PT1165126E

PT1165126E - Processo para a preparação de uma vacina para o papilomavírus humanos com partículas semelhantes a vírus desagregadas e reagregadas

Info

Publication number: PT1165126E
Application number: PT00918248T
Authority: PT
Inventors: David B Volkin; Henryk Mach; Li Shi
Original assignee: Merck & Co Inc
Priority date: 1999-03-26
Filing date: 2000-03-22
Publication date: 2006-12-29
Also published as: LTC1165126I2; ES2270822T3; AR023166A1; CY2007008I2; CY2007010I2; AU778937B2; CY1105779T1; NL300269I2; LU91328I2; LU91328I9; CY2007008I1; DE122007000032I1; CY2007009I1; NL300270I1; NL300269I1; SI1165126T1; CY2007009I2; EP1165126A1; DE60030698D1; US6245568B1

Description

ΡΕ1165126 1 DESCRIÇÃO "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE ΌΜΑ VACINA PARA O PAPILOMAVIRUS HUMANO COM PARTÍCULAS SEMELHANTES A VÍRUS DESAGREGADAS E REAGREGADAS"

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Esta invenção divulga uma vacina para o Papiloma-vírus Humano (HPV) que contém partículas semelhantes a vírus (VLPs) que tenham sido desagregadas em capsómeros e de novo reagregadas em VLPs. Esta invenção também se relaciona com processos de fabricação desta vacina resultando em VLPs do HPV mais homogéneas e com uma estabilidade de armazenamento grandemente melhorada.

ANTECEDENTES DÃ INVENÇÃO 0 Papilovírus Humano (HPV) infecta o tracto genital e tem sido associado com várias displasias, cancros, e outras doenças. Estas doenças são alvos habituais para o desenvolvimento de vacinas e as vacinas que contenham partículas semelhantes a vírus (VLPs) que contenham a proteína LI ou a combinação das proteínas L1+L2 estão correntemente em ensaios clínicos.

Foi descoberto, no entanto, que a proteína LI 2 ΡΕ1165126 recombinante de VLPs do HPV purificada a partir de leveduras não é estável durante o armazenamento a longo prazo, quer em solução quer quando adsorvida em partículas adjuvantes de alumínio.

No passado, vários investigadores têm investigado as condições de agregação e desagregação das VLPs do HPV. Por exemplo, McCarthy et al, 1998 "Quantitative Disassembly and Reassembly of Human Papillomavirus Type 11 Viruslike Particles in Vitro" J. Virology 72(1): 32-41, descreve a desagregação e a reagregação da LI recombinante de VLPs do HPV 11 purificada a partir de células de insectos de forma a obter uma preparação homogénea de VLPs. Foi utilizada uma incubação prolongada (cerca de 16 horas a 4 °C) com uma relativamente alta concentração de agente redutor a um poder iónico fisiológico para desagregar as VLPs, e foi utilizada a remoção do agente redutor a um poder iónico mais elevado para reagregar as VLPs. Este método, no entanto, é muito consumidor de tempo.

De forma a desenvolver uma vacina útil comercialmente, é necessária uma formulação estável no armazenamento. Será desejável ter um procedimento de tratamento simples, rápido e quantitativo para preparar uma formulação de PLVs do HPV estável no armazenamento.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Esta invenção relaciona-se com um processo de 3 ΡΕ1165126 preparação de partículas semelhantes a vírus (VLPs) do papilomavírus humano (HPV) estáveis.

Em algumas formas de realização, as VLPs reagre-gadas são adsorvidas num adjuvante de alumínio.

Esta invenção também se relaciona com a preparação de VLPs por um processo compreendendo os passos de: (a) incubar VLPs purificadas numa mistura de dissociação de alta salinidade compreendendo ditiotreitol (DTT) a 2-20 mM, um sal presente numa gama equivalente a de 0,5 M a 1,25 M de NaCl, um surfactante não iónico, um agente quelatante de metais, e um tampão até que sejam produzidas VLPs desagregadas/ (b) remover o agente redutor da mistura de dissociação; e (c) reagregar as VLPs desagregadas; e (d) adsorver opcionalmente as VLPs do HPV reagregadas em adjuvante de alumínio.

Uma outra forma de realização desta invenção relaciona-se com VLPs preparadas por um processo compreendendo os passos de: (a) incubar VLPs purificadas numa mistura de 4 ΡΕ1165126 dissociação de baixa salinidade compreendendo DTT a 2-20 mM, um sal presente numa gama equivalente a de 0,10-0,2 M de NaCl, um surfactante não iónico, um agente quelatante de metais, e um tampão até que sejam produzidas VLPs desagregadas; (b) remover o agente redutor da mistura de dissociação; e (c) reagregar as VLPs desagregadas; e (d) adsorver opcionalmente as VLPs do HPV reagregadas em adjuvante de alumínio.

Esta invenção também se relaciona com formulações de vacina compreendendo VLPs preparadas pelos processos acima, e que são armazenadas num tampão de formulação. O tampão de formulação compreende um sal, um tampão de histidina, e um surfactante não iónico.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A FIGURA 1 é um gráfico apresentando a desagregação e a reagregação de VLPs do HPV 16 conforme determinado por análise de ultracentrifugação analítica. A FIGURA 2 é um gráfico apresentando as distribuições das dimensões das partículas de VLPs do HPV 16 desagregadas e reagregadas (linha interrompida) e de VLPs 5 ΡΕ1165126 do HPV 16 não tratadas (linha a cheio) conforme determinado por análise de ultracentrifugação analitica. A FIGURA 3 é um gráfico apresentando a estabilidade no armazenamento acelerado (37 °C) de formulações de vacina do HPV 16 com aluminio conforme determinado por antigenicidade in vitro por via de análise BIAcore. A FIGURA 4 apresenta a estabilidade no armazenamento acelerado de VLPs do HPV 16 em soluções com salinidade fisiológica conforme determinado por antigenicidade in vitro por via de análise BIAcore. A FIGURA 5 apresenta o efeito do tratamento de desagregação/reagregação sobre a estabilidade térmica de diferentes lotes de VLPs do HPV 16 conforme determinado pela monitorização da agregação induzida termicamente através da turbidez em UV (análise de ponto de nuvem).

As FIGURAS 6A-D apresentam a estabilidade no armazenamento acelerado (37 °C) de quatro tipos diferentes (HPV 16, 11, 6a, 18) de VLPs do HPV desagregadas/reagre-gadas, bem como de VLPs do HPV de controlo não tratadas, em solução conforme determinado por antigenicidade in vitro por via de análise BIAcore. A FIGURA 6A é relativa ao HPV 6a; a FIGURA 6B é relativa ao HPV 11; a FIGURA 6C é relativa ao HPV 16; e a FIGURA 6D é relativa ao HPV 18.

As FIGURAS 7A-D apresentam a estabilidade no 6 ΡΕ1165126 armazenamento acelerado de quatro tipos diferentes (HPV 16, 11, 6a, 18) de VLPs do HPV desagregadas/reagregadas, bem como de VLPs do HPV de controlo não tratadas, adsorvidas em adjuvante de aluminio. As amostras foram doseadas em relação à antigenicidade in vitro por via de análise BIAcore após terem sido tratadas com uma solução de citrato para libertar o antigénio do adjuvante de aluminio. As FIGURAS 7A e 7B são relativas às VLPs do HPV 6a; as FIGURAS 7C e 7D são relativas às VLPs do HPV 11; as FIGURAS 7E e 7F são relativas às VLPs do HPV 16; e as FIGURAS 7G e 7H são relativas às VLPs do HPV 18.

