JP2020089384A - 融合前rsv fタンパク質およびそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2013年3月13日に提出された米国仮出願第61/780,910号、2013年3月15日に提出された第61/798,389号、2013年7月23日に提出された第61/857,613号、および2013年8月9日に提出された第61/863,909号に対する優先権を主張するものであり、そのそれぞれは参照によりその全体として組み入れられる。
本開示は、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)に対する免疫応答の誘発および検出のための、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、組成物、およびそれらの使用方法に関する。
呼吸器合胞体ウイルス(RSV)は、パラミクソウイルス(Paramyxoviridae)科ニューモウイルス(Pneumovirus)属における、エンベロープを有する非分節型マイナス鎖RNAウイルスである。それは、子どもの間での彼らの生後1年以内における細気管支炎および肺炎の最も一般的な原因である。RSVは、任意の年齢で、とりわけ高齢者、または心臓系、肺系、もしくは免疫系の欠陥を有する人の間で起こり得る、重度の下気道疾患を含む反復性感染症も引き起こす。現在、とりわけ未成熟性、気管支肺異形成症、または先天性心疾患を有する乳児において、RSV感染によって引き起こされる重度の病気を阻止するために受動免疫が用いられている。現在の治療には、RSV中和抗体であるパリビズマブ(SYNAGIS(登録商標);MedImmune, Inc.)の投与が含まれ、それは、RSV融合(F)タンパク質上にある24アミノ酸の直線状の立体構造エピトープに結合する。
本明細書において記載されるように、その融合前立体構造の状態にあるRSV Fタンパク質の三次元構造を解明した。本開示は、その膜遠位先端における特有の抗原部位(「抗原部位φ」)を提示する、RSV Fの融合前立体構造についての原子レベルでの詳細を初めて明らかにしている。融合前Fの三次元構造をガイドとして用いて、融合前Fの安定化形態(「PreF」抗原)を操作しかつ構築し、そして使用して、先行のRSV Fタンパク質ベースの免疫原で達成されたものより何倍も大きく、かつ動物モデルにおけるRSV攻撃に対して防御を提供する、RSV中和免疫応答を生じさせた。PreF抗原は、例えばRSVに対する潜在的ワクチンおよび診断用分子の両方として用いられ得る。
天然RSV Fタンパク質と比較して、非天然ジスルフィド結合を形成するS155CおよびS290C置換を含む組換えRSV Fタンパク質を含む免疫原であって、該組換えRSV Fタンパク質が、RSV F融合前特異的抗体に特異的に結合する、免疫原。
[本発明1002]
組換えRSV Fタンパク質が、SEQ ID NO: 124の、それぞれアミノ酸26〜103および145〜310と少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むF2ポリペプチドおよびF1ポリペプチドを含むかまたはそれらからなる、本発明1001の免疫原。
[本発明1003]
組換えRSV Fタンパク質が、SEQ ID NO: 124の、それぞれアミノ酸26〜103および145〜513と少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むF2ポリペプチドおよびF1ポリペプチドを含むかまたはそれらからなる、本発明1001の免疫原。
[本発明1004]
組換えRSV Fタンパク質が、SEQ ID NO: 124の、それぞれアミノ酸26〜103および145〜529と少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むF2ポリペプチドおよびF1ポリペプチドを含むかまたはそれらからなる、本発明1001の免疫原。
[本発明1005]
組換えRSV Fタンパク質が、SEQ ID NO: 124の、それぞれアミノ酸26〜103および145〜551と少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むF2ポリペプチドおよびF1ポリペプチドを含むかまたはそれらからなる、本発明1001の免疫原。
[本発明1006]
組換えRSV Fタンパク質が、位置190、位置207、または位置190および207において、F、L、W、Y、H、またはM置換をさらに含む、本発明1001〜1005のいずれかの免疫原。
[本発明1007]
組換えRSV Fタンパク質が、S155C、S290C、およびS190F置換、またはS155C、S290C、S190F、およびV207L置換を含む、本発明1006の免疫原。
[本発明1008]
組換えRSV Fタンパク質が、
1つまたは複数の非天然ジスルフィド結合を形成する、位置512および513、位置519および520、または位置526および527のうちの1つまたは複数におけるシステイン置換のペア
をさらに含む、本発明1004〜1007のいずれかの免疫原。
[本発明1009]
組換えRSV Fタンパク質が一本鎖RSV Fタンパク質である、本発明1001〜1008のいずれかの免疫原。
[本発明1010]
D25またはAM22融合前特異的抗体に特異的に結合する、本発明1001〜1009のいずれかの免疫原。
[本発明1011]
F2ポリペプチドおよびF1ポリペプチドが異種ペプチドリンカーによって連結しているかまたは直接連結しており、かつ組換えRSV Fタンパク質がpep27ポリペプチドを含まない、本発明1001〜1010のいずれかの免疫原。
