ES2325053T3 - Metodo in vitro para desensamblaje/reensamblaje de particulas similares a virus de papilomavirus (vlp). - Google Patents

Abstract

Un método para producir una composición que contiene partículas similares a virus (VLP) de papilomavirus homogénea que comprende (i) desensamblar dicha composición que contiene partículas similares a virus con una solución que comprende un agente reductor sulfhidrilo que tiene una fuerza iónica que es de 1,0 M a 1,5 M para desensamblar al menos el 70% de dichas VLP en moléculas de L1 más pequeñas correctamente plegadas; y (ii) reensamblar dichas VLP desensambladas por eliminación u oxidación del agente reductor sulfhidrilo, en el que la concentración del agente reductor usado en la etapa (i) es de al menos el 1% en peso y la partícula similar a virus se pone en contacto con el agente reductor durante al menos 16 horas.

Description

Método in vitro para desensamblaje/reensamblaje de partículas similares a virus de papilomavirus (VLP).

Campo de la invención

La presente invención proporciona un medio altamente eficaz de desensamblaje de partículas simulares a virus de papilomavirus (VLP) en capsómeros y/o subunidades de menor tamaño y reensamblaje en VLP. Estas composiciones que contienen VLP reemsambladas producidas por la invención expresan epítopos conformacionales neutralizantes y tienen una homogeneidad elevada y por lo tanto comprenden agentes de diagnóstico y profilácticos eficaces para el diagnóstico o la prevención de una infección por papilomavirus. Además, se analiza el uso de dichas VLP para encapsulación de restos deseados, por ejemplo, agentes de diagnóstico o terapéuticos, y el uso de las mismas como "pseudoviriones" para evaluar la eficacia de supuestas vacunas o agentes terapéuticos.

Antecedentes de la invención

Los papilomavirus infectan una amplia diversidad de especies diferentes de animales incluyendo seres humanos. La infección se caracteriza típicamente por la inducción de tumores epiteliales y fibroepiteliales benignos o verrugas en el sitio de infección. Cada especie de vertebrado se infecta por un conjunto específico de especies de papilomavirus, comprendiendo el mismo varios tipos de papilomavirus diferentes. Por ejemplo, se han aislado más de sesenta genotipos diferentes de papilomavirus humanos (HPV). Los papilomavirus son agentes infecciosos altamente específicos de especie. Por ejemplo, los papilomavirus caninos y de conejo no puede inducir papilomas en especies heterólogas tales como seres humanos. Una inmunidad neutralizante a una infección contra un tipo de papilomavirus generalmente no confiere inmunidad contra otro tipo, incluso cuando los tipos infectan una especie homóloga.

En seres humanos, los papilomavirus causan verrugas genitales, una enfermedad prevalente de transmisión sexual. Los HPV tipos 6 y 11 se asocian más comúnmente con verrugas genitales benignas o condilomas acuminados. Las verrugas genitales son muy comunes y la infección por HPV subclínica o inaparente es incluso más común que la infección clínica. Aunque la mayoría de las lesiones inducidas por HPV son benignas, las lesiones que surgen de ciertos tipos de papilomavirus, por ejemplo, HPV-16 y HPV-18, pueden experimentar una progresión maligna. Además, la infección por uno de los tipos de papilomavirus asociados con tumores malignos se considera que es un factor de riesgo significativo en el desarrollo de cáncer cervical, el segundo cáncer más común en mujeres en todo el mundo. De los genotipos de HPV implicados en el cáncer cervical, el HPV-16 es el más común, encontrándose en aproximadamente el 50% de los cánceres cervicales.

En vista de los riesgos de salud significativos representados por una infección por papilomavirus en general, y por una infección por papilomavirus humanos en particular, diversos grupos han descrito el desarrollo de antígenos de papilomavirus recombinantes y su uso como agentes de diagnóstico y como vacunas profilácticas. En general, dicha investigación se ha centrado en la producción de vacunas profilácticas que contienen la proteína principal de la cápsida (L1) en solitario o en combinación con la proteína secundaria de la cápsida (L2). Por ejemplo, Ghim et al, Virology, 190: 548-552 (1992), describieron la expresión de proteína L1 de HPV-1 usando expresión de vaccinia en células Cos, que presentaban epítopos conformacionales, y el uso de la misma como una vacuna o para tipado o detección serológica. Este trabajo también es la base de una solicitud de patente de Estados Unidos de Nº de serie 07/903.109, presentada el 25 de junio de 1992 (abandonada en favor de la de Estados Unidos de Nº de serie 08/216.506, presentada el 22 de marzo de 1994) (documento WO 9400152)) cuya comercialización se ha autorizado por el cesionario de esta solicitud. Además, Suzich et al, Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A., 92: 11553-11557 (1995), describen que la inmunización de caninos con un papilomavirus oral canino recombinante (COPV) expresado en un sistema de baculovirus/célula de insecto prevenía totalmente el desarrollo de papilomas mucosos víricos. Estos resultados son importantes dadas las similitudes significativas entre muchos HPV y el COPV. Por ejemplo, el COPV, de forma similar a HPV asociados con cáncer anogenital y genital, infecta e induce lesiones en un sitio de la mucosa. Además, las secuencias de L1 de COPV comparten similitudes estructurales con secuencias de L1 de HPV. Dadas estas similitudes, el modelo de COPV/beagle es útil para la investigación de vacunas que contienen proteína L1, por ejemplo, investigación de la respuesta inmune protectora, protección de una infección natural y optimización de protocolos de vacunación. (Ídem).

Además, un grupo de investigación de la Universidad de Rochester describió la producción de proteína principal de la cápsida de papilomavirus humanos (L1) y partículas similares a virus usando un sistema de expresión de baculovirus/célula de insecto (Rose et al, Universidad de Rochester, documento WO 94/20137, publicado el 15 de septiembre de 1994). En particular, describen la expresión de la proteína principal de la cápsida L1 de HPV-6 y HPV-11 y la producción de partículas similares a virus de HPV-6, HPV-11, HPV-16 y HPV-18.

Además, un grupo de investigación de la Universidad de Queensland también describió supuestamente la fabricación recombinante de proteínas L1 y/o L2 de papilomavirus y partículas similares a virus, así como su uso potencial como vacunas (Frazer et al, documento WO 93/02189, publicado el 4 de febrero de 1993).

Aún más, un grupo de investigación del gobierno de los Estados Unidos describió proteínas de la cápsida de papilomavirus recombinantes supuestamente capaces de autoensamblarse en estructuras capsoméricas y cápsidas virales que comprenden epítopos conformacionales antigénicos (patente de Estados Unidos Nº 5.437.951, Lowy et al, expedida el 1 de agosto de 1995). Las reivindicaciones de esta patente se refieren a una secuencia de ADN de HPV-16 específica que codifica una proteína L1 capaz de autoensamblarse y el uso de la misma para expresar cápsidas de HPV-16 recombinantes que contienen dicha proteína L1 de HPV-16.

Con respecto a vacunas que contienen proteína de la cápsida de HPV, está ampliamente aceptado por los especialistas en la técnica que un requisito previo necesario de una vacuna basada en la proteína principal de la cápsida L1 de HPV eficaz es que la proteína L1 presente epítopos conformacionales expresados por proteínas principales de la cápsida de papilomavirus humanos nativo (véase, por ejemplo, Hines et al, Gynecologic Oncology, 53: 13-20 (1994); Suzich et al, Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A., 92: 11553-11557 (1995)).

Se han descrito en la bibliografía proteínas L1 de HPV recombinantes tanto de partículas como no de partículas que presentan epítopos conformacionales nativos de L1 de HPV. Se sabe que L1 es estable en varias configuraciones oligoméricas, por ejemplo, (i) capsómeros que comprenden pentámeros de la proteína L1 y (ii) cápsidas que están constituidas por setenta y dos capsómeros en una estructura icosaédrica T = 7. Además, se sabe que la proteína L1, cuando se expresa en células eucariotas por sí misma o en combinación con L2, es capaz de autoensamblarse eficazmente en estructuras similares a cápsidas generalmente denominadas partículas similares a virus (VLP). Se ha descrito que las VLP son morfológicamente y antigénicamente similares a los viriones auténticos. Además, se ha descrito que la inmunización con VLP provoca la producción de anticuerpos neutralizantes de virus. Más específicamente, los resultados con una diversidad de papilomavirus animales (papilomavirus oral canino y papilomavirus bovino 4) han sugerido que la inmunización con VLP da como resultado una protección frente a una infección por papilomavirus posterior. Por consiguiente, se ha propuesto a las VLP compuestas por proteínas L1 de HPV como vacunas para prevenir enfermedades asociadas con infecciones por papilomavirus humanos.

Por ejemplo, se ha descrito que la proteína L1 puede ensamblarse en VLP cuando se expresa usando baculovirus y vectores de virus vaccinia recombinantes y en la levaduras recombinantes (Hagensee et al, J. Virol., 68: 4503-4505 (1994); Hofmann et al, Virology, 209: 506-518 (1995); Kirnbauer et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 12180-12184 (1992); Kirnbauer et al, J. Virol., 67: 6929-6936 (1993), Rose et al, J. Virol., 67: 1936-1944 (1993); Sasagawa et al, Virology, 206: 126-135 (1995); Suzich et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 11553-11557 (1995); Volpers et al, Virology, 200: 504-512 (1994); Zhou et al, J. Virol., 68: 619-625 (1994)).

La mayoría de las preparaciones de L1 recombinante anteriores aisladas de células eucariotas han dado como resultado una población variable de VLP que se aproximan a 55 nm de diámetro, que son similares en aspecto a viriones intactos. Sin embargo, el ensamblaje de VLP es algo sensible al tipo celular. Por ejemplo, la L1 expresada en Escherichia coli se expresa en gran medida en forma de capsómeros o de menor tamaño, con pocas o ninguna cápsida aparente ni en la célula ni tras la purificación (Rose et al, J. Virol., 67: 1936-1944 (1993), Li et al, J. Virol., 71: 2988-2995 (1997). Se observan resultados similares cuando se expresa la proteína VP1 de virus polioma en E. coli (Salunke et al, Biophys. J., 56: 887-900 (1989)).

Hasta la fecha no se ha descrito un método in vitro eficaz para el desensamblaje cuantitativo y posterior reensamblaje de VLP de papilomavirus.

Dicho método sería altamente ventajoso ya que potencialmente permitiría la preparación de VLP de papilomavirus más estables y/o homogéneas. Esto sería beneficioso ya que tanto la homogeneidad como la estabilidad son preocupaciones significativas en la preparación de vacunas y en la caracterización durante la fabricación. Además, la capacidad para desensamblar y reensamblar VLP tiene aplicaciones importantes en la purificación de VLP. Las proteínas L1 de HPV expresadas en células eucariotas se ensamblan espontáneamente para formar VLP, como se ha analizado anteriormente. Sin embargo, la mayoría de los procedimientos de purificación de proteínas se han diseñado para purificar proteínas de un tamaño mucho menor que el de la VLP de 55 nm y \sim20 millones de dalton. El potencial para desensamblar VLP extraídas de células eucariotas a nivel de capsómeros de L1 o de menor tamaño, purificar los componentes de menor tamaño mediante técnicas convencionales y, después, reensamblarlos para forma VLP en la fase deseada del proceso de purificación es muy potente y actualmente se está utilizando en la purificación de VLP de HPV-16_{Tr}, como se analiza a continuación (compuestas por una forma mutada de la proteína L1 de HPV-16 de la que se han delecionado los 34 aminoácidos C-terminales). Por último, la capacidad para desensamblar y reensamblar VLP in vitro permite el empaquetamiento de compuestos exógenos deseados dentro de la VLP reensamblada.

Intentos anteriores de desensamblaje de VLP de papiloma han incluido experimentos basados en trabajos anteriores realizados en poliomavirus, un papovavirus relacionado, en los que se demostró que tanto la reducción de disulfuros como la quelación de cationes eran esenciales para el desensamblaje del virión (Brady et al, J. Virol., 23: 717-724 (1977)). Sin embargo, en el caso de VLP de HPV se ha demostrado que los bajos niveles de agente reductor (DTT 1-10 mM) que proporcionan un desensamblaje óptimo de poliomavirus en presencia de bajos niveles de agentes quelantes (por ejemplo, EGTA 0,5-10 mM) sólo eran ligeramente eficaces en el desensamblaje de VLP de papilomavirus (véase la Tabla 1, Li et al, J. Virol., 71: 2988-2995 (1997)). Por el contrario, se ha descrito que VLP de L1 de HPV-11 parcialmente tripsinizadas se disocian eficazmente en dichas condiciones (Li et al, J. Virol., 71: 2988-2995 (1997)). Sin embargo, esto es ventajoso ya que el uso de proteasa puede dar como resultado efectos adversos, por ejemplo, eliminación de epítopos neutralizantes.

Además, Sapp y colaboradores demostraron que el "desensamblaje parcial" de VLP de HPV-33 podía conseguirse por tratamiento con agente reductor en solitario (DTT 20 mM). Sin embargo, no se determinó el grado de degradación de VLP (Sapp et al, J. Gen. Virol., 76: 2407-2412 (1995)).

Como se ha analizado anteriormente, el ensamblaje de cápsidas de HPV requieren proteína L1 correctamente plegada. Sin embargo, no se han dilucidado bien factores adicionales significativos para la formulación y estabilidad de VLP. Con respecto a los mismos, en general se sabe que el ensamblaje de VLP puede afectarse por numerosos factores. Por ejemplo, los factores y condiciones que se sabe que afectan al ensamblaje para otros virus incluyen, a modo de ejemplo: pH, fuerza iónica, modificaciones postraduccionales de proteínas de la cápsida viral, enlaces disulfuro y formación de enlaces catiónicos divalentes, entre otros. Por ejemplo, la importancia de la formación de enlaces catiónicos, específicamente calcio, en el mantenimiento de la integridad del virión se ha demostrado para poliomavirus (Brady et al, J. Virol., 23: 717-724 (1977) y rotovirus (Gajardo et al, J. Virol., 71: 2211-2216 (1997). Además, los enlaces disulfuro parecen ser significativos para estabilizar poliomavirus (Walter et al, Cold Spring Har. Symp. Quant. Biol., 39: 255-257 (1975); Brady et al, J. Virol., 23: 717-724 (1977)); y virus SV40 (Christansen et al, J. Virol., 21: 1079-1084 (1977)). Además, se sabe que factores tales como el pH y la fuerza iónica influyen en la estabilidad de la cápsida de poliomavirus, afectando presumiblemente a interacciones electrostáticas (Brady et al, J. Virol., 23: 717-724 (1977); Salunke et al, Cell, 46: 895-904 (1986); Salunke et al, Biophys. J., 56: 887-900 (1980)). Además, se sabe que las modificaciones postraduccionales de algunas proteínas de la cápsida viral pueden afectar a la estabilidad y al ensamblaje de la cápsida, por ejemplo, glicosilación, fosforilación y acetilación (Garcea et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 3613-3617 (1983); Xi et al, J. Gen. Virol., 72: 2981-2988 (1991)). Por lo tanto, existen numerosos factores interrelacionados que pueden afectar a la estabilidad, ensamblaje y desensamblaje de la cápsida, que varían ampliamente incluso para virus relacionados.

El documento WO-A-9913056 describe un método de desensamblaje/reensamblaje de VLP de papilomavirus.

Por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de dilucidar los factores que afectan al ensamblaje y desensamblaje de VLP de papilomavirus. Además, basándose en los mismos, existe la necesidad en la técnica de un método in vitro eficaz de desensamblaje y reensamblaje de VLP de papilomavirus que de cómo resultado VLP que tengan buena homogeneidad, estabilidad y propiedades inmunogénicas, es decir, las que presenten epítopos conformacionales y, más particularmente neutralizantes, expresados en la superficie de viriones de papilomavirus nativos intactos. Además, existe una necesidad significativa de métodos para el desensamblaje y reensamblaje de VLP de papilomavirus que evitan los problemas del desensamblaje parcial de VLP y que evitan el uso de proteasa usada en métodos anteriores de generación de capsómeros de papilomavirus.

