV VLP, 및 미처리된 대조용 HPV VLP의 촉진된 저장 안정성을 보여준다. 알루미늄 애주번트로 부터 항원을 방출시키기 위하여 시트레이트 용액중에서 처리한 후, 샘플을 BIAcore 분석을 통해 시험관내 항원성에 대해 분석한다. 도 7A 및 7B는 HPV 6A이고, 도 7C 및 7D는 HPV 11이고, 도 7E 및 7F는 HPV 16이고, 도 7G 및 7H는 HPV 18 VLP이다.

도 8A 내지 8F는, 대략 생리학적 상태(저염 공정) 또는 높은 염 농도(고염 공정)에서의 분해 공정으로 부터 제조된, 분해/재조립된 HPV 6a, HPV 11 및 HPV 16 VLP의 열 안정성 및 유체역학적 크기 분포를 비교한 것이다. HPV VLP의 이러한 물리적 특성을 구름점 분석 및 분석적 초원심분리 분석에 의해 측정한다. 저염 공정에서, HPV VLP는 0.166M NaCl, 10mM TRIS 용액(pH 8.2)에서 분해되는 반면에, 고염 공정에서, HPV VLP는 0.63M NaCl, 35mM 포스페이트, 및 100mM TRIS 용액(pH 8.2)에서 분해된다. 두 용액 모두 EDTA 및 폴리소르베이트 80을 함유한다. 도 8A 및 8B는 HPV 6A VLP의 구름점 및 분석적 초원심분리 데이타를 보여주며, 도 8C 및 8D는 HPV 11 VLP를 사용한 동일한 분석을 보여주며, 도 8E 및 도 8F는 HPV 16 VLP를 사용한 동일한 분석을 보여준다.

도 9A 내지 9D는 SEC-HPLC 분석에 의해 측정된, 미처리된 HPV VLP 및 분해/재조립된 HPV VLP의 입자 크기 분포 및 표면 친화성을 보여준다. 도 9A는 HPV 6a이며, 도 9B는 HPV 1이고, 도 9C는 HPV 16이며, 도 9D는 HPV 18이다.

본 발명은, HPV 백신 제형물의 전반적인 안정성에 크게 기여하는 것으로 밝혀진, 보다 안정한 HPV VLP를 제조하는 방법에 관한 것이다. 정제된 HPV VLP가 생성되고, 아마도 캡소미어로 분해되고, VLP로 재조립된 후, 백신 제형물중의 활성 성분으로서 사용된다.

본 발명에 따르면, 모든 유형의 HPV VLP가 백신 제형물의 항원성 부분으로서 사용될 수 있다. VLP는 단지 L1 단백질만을 함유할 수 있거나 L1 및 L2 단백질 모두를 함유할 수 있다. 단백질은 야생형 아미노산으로 구성될 수 있거나, 이들이 돌연변이를 지닐 수 있다. 야생형 아미노산으로 구성된 L1 단백질만을 함유하는 VLP가 바람직하다.

바람직한 HPV는 질환과 관련된 것들로서, HPV 1, HPV 2, HPV 3, HPV 4, HPV 6a, HPV 6b, HPV 7, HPV 10, HPV 11, HPV 16, 및 HPV 18, HPV 34, HPV 39, HPV 41-44, HPV 51-55가 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 HPV에는 HPV 6a, HPV 6b, HPV 11, HPV 16 및 HPV 18이 포함된다. 또한, 본 발명의 제형물은 다수의 HPV 항원을 함유하는 다가 백신을 포함하는 HPV 유형의 조합, 예를 들면 HPV 6, HPV 11, HPV 16 및 HPV 18의 조합에 적합하다.

당업계에 공지된 바와 같이, VLP는 재조합 기술로 제조되는 것이 바람직하다. VLP를 제조하는데 사용되는 숙주 세포는 효모 세포가 특히 바람직하나, 세균, 곤충, 및 포유동물 세포와 같은 다른 세포 유형이 공지되어 있고, 현재 숙주로서 사용된다. 이론에 얽매이지 않는다면, VLP중 L1 단백질내의 이황화 결합 상태는 재조합 L1을 발현시키는데 사용되는 숙주 세포 및 후속적인 정제 방법에 따라 달라질 수 있다. 문헌[McCarthy et al 1998, supra]에는 곤충 세포에서 생성된 재조합 VLP중 일부 이황화 가교된 L1 삼량체가 기술되어있다. 한편, 본 발명에 따르면,효모에서 생성된 VLP의 L1 단백질내의 이황화 결합은 상이할 수 있으므로, 최적 분해 및 재조립에 상이한 상태가 요구된다.

일부 제형물의 경우에, 알루미늄에 흡착된 생성물이 요구된다. 일반적으로, 이러한 경우에, 알루미늄상에 흡착된 HPV VLP의 농도는 각 HPV VLP 유형에 있어서 약 10 내지 200mcg/ml이다. 이는, 특정 유형의 HPV의 항원성, 및 "칵테일" 유형의 백신중의 다수 유형의 HPV의 존재와 같은 요인들에 따라, 조정될 수 있다.

분해

VLP가 재조합 숙주 세포에서 생성되고 정제된 후, 이들을 해리 혼합물에서 항온처리하여 분해시킨다, 분해는, 생리학적(또한 "저염 공정"으로 지칭되기도 함) 농도에서 1.25M NaCl(또한 "고염 공정"으로 지칭되기도 함)에 이르는 다양한 비교적 광범위한 이온 농도 환경에서 디티오트레이톨(DTT)와 같은 환원제로 이황화 결합을 환원시킴으로써 일차적으로 유도된다. 해리 혼합물은 환원제, 염, 비이온성 계면활성제, 금속 킬레이팅제, 및 완충제를 포함한다.

당해 환원제는 바람직하게는 디티오트레이톨(DTT)이나, 다른 환원제도 공지되어 있고 사용될 수 있다. 과거에는, HPV 입자를 분해하는데 다른 환원제(예: 베타-머캅토에탄올, β-ME)가 사용되었으나[참조 문헌: McCarthy et al., supra], 비교적 고농도의 환원제(5%, 또는 713mM의 β-ME)가 필요하였다. 대조적으로, 본 발명의 일 양태에서는 비교적 저 농도의 환원제가 사용된다.

명세서 및 청구범위에서, "비교적 저 농도의 환원제"란 용어는, 환원제로서DTT를 사용하는 경우 약 2mM 내지 20mM를 의미하고, 다른 환원제를 사용하는 경우 2 내지 20mM DTT와 거의 동일한 효과를 나타내는 또 다른 환원제의 양을 의미한다. 환원제의 바람직한 양은 약 10mM DTT이다.