As FIGURAS 8A-F são comparações da estabilidade térmica e da distribuição da dimensão hidrodinâmica de VLPs dos HPV 6a, HPV 11 e HPV 16 desagregadas/reagregadas, preparadas a partir de um processo de desagregação tanto perto das condições fisiológicas (processo com baixa salinidade) como a concentrações elevadas de sais (processo de alta salinidade). Estas propriedades físicas das VLPs do HPV foram determinadas por análise de ponto de nuvem e por análise de ultracentrifugação analítica. No processo de baixa salinidade, as VLPs do HPV foram desagregadas em NaCl a 0,166 M, solução de TRIS a 10 mM (pH 8,2), enquanto que no processo de alta salinidade, as VLPs do HPV foram desagregadas em NaCl a 0,63 M, fosfato a 35 mM, e solução de TRIS a 100 mM (pH 8,2) . Ambas as soluções continham também EDTA e Polisorbato 80. As FIGURAS 8A e 8B apresentam os dados de ponto de nuvem e de ultracentrifugação analítica das VLPs do HPV 6a; As FIGURAS 8C e 8D apresentam 7 ΡΕ1165126

a mesma análise com VLPs do HPV 11; As FIGURAS 8E e 8F apresentam a mesma análise com VLPs do HPV 16.

As FIGURAS 9A-D são a distribuição da dimensão das particulas e a afinidade de superfície de VLPs do HPV não tratadas e desagregadas/reagregadas conforme determinado por análise SEC-HPLC. A FIGURA 9A é relativa ao HPV 6a; a FIGURA 9B é relativa ao HPV 1, a FIGURA 9C é relativa ao HPV 16; e a FIGURA 9D é relativa ao HPV 18.

Esta invenção relaciona-se com um processo para produzir VLPs do HPV mais estáveis o que tem sido verificado como contribuindo significativamente para a estabilidade geral de uma formulação de vacina para o HPV. As VLPs do HPV purificadas são produzidas, desagregadas em presumíveis capsómeros, reagregadas em VLPs, e então utilizadas como ingrediente activo numa formulação de vacina.

De acordo com esta invenção, qualquer tipo de VLPs do HPV pode ser utilizado como a porção antigénica da formulação da vacina. As VLPs podem conter apenas a proteína Ll, ou podem conter ambas as proteínas LI e L2. As proteínas podem ter uma composição em aminoácido de tipo selvagem, ou podem conter mutações. São preferidas as VLPs contendo apenas a proteína Ll que tenha uma composição em aminoácido do tipo selvagem.

Os HPVs que são preferidos são aqueles associados com a doença, incluindo mas não limitados a: HPV 1, HPV 2, ΡΕ1165126 HPV 3, HPV 4, HPV 6a, HPV 6b, HPV 7, HPV 10, HPV 11, HPV 16, e HPV 18, HPV 34, HPV 39, HPV 41-44 e HPV 51-55. Os HPVs preferidos incluem HPV 6a, HPV 6b, HPV 11, HPV 16, e HPV 18. Adicionalmente, as formulações desta invenção são apropriadas para combinações de tipos de HPV, incluindo vacinas multivalentes contendo uma pluralidade de antigénios do HPV, tais como uma combinação de HPV 6, 11, 16 e 18. É preferido que as VLPs sejam preparadas por técnicas recombinantes, como é conhecido na técnica. É particularmente preferido que a célula hospedeira utilizada para preparar as VLPs seja uma célula de levedura, embora outros tipos de células, tais como células bacterianas, de insectos e de mamíferos sejam conhecidas e utilizadas correntemente como hospedeiras. Embora não desejando estar limitado pela teoria, parece que o estado das ligações dissulfido na proteína LI numa VLP pode diferir dependendo das células hospedeiras utilizadas para exprimir a LI recombinante bem como do método de purificação subsequente. McCarthy et al 1998, supra descreve alguns trímeros de LI reticulados por pontes dissulfido em VLPs recombinantes produzidas em células de insectos. Por outro lado, de acordo com esta invenção, o estado da ligação dissulfido na proteína LI de VLPs produzidas em leveduras pode diferir e portanto necessitar de condições diferentes para a desagregação e reagregação óptimas.

Para algumas formulações, é desejado um produto adsorvido em alumínio. Geralmente, neste caso, a 9 ΡΕ1165126 concentração de VLPs do HPV que é adsorvida no alumínio é de cerca de 10-200 mcg/mL para cada tipo de VLP do HPV. Isto pode ser ajustado, dependendo de factores tais como a antigenicidade do tipo particular de HPV, e a presença de múltiplos tipos de HPVs numa vacina do tipo "cocktail".

Desagregação

Após as VLPs terem sido produzidas na célula hospedeira recombinante e purificadas, elas são desagregadas incubando-as numa mistura de dissociação. A desagregação é principalmente conduzida pela redução das ligações dissulfido com ditiotreitol (DTT) em meios com uma relativamente larga gama de forças iónicas variando desde fisiológicas (também referidos como o "processo de baixa salinidade") a até 1,25 M de NaCl (também referidos como o "processo de alta salinidade"). A mistura de dissociação compreende um agente redutor, um sal, um surfactante não iónico, um agente quelatante de metais e um tampão. O agente redutor é o ditiotreitol (DTT) , embora sejam conhecidos e possam ser utilizados outros agentes redutores. No passado, outros têm utilizado outros agentes redutores (tais como o beta-mercaptoetanol, β-ΜΕ) para desagregar as partículas do HPV (ver, por exemplo McCarthy et al, supra), mas eles tinham empregue uma relativamente elevada concentração de agente redutor (5%, ou β-ΜΕ a 713 mM). Contrastando, um aspecto da presente invenção é a utilização de uma relativamente baixa concentração do agente redutor. 10 ΡΕ1165126

Para os propósitos da memória descritiva e das reivindicações, o termo "relativamente baixa concentração de um agente redutor" significa de cerca de 2 mM a 20 mM se se utiliza o DTT como agente redutor, ou se for empregue um agente redutor alternativo, a guantidade do agente redutor alternativo que deverá ter aproximadamente o mesmo efeito como se se empregasse 2-20 mM de DTT. Uma quantidade preferida de agente redutor é de cerca de 10 mM de DTT.

Um outro componente importante da mistura de dissociação é o sal. Geralmente, a força iónica da mistura de dissociação é mantida pela presença de sais. Pode ser utilizado quase qualquer sal que possa contribuir para o controlo da força iónica. Os sais preferidos que podem ser utilizados para ajustar a força iónica são quaisquer sais fisiologicamente aceitáveis, tais como NaCl, KC1, Na2S04, (NH4)2S04, fosfato de sódio, citrato de sódio e misturas deles. Os sais particularmente preferidos são: NaCl, KC1, e Na2S04, e especialmente NaCl.