\vskip1.000000\baselineskip

Objetos de la invención

Por lo tanto, un objeto de la invención es resolver los problemas de la técnica anterior.

Más específicamente, un objeto de la invención es proporcionar un nuevo método para desensamblaje y reensamblaje de VLP de papilomavirus.

Aún más específicamente, un objeto de la invención es proporcionar un nuevo método para desensamblaje y reensamblaje de VLP de papilomavirus humanos.

También es un objeto de la descripción proporcionar un método que permite el desensamblaje y ensamblaje cuantitativo de VLP de papilomavirus en grandes cantidades.

Otro objeto de la descripción es proporcionar composiciones que contengan VLP de papilomavirus, preferiblemente composiciones que contengan VLP de papilomavirus humanos, de una calidad mejorada, por ejemplo, homogeneidad, inmunogenicidad y/o estabilidad mejoradas.

Otro objeto de la descripción es proporcionar un medio mejorado de purificación de VLP por incorporación del desensamblaje/reensamblaje de VLP dentro del proceso de purificación.

Otro objeto más de la descripción es proporcionar un método para la encapsulación de restos deseados en VLP de papilomavirus, por ejemplo, agentes terapéuticos o de diagnóstico.

Otro objeto de la descripción es proporcionar VLP de papilomavirus, preferiblemente VLP de papilomavirus humanos, que contienen agentes terapéuticos o de diagnóstico deseados contenidos en las mismas, por ejemplo, agentes anticancerosos o agentes antivirales.

Otro objeto más de la descripción es generar "pseudoviriones" para tipos de virus HPV en los que actualmente no están disponibles cantidades recuperables de viriones de HPV mediante la encapsulación de compuestos exógenos en VLP de HPV construidas usando proteínas L1 y L1/L2 de dicho papilomavirus HPV, en particular, un ADN que se corresponda con el genoma de dicho HPV o un fragmento o forma mutada del mismo, o un ADN que codifica un marcador de selección tal como \beta-galactosidasa.

Otro objeto más de la descripción es proporcionar un nuevo método de administración de un resto deseado, por ejemplo, un ADN a células deseadas, en el que el vehículo de administración para dicho resto, por ejemplo, ADN sentido o antisentido, comprende una VLP de papilomavirus.

Otro objeto más de la presente descripción es usar pseudoviriones basados en VLP de HPV en un ensayo in vitro para ensayar la eficacia de vacunas de HPV potenciales, que ensaye la capacidad de anticuerpos neutralizantes para inhibir la inserción de ADN encapsulado en las mismas en células.

\vskip1.000000\baselineskip

Breve descripción de la invención

Por lo tanto, la invención se refiere generalmente a un nuevo método para desensamblaje y reensamblaje de VLP de papilomavirus, preferiblemente VLP de papilomavirus humanos in vitro.

Específicamente, la presente invención proporciona un método para producir una composición que contiene partículas similares a virus (VLP) de papilomavirus homogénea, que comprende (i) desensamblar dicha composición que contiene partículas similares a virus con una solución que comprende un agente reductor sulfhidrilo que tiene una fuerza iónica que es de 1,0 M a 1,5 M para desensamblar al menos el 70% de dichas VLP en moléculas L1 de menor tamaño plegadas correctamente; y (ii) reensamblar dichas VLP desensambladas mediante la eliminación u oxidación del agente reductor sulfhidrilo, en el que la concentración del agente reductor usada en la etapa (i) es al menos el 1% en peso y la partícula similar a virus se pone en contacto con el agente reductor durante al menos
16 horas.

Como se han analizado anteriormente, las VLP de papilomavirus están constituidas principalmente por una proteína estructural L1 que es estable como capsómeros pentaméricos o cápsidas compuestas por 72 capsómeros. Dichas VLP también pueden comprender la proteína L2. En particular, mediante la elección sensata de las condiciones experimentales, los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que el desensamblaje cuantitativo de VLP de papilomavirus (casi totalmente a nivel de capsómeros o de menor tamaño) y el posterior reensamblaje puede conseguirse sistemáticamente mediante una exposición prolongada de VLP a un solución que comprende una alta concentración de al menos un agente reductor sulfhidrilo contenido preferiblemente en tampones de fuerza iónica apropiada. En concreto, la fuerza iónica de la solución es de 1,0 M a 1,5 M. El presente método da como resultado composiciones que contienen VLP reensambladas de una homogeneidad muy elevada, que comprenden predominantemente partículas en el intervalo de VLP de tamaño completo, con un promedio de 56,5 \pm 7, 0 nm (n = 15) con muy pocas VLP parcialmente ensambladas o complejos de menor tamaño. Los rendimientos también son muy elevados, es decir, cuantitativos, con un promedio del 80-90% en términos de proteína L1 total de material de partida respecto a VLP reensambladas en condiciones óptimas de desensamblaje. Además, esencialmente todos los capsómeros desasociados previamente se reensamblan para producir VLP de tamaño completo solubles y filtrables.

Se ha descubierto inesperadamente que el uso de dichas condiciones da como resultado composiciones de VLP de papilomavirus de una homogeneidad aumentada (respecto al material de partida de VLP y a las composiciones de VLP disponibles), es decir, composiciones homogéneas constituidas casi totalmente por VLP de papilomavirus que son de 55 nm, 150 S. Además, se ha demostrado que estas VLP homogéneas presentan epítopos de HPV conformacionales neutralizantes, un requisito previo de una vacuna basada en VLP de HPV profiláctica eficaz. Además, se ha descubierto sorprendentemente por los inventores que los quelantes no aumentan el desensamblaje de VLP y además pueden inhibir el reensamblaje de capsómeros en VLP. Como se analiza en más detalle a continuación, estos descubrimientos eran sorprendentes porque para un papovavirus relacionado, poliomavirus, se ha demostrado que tanto la exposición a bajos niveles de agente reductor sulfhidrilo como la quelación de iones de calcio eran esenciales para el desensamblaje del virión. Por el contrario, dichas condiciones solo son ligeramente eficaces para el desensamblaje de VLP de papiloma.

Como se indica, también se ha descubierto que las composiciones de capsómeros y VLP de papilomavirus producidas de acuerdo con la invención presentan epítopos específicos de estructura (conformacionales), en particular neutralizantes, que se encuentran en la superficie de viriones de papilomavirus intactos. Esto se ha demostrado tanto por su reactividad con anticuerpos monoclonales de papilomavirus anti-L1 neutralizantes y específicos de estructura en un ensayo de ELISA como por su capacidad para inducir la síntesis de anticuerpos que neutralicen una infección por virus papilomavirus en un ensayo de infección por RT-PCR. Por lo tanto, se adaptan bien al uso como agentes profilácticos para prevenir una infección por PV y para fines de diagnóstico. Además, los presentes métodos para desensamblaje y reensamblaje de VLP pueden aplicarse en diferentes grados de pureza de VLP. Esto permite el desensamblaje de mezclas brutas de VLP, la purificación de los componentes de VLP más pequeños y volubles (que es más sencillo debido a su tamaño enormemente disminuido) seguido del reensamblaje en la fase deseada del proceso de purificación. Además esta etapa permite la eliminación de otros virus extraños intactos.

Además, como se analiza en mayor detalle a continuación, lo métodos proporcionan además la introducción de restos deseados, por ejemplo, ADN, proteínas, péptidos, hormonas, radionúclidos, agentes anticancerosos y agentes antivirales en VLP durante el reensamblaje. Esto es ventajoso ya que pueden usarse dichas VLP como vehículos de administración (para la inserción de restos deseados en células) y como "pseudoviriones" para evaluar la eficacia profiláctica de vacunas de papilomavirus.

Los presentes inventores formulan la hipótesis de que el desensamblaje de VLP de papilomavirus requiere una exposición prolongada a niveles muy elevados de agente reductor debido a la presencia de enlaces disulfuro estabilizantes que probablemente están enterrados e inaccesibles y a que la exposición de estos enlaces a disolvente por fluctuaciones estructurales locales es muy poco frecuente. (Este fenómeno se analiza en mayor detalle en la solicitud WO 9901557, presentada el 3 de julio de 1997). Aparentemente, tras una exposición prolongada a concentraciones elevadas de agente reductor y a una fuerza iónica apropiada, es decir, de 1,0 M a 1,5 M, estos enlaces se vuelven accesibles con el tiempo.

Definiciones Proteína principal de la cápsida o proteína L1

Esta expresión se refiere a la proteína estructural de papilomavirus (PV) que constituye la porción principal de la estructura de la cápsida de PV. Se ha descrito aplicación de esta proteína en la preparación de vacunas de HPV y como un agente de diagnóstico.

Proteína secundaria de la cápsida o proteína L2

Esta expresión se refiere a la proteína estructural de papilomavirus que constituye una porción minoritaria de la estructura de la cápsida viral de PV.

Partículas similares a virus o VLP

Esta expresión se refiere a las estructuras similares a cápsidas que son el resultado de la expresión y ensamblaje de una secuencia de ADN de L1 de papilomavirus en solitario o en combinación con una secuencia de ADN de L2. Las VLP son morfológicamente y antigénicamente similares a viriones auténticos. Pueden producirse VLP in vivo en células hospedadoras adecuadas, por ejemplo, células hospedadoras de mamíferos e insectos o pueden formarse espontáneamente tras la purificación de proteínas L1 recombinantes. Además, pueden producirse usando fragmentos de L1 o formas mutadas de la misma, por ejemplo, proteínas L1 que se han modificado por adición, sustitución o deleción de uno o más aminoácidos. Los mutantes de L1 que se incluyen en el alcance de la presente invención son los que tras el reensamblaje de VLP presentan al menos un epítopo conformacional de PV nativo. Por ejemplo, esto incluye proteínas L1 que se han truncado en el último resto de glutamina conservado en el extremo carboxi-terminal. La escisión en dicho resto de glutamina eliminará, como promedio, de 30 a 40 restos aminoacídicos de la proteína L1. Pueden determinarse mutantes o fragmentos adecuados basándose en la reactividad de dichas proteínas L1 con antisuero neutralizante o su capacidad para generar un antisuero neutralizante.

Pseudovirión

Este término se refiere a VLP que contienen compuestos marcadores exógenos, compuestos por proteínas L1 o L1 y L2 o fragmentos o formas mutadas de las mismas de un tipo de PV específico. Pueden usarse pseudoviriones para ensayar la eficacia de sustancias, tales como anticuerpos, para bloquear la unión viral específica y/o la captación en células diana en casos en los que no está disponible virus auténtico.

Proteína L1 plegada correctamente

Esta expresión se refiere a proteína L1, un fragmento de la misma o una forma mutada de la misma (monomérica en forma de oligómeros pequeños (dímeros, tetrámeros) o capsómeros) que está en una conformación adecuada para el reensamblaje en VLP y que conserva epítopos presentes en cápsidas virales nativas o VLP.

Capsómeros

Este término se refiere a una configuración oligomérica de la proteína L1 que está constituida por pentámeros de L1.

Cápsidas

Este término se refiere a la porción estructural del papilomavirus que está compuesta por capsómeros. Más específicamente, está constituida por setenta y dos capsómeros en una estructura icosaédrica T = 7.

Epítopo Conformacional de L1 de HPV

Esta expresión se refiere a un epítopo expresado en la superficie de una proteína L1 correctamente plegada que también se expresa por una proteína L1 o fragmento o forma mutada de la misma, que también se expresa por una proteína L1 de un HPV infeccioso de tipo silvestre correspondiente. Es bien aceptado por los especialistas en la técnica que la presentación de epítopos conformacionales es esencial para la eficacia (tanto como agentes profilácticos como de diagnóstico) de inmunógenos de proteína L1 de HPV.

Epítopo Conformacional Neutralizante de L1 de HPV

Esta expresión se refiere a un epítopo expresado en la superficie de una proteína L1 correctamente plegada, fragmento o forma mutada de la misma que también se expresa por una proteína L1 de un HPV infeccioso de tipo silvestre correspondiente y que genera anticuerpos neutralizantes. Es bien aceptado por los especialistas en la técnica que la presentación de epítopos conformacionales neutralizantes es esencial para la eficacia (tanto como agentes profilácticos como de diagnóstico) de inmunógenos de proteína L1 de HPV.

Anticuerpo Conformacional

Esta expresión se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo expresado en una proteína L1 correctamente plegada pero no en una proteína L1 desnaturalizada.

Solución de Agente Reductor de Alta Concentración

Esta expresión se refiere a una solución que contiene una cantidad de al menos un agente reductor sulfhidrilo, por ejemplo, glutatión, \beta-mercaptoetanol, ditiotreitol, cisteína, sulfuro de hidrógeno o sal sódica o potásica del ácido 2-mercaptoetanosulfónico, que proporciona un desensamblaje de al menos el 70% de VLP de papilomavirus, cuando las VLP se ponen en contacto con el mismo durante periodos prolongados, típicamente al menos 2 horas y, de acuerdo con la invención, de al menos 16 horas. La concentración del agente reductor puede variar dependiendo del agente reductor en particular pero, de acuerdo con la invención, es de al menos el 1% en peso. En el caso de \beta-mercaptoetanol, esta cantidad será de al menos preferiblemente el 1% en peso, más preferiblemente de al menos el 3-5% en peso. En el caso de ditiotreitol, la cantidad será preferiblemente de al menos aproximadamente 100 mM.

Exposición o Contacto Prolongado de VLP con Solución de Agente Reductor de Alta Concentración

Esta expresión se refiere al tiempo que las VLP se ponen en contacto con solución de agente reductor de alta concentración que es suficiente para proporcionar un desensamblaje de al menos el 70% de VLP en capsómeros. De acuerdo con la invención, las VLP se ponen en contacto con el agente reductor durante al menos 16 horas. Preferiblemente, dicha exposición prolongada dará como resultado un desensamblaje del 70-90% y óptimamente un desensamblaje de VLP prácticamente total. Este tiempo variará para diferentes tipos de PV y también puede depender de las células en las que se expresan las VLP (material de partida), del grado de pureza (presencia o ausencia de agregados), del pH y de la fuerza iónica. Además, las VLP formadas a partir de proteína L1 mutada o químicamente alterada, por ejemplo, proteína L1 truncada C-terminalmente, pueden desensamblarse en condiciones más suaves. Generalmente, esta exposición será durante al menos 2 horas (en el caso de VLP de HPV-16_{Tr}) y, más típicamente, más prolongada, es decir, de al menos 12 horas, más preferiblemente de al menos 16 horas (en el caso de VLP de HPV-11).

Análisis de SDS/PAGE de proteína L1 de HPV-11 purificada. La proteína se mezcló con tampón de preparación de muestras en ausencia (carril 1) o presencia (carril 2) de DTT 2 mM y se llevó a ebullición durante 2 minutos antes de la electroforesis en gel.

Análisis en colchón de sacarosa al 30% del desensamblaje de VLP de HPV-11. Se trataron preparaciones de HPV-11 a 4ºC como se describe en el texto y se tomaron muestras en la parte superior (T) o inferior (B) del colchón de sacarosa antes de la electroforesis en gel. Grupo 1, material de partida de VLP de HPV-11 purificadas sin tratar en PBS. Grupo 2, VLP incubadas con \betaME al 5% durante 16 horas. Grupo 3, VLP incubadas con \betaME al 5% durante 1 hora. Grupo 4 VLP incubadas con \betaME al 2% durante 16 horas. Grupo 5, VLP incubadas con \betaME al 0,5% durante 16 horas. Grupo 6, VLP incubadas con DTT 10 mM, EDTA 5 mM durante 16 horas.

Análisis de gradiente lineal de sacarosa del 5 al 20% de VLP de HPV-11 desensambladas. Se incubaron VLP en PBS con \betaME al 5% (a) o NaHCO_{3} 200 mM, pH 9,6 (b) durante 16 horas a 4ºC y después se centrifugaron en un gradiente lineal de sacarosa del 5 al 20% como se describe en el texto. El gradiente se recogió en 25 fracciones (0,5 ml) y el sedimento (P) se resuspendió en 0,5 ml de PBS. Una inmunotransferencia demostraba la posición de la proteína L1 a través del gradiente. También se indicaban las posiciones de los picos en los que migraban los patrones de sedimentación cuando se procesaban en gradientes separados.