해리 혼합물의 또 다른 중요한 성분은 염이다. 일반적으로, 해리 혼합물의 이온 농도는 염의 존재에 의해 유지된다. 이온 농도의 조절에 기여할 수 있는 거의 모든 염이 사용될 수 있다. 이온 농도를 조절하는데 사용될 수 있는 바람직한 염은 임의의 생리학적으로 허용되는 염, 예를 들면 NaCl, KCl, Na₂SO₄, (NH₄)₂SO₄, 인산나트륨, 시트르산나트륨 및 이의 혼합물이다. 특히 바람직한 염은 NaCl, KCl 및 Na₂SO₄이고, 특히 바람직한 염은 NaCl이다.

본 발명의 저염 태양에서, 해리 혼합물은 거의 생리학적 이온 농도이어야 한다. 본 명세서 및 청구범위에 있어서, 염을 지칭할 때, "거의 생리학적"이란 용어는, 염으로서 NaCl을 사용하는 경우, 0.10 내지 0.20M, 바람직하게는 약 0.15 내지 0.18M, 보다 바람직하게는 약 0.16M을 의미한다. 사용될 수 있는 다른 염에 대하여는, 거의 생리학적 NaCl 용액과 등가일 수 있는 몰농도를 계산하는 것은 당업자의 기술 범위내에 속한다.

달리, 해리는 고염 환경에서 일어날 수 있다. 본원에서 사용된, "고염"이란 0.5M 이상의 염, 및 10mM 이상의 완충제를 의미한다. 사용된 염이 NaCl인 경우 고염에 대한 바람직한 범위는 0.5 내지 1.25M이고, 보다 바람직한 범위는 0.60 내지 0.1M이다. 다른 염의 경우에, 0.5M 및 1.25M NaCl 용액과 등가일 수 있는 몰농도를 계산하는 것은 당업자의 기술 범위내에 속한다.

고염 분해 공정의 성공적인 사용은 매우 예기치 않은 것이었다 - 문헌[Brady et al., 1977 Virology 23: 717-724, Belnap et al 1995 J. Mol. Biol. 259-263] 및 공개된 특허원 WO 99/13056은 염 농도를 0.5M NaCl 미만으로 제한한다. 그럼에도 불구하고, 고염 분해의 사용이, 고염이 가능한 단백질 응집을 제한하여 단백질 질량 회수를 향상시키고, 또한 분해/재조립 처리를 최종 정제 크로마토그래피 단계에 개시할 수 있도록 하여 정제 단계중에 필요한 공정 단계의 수를 감소시킬 수 있다는 점에서 유리하다.

놀랍게도, 바람직한 고염 용액(예를 들면, 1.0M NaCl, 10mM TRIS 완충제, pH 8.2, 2mM EDTA, 0.03% 폴리소르베이트 80 및 2 내지 20mM DTT)이 당해 공정에서 약 100% HPV 단백질 질량 회수를 가능케한다는 것이 밝혀졌다. 또 다른 고염 용액(0.63M NaCl, 35mM 포스페이트 완충제, 100mM TRIS 완충제, pH 8.2, 2mM EDTA, 0.03% 폴리소르베이트 80 및 2 내지 20mM DTT)도 또한 바람직하다.

HPV VLP 분해의 효력에 미치는 고염 농도의 효과를 보다 이해하고 특징을 결정하기 위하여, 고염(0.5 내지 1.0M NaCl) 및 저염(생리학적) 분해 상태하 모두에서 비교 연구를 수행한다. 정적 광 산란 강도에서의 변화를 모니터링하여 VLP 분해를 평가한다. 고염 및 생리학적 염 상태하 모두에서 결과는 상당히 유사하게 관찰되었다 - (20mM)DTT 첨가후 약 2분내에 완전한 VLP 분해가 일어났다. 분해의 추가적 반응속도론은 염 농도 보다는 차라리 환원제의 농도에 의해 제어되는 것으로 보이는데, 이는 환원제의 고 농도가 주어진 온도 및 pH에서의 신속한 분해와 상관이 있음을 나타낸다.

생리학적 염 또는 고염하에서 분해되고 조립된 VLP의 다른 생물물리학적 특성을 조사한다. 고염 및 저염 상태하 모두에서의 분해/재조립 VLP에 대한 열 안정성 및 유체역학적 크기 분포는 유사하다. 그러나, 총 단백질 질량 회수는 고염 분해 공정에 의해 생성된 분해/재조립된 HPV VLP의 경우에 비교적 더 높다(100%에 근접).

해리 혼합물의 또 다른 성분은 비이온성 계면활성제이다. 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, Triton X-100^R, Triton X-114^R, NP-40^R, Span 85, 및 비이온성 계면활성제의 Pluronic 시리즈의 구성원으로 이루어진 그룹중에서 선택될 수 있다. 폴리소르베이트 80이 특히 바람직하다. 폴리소르베이트 80의 바람직한 농도는 약 0.01 내지 0.50%이고, 바람직하게는 약 0.01 내지 0.10%, 특히 바람직하게는 약 0.03%이다.

해리 혼합물은 완충제의 존재에 의해 pH가 조절되어야 한다. HPV VLP의 분해는 광범위한 염기성 pH, 예를 들면 7.0 내지 10에서 일어날 수 있다. 바람직한 pH는 8.0 내지 8.5이고, 바람직하게는 약 8.2이다. 바람직한 완충제는 5 내지 100mM, 바람직하게는 5 내지 15mM의 TRIS이나, 포스페이트와 같은 다른 완충제가 사용될 수 있다. TRIS가 해리 혼합물 상태에 양호한 pH 및 이온 농도 조절을 제공하기 때문에, TRIS가 일반적으로 바람직하다. 임의로, 포스페이트 완충제가 0 내지 50mM로 첨가될 수 있다.

또한, 금속 킬레이팅제가 해리 혼합물중에 존재하여 VLP의 완전한 분해를 보장한다. 바람직한 금속 킬레이팅제는 0.5 내지 5mM, 바람직하게는 약 2mM의 EDTA이나, 다른 공지된 킬레이팅제가 사용될 수 있다.