[本発明1012]
組換えRSV Fタンパク質が三量体化ドメインに連結している、本発明1001〜1011のいずれかの免疫原。
[本発明1013]
組換えRSV Fタンパク質がタンパク質ナノ粒子サブユニットに連結している、本発明1001〜1012のいずれかの免疫原。
[本発明1014]
RSV F融合前特異的抗体に特異的に結合する融合前立体構造に組換えRSV Fタンパク質を安定化させる、天然RSV Fタンパク質と比較して少なくとも1個のアミノ酸置換を含む組換えRSV Fタンパク質またはそのフラグメント
を含む単離された免疫原であって、
該免疫原が、該抗体の非存在下で少なくとも24時間生理的pHでリン酸緩衝生理食塩水における20℃でのインキュベーション後に該抗体に特異的に結合し、かつ該抗体が、融合後立体構造の状態にあるRSV Fタンパク質には結合しない、単離された免疫原。
[本発明1015]
組換えRSV Fタンパク質またはそのフラグメントの融合前立体構造が、融合前特異的抗体に特異的に結合する抗原部位φを含み、かつ該抗原部位φが、SEQ ID NO: 1〜184のうちの1つとして明示される天然RSV Fタンパク質配列の残基62〜69および196〜209を含む、本発明1014の免疫原。
[本発明1016]
D25、AM22、5C4、またはMPE8融合前特異的抗体に特異的に結合する、本発明1014または本発明1015の免疫原。
[本発明1017]
天然RSV Fタンパク質が、RSV A、B、またはウシRSV Fタンパク質である、本発明1014〜1016のいずれかの免疫原。
[本発明1018]
組換えRSV Fタンパク質またはそのフラグメントが、F1ポリペプチドおよびF2ポリペプチドを含み、かつ任意で、pep27ポリペプチドまたはその一部を含まない、本発明1014〜1017のいずれかの免疫原。
[本発明1019]
F2およびF1ポリペプチドがそれぞれRSV Fの位置62〜69および196〜209を含み、かつ
該F2ポリペプチドがRSV Fの位置26〜109の8〜84個の残基を含むかまたはそれらからなり、かつ
該F1ポリペプチドがRSV Fの位置137〜529の14〜393個の残基を含むかまたはそれらからなり、
該RSV Fの位置が、SEQ ID NO: 124として明示される参照F0ポリペプチドのアミノ酸配列に対応する、
本発明1018の免疫原。
[本発明1020]
F2ポリペプチドのC末端残基およびF1ポリペプチドのN末端残基が、それぞれRSV Fの位置97および137;97および145;97および150;102および144;102および145;102および146;102および147;103および144;103および145;103および146;103および147;104および144;104および145;104および146;104および147;105および144;105および145;105および146;105および147;または105および150を含む、本発明1019の免疫原。
[本発明1021]
F2およびF1ポリペプチドが、それぞれ26〜109および137〜513;26〜107および137〜513;26〜107および145〜513;26〜105および137〜513;26〜105および145〜513;26〜103および145〜513;26〜109および137〜529;26〜107および137〜529;26〜107および145〜529;26〜105および137〜529;26〜105および145〜529;26〜103および145〜529;46〜103および147〜310;46〜104および146〜310;50〜96および149〜306;51〜103および146〜307;51〜103および139〜307;50〜105および146〜306;または53〜97および148から305〜320の中の1箇所までであるRSV Fの位置を含むかまたはそれらからなる、本発明1019の免疫原。
[本発明1022]
F1およびF2ポリペプチドが、SEQ ID NO: 1〜184のうちのいずれか1つとして明示される天然RSV Fタンパク質配列の対応する配列と少なくとも80%同一である、本発明1018〜1021のいずれかの免疫原。
[本発明1023]
組換えRSV Fタンパク質が一本鎖RSV Fタンパク質であり、かつF2およびF1ポリペプチドが異種ペプチドリンカーによって連結しているかまたは直接連結している、本発明1018〜1022のいずれかの免疫原。
[本発明1024]
F2ポリペプチドの位置105が、F1ポリペプチドの位置145にGly-Serリンカーによって連結している;または
F2ポリペプチドの位置103が、F1ポリペプチドの位置145に直接連結している、
本発明1023の免疫原。
[本発明1025]
異種ペプチドリンカーが、SEQ ID NO: 356〜365もしくは1443〜1453のうちの1つとして明示されるアミノ酸配列を含む、またはG、S、GG、GS、SG、GGG、もしくはGSGリンカーである、本発明1023または本発明1024の免疫原。
[本発明1026]
組換えRSV Fタンパク質が、
(a)システインペア間の非天然ジスルフィド結合;
(b)空洞充填アミノ酸置換;
(c)再パッキングアミノ酸置換;
(d)N結合型グリコシル化部位;または
(e)(a)〜(d)のうちの2つもしくはそれ以上の組み合わせ
によって、RSV Fタンパク質融合前立体構造に安定化されている、本発明1014〜1025のいずれかの免疫原。
[本発明1027]
システインのペアが第1のシステインおよび第2のシステインを含み、かつ第1のシステインが、RSV Fの位置137〜216の中の1箇所にアミノ酸置換によって導入されており、かつ第2のシステインが、RSV Fの位置271〜460の中の1箇所にアミノ酸置換によって導入されている、本発明1026の免疫原。
