JP4594534B2 - 分解再構築ウイルス様粒子を含むヒトパピローマウイルスワクチン - Google Patents
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Description
発明の簡単な説明
本発明はキャプソメアに分解した後に再構築したウイルス様粒子(VLP)を含むヒトパピローマウイルス(HPV)ワクチンに関する。本発明はHPV VLPをより均質にし、貯蔵安定性を著しく改善させた前記ワクチンの製造方法にも関する。
【0002】
発明の背景
ヒトパピローマウイルス(HPV)は生殖管に感染し、種々の異形成、癌及び他の疾病に結び付けられている。これらの疾病は今日のワクチン開発の標的であり、L1又はL1+L2タンパク質の組合せを含むウイルス様粒子(VLP)を含むワクチンが現在臨床試験中である。
【0003】
しかし、酵母から精製した組換えL1タンパク質HPV VLPは溶液中又はアルミニウムアジュバント粒子に吸着させた場合のいずれも長期貯蔵中に不安定であることが判明した。
【0004】
従来、様々の研究者がHPV VLPの集合と分解の条件について研究している。例えば、McCarthyら,1998“Quantitative Disassembly and Reassembly of Human Papillomavirus Type 11 Viruslike Particles in Vitro” J.Virology 72(1):32−41はVLPの均質調製物を得るために昆虫細胞から精製した組換えL1HPV11VLPの分解と再構築について記載している。比較的高濃度還元剤を生理的イオン強度で長時間インキュベート(約16時間、4℃)してVLPを分解し、より高いイオン強度で還元剤を除去してVLPを再構築させている。しかし、この方法は非常に長時間を要する。
【0005】
商業的に有用なワクチンを開発するためには貯蔵安定製剤が必要である。貯蔵安定HPV VLP製剤を製造するために、比較的簡単で迅速で定量的な処理方法が得られるならば望ましい。
【0006】
発明の詳細な説明
本発明は安定なヒトパピローマウイルス(HPV)ウイルス様粒子(VLP)の製造方法として、
(a)比較的低濃度の還元剤と、1.25Mまでの生理的イオン強度範囲で存在する塩と、非イオン界面活性剤と、金属キレート剤と、緩衝液を含む解離用混合物中で分解VLPが生成されるまでVLPをインキュベートする段階と、
(b)解離用混合物から還元剤を除去する段階と、
(c)分解VLPをVLPに再構築する段階を含む方法に関する。
【0007】
態様によっては、再構築VLPをアルミニウムアジュバントに吸着させる。
【0008】
本発明は、
(a)比較的低濃度の還元剤と、0.5M〜1.25M塩の範囲で存在する塩と、非イオン界面活性剤と、金属キレート剤と、緩衝液を含む高塩解離用混合物中で分解VLPが生成されるまで精製VLPをインキュベートする段階と、
(b)解離用混合物から還元剤を除去する段階と、
(c)分解VLPを再構築させる段階と、
(d)場合により、再構築HPV VLPをアルミニウムアジュバントに吸着させる段階を含む方法により製造したVLPにも関する。
【0009】
本発明の別の態様は、
(a)比較的低濃度の還元剤と、ほぼ生理的イオン強度で存在する塩と、非イオン界面活性剤と、金属キレート剤と、緩衝液を含む低塩解離用混合物中で分解VLPが生成されるまで精製VLPをインキュベートする段階と、
(b)解離用混合物から還元剤を除去する段階と、
(c)分解VLPを再構築させる段階と、
(d)場合により、再構築HPV VLPをアルミニウムアジュバントに吸着させる段階を含む方法により製造したVLPに関する。
【0010】
本発明の別の側面は、上記方法のいずれかにより製造したVLPから製造したワクチンに関する。
【0011】
本発明は上記方法により製造したVLPを含み、製剤用緩衝液中に保存したワクチン製剤にも関する。製剤用緩衝液は塩と、ヒスチジン緩衝液と、非イオン界面活性剤を含む。
【0012】
図面の簡単な説明
図1は超遠心分析により測定したHPV16VLPの分解と再構築を示すグラフである。
【0013】
図2は超遠心分析により測定した分解/再構築HPV16VLP(破線)と未処理HPV16VLP(実線)の粒度分布を示すグラフである。
【0014】
図3はBIAcore分析によるin vitro抗原性により測定したHPV16−アルミニウムワクチンの加速貯蔵安定性(37℃)を示すグラフである。
【0015】
図4はBIAcore分析によるin vitro抗原性により測定した、生理的塩類溶液中のHPV16VLPの加速貯蔵安定性を示す。
【0016】
図5はUV濁度(曇点分析)により熱誘導凝集をモニターすることにより測定した各種HPV16VLPロットの熱安定性に及ぼす分解/再構築処理の効果を示す。
【0017】
図6A〜DはBIAcore分析によるin vitro抗原性により測定した溶液中の4種(HPV16、11、6a、18)の異なる分解/再構築HPV VLPと未処理対照HPV VLPの加速貯蔵安定性(37℃)を示す。図6AはHPV6a、図6BはHPV11、図6CはHPV16、図6DはHPV18を表す。
【0018】
図7A〜Hはアルミニウムアジュバントに吸着させた4種(HPV16、11、6a、18)の異なる分解/再構築HPV VLPと未処理対照HPV VLPの加速貯蔵安定性を示す。試料はクエン酸溶液で処理してアルミニウムアジュバントから抗原を放出させた後にBIAcore分析によりin vitro抗原性をアッセイした。図7A及び7BはHPV6a、図7C及び7DはHPV11、図7E及び7FはHPV16、図7G及び7HはHPV18を表す。
【0019】