특히 바람직한 해리 혼합물은 10mM TRIS 완충제(pH 8.2)중의 HPV VLP 단백질 300mcg/ml를 포함하고, 추가로 0.16M 내지 0.18M NaCl, 10 또는 20mM DTT, 2mM EDTA, 및 0.03% 폴리소르베이트 80을 함유한다. 달리, 해리 혼합물은 0.63M NaCl, 35mM 포스페이트, 100mM TRIS 완충제(pH 8.2), 10 또는 20mM DTT, 2mM EDTA, 및 0.03% 폴리소르베이트 80중에 동일한 양의 단백질을 포함한다.

본 발명의 방법에 있어서 이점은 분해 단계가 상당히 신속하며, 실온에서 약 1시간 미만 동안 해리 혼합물내에서 VLP를 항온처리하는 단계만을 요구하여, 30 내지 40분 정도의 짧은 시간이 사용될 수 있다는 것이다. 경우에 따라, 해리 단계( 및 분해/재조립 공정의 다른 단계)를 멸균 상태에서 수행할 수 있다. 예를 들면, 완충제 성분을 멸균 여과하여, 멸균 단백질 용액과 함께 사용할 수 있다. 또한, 용액중의 분해/재조립된 HPV VLP를 사용하기 전에 또는 알루미늄 애주번트에 흡착시키기 전에 멸균 여과시킬 수 있다.

VLP의 분해가 완료된 후, 환원제는 제거되어야 한다. 이는 투석 단계 또는 투석여과(diafiltration)/한외여과 단계를 사용함으로써 달성될 수 있다. 투석 단계는, 염(생리학적 농도, 또는 고염 공정이 사용되는 경우 1M과 같은 고염 농도), 비이온성 계면활성제, 및 해리 혼합물에 존재하는 것과 유사하나 해리 혼합물에 존재하는 것 보다 pH가 낮은 완충제의 용액에 대한 투석을 포함한다. 이러한 투석단계에서 권고된 pH 범위는 약 6.5 내지 7.5이고, 바람직하게는 약 7.0이다. 바람직한 투석 용액은 0.16 내지 0.18M NaCl, 0.01 내지 0.03% 폴리소르베이트 80, 10mM 포스페이트를 포함하고, pH 7.0이다. 권고된 투석의 또 다른 예는 0.166M NaCl, 10mM 포스페이트 완충제의 용액(pH 7.0)에 대한 1:100 투석(3회 교환, 각각 30분)이다. 달리, 바람직한 용액은 1.0M NaCl, 10mM 포스페이트, 및 0.03% 폴리소르베이트 80를 포함하고, pH 7.0이다.

필요한 경우, DTT를 제거하기 위하여, 추가적 비이온성 세제, 예를 들면 폴리소르베이트 80을 사용된 완충제에 가하여, 당해 공정을 통해 단백질과 비이온성 세제의 충분한 수준을 유지할 수 있다.

달리, 후술될 재조립 용액을 사용하여 DTT를 제거할 수 있다.

보다 많은 용량을 사용하는 경우, 측정가능한 투석여과 및 한외여과 장비를 투석 공정 대신에 사용할 수 있다.

재조립

다음 단계는 VLP를 재조립하는 것이다. 이는 상기한 투석 단계중, 상기한 투석여과/한외여과 단계, 또는 별도의 또는 추가적 투석 단계중에 수행될 수 있으며, 수 시간 내지 약 24시간이 소요될 수 있다. 별도의 투석을 사용하는 경우, 당해 투석은, 0.5 내지 1.35M NaCl 범위의 이온 농도의 염, 금속 이온 공급원, 완충제(pH 6.0 내지 6.5)을 포함하는 재조립 완충제를 사용하여 수행한다.

당해 염은 바람직하게는 앞의 단계에서 사용된 것과 동일한 염이나, 이의 농도는 바람직하게는 보다 높다. 예를 들면, NaCl을 사용하는 경우, 이는 0.5 내지 1.35M, 바람직하게는 약 1.0M의 농도로 존재하여야 한다.

금속 이온 공급원은 Ca⁺²또는 Mg⁺²공급원, 예를 들면 CaCl₂또는 MgCl₂이어야 하고, 존재하는 경우 재조립된 VLP에 대해 안정성을 제공하리라 여겨진다. 아연도 또한 사용될 수 있으나, 통상적으로 다른 이온 보다는 덜 유익하다. CaCl₂가 바람직하다. 금속 이온의 양은 약 1 내지 10mM, 바람직하게는 약 2mM의 농도로 존재하여야 한다.

글리신 또는 시트르산나트륨을 재조립 완충제 성분 및/또는 pH 조절제로서 첨가한다. 첨가량의 범위는 약 20 내지 70mM, 바람직하게는 약 50mM이다.

완충제는 글리신과 포스페이트와 배합물, 또는 시트레이트와 포스페이트의 배합물, 또는 시트레이트 단독일 수 있다. 포스페이트를 단독으로 사용하는 것은 권장되지 않는다 바람직한 재조립 완충제는 1M NaCl, 2mM Ca⁺², 50mM 시트레이트, pH6.2, 및 0.03% 폴리소르베이트 80이다.

필요한 경우, 추가적 비이온성 세제, 예를 들면 폴리소르베이트 80을 재조립 완충제에 첨가하여, 당해 공정을 통해 단백질과 비이온성 세제의 충분한 수준을 유지할 수 있다.

완충제 교환

최종적으로, 최종 투석 완충제를 사용하여 투석에 의해 모든 잔류 시약을 제거한다. 하나의 예는 염(바람직하게는 NaCl), 비이온성 계면활성제, 및 임의의 히스티딘을 함유한다. 염, 예컨대 NaCl은 약 0.25M 내지 1M, 보다 바람직하게는 약 0.5M로 존재하는 것이 바람직하다. 히스티딘(pH 6.0 내지 6.5, 바람직하게는 약 6.2)은 2 내지 50mM, 바람직하게는 약 5 내지 20mM로 존재할 수 있다. 비이온성 계면활성제, 예를 들면 폴리소르베이트 80 또는 폴리소르베이트 20은 0.01 내지 0.03%로 존재할 수 있다. 또 다른 바람직한 완충제 교환은 0.5M NaCl 및 0.03% 폴리소르베이트 80이다.

HPV VLP를 분해/재조립하는데 사용된 이러한 다중 투석 단계는 투석여과 및/또는 한외여과 시스템과 같은 대규모의 장비를 사용하여 수행할 수 있다. 필요한 경우, 추가적 비이온성 세제, 예를 들면 폴리소르베이트 80을 임의의 분해/재조립 완충제에 첨가하여, 당해 공정을 통하여 단백질과 함께 비이온성 세제를 충분한 수준으로 유지할 수 있다.