Numa forma de realização desta invenção de baixa salinidade, a mistura de dissociação deverá ter uma força iónica que seja aproximadamente fisiológica. Para os propósitos desta memória descritiva e reivindicações, o termo "aproximadamente fisiológica" quando se refere a um sal, significa 0,10-0,20 M, e preferivelmente cerca de 0,15-0,18 M, e mais preferivelmente cerca de 0,16 M quando se emprega NaCl como o sal. Para outros sais que possam ser 11 ΡΕ1165126 utilizados, cabe à habilidade do perito calcular a molaridade que deverá ser equivalente a uma solução de NaCl aproximadamente fisiológica.

Alternativamente, a dissociação pode ter lugar num ambiente de alta salinidade. Como aqui se utiliza, "alta salinidade" significa sal pelo menos a 0,5 M, e agentes tampões a pelo menos 10 mM. Uma gama preferida para a alta salinidade é de 0,5 a 1,25 M, se o sal utilizado é NaCl, e uma gama mais preferida é de 0,60 a 0,1 M. Para outros sais, cabe à habilidade do perito determinar a molaridade que deverá ser equivalente a uma solução de NaCl a 0,5 M e 1,25 M. A utilização com sucesso de um procedimento de desagregação a alta salinidade foi inteiramente inesperada - os relatos na literatura tais como Brady et al, 1977 Virology 23: 717-724, Belnap et al 1995 J. Mol. Biol. 259: 249-263 e o Pedido de Patente publicado WO 99/13056 limitam a concentração em sal a menos do que 0,5 M de NaCl. Contudo, foi descoberto que a utilização de uma desagregação a alta salinidade é vantajosa por a alta salinidade limitar a possível agregação da proteína, resultando numa recuperação melhorada da massa proteica, e também permite que o tratamento de desagregação/reagregação seja iniciado no passo final de purificação por cromatografia, reduzindo dessa forma o número de passos do processo necessários durante a purificação. 12 ΡΕ1165126

Foi descoberto surpreendentemente que uma solução de alta salinidade preferida (tal como NaCl a 1,0 M, tampão TRIS a 10 mM, pH 8,2, EDTA a 2 mM, 0,03% de Polisorbato 80 e DTT a 2-20 mM) resulta numa recuperação da massa proteica de HPV de aproximadamente 100% no processo. É também preferida outra solução de alta salinidade (NaCl a 0,63 M, tampão de fosfato a 35 mM, tampão TRIS a 100 mM, pH 8,2, EDTA a 2 mM, 0,03% de Polisorbato 80 e DTT a 2-20 mM).

De forma a melhor compreender e caracterizar o efeito da concentração de alta salinidade sobre a eficácia na desagregação de VLPs do HPV, foram levados a cabo estudos comparativos sob condições de desagregação tanto de alta (NaCl a 0,5-1,0 M) como de baixa (fisiológica) salinidade. Foram monitorizadas alterações na intensidade da difusão estática de luz para avaliar a desagregação das VLPs. Foi observado que os resultados eram bastante similares para ambas as condições de alta salinidade e salinidade fisiológica - ocorreu a completa desagregação das VLPs dentro de cerca de dois minutos após a adição de DTT (20 mM) . Além disso, a cinética da desagregação parece ser mais controlada pela concentração do agente redutor do que pela concentração em sal, com a concentração mais elevada de agente redutor em correlação com uma desagregação mais rápida a uma dada temperatura e pH.

Foram examinadas outras propriedades biofísicas das VLPs desagregadas e reagregadas tanto em salinidade fisiológica como em alta salinidade. A estabilidade térmica 13 ΡΕ1165126 e as distribuições das dimensões hidrodinâmicas para as VLPs desagregadas/reagregadas geradas em condições tanto de alta como de baixa salinidade eram similares. No entanto, a recuperação da massa proteica total era relativamente mais elevada (perto de 100%) para as VLPs do HPV desagregadas/reagregadas geradas com o processo de desagregação de alta salinidade.

Um outro componente da mistura de dissociação é um surfactante não iónico. O surfactante não iónico pode ser seleccionado a partir do grupo consistindo de: Polisorbato 80, Polisorbato 20, polioxietileno-alquil-éteres, Triton X-100®, Triton X-114®, NP-40®, Span 85 e um membro da série Pluronic de surfactantes não iónicos. O Polisorbato 80 é particularmente preferido. Uma concentração preferida de Polisorbato 80 é de cerca de 0,01-0,50%, e preferivelmente cerca de 0,01-0,10%, e especialmente cerca de 0,03%. A mistura de dissociação deverá ser controlada em relação ao pH pela presença de um tampão. A desagregação das VLPs do HPV pode ter lugar a uma larga gama de pH básico tal como desde acima de 7,0 até 10. Um pH preferido é 8,0-8,5, e preferivelmente cerca de 8,2. Um tampão preferido é o TRIS a 5-100 mM, preferivelmente 5-15 mM, embora possam ser utilizados outros tampões tais como o fosfato. O TRIS é geralmente preferido, pois proporciona um bom controlo do pH e da força iónica nas condições da mistura de dissociação. Opcionalmente pode ser adicionado tampão de fosfato a 0-50 mM. 14 ΡΕ1165126

Um agente quelatante de metais está também presente na mistura de dissociação para assegurar a completa desagregação das VLPs. Um agente quelatante de metais preferido é o EDTA a de 0,5 até 5 mM, e preferivelmente a cerca de 2 mM, embora possam ser utilizados outros agentes quelatantes conhecidos.

Uma mistura de dissociação particularmente preferida compreende aproximadamente 300 mcg/mL de proteina de VLP do HPV num tampão TRIS a 10 mM, pH 8,2, contendo adicionalmente NaCl a 0,16 M - 0,18 M, DTT a 10 ou 20 mM, EDTA a 2 mM e 0,03% de Polisorbato 80. Alternativamente, a mistura de dissociação contém a mesma quantidade de proteina em NaCl a 0,63 M, fosfato a 35 mM, tampão TRIS a 100 mM, pH 8,2, DTT a 10 ou 20 mM, EDTA a 2 mM e 0,03% de Polisorbato 80.

Uma vantagem do processo desta invenção é que o passo de desagregação é razoavelmente rápido, e apenas requer a incubação das VLPs na mistura de dissociação durante menos do que cerca de uma hora à temperatura ambiente, e podem ser utilizados tempos tão curtos como 30-40 minutos. Se desejado, o passo de dissociação (bem como outros passos do processo de desagregação/reagregação) podem ser realizados sob condições estéreis. Por exemplo, os componentes do tampão podem ser sujeitos a filtração estéril, e utilizados com soluções estéreis de proteínas. Adicionalmente, as VLPs do HPV desagregadas/reagregadas em 15 ΡΕ1165126 solução podem ser sujeitas a filtração estéril antes da utilização ou antes da adsorção no adjuvante de alumínio.