図8A〜Fは生理的条件付近(低塩法)又は高塩濃度(高塩法)の分解法により製造した分解/再構築HPV6a、HPV11及びHPV16VLPの熱安定性と流体力学的サイズ分布の比較を示す。HPV VLPのこれらの物性は曇点分析と超遠心分析により測定した。低塩法では0.166M NaCl、10mM TRIS溶液(pH8.2)中でHPV VLPを分解し、高塩法では0.63M NaCl、35mMリン酸及び100mM TRIS溶液(pH8.2)中でHPV VLPを分解する。どちらの溶液にもEDTAとポリソルベート80を加える。図8A及び8BはHPV6aVLPの曇点及び超遠心分析データを示し、図8C及び8DはHPV11VLPについての同分析データを示し、図8E及び8FはHPV16VLPについての同分析データを示す。
【0020】
図9A〜DはSEC−HPLC分析により測定した未処理及び分解/再構築HPV VLPの粒度分布と表面親和性を示す。図9AはHPV6a、図9BはHPV11、図9CはHPV16、図9DはHPV18を表す。
【0021】
本発明はより安定なHPV VLPの製造方法に関し、これらのVLPはHPVワクチン製剤の総合安定性を著しく改善することが判明した。精製HPV VLPを生成し、キャプソメアであると予想される形態に分解し、再構築してVLPとした後、ワクチン製剤の活性成分として使用する。
【0022】
本発明によると、任意タイプのHPV VLPをワクチン製剤の抗原部分として使用することができる。VLPはL1タンパク質のみを含むものでもよいし、L1タンパク質とL2タンパク質の両者を含むものでもよい。タンパク質は野生型アミノ酸組成でもよいし、突然変異を含むものでもよい。野生型アミノ酸組成のL1タンパク質のみを含むVLPが好ましい。
【0023】
好ましいHPVは疾病に関連するものであり、例えばHPV1、HPV2、HPV3、HPV4、HPV6a、HPV6b、HPV7、HPV10、HPV11、HPV16及びHPV18、HPV34、HPV39、HPV41〜44及びHPV51〜55が挙げられるが、これらに限定されない。好ましいHPVとしては、HPV6a、HPV6b、HPV11、HPV16及びHPV18が挙げられる。更に、本発明の製剤はHPVタイプの組合せにも適しており、例えば複数のHPV抗原(例えばHPV6、11、16及び18)を含む多価ワクチンが挙げられる。
【0024】
VLPは当分野で公知のように組換え技術により製造することが好ましい。VLPを製造するために使用する宿主細胞は酵母細胞が特に好ましいが、細菌、昆虫及び哺乳動物細胞等の他の細胞種も宿主として知られ、広く使用されている。理論に結び付けるものではないが、VLPにおけるL1タンパク質中のジスルフィド結合状態は組換えL1を発現させるために使用する宿主細胞とその後の精製方法によって異なると思われる。McCarthyら,1998,前出は昆虫細胞で生産した組換えVLPにジスルフィド架橋L1トライマーが存在すると記載している。他方、本発明によると、酵母で生産されるVLPのL1タンパク質中のジスルフィド結合状態は一定していないので、最適な分解と再構築には異なる条件が必要であると思われる。
【0025】
製剤によっては、アルミニウム吸着体が好ましい。一般にこの場合には、アルミニウムに吸着させるHPV VLPの濃度は各HPV VLPタイプ毎に約10〜200μg/mLである。これは特定タイプのHPVの抗原性や、「カクテル」型ワクチンにおける複数タイプのHPVの存在等の因子に応じて調節することができる。
【0026】
分解
組換え宿主細胞でVLPを生産させ、精製した後、解離用混合物中でインキュベートすることにより分解する。分解は生理的(「低塩法」とも言う)から1.25M NaCl(「高塩法」とも言う)までの比較的広い範囲のイオン強度環境でジチオスレイトール(DTT)等の還元剤でジスルフィド結合を還元することにより主に実施される。解離用混合物は還元剤と、塩と、非イオン界面活性剤と、金属キレート剤と、緩衝液を含む。
【0027】
還元剤はジチオスレイトール(DTT)が好ましいが、他の還元剤も知られており、使用できる。HPV粒子を分解するために他の還元剤(例えばβ−メルカプトエタノール、β−ME)も従来使用されている(例えば、McCarthyら,1998,前出参照)が、その場合には比較的高濃度の還元剤(5%又は713mMβ−ME)を使用した。これに対して、本発明の1側面は比較的低濃度の還元剤の使用にある。
【0028】
本明細書及び請求の範囲において「比較的低濃度の還元剤」なる用語は、DTTを還元剤として使用する場合には約2mM〜20mMを意味し、別の還元剤を使用する場合には2〜20mM DTTを使用した場合とほぼ同一の効果をもつ別の還元剤の量を意味する。還元剤の好ましい量は約10mM DTTである。
【0029】
解離用混合物の別の重要な成分は塩である。一般に、解離用混合物のイオン強度は塩の存在により維持される。イオン強度の調節に有効な塩は殆どいかなる塩をも使用することができる。イオン強度を調節するために使用可能な好ましい塩は任意の生理的に許容可能な塩であり、例えばNaCl、KCl、Na2SO4、(NH4)2SO4、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム及びその混合物が挙げられる。特に好ましい塩はNaCl、KCl及びNa2SO4、特にNaClである。
【0030】
本発明の低塩態様では、解離用混合物はほぼ生理的なイオン強度でなければならない。本明細書及び請求の範囲において塩に関する「ほぼ生理的」なる用語は、NaClを塩として使用する場合には0.10〜0.20M、好ましくは約0.15〜0.18M、より好ましくは約0.16Mを意味する。他の使用可能な塩については、当業者はほぼ生理的なNaCl溶液と等価のモル濃度を計算することができる。