[本発明1028]
システインのペアが、それぞれがCα炭素およびCβ炭素を含む第1のシステインおよび第2のシステインを含み、かつ
(a)第1のシステインが、RSV Fの位置137〜216または461〜513の中の1箇所にアミノ酸置換によって導入されており、かつ第2のシステインが、RSV Fの位置26〜61、77〜97、または271〜460の中の1箇所にアミノ酸置換によって導入されており;かつ
(b)表1に提供される構造座標によって明示される三次元構造において、各Cβ炭素に対する最適な回転異性体を用いた際、第1のシステイン位置のCα炭素が、第2のシステイン位置のCα炭素から2.0〜8.0Åであり、かつ/または第1のシステイン位置のCβ炭素が、第2のシステイン位置のCβ炭素から2.0〜5.5Åである、本発明1026の免疫原。
[本発明1029]
システインのペアが、それぞれがCα炭素およびCβ炭素を含む第1のシステインおよび第2のシステインを含み、かつ
(a)第1のシステインおよび第2のシステインが、RSV Fの位置137〜216もしくはRSV Fの位置461〜513にアミノ酸置換によって導入されているか;または第1のシステインが、RSV Fの位置137〜216にアミノ酸置換によって導入されており、かつ第2のシステインが、RSV Fの位置461〜513にアミノ酸置換によって導入されており;かつ
(b)表1に提供される構造座標によって明示される三次元構造において、各Cβ炭素に対する最適な回転異性体を用いた際、第1のシステイン位置のCα炭素が、第2のシステイン位置のCα炭素から2.0〜8.0Åであり、かつ/または第1のシステイン位置のCβ炭素が、第2のシステイン位置のCβ炭素から2.0〜5.5Åである、本発明1026の免疫原。
[本発明1030]
非天然ジスルフィド結合が、RSV Fの位置155と290との間のプロトマー内ジスルフィド結合を含む、本発明1026の免疫原。
[本発明1031]
組換えRSV Fタンパク質が、S155CおよびS290C置換を含む、本発明1030の免疫原。
[本発明1032]
組換えRSV Fタンパク質が、SEQ ID NO: 185の残基26〜109および137〜513、残基26〜103および145〜513、または残基26〜105および145〜513と少なくとも80%の同一性を含むアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる、本発明1031の免疫原。
[本発明1033]
位置190、位置207、または位置190および207におけるF、L、W、Y、H、またはM置換を含む空洞充填アミノ酸置換を含む、本発明1026〜1032のいずれかの免疫原。
[本発明1034]
190F;190L;190W;190Y;190H;190M;190Fおよび207L;190Fおよび207F;190Fおよび207W;190Lおよび207L;190Lおよび207F;190Lおよび207W;190Wおよび207L;190Wおよび207F;190Wおよび207W;190Yおよび207L;190Yおよび207F;190Yおよび207W;190Hおよび207L;190Hおよび207F;190Hおよび207W;190Mおよび207L;または190Mおよび207F;190Mおよび207Wのうちの1つを含む空洞充填アミノ酸置換を含む、本発明1033の免疫原。
[本発明1035]
組換えRSV Fタンパク質が、SEQ ID NO: 191の残基26〜109および137〜513、残基26〜103および145〜513、または残基26〜105および145〜513と少なくとも80%の同一性を含むアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる、本発明1034の免疫原。
[本発明1036]
組換えRSV Fタンパク質が、位置155および290におけるシステイン置換間の非天然ジスルフィド結合、ならびに位置190、位置207、または位置190および207におけるF、L、W、Y、H、またはM空洞充填置換を含む、本発明1026の免疫原。
[本発明1037]
組換えRSV Fタンパク質が、S155C、S290C、およびS190F置換、またはS155C、S290C、S190F、およびV207L置換を含む、本発明1036の免疫原。
[本発明1038]
組換えRSV Fタンパク質が、
SEQ ID NO: 185(DS、サブタイプA)、1479(DS、サブタイプB)、371(DS-Cav1、サブタイプA)、372(DSCav1、サブタイプB)、373(DSCav1、ウシ)、374(DS S190F、サブタイプA)、375(DS、S190F、サブタイプB)、または376(DS、S190F、ウシ)のうちの1つにある、それぞれ残基26〜109および137〜513、またはそれぞれ26〜103および145〜513、またはそれぞれ26〜105および145〜513と少なくとも80%の同一性を含むアミノ酸配列
を含むかまたはそれらからなる、本発明1026の免疫原。
[本発明1039]
組換えRSV Fタンパク質が、
SEQ ID NO: 669の残基26〜476(BZGJ9 DS-Cav1)
SEQ ID NO: 706の残基26〜472(BZGJ9-9 DS-Cav1)
SEQ ID NO: 707の残基26〜474(BZGJ9-10 DS-Cav1)
と少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含む、本発明1026の免疫原。
[本発明1040]