경우에 따라, 분해/재조립된 HPV VLP를 공지된 기술을 사용하여 알루미늄 애주번트상에 흡착시킬 수 있다.

임의로, 재조립된 VLP 제형물의 안정성이 다가음이온성, 중합체성 부형제의 첨가에 의해 더욱 증가될 수 있다. 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐 사용된, "다가음이온성 중합체(polyanionic polymer)"란 용어는 단일 장쇄를 가지거나, 다중 가교된 쇄를 갖는 화합물을 의미하며; 용액중에서 두 유형 모두 쇄를 따라 수개의음전하를 포함한다. 다가음이온성 단백질의 예에는 단백질, 다가음이온, 펩티드 및 폴리-핵산이 포함된다. 특정 안정화제는 카복시메틸 셀룰로즈(특히 10 내지 800cps), 헤파린(6-30kDa), 폴리-아미노산(2 내지 100kDa)[예: 폴리(Glu), 폴리(Asp) 및 폴리(Glu, Phe)], 산화된 글루타티온[Glu-Cys-Gly]₂(613 Da), 폴리-뉴클레오티드[예: 폴리시티딜산(200 내지 700kDa) 및 폴리아데닐산(200 내지 700kDa)], RNA, DNA, 및 혈장 알부민으로 부터 이루어진 그룹중에서 선택된다.

다가음이온성 중합체 부형제의 농도는, 존재시, 약 0.01% 내지 0.5%, 특히 약 0.05 내지 0.1%(중량/용량)이나, 다가음이온성 부형제(예: 0.01% 알부민, DNA 또는 헤파린)의 10배 적은 양을 첨가하더라도, 미처리된 HPV VLP-알루미늄 제형물에 대해 증가된 안정성을 제공한다.

전형적인 백신 제형물은, 1) 각각의 HPV VLP 유형 10 내지 200mcg/mL 및 0.15 내지 0.32M 염수를 함유하는 알루미늄-흡착된 생성물, 2) 5 내지 10mM 히스티딘, pH 6.2, 및 3) 0.005 내지 0.03% 비이온성 계면활성제를 포함한다.

상기 방법에 의해 생성된 HPV 백신 제형물은, 도 7에서 보여지는 바와 같이, 2-8℃ 내지 실온에서 6개월 이상(연구 진행중) 안정하다.

본 발명의 또 다른 양상은, 분해/재조립된 VLP로 제조된 백신을 안정하게 장기간 저장하기 위하여, 제형물 완충제를 사용하는 것이다. 제형물 완충제는 0.15 내지 0.32M NaCl, 5 내지 10mM 히스티딘, pH 6.2, 및 0.005 내지 0.015% 폴리소르베이트 80을 포함한다. 이들 백신 제형물은 적어도 6개월까지 다양한 온도 범위(4내지 30℃)에서 안정하다. 후술되는 비-제한적인 실시예는 본 발명을 보다 명확히 하기 위해 제공된다.

본 발명은,

(a) 비교적 저 농도의 환원제, 생리학적 이온 농도 내지 1.25M 범위로 존재하는 염, 비이온성 계면활성제, 금속 킬레이팅제, 및 완충제를 포함하는 해리 혼합물중에서, VLP가 분해될 때까지 VLP를 항온처리하는 단계;

(b) 해리 혼합물로 부터 환원제를 제거하는 단계; 및

(c) 분해된 VLP를 VLP로 재조립하는 단계를 포함하여, 안정한 사람 파필로마바이러스(HPV) 바이러스-유사 입자(VLP)를 제조하는 방법에 관한 것이다.

일부 태양에서, 재조립된 VLP는 알루미늄 애주번트에 흡착된다.

또한, 본 발명은,

(a) 비교적 저 농도의 환원제, 0.5M 내지 1.25M 범위로 존재하는 염, 비이온성 계면활성제, 금속 킬레이팅제, 및 완충제를 포함하는 고염 해리 혼합물중에서, VLP가 분해될 때까지 정제된 VLP를 항온처리하는 단계;

(b) 해리 혼합물로 부터 환원제를 제거하는 단계;

(c) 분해된 VLP를 VLP로 재조립하는 단계; 및

(d) 임의로, 재조립된 HPV VLP를 알루미늄 애주번트에 흡착시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 VLP에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 태양은,

(a) 비교적 저 농도의 환원제, 거의 생리학적 이온 농도로 존재하는 염, 비이온성 계면활성제, 금속 킬레이팅제, 및 완충제를 포함하는 저염 해리 혼합물중에서, VLP가 분해될 때까지 정제된 VLP를 항온처리하는 단계;

(b) 해리 혼합물로 부터 환원제를 제거하는 단계;

(c) 분해된 VLP를 VLP로 재조립하는 단계; 및

본 발명의 또 다른 양상은 상기 방법의 어느 하나에 의해 생성된 VLP로 부터 제조된 백신에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 VLP를 포함하고, 제형물 완충제중에서 저장되는 백신 제형물에 관한 것이다. 당해 제형물 완충제는 염, 히스티딘 완충제, 및 비이온성 계면활성제를 포함한다.

실시예 1

0.5M NaCl, 0.003% 폴리소르베이트 80 중의 효모-유래된 재조합 L1 단백질 HPV 16 VLP(단백질 순도 95% 초과)의 용액(목표 pH 약 6.2)을 본 실험의 대부분에 사용한다. HPV 6a VLP 및 HPV 11 VLP는 0.5M NaCl, 0.03% 폴리소르베이트 80에 넣는다. HPV 18 VLP는 0.5M NaCl, 0.01% 폴리소르베이트 80에 넣는다. 이들 연구의 일부는, 1.25M NaCl을 함유하는 75mM 포스페이트 완충제(pH 7)중의 HPV 6a, 11 및 16 VLP을 이용한다.

후속적인 시험관내 분석을 위한 알루미늄 애주번트로 부터의 HPV VLP의 방출

알루미늄 애주번트로 부터 HPV VLP를 방출시키기 위해, HPV-알루미늄 제형물을 시트레이트 및 폴리소르베이트 80을 함유하는 고염 용액으로 희석함을 포함하는 알루미늄 용해 방법이 개발되었다. 알루미늄 용해법으로 부터 수득된 HPV VLP 샘플을, BIAcore 분석을 사용하여 시험관내 항원성 분석에 직접 적용한다.