【0031】
あるいは、高塩環境で解離を実施してもよい。本明細書で使用する「高塩」とは少なくとも0.5Mの塩及び少なくとも10mMの緩衝剤を意味する。使用する塩がNaClである場合には、好ましい高塩範囲は0.5〜1.25Mであり、より好ましい範囲は0.60〜0.1Mである。他の塩については、当業者は0.5M〜1.25M NaCl溶液と等価のモル濃度を計算することができる。
【0032】
高塩分解法を使用できるという点は全く予想外であり、Bradyら,1977 Virology 23:717−724、Belnapら,1995 J.Mol.Biol.259:249−263及び公開特許出願WO99/13056等の文献報告は塩濃度をを0.5M NaCl未満に制限している。しかし、高塩濃度はタンパク質凝集の危険を抑え、その結果、タンパク質総回収率が改善され、最終精製クロマトグラフィー段階で分解/再構築処理を開始することができ、従って、精製中に必要な処理段階数が減るという点から、高塩分解を使用すると有利であることが判明した。
【0033】
好ましい高塩溶液(例えば1.0M NaCl、10mM TRIS緩衝液(pH8.2)、2mM EDTA、0.03%ポリソルベート80及び2〜20mM DTT)を使用すると、製造工程におけるHPVタンパク質総回収率はほぼ100%になることが意外にも判明した。別の高塩溶液(0.63M NaCl、35mMリン酸緩衝液、100mM TRIS緩衝液(pH8.2)、2mM EDTA、0.03%ポリソルベート80及び2〜20mM DTT)も好ましい。
【0034】
HPV VLP分解の有効性に及ぼす高塩濃度の効果をよりよく理解し、特性決定するために、高(0.5〜1.0M NaCl)及び低(生理的)塩分解条件下の両者で比較試験を実施した。静的光散乱強度の変化をモニターし、VLP分解を調べた。結果は高塩条件と生理的塩条件の両者で非常によく似ており、(20mM)DTT添加から約2分以内に完全なVLP分解が生じることが分かった。更に、分解速度は塩濃度よりも還元剤濃度により制御されると思われ、所与温度及びpHでは還元剤の濃度が高いほど分解速度は増した。
【0035】
生理的又は高塩下に分解再構築したVLPの他の生物物理学的特性も試験した。高低塩条件下の両者で調製した分解/再構築VLPの熱安定性と流体力学的サイズ分布は似ている。他方、タンパク質総回収率は高塩分解法で調製した分解/再構築HPV VLPのほうが比較的高かった(約100%)。
【0036】
解離用混合物の別の成分は非イオン界面活性剤である。非イオン界面活性剤はポリソルベート80、ポリソルベート20、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類、Triton X−100(登録商標)、Triton X−114(登録商標)、NP−40(登録商標)、Span85及びプルロニック系非イオン界面活性剤の一員から構成される群から選択することができる。ポリソルベート80が特に好ましい。ポリソルベート80の好ましい濃度は約0.01〜0.50%、好ましくは約0.01〜0.10%、特に約0.03%である。
【0037】
解離用混合物は緩衝液の存在によりpH調節すべきである。HPV VLPの分解は7.0〜10等の塩基性pH範囲で実施することができる。好ましいpHは8.0〜8.5、好ましくは約8.2である。好ましい緩衝液は5〜100mM、好ましくは5〜15mMのTRISであるが、リン酸等の他の緩衝液も使用できる。解離用混合物条件で良好なpH及びイオン強度制御が得られることから、一般にはTRISが好ましい。場合により、0〜50mMのリン酸緩衝液を加えてもよい。
【0038】
解離用混合物にはVLPの完全な分解を確保するために金属キレート剤も加える。好ましい金属キレート剤は0.5〜5mM、好ましくは約2mMのEDTAであるが、他の公知キレート剤も使用できる。
【0039】
特に好ましい解離用混合物は0.16M〜0.18M NaCl、10又は20mM DTT、2mM EDTA及び0.03%ポリソルベート80を加えた10mM TRIS緩衝液(pH8.2)中に約300μg/mLのHPV VLPタンパク質を含む。あるいは、解離用混合物は0.63M NaCl、35mMリン酸、100mM TRIS緩衝液(pH8.2)、10又は20mM DTT、2mM EDTA及び0.03%ポリソルベート80中に同一量のタンパク質を含む。
【0040】
本発明の方法の1つの利点は、分解段階がかなり迅速であり、解離用混合物中でVLPを室温で約1時間未満インキュベートするだけでよく、30〜40分程度まで短縮できるという点である。所望により、解離段階(及び分解/再構築処理の他の段階)は滅菌条件下に実施してもよい。例えば、緩衝液成分を滅菌濾過し、滅菌タンパク質溶液と共に使用してもよい。更に、使用前又はアルミニウムアジュバントに吸着する前に溶液中の分解/再構築HPV VLPを滅菌濾過してもよい。
【0041】
VLP分解の完了後、還元剤を除去しなければならない。これは透析段階又は透析濾過/限外濾過段階を使用して実施することができる。透析段階は塩(生理的強度又は高塩法を使用した場合には1M等の高塩濃度)と、非イオン界面活性剤と、解離用混合物中に存在するものと同様であるが、解離用混合物中に存在するものよりも低pHの緩衝液を含む溶液で透析することからなる。この透析段階に推奨されるpH範囲は約6.5〜7.5、好ましくは約7.0である。好ましい透析溶液の1例は0.16〜0.18M NaCl、0.01〜0.03%ポリソルベート80、10mMリン酸(pH7.0)を含む。推奨される透析の別の例は0.166M NaCl、10mMリン酸緩衝液(pH7.0)の溶液による1:100透析(30分間ずつ3回交換)である。あるいは、好ましい溶液は1.0M NaCl、10mMリン酸及び0.03%ポリソルベート80(0H7.0)である。