F1ポリペプチドが、RSVの位置492から位置510〜529の中の1箇所までを含むRSV α10ヘリックスを含み、かつF1ポリペプチドが、非天然プロトマー間ジスルフィド結合を形成する少なくとも2個のシステイン置換を含む、本発明1026〜1039のいずれかの免疫原。
[本発明1041]
F1ポリペプチドの位置512〜524が、
(SEQ ID NO: 844の残基512〜524)もしくは
(SEQ ID NO: 849の残基512〜524Y)として明示されるアミノ酸配列を含むか;またはF1ポリペプチドの位置512〜529が、
(SEQ ID NO: 853の残基512〜529)として明示されるアミノ酸配列を含む、本発明1040または本発明1041の免疫原。
[本発明1042]
組換えRSV Fタンパク質またはそのフラグメントが、SEQ ID NO: 1〜184のうちのいずれか1つに明示される、以下のRSV F2およびF1位置:
(a)それぞれ56〜97および189〜211;
(b)それぞれ58〜97および192〜242;
(c)それぞれ59〜97および194〜240;
(d)それぞれ60〜75および193〜218;
(e)それぞれ60〜94および192〜229;
(f)それぞれ60〜94および192〜232;
(g)それぞれ60〜94および193〜237;
(h)それぞれ60〜95および192〜240;
(i)それぞれ60〜96および192〜239;
(j)それぞれ60〜97および192〜242;
(k)それぞれ60〜97および194〜239;
(l)それぞれ61〜96および192〜235;
(m)それぞれ61〜96および192〜240;
(n)それぞれ62〜69および196〜209;または
(o)(a)〜(m)のうちのいずれか1つに挙げられたF2およびF1位置の円順列変異(circular permutation)
と少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなり、該RSV F2およびF1位置が異種リンカーによって接合されている、本発明1019の免疫原。
[本発明1043]
組換えRSV Fタンパク質またはそのフラグメントが、SEQ ID NO: 1〜184のうちのいずれか1つに明示される、以下のRSV F2およびF1位置:
(a)それぞれ46〜103および147〜310;
(b)それぞれ46〜104および146〜310;
(c)それぞれ50〜96および149〜306;
(d)それぞれ51〜103および146〜307;
(e)それぞれ51〜103および139〜307;
(f)それぞれ50〜105および146〜306;
(g)53〜97および148から305〜320の中の1箇所まで;または
(h)(a)〜(g)のうちのいずれか1つに挙げられたF2およびF1位置の円順列変異
と少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなり、該RSV F2およびF1位置が種リンカーによって接合されているかまたは直接連結している、本発明1019の免疫原。
[本発明1044]
組換えRSV Fタンパク質が、位置155および290におけるシステイン置換、ならびに位置190、位置207、または位置190および207におけるF、L、W、Y、H、またはM置換を含む、本発明1043の免疫原。
[本発明1045]
組換えRSV Fタンパク質が、S155CおよびS290C置換;S155C、S290C、およびS190F置換;またはS155C、S290C、S190F、およびV207L置換を含む、本発明1044の免疫原。
[本発明1046]
異種リンカーが、SEQ ID NO: 1443〜1455のうちのいずれか1つとして明示されるアミノ酸配列、またはG、S、GG、GS、SG、GGG、もしくはGSGリンカーを含むかまたはそれらからなる、本発明1042〜1044のいずれかの免疫原。
[本発明1047]
組換えRSV Fタンパク質が足場タンパク質に連結している、前記本発明のいずれかの免疫原。
[本発明1048]
RSV F融合前エピトープを含むポリペプチドに共有結合で連結された異種足場タンパク質を含むエピトープ-足場タンパク質を含む免疫原であって、RSV F融合前特異的抗体が該エピトープ-足場タンパク質に特異的に結合する、免疫原。
[本発明1049]
RSV Fタンパク質融合前エピトープが、異種ペプチドリンカーによって連結されたRSV Fの位置62〜69および196〜209、またはその円順列変異体(circular permutant)を含むかまたはそれらからなり、該位置が、SEQ ID NO: 124として明示される参照F0ポリペプチドのアミノ酸配列に対応する、本発明1048の免疫原。
[本発明1050]
異種足場タンパク質が、2KNO、2A90、2W59、3U2E、2VJ1、1CHD、1PQZ、または2MOE足場タンパク質のうちの1つである、本発明1048または本発明1049の免疫原。
[本発明1051]
エピトープ足場タンパク質が、RSV Fタンパク質と少なくとも80%同一なアミノ配列、およびSEQ ID NO: 1053のうちのいずれか1つに明示される足場タンパク質配列を含むかまたはそれらからなる、本発明1050の免疫原。
[本発明1052]
SEQ ID NO: 1040の残基1〜128(TZ-13);
SEQ ID NO: 1053の残基1〜126(JG_2KN0);
SEQ ID NO: 1106の残基1〜187(TZ-19);
SEQ ID NO: 1156の残基27〜247(E-CP_RBD51-307_14mutDS-Cav1_THS);
SEQ ID NO: 1170の残基26〜282(RSVF(+)THS_s_to_hp2_foldon9);