Figura 4: análisis de gradiente lineal de sacarosa del 10 al 65% de VLP de HPV-11 en diversos estados de ensamblaje. Una alícuota de material de partida de VLP purificadas (a) se incubó con \betaME al 5% durante 16 horas a 4ºC (b). Después, una porción de las VLP tratadas con \betaME se reensamblaron mediante diálisis en PBS-NaCl 0,5 para eliminar el agente reductor (c). Las muestras se centrifugaron después en gradientes lineales de sacarosa del 10 al 65% como se describe en el texto. Cada gradiente se recogió en 12 fracciones (1 ml) y el sedimento (P) se resuspendió en 1 ml de PBS. Las inmunotransferencias demostraban las posiciones a las que migraba la proteína L1 en los diferentes gradientes. También se indicaban las posiciones de los picos en los que migraban los patrones de sedimentación.

Micrografías de electrones de VLP de HPV-11 en diversos estados de ensamblaje. Se tiñeron VLP tratadas como se ha descrito con ácido fosfotúngstico al 2%, se aplicaron a rejillas y se fotografiaron a aumentos de 15-25.000 veces. Las micrografías mostraban material de partida de VLP purificadas, VLP desensambladas a nivel de capsómeros por incubación con \betaME al 5% durante 16 horas a 4ºC y VLP reensambladas a partir de VLP desensambladas mediante diálisis en PBS-NaCI 0,5.

Reacción de VLP intactas y desensambladas con anticuerpos monoclonales específicos de estructura de HPV-11. Material de partida de VLP de L1 de HPV-11 (A), VLP desensambladas por tratamiento con \betaME al 5% sin (B) o con (C) diálisis posterior en PBS-NaCl 0,5 M para eliminar el agente reductor y VLP desensambladas en presencia de carbonato 200 mM, pH 9,6 y después dializadas en PBS-NaCl 0,5 M (D) se unieron a los pocillos de placas de microtitulación. Se ensayaron anticuerpos monoclonales específicos de estructura de HPV-11 H11.F1 (neutralizante de HPV-11; V) y H11.A3 (no neutralizante de HPV-11; \bullet) para determinar la inmunorreactividad con los antígenos unidos una ELISA como se describe en los Materiales y Métodos. La reactividad con el anticuerpo monoclonal AU1 (\sqbullet) que reconoce un epítopo lineal que se encuentra en la L1 de HPV-11 se usó como control para demostrar la unión de antígeno a los pocillos de microtitulación.

Comparación de la capacidad de antisueros generados contra VLP de HPV-11 purificadas iniciales y VLP reensambladas para neutralizar virus HPV-11. Se incubaron sueros anti-HPV-11 con viriones de HPV-11 durante 60 min a 37ºC antes de la adición a células HaCaT. Como alternativa, se añadieron viriones a células sin preincubación con suero. Seis días post-infección las células se recogieron y se extrajo el ARN total. Se usó el diez por ciento del ARN total para una transcripción inversa y el diez por ciento del ADNc resultante se usó después como molde para una PCR anidada usando cebadores específicos para el mensaje cortado y empalmado E1^E4 de HPV-11. Se separaron productos de PCR en geles de agarosa al 2%. Los geles se tiñeron con bromuro de etidio y se examinaron bajo luz UV para determinar la presencia de la banda E1^E4 de \sim0,6 kb (a). Se realizó una amplificación por PCR de \beta-actina en todas las muestras de ADNc como control interno (b). El tamaño esperado de la banda de \beta-actina es de \sim0,6 kb. El carril S contenía marcadores de pesos moleculares. El Carril C representaba reacciones realizadas con ARN de células incubadas sin virus y el Carril V representaba células incubadas con virus que no se habían preincubado con suero. Como se esperaba, la banda E1^E4 se detectaba en células infectadas por virus pero no en células sin infectar. Los siguientes carriles contenían productos de PCR de células infectadas con virus que se habían preincubado con diluciones log_{10} seriadas de antisuero anti-HPV-11 (10^{-3}-10^{-7}) generado contra VLP de HPV-11 purificadas iniciales y VLP reensambladas.

La comparación de SDS/PAGE de VLP de HPV-16_{Tr} en los estados ensamblado (-\betaME) y desensamblado (+\betaME, Procesamiento 2) indicaba la mayor pureza de las VLP purificadas en el estado desensamblado.

Análisis de gradiente lineal de sacarosa del 5 al 20% de VLP de HPV-16_{Tr} desensambladas. Se incubaron VLP purificadas finales del Procesamiento 2 +\betaME (véase la Tabla 3) en PBS con \betaBME al 4% durante 16 horas a 4ºC y después se centrifugaron en un gradiente lineal de sacarosa del 5 al 20%, como se describe en la sección de Métodos. El gradiente se recogió en 25 fracciones (0,5 ml) y el sedimento (P) se resuspendió en 0,5 ml de PBS. Una inmunotransferencia sondada con el anticuerpo monoclonal específico de HPV-16 16-E demostraba la posición de la proteína L1 por el gradiente. También se indicaban las posiciones de los picos en los que migraban los patrones de sedimentación cuando se procesaban en gradientes separados.

Análisis de gradiente lineal de sacarosa del 10 al 65% de VLP de HPV-16_{Tr} en diversos estados de ensamblaje. Se incubó una alícuota de (a) material de partida de VLP purificadas (Procesamiento 2 +\betaME; véase la Tabla 3) con \betaME al 4% durante 16 horas a 4ºC (b). Una porción de las VLP tratadas con \betaME se reensambló después mediante diálisis en PBS-NaCl 0,5 para eliminar el agente reductor (c). Las muestras se centrifugaron después en gradientes lineales de sacarosa del 10 al 65%, como se describe en el texto. Cada gradiente se recogió en 12 fracciones (1 ml) y el sedimento (P) se resuspendió en 1 ml de PBS. Se muestran inmunotransferencias sondadas con el anticuerpo monoclonal específico de HPV-16 16-E, que demuestran las posiciones a las que migraba la proteína L1 en los diferentes gradientes. También se indicaban las posiciones de los picos en los que migraban los patrones de sedimentación, como en la Figura 9.

\vskip1.000000\baselineskip

Descripción detallada de la invención

Como se ha analizado, la presente invención se refiere generalmente a un nuevo método que proporciona un desensamblaje altamente eficaz de VLP de papilomavirus, es decir, un desensamblaje de al menos el 70%, más preferiblemente un desensamblaje del 70-90%, y más preferiblemente, un desensamblaje total de VLP que comprende una exposición prolongada de VLP de papilomavirus compuestas por L1, fragmentos de L1 o proteínas L1 mutadas o una combinación de fragmentos de proteínas L1 o formas mutadas de las mismas y proteínas L2, fragmentos o formas mutadas de las mismas a una solución de agente reductor sulfhidrilo a alta concentración. De acuerdo con la invención, la concentración del agente reductor será de al menos el 1% en peso, y más preferiblemente, de aproximadamente el 3-5% en peso. Además, la solución que contiene agente reductor tendrá una fuerza iónica que es de 1,0 M a
1,5 M.

Sin embargo, las concentraciones de agente reductor y la fuerza iónica pueden variar para diferentes tipos de papilomavirus, las células hospedadoras de las que se obtienen, formas mutadas y/o químicamente alteradas de la proteína L1 y pureza. Más específicamente, los presentes inventores han dilucidado condiciones para un desensamblaje máximo de VLP purificadas in vitro que proporciona un reensamblaje posterior eficaz. Se ha descubierto que la incubación prolongada de VLP de papilomavirus con concentraciones relativamente altas de agentes reductores a fuerzas iónicas que son como máximo de 1,5, genera capsómeros solubles homogéneos a partir de VLP purificadas. Además, se ha descubierto que tras la eliminación o, como alternativa, por oxidación del agente reductor, se obtiene una población definida de VLP intactas de un tamaño apropiado.

Esto se ha demostrado en particular usando VLP de HPV-11 producidas en un sistema de baculovirus/célula insecto, es decir, en células de Trichoplasia ni (High Five®) infectadas con un baculovirus recombinante que contiene la secuencia de ADN completa de L1 de HPV-11. Sin embargo, basándose en estos resultados, es razonable concluir que se conseguirán resultados similares usando VLP de papilomavirus producidas a partir de otros tipos y especies, en particular, otros tipos de papilomavirus humanos. Esto es razonable ya que se ha demostrado que numerosas proteínas L1 de papilomavirus dan como resultado VLP cuando se expresan en sistemas de vectores de expresión recombinantes adecuados. Además, dichos resultados pueden conseguirse usando fragmentos de L1, por ejemplo, deleciones carboxi-terminales y formas mutadas de L1.

Asimismo, es razonable esperar que se conseguirán resultados similares usando VLP de papilomavirus compuestas por una combinación de proteínas L1 y L2 o fragmentos o formas mutadas de las mismas, ya que las VLP compuestos por L1 o L2 parecen prácticamente idénticas a VLP compuestas solamente por proteínas L1. [Sin embargo, suponiendo que L2 tiene un papel estabilizante significativo, los presentes inventores reconocen que el desensamblaje puede requerir el uso de mayores concentraciones de agente reductor, una exposición más prolongada al mismo, un pH elevado y/o una fuerza iónica reducida durante el desensamblaje.] Además, se espera que los presentes métodos serán adecuados para el desensamblaje/ensamblaje de VLP obtenidas de cualquier sistema celular hospedador que dé como resultado la producción de VLP de papilomavirus. Aunque los Solicitantes reconocen que existen algunas diferencias de células hospedadoras, como se ha analizado anteriormente, se ha descrito que muchas células hospedadoras expresan VLP de papilomavirus en forma de VLP.

En general, el material de partida de VLP deseado se producirá en un sistema celular hospedador adecuado, por ejemplo, un sistema de baculovirus/célula de insecto, y se extraerá del mismo usando métodos conocidos. La técnica de extracción dependerá de factores tales como las células hospedadoras específicas usadas, la concentración, si la proteína permanece intracelular o se secreta, entre otros factores.

El desensamblaje de las VLP puede realizarse a diferentes niveles de pureza de VLP. Cuando se realiza junto con purificación, se extraerán las VLP de células, se desensamblarán, se purificarán mediante técnicas convencionales y se reensamblarán en el grado de pureza deseado. En los casos en los que se usarán VLP para empaquetar compuestos exógenos o cuando se realice el desensamblaje/reensamblaje para mejorar la homogeneidad del producto final, las VLP usadas serán de una pureza bastante elevada. En este caso, las VLP usadas para el desensamblaje serán preferiblemente de una pureza de proteína de aproximadamente el 10-70%, más preferiblemente de una pureza de proteína de aproximadamente el 10-50% y, más preferiblemente, de una pureza de proteína de aproximadamente el 30-40%. Se conocen métodos para determinar la pureza de VLP e incluyen métodos densitométricos de SDS-PAGE.

Como se analiza en detalle a continuación en la sección de materiales y métodos, los presentes inventores desarrollaron un ensayo de exploración rápida para el estudio del desensamblaje de VLP que usa un gradiente de fases de sacarosa. En este sistema, las VLP intactas se sedimentan a través de un colchón de sacarosa al 30%, mientras que los capsómeros no agregados, oligómeros de L1 de menor tamaño o monómeros de L1 permanecen en la parte superior del colchón. Por lo tanto, este método de ensayo es beneficioso ya que facilita la identificación exacta de las condiciones que dan como resultado un desensamblaje máximo de VLP.

En general, se descubrió que el desensamblaje máximo de VLP requiere una exposición prolongada de VLP no agregadas a una solución que contiene una alta concentración de agente reductor sulfhidrilo. De acuerdo con la invención, la VLP se pone en contacto con el agente reductor durante al menos 16 horas. Como se ha explicado previamente, una exposición prolongada es la duración suficiente para dar como resultado un desensamblaje de al menos el 70% de las VLP, más preferiblemente un desensamblaje de VLP del 70-90% e idealmente un desensamblaje prácticamente total de VLP. En el caso de VLP de L1 de HPV-11 recombinantes producidas en el sistema de células de insecto ejemplificado, el desensamblaje máximo se producía después de aproximadamente 16 horas a 4ºC (usando una solución que contiene el 5% en peso de \beta-mercaptoetanol). Sin embargo, dichos tiempos de exposición pueden reducirse potencialmente usando otros materiales de partida de VLP, diferentes condiciones de pH, mayores concentraciones de agente reductor y menores fuerzas iónicas. Por ejemplo, se ha descubierto [no se muestran los resultados] que el desensamblaje sustancial de VLP formadas por una forma truncada C-terminalmente de la proteína L1 de HPV-16 puede efectuarse por exposición de dichas VLP con una solución de \beta-mercaptoetanol (4%) después de aproximadamente 2 horas a 4ºC. Como se ha indicado anteriormente, de acuerdo con la invención, las fuerzas iónicas para el desensamblaje son de 1,0 M a 1,5 M.

Se ha demostrado que el presente método de desensamblaje de VLP es eficaz usando \beta-mercaptoetanol y ditiotreitol como los agentes reductores. Sin embargo, se espera que otros agentes reductores conocidos proporcionarían resultados similares. Los ejemplos de agentes reductores adecuados útiles en la invención incluyen glutatión, \beta-mercaptoetanol, ditiotreitol, ditioeritritol, cisteína, sulfuro de hidrógeno, sales de 2-mercaptoetanosulfonato y mezclas de los mismos.

Como se indica, el presente método pone en contacto VLP con una solución que tiene una alta concentración de agente reductor sulfhidrilo. En este documento, se define que ésta es una concentración de agente reductor que da como resultado un desensamblaje sustancial de VLP, es decir, un desensamblaje de VLP de al menos el 70%, preferiblemente de al menos el 70-90% y, más preferiblemente, prácticamente total después de una exposición prolongada.

Estas altas concentraciones de agente reductor variarán dependiendo de los agentes o combinaciones reductoras particulares. En el caso de \beta-mercaptoetanol, se ha descubierto que una concentración de al menos aproximadamente el 5% en peso (713 mM) da como resultado un desensamblaje óptimo de VLP de L1 de HPV-11 a fuerza iónica fisiológica. Concentraciones inferiores de agente reductor y periodos de exposición reducidos dan como resultado un desensamblaje de VLP menos eficaz. Por ejemplo, se ha descubierto que soluciones de \beta-mercaptoetanol al 4% también proporcionan un desensamblaje eficaz (de al menos el 70%).

También se ha descubierto que la fuerza iónica es un parámetro importante en el método de desensamblaje. De acuerdo con la invención, se efectuará el desensamblaje usando una solución que tiene una fuerza iónica de 1,0 M a 1,5 M. Las sales adecuadas para obtener soluciones que tienen dicha fuerza iónica incluyen NaCl, KCl y NH_{4}. Se ha descubierto que fuerzas iónicas mayores hacen que el método de desensamblaje de VLP sea menos eficaz.

También se descubrió que la presencia de agregación de VLP tenía efectos adversos sobre el desensamblaje. Este efecto puede evitarse por eliminación de material agregado o puede evitarse potencialmente mediante una exposición más prolongada de las VLP a la solución de agente reductor de alta concentración. Esto ocurre probablemente debido a que los enlaces disulfuro están enterrados y, por lo tanto inaccesibles para el agente reductor, en agregados, impidiendo de este modo el desensamblaje.

También, como se ha analizado, se ha descubierto sorprendentemente que los quelantes, incluso a altas concentraciones, no tienen un efecto significativo sobre el desensamblaje de VLP de HPV-11. Esto se mostró usando tanto EGTA como EDTA, ambos quelantes bien conocidos, en solitario o en combinación con ditiotreitol. Como se ha analizado anteriormente, esto es sorprendente ya que se ha describo que los agentes quelantes son necesarios en el desensamblaje de VLP para un papovavirus relacionado.