【0042】
必要に応じて、DTTを除去するために使用する緩衝液にポリソルベート80等の非イオン界面活性剤を更に加え、製造工程を通してタンパク質に十分な非イオン界面活性剤濃度を維持するようにしてもよい。
【0043】
あるいは、下記再構築用溶液を使用してDTTを除去してもよい。
【0044】
大容量の場合には、透析法の代わりに大規模化可能な透析濾過又は限外濾過システムを使用することができる。
【0045】
再構築
次段階ではVLPを再構築する。これは上記透析段階中、上記透析濾過/限外濾過段階中、又は別個もしくは付加的な透析段階中に実施することができ、数時間から約24時間までとすることができる。別個の透析を使用する場合には、0.5〜1.35M NaClの範囲のイオン強度の塩と、金属イオン源と、pH6.0〜6.5の緩衝液を含む再構築用緩衝液を使用して実施する。
【0046】
塩は前段階で使用したと同一の塩が好ましいが、その濃度は高くしたほうが好ましい。例えば、NaClを使用する場合には、0.5〜1.35M、好ましくは約1.0Mの濃度とすべきである。
【0047】
金属イオン源はCaCl2又はMgCl2等のCa+2又はMg+2源とすべきであり、再構築VLPに安定性を与えると予想される。亜鉛も使用できるが、一般には他のイオンのほうがよい。CaCl2が好ましい。金属イオンの量は約1〜10mM、好ましくは約2mMの濃度とすべきである。
【0048】
再構築用緩衝液成分及び/又はpH調節剤としてグリシン又はクエン酸ナトリウムを加える。その量は約20〜70mM、好ましくは約50mMとする。
緩衝液はグリシンとリン酸又はクエン酸とリン酸の組合せでもよいし、クエン酸単独でもよい。リン酸緩衝液の単独使用は推奨されない。好ましい再構築用緩衝液は1M NaCl、2mM Ca+2、50mMクエン酸(pH6.2)及び0.03%ポリソルベート80である。
【0049】
必要に応じて、再構築用緩衝液にポリソルベート80等の非イオン界面活性剤を更に加え、製造工程を通してタンパク質に十分な非イオン界面活性剤濃度を維持するようにしてもよい。
【0050】
大容量の場合には、透析法の代わりに大規模化可能な透析濾過又は限外濾過システムを使用することができる。
【0051】
緩衝液交換
最後に、反応体が残留している場合には最終透析用緩衝液で透析することにより除去することができる。1例は塩(好ましくはNaCl)と、非イオン界面活性剤と、場合によりヒスチジンを含む。塩はNaClの場合には約0.25M〜1Mが好ましく、約0.5Mがより好ましい。ヒスチジンは2〜50mM、好ましくは約5〜20mMでpH6.0〜6.5、好ましくは約pH6.2とすることができる。非イオン界面活性剤(例えばポリソルベート80又はポリソルベート20)は0.01〜0.03%とすることができる。別の好ましい緩衝液交換は0.5M NaClと0.03%ポリソルベート80を使用する。
【0052】
HPV VLPを分解/再構築させるために使用するこれらの多重透析段階は、透析濾過及び/又は限外濾過システム等の大規模装置で実施してもよい。必要に応じて、任意の分解/再構築用緩衝液にポリソルベート80等の非イオン界面活性剤を更に加え、製造工程を通してタンパク質に十分な非イオン界面活性剤濃度を維持するようにしてもよい。
【0053】
所望により、公知技術を使用して分解/再構築HPV VLPをアルミニウムアジュバントに吸着させてもよい。
【0054】
場合により、ポリアニオンポリマー賦形剤を加えて再構築VLP製剤の安定性を更に高めてもよい。本明細書及び請求の範囲を通して使用する「ポリアニオンポリマー」なる用語は長い単鎖化合物又は多重架橋鎖化合物を意味し、いずれの場合も溶液中で鎖に沿って負の多重電荷をもつ。ポリアニオンポリマーの例としては、タンパク質、ポリアニオン、ペプチド及びポリ核酸が挙げられる。特定安定剤はカルボキシメチルセルロース(特に10〜800cps)、ヘパリン(6〜30kDa)、ポリアミノ酸(2〜100kDa)[例えばポリ(Glu)、ポリ(Asp)及びポリ(Glu,Phe)]、酸化グルタチオン[Glu−Cys−Gly]2(613Da)、ポリヌクレオチド(例えばポリシチジル酸(200〜700kDa)及びポリアデニル酸(200〜700kDa))、RNA、DNA及び血清アルブミンから構成される群から選択することができる。
【0055】
ポリアニオンポリマー賦形剤を加える場合、その濃度は約0.01%〜約0.5%、特に約0.05〜0.1%(重量/容量)であるが、これらの量の10分の1のポリアニオン賦形剤(例えば0.01%アルブミン、DNA又はヘパリン)を加えても未処理HPV VLP−アルミニウム製剤の安定性を高めることができる。
【0056】
典型的なワクチン製剤は、1)10〜200μg/mLの各HPV VLPタイプと0.15〜0.32M食塩水を含むアルミニウム吸着体と、2)5〜10mMヒスチジン(pH6.2)と、3)0.005〜0.03%非イオン界面活性剤を含む。
【0057】
この方法により得られるHPVワクチン製剤は図7に示すように2〜8℃から室温で少なくとも6カ月間(試験続行中)安定である。
【0058】
本発明の別の側面は分解/再構築VLPから製造したワクチンの安定な長期貯蔵を実現するための製剤用緩衝液の使用である。製剤用緩衝液は0.15〜0.32M NaClと、5〜10mMヒスチジン(pH6.2)と、0.005〜0.015%ポリソルベート80を含む。これらのワクチン製剤は種々の温度範囲(4〜30℃)で少なくとも6カ月間まで安定である。以下、実施例により本発明を更に説明するが、これらの実施例により発明を限定するものではない。