SEQ ID NO: 1188の残基21〜283(MS_08);
SEQ ID NO: 1194の残基27〜553(GSJnh4-TWIN);または
SEQ ID NO: 1212の残基26〜580(GSJnh4Fd-TWIN)
と少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含む、本発明1042または本発明1043の免疫原。
[本発明1053]
組換えRSV Fタンパク質またはそのフラグメントの多量体を含む、前記本発明のいずれかの免疫原。
[本発明1054]
組換えRSV Fタンパク質もしくはそのフラグメントまたはエピトープ足場タンパク質が、三量体化ドメインに連結している、前記本発明のいずれかの免疫原。
[本発明1055]
組換えRSV Fタンパク質のF1ポリペプチドのC末端が、三量体化ドメインに連結している、本発明1054の免疫原。
[本発明1056]
三量体化ドメインがフォルドンドメインである、本発明1054または本発明1055の免疫原。
[本発明1057]
F1ポリペプチドと三量体化ドメインとの間にプロテアーゼ切断部位をさらに含む、本発明1054〜1056のいずれかの免疫原。
[本発明1058]
プロテアーゼ切断部位と三量体化ドメインとの間に膜貫通ドメインをさらに含む、本発明1057の免疫原。
[本発明1059]
三量体化ドメインに連結された組換えRSV Fタンパク質が、
SEQ ID NO: 185(DS、サブタイプA)、1479(DS、サブタイプB)、371(DS-Cav1、サブタイプA)、372(DSCav1、サブタイプB)、373(DSCav1、ウシ)、374(DS S190F、サブタイプA)、375(DS、S190F、サブタイプB)、または376(DS、S190F、ウシ)のうちの1つにある残基26〜109および137〜544、または26〜103および145〜544と少なくとも80%の同一性を含むアミノ酸配列
を含むかまたはそれらからなる、本発明1054の免疫原。
[本発明1060]
三量体化ドメインに連結された組換えRSV Fタンパク質が、
SEQ ID NO: 669の残基26〜476(BZGJ9 DSCav1)
SEQ ID NO: 706の残基26〜472(BZGJ9-9 DSCav1)
SEQ ID NO: 707の残基26〜474(BZGJ9-10 DSCav1)
の残基と少なくとも80%の同一性を含むアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる、本発明1054の免疫原。
[本発明1061]
組換えRSV Fタンパク質もしくはそのフラグメントまたはエピトープ足場タンパク質が、タンパク質ナノ粒子サブユニットに連結している、前記本発明のいずれかの免疫原。
[本発明1062]
組換えRSV Fタンパク質もしくはそのフラグメントまたはエピトープ足場タンパク質のC末端が、タンパク質ナノ粒子サブユニットに連結している、前記本発明のいずれかの免疫原。
[本発明1063]
タンパク質ナノ粒子サブユニットが、フェリチン、エンカプスリン、硫黄オキシゲナーゼレダクターゼ(SOR)、ルマジンシンターゼ、またはピルビン酸デヒドロゲナーゼのナノ粒子サブユニットである、本発明1061または本発明1062の免疫原。
[本発明1064]
フェリチンナノ粒子サブユニットが、SEQ ID NO: 350の残基517〜679と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ任意で、フェリチンポリペプチド内にC31S、C31A、またはC31V置換を含み;
SORサブユニットが、SEQ ID NO: 344またはSEQ ID NO: 345の残基516〜825と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;
ルマジンシンターゼサブユニットが、SEQ ID NO: 346もしくはSEQ ID NO: 348の残基517〜670、またはSEQ ID NO: 347の残基517〜669と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;または
ピルビン酸デヒドロゲナーゼシンターゼサブユニットが、SEQ ID NO: 349の残基516〜757と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
本発明1063の免疫原。
[本発明1065]
フェリチンに連結された組換えRSV Fタンパク質が、SEQ ID NO: 377〜382(A、B、ウシ-DSCav1、およびDS S190Fフェリチン粒子)のうちのいずれか1つの残基26〜105および137〜679と少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなり、フェリチンに連結された組換えRSV Fタンパク質が、融合前特異的抗体に特異的に結合するフェリチンナノ粒子を形成する、本発明1063の免疫原。
[本発明1066]
フェリチンに連結された組換えRSV Fタンパク質が、
SEQ ID NO: 1429の残基28〜664(BZGJ9 DS-Cav1 Longlinkフェリチン);
SEQ ID NO: 1430の残基28〜663(BZGJ9-9 DS-Cav1 Longlinkフェリチン);または
SEQ ID NO: 1431の残基28〜665(BZGJ9-10 DS-Cav1 Longlinkフェリチン)
と少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる、本発明1063の免疫原。