시험관내 항원성 분석

알루미늄 용해법으로 부터 수득된 HPV VLP 샘플을, 0.02% 폴리소르베이트 80을 함유하는, pH가 6 내지 6.5이고 고 이온 농도(약 0.5M 내지 1M NaCl, 0.1M 시트르산나트륨)인 안정화 용액중에 넣는다. 당해 샘플을 추가로 희석시키지 않고 BIAcore 분석에 직접 적용한다(HPV VLP 유형 특이적 중화 항체 이용). 용액 샘플(알루미늄 애주번트 부존재)을, BIAcore 분석에 앞서, 약 0.5 내지 1M NaCl로 목적 농도로 희석시킨다. 모든 항원성 데이타는 동결된 HPV VLP 대조군 샘플(알루미늄 비 흡착)에 비교된다.

단백질 농도 분석

벌크 용액 및 제형화된 샘플(알루미늄 용해 후) 둘 모두의 HPV VLP의 단백질 농도를, HP 8542A Diode Array 분광계 및 1cm 길이의 통로를 갖는 큐벳을 사용하여 주위 온도에서 UV 흡수 스펙트럼을 측정하여, 판정한다. 샘플 용적은 100 내지 250㎕이다. 단백질 농도를 다중-성분 제2 유도체 분석 기술을 사용하여 계산한다. 일부 실험에서, 단백질 농도를 BCA 착색 분석에 의해 측정한다.

유체역학적 크기 분석

미처리된 HPV VLP 및 분해/재조립된 HPV VLP의 유체역학적 크기를 동적 광 산란, 분석적 초원심분리, 및 SEC-HPLC로 측정한다.

동적 광 산란 측정은 90℃에서 Malvern 4700 광 산란 시스템을 사용하여 주위 온도에서 수행한다. HPV VLP의 겉보기 유체역학적 크기를 Z-평균 유체역학적 직경으로서 측정한다. 각각의 값은 동일한 샘플의 5회 측정치의 평균이다.

침강 속도 실험을 Beckman XLI 분석적 초원심분리와 280nm에서의 UV 검출을 사용하여 수행한다. 고정 및 가변 속도 모드를 포함하는 두 개의 상이한 방법을 사용하여 침강 계수를 측정한다.

SEC-HPLC 측정을 UV 및 형광 검출기와 Waters/Millennium 2690 시스템을 사용하여 주위 온도에서 수행한다. PLGFC 4000Å 칼럼(HPV VLP로 미리 조절함)을 이동상으로서 750mM NaCl, 25mM 포스페이트 완충제(pH 7)를 사용하여 0.4ml/분의 유속에서 사용한다.

전자현미경 분석

투과 전자현미경(TEM)을 네가티브 염색을 사용하여 수행한다. 샘플을 고정시키고, 포스포텡스텐산으로 염색하고, JEOL 1200 EX 투과 전자현미경으로 조사한다. 30,000x 내지 40,000x 배율로 수회 취한 샘플의 임의의 부위의 현미경 사진을 찍는다. 음화로 부터 인화지를 현상하는데 추가로 3배의 배율을 도입한다.

실시간 및 촉진된 저장 안정성 연구

HPV-알루미늄 제형물 저장 안정성 연구를 수행한다. 안정성 연구의 온도는 일반적으로 2 내지 8, 15, 25, 30 및 37℃이다. 환상 이색성 및 형광성 분광분석에 의한 이전의 입체형태적 통합 데이터(제시되지 않음)로 부터 알 수 있는 바와 같이, 40 내지 45℃ 이상의 온도 증가는 HPV VLP의 L1 단백질에서 상당한 입체형태적 변화를 유도하며, 이러한 상태는 촉진된 저장 안정성 연구에서 분명히 피할 필요가 있다.

HPV VLP 열 안정성을 혼탁도 분석에 의해 평가하며, 이러한 혼탁도 분석은 HP 845X UV-Visible 시스템 소프트웨어 및 온도 제어 시스템이 장착된 HP 8542A Diode Array 분광계를 사용하여 수행한다. 용액의 광 산란(단백질의 응집에 의함)을, 제어된 속도로 온도가 24℃에서 74℃로 증가하도록 한 프로그램의 동적 모드하에서 350nm에서 수행한다.

마우스 효능 시험

HPV VLP의 생체내 면역원성을 BALB c 마우스에서 평가한다. HPV VLP 샘플을 알루미늄 애주번트상에 흡착시키고, 알루미늄 애주번트로 여러 목표 농도로 희석시키고, 마우스내로 주사한다. 혈청을 수집하고, ELISA 분석에 의해 항체 수준을 분석한다.

실시예 2

분석적 초원심분리 분석으로 측정된 HPV 16 VLP의 분해 및 재조립

도 1에 도시된 바와 같이, HPV 16 VLP을 10mM TRIS 또는 포스페이트, 0.166M NaCl, 2mM EDTA, 및 2mM DTT을 함유하는 pH 8.2 완충제중에서 20분간 실온으로 항온처리(중간 곡선)한 후 분해한다. 분해된 HPV 16 샘플은 L1 캡소미어에 대해 예견되었던 것 보다 작은 S 값에서 피크를 나타내었으며, 이는 HPV L1단백질 오량체의 크기를 제시한다. 상단의 곡선은, 분해된 HPV 16(캡소미어)가 글리신 또는 시트레이트의 존재하에 10mM 인산나트륨, 0.5 내지 1M NaCl, 2mM 염화칼슘을 함유하는 pH 6.2 완충제로 투석시킴으로써 재조립됨을 보여준다. 하단 곡선은 미처리된 HPV 16 VLP를 보여준다.

실시예 3

분해/재조립된 HPV 16 VLP의 입자 크기 분포

도 2는 분석적 초원심분리 분석에 의해 측정된, 실시예 2에 기술된 분해 및 재조립된 HPV 16 VLP(점선) 및 미처리된 HPV 16 VLP(실선)의 입자 크기 분포를 보여준다. 당해 데이터에 의해 밝혀진 바에 따르면, 피크의 위치와 폭으로 각각 판단하건대, 분해/재조립된 HPV 16 VLP가 보다 크고, 보다 균질한 분포를 가진다. 전자현미경(EM) 분석은 분석적 초원심분리 분석을 확인시켜주며; 이는 분해/재조립된 VLP가 보다 균질하고, 평균 입자 직경이 약 80 내지 85nm인 균일한 크기의 원형 입자로 존재함을 보여준다(EM 데이터는 제시되지 않음). 미처리된 샘플은 보다 작고, 보다 이질적인 형상이고, 평균 크기가 약 50 내지 68nm인 크기 분포를 갖는 것으로 여겨진다. 유사하게, 후의 데이터 셋트는, 미처리된 HPV 16 VLP가 약 40nm의 평균 크기를 갖는 반면, 재조립된 HPV 16 VLP는 약 60nm의 평균 크기를 가짐을 보여준다.