【0059】
実施例1
これらの実験の大半では、酵母由来組換えL1タンパク質HPV16VLP(タンパク質純度>95%)の0.5M NaCl、0.003%ポリソルベート80凍結溶液(目標pH約6.2)を使用した。HPV6aVLPとHPV11VLPは0.5M NaCl、0.03%ポリソルベート80溶液とした。HPV18VLPは0.5M NaCl、0.01%ポリソルベート80溶液とした。試験によっては1.25M NaClを加えた75mMリン酸緩衝液(pH7)でHPV6a、11及び16VLPを使用した。
【0060】
引き続き行うin vitro分析のためのアルミニウムアジュバントからのHPV VLPの放出
アルミニウムアジュバントからHPV VLPを放出させるために、クエン酸とポリソルベート80を含む高塩溶液でHPV−アルミニウム製剤を希釈するアルミニウム溶解法を開発した。アルミニウム溶解法からのHPV VLPサンプルをBIAcore分析によるin vitro抗原性アッセイで直接使用した。
【0061】
in vitro抗原性アッセイ
0.02%ポリソルベート80を加えたpH6〜6.5及び高イオン強度(約0.5M〜1M NaCl,0.1Mクエン酸ナトリウム)の安定化溶液にアルミニウム溶解法からのHPV VLPサンプルを溶かした。サンプルは(HPV VLPタイプ特異的中和抗体を使用して)それ以上希釈せずに直接BIAcore分析した。溶液サンプル(アルミニウムアジュバントなし)はBIAcore分析前に約0.5〜1M NaClで目標濃度まで希釈した。全in vitro抗原性データは(アルミニウムに吸着していない)凍結HPV VLP対照サンプルを基準とする。
【0062】
タンパク質濃度分析
HP8452Aダイオードアレースペクトロフォトメーターと経路長1cmのキュベットを使用して、バルク溶液と処方サンプル(アルミニウム溶解後)の両者におけるHPV VLPのタンパク質濃度を周囲温度でUV吸光度スペクトル測定により測定した。使用したサンプル容量は100〜250μlとした。多成分二次導関数分析法を使用してタンパク質濃度を計算した。一部の実験では、BCA比色分析でもタンパク質濃度を測定した。
【0063】
流体力学的サイズ分析。
【0064】
未処理及び分解/再構築HPV VLPの流体力学的サイズは動的光散乱、分析用超遠心及びSEC−HPLCにより測定した。
【0065】
動的光散乱測定はMalvern 4700光散乱システムを90°で使用して周囲温度で実施した。HPV VLPの見掛けの流体力学的サイズをZ平均流体力学的直径として測定した。各値は同一サンプルの5回の測定の平均を表す。
【0066】
沈降速度実験はBeckman XLI分析用遠心機と280nmのUV検出を使用して実施した。固定及び可変速度モードの2種の異なる方法を使用して沈降係数を決定した。
【0067】
SEC−HPLC測定はWaters/Millennium 2690システムとUV及び蛍光検出器を使用して周囲温度で実施した。750mM NaCl、25mMリン酸緩衝液(pH7)を移動相として使用し、(HPV VLPでプレコンディショニングした)PL−GFC 4000Åカラムを流速0.4ml/分で使用した。
【0068】
電子顕微鏡分析
ネガティブ染色法を使用して透過型電子顕微鏡(TEM)分析を実施した。サンプルを固定し、リンタングステン酸で染色し、JEOL 1200EX透過型電子顕微鏡で試験した。調製したサンプルを含むランダム領域の30000倍〜40000倍顕微鏡写真を複数回撮影した。ネガからプリントに現像する際に更に3倍に拡大した。
【0069】
実時間及び加速貯蔵安定性試験
HPV−アルミニウム製剤貯蔵安定性試験を実施した。安定性試験の温度は一般に2〜8、15、25、30及び37℃とした。円二色性と蛍光スペクトロスコピーによる既存の配座安定データ(図示せず)によると、温度が40〜45℃以上になるとHPV VLPのL1タンパク質に有意な配座変化が生じることが示されているが、このような状態は加速貯蔵安定性試験では絶対避けなければならない。
【0070】
HP845X UV−可視光システムソフトウェアと温度調節システムを搭載したHP8452Aダイオードアレースペクトロフォトメーターを使用して濁度アッセイを実施することによりHPV VLP熱安定性も評価した。温度を24℃から74℃まで制御速度で上げることによりプログラムの動態モード下に350nmで(タンパク質凝集による)溶液の光散乱を追跡した。
【0071】
マウス力価試験
HPV VLPのin vivo免疫原性をBALBcマウスで評価した。HPV VLPサンプルをアルミニウムアジュバントに吸着させ、アルミニウムアジュバントで数種の目標濃度まで希釈し、マウスに注射した。血清を採取し、ELISAアッセイにより抗体濃度を分析した。
【0072】
実施例2
超遠心分析により測定したHPV16VLPの分解及び再構築
図1に示すように、HPV16VLPは10mM TRIS又はリン酸、0.166M NaCl、2mM EDTA及び2mM DTTを含有するpH8.2緩衝液中で室温で20分間インキュベーション後に分解する(中段曲線)。分解したHPV16サンプルはL1キャプソメアであると予想される小さいS値にピークを示し、HPV L1タンパク質ペンタマーのサイズを示唆している。上段曲線は分解したHPV16(キャプソメア)がその後、グリシン又はクエン酸の存在下に10mMリン酸ナトリウム、0.5〜1M NaCl、2mM塩化カルシウムを含有するpH6.2緩衝液で透析することによりVLPに再構築したことを示す。下段曲線は未処理HPV16VLPを示す。