Además, se ha descubierto que el tampón carbonato (NaHCO_{3} 0,2 M, pH 9,6) causaba un desensamblaje significativo de VLP de HPV-11. Sin embargo, a diferencia del desensamblaje inducido por una exposición prolongada a agentes reductores sulfhidrilo, no era posible reensamblar las VLP tratadas con carbonato. Se formuló la hipótesis de que el tratamiento con carbonato desnaturalizaba parcialmente la proteína L1. Esto demuestra que sólo los métodos (tales como una exposición prolongada a concentraciones eficaces de agentes reductores sulfhidrilo) que desensamblan VLP, al tiempo que conservan la estructura proteica de L1 plegada correctamente, producirán material que sea competente para reensamblarse en VLP solubles de tamaño completo.

Como se indica, el presente desensamblaje de VLP de PV da como resultado capsómeros de alta homogeneidad que presentan epítopos conformacionales neutralizantes como se demuestra por su reactividad con anticuerpos monoclonales conformacionales y neutralizantes producidos contra el papilomavirus particular (HPV-11 ejemplificado). Además, en condiciones óptimas, el presente método da como resultado en una composición en la que las VLP parecen estar totalmente degradadas en capsómeros. Por el contrario, el presente desensamblaje de VLP de HPV-16_{Tr} parece dar como resultado una mezcla de capsómeros, oligómeros de L1 de menor tamaño y monómeros de L1. Sin embargo, esta mezcla de oligómeros de L1 también es capaz de un reensamblaje cuantitativo. Esto indica que el presente método produce proteína L1 correctamente plegada o fragmentos o formas mutadas de la misma en forma de capsómeros, oligómeros de L1 de menor tamaño o monómeros de L1 que son competentes para el reensamblaje de VLP.

Como se ha analizado, una ventaja particular de la invención es que dichos capsómeros, oligómeros o monómeros pueden ensamblarse después cuantitativamente en VLP simplemente por eliminación de la solución de agente reductor. La eliminación de agente reductor puede conseguirse mediante diversos métodos, por ejemplo, diálisis o cromatografía en columna. Como alternativa, la adición de oxidantes en exceso puede promover potencialmente la reformación de los enlaces disulfuro apropiados, conduciendo a un reensamblaje de VLP. Como se ha analizado anteriormente, el reensamblaje se afecta por la integridad estructural del material de partida de proteína L1 correctamente plegada. Además, la solubilidad del material de partida afecta al reensamblaje, ya que el material agregado no se reensamblará cuantitativamente.

El reensamblaje se efectúa por eliminación del agente reductor sulfhidrilo o adición de oxidantes y exposición de material de partida de proteína L1 correctamente plegada a condiciones de fuerza iónica superiores equivalentes, por ejemplo, de 0,15 a 1,5. Las concentraciones salinas superiores funcionan estabilizando las VLP. Sin embargo, la adición de agentes quelantes tiene el efecto opuesto, es decir, inhibe moderadamente el reensamblaje.

Sorprendentemente, dicho reensamblaje da como resultado VLP que son mucho más homogéneas en el tamaño de partícula que el material de partida de VLP original. Esto se demostró por comparación del material de VLP de partida y el producto de VLP reensambladas en gradientes lineales de sacarosa del 10 al 65% y por examen bajo el microscopio electrónico. Predominantemente, se detectaron partículas en el intervalo de VLP de tamaño completo, con un promedio de 56,5 \pm 7,0 nm con muy pocas VLP parcialmente ensambladas o complejos de menor tamaño aparentes. Además, los rendimientos son muy elevados, con un promedio de aproximadamente el 80-90% en términos de proporción de proteína L1 total de material de partida respecto a VLP reensambladas usando condiciones óptimas de reensamblaje. Esencialmente, todo el material de partida desensamblado parece volver a formar VLP solubles y filtrables de tamaño completo. Además, estas VLP presentan epítopos conformacionales neutralizantes que se encuentran en la superficie de viriones de papilomavirus auténticos y generan anticuerpos neutralizantes tan potentemente como el material de partida de VLP.

Aunque estos resultados son nuevos e inesperados, no obstante se espera, basándose en los contenidos de la solicitud, que un especialista en la técnica pueda conseguir rendimientos de VLP incluso superiores variando las concentraciones de proteína, pH, fuerza iónica y/o cinética.

La presente descripción proporciona además métodos para producir VLP de papilomavirus que tienen encapsulado en las mismas un resto o restos deseados. Esto se conseguirá generalmente mediante las siguientes etapas:

(i)

obtener VLP de un papilomavirus deseado, que estén constituidas por L1, o fragmentos de L1 o formas mutadas de L1 o una combinación de proteínas L1 y L2;

(ii)

desensamblar dichas VLP por contacto de dichas VLP con una solución que contiene una alta concentración de agente reductor sulfhidrilo que tiene una purificación de fuerza iónica apropiada que es como máximo de 1,5;

(iii)

poner en contacto la VLP desensamblada con una solución que contenía un resto a encapsular en la misma y, opcionalmente, que contiene también proteína L2 purificada (por ejemplo, si las VLP desensambladas no comprendían proteína L2); y

(iv)

reensamblar dichas VLP desensambladas por eliminación del agente reductor sulfhidrilo o por adición de oxidante en exceso a una fuerza iónica apropiada, típicamente de 0,15 a 1,5 M, produciendo de este modo VLP que contienen el resto o restos deseados.

Las etapas de desensamblaje y reensamblaje se realizan como se ha descrito anteriormente, es decir, el desensamblaje se efectúa por uso de altas concentraciones de agentes reductores sulfhidrilo, típicamente de al menos el 1% en peso, o superiores, y durante periodos prolongados, es decir, al menos 2 horas, y típicamente durante más tiempo, por ejemplo, al menos 16 horas. Como se ha analizado, el tiempo de exposición y la concentración de agente reductor se afectan por el tipo de VLP de papilomavirus, el sistema celular hospedador en el que se producen, mutaciones dentro de la proteína L1 (por ejemplo, truncamientos C-terminales), nivel de pureza, si están presentes agregados y potencialmente, si las VLP están compuestos por L1, fragmentos de L1 o formas mutadas de las mismas o una combinación de L1 y L2. El reensamblaje se produce tras la eliminación u oxidación del agente reductor sulfhidrilo.

Aunque es razonable suponer que las VLP compuestas por L1 y L2 se desensamblarán en condiciones similares que las VLP basadas en L1, la proteína L2 puede cumplir una función estabilizante. Por lo tanto, el desensamblaje de VLP compuestas por L1 y L2 puede requerir potencialmente concentraciones superiores de agente reductor, una exposición más prolongada al mismo, una fuerza iónica reducida, un pH elevado o una combinación de los mismos. Como alternativa, las VLP constituidas totalmente por proteínas L1 de PV pueden desensamblarse como se muestra en este documento y la proteína L2 purificada (producida por métodos recombinantes) puede añadirse durante la etapa de reensamblaje.

Los restos que pueden encapsularse en las VLP incluyen restos terapéuticos y de diagnóstico, por ejemplo, secuencias de ácido nucleico, radionúclidos, hormonas, péptidos, agentes antivirales, agentes antitumorales, agentes modulares del crecimiento celular, inhibidores del crecimiento celular, citoquinas, antígenos, toxinas, etc.

Las presentes VLP que contienen un resto deseado encapsulado en las mismas, tras la administración a un hospedador deseado, preferiblemente un ser humano, deberían captarse por células normalmente infectadas por el papilomavirus particular, por ejemplo, células epiteliales, queratinocitos, etc., proporcionando de este modo la internalización potencial de dicho resto encapsulado en estas células. Esto puede facilitar el uso de las presentes VLP para terapia (al contrario que los agentes profilácticos) ya que permite la administración de un agente terapéutico en un sitio celular deseado, por ejemplo, un sitio de cáncer cervical. Dada la exigencia de los PV en general, esto puede proporcionar un medio altamente selectivo de administración de restos deseados a células diana. Por ejemplo, puede proporcionar un medio de administración de secuencias de ácido nucleico, por ejemplo, un ADN que codifica un polipéptido terapéutico o una secuencia antisentido.

El resto o restos encapsulados, por supuesto, no deberían afectar desfavorablemente al ensamblaje y/o la estabilidad de las VLP. Esto puede determinarse produciendo VLP que contengan el resto deseado y evaluando sus efectos, si los tiene, sobre ensamblaje y/o la estabilidad de VLP.

En el caso de ADN o ARN, la secuencia de ácido nucleico encapsulada puede ser de hasta 8 kilobases, el tamaño del genoma de PV. Sin embargo, típicamente las secuencias encapsuladas serán de menor tamaño, por ejemplo, del orden de 1-2 kilobases. Típicamente, estos ADN codificarán un polipéptido deseado, por ejemplo, un polipéptido terapéutico, tal como una enzima, hormona, factor de crecimiento, etc. Esta secuencia estará además unida operativamente a secuencias que faciliten la expresión de la misma en las células hospedadoras diana.

Otra aplicación de VLP que contienen ADN encapsulados es como "pseudoviriones". A este respecto, numerosos papilomavirus, incluyendo los implicados en enfermedades humanas, son poco frecuentes, no pueden propagarse fácilmente in vitro y no pueden purificarse fácilmente a partir de fuentes celulares humanas en cantidades que faciliten el uso de los mismos en ensayos de neutralización de anticuerpos. Esto es problemático ya que impide o hace difícil evaluar la fiabilidad de vacunas o agentes terapéuticos para determinar su protección contra estos virus HPV específicos. Los ejemplos de de tipos de HPV para los que actualmente no hay reservas disponibles incluyen HPV 33 y 35.

La presente debería evitar o al menos reducir dichos problemas. Esencialmente, se construirán "pseudoviriones" que se corresponden con estos virus que comprenden VLP que están constituidas por L1, fragmentos de L1, formas mutadas de L1, o una combinación de proteínas L1 y L2 del PV particular, y se encapsulará además en los mismos parte del genoma de dicho papilomavirus o un ADN que codifique un marcador de selección.

Este pseudovirión se usará en un ensayo de "infectividad" celular in vitro para evaluar la eficacia de las vacunas de VLP correspondientes. Esencialmente, esto se efectuará poniendo en contacto las células con dichos pseudovirones. Estos pseudoviriones deberían unirse a dichas células y proporcionar la inserción de dicho ADN. Después de eso, puede evaluarse la inserción de dicho ADN mediante métodos conocidos, por ejemplo, métodos de hibridación por PCR o basados en la expresión del marcador de selección, por ejemplo, \beta-galactosidasa.

Esto se efectuará tanto en presencia como en ausencia de anticuerpos generados contra proteínas L1 o L2 específicas para el HPV particular. Si se inhibe la inserción, como se determina, por ejemplo, basándose en una expresión reducida del marcador de selección, esto es un indicio de que la proteína L1 o L2 causaba la producción de anticuerpos neutralizantes de virus.

La presente invención es aplicable para producir VLP para cualquier papilomavirus y, en particular, cualquier papilomavirus humano. Se han descrito muchos ADN de L1 y L2 de HPV en la bibliografía y están públicamente disponibles (véase, por ejemplo, Baker, Sequence Analysis of Papillomavirus, Genomes, págs. 321-384; Long et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.437.931, Cole et al, J. Mol Biol., 193: 599-608 (1987); Danos et al, EMBO J., 1: 231-236 (1982); Cole et al, J. Virol., 38 (3): 991-995 (1986)). Además, es bien sabido que los ADN de L1 de HPV presentan una homología significativa. Por lo tanto, puede obtenerse fácilmente un ADN de L1 de HPV deseado, por ejemplo, mediante el uso de un ADN de L1 de HPV descrito anteriormente o un fragmento del mismo como una sonda de hibridación o como un cebador durante la amplificación por reacción en cadena de polimerización (PCR). De hecho, se han clonado y expresado numerosos ADN de L1 de HPV.

Preferiblemente, dicho ADN de L1 de HPV en la presente invención procederá de un HPV que esté implicado en cáncer o condilomas acuminados, por ejemplo, HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-56 y HPV-58 están implicados en cáncer y HPV-6, HPV-11, HPV-30, HPV-42, HPV-43, HPV-44, HPV-54, HPV-55 y HPV-70 están implicados en verrugas. Sin embargo, las presentes VLP homogéneas pueden producirse a partir de cualquier ADN de L1 de HPV deseado.

En general, la L1, fragmento de L1 o proteína L1 mutante de HPV seleccionada y, opcionalmente, secuencias de L2 se expresarán en un sistema celular hospedador recombinante deseado y se usarán para producir VLP de HPV para el desensamblaje.

El hospedador seleccionado y el vector de expresión se cultivarán en condiciones que favorezcan la producción de VLP. Esto dependerá en gran medida del sistema hospedador seleccionado y de las secuencias reguladoras contenidas en el vector, por ejemplo, de si la expresión requiere inducción. Después de la expresión, las VLP de HPV se extraerán de las células hospedadoras. Los medios de extracción también dependerán en cierta medida del sistema hospedador/vector.

Por ejemplo, si se selecciona un vector de expresión intracelular, las células hospedadoras deberán lisarse y las VLP de HPV recuperarse del listado. Por el contrario, si el vector de expresión contiene secuencias que facilitan la secreción, las VLP de HPV pueden recuperarse directamente del medio de cultivo. Se conocen bien en la técnica métodos para la recuperación de proteínas heterólogas a partir de células hospedadoras recombinantes y medio de cultivo.

Pueden expresarse secuencias de L1 de HPV en cualquier célula hospedadora que proporcionan la expresión de rendimientos recuperables de VLP de HPV. Se conocen bien sistemas hospedadores adecuados para la expresión de proteínas recombinantes e incluyen, a modo de ejemplo, bacterias, células de mamífero, levaduras y células de insecto. Un sistema de expresión preferido comprende el sistema de baculovirus/célula de insecto usado en los ejemplos, ya que este sistema proporciona altos rendimientos de proteína. Sin embargo, pueden reproducirse proteínas L1 y L2 de HPV en otros sistemas, en particular bacterias y levaduras.

Se conocen bien en la técnica y están disponibles en el mercado vectores adecuados para clonación y expresión de las presentes secuencias de ADN que codifican L1 de HPV, fragmentos o mutantes de la misma. Además, también se conocen bien secuencias reguladoras adecuadas para lograr la clonación y expresión, por ejemplo, promotores, secuencias de poliadenilación, potenciadores y marcadores de selección. La selección de secuencias apropiadas para obtener rendimientos de proteína recuperables es rutinaria para un especialista en la técnica.

Se ha descrito aplicación de VLP en vacunas profilácticas y agentes de diagnóstico de HPV. También pueden ser útiles capsómeros producidos por desensamblaje, ya que se ha descubierto que presentan epítopos conformacionales neutralizantes e inducen anticuerpos neutralizantes. Las presentes VLP pueden ser ventajosas para ello debido a su homogeneidad aumentada y, potencialmente, a su estabilidad.

Como se ha analizado, la presente invención debería ser en general aplicable a cualquier secuencia de L1 de HPV, fragmento o forma mutada de la misma, que tras la expresión genere epítopos conformacionales. Existe una diversidad de tipos de HPV conocidos en la técnica. Además, tipos particulares de HPV se asocian con infecciones particulares, tales como verrugas planas, verrugas cutáneas, epidermodisplasia verrucirformis, lesiones y cáncer cervical. Se han identificado más de 60 tipos de HPV diferentes en lesiones clínicas mediante estudios de homología de la secuencia de nucleótidos viral. Véase, por ejemplo, Jenson et al, en: Belshe, R. ed., Textbook of human virology, Segunda Edición, MASS: PSG, 1989: 951 y Kremsdorf et al, Virol., 52: 1013-1018 (1984). El tipo de HPV determina, en parte, el sitio de infección, las características patológicas y el aspecto clínico, así como la evolución clínica de la lesión respectiva.

Debido a que se piensa de que existe escasa o ninguna inmunidad cruzada para los tipos de HPV y que la inmunidad a una infección es específica de tipo de HPV, será necesario producir VLP de HPV recombinantes para cada tipo de HPV específico para el que sea necesaria protección o tratamiento. Sin embargo, debido a la homología entre las proteínas y genes de L1, pueden utilizarse técnicas de hibridación para aislar el gen de L1 de interés particular. Pueden utilizarse sondas de nucleótidos seleccionadas de regiones de la proteína L1 que se ha demostrado que muestran homología de secuencia para aislar otros genes de L1. Se conocen en la técnica métodos para hibridación (véase, por ejemplo, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D. C. (1985); Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Maniatis et al, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor, NY (1982); y Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook et al, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Segunda Edición, Cold Spring Harbor, NY (1989)). Como alternativa, pueden utilizarse métodos de PCR para amplificar genes o fragmentos de genes de L1 (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 4.683.195; 4.683.202; y 4.800.159).