Após a desagregação das VLPs estar completa, o agente redutor deverá ser removido. Isto pode ser alcançado através da utilização de um passo de diálise ou de um passo de diafiltração/ultrafiltração. 0 passo de diálise compreende uma diálise contra uma solução de sal (com força fisiológica ou, se foi utilizado o processo de alta salinidade, concentrações mais elevadas de sal tais como 1 M) , surfactante não iónico, e tampão similar ao presente na mistura de dissociação, mas a um pH inferior ao presente na mistura de dissociação. As gamas de pH recomendadas neste passo de diálise são desde cerca de 6,5-7,5, e preferivelmente cerca de 7,0. Uma solução de diálise preferida compreende NaCl a 0,16-0,18 M, 0,01-0,03% de Polisorbato 80, fosfato a 10 mM a pH 7,0. Um outro exemplo de uma diálise recomendada é uma diálise a 1:100 (três mudanças, de 30 minutos cada) contra uma solução de NaCl a 0,166 M, tampão de fosfato a 10 mM, pH 7,0. Alternativamente, uma solução preferida é NaCl a 1,0 M, fosfato a 10 mM e 0,03% de Polisorbato 80, pH 7,0.

Se necessário, pode ser adicionado detergente não iónico adicional, tal como Polisorbato 80, ao tampão utilizado para remover o DTT de forma a manter um nível suficiente de detergente não iónico com a proteína ao longo do processo. 16 ΡΕ1165126

Alternativamente, poderá ser utilizada a solução de reagregação descrita abaixo para remover o DTT.

Com volumes maiores, pode ser utilizada uma montagem de diafiltração ou de ultrafiltração escalável em vez do procedimento de diálise.

Reagregação 0 passo seguinte é de reagregar as VLPs. Isto pode ser realizado durante o passo de diálise descrito acima, durante o passo de diafiltração/ultrafiltração descrito acima, ou durante um passo separado, ou adicional de diálise, e pode demorar várias horas, até 24 horas. Se se utiliza uma diálise separada, a diálise é realizada utilizando um tampão de reagregação compreendendo: sal com força iónica na gama de 0,5-1,35 M de NaCl, uma fonte de iões metálicos, um tampão a pH 6,0-6,5. O sal é preferivelmente o mesmo sal que tenha sido utilizado nos passos anteriores, embora a sua concentração seja preferivelmente mais elevada. Por exemplo, se é utilizado NaCl, ele deverá estar presente a uma concentração de 0,5-1,35 M, e preferivelmente a cerca de 1,0 M. A fonte de iões metálicos deverá ser uma fonte de Ca2+ ou de Mg2+, tal como CaCl2, ou MgCl2 e estar presente presumivelmente para proporcionar estabilidade às VLPs reagregadas. O zinco pode também ser utilizado, mas típica- 17 ΡΕ1165126 mente é menos vantajoso do que os outros iões. É preferido o CaCÍ2· A quantidade de ião metálico deverá estar presente numa concentração de cerca de 1-10 mM, preferivelmente a cerca de 2 mM. É adicionada glicina ou citrato de sódio como componente do tampão de reagregação e/ou controlador de pH. As quantidades variam desde cerca de 20-70 mM, preferivelmente cerca de 50 mM. O tampão pode ser a combinação de glicina e fosfato, ou citrato e fosfato, ou apenas citrato. A utilização de tampão de fosfato sozinho não é recomendada. Um tampão preferido de reagregação é NaCl a 1 M, Ca2+ a 2 mM, citrato a 50 mM, pH 6,2 e 0,03% de Polisorbato 80.

Se necessário, pode ser adicionado detergente não iónico adicional, tal como Polisorbato 80, ao tampão de reagregação para se manter um nível suficiente de detergente não iónico com a proteína ao longo do processo.

Mudança de Tampão

Finalmente, quaisquer reagentes remanescentes podem ser removidos por diálise utilizando um tampão de 18 ΡΕ1165126 diálise final. Um exemplo contém sal (preferivelmente NaCl), e surfactante não iónico, e opcionalmente histidina. 0 sal, se for NaCl, está presente preferivelmente a cerca de 0,25 Μ - 1 M, mais preferivelmente a cerca de 0,5 Μ. A histidina pode estar presente a 2-50 mM, preferivelmente a cerca de 5-20 mM com um pH de 6,0-6,5, e preferivelmente a cerca de pH 6,2. O surfactante não iónico, tal como o Polisorbato 80 ou o Polisorbato 20, pode estar presente a 0,01-0,03%. Uma mudança de tampão alternativa preferida é NaCl a 0,5 M e 0,03% de Polisorbato 80.

Estes múltiplos passos de diálise utilizados para desagregar/reagregar as VLPs do HPV podem também ser realizados com equipamento de larga escala tais como sistemas de diafiltração e/ou de ultrafiltração. Se necessário, pode ser adicionado detergente não iónico adicional, tal como Polisorbato 80, a qualquer dos tampões de desagregação/reagregação para se manter um nivel suficiente de detergente não iónico com a proteína ao longo do processo.

Se desejado, as VLPs do HPV desagregadas/reagre-gadas podem ser adsorvidas num adjuvante de alumínio utilizando técnicas conhecidas.

Opcionalmente, a estabilidade da formulação de VLPs reagregadas pode ser adicionalmente melhorada pela adição de excipientes polianiónicos, poliméricos. Como se utiliza ao longo da memória descritiva e reivindicações, o 19 ΡΕ1165126 termo "polímero polianiónico" tem a intenção de se referir a compostos que têm tanto uma longa cadeia simples, como múltiplas cadeias reticuladas; possuindo ambos os tipos múltiplas cargas negativas ao longo da(s) cadeia (s) quando em solução. Exemplos de polímeros polianiónicos incluem: proteínas, polianiões, péptidos e ácidos polinucleicos. Estabilizadores específicos podem ser seleccionados a partir do grupo consistindo de: carboximetilcelulose (particularmente 10-800 cps), heparina (6-30 kDa), poliamino-ácidos (2-100 kDa) tais como Poli(Glu), Poli(Asp), e Poli(Glu, Fen), glutationa oxidada [Glu-Cis-Gli]2 (613 Da), poli-nucleótidos tais como ácido policitidílico (200-700 kDa), e ácido poliadenílico (200-700 kDa), ARN, ADN, e albuminas do soro. A concentração do excipiente polimérico polianiónico, quando presente, é de cerca de 0,01% a cerca de 0,5%, particularmente cerca de 0,05-0,1% (em peso/volume), embora a adição de uma quantidade até dez vezes inferior de excipientes polianiónicos (por exemplo, 0,01% de albumina, ADN ou heparina) ainda proporcione uma estabilidade melhorada em relação a formulações de VLPs do HPV com alumínio não tratadas.

Uma formulação de vacina típica inclui: 1) produto adsorvido em alumínio contendo 10-200 mcg/mL de cada tipo de VLPs do HPV e solução salina a 0,15-0,32 M; 2) histidina a 5-10 mM, pH 6,2; e 3) surfactante não iónico a 0,005-0,03%. 20 ΡΕ1165126

As formulações de vacinas do HPV resultantes deste processo são estáveis a 2-8 °C e até à temperatura ambiente durante pelo menos 6 meses (estudo em continuação) conforme ilustrado na FIGURA 7.