실시예 4

BIAcore 분석에 의해 측정된, HPV 16 VLP-알루미늄 백신 제형물의 촉진된안정성(37℃)

분해/재조립된 HPV 16 VLP 및 미처리된 HPV 16 VLP를 알루미늄 애주번트상에 흡착시키고(단백질 160mcg/ml 및 Al 450mcg/ml), 0.32M NaCl, 10mM 히스티딘, 0.015% 폴리소르베이트 80(pH 6.2)중에 제형화시킨다. 샘플의 시험관내 항원성을 BIAcore 분석에 의해 특정 시간에 분석한다.

도 3에서, 분해되고 재조립된 HPV 16 VLP는 채워진 원과 빈 사각형으로 도시되어 있으며; 미처리된 HPV 16 VLP은 채워진 다이아몬드로 도시되어 있다. Run 1은 재조립 완충제중에 시트레이트를 함유하고, Run 2는 글리신을 함유한다. 당해 데이터에 따르면, 분해/재조립 공정이 미처리된 HPV VLP에 비해 알루미늄 애주번트 흡착된 HPV 16 VLP의 촉진된 저장 안정성을 현저하고 급격하게 증진시킨다는 것이 입증된다. 알루미늄 흡착된 분해/재조립된 HPV VLP의 시험관내 항원성의 상실이, 3개월 후 25℃ 및 4℃에서 수행된 유사한 실험에서 관찰되지 않았다.

실시예 5

BIAcore 분석에 측정된, 생리학적 염 용액중의 HPV 16 VLP의 용액내 촉진된 안정성(37℃)

80mcg/ml의 분해/재조립된 HPV 16 VLP 및 미처리된 HPV 16 VLP를 0.15M NaCl, 10mM 히스티딘, 0.015% 폴리소르베이트 80(pH 6.2)중에서 37℃에서 항온처리한다. 샘플의 시험관내 항원성을 BIAcore 분석에 의해 특정 시간에 분석한다. 당해 데이터에 따르면, 분해/재조립 공정이 미처리된 HPV VLP에 비해 HPV 16 VLP의촉진된 저장 안정성을 현저하게 증진시킨다는 것이 입증된다. 이는 도 4에 도시되어 있으며, 여기서 분해 및 재조립된 VLP는 빈 원형 및 빈 사각형으로 도시되고, 미처리된 VLP는 채워진 다이아몬드형으로 도시된다. Run 1은 재조립 완충제중에 시트레이트를 함유하고, Run 2는 글리신을 함유한다.

실시예 6

UV 분광분석(구름점 분석)에 의해 열-유도된 혼탁 형성(응집)을 모니터링하여 측정된, 상이한 롯트의 HPV 16 VLP의 열 안정성에 미치는 분해/재조립 공정 처리의 효과

표준 구름점 프로토콜을 샘플에 적용한다: 제어된 속도로 24℃로 부터 74℃로 가열하면서, 용액의 흡광도를 350nm에서 측정한다. 도 5에 도시된 바와 같이, 3개의 상이한 롯트의 HPV 16 VLP(롯트 1, 2, 3)를 분해/재조립 처리 전(점선 및 빈 기호) 및 후(실선 및 채워진 기호)에 분석한다. 이들 샘플중에서 HPV 16 VLP(롯트 1)을 3회 시험한다. 당해 데이터에 따르면, 분해/재조립 공정 처리가 열-유도된 응집에 대한 HPV 16 VLP의 고유 안정성을 현저히 증가시킨다는 것이 입증된다. 열 안정성 증가와 더블어, 분해/재조립 공정 처리에 의해 일정하고 균일한 안정성 프로파일이 수득된다.

실시예 7

미처리된 HPV 16 VLP 및 분해/재조립된 HPV 16 VLP의 시험관내 항원성을 다량의 HPV 16 VLP를 사용하여 평가하는데, 이때 미처리된 VLP 및 분해/재조립된 VLP 둘다를 알루미늄 애주번트에 흡착시키기 전 및 후에 평가한다. 시험관내 항원성을 BIAcore 분석에 의해 측정하고, 단백질 농도를 UV 분광분석 및 BCA 착색 분석에 의해 측정한다. 이어서, 항원 대 단백질 비를 미처리된 HPV 16 VLP 및 분해/재조립된 HPV 16 VLP 모두에 대해 측정한다. 분해/재조립된 HPV 16 VLP의 시험관내 항원성은 약 50% 증가된다. 예를 들면, 분해/재조립된 HPV 16 VLP 대 미처리된 HPV 16 VLP에 있어서 항원 대 단백질 비는 1.7이고, 1.5 내지 1.9 범위내 이다. 이러한 관찰은 EIA 분석(평균 1.6 및 범위 1.5 내지 1.9) 및 IVRP 분석(평균 1.4 및 범위 1.3 내지 1.5)에 의해 확인된다.

미처리된 HPV 16 VLP 및 분해/재조립된 알루미늄 흡착된 HPV 16 VLP의 생체내 면역원성을 마우스 효능 시험을 이용하여 평가한다. 이러한 시험에 의해, 마우스 혈청전환(seroconvert)의 50%를 초과하는 HPV VLP의 용량(mcg)을 나타내는 ED50 값이 수득된다. 분해/재조립된 HPV 16 VLP의 생체내 면역원성은 미처리된 HPV 16 VLP과 등가이거나, 이보다 우수하다. 실험에 의해 밝혀진 바에 의하면, 두 개의 분해/재조립된 샘플에 대한 ED50 값은 0.034 내지 0.062인 반면, 미처리된 샘플에 대한 ED50 값은 0.146이다. 제2의 마우스 실험에서, 3개의 분해/재조립된 HPV 16 VLP 샘플에 대한 ED50이 0.0125 미만인 반면, 미처리된 샘플에 대한 ED50 값은 0.074이다.