También pueden aislarse partículas de virus para un tipo de papilomavirus particular, clonarse el ADN y aislarse las secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas de L1. Se han descrito métodos para el aislamiento de partículas virales y la clonación de ADN virales (véase, por ejemplo, Heilman et al, J. Virology, 36: 395-407 (1980); Beaudenon et al, Nature, 321: 246-249 (1986); Georges et al, J. Virology. 51:530-538 (1984); Kremsdorf et al, J. Virology, 52: 1013-1018 (1984); Clad et al, Virology, 118: 254-259 (1982); DeVilliers et al. J. Virology, 40: 932-935 (1981); y Solicitud de Patente Europea 0.133.123).

Como alternativa, puede aislarse la proteína L1 para un papilomavirus humano particular, determinarse la secuencia de aminoácidos y construirse sondas de ácido nucleico basadas en la secuencia de ADN predicha. Dichas sondas pueden utilizarse para aislar el gen de L1 de una genoteca de ADN de papilomavirus (véase, por ejemplo, Suggs et al, PNAS, 78 (11): 6613-6617 (1981) y Young y Davis, PNAS, 80: 1194 (1983)).

Como se ha analizado, la formación de VLP es algo sensible al tipo celular en el que se efectúa la expresión: por lo tanto, es ventajoso seleccionar sistemas que produzcan grandes cantidades de VLP como el material de partida para el desensamblaje de VLP. En general, el sistema de expresión comprenderá un vector que tiene la proteína L1 de interés y las regiones reguladoras apropiadas, así como una célula hospedadora adecuada.

Los vectores de baculovirus son un sistema vector preferido. El sistema de baculovirus ofrece la ventaja de que puede inducirse que un gran porcentaje de células exprese proteína debido al uso de infección en lugar de técnicas de transfección. Aunque el baculovirus es un virus de insecto y crece en células de insecto (Sf9), estas células contienen muchos de los mecanismos eucariotas para procesamiento de proteínas, incluyendo glicosilación y fosforilación, que pueden ser importantes para generar proteínas de una conformación apropiada. Se conocen en la técnica sistemas de vectores de baculovirus (véase, por ejemplo, Summers y Smith. Texas Agricultural Experimental Bulletin, Nº 1555 (1987); Smith et al, Mol. Cell Biol., 3: 2156-2165 (1985); Posse, Virus Research, 5: 4359 (1986); y Matsuura, J. Gen. Virol., 68: 1233-1259 (1987)). Además, se ha descrito que las células infectadas por baculovirus expresan proteínas L1 de HPV que presentan la conformación apropiada.

Para la expresión en un sistema de expresión apropiado, un gen de L1, fragmento o gen de L1 modificado se une operativamente en un vector de expresión y se introduce en una célula hospedadora para permitir la expresión de la proteína L1 por esa célula. El gen con las regiones reguladoras apropiadas se proporcionará en la orientación y fase de lectura apropiadas para permitir la expresión. Se conocen en la técnica métodos para la construcción de genes (véase, en particular, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Segunda Edición, Cold Spring Harbor, NY (1989)), y las referencias citadas en el mismo.

Pueden emplearse una amplia diversidad de secuencias transcripcionales y reguladoras. Las señales pueden proceder de fuentes virales, en las que las secuencias reguladoras se asocian con un gen particular que tiene un alto nivel de expresión. Es decir, se utilizarán promotores fuertes, por ejemplo, de fuentes virales o de mamíferos. De esta forma, las condiciones óptimas para realizar la invención incluyen la clonación del gen de L1 en un vector de expresión que sobreexpresará epítopos neutralizantes de virus conformacionalmente dependientes de la proteína L1 en células diana transfectadas o infectadas.

La idoneidad de las VLP de HPV producidas de acuerdo con la invención como vacunas o como agentes de diagnóstico se confirma por reacción con anticuerpos o anticuerpos monoclonales que reaccionan o reconocen epítopos conformacionales presentes en el virión intacto y basándose en su capacidad para provocar la reducción de antisuero neutralizante. Los especialistas en la técnica conocen ensayos adecuados que determinan si se producen anticuerpos neutralizantes. Esta es una característica esencial de VLP de HPV que se van a usar en vacunas de HPV. De esta forma, puede verificarse si las VLP de HPV desencadenarán la producción de anticuerpos neutralizantes anti-HPV. Por lo tanto, pueden ensayarse otros vectores de expresión y sistemas de expresión para el uso en la invención.

Como se ha analizado, las VLP de la presente descripción pueden utilizarse para detectar, diagnosticar, serotipar y tratar una infección por papilomavirus. Cuando se usan para diagnóstico o serotipado, las VLP pueden marcarse usando cualquiera de una diversidad de marcadores y métodos de marcaje. Los ejemplos de tipos de marcadores que pueden usarse incluyen, pero sin limitación, marcadores enzimáticos, marcadores radioisotópicos, marcadores isotópicos no radiactivos, marcadores fluorescentes, marcadores de toxinas y marcadores quimioluminiscentes.

Los ejemplos de marcadores enzimáticos adecuados incluyen malato hidrogenasa, nucleasa estafilocócica, delta-5-esteroide isomerasa, alcohol deshidrogenasa de levaduras, alfa-glicerol fosfato deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, peroxidasa, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa, acetilcolinesterasa, etc.

Los ejemplos de marcadores radioisotópicos adecuados incluyen ^{3}H, ^{125}I, ^{131}I, ^{32}P, ^{35}S, ^{14}C, ^{51}Cr, ^{57}To, ^{58}Co, ^{59}Fe, ^{75}Se, ^{152}Eu,Y, ^{67}Cu, ^{211}At, ^{212}Pb, ^{47}Sc y ^{109}Pd.

Los ejemplos de marcadores presentes adecuados incluyen un marcador ^{152}Eu, un marcador de fluoresceína; un marcador de isotiocianato; un marcador de rodamina, un marcador de ficoeritrina, un marcado de ficocianina, un marcador de aloficociania, un marcador de o-ftaldehído, un marcador de fluorescamina, etc.

Los ejemplos de marcadores de toxinas adecuados incluyen toxina diftérica, ricina y toxina del cólera. Los ejemplos de marcadores quimioluminiscentes incluyen un marcador de luminal, un marcador de isoluminal, un marcador de éster de acridinio aromático, un marcador de imizadol y un marcador de sal de acridinio, un marcador de éster de oxalato, un marcador de luciferina, un marcador de luciferasa, un marcador de aecuorina, etc.

Los especialistas en la técnica conocerán otros marcadores adecuados que pueden emplearse. La unión de estos marcadores a VLP puede conseguirse usando técnicas convencionales comúnmente conocidas por los especialistas en la técnica. Se describen técnicas típicas por Kennedy et al, Clin. Chim. Acta, 70: 1-31 (1976) y Schurs et al, Clin. Chim. Acta, 81: 1-40 (1977). Son técnicas de acoplamiento mencionadas en este último, el método de glutaraldehído, el método de periodato, el método de dimaleimida, el método de éster de m-maleimidobencil-N-hidroxi-succinimida.

La detección de los anticuerpos anti-HPV usando las presentes VLP puede mejorarse mediante el uso de soportes. Los soportes bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza del transportador puede ser soluble en cierto grado o insoluble para los fines de la presente invención. Los especialistas en la técnica indicarán muchos otros soportes adecuados para unir proteínas o serán capaces de determinarlos mediante el uso de una experimentación de rutina.

El aspecto más importante de la presente invención, sin embargo, implica el desarrollo de vacunas de PV. Las vacunas contendrán una cantidad de las presentes VLP de HPV suficiente para inducir la formación de anticuerpos neutralizantes en el hospedador contenida en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La administración de las presentes vacunas que contienen VLP puede efectuarse por cualquier medio farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, por vía parenteral, local o sistémica incluyendo, a modo de ejemplo, administración oral, intranasal, intravenosa, intramuscular y tópica. La forma de administración depende de factores incluyendo la vía natural de infección. La dosificación administrada dependerá de factores incluyendo la edad, salud, peso, clase de tratamiento simultáneo, si existe, y de la naturaleza y del tipo de papilomavirus humano particular. La vacuna puede emplearse en formas de dosificación tales como cápsulas, soluciones líquidas, suspensiones o elixires para administración oral o formulaciones líquidas estériles tales como soluciones o suspensiones para uso parenteral o intranasal. Se usa preferiblemente un vehículo inerte inmunológicamente aceptable, tal como solución salina o solución salina tamponada con fosfato.

Las vacunas se administrarán en cantidades terapéuticamente eficaces. Es decir, en cantidades suficientes para producir una respuesta inmunológica protectora. Generalmente, las vacunas se administrarán en dosificaciones que varían de aproximadamente 0,1 mg de proteína a aproximadamente 20 mg de proteína, más generalmente de aproximadamente 0,001 mg a aproximadamente 100 mg de proteína. Pueden administrarse dosificaciones individuales o múltiples.

El método de la presente descripción hace posible la preparación de vacunas que contienen VLP de HPV para prevenir una infección por papilomavirus. Además, siguiendo los métodos de la descripción, pueden generarse vacunas para cualquiera de los papilomavirus específicos humanos.

Como más de un tipo de PV puede asociarse con infecciones por PV, las vacunas pueden comprender VLP de HPV estables procedentes de más de un tipo de PV. Por ejemplo, puesto que el HPV 16 y 18 se asocian con carcinomas cervicales, por lo tanto, una vacuna para neoplasia cervical puede comprender VLP de HPV 16; de HPV 18; o tanto de HPV 16 como 18.

De hecho, se sabe que una diversidad de neoplasias están asociadas con infecciones por PV. Por ejemplo, los HPV 3a y 10 se han asociado con verrugas planas. Se ha descrito que varios tipos de HPV están asociados con epidermodisplasia verruciformis (EV) incluyendo HPV 3a, 5, 8, 9, 10 y 12. Se ha descrito que los HPV 1, 2, 4 y 7 están asociados con verrugas cutáneas y los HPV 6b, 11a, 13 y 16 se asocian con lesiones de las membranas mucosas (véase, por ejemplo, Kremsdorf et al, J. Virol, 52: 1013-1018 (1984); Beaudenon et al, Nature, 321: 246-259 (1986); Heilman et al, J. Virol, 36: 395-407 (1980); y DeVilliers et al, J. Virol., 40: 932-935 (1981)). Por lo tanto, la presente formulación de vacuna puede comprender una mezcla de VLP reensambladas obtenidas de diferentes tipos de HPV dependiendo de la protección deseada.

Como se indica, las VLP de HPV de la descripción también pueden utilizarse para serotipado y para la incorporación en kits de serotipado.

Para el ensayo serológico, los kits comprenderán las presentes VLP de HPV y medios para la detección de dichos sustratos enzimáticos, anticuerpo marcado y similares.

Habiéndose descrito ahora la invención en general, los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no pretenden ser limitantes a menos que se especifique otra cosa.

Ejemplos

Se usaron los siguientes materiales y métodos en los Ejemplos.

Materiales y Métodos VLP de HPV-11

Para el uso en estudios de desensamblaje y reensamblaje de VLP usando proteína pura, se expresaron de forma heteróloga proteínas L1 de HPV-11 en células Trichoplusia ni (High Five®) con baculovirus recombinante que codifica la fase lectura abierta completa de L1 cadena abajo del promotor de polihedrina como se describe (Ghim et al, en M. A. Stanley (ed.) Immunology of human papillomaviruses, Plenum, Nueva York, págs. 147-153 (1993)). Las células se recogieron aproximadamente 72 horas post-infección, se sedimentaron por centrifugación y se congelaron. Para la preparación de VLP, el concentrado celular se resuspendió en tampón de homogenización (NaH_{2}PO_{4} 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 que contiene leupeptina 10 \mug/ml, aprotinina 1 \mug/ml y pepstatina A 1 \mug/ml) y se lisaron en un microfluidificador (Microfluidics modelo HC8000/3A). El lisado homogeneizado se centrifugó después a 100.000 x g durante 90 minutos y el sedimento que contenía VLP de HPV-11 se resuspendió en PBS que contenía CsCl (405 g/l). El lisado clarificado se centrifugó después durante una noche a 83.000 x g y se recogió la banda de VLP. Las VLP se diluyeron en PBS-NaCl 0,5 M y se estratificaron sobre un gradiente de fases de dos componentes compuesto por sacarosa al 30% y al 63%. Los gradientes se centrifugaron a 167.000 x g durante 3 horas y la banda de VLP purificada se recogió en la interfaz entre las soluciones de sacarosa al 30% y al 63%. Después, las VLP se dializaron en tampones seleccionados (PBS o PBS con NaCl añadido a una concentración final de 0,3 M o 0,5 M) y se almacenaron a 4ºC. Se determinó la concentración de proteína mediante el ensayo de Bradford (Bradford et al, Anal. Biochem., 72: 248-254 (1976)) usando albúmina de suero bovino como la proteína de referencia y se determinó el contenido de L1 como se describe (Suzich et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 11553-11557 (1995)). Partiendo de 25-30 g de concentrado celular húmedo, el protocolo anterior producía 15-25 mg de VLP de HPV-11.

VLP de HPV-16_{Tr}

Para el uso en estudios de desensamblaje y reensamblaje de VLP durante la purificación, se expresaron proteínas L1 de HPV-16_{Tr} (compuestas por una forma mutada de la proteína L1 de HPV-16 de la que se habían delecionado los 34 aminoácidos C-terminales) en células High Five® como se han descrito anteriormente. El concentrado celular se resuspendió en tampón de extracción (Tris 10 mM, Tritón X-100 al 1,0%, pH 6,0), se mezcló por agitación y se centrifugó brevemente a 1.000 x g. El sedimento que contenía las VLP de HPV-16_{Tr} se resuspendió en tampón Tris 20 mM, NaCl 0,1 M, a pH 8,0, se agitó vorticialmente brevemente y se centrifugó a 3.000 x g durante 30 min. El sobrenadante se recogió, se filtró a través de filtros de jeringa de acetato de celulosa de 0,45 \mum y después se incubó en presencia o ausencia de \betaME al 4% durante >2 horas a 4ºC antes del uso en ensayos de purificación en columna. El sobrenadante filtrado aclarado (+/-\betaME) se aplicó a diferentes resinas de intercambio iónico a valores de conductividad reducida (5-15 miliohms), se lavó con varios volúmenes de columna de tampón de equilibrado y se eluyó con un gradiente de NaCl creciente. Para ensayar la utilidad de HIC para eliminar contaminantes de ADN y proteínas residuales, las fracciones que contenían el pico de la proteína L1 eluida de la IEC se combinaron, se ajustaron a 0,7 M en sulfato de amonio y se aplicaron a una columna de HIC equilibrada en el mismo tampón. La columna se lavó con varios volúmenes de columna de tampón de equilibrado y después la proteína L1 se eluyó de la columna de HIC a una menor concentración de sulfato de amonio. Los productos finales de los procesos de purificación (+/-\betaME) se dializaron exhaustivamente contra PBS (NaCl 0,5 M) y se compararon en términos de pureza, rendimiento y ADN residual. El aspecto de las VLP se caracterizó por microscopía electrónica y análisis de gradiente lineal de sacarosa (véase a continuación).