Um outro aspecto desta invenção é a utilização de um tampão de formulação para proporcionar um armazenamento estável e a longo prazo de vacinas preparadas com VLPs desagregadas/reagregadas. O tampão de formulação compreende NaCl a 0,15-0,32 M, histidina a 5-10 mM, pH 6,2, e 0,005-0,015% de Polisorbato 80. Estas formulações de vacinas são estáveis a várias gamas de temperaturas (desde 4-30 °C) durante pelo menos seis meses. Os seguintes Exemplos não limitadores são apresentados para melhor explicar a invenção. EXEMPLO 1

Foi utilizada para a maioria destas experiências uma solução gelada de proteína LI recombinante de VLPs do HPV 16 derivada de levedura (com uma pureza da proteína superior a 95%), em NaCl a 0,5 M, 0,003% de Polisorbato 80, pH alvejado a aproximadamente 6,2. As VLPs do HPV 6a e as VLPs do HPV 11 estavam em NaCl a 0,5 M, 0,03% de Polisorbato 80. As VLPs do HPV 18 estavam em NaCl a 0,5 M, 0,01% de Polisorbato 80. Alguns dos estudos utilizaram VLPs do HPV 6a, 11, e 16 em tampão de fosfato a 75 mM a pH 7 contendo NaCl a 1,25 M. 21 ΡΕ1165126

Libertação de VLPs do HPV do adjuvante de alumínio para subsequente análise in vitro.

Para libertar as VLPs do HPV do adjuvante de alumínio, foi desenvolvido um método de dissolução de alumínio que incluía a diluição da formulação de alumí-nio-HPV numa solução de alta salinidade contendo citrato e Polisorbato 80. As amostras de VLPs do HPV do método de dissolução de alumínio foram directamente sujeitas a uma dosagem de antigenicidade in vitro utilizando a análise BIAcore.

Dosagem de antigenicidade in vitro. As amostras de VLPs do HPV do método de dissolução de alumínio estavam numa solução estabilizadora de pH 6-6,5 e alta força iónica (NaCl a cerca de 0,5 Μ - 1 M, citrato de sódio a 0,1 M) contendo 0,02% de Polisorbato 80. As amostras foram directamente sujeitas a análise BIAcore sem diluição adicional (utilizando anticorpo neutralizante específico do tipo de VLPs do HPV). Diluíram-se amostras de solução (sem adjuvante de alumínio) até uma concentração de NaCl alvejada a cerca de 0,5-1 M antes da análise BIAcore. Todos os dados de antigenicidade in vitro estão referenciados a uma amostra de controlo de VLPs do HPV gelada (sem adjuvante de alumínio).

Análise de concentração de proteína. Foram determinadas as concentrações de proteína das VLPs do HPV 22 ΡΕ1165126 tanto de soluções em bruto como de amostras formuladas (após a dissolução de alumínio) pela medição do espectro de absorvância em UV à temperatura ambiente utilizando um espectrofotómetro HP 8452A Diode Array e uma cuvete com um comprimento do percurso de 1 cm. Os volumes utilizados das amostras foram de 100-250 microlitros. A concentração de proteina foi calculada utilizando uma técnica de análise em multicomponentes de segunda derivada. Para algumas experiências, a concentração em proteínas foi também determinada por análise colorimétrica BCA.

Análise da dimensão hidrodinâmica. A dimensão hidrodinâmica das VLPs do HPV não tratadas e desagrega-das/reagregadas foi determinada por difusão dinâmica de luz, ultracentrifugação analítica, e SEC-HPLC.

As medições por difusão dinâmica de luz foram realizadas à temperatura ambiente utilizando um Sistema de Difusão de Luz Malvern 4700 a 90°. A dimensão hidrodinâmica aparente das VLPs do HPV foi determinada como a média-Z do diâmetro hidrodinâmico. Cada um dos valores representa a média de cinco medições da mesma amostra.

Foram realizadas experiências de velocidade de sedimentação utilizando uma ultracentrifugadora analítica Beckman XLI com detecção de UV a 280 nm. Foram utilizados dois métodos diferentes para determinar o coeficiente de sedimentação incluindo modos de velocidade fixa e variável. 23 ΡΕ1165126

Foram realizadas medições por SEC-HPLC à temperatura ambiente utilizando um sistema Waters/Millennium 2690 com detectores de UV e de fluorescência. Foi utilizada uma coluna PL-GFC 4000 Â (pré-condicionada com VLPs do HPV) a uma razão de fluxo de 0,4 mL/minuto utilizando NaCl a 750 mM, tampão de fosfato a 25 mM (pH 7) como fase móvel.

Análise por microscopia electrónica. Foi realizada a Microscopia Electrónica de Transmissão (MET) utilizando coloração negativa. As amostras foram fixadas e coradas com ácido fosfotúngstico e examinadas num Microscópio Electrónico de Transmissão JEOL 1200 EX. Foram tomadas micrografias de áreas aleatórias com as amostras preparadas múltiplas vezes a uma ampliação entre 30 000 x e 40 000 x. Foi introduzida uma ampliação adicional de 3 vezes na revelação das impressões a partir dos negativos.

Estudos de estabilidade no armazenamento acelerado e em tempo real. Foram levados a cabo estudos de estabilidade no armazenamento de formulações HPV-aluminio. A temperatura nos estudos de estabilidade foi geralmente de 2-8, 15, 25, 30 e 37 °C. Dados prévios de integridade conformacional (não apresentados) com espectroscopia de dicroismo circular e de fluorescência tinham mostrado que aumentar a temperatura acima de 40-45 °C induz alterações conformacionais significativas na proteína LI de VLPs do HPV, uma condição que necessita claramente de ser evitada em estudos de estabilidade no armazenamento acelerado. 24 ΡΕ1165126

Foi também avaliada a estabilidade térmica de VLPs do HPV com ensaios de turbidez que foram levados a cabo utilizando um espectrofotómetro HP 8452A Diode Array equipado com uma aplicação de base HP 845X UV-Visible e um sistema de controlo da temperatura. A difusão da luz pelas soluções (devida à agregação de proteínas) foi seguida a 350 nm sob o modo cinético do programa aumentando a temperatura de desde 24 °C até 74 °C a uma taxa controlada.

Teste de potência em ratinhos. Foi avaliada in vivo a imunogenicidade de VLPs do HPV em ratinhos BALBc. Foram adsorvidas amostras de VLPs do HPV em adjuvante de alumínio, diluídas até várias concentrações desejadas com adjuvante de alumínio e injectadas em ratinhos. Foi recolhido soro e analisado em relação aos níveis de anticorpos por dosagem ELISA. EXEMPLO 2

Desagregação e reagreqação de VLPs do HPV 16 conforme determinado pela análise por ultracentrifugação analítica.