[本発明1067]
SEQ ID NO: 1220の残基56〜500(GSJnh2F);
SEQ ID NO: 1263の残基48〜429(MP11);
SEQ ID NO: 1266の残基56〜536(GSJnh2Fd-F);
SEQ ID NO: 1268の残基56〜526(GSJnh4Fd-F);
SEQ ID NO: 1275の残基53〜256(m0e-resurf1-フェリチン);または
SEQ ID NO: 1281の残基52〜437(LS1-E-CP_RBD51-307_11mutDS-Cav1_THS)
と少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含む、本発明1063の免疫原。
[本発明1068]
組換えRSV Fタンパク質が精製タグに連結している、前記本発明のいずれかの免疫原。
[本発明1069]
組換えRSV Fタンパク質が、生理的pHにおいてリン酸緩衝生理食塩水中で三量体を形成する、前記本発明のいずれかの免疫原。
[本発明1070]
免疫原が、水溶液中でインキュベートされた場合に免疫原の均質集団を形成し、該溶液中でインキュベートされた免疫原の少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、および/または少なくとも95%が、
(a)50℃にて、350mM NaCl pH7.0中で1時間のインキュベーション;
(b)25℃にて、350mM NaCl pH3.5中で1時間のインキュベーション;
(c)25℃にて、350mM NaCl pH10中で1時間のインキュベーション;
(d)25℃にて、10mMモル浸透圧濃度、pH7.0中で1時間のインキュベーション;
(e)25℃にて、3000mMモル浸透圧濃度、pH7.0中で1時間のインキュベーション;もしくは
(f)350mM NaCl pH7.0中で10回の凍結融解サイクル;または
(g)(a)〜(f)のうちの2つもしくはそれ以上の組み合わせ
の後に融合前特異的抗体に特異的に結合し、該免疫原が融合前特異的抗体の非存在下で該溶液中でインキュベートされる、前記本発明のいずれかの免疫原。
[本発明1071]
(a)組換えRSV Fタンパク質またはそのフラグメントが、RSV Fの位置481と489との間またはRSV Fの位置509と510との間にジスルフィド結合を含まず;
(b)組換えRSV Fタンパク質またはそのフラグメントが、RSV Fの位置481、489、509、510、またはそれらの組み合わせにおいてシステイン残基を含まず;
(c)(a)および(b)の組み合わせである、
前記本発明のいずれかの免疫原。
[本発明1072]
本発明1001〜1061のいずれかの免疫原を含む、ウイルス様粒子。
[本発明1073]
本発明1001〜1067のいずれかの免疫原を含む、タンパク質ナノ粒子。
[本発明1074]
タンパク質ナノ粒子が、フェリチンナノ粒子、エンカプスリンナノ粒子、硫黄オキシゲナーゼレダクターゼ(SOR)ナノ粒子、ルマジンシンターゼナノ粒子、またはピルビン酸デヒドロゲナーゼナノ粒子である、本発明1073のタンパク質ナノ粒子。
[本発明1075]
モノクローナル抗体D25またはAM22のFabが、1μMまたはそれ未満のKdで免疫原、ウイルス様粒子、またはタンパク質ナノ粒子に特異的に結合する、本発明1001〜1074のいずれかの免疫原、ウイルス様粒子、またはタンパク質ナノ粒子。
[本発明1076]
本発明1001〜1075のいずれかの免疫原またはタンパク質ナノ粒子をコードする核酸分子。
[本発明1077]
核酸分子が、免疫原またはタンパク質ナノ粒子の前駆体タンパク質をコードする、本発明1076の核酸分子。
[本発明1078]
前駆体タンパク質が、N末端からC末端方向に、シグナルペプチド、F2ポリペプチド、Pep27ポリペプチド、およびF1ポリペプチドを含む、本発明1077の核酸分子。
[本発明1079]
ヒトまたはウシ細胞内での発現にコドン最適化された、本発明1076〜1078のいずれかの核酸分子。
[本発明1080]
プロモーターに機能的に連結された、本発明1076〜1079のいずれかの核酸分子。
[本発明1081]
本発明1080の核酸分子を含む、ベクター。
[本発明1082]
ウイルスベクターである、本発明1081のベクター。
[本発明1083]
ウシパラインフルエンザウイルスベクター、ヒトパラインフルエンザウイルスベクター、ニューカッスル病ウイルスベクター、センダイウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、弱毒化RSVベクター、パラミクソウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ベネズエラウマ脳炎ベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、水疱性口内炎ウイルスベクター、ピコルナウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターである、本発明1082のウイルスベクター。
[本発明1084]
SEQ ID NO: 383、SEQ ID NO: 384、SEQ ID NO: 385、またはSEQ ID NO: 386として明示されるヌクレオチド配列を含む、本発明1076〜1083のいずれかの核酸分子またはベクター。
[本発明1085]
本発明1081〜1082のいずれかのベクターを含む、単離された宿主細胞。
[本発明1086]
本発明1001〜1084のいずれかの免疫原、ウイルス様粒子、タンパク質ナノ粒子、核酸分子、またはベクターの有効量、および薬学的に許容される担体を含む、免疫原性組成物。