Centrifugación en gradiente de sacarosa

Se usaron tres tipos de gradientes de sacarosa en estos experimentos. En primer lugar, se usó una centrifugación en colchones de sacarosa al 30% para identificar condiciones que favorecieran el desensamblaje de VLP en componentes solubles de menor tamaño. Se estratificaron mezclas de reacción de 100-200 \mul que contenían VLP (50-100 \mug de proteína total) más o menos agentes interruptores de potencial sobre tubos de centrífuga de 5 ml llenos con 4,8 ml de sacarosa al 30% (p/p en PBS-NaCl 0,5 M) y se centrifugaron a 197.000 x g durante 2 horas a 40ºC en un rotor con cubeta oscilante. Se tomó una alícuota de 50 \mul de la parte más superior del tubo y se mezcló con tampón de preparación de muestras de Laemmli 2X (Laemmli, U. K., Nature, 227: 680-685 (1970)). El resto del colchón de sacarosa al 30% se retiró mediante una pipeta y el "sedimento" (típicamente no había sedimento visible) se resuspendió en 100 \mul de tampón de preparación de muestras de Laemmli 1X. La presencia de proteína L1 de HPV-11 en la parte superior o inferior del colchón de sacarosa al 30% se determinó después mediante SDS/PAGE y la cantidad relativa de L1 se cuantificó mediante análisis de geles digitalizados. En segundo lugar, el estado de VLP desensambladas se determinó mediante centrifugación por velocidad-zonal a través de gradientes lineales de sacarosa del 5 al 20%. Las VLP desensambladas (100-200 \mug de proteína total en 400 \mul) se estratificaron sobre gradientes preformados de 11,6 ml compuestos por sacarosa del 5 al 20% (p/v en PBS-NaCl 0,5 M) y se centrifugaron a 111.000 x g durante 24 horas a 4ºC en un rotor con cubeta oscilante. Las fracciones (0,5 ml) se recogieron a través del gradiente y el "sedimento" (típicamente no había sedimento visible) se resuspendió en 0,5 ml de PBS mediante homogenización suave. La posición de la proteína L1 de HPV-11 por el gradiente se determinó mediante inmunotransferencia. Los gradientes se calibraron usando proteínas patrón con coeficientes de sedimentación establecidos (\beta-galactosidasa de E. coli, 19S; catalasa de hígado bovino, 11,3 S; albúmina de suero bovino, 4,3 S) y se determinó el porcentaje de sacarosa en las fracciones mediante refractometría.

En tercer lugar, el estado de VLP iniciales, desensambladas y reensambladas se determinó mediante centrifugación por velocidad-zonal a través de gradientes lineales de sacarosa del 10 al 65%. La proteína L1 de HPV-11 (100-200 \mug de proteína total en 400 \mul) en diversos estados de ensamblaje se estratificó sobre gradientes preformados de 11,6 ml compuestos por sacarosa del 10 al 65% (p/v en PBS-NaCl 0,5 M) y se centrifugó a 188.000 x g durante 2,5 horas a 40ºC en un rotor con cubeta oscilante. Los gradientes se recogieron (en fracciones de 1,0 ml), se analizaron y se calibraron como anteriormente, usándose VLP de B 19 de parvovirus (70 S) y de L1 de HPV-18 (160 s) como patrones de calibración adicionales.

Electroforesis en Gel SDS/PAGE

Se realizó un SDS/PAGE en gran medida de acuerdo con el método de Laemmli (Laemmli, U. K., Nature, 227: 680-685 (1970)). Se mezclaron muestras con tampón de preparación de muestras, se llevaron a ebullición durante 2 minutos, se centrifugaron brevemente en una minifuga y se cargaron en minigeles al 7,5% (Figura 1) o al 10% (Figuras 2-4) con un gel de preconcentración al 4%. Los geles se procesaron durante aproximadamente 1 hora a una corriente constante de 20 mA a temperatura ambiente y la proteína se visualizó por tinción con azul brillante de Coomassie R250.

Inmunotransferencia

Se prepararon inmunotransferencias de L1 de HPV-11 a partir de geles de SDS/PAGE en gran medida de acuerdo con el método de Towbin et al (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 4350-4354 (1979)). Las transferencias se bloquearon con proteína de leche desnatada al 1% en PBS durante una noche a 4ºC. Las transferencias se sondaron con AU1 (Berkely Antibody Co. ), un monoclonal de ratón dirigido contra un epítopo lineal en proteínas L1 de papilomavirus (25) durante 90 minutos, se lavó con PBS, Tritón X-100 al 0,1% y después se volvió a bloquear durante 30 minutos. Las transferencias se incubaron después con anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón marcado con HRP (Southern Biotechnology Associates, Inc.) durante 40 minutos y se lavó como anteriormente. Las transferencias se revelaron después con reactivo de transferencia de Western ECL (Amersham) y se expusieron a una película de rayos X.

Análisis de geles

Se determinó la M_{r} de L1 monomérica y oligomérica a partir de sus valores de R_{f} en SDS/PAGE a 7,5% en comparación con proteínas patrón (Véase, Jackowski et al, en T. E. Creighton (ed.), Protein structure: a practical approach, IRL Press, Nueva York, págs. 1-21 (1989)). Donde se indica, los geles se digitalizaron en un densitómetro de lecho plano Hewlett Packard Scanjet Plus y la intensidad relativa de las bandas se determinó usando el programa informático Scan Analysis (Versión 2.2; Specom Research).

Microscopía electrónica

Se dejó que las muestras de proteína se asentaran en rejillas de cobre recubiertas con formvar y carbono (Electron Microscopy Sciences), se realizó una transferencia en seco y se tiñeron con ácido fosfotúngstico al 2% recién filtrado (pH 6,8). Las rejillas se examinaron en un microscopio electrónico de transmisión JEOL modelo 1005 a un voltaje de aceleración de 100 kV y se fotografiaron a aumentos nominales de 15-25.000x.

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)

VLP de L1 de HPV-11 (0,5-1,0 mg/ml de L1) en PBS-NaCl 0,3 M se almacenaron sin tratamiento a 4ºC o se incubaron durante una noche a 4ºC después de la adición de \betaME (a una concentración final del 5%) o tampón carbonato 2,0 M, pH 9,6 (a una concentración final de carbonato de 200 mM). Después se dializó una porción de las muestras tratadas contra 4 x 1l de PBS-NaCl 0,5 M a 4ºC durante \geq24 h. Todas las muestras se diluyeron hasta una concentración de 0,8 \mug de L1/ml y se distribuyeron en los pocillos de placas de microtitulación (80 ng de L1 por pocillo). VLP sin tratar y el material dializado se diluyeron en PBS. La muestra tratada con \betaME sin diálisis posterior se diluyó en PBS que contenía \betaME al 5% y una muestra no dializada incubada en carbonato 200 mM se diluyó en carbonato 200 mM, pH 9,6. Después de la incubación a 37ºC durante 1 h, las placas se lavaron con PBS, Tween-20 al 0,1% (PBS-Tw) y se bloquearon con proteína de leche desnatada al 5% en PBS. Se diluyeron anticuerpos monoclonales (AU1, o H11.F1 y H11.A3 purificados de ascitis adquiridos en la Universidad del Estado de Pensilvania (Christensen et al, J. Virol., 64: 5678-5681 (1990)) en leche desnatada al 1% en PBS y se añadieron a los pocillos. Después de una incubación de 2 h a temperatura ambiente, las placas se lavaron con PBS-TW y se añadió anti-IgG de ratón de cabra marcado con HRP. Después de 1 h a temperatura ambiente, las placas se lavaron como anteriormente y se revelaron con sustrato de HRP (Kirkegaard and Perry Laboratories). Se realizaron mediciones de densidad óptica a 405 nm en el punto de tiempo de 15 min. Se calcularon los promedios de pocillos por duplicado como los valores de densidad óptica finales.

Ensayo de Neutralización de HPV-11

Se generaron antisueros contra VLP de HPV-11 purificadas originales y VLP de HPV-11 que se desensamblaron mediante exposición prolongada a agente reductor sulfhidrilo y después se reensamblaron tras la eliminación del agente reductor mediante diálisis, en ratones BALB/c (grupos de 5). A los ratones se les inyectó s. c. 1 \mug de VLP adsorbidas a adyuvante Alhydrogel 1 mg/ml en las semanas 0, 4 y 9, realizándose extracciones de sangre terminales la semana 13. Para determinar si los antisueros generados en los ratones eran capaces de neutralizar virus HPV-11, se ensayó la capacidad de los antisueros para bloquear la expresión de un ARNm cortado y empalmado de HPV-11 específico en una línea celular humana (HaCaT).

Se suministró HaCaT, una línea celular de queratinocitos humanos inmortalizados (Boukamp et al, J. Cell Biol., 106: 761-771 (1988)) por el Dr. Norbert Fusenig. Las células se cultivaron hasta confluencia en 154/HKGS (Cascade Biologics, Inc.) complementado con penicilina (100 unidades/ml) y estreptomicina (100 \mug/ml) en placas de 24 pocillos. Se sonicó virus de reserva HPV-11_{Hershey} adquirido del Dr. John Kreider (Kreider et al, J. Virol., 61: 590-593 (1987)) durante 25 s en hielo, se diluyó en medio 154/HKGS y se incubó durante una hora a 37ºC. Se aspiró el medio de las células HaCaT y se añadieron 0,5 ml de virus diluido por pocillo. Como control, uno de los pocillos de células en cada placa recibió 0,5 ml de medio sin virus. Para neutralización mediada por anticuerpos, se diluyeron los antisueros en 154/HKGS y se incubaron con una cantidad fija del virus de reserva HPV-11 en un volumen final de 0,5 ml durante una hora a 37ºC antes de la adición a las células HaCaT. Se añadió medio fresco a cada pocillo de células cuatro días post-infección y el día seis se recogieron las células y se preparó el ARN celular total usando reactivo Tri (Molecular Research Center, Inc.). Se resuspendieron los sedimentos de ARN finales en 20 \mul de agua tratada con DEPC y se cuantificaron mediante espectrofometría.

La capacidad de los antisueros para bloquear la expresión de ARNm cortado y empalmado específico de HPV-11 se determinó mediante PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR). Se realizaron reacciones de transcripción inversa (RT) usando un kit de ADNc de Primera Cadena (Boehringer Mannheim) con 2 \mug de ARN total como molde y oligo dT como cebador. Era necesaria una PCR anidada para detectar ADNc de E1^E4 de HPV-11. La primera vuelta de amplificación se llevó a cabo con el 25% del ADNc de cada reacción de RT y 5'-TACAAGACCTTTTGCTGGGCACA-3' (localizado en las bases 765-787 en la secuencia genómica del HPV-11) como el cebador externo directo y 5'-AAAGGCAGGA.AAATAGCACAC-3' (localizado en las bases 4088-4110 en la secuencia genómica del HPV-11) como el cebador externo inverso durante 30 ciclos de PCR. Se usó el diez por ciento de la mezcla de PCR de la primera vuelta para reacciones anidadas con 5'-ATATTGTGTGTCCCATCTGCG-3' (localizado en las bases 792-812) como cebador directo anidado y 5'-CAGCAATTTGTACAGGCACTAC-3' (localizado en las bases 3877-3898 en la secuencia genómica del HPV-11) como el cebador inverso anidado durante 30 ciclos de PCR. Se prepararon reacciones de PCR de primera vuelta y anidada con perlas Hot Wax (1,5 mM) y tampón de pH 9,5 (InVitrogen) con dNTP 200 \muM, 125 ng de cada cebador directo e inverso y 2,5 unidades de polimerasa Taq (Perkin-Elmer) en un volumen final de 50 \mul. El perfil de temperatura tanto para la PCR de primera vuelta como anidada era de 80ºC/5 min, 95ºC/30 s, 72ºC/30 s con una extensión final a 72ºC durante 10 min.

Como control para demostrar que el ensayo que era capaz de detectar ARNm extraído de células HaCaT, todas las muestras de ADNc se usaron en reacciones de PCR separadas con cebadores específicos para ARNm de \beta-actina celular cortado y empalmado como se describe y amplificado como anteriormente (Smith et al, J. Invest. Dermatol., 105: 1-7 (1995)).

Todos los productos de PCR se separaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2% y se visualizaron mediante fluorescencia con bromuro de etidio.

Ejemplo 1

Desensamblaje cuantitativo de VLP de HPV-1

Se prepararon cantidades relativamente grandes de VLP de L1 de HPV-11 como material de partida para el estudio del desensamblaje y reensamblaje de VLP. Se aislaron VLP de L1 de HPV-11 a partir de células High Five® infectadas con baculovirus recombinante mediante centrifugación en gradiente de CsCl y sacarosa. La pureza calculada de estas preparaciones de L1, basándose en análisis densitométricos de SDS/PAGE, variaba entre el 70 y el 90%. Además, en gradientes lineales de sacarosa la mayor parte de la proteína migraba como se esperaba para una mezcla de VLP individuales y agrupadas y en la microscopía electrónica era evidente una mezcla de partículas de tamaño intermedio y completo (50-55 nm).

Las interacciones covalentes y no covalentes que estabilizan las VLP de L1 ensambladas no se conocen totalmente, pero un trabajo anterior sobre VLP de papilomavirus y viriones de poliomavirus relacionados y VLP sugería la importancia de la fuerza iónica, cationes divalentes (Brady et al, J. Virol., 23: 717-724 (1977); Salunke et al, Biophys. J., 56: 887-900 (1987)) y enlaces disulfuro (Sapp et al, J. Gen. Virol., 76: 2407-2512 (1995); Volpers et al, Virology, 200: 504-512 (1994)). En particular, Sapp y colaboradores habían demostrado por inmunotransferencia que el \sim50 por ciento de la proteína L1 de VLP de HPV-33 estaba unida por enlaces disulfuro en un intervalo de oligómeros de mayor tamaño con una M_{r} aparente que concuerda con trímeros de L1, y que condiciones reductoras suaves degradan parcialmente las VLP de HPV-33 a nivel de capsómeros (Sapp et al, J. Gen-Virol., 76: 2401-2412 (1995); Volpers et al, Virol, 200: 504-512 (1994)). En estos estudios, en ausencia de agentes reductores sólo un porción de la proteína L1 de HPV-11 migraba en SDS/PAGE con una M_{r} aparente de 55.000 Da.

Aproximadamente el 40% (el porcentaje variaba entre diferentes preparaciones de VLP) de la proteína L1 de VLP de HPV-11 estaba unida por enlaces disulfuro en oligómeros de mayor tamaño; con valores de M_{r} predichos de aproximadamente 144.000 Da (posiblemente trímero de L1) y 210.000 Da (posiblemente tetrámero de L1). Los oligómeros de L1 no migraban como una sola banda, y parecían ser de un tamaño heterogéneo. El oligómero de \sim200.000 Da también se observó en inmunotransferencias por Sapp y colaboradores (Sapp et al, J. Gen. Virol., 76: 2407-2412 (1995); Volpers et al, Virol., 200: 504-512 (1994)), como parte de una banda ancha de mayor peso molecular. Estos resultados indican que una porción de las proteínas L1 en VLP de HPV-11 están unidas por enlaces disulfuro en oligómeros de mayor tamaño. Para estudiar el papel de los enlaces disulfuro y otras interacciones en la estabilidad de VLP, se desarrolló un ensayo de exploración rápida para desensamblaje de VLP. VLP de L1 de HPV-11 purificadas tanto antes como después de diversos tratamientos, se estratificaron sobre colchones de sacarosa al 30%, se centrifugaron y se visualizó la distribución de proteína L1 en la parte superior e inferior del colchón al 30% mediante SDS/PAGE. Se esperaba que las VLP intactas se sedimentaran a través del colchón de sacarosa al 30%; se esperaba que los capsómeros no agregados y monómeros de L1 permanecieran en la parte superior del colchón.

Para cuantificar la disposición relativa de proteína L1, los geles se digitalizaron, se determinó la intensidad total de las bandas de L1 en la parte superior y en la parte inferior del colchón y después se calculó el porcentaje de la intensidad de tinción de L1 que se encontraba en cualquier posición. Los resultados de varias de dichas determinaciones se representaron en tablas en las Tablas 1 y 2. El material de partida de VLP purificadas se sedimentaba a través de la sacarosa al 30%, como se predijo, sin L1 aparente en la parte superior. Sin embargo, tras la incubación con una concentración elevada del agente reductor \beta-mercaptoetanol (\betaME), la proteína L1 se encontraba en gran medida en la parte superior del colchón de sacarosa al 30%, indicando que el agente reductor había desensamblado las VLP de HPV-11 en componentes no agregados de menor tamaño. Curiosamente, el desensamblaje máximo de las VLP requiere típicamente exposición a una concentración muy elevada de agente reductor (en este caso, \betaME al 5% o 713 mM) durante una duración relativamente prolongada (\sim16 horas a 4ºC). Las concentraciones inferiores de agente reductor o duraciones más cortas de reducción no eran tan eficaces de forma fiable en el desensamblaje de VLP. La adición de una baja concentración de un agente quelante no aumentaba el desensamblaje (Tabla 1).