【0073】
実施例3
分解/再構築HPV16VLPの粒度分布
図2は実施例2に記載したように分解再構築させたHPV16VLP(破線)と未処理HPV16VLP(実線)の粒度分布を超遠心分析により測定した結果を示す。データから明らかなように、夫々ピークの位置と幅から見て、分解/再構築HPV16VLPのほうが粒度が大きく、分布が均質である。電子顕微鏡(EM)分析でも分解/再構築VLPのほうが均質であり、粒度の均質な平均直径約80〜85nmの真円に近い粒子として存在しており(EMデータは示さず)、超遠心分析を裏付けている。未処理サンプルのほうが粒度が小さく、形状と粒度分布が不均質であり、平均粒度は約50〜68nmである。同様に、その後の一連のデータによると、未処理HPV16VLPは平均粒度約40nmであるが、再構築HPV16VLPは平均粒度約60nmである。
【0074】
実施例4
BIAcore分析により測定したHPV16VLP−アルミニウムワクチン製剤の加速安定性(37℃)
分解/再構築HPV16VLPと未処理HPV16VLPをアルミニウムアジュバント(160μg/mLタンパク質に対して450μg/mL Al)に吸着させ、0.32M NaCl、10mMヒスチジン、0.015%ポリソルベート80(pH6.2)に加えた。サンプルのin vitro抗原性をBIAcore分析により指定時間でアッセイした。
【0075】
図3は分解再構築HPV16VLPを黒丸と白四角で示し、未処理サンプルを黒菱形で示す。試験1は再構築用緩衝液にクエン酸を加え、試験2はグリシンを加えた。データから明らかなように、分解/再構築処理の結果、アルミニウムアジュバントに吸着させたHPV16VLPの加速貯蔵安定性は未処理HPV VLPに比較して有意且つ劇的に増加する。同様の実験を25℃と4℃で3カ月間実施したが、アルミニウムアジュバントに吸着させた分解/再構築HPV VLPのin vitro抗原性の低下は認められなかった。
【0076】
実施例5
BIAcore分析により測定した生理的塩類溶液中のHPV16VLPの加速安定性(37℃)
分解/再構築HPV16VLPと未処理HPV16VLP 80μg/mlを0.15M NaCl、10mMヒスチジン、0.015%ポリソルベート80(pH6.2)中で37℃でインキュベートした。サンプルのin vitro抗原性をBIAcore分析により指定時間にアッセイした。データから明らかなように、分解/再構築処理の結果、HPV16VLPの加速貯蔵安定性は未処理HPV VLPに比較して有意に増加する。これを図4に示し、分解/再構築VLPは白丸と白四角で示し、未処理VLPは黒菱形で示す。試験1は再構築用緩衝液にクエン酸を加え、試験2はグリシンを加えた。
【0077】
実施例6
UVスペクトロスコピー(曇点分析)により熱誘導濁り形成(凝集)をモニターすることにより測定した各種HPV16VLPロットの熱安定性に及ぼす分解/再構築処理の効果
標準曇点プロトコールをサンプルに適用し、溶液の光学密度350nmでモニターしながら制御速度で24℃から74℃まで加熱した。図5に示すように、3種の異なるロットのHPV16VLP(ロット1、2、3)を分解/再構築処理の前(破線と白記号)と後(実線と黒記号)に分析した。これらのサンプルのうち、HPV16VLP(ロット1)は3回試験した。データから明らかなように、分解/再構築処理の結果、熱誘導凝集に対するHPV16VLPの固有安定性は有意に増加する。熱安定性増加に加え、分解/再構築処理の結果、より安定した均質な安定性プロフィルが得られる。
【0078】
実施例7
未処理及び分解/再構築VLPのin vitro抗原性を大量のHPV16VLPで更に評価し、未処理及び分解/再構築VLPの両者をアルミニウムアジュバント吸着前後に評価した。in vitro抗原性はBIAcore分析により測定し、タンパク質濃度はUVスペクトロスコピーとBCA比色アッセイにより測定した。次に、未処理及び分解/再構築HPV16VLPの両者の抗原対タンパク質比を測定した。例えば、分解/再構築及び未処理HPV16VLPの抗原対タンパク質比は1.7であり、1.5〜1.9の範囲であった。この結果はEIA分析(平均1.6と範囲1.4〜1.8)とIVRP分析(平均1.4と範囲1.3〜1.5)により裏付けられた。
【0079】
未処理及び分解/再構築アルミニウム吸着HPV16VLPのin vivo免疫原性をマウス力価試験により評価した。この試験ではマウスの50%以上が血清変換するHPV VLPの用量(μg)を表すED50値を測定する。分解/再構築HPV16VLPのin vivo免疫原性は未処理HPV16VLPと同等であるか、又はそれよりも良好であった。1回目の実験では、未処理サンプルのED値0.146に対して、2種の分解/再構築サンプルのED50値は0.034〜0.062であった。2回目のマウス実験では、未処理サンプルのED50値0.074に対して3種の分解/再構築HPV VLPサンプルで<0.0125のED50値が得られた。
【0080】
実施例8
BIAcore分析により測定した溶液中とアルミニウムアジュバントに吸着させた未処理及び分解/再構築HPV VLPの加速安定性(37℃)