[本発明1087]
アジュバントをさらに含む、本発明1086の免疫原性組成物。
[本発明1088]
アジュバントが、alum、水中油型組成物、MF59、AS01、AS03、AS04、MPL、QS21、CpGオリゴヌクレオチド、TLR7アゴニスト、TLR4アゴニスト、TLR3アゴニスト、またはそれらのうちの2つもしくはそれ以上の組み合わせである、本発明1087の免疫原性組成物。
[本発明1089]
アジュバントがTh1免疫応答を促進する、本発明1087の免疫原性組成物。
[本発明1090]
組成物中の免疫原、ウイルス様粒子、またはタンパク質ナノ粒子の少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、および/または少なくとも98%が、生理的pHかつ4℃で少なくとも24時間および/または少なくとも1週間リン酸緩衝生理食塩水中でのインキュベーション後に融合前特異的抗体に特異的に結合する、本発明1086〜1089のいずれかの免疫原性組成物。
[本発明1091]
組成物中の免疫原、エピトープ足場タンパク質、またはタンパク質ナノ粒子の少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または少なくとも95%が、
(a)50℃にて、350mM NaCl pH7.0中で1時間のインキュベーション;
(b)25℃にて、350mM NaCl pH3.5中で1時間のインキュベーション;
(c)25℃にて、350mM NaCl pH10中で1時間のインキュベーション;
(d)25℃にて、10mMモル浸透圧濃度、pH7.0中で1時間のインキュベーション;
(e)25℃にて、3000mMモル浸透圧濃度、pH7.0中で1時間のインキュベーション;もしくは
(f)350mM NaCl pH7.0中で10回の凍結融解サイクル;または
(g)(a)〜(f)のうちの2つもしくはそれ以上の組み合わせ
の後に融合前特異的抗体に特異的に結合する、本発明1086〜1090のいずれかの免疫原性組成物。
[本発明1092]
RSV Fタンパク質サブタイプAおよびBに基づく組換えRSV Fタンパク質またはそのフラグメントの混合物を含む、本発明1086〜1091のいずれかの免疫原性組成物。
[本発明1093]
免疫原に特異的に結合するRSV F融合前特異的抗体をさらに含む、本発明1086〜1092のいずれかの免疫原性組成物。
[本発明1094]
免疫応答を生じさせるために本発明1086〜1093のいずれかの免疫原性組成物の有効量を対象に投与する工程を含む、対象においてRSV Fに対する免疫応答を生じさせるための方法。
[本発明1095]
免疫応答がTh1免疫応答を含む、本発明1094の方法。
[本発明1096]
本発明1086〜1093のいずれかの免疫原性組成物の治療上有効量を対象に投与し、それによって対象におけるRSV感染症を治療するまたは阻止する工程を含む、対象におけるRSV感染症を治療するまたは阻止するための方法。
[本発明1097]
免疫原性組成物のプライム-ブースト投与を含む、本発明1094〜1096のいずれかの方法。
[本発明1098]
抗RSV剤の治療上有効量を対象に投与する工程をさらに含む、本発明1094〜1097のいずれかの方法。
[本発明1099]
本発明1001〜1075のいずれかの免疫原、ウイルス様粒子、またはタンパク質ナノ粒子の有効量を提供する工程;
組換えRSV Fタンパク質またはタンパク質ナノ粒子とRSV F結合抗体との間で免疫複合体を形成するのに十分な条件下で、対象由来の生物学的サンプルを組換えRSV Fタンパク質またはタンパク質ナノ粒子と接触させる工程;および
免疫複合体を検出し、それによって対象におけるRSV F結合抗体を検出するまたは単離する工程
を含む、対象におけるRSV F結合抗体を検出するまたは単離するための方法。
[本発明1100]
対象が、RSV感染症の危険性があるまたはRSV感染症を有する、本発明1094〜1099のいずれかの方法。
[本発明1101]
RSV感染症が、ヒトRSVサブタイプA、ヒトRSVサブタイプB、またはウシRSVの感染症である、本発明1100の方法。
[本発明1102]
対象がヒトまたは獣医学的対象である、本発明1094〜1101のいずれかの方法。
[本発明1103]
対象が、1歳未満、65歳を上回る、または妊娠している、本発明1094〜1101のいずれかの方法。
[本発明1104]
対象が、出産可能な年齢の女性、学齢期の子ども、2〜5歳、生後6〜12ヶ月、または生後6ヶ月未満である、本発明1094〜1101のいずれかの方法。
[本発明1105]
本発明1001〜1093のいずれかの免疫原、ウイルス様粒子、タンパク質ナノ粒子、核酸分子、ベクター、宿主細胞、または免疫原性組成物、およびキットを使用するための指示書を含む、キット。
[本発明1106]
対象におけるRSV感染症を阻害するまたは阻止するための、本発明1001〜1093のいずれかの免疫原、ウイルス様粒子、タンパク質ナノ粒子、核酸分子、ベクター、または免疫原性組成物の使用。
[本発明1107]
対象においてRSV Fタンパク質に対する免疫応答を誘導するための、本発明1001〜1093のいずれかの免疫原、ウイルス様粒子、タンパク質ナノ粒子、核酸分子、ベクター、または免疫原性組成物の使用。
態様についての前述のおよび他の目的、特長、および利点は、添付の図を参照して進む以下の詳細な説明からより明白になるであろう。