Además de reductores, se descubrió que las otras variables importantes para el desensamblaje cuantitativo de VLP eran la fuerza iónica durante la reacción del desensamblaje y la solubilidad del material de partida de VLP. Como se observó anteriormente para viriones de poliomavirus, las condiciones de fuerza iónica inferiores desestabilizan las VLP (Brady et al, J. Virol., 23: 717-724 (1977)), aunque Sapp et al, J. Gen Virol., 76: 2407-2412 (1996) describieron que la generación de capsómeros de HPV-33 a partir de VLP era insensible a una concentración de sal de NaCl entre 0,15 M y 0,6 M. Para VLP de HPV-11, se observó un desensamblaje máximo (\sim90%) de VLP expuestas al \betaME al 5% durante 16 horas a una fuerza iónica "fisiológica" (es decir, NaCl 0,15 M), pero se hacía proporcionalmente menos eficaz a medida que se aumentaba la fuerza iónica (Tabla 1). El efecto estabilizante de una fuerza iónica aumentada podía superarse parcialmente por incubación de las VLP con agentes reductores durante duraciones más prolongadas o a temperaturas elevadas. Sin embargo, aunque incubar las VLP con \betaME al 5% durante 120 horas a 4ºC o durante 24 horas a 24ºC aumentada el grado de desensamblaje hasta el 60-70% a NaCl 0,5 M, el desensamblaje todavía distaba de ser completo (no se muestran los datos). Además, para un desensamblaje cuantitativo, también era importante el grado de agregación del material de partida de VLP. En los experimentos descritos en este documento, las soluciones de VLP se dializaron en tampones de diferente fuerza iónica y se almacenaron a 4ºC hasta el uso en ensayos de desensamblaje. Después de varios días, particularmente a NaCl 0,15 M, las soluciones se volvían ligeramente turbias, indicando cierto grado de agregación (aunque se observaba escaso o ningún precipitado). El tratamiento de las soluciones de VLP turbias con agentes reductores no producía el mismo grado de desensamblaje que se observaba con la solución de VLP solubles inicial, indicando que las VLP agregadas eran resistentes al desensamblaje. Sin embargo, tras la eliminación del material agregado (que variaba del 10-50% de las VLP totales dependiendo del envejecimiento de la preparación) por filtración, las VLP que permanecen solubles podían desensamblarse de nuevo en la misma medida que el material de partida de VLP solubles inicial.

Curiosamente, incluso a altas concentraciones de quelantes, la quelación de cationes no influía significativamente en el desensamblaje de VLP. La diálisis de VLP en tampones de EDTA o EGTA 200 mM (PBS-NaCl 0,3 M, pH 7,4) condujo a un desensamblaje inaparente y la adición de ditiotreitol 10 mM (DTT) a los tampones de diálisis tenía un escaso efecto (Tabla 2). La incapacidad de altas concentraciones de quelantes para desensamblar VLP se confirmó mediante análisis microscópico electrónico, aunque el EDTA (pero no el EGTA) parecía hinchar las VLP ligeramente (no se muestran los datos). Cualquiera de estas concentraciones de quelante era insuficiente para extraer iones estructuralmente importantes estrechamente unidos, o cationes que no son esenciales para mantener la integridad estructural de la VLP. Por el contrario, la adición de una alícuota concentrada de tampón de NaHCO_{3} (pH 9,6) a una solución de VLP a una concentración final de carbonato 200 mM (en PBS-NaCl 0,3 M), causaba una degradación significativa de las VLP (Tabla 2). La adición de DTT (a una concentración final de 10 mM), no aumentaba adicionalmente la degradación inducida por carbonato. La incubación de VLP con carbonato 200 mM/DTT 10 mM se usa comúnmente para desnaturalizar viriones o VLP de HPV en ELISA (Favre et al., J. Virol., 15: 1239-1237 (1975); Christensen et al, J. Virol., 64: 3151-3156 (1990); Christensen et al, J. Gen. Virol., 75: 2271-2276 (1994)). El efecto del carbonato parecer ser específico de tampón y no simplemente estar en función del pH, ya que la incubación de VLP de HPV-11 con tampón de glicina de pH 9,6 (concentración final de 200 mM) causaba una degradación de VLP muy escasa, como se medía mediante el ensayo de colchón de sacarosa al 30% (Tabla 2). De forma similar, Brady et al. (J. Virol; 23: 717-724 (1977)), observaron que el tampón carbonato a pH alcalino, pero no el pH alcalino en solitario, disociaba viriones de poliomavirus. Sin embargo, el efecto específico del carbonato a pH 9,6 no parecía deberse a la capacidad quelante potencial del carbonato, como se sugería por Brady et al. (J. Virol., 23: 717-724 (1977)), ya que el EDTA
200 mM a pH 9,6 (+/- DTT 10 mM) era completamente ineficaz en el desensamblaje de VLP (no se muestran los datos).

Ejemplo 2

Caracterización de VLP de HPV-11 desensambladas

Después de una exposición a largo plazo a altas concentraciones de agente reductor, las VLP purificadas parecen degradarse a nivel de capsómeros.

Las VLP desensambladas generadas por incubación con \betaME al 5% durante 16 horas a 4ºC migraban en gradientes lineales de sacarosa del 5 al 20% con un coeficiente de sedimentación promedio de 11,3 \pm 1,5 S (n = 5), determinado con respecto a los patrones de sedimentación. Se observaron ocasionalmente especies de mayor tamaño con un coeficiente de sedimentación calculado de 16-18 S (quizá capsómeros diméricos) e incluso materiales sedimentados. Sin embargo, se detectó menos del 10% de la L1 en la parte superior de los gradientes (posición esperada para monómeros de L1) o en el sedimento (posición esperada para VLP intactas o capsómeros agregados), sugiriendo que el material de partida de VLP purificadas se desensamblaba en gran medida a nivel de capsómeros individuales tras una reducción prolongada. Esta conclusión se confirma mediante análisis microscópico electrónico de VLP después de una incubación prolongada con \betaME al 5%, que representaba un campo de capsómeros homogéneos con un promedio de 9,7 \pm 1,2 nm (n = 15) de diámetro, siendo evidentes ocasionalmente unas cuantas estructuras agregadas de mayor tamaño (la L1 monomérica no se detectaría con esta técnica). El diámetro de capsómero estimado es ligeramente más pequeño que el observado por crioelectromicroscopía (11-12 nm) (Baker et al, Biophys. J., 60: 1445-1456 (1991); Hagensee et al, J. Virol., 68: 4503-4504, (1994); Belnap et al, J. Mol. Biol., 2591: 249-263 (1996)), quizá debido a encogimiento durante la preparación de una gradilla de microscopio electrónico. Los datos de que la exposición prolongada a altas concentraciones de reductores desensambla cuantitativamente VLP solubles purificadas en una población homogénea de capsómeros.

Los capsómeros generados a partir de VLP de HPV-11 tras una exposición a largo plazo a altas concentraciones de agente reductor contienen epítopos estructurales que se encuentran en VLP intactas. Se ha descrito un panel de anticuerpos monoclonales específicos de HPV-11 que reaccionan con VLP de L1 de HPV-11 intactas pero no con L1 "desnaturalizada". Estos monoclonales incluyen H11.F1, que se ha demostrado que reconoce un epítopo neutralizante dominante en viriones de HPV-11, y H11.A3, un anticuerpo no neutralizante diferente dependiente de estructura (Christensen y Kreider, J. Virol., 64: 3151-3156 (1990); Christensen et al, J. Virol., 64: 5678-5681 (1990)). Como se preveía, H11.F1 y H11.A3 reaccionaban fuertemente con el material de partida de VLP de HPV-11 purificadas cuando se analizaba mediante ELISA. Sin embargo, estos anticuerpos también reaccionaban con capsómeros generados a partir del material de partida de VLP mediante exposición a agente reductor. Por lo tanto, los capsómeros poseen al menos parte de los epítopos dependientes de estructura que se encuentran en la superficie de VLP intactas y viriones auténticos, de acuerdo con estudios realizados por Li et al, (J. Virol., 71: 2988-2995 (1997)) en capsómeros de HPV-11 expresados en E. coli. Estos resultados demuestran además que los anticuerpos monoclonales H11.F1 y H11.A3, aunque requieren una conformación "de tipo nativo" para la unión, no dependen de VLP como se ha descrito anteriormente (Ludmerer et al, J. Virol., 71: 3834-3839 (1997)).

Por el contrario, los anticuerpos monoclonales H11.F1 y H11.A3 no reconocen VLP de HPV 11 disociadas por tratamiento con tampón carbonato a pH 9,6 (no se muestran los datos; Christensen et al, J. Gen. Virol., 75: 2271-2275 (1994)). El tratamiento con carbonato no condujo a una solución homogénea de capsómeros sino que en su lugar aparecía como una mezcla poco definida de objetos pequeños parcialmente agregados cuando se examinaba por microscopía electrónica (no se muestran los datos). Esta observación se confirmó parcialmente por análisis de VLP tratadas con carbonato en gradientes lineales de sacarosa del 5 al 20%, en los que la proteína L1 migraba en gran medida a \sim4 S, aunque se observó una pequeña población a 9-11 S, de acuerdo con los efectos del tampón carbonato (a pH 10,6, con DTT 10 mM) sobre viriones de BPV (Favre et al, J. Virol., 15: 1239-1247 (1975)). Por último, aunque el tratamiento con tampón de glicina a pH 9,6 no disociaba las VLP en partículas individuales de menor tamaño (Tabla 2), sí tenía cierto efecto sobre VLP tratadas con glicina a pH 9,6 que aparecían en el microscopio electrónico como una mezcla escasamente definida de VLP intactas y parcialmente degradadas y agregadas (no se muestran los datos).

Ejemplo 3

Reensamblaje cuantitativo de VLP de HPV-11

El reensamblaje de VLP a partir de capsómeros HPV-11 se producía tras la eliminación del agente reductor, mediante diálisis o cromatografía en columna. Partiendo de una preparación homogénea de capsómeros solubles, la diálisis prolongada en ausencia de agentes reductores producía sistemáticamente una población definida de VLP reensambladas. Las VLP reensambladas conservaban los epítopos estructurales reconocidos por los anticuerpos monoclonales H11.F1 y H11.A3.

Para el reensamblaje, se dializaron capsómeros (1-5 ml a proteína total 0,5-1,0 mg/ml) frente a 4 x 1 l de PBS-NaCl 0,5 M a 4ºC durante \geq24 h; la concentración de sal elevada estaba diseñada para estabilizar las VLP. Mientras que la adición de agentes quelantes no aumentaba de forma apreciable la capacidad de agentes reductores para desensamblar VLP (Tabla 1), la presencia de EDTA 2 mM interfería de forma moderada con el reensamblaje, produciendo VLP que migraban en un gradiente lineal de sacarosa del 10 al 65% como una población bastante separada de partículas 150 S pero aparecían aplanadas y parcialmente abiertas en la microscopía electrónica (no se muestran los datos). Por el contrario, la adición de Ca^{2+} 2 mM durante la reacción de reensamblaje causaba que las VLP se adhirieran entre sí, como se muestra por el análisis de gradiente lineal de sacarosa del 10 al 65% en el que las VLP reensambladas en presencia de calcio migraban totalmente en el sedimento. Sin embargo, la presencia de Ca^{2+} no parecía influir de otro modo en la morfología básica de las VLP cuando se examinaba en el microscopio electrónico (no se muestran los datos). Por último, la diálisis de VLP tratadas con carbonato en PBS-NaCl 0,5 M no conducía al reensamblaje de VLP. En su lugar, la proteína L1 permanecía como componentes solubles pequeños o un precipitado amorfo agregado, como se mostraba tanto mediante microscopía electrónica como por análisis de gradiente lineal de sacarosa del 10 al 65% (no se muestran los datos). La diálisis de VLP tratadas con carbonato no restauraba la reactividad con los anticuerpos monoclonales específicos de estructura H11.F1 y H11.A3.

Caracterización de VLP de HPV-11 reensambladas

Después de la eliminación del agente reductor, los capsómeros se reensamblaban de forma cuantitativa en VLP. Sorprendentemente, las VLP reensambladas eran mucho más homogéneas en el tamaño de partícula que el material de partida de VLP purificadas en gradiente de cesio y sacarosa. Cuando las tres fases de la reacción de desensamblaje/reensamblaje se comparaban mediante gradientes lineales de sacarosa del 10 al 65%, el material de partida de VLP purificadas se distribuía a través del gradiente, migrando muchas partículas a la posición esperada para VLP intactas (150-160 S), pero con la mayoría de la proteína más abajo en el gradiente y en el sedimento. De forma similar, cuando se examinaban en la microscopía electrónica, se observaba que el material de partida de VLP era una mezcla de partículas de diferentes tamaños, incluyendo VLP de tamaño completo de 50-55 nm de diámetro. Es posible que se produjera alguna rotura de VLP durante la extracción y purificación, ya que el análisis de gradiente lineal de sacarosa de fases anteriores del proceso de purificación indicaba una distribución más homogénea de tamaños de partícula (no se muestran los datos).

Tras una exposición a largo a plazo a altas concentraciones de agentes reductores, las VLP se desensamblaron en capsómeros, como se ha descrito anteriormente. En comparación con el material de partida de VLP, los capsómeros migraban en la parte superior de los gradientes lineales de sacarosa del 10 al 65% (detectándose escasa o ninguna L1 en el sedimento: y en la microscopía electrónica aparecía como un campo no degradado de capsómeros).

El reensamblaje de los capsómeros producía una población homogénea de VLP esféricas de tamaño completo. Las VLP reensambladas se distribuían en bandas a la mitad de los gradientes lineales de sacarosa del 10 al 65% con un coeficiente de sedimentación predicho de 150,4 \pm 4,6 S (n = 7), detectándose mucha menos L1 en el sedimento o en la parte inferior del gradiente que la que se observaba con el material de partida de VLP purificadas.

La homogeneidad de las VLP reensambladas era incluso más sorprendente cuando se examinaba en el microscopio electrónico. Se detectaron predominantemente partículas en el intervalo de VLP de tamaño completo con un promedio de 56,5 \pm 7,0 nm (n = 15), siendo evidentes muy pocas VLP parcialmente ensambladas o complejos de menor tamaño. Los rendimientos del proceso de reensamblaje también eran impresionantes (de promedio; 83% en términos de proteína L1 total a partir de material de partida respecto a VLP reensambladas en condiciones óptimas de desensamblaje), ya que esencialmente todos los capsómeros parecían volver a formar VLP solubles filtrables de tamaño completo.

Ejemplo 4

Comparación de la Capacidad de VLP de HPV-11 Purificadas Iniciales y VLP de HPV-11 Reensambladas para Generar Anticuerpos Neutralizantes de Virus

Para que las VLP reensambladas funcionen con éxito como candidatos de vacunas es esencial que conserven la capacidad para generar anticuerpos neutralizantes de virus cuando se inyectan en animales de experimentación. Para ensayar esto, se generaron antisueros policlonales tanto de las VLP de HPV-11 iniciales purificadas como de VLP de HPV-11 desensambladas/reensambladas en ratones BALB/c, como se describe en la sección de Métodos. Cada antisuero era igualmente reactivo contra el inmunógeno correspondiente cuando se ensayaba en un formato de ELISA (no se muestran los datos). De forma más importante, cuando se ensayaban en el ensayo de neutralización por RT-PCR que implicaba viriones de HPV-11 infecciosos (Smith et al., J. Invest. Dermatol., 105: 1-7 (1995)), los antisueros policlonales específicos de VLP de HPV-11 reensambladas post-inmunes presentaban un título de neutralización de 10^{-5}-10^{-6}, igual que el obtenido con los antisueros generados contra las VLP de HPV-11 purificadas iniciales. Esto demuestra que las VLP de HPV-11 reensambladas conservan el dominio antigénico neutralizante de cápsida altamente inmunogénico de viriones de HPV-11 y tienen el potencial de servir como vacunas para la prevención de enfermedad genital por HPV.