실시예 8

BIAcore 분석에 의해 측정된, 용액 및 알루미늄 애주번트내의 미처리된 HPV VLP 및 분해/재조립된 HPV VLP의 촉진된 안정성(37℃)

HPV VLP 80mcg/ml을 0.32M NaCl, 10mM 히스티딘, 0.015% 폴리소르베이트 80을 함유하는, pH 6.2, 37℃의 용액에서 항온처리한다. 샘플을, 도 6에서 표시된 시간에 BIAcore로 시험관내 항원성에 대해 분석한다. 당해 데이터에 나타난 바에 의하면, 분해/재조립 처리를 통해, 촉진된 저장 안정성 시험 동안에, 용액내의 HPV VLP 유형 6a, 11 및 16에 대한 안정성이 급격하게 향상된다. 미처리된 HPV 18 VLP는 다른 3개의 유형에 대한 분해/재조립된 VLP와 유사한 안정성 프로파일을 보여준다. 아마도 분해/재조립 처리가 HPV 18 VLP에 영향을 줄 수 없음으로 인해, HPV 18 VLP 처리시 현저한 안정성 증가가 관찰되지 않는다(데이터는 제시되지 않음). 이러한 연구에 사용된 샘플은 저염 분해 공정에 의해 생성된다. 분해/재조립 처리를 통한 4개의 유형에 대한 단백질 질량 회수는, HPV 11, 16 및 18 VLP의 경우 약 85 내지 95%이고, HPV 6a VLP의 경우 약 60 내지 70%이다. 분해/재조립 처리를 통한 수율은, VLP 응집면에서 특정 롯트의 HPV VLP의 성질에 의해 영향을 받는 것으로 보인다. 고염 상태하에서 분해 공정이 일어나는 경우, 분해/재조립 처리를 통한 단백질 질량 회수는 거의 100%로 증가한다. 분석적 초원심분리에 의한 분해/재조립된 HPV VLP의 분석에 의하면, 분해/재조립 처리를 통해 캡소미어가 VLP로 거의 정량적으로 재조립됨이 제시된다.

도 7은, HPV VLP 400mcg/ml을 알루미늄 애주번트 450mcg/ml상에 흡착시키고, 0.32M NaCl, 10mM 히스티딘, 0.015% 폴리소르베이트 80을 함유하는 pH 6.2의 용액중에서 4℃, 15℃, 25℃, 30℃ 및 37℃로 항원처리한다. 샘플을, 알루미늄 애주번트로 부터 항원을 방출시키기 위하여 시트레이트 용액중에 처리한 후, 도면에서 표시된 시간에 BIAcore로 시험관내 항원성에 대해 분석한다. 당해 데이터가 나타내는 바에 따르면, 분해/재조립 처리에 의해, 촉진된 저장 안정성 시험 동안에, 알루미늄 흡착된 HPV VLP 유형 6a, 11 및 16에 대한 안정성이 급격히 증가된다. 미처리된 HPV 18 VLP는 다른 3개의 유형에 대한 분해/재조립된 VLP와 유사한 안정성 프로파일을 보여준다. HPV 18 VLP의 분해/재조립 처리시, 현저한 안정성 증가가 관찰되지 않는다.

실시예 9

저염 분해 공정 및 고염 분해 공정 모두에 의해 제조된, 재조립된 HPV 6a, HPV 11, 및 HLP 16 VLP의 열 안정성 및 유체역학적 크기 분포

샘플을 구름점 및 분석적 초원심분리 분석으로 평가한다. 저염 공정에서, HPV VLP를 0.166M NaCl, 10mM TRIS 용액(pH 8.2)에서 분해하는 반면, 고염 공정에서 HPV VLP를 0.63M NaCl, 35mM 포스페이트, 및 100mM TRIS 용액(pH 8.2)에서 분해한다. 두 용액 모두 EDTA 및 폴리소르베이트 80을 함유한다. 도 8에 제시된 바와 같은 데이터는, 저염 및 고염 공정에 의해 제조된 분해/재조립된 HPV VLP가, HPV VLP 유형 11, 6a 및 16의 경우 이들의 열 안정성 및 유체역학적 크기 분포면에서 유사하다.

실시예 10

SEC-HPLC 분석에 의해 측정된, HPV VLP의 입자 크기 분포 및 표면 친화성

분해/재조립된 HPV VLP(도 9, 실선) 및 미처리된 HPV VLP(유형 11, 16 및 6a)(점선)를 4000A GPC 크기 배제 칼럼상에서 분석한다. 단일 피크가, 미처리된 HPV VLP의 보다 이질적인 분포에 비해, 분해/재조립된 HPV VLP로 부터 수득된다. 분해/재조립된 HPV VLP의 단량체 피크는 미처리된 HPV VLP의 단량체 피크 보다도 더 작은 용출 용적을 가지는데, 이는 분해/재조립된 VLP의 경우에 비교적 입자 크기가 더 크다는 것을 제시한다. 분해/재조립된 HPV VLP의 전체 피크 면적이 비교적 더 크다는 것은 분해/재조립된 VLP의 회수율이 더 크다는 것을 나타내며, 분해/재조립된 VLP가 미처리된 VLP 보다 컬럼에 대해 더 낮은 친화성을 가짐을 제시한다. 미처리된 HPV 18 VLP는 다른 3개의 유형의 분해/재조립된 VLP과 유사한 SEC HPLC 프로파일을 보여준다.

Claims

(a) 비교적 저 농도의 환원제, 거의 생리학적 이온 농도 내지 1.25M 범위로 존재하는 염, 비이온성 계면활성제, 금속 킬레이팅제, 및 완충제를 포함하는 해리 혼합물에서, VLP가 분해될 때까지 VLP를 항온처리하는 단계;