0.32M NaCl、10mMヒスチジン、0.015%ポリソルベート80を含有する溶液(pH6.2)中で80μg/mL HPV VLPを37℃でインキュベートした。図6に示す時点でBIAcoreによりサンプルのin vitro抗原性をアッセイした。データから明らかなように、分解/再構築処理の結果、加速貯蔵安定性試験中にHPV VLPタイプ6a、11及び16の安定性は劇的に増加した。未処理HPV18VLPは他の3種の分解/再構築VLPに似た安定性プロフィルを示す。HPV18VLPの処理サンプルに有意安定性増加は認められず、これは恐らく分解/再構築処理がHPV18VLPに作用できないためであると思われる(データは示さず)。本試験に使用したサンプルは低塩分解法で調製した。分解/再構築処理後の4種のタンパク質総回収率はHPV11、16及び18VLPで約85〜95%であり、HPV6aVLPで約60〜70%であった。分解/再構築処理後の収率はVLP凝集として特定ロットのHPV VLPの品質に影響されると思われる。分解処理を高塩条件下に実施する場合、分解/再構築処理後のタンパク質総収率はほぼ100%まで増加する。分解/再構築HPV VLPの超遠心分析によると、分解/再構築処理はキャプソメアのほぼ定量的なVLP再構築を生じると予想される。
【0081】
図7はアルミニウムアジュバントに吸着させたHPV VLPの貯蔵及び加速安定性を示し、400μg/mL HPV VLPを450μg/mLアルミニウムアジュバントに吸着させ、0.32M NaCl、10mMヒスチジン、0.015%ポリソルベート80を含有する溶液(pH6.2)中で4℃、15℃、25℃、30℃及び37℃でインキュベートした。クエン酸溶液で処理してアルミニウムアジュバントから抗原を放出させた後に図面に示す時点でBIAcoreによりサンプルのin vitro抗原性をアッセイした。データから明らかなように、分解/再構築処理の結果、加速貯蔵安定性試験でアルミニウム吸着HPV VLPタイプ6a、11及び16の安定性は劇的に増加した。未処理HPV18VLPは他の3種の分解/再構築VLPに似た安定性プロフィルを示す。HPV18VLPの分解/再構築処理では有意安定性増加は認められない。
【0082】
実施例9
低塩分解法と高塩分解法の両者により調製した再構築HPV6a、HPV11及びHPV16VLPの熱安定性と流体力学的サイズ分布
サンプルを曇点分析と超遠心分析により評価した。低塩法では、0.166M NaCl、10mM TRIS溶液(pH8.2)中でHPV VLPを分解し、高塩法では0.63M NaCl、35mMリン酸及び100mM TRIS溶液(pH8.2)中でHPV VLPを分解する。どちらの溶液にもEDTAとポリソルベート80を加えた。図8に示すデータから明らかなように、低塩法と高塩法により調製した分解/再構築HPV VLPはHPV VLPタイプ11、6a及び16では熱安定性と流体力学的サイズ分布が似ている。
【0083】
実施例10
SEC−HPLC分析により測定したHPV VLPの粒度分布と表面親和性
分解/再構築(図9、実線)及び未処理(破線)HPV VLP(タイプ11、16及び6a)を4000A GPCサイズ排除カラムで分析した。未処理HPV VLPは分布が不均質であったが、分解/再構築HPV VLPからは単一ピークが得られた。分解/再構築HPV VLPのモノマーピークは未処理HPV VLPのモノマーピークよりも溶出容量が小さく、分解/再構築VLPの粒度が比較的大きいことを示唆している。分解/再構築HPV VLPは合計ピーク面積が比較的大きく、分解/再構築VLPの回収率が高いことを示しており、分解/再構築VLPは未処理VLPよりもカラム親和性が低いことを示唆している。未処理HPV18VLPは他の3種の分解/再構築VLPに似たSEC−HPLCプロフィルを示す。
【図面の簡単な説明】
【図1】 超遠心分析により測定したHPV16VLPの分解と再構築を示すグラフである。
【図2】 超遠心分析により測定した分解/再構築HPV16VLP(破線)と未処理HPV16VLP(実線)の粒度分布を示すグラフである。
【図3】 BIAcore分析によるin vitro抗原性により測定したHPV16−アルミニウムワクチンの加速貯蔵安定性(37℃)を示すグラフである。
【図4】 BIAcore分析によるin vitro抗原性により測定した生理的塩類溶液中のHPV16VLPの加速貯蔵安定性を示す。
【図5】 UV濁度(曇点分析)により熱誘導凝集をモニターすることにより測定した各種HPV16VLPロットの熱安定性に及ぼす分解/再構築処理の効果を示す。
【図6A】 BIAcore分析によるin vitro抗原性により測定した溶液中の異なる分解/再構築HPV VLPと未処理対照HPV VLPの加速貯蔵安定性(37℃)を示し、AはHPV6aを表す。
【図6B】 BIAcore分析によるin vitro抗原性により測定した溶液中の異なる分解/再構築HPV VLPと未処理対照HPV VLPの加速貯蔵安定性(37℃)を示し、BはHPV11を表す。
【図6C】 BIAcore分析によるin vitro抗原性により測定した溶液中の異なる分解/再構築HPV VLPと未処理対照HPV VLPの加速貯蔵安定性(37℃)を示し、CはHPV1を表す。
【図6D】 BIAcore分析によるin vitro抗原性により測定した溶液中の異なる分解/再構築HPV VLPと未処理対照HPV VLPの加速貯蔵安定性(37℃)を示し、DはHPV18を表す。
【図7】 A〜Hはアルミニウムアジュバントに吸着させた異なる分解/再構築HPV VLPと未処理対照HPV VLPの加速貯蔵安定性を示し、それぞれHPV6a、HPV6a、HPV11、HPV11、HPV16、HPV16、HPV18、HPV18を表す。
【図8】 A〜Fは生理的条件付近(低塩法)又は高塩濃度(高塩法)の分解法により製造した分解/再構築HPV6a、HPV11及びHPV16VLPの熱安定性と流体力学的サイズ分布の比較を示す。A及びBはHPV6aVLPの曇点及び超遠心分析データを示し、C及びDはHPV11VLPについての同分析データを示し、E及びFはHPV16VLPについての同分析データを示す。