Ejemplo 5

Aplicación de desensamblaje y reensamblaje de VLP durante la purificación de VLP de HPV

Como se ha analizado anteriormente, los métodos de purificación de proteínas convencionales no están optimizados para el uso con complejos de proteínas del tamaño de VLP (partículas de 20.000.000 Da, 55 nm de diámetro). En particular, el tamaño absoluto de VLP disminuye radicalmente la capacidad y utilidad de la mayoría de resinas cromatográficas, ya que gran parte de la química reactiva en la resina es estéricamente inaccesible a las VLP. Sin embargo, esta dificultad puede evitarse potencialmente por desensamblaje de las VLP brutas extraídas de células, purificación de las VLP desensambladas usando métodos convencionales y reensamblaje de las VLP en la fase deseada de pureza. Una segunda preocupación con la purificación de VLP es la contaminación con ADN residual. En un trabajo anterior realizado con VLP de HPV-11 purificadas persiste cierto nivel de ADN de fondo que no se elimina por tratamiento con ADNasa, sugiriendo que el ADN está encapsulado en el interior de las VLP o muy íntimamente asociado con las mismas. El desensamblaje de las VLP debería permitir una eliminación aumentada de ADN contaminante, una consideración importante para cualquier compuesto biológico destinado para uso clínico.

Para ensayar este potencial, se extrajeron VLP de HPV-16_{Tr} de células de insecto infectadas con baculovirus y se purificaron mediante cromatografía de IEC y HIC convencional, como se describe en la sección de Métodos, en ausencia de agente reductor sulfhidrilo (VLP intactas) o en presencia de \betaME al 4% (VLP desensambladas). En el último caso, las VLP extraídas se incubaron con \betaME al 4% durante >2 h a 4ºC antes de la cromatografía en columnas de IEC y HIC, que también se equilibraron en \betaME. Los productos finales purificados de ambos procedimientos de purificación (es decir, en presencia o ausencia de agente reductor sulfhidrilo) se dializaron contra 4 x 1 l de PBS (NaCl 0,5 M) y se determinó la pureza, rendimiento y niveles de ADN residuales. Como se muestra en la Tabla 3, una preparación representativa purificada en ausencia de \betaME daba como resultado VLP de HPV-16_{Tr} que tenían una pureza de solo aproximadamente el 60% (en términos de contaminación de proteína) y niveles contenidos de ADN superiores a los deseados para uso humano. Por el contrario, tres preparaciones de VLP purificadas en el estado desensamblado se caracterizaban por rendimientos mayores, pureza de proteína significativamente superior y niveles de ADN residual sustancialmente reducidos. La mayor pureza de proteína de VLP purificadas en el estado de desensamblado es fácilmente evidente cuando se analizaba mediante SDS/PAGE.

El tamaño y la homogeneidad de las VLP de HPV-16_{Tr} reensambladas post-purificación han sido más heterogéneos que los observados para reensamblaje de VLP de HPV-11 purificadas, pero de promedio han sido tan homogéneos como las VLP de HPV-16_{Tr} purificadas sin desensamblaje y en algunos casos han formado uniformemente VLP homogéneas de tamaño completo, algo que nunca se observó con VLP de HPV-16_{Tr} purificadas sin desensamblaje (no se muestran los datos).

Existen diferencias interesantes en los efectos de un tratamiento prolongado con agentes reductores sulfhidrilo entre VLP de HPV-16_{Tr} y HPV-11 purificadas. En primer lugar, las VLP de HPV-16_{Tr} parecen desensamblarse cuantitativamente a menores niveles de agente reductor y/o a duraciones más cortas de exposición (no se muestran los datos). No es evidente si esto refleja una diferencia genuina entre VLP de HPV-16 y HPV-11 o si se debe al truncamiento C-terminal de la proteína L1 de HPV-16_{Tr}, puesto que en ensayos preliminares se ha observado que el recorte proteolítico del extremo C-terminal de la proteína L1 de HPV-11 también acelera la degradación de VLP en presencia de agente reductor sulfhidrilo. Una característica más interesante es que el tratamiento de VLP de HPV-16_{Tr} purificadas con agente reductor sulfhidrilo parece generar una mezcla de capsómeros, oligómeros de menor tamaño de la proteína L1 y monómeros de L1 en base al análisis de gradiente lineal de sacarosa del 5 al 20% de VLP de HPV-16_{Tr} desensambladas. Sin embargo, tras la eliminación del agente reductor por diálisis, esta mezcla de componentes pequeños y solubles es capaz de reensamblarse en VLP intactas con un rendimiento de \sim90%, como se demuestra por análisis de gradiente lineal de sacarosa del 10 al 65% y como se confirmó mediante análisis microscópico electrónico (no se muestran los datos). Estos resultados demuestran que las VLP pueden desensamblarse a nivel de capsómeros o incluso oligómeros de L1 de menor tamaño y todavía ser competentes para reensamblarse en VLP intactas de tamaño completo, siempre que las condiciones de desensamblaje generen proteínas L1 solubles correctamente plegadas.

TABLA 1

1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2

2

TABLA 3

3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

Conclusiones

Por lo tanto, la presente invención proporciona condiciones exactas para el desensamblaje cuantitativo y el posterior reensamblaje de VLP de Papilomavirus in vitro. Como se ha analizado, intentos previos de desensamblaje de VLP de papiloma estaban en cierta medida influenciados por trabajos realizados en poliomavirus, un papovavirus relacionado, donde se demostró que tanto la reducción de disulfuros como la quelación de iones de calcio eran esenciales para el desensamblaje del virión (Brady et al, J. Virol., (1977)). Sin embargo, era sorprendente descubrir que los bajos niveles de agente reductor (DTT 1-10 mM) óptimos para el desensamblaje de poliomavirus en presencia de bajos niveles de agentes quelantes (por ejemplo EDTA 0,5-10 mM) eran sólo ligeramente eficaces en el desensamblaje de VLP de papiloma (Tabla 1, Li et al, (Ídem) (1997)), aunque se disociaron VLP de L1 de HPV-11 parcialmente tripsinizadas mediante las condiciones anteriores (Li et al, (Ídem) (1997)). Sin embargo, Sapp y colaboradores demostraron que podían generarse capsómeros a partir de VLP de HPV-33 por tratamiento con agente reductor en solitario (DTT 20 mM) aunque no se determinó el grado de degradación de VLP (Sapp et al, (Ídem) 1995)). En los experimentos analizados anteriormente se descubrió que cuando se examinaba el desensamblaje mediante análisis de gradiente, era necesario ensayar la presencia de proteína de L1 en "sedimento". En muchos casos, el examen de fracciones a través del gradiente sugeriría que se había conseguido una buena degradación. Sin embargo, el examen del sedimento, incluso cuando no había sedimento visible, indicaría que un gran porcentaje de la proteína estaba todavía en forma de VLP de tamaño variable o agregado de otra forma, como se confirmaba mediante análisis microscópico electrónico. El desarrollo del ensayo de colchón de sacarosa al 30% permitía explorar varias condiciones de desensamblaje rápidamente e identificar las que desensamblaban sistemáticamente las VLP en componentes solubles de menor tamaño. Se descubrió que el desensamblaje cuantitativo en una solución homogénea de capsómeros individuales (para VLP de HPV-11) o una mezcla de capsómeros y oligómeros de L1 de menor tamaño correctamente plegados y monómeros de L1 (VLP de HPV-16_{Tr}) podía conseguirse sistemáticamente mediante el tratamiento prolongado de VLP no agregadas con altos niveles de agente reductor en tampones de fuerza iónica de moderada a reducida.

Como se ha analizado, la observación de que la quelación de cationes no afectaba sustancialmente al desensamblaje de VLP de HPV-11 era sorprendente ya que contradice estudios anteriores con poliomavirus que indicaban que la quelación de calcio promovía el desensamblaje de viriones y que el calcio añadido podía superar el efecto de quelantes (Brady et al, (Ídem) (1977)). De forma similar, Montross et al, (Ídem) (1991), observaron que las VLP de poliomavirus, que normalmente se ensamblan solamente en el núcleo, podían formarse en el citoplasma después de la adición de un ionóforo de calcio, que presumiblemente aumentaba la concentración de calcio citoplasmático hasta el nivel necesario. Sin embargo, aparentemente el calcio no es importante para la estabilidad de la cápsida de L1 de HPV-11. Por el contrario, el tratamiento con tampón carbonato a un pH alcalino "desensamblaba" VLP de L1 de HPV-11, de forma similar a los resultados observados con viriones de poliomavirus (Brady et al, (Ídem) (1977)). Sin embargo, este tratamiento parece ser más fuerte, ya que no podían regenerarse las VLP mediante diálisis en PBS-NaCl 0,5 M después del tratamiento con carbonato.

El desensamblaje de VLP de HPV-11 mediante tratamiento con carbonato daba como resultado proteína L1 que no reaccionaba con anticuerpos monoclonales específicos de HPV-11 dependientes de estructura. Por el contrario, el desensamblaje de VLP de L1 de HPV-11 mediante reducción prolongada dada como resultado capsómeros que poseían epítopos específicos de estructura que se encuentran en la superficie tanto de VLP de L1 de HPV-11 intactas como de viriones de HPV-11. Estos resultados confirman la idea de que solamente la proteína L1 correctamente plegada conserva la capacidad de reensamblarse en VLP.

Para reensamblar VLP de tamaño completo eficazmente in vitro, los resultados analizados en este documento indican que la integridad estructural, solubilidad y homogeneidad del material de partida son importantes. Después de la generación de una población de capsómeros de este tipo (para VLP de HPV-11) o una mezcla de capsómeros y oligómeros de L1 de menor tamaño correctamente plegados y monómeros de L1 (VLP de HPV-16_{Tr}) por reducción con tiol, el reensamblaje se produce espontáneamente tras la eliminación del agente reductor. El reensamblaje se consiguió por eliminación del agente reductor sulfhidrilo, por métodos cromatográficos en columna o por diálisis contra un gran exceso de tampón, produciendo una población de VLP reensambladas de tamaño completo más homogénea en tamaño que el material de partida de VLP. En estudios anteriores de poliomavirus, Salunke et al, (Ídem) (1989) observaron que el ensamblaje de VLP a partir de capsómeros producía múltiples ensamblajes icosaédricos polimórficos en función de las condiciones de ensamblaje (pH, fuerza iónica y concentración de calcio). Curiosamente, la estructura formada más sistemáticamente era un icosaedro de 24 capsómeros, así como un icosaedro de 12 capsómeros, además del icosaedro de 72 capsómeros de la cápsida viral. Los autores observaron que la formación de enlaces disulfuro podía contribuir al ensamblaje de VLP de polioma pero no era esencial, ya que a una fuerza iónica elevada (sulfato de amonio 2 M) se formaban cápsidas de tamaño variable incluso en presencia de ME 15 mM. De forma similar, Li et al, (Ídem) (1997), han observado que los capsómeros de HPV-11 purificados en columna expresados en E. coli tienen la capacidad de formar estructuras similares a cápsidas NaCl 1 M, de nuevo en presencia de \betaME 15 mM. Sin embargo, aunque las condiciones de alta fuerza iónica favorecen aparentemente cierto grado de formación de cápsidas, es evidente a partir de los estudios que a una fuerza iónica fisiológica, son necesarios enlaces disulfuro para mantener las VLP de L1 de HPV-11 y HPV-16_{Tr} juntas.

Aún dado que las reacciones de desensamblaje se realizaron típicamente a 4ºC sin agitación, es interesante que el desensamblaje máximo requería una exposición prolongada a niveles muy elevados de agente reductor. Como se ha analizado anteriormente, la explicación más probable es que los enlaces disulfuro estabilizantes están enterrados e inaccesibles y que la exposición de estos enlaces al disolvente por fluctuaciones estructurales locales es muy poco frecuente.

La capacidad para reensamblar VLP de tamaño completo en volumen abre varias posibilidades. A altas dosis las VLP reensambladas son capaces de generar anticuerpos neutralizantes de virus como el material de partida de VLP purificadas. Aunque se observan varias partículas de diferentes tamaños y formas en el núcleo de células después de la infección in vivo (Kiselev et al, J. Mol. Biol., 40: 155-171, (1969)), presumiblemente sólo los virus de tamaño completo son productivamente infecciosos. Como se ha analizado, las presentes VLP reensambladas pueden presentar potencialmente mayor estabilidad debido al presente método que proporciona partículas VLP más uniformes. Además, como se ha analizado anteriormente, potencialmente la reacción de reensamblaje puede mejorarse adicionalmente variando las concentraciones de proteína, pH, fuerza iónica y cinética, tanto para optimizar el reensamblaje en un intervalo más amplio de condiciones de partida. Por último, la presente invención permite el empaquetamiento de compuestos exógenos en el interior de VLP realizando la reacción de reensamblaje en presencia de una solución concentrada del compuesto seleccionado. La presente invención, como se ha analizado anteriormente, puede usarse para generar pseudoviriones para el uso como sustitutos de tipos de virus HPV que no están disponibles actualmente o como un sistema de administración para fármacos u otros compuestos dirigidos.

<110> MCCARTHY, MICHAEL P.

\hskip1cm

SUZICH, JOANNE A.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> MÉTODO IN VITRO PARA DESENSAMBLAJE/REENSAMBLAJE DE PARTÍCULAS SIMILARES A VIRUS DE PAPILOMAVIRUS (VLP), COMPOSICIONES HOMOGÉNEAS DE VLP Y CAPSÓMEROS PRODUCIDAS POR DICHOS MÉTODOS; USO DE LAS MISMAS COMO VEHÍCULO PARA UNA PURIFICACIÓN MEJORADA Y ADMINISTRACIÓN DE AGENTES ACTIVOS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 23525.0012

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<240> 09/457.594

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 09-12-1999

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 09/379.615

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 24-08-1999

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 08/923.997

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 05-09-1997

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Papilomavirus humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tacaagacct tttgctgggc aca

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Papilomavirus humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaaggcagga aaatagcaca c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Papilomavirus humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atattgtgtg tcccatctgc g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Papilomavirus humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagcaatttg tacaggcact ac

\hfill

22

Claims (7)

1. Un método para producir una composición que contiene partículas similares a virus (VLP) de papilomavirus homogénea que comprende (i) desensamblar dicha composición que contiene partículas similares a virus con una solución que comprende un agente reductor sulfhidrilo que tiene una fuerza iónica que es de 1,0 M a 1,5 M para desensamblar al menos el 70% de dichas VLP en moléculas de L1 más pequeñas correctamente plegadas; y (ii) reensamblar dichas VLP desensambladas por eliminación u oxidación del agente reductor sulfhidrilo, en el que la concentración del agente reductor usado en la etapa (i) es de al menos el 1% en peso y la partícula similar a virus se pone en contacto con el agente reductor durante al menos 16 horas.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicho agente reductor sulfhidrilo se selecciona del grupo que consiste en glutatión, ditiotreitol, \beta-mercaptoetanol, ditioeritritol, cisteína, sulfuro de hidrógeno y mezclas de los mismos.

3. El método de la reivindicación 1, en el que el agente reductor sulfhidrilo se oxida o se elimina mediante diálisis, diafiltración o cromatografía en columna.

4. El método de la reivindicación 1, en el que las VLP son VLP de papilomavirus humanos.

5. El método de la reivindicación 4, en el que dichas VLP se seleccionan del grupo que consiste en HPV-6; HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-30, HPV-31, HPV-35, HPV-39, HPV-41, HPV-42, HPV-44, HPV-45, HPV-52, HPV-54, HPV-55, HPV-56, HPV-58, HPV-70 y mezclas de los mismos.

6. El método de la reivindicación 1, en el que dicha VLP incluye una proteína L1 o proteína L1 truncada de HPV-16.

7. El método de la reivindicación 1, en el que la concentración del agente reductor usado en la etapa (i) es de al menos el 4% en peso.