(b) 해리 혼합물로 부터 환원제를 제거하는 단계; 및

(c) 분해된 VLP를 VLP로 재조립하는 단계를 포함하여, 안정한 사람 파필로마바이러스(HPV) 바이러스-유사 입자(VLP)를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 해리 혼합물중의 환원제가 약 2 내지 20mM 디티오트레이톨(DTT)인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 해리 혼합물중의 염이 NaCl, KCl, Na₂SO₄, (NH₄)₂SO₄인산나트륨, 시트르산나트륨, 및 이의 혼합물로 이루어진 그룹중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 해리 혼합물중의 비이온성 계면활성제가 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, Triton X-100^R, Triton X-114^R, NP-40^R, Span 85, 및 Pluronic 비이온성 계면활성제로 이루어진 그룹중에서선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 비이온성 계면활성제가 0.01 내지 0.5% 폴리소르베이트 80인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 해리 혼합물중의 완충제가 pH 7 내지 10의, TRIS 또는 포스페이트 완충제인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 해리 혼합물중의 금속 킬레이팅제가 0.5 내지 5mM의 EDTA인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (a)를 실온에서 약 1시간 미만으로 수행하는 방법.
제8항에 있어서, 단계 (a)를 실온에서 30분 내지 40분간 수행하는 방법.
제3항에 있어서, 염이 NaCl인 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 해리 혼합물중의 염이 0.10M 내지 0.2M NaCl인 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 해리 혼합물중의 염이 0.50M 내지 1.25M NaCl인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (b)가 투석 또는 투석여과(diafiltration)/한외여과 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 투석 단계가 생리학적 염 또는 보다 높은 농도의 염, 비이온성 계면활성제, 및 해리 혼합물중에 존재하는 것 보다 pH가 낮은 완충제의 용액에 대한 투석 또는 투석여과/한외여과를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 투석 단계가 0.5 내지 1.35M NaCl 범위의 이온 농도의 염, 금속 이온 공급원, 및 pH 6.0 내지 6.5의 완충제를 포함하는 재조립 완충제에서의 투석 또는 투석여과/한외여과를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (c)가 0.5 내지 1.35M NaCl 범위의 이온 농도의 염, 금속 이온 공급원, 및 pH 6.0 내지 6.5의 완충제를 포함하는 재조립 완충제를 이용하는 투석 또는 투석여과/한외여과 단계를 포함하는 방법.
제16항에 있어서, 금속 이온 공급원이 Ca⁺²또는 Mg⁺²공급원인 것을 특징으로 하는 방법.
제17항에 있어서, 금속 이온 공급원이 0.5 내지 5.0mM의 CaCl₂또는 MgCl₂인 것을 특징으로 하는 방법.
제16항에 있어서, 완충제가 a) 글리신 및 포스페이트, b) 시트레이트 및 포스페이트, 및 c) 시트레이트로 이루어진 그룹중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제16항에 있어서, 재조립 완충제가 1M NaCl, 2mM Ca⁺², 50mM 시트레이트, pH 6.2, 및 0.03% 폴리소르베이트 80을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 0.25 내지 1.25M NaCl, 비이온성 세제, 및 임의로, pH 6.0 내지 6.5의 히스티딘 완충제를 포함하는 최종 완충제를 포함하는 투석 단계로 추가로 정제하는 (d) 단계를 포함하는 방법.
제21항에 있어서, 비이온성 세제가 폴리소르베이트 80 또는 폴리소르베이트 20인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 분해/재조립된 VLP를 알루미늄 애주번트상에 흡착시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, VLP가 HPV 6a, HPV 6b, HPV 11, HPV 16, HPV 18 및 이의 조합물로 이루어진 그룹중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
(a) 0.16 내지 0.18M NaCl, 2 내지 20mM DTT, 0.01 내지 0.03% 폴리소르베이트 80, 0.5 내지 5mM EDTA, 및 5 내지 15mM TRIS 완충제(pH 8.2)를 포함하는, 저염 해리 혼합물중에서 VLP를 30 내지 40분 동안 항온처리하여, VLP를 분해시키는 단계;

(b) 임의로, 0.16 내지 0.18M NaCl, 0.01 내지 0.03% 폴리소르베이트 80, 및 10mM 포스페이트(pH 7.0)를 포함하는 완충제에 대한 투석을 사용하여, 상기 해리 혼합물로 부터 DTT를 제거하는 단계;

(c) 1.0M NaCl, 2mM CaCl2, 및 50mM 시트르산나트륨, 50mM 글리신과 포스페이트, 및 50mM 시트레이트로 이루어진 그룹중에서 선택된 pH 6.2 완충제를 포함하는 재조립 완충제에 대한 투석을 사용하여, 분해된 VLP를 재조립하는 단계; 및

(d) 추가로, 0.5M NaCl 및 10mM 히스티딘(pH 6.2)를 포함하는 최종 완충제에 대한 투석을 사용하여, 재조립된 VLP를 정제하는 단계를 포함하여, HPV 바이러스-유사 입자(VLP)를 포함하는 저장 안정성 사람 파필로마바이러스(HPV) 백신을 제조하는 방법.
제25항에 있어서, 단계 (d)로 부터의 재조립된 VLP를 알루미늄 애주번트상에 흡착시키는 (e) 단계를 추가로 포함하는 방법.
(a) 0.5 내지 1.25M NaCl, 2 내지 20mM DTT, 0.01 내지 0.03% 폴리소르베이트 80, 0.5 내지 5mM EDTA, 5 내지 100mM TRIS 완충제, 및 0 내지 50mM 포스페이트 (pH 8.2)를 포함하는 고염 해리 혼합물중에서 VLP를 30 내지 40분 동안 항온처리하여, VLP를 분해시키는 단계;

(b) 임의로, 1M 이상의 NaCl, 0.01 내지 0.03% 폴리소르베이트 80, 및 10mM 포스페이트(pH 7.0)를 포함하는 완충제에 대한 투석을 사용하여, 상기 해리 혼합물로 부터 DTT를 제거하는 단계;

(c) 1.0 내지 1.35M NaCl, 2mM CaCl₂, 및 50mM 시트르산나트륨, 50mM 글리신과 포스페이트, 및 50mM 시트레이트로 이루어진 그룹중에서 선택된 pH 6.2 완충제를 포함하는 재조립 완충제에 대한 투석을 사용하여, 분해된 VLP를 재조립하는 단계; 및

(d) 추가로, 0.5M NaCl 및 10mM 히스티딘(pH 6.2)를 포함하는 최종 완충제에 대한 투석을 사용하여, 재조립된 VLP를 정제하는 단계를 포함하여, HPV 바이러스-유사 입자(VLP)를 포함하는 저장 안정성 사람 파필로마바이러스(HPV) 백신을 제조하는 방법.
제27항에 있어서, 단계 (d)로 부터의 재조립된 VLP를 알루미늄 애주번트상에 흡착시키는 (e) 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항의 방법에 의해 제조된 백신.
제23항의 방법에 의해 제조된 백신.
제25항의 방법에 의해 제조된 백신.
제28항의 방법에 의해 제조된 백신.
VLP; 및 0.15 내지 0.32M NaCl, 5 내지 10mM 히스티딘(pH 6.2), 및 0.005 내지 0.015% 폴리소르베이트 80을 포함하는 제형물 완충제를 포함하는 백신 제형물.
알루미늄 흡착된 VLP; 및 0.15 내지 0.32M NaCl, 5 내지 10mM 히스티딘(pH 6.2), 및 0.005 내지 0.015% 폴리소르베이트 80을 포함하는 제형물 완충제를 포함하는 백신 제형물.