Como se pode ver na FIGURA 1, as VLPs do HPV 16 foram desagregadas após incubação num tampão a pH 8,2 contendo TRIS ou fosfato a 10 mM, NaCl a 0,166 M, EDTA a 2 mM, e DTT a 2 mM à temperatura ambiente durante 2 0 minutos (curda do meio) . A amostra de HPV 16 desagregada apresenta um pico a um valor S mais pequeno do que o 25 ΡΕ1165126 esperado para os capsómeros Ll, sugerindo a dimensão de pentâmeros de proteina Ll do HPV. A curva superior mostra que os HPV 16 desagregados (capsómeros) foram então reagrupados em VLPs por diálise num tampão a pH 6,2 contendo fosfato de sódio a 10 mM, NaCl a de 0,5 a 1 M, cloreto de cálcio a 2 mM na presença de glicina ou de citrato. A curva inferior mostra as VLPs do HPV 16 não tratadas. EXEMPLO 3

Distribuições da dimensão das partículas de VLPs do HPV 16 desagregadas/reagregadas. A FIGURA 2 apresenta as distribuições das dimensões das particulas de VLPs do HPV 16 que foram desagregadas e reagregadas como descrito no Exemplo 2 (linha interrompida) e VLPs do HPV 16 não tratadas (linha a cheio) conforme determinado por análise de ultracentri-fugação analitica. Os dados revelam que as VLPs do HPV 16 desagregadas/reagregadas eram maiores e tinham uma distribuição mais homogénea, como se pode julgar a partir das posições e larguras dos picos, respectivamente. A análise por microscopia electrónica (ME) confirma a análise por ultracentrifugação analítica; mostra que as VLPs desagregadas/reagregadas são mais homogéneas e existem como partículas mais arredondadas de dimensão uniforme com diâmetro médio de aproximadamente 80-85 nm (dados de ME não apresentados). As amostras não tratadas parecem ser mais 26 ΡΕ1165126 pequenas e com uma distribuição de forma e dimensão mais heterogéneas com uma dimensão média à volta de 50-68 nm. De forma similar, um conjunto de dados posteriores mostra que as VLPs do HPV 16 não tratadas têm uma dimensão média de aproximadamente 4 0 nm, enquanto que as VLPs do HPV 16 reagregadas têm uma dimensão média de aproximadamente 60 nm. EXEMPLO 4

Estabilidade acelerada (37 aC) de formulações de vacina de VLP-alumínio do HPV 16 conforme determinado por análise BIAcore. VLPs do HPV 16 desagregadas/reagregadas bem como VLPs do HPV 16 não tratadas foram adsorvidas em adjuvante de aluminio (a 160 mcg/mL de proteina e 450 mcg/mL de Al) e formuladas em NaCl a 0,32 M, histidina a 10 mM, 0,015% de Polisorbato 80, pH 6,2. Foi doseada a antigenicidade in vitro das amostras em momentos identificados por análise BIAcore.

Na FIGURA 3, as VLPs do HPV 16 desagregadas e reagregadas são representadas por círculos a cheio e quadrados vazios; e as não tratadas por losangos a cheio. O processamento 1 continha citrato e o processamento 2 tinha glicina no tampão de reagregação. Os dados demonstram que o processo de desagregação/reagregação resulta numa significativa e dramática melhoria da estabilidade no 27 ΡΕ1165126 armazenamento acelerado das VLPs do HPV 16 adsorvidas em adjuvante de alumínio quando comparada com a das VLPs do HPV não tratadas. Não foi observada in vitro perda de antigenicidade das VLPs do HPV desagregadas/reagregadas adsorvidas em alumínio em experiências similares realizadas a 25 °C e 4 °C após três meses. EXEMPLO 5

Estabilidade acelerada (37 eC) de VLPs do HPV 16 em solução com salinidade fisiológica conforme determinado por análise BIAcore.

Incubaram-se 80 mcg/mL de VLPs do HPV 16 desagregadas/reagregadas bem como VLPs do HPV 16 não tratadas em NaCl a 0,15 M, histidina a lOmM, 0,015% de Polisorbato 80, pH 6,2 a 37 °C. Foi doseada in vitro a antigenicidade das amostras em momentos identificados por análise BIAcore. Os dados demonstram que o processo de desagregação/rea-gregação resulta numa significativa melhoria da estabilidade no armazenamento acelerado de VLPs do HPV 16 quando comparado com a de VLPs do HPV não tratadas. Isto é apresentado na FIGURA 4, onde as VLPs desagregadas e reagrupadas estão representadas por círculos vazios e quadrados vazios; as VLPs não tratadas estão representadas por losangos a cheio. O processamento 1 contém citrato e o processamento 2 tem glicina no tampão de reagregação. EXEMPLO 6 28 ΡΕ1165126

Efeitos do tratamento com processo de diferentes lotes de VLPs do HPV 16 conforme determinado pela monitorização da formação de turbidez (agregação) termicamente induzida, através de espectroscopia de UV (análise de ponto de nuvem). Foi aplicado às amostras um protocolo padronizado de ponto de nuvem: aquecimento desde 24 °C até 74 °C a uma taxa controlada sendo a densidade óptica da solução monitorizada a 350 nm. Como se mostra na FIGURA 5, foram analisados três lotes diferentes de VLPs do HPV 16 (lotes 1, 2, 3) antes (linhas interrompidas e símbolos vazios) e após (linhas a cheio e símbolos a cheio) o tratamento de desagregação/reagregação. De entre estas amostras de VLPs do HPV 16 (lote 1) foi testado três vezes. Os dados demonstram que o tratamento com o processo de desagregação/reagregação resulta numa significativa melhoria na estabilidade intrínseca das VLPs do HPV 16 contra a agregação induzida pelo calor. Adicionalmente à melhoria na estabilidade térmica, o tratamento com o processo de desagregação/reagregação também resulta num mais consistente e homogéneo perfil de estabilidade.

Exemplo 7 A antigenicidade in vitro de VLPs do HPV 16 não tratadas e desagregadas/reagregadas foi adicionalmente 29 ΡΕ1165126 avaliada com um lote de VLPs do HPV 16 em que ambas as VLPs não tratadas e desagregadas/reagregadas foram avaliadas antes e após adsorção no adjuvante de alumínio. A antigenicidade in vitro foi medida por análise BIAcore e a concentração de proteína por espectroscopia de UV e dosagem colorimétrica BCA. A razão entre antigénio e proteína foi então determinada para ambas as VLPs do HPV 16 não tratadas e desagregadas/reagregadas. A antigenicidade in vitro das VLPs do HPV 16 desagregadas/reagregadas estava melhorada em cerca de 50%. Por exemplo, a razão entre antigénio e proteína para as VLPs do HPV 16 das desagregadas/reagregadas versus não tratadas foi de 1,7 com uma gama de 1,5-1,9. Esta observação foi confirmada por análise EIA (média de 1,6 e gama de 1,4-1,8) e análise IVRP (média 1,4 e gama de 1,3-1,5).

Foi avaliada a imunogenicidade in vivo de VLPs do HPV 16 adsorvidas em alumínio não tratadas e desagregadas/reagregadas com um teste de potência em ratinhos. Este teste gera um valor ED5o representando a dose (mcg) de VLPs do HPV para a qual mais do que 50% dos ratinhos serocon-vertem. A imunogenicidade in vivo das VLPs do HPV 16 desagregadas/reagregadas era equivalente à, ou melhor do que a, das VLPs do HPV 16 não tratadas. Uma experiência mostrou um valor de ED50 de 0,034-0,062 para duas amostras desagregadas/reagregadas versus um valor de ED5o de 0,146 para a amostra não tratada. Numa segunda experiência com ratinhos, foi obtido um valor de ED5o de <0,0125 para três amostras de VLPs do HPV desagregadas/reagregadas versus um valor de ED50 de 0,074 para a amostra não tratada. 30 ΡΕ1165126 EXEMPLO δ

Estabilidade acelerada (37 aC) de VLPs do HPV não tratadas e desagregadas/reagregadas em solução e em adjuvante de alumínio conforme determinado por análise BIAcore.