【図9】 A〜DはSEC−HPLC分析により測定した未処理及び分解/再構築HPV VLPの粒度分布と表面親和性を示し、それぞれHPV6a、HPV11、HPV16、HPV18を表す。
Claims (17)
- ヒトパピローマウイルス(HPV)のウイルス様粒子(VLP)を含む、貯蔵に対して安定なヒトパピローマウイルスワクチンの製造方法であって、
(a)0.1〜0.2MのNaCl、2〜20mMのDTT、0.01〜0.5%のポリソルベート80、0.5〜5mMのEDTA及び5〜15mMのpH7〜10のTRIS緩衝液を含む低解離用混合物中で分解したVLPが生成されるまでVLPをインキュベートする段階と、
(b)場合により、透析濾過、限外濾過、又は0.1〜0.2MのNaCl、0.01〜0.05%のポリソルベート80及びpH6.5〜7.5のリン酸緩衝液を含む透析液に対する透析によって、解離用混合物からDTTを除去する段階、及び
(c)透析濾過、限外濾過、又は0.5〜1.35MのNaCl、0.5〜5mMのCa +2 又は0.5〜5mMのMg +2 、pH6.0〜6.5の20〜70mMのクエン酸ナトリウム、20〜70mMのグリシン及びリン酸塩及び20〜70mMのクエン酸塩及びリン酸塩からなる群から選択される緩衝液を含む再構築用緩衝液に対する透析によって分解したVLPを再構築する段階を含む前記方法。 - さらに(d)透析濾過、限外濾過又は0.25〜1MのNaCl、5〜20mMのヒスチジンを含むpH6〜6.5の最終緩衝液に対する透析によって、再構築されたVLPを精製する段階を含む請求項1に記載の方法。
- さらに(e)段階(d)で得られた再構築されたVLPをアルミニウムアジュバントに吸着する段階を含む請求項2に記載の方法。
- VLPがHPV6a、HPV6b、HPV11、HPV16、HPV18及びその組合せからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 段階(a)においてVLPを1時間未満インキュベーションすることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 段階(a)における解離用混合物が、0.16〜0.18M NaClと、2〜20mM DTTと、0.01〜0.03%ポリソルベート80と、0.5〜5mM EDTAと、pH8.2の5〜15mM TRIS緩衝液を含む請求項1に記載の方法。
- 段階(b)における緩衝液が、0.16〜0.18MのNaClと、0.01〜0.03%のポリソルベート80と、pH7.0の10mMリン酸塩を含む請求項1に記載の方法。
- 再構築用緩衝液が、1.0MのNaClと、2mM Ca +2 と、pH6.2の50mMのクエン酸ナトリウム、50mMのグリシンとリン酸塩、及び50mMのクエン酸塩とリン酸塩からなる群から選択される緩衝液を含む、請求項1に記載の方法。
- 段階(d)における最終緩衝液が0.5M NaClと、pH6.2の10mMヒスチジンを含む請求項1に記載の方法。
- ヒトパピローマウイルス(HPV)のウイルス様粒子(VLP)を含む、貯蔵に対して安定なヒトパピローマウイルスワクチンの製造方法であって、
(a)0.5〜1.25MのNaClと、2〜20mMのDTTと、0.01〜0.05%のポリソルベート80と、0.5〜5mMのEDTAと、pH7〜10の5〜100mMのTRIS緩衝液及び0〜50mMのリン酸緩衝液を含む高塩解離用混合物中で、分解したVLPが生成するまでVLPをインキュベートする段階、
(b)場合により、解離用混合物から透析濾過、限外濾過又は少なくとも1MのNaClと、0.01〜0.05%ポリソルベート80と、pH6.5〜7.5のリン酸緩衝液を含む緩衝液に対する透析により解離用混合物からDTTを除去する段階、及び
(c)透析濾過、限外濾過又は0.5〜1.35M NaClと、0.5〜5mMのCa +2 又は、0.5〜5mMのMg +2 と、20〜70mMのクエン酸ナトリウム、20〜70mMのグリシンとリン酸塩、及び20〜70mMのクエン酸塩とリン酸塩から構成される群から選択されるpH6〜6.5の緩衝液を含む再構築用緩衝液に対する透析により分解したVLPを再構築させる段階を含む方法。 - さらに(d)透析濾過、限外濾過又は0.25〜1MのNaCl、pH6〜6.5の5〜20mMのヒスチジンを含む最終緩衝液に対する透析によって、再構築されたVLPを精製する段階を含む請求項10に記載の方法。
- さらに(f)段階(d)で得られた再構築されたVLPをアルミニウムアジュバントに吸着する段階を含む請求項11に記載の方法。
- VLPがHPV6a、HPV6b、HPV11、HPV16、HPV18及びその組合せからなる群から選択される、請求項10に記載の方法。
- 段階(a)においてVLPを1時間未満インキュベーションし、解離用混合物が0.5MのNaClと、2〜20mMのDTTと、0.01〜0.03%のポリソルベート80と、0.5〜5mMのEDTAと、pH8.2の5〜100mMのTRIS緩衝液及び0〜50mMのリン酸塩を含む請求項10に記載の方法。
- 段階(b)における解離用混合物が、1MのNaClと、0.01〜0.03%のポリソルベート80と、pH7.0の10mMリン酸塩を含む請求項10に記載の方法。
- 段階(c)における再構築用緩衝液が、1.0〜1.35MのNaClと、2mMのCa +2 と、50mMクエン酸ナトリウム、50mMグリシンとリン酸塩、及び50mMクエン酸塩とリン酸塩から構成される群から選択されるpH6.2の緩衝液を含む請求項10に記載の方法。
- 段階(d)における最終緩衝液が0.5M NaClと、pH6.2の10mMヒスチジンを含む請求項11に記載の方法。
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