Foram incubadas 80 mcg/mL de VLPs do HPV em solução contendo NaCl a 0,32 M, histidina a 10 mM, 0,015% de Polisorbato 80, pH 6,2 a 37 °C. As amostras foram doseadas em relação à antigenicidade in vitro por BIAcore nos tempos indicados na FIGURA 6. Os dados indicam que o tratamento de desagregação/reagregação resulta numa melhoria dramática da estabilidade para as VLPs do HPV dos tipos 6a, 11, e 16 em solução durante o teste de estabilidade no armazenamento acelerado. As VLPs do HPV 18 não tratadas apresentam um perfil de estabilidade similar ao das VLPs desagregadas/reagregadas para os outros três tipos. Não foi observada melhoria significativa da estabilidade com o tratamento de VLPs do HPV 18 provavelmente devido à incapacidade do tratamento de desagregação/reagregação para afectar as VLPs do HPV 18 (dados não apresentados) . As amostras utilizadas para este estudo foram geradas com o processo de desagregação de baixa salinidade. A recuperação da massa de proteína para os quatro tipos através do tratamento de desagregação/reagregação foi de aproximadamente 85-95% para as VLPs do HPV 11, 16 e 18 e aproximadamente de 60-70% para as VLPs do HPV 6a. O rendimento através do tratamento de desagregação/rea- 31 ΡΕ1165126 gregaçao parece ser afectado pela qualidade do lote específico de VLPs do HPV em termos da agregação das VLPs. 0 rendimento em massa de proteína através do tratamento de desagregação/reagregação aumenta até perto de 100% quando o processo de desagregação tem lugar sob condições de alta salinidade. A análise por ultracentrifugação analítica das VLPs do HPV desagregadas/reagregadas sugere que o tratamento de desagregação/reagregação resulta numa reagre-gação quase quantitativa dos capsómeros em VLPs. A FIGURA 7 apresenta a estabilidade de armazenamento e acelerada das VLPs do HPV adsorvidas em adjuvante de alumínio nas quais 400 mcg/mL de VLPs do HPV foram adsorvidas em 450 mcg/mL de adjuvante de alumínio e incubadas numa solução contendo NaCl a 0,32 M, histidina a 10 mM, 0,015% de Polisorbato 80, pH 6,2 a 4 °C, 15 °C, 25 °C, 30 °C e 37 °C. As amostras foram doseadas em relação à antigenicidade in vitro por BIAcore nos tempos indicados na figura após tratamento numa solução de citrato para libertar o antigénio do adjuvante de alumínio. Os dados indicam que o tratamento de desagregação/reagregação resulta numa melhoria dramática da estabilidade para as VLPs do HPV dos tipos 6a, 11, e 16 adsorvidas em alumínio no teste de estabilidade no armazenamento acelerado. As VLPs do HPV 18 não tratadas mostram um perfil de estabilidade similar ao das VLPs desagregadas/reagregadas para os outros três tipos. Não foi observada melhoria significativa da estabilidade com o tratamento de desagregação/reagregação das VLPs do HPV 18. 32 ΡΕ1165126 EXEMPLO 9

Estabilidade térmica e distribuição da dimensão hidrodinâmica de VLPs reagregadas do HPV 6a, HPV 11 e HPV 16, preparadas tanto pelo processo de desagregação em baixa salinidade como pelo processo de desagregação em alta salinidade. As amostras foram avaliadas por análise de ponto de nuvem e ultracentrifugação analítica. No processo de baixa salinidade, as VLPs do HPV foram desagregadas em NaCl a 0,166 M, solução de TRIS a 10 mM (pH 8,2) enquanto que no processo de alta salinidade, as VLPs do HPV foram desagregadas em NaCl a 0,63 M, fosfato a 35 mM, e solução de TRIS a 100 mM (pH 8,2). Ambas as soluções continham também EDTA e Polisorbato 80. Os dados, como se vê na FIGURA 8, mostram que as VLPs do HPV desagregadas/rea-gregadas preparadas pelos processos de baixa e alta salinidade são similares em relação à sua estabilidade térmica e distribuição da dimensão hidrodinâmica para as VLPs do HPV dos tipos 11, 6a e 16. EXEMPLO 10

Distribuição da dimensão das partículas e afinidade de superfície de VLPs do HPV conforme medido por análise SEC-HPLC.

Foram analisadas VLPs do HPV (tipos 11, 16 e 6a) desagregadas/reagregadas (FIGURA 9, linha a cheio) e não tratadas (linha interrompida) numa coluna de exclusão de 33 ΡΕ1165126 tamanho 4000A GPC. Foi obtido um único pico a partir das VLPs do HPV desagregadas/reagregadas em comparação com uma mais heterogénea distribuição para as VLPs do HPV não tratadas. Os picos do monómero das VLPs do HPV desagregadas/reagregadas tinham um volume de eluição mais pequeno do que o dos picos dos monómeros das VLPs do HPV não tratadas, sugerindo uma dimensão relativamente maior das particulas para as VLPs desagregadas/reagregadas. As áreas totais dos picos relativamente maiores das VLPs do HPV desagregadas/reagregadas indicam uma taxa de recuperação mais elevada das VLPs desagregadas/reagregadas sugerindo que as VLPs desagregadas/reagregadas têm menor afinidade para a coluna do que as VLPs não tratadas. As VLPs do HPV 18 não tratadas mostram um perfil de SEC-HPLC similar ao das VLPs desagregadas/reagregadas para os outros três tipos.

Lisboa, 20 de Outubro de 2006

Claims

ΡΕ1165126 1 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para preparar uma vacina para o papilomavírus humano (HPV) compreendendo partículas semelhantes a vírus (VLPs) do HPV, compreendendo o processo os passos de: (a) incubar VLPs numa mistura de dissociação compreendendo ditiotreitol (DTT) a 2-20 mM, um sal presente numa gama equivalente a de 0,10 - 0,2 M de NaCl, um surfactante não iónico, um agente quelatante de metais e um tampão até que sejam produzidas VLPs desagregadas; (b) remover o agente redutor da mistura de dissociação; e (c) reagregar as VLPs desagregadas.
2. Processo para preparar uma vacina para o papilomavírus humano (HPV) compreendendo partículas semelhantes a vírus (VLPs) do HPV, compreendendo o processo os passos de: (a) incubar VLPs numa mistura de dissociação compreendendo ditiotreitol (DTT) a 2-20 mM, um sal presente numa gama equivalente a de 0,50-1,25 M de NaCl, um surfactante não iónico, um agente quelatante de metais e um tampão até que sejam produzidas VLPs desagregadas; 2 ΡΕ1165126 (b) remover o agente redutor da mistura de dissociação; e (c) reagregar as VLPs desagregadas.
3. Processo de acordo com as Reivindicações 1 ou 2 em que o sal na mistura de dissociação é seleccionado a partir de NaCl, KC1, Na2SC>4, (ΝΗ4)23θ4, fosfato de sódio, citrato de sódio e misturas deles, e é preferivelmente NaCl.
4. Processo de acordo com a Reivindicação 3 em que o sal na mistura de dissociação é NaCl.
5. Processo de acordo com as Reivindicações 1, 2, 3 ou 4 em que o surfactante não iónico na mistura de dissociação é seleccionado a partir de Polisorbato 80, Polisorbato 20, polioxietileno-alquil-éteres, Triton X-100®, Triton X-114®, NP-40®, Span 85 e um surfactante não iónico Pluronic.
6. Processo de acordo com a Reivindicação 5 em que o surfactante não iónico é Polisorbato 80 a 0,01-0,5%.
7. Processo de acordo com qualquer das Reivindicações precedentes em que o tampão na mistura de dissociação é TRIS ou tampão de fosfato, a pH 7-10. 3 ΡΕ1165126
8. Processo de acordo com qualquer das Reivindicações precedentes em que o aqente quelatante de metais na mistura de dissociação é EDTA a 0,5-5 mM.
9. Processo de acordo com qualquer das Reivindicações precedentes em que o passo (a) tem lugar durante menos do que uma hora à temperatura ambiente.
10. Processo de acordo com a Reivindicação 9 em que o passo (a) tem lugar durante 30-40 minutos à temperatura ambiente.
11. Processo de acordo com qualquer das Reivindicações precedentes em que o passo (b) compreende um passo de diálise ou de diafiltração/ultrafiltração.
12. Processo de acordo com a Reivindicação 11 em que o passo de diálise compreende uma diálise ou diafil-tração/ultrafiltração contra uma solução a uma concentração de salinidade fisiológica ou de alta salinidade, surfac-tante não iónico, e tampão a um pH inferior ao presente na mistura de dissociação.
13. Processo de acordo com a Reivindicação 11 em que o passo de diálise compreende uma diálise ou diafil-tração/ultrafiltração num tampão de reagregação, compreendendo o dito tampão de reagregação: sal com força iónica 4 ΡΕ1165126 na gama de 0,5-1,35 M de NaCl, uma fonte de iões metálicos, e um tampão a pH 6,0-6,5.
14. Processo de acordo com qualquer das Reivindicações precedentes em que o passo (c) compreende um passo de diálise ou de diafiltração/ultrafiltração com um tampão de reagregação, compreendendo o tampão de reagregação: sal com força iónica na gama de 0,5-1,35 M de NaCl, uma fonte de iões metálicos, e um tampão a pH 6,0-6,5.
15. Processo de acordo com a Reivindicação 14 em que a fonte de iões metálicos é uma fonte de Ca2+ ou de Mg2+.
16. Processo de acordo com a Reivindicação 15 em que a fonte de iões metálicos é CaCl2 ou MgCl2 a 0,5-5,0 mM.
17. Processo de acordo com as Reivindicações 13, 14 ou 15 em que o tampão compreende a) glicina e fosfato; b) citrato e fosfato; ou c) citrato.
18. Processo de acordo com a Reivindicação 17 em que o tampão de reagregação compreende NaCl a 1 M, Ca2+ a 2 mM, citrato a 50 mM, pH 6,2 e 0,03% de Polisorbato 80.
19. Processo de acordo com qualquer das Reivindicações precedentes compreendendo adicionalmente: 5 ΡΕ1165126 (d) purificar adicionalmente com um passo de diálise compreendendo um tampão final compreendendo: NaCl a 0,25-1,25 M e um detergente não iónico.
20. Processo de acordo com a Reivindicação 19 em que o tampão final compreende adicionalmente um tampão de histidina a pH 6,0-6,5.
21. Processo de acordo com as Reivindicações 19 ou 20 em que o detergente não iónico é Polisorbato 80 ou Polisorbato 20.
22. Processo de acordo com qualquer das Reivindicações precedentes, compreendendo adicionalmente adsorver as VLPs desagregadas/reagregadas em adjuvante de aluminio.
23. Processo de acordo com qualquer das Reivindicações precedentes, em que as VLPs são seleccionadas a partir do HPV 6a, HPV 6b, HPV 11, HPV 16, HPV 18, e de combinações deles.
24. Processo para preparar uma vacina para o papilomavirus humano (HPV) compreendendo partículas semelhantes a virus (VLPs) do HPV, compreendendo o processo os passos de: (a) incubar VLPs numa mistura de dissociação de 6 ΡΕ1165126 baixa salinidade durante 30-40 minutos, compreendendo a mistura de dissociação: NaCl a 0,16-0,18 M, DTT a 2-20 mM, 0,01-0,03% de Polisorbato 80, EDTA a 0,5-5 mM e tampão TRIS a 5-15 mM, a um pH de 8,2 para produzir VLPs desagregadas; (c) reagregar as VLPs desagregadas utilizando uma diálise contra um tampão de reagregaçao, compreendendo o tampão de reagregaçao NaCl a 1,0 M, CaCl2 a 2 mM; e um tampão a pH 6,2 seleccionado a partir do grupo consistindo de: citrato de sódio a 50 mM; glicina e fosfato a 50 mM; e citrato a 50 mM; e (d) purificar adicionalmente as VLPs reagregadas utilizando uma diálise contra um tampão final compreendendo NaCl a 0,5 M, e histidina a 10 mM, a pH 6,2.
25. Processo de acordo com a Reivindicação 24 que compreende adicionalmente, como passo (b) , remover o DTT da mistura de dissociação utilizando uma diálise contra um tampão compreendendo NaCl a 0,16-0,18 M, 0,01-0,03% de Polisorbato 80 e fosfato a 10 mM a um pH de 7,0.
26. Processo de acordo com as Reivindicações 24 ou 25, compreendendo adicionalmente (e) adsorver as VLPs reagregadas do passo (d) em adjuvante de alumínio. 7 ΡΕ1165126
27. Processo para preparar uma vacina para o papilomavírus humano (HPV) estável no armazenamento compreendendo partículas semelhantes a vírus (VLPs) do HPV, compreendendo o processo os passos de: (a) incubar VLPs numa mistura de dissociação de alta salinidade durante 30-40 minutos, compreendendo a mistura de dissociação: NaCl a 0,5-1,25 M, DTT a 2-20 mM, 0,01-0,03% de Polisorbato 80, EDTA a 0,5-5 mM e tampão TRIS a 5-100 mM, e fosfato a 0-50 mM a um pH de 8,2 para produzir VLPs desagregadas; (c) reagregar as VLPs desagregadas utilizando uma diálise contra um tampão de reagregação, compreendendo o tampão de reagregação NaCl a 1,0-1,35 M, CaCl2 a 2 mM; e um tampão a pH 6,2 seleccionado a partir do grupo consistindo de: citrato de sódio a 50 mM; glicina e fosfato a 50 mM; e citrato a 50 mM; e (d) purificar adicionalmente as VLPs reagregadas utilizando uma diálise contra um tampão final, compreendendo o tampão final NaCl a 0,5 M, e histidina a 10 mM, a pH 6,2.
28. Processo de acordo com a Reivindicação 27 que compreende adicionalmente, como passo (b) , remover o DTT da mistura de dissociação utilizando uma diálise contra um tampão compreendendo pelo menos NaCl a 1 M, 0,01-0,03% de Polisorbato 80 e fosfato a 10 mM a um pH de 7,0. ΡΕ1165126
29. Processo de acordo com as Reivindicações 27 ou 28, compreendendo adicionalmente (e) adsorver as VLPs reagregadas do passo (d) em adjuvante de aluminio. Lisboa, 20 de Outubro de 2006