添付の配列表に挙げられる核酸およびアミノ酸配列は、米国特許法施行規則1.822条において規定されるように、ヌクレオチド塩基に対する標準的な文字略語、およびアミノ酸に対する3文字コードを用いて示されている。各核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、相補鎖は、呈示された鎖への任意の言及によって含まれると理解される。配列表は、2014年3月12日に作成された「Sequence.txt」(約3.2MB)と名付けられたファイルの形態でASCIIテキストファイルとして提出されており、かつ参照により本明細書に組み入れられる。添付の配列表における配列の説明は以下の通りである。
D25 Fabによって結合されたRSV Fタンパク質の結晶構造の原子座標は、参照によりその全体として本明細書に組み入れられる、2013年3月13日に提出された米国仮出願第61/780,910号の表1に列挙されている。D25 Fabによって結合されたRSV Fタンパク質の結晶構造のこれらの原子座標は、蛋白質構造データバンク(Protein Data Bank)アクセッション番号4JHWとして寄託もされており、それは、2013年5月1日にそのデータベースに存在しているものとして参照により本明細書に組み入れられる。
RSV F糖タンパク質は、ウイルス膜と細胞膜との融合を促すI型融合タンパク質である(Walsh and Hruska, J. Virol., 47, 171 (1983))。初期合成の後、RSV Fは、折り畳みエネルギーを蓄える準安定性融合前立体構造をとり、それは、宿主細胞膜との接触後、構造再編成の間に高度に安定した融合後立体構造へと解放される。RSV Fタンパク質上の3つの抗原部位(I、II、およびIV)は、中和活性を誘発することが見出されており(Arbiza et al., J. Gen. Virol., 73, 2225 (1992);Lopez et al., J. Virol., 72, 6922 (1998);Lopez et al., J. Virol., 64, 927 (1990))、かつすべては、構造的および生物物理学的な調査によって判定されるように、RSV Fタンパク質の融合後形態上に存在する(McLellan et al., J. Virol., 85, 7788 (2011);Swanson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 108, 9619 (2011))。しかしながら、融合後RSV Fを用いたヒト血清の吸収は、F特異的中和活性の大部分を除去できず、これによりRSV Fの融合前形態が新規な中和抗原部位を持つことが示唆される(Magro et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 109, 3089 (2012))。
別様に付記されていない限り、技術的用語は従来的使用法に従って用いられる。分子生物学における共通用語の定義は、Oxford University Pressによって刊行されたBenjamin Lewin, Genes VII, 1999;Blackwell Science Ltd.によって刊行されたKendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, 1994;およびVCH Publishers, Inc.によって刊行されたRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, 1995;ならびに他の同様の参考文献に見出され得る。
N末端−A鎖−リンカー−B鎖−リンカー−C鎖−リンカー−D鎖−C末端
を有する、A、B、C、およびD鎖を備えた4本鎖逆平行シートに関して、鎖間のリンカー接続を変更することによる4本の鎖A、B、C、およびDの円順列変異体には、
変更されたN末端およびC末端を備えた順列:
N末端−C鎖−リンカー−D鎖−リンカー−A鎖−リンカー−B鎖−C末端
保たれたN末端を備えた順列:
N末端−A鎖−リンカー−D鎖−リンカー−C鎖−リンカー−B鎖−C末端
保たれたC末端を備えた順列:
N末端−C鎖−リンカー−B鎖−リンカー−A鎖−リンカー−D鎖−C末端
が含まれると考えられる。
1)アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T);
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4)アルギニン(R)、リジン(K);
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);および
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)
として明示されるT4フォルドンドメインである。いくつかの態様は、例えばフォルドンドメインに近接した、切断目的で用いられ得るトロンビン切断部位の組み入れによって、精製タンパク質から切断され得るフォルドンドメインを含む。
RSV Fタンパク質は、その融合前および融合後の立体構造間で劇的な構造再編成を受けることが本明細書において開示される(下記の実施例1を参照されたい)。図2Bに示されるように、融合前立体構造におけるF1ポリペプチドのN末端領域(図2Aに示される膜遠位ローブに部分的に対応する)は、表示されるα2、α3、β3、β4、およびα4のヘリックスおよびβシート構造を含み、一方で融合後構造におけるF1ポリペプチドのN末端の対応する領域は、伸長したα5ヘリックス構造を含む。さらに、融合前立体構造におけるF1ポリペプチドのC末端領域(図2Aに示される膜近位ローブに部分的に対応する)は、表示されるβ22、α9、およびβ23のβシートおよびヘリックス構造を含み、一方で融合後立体構造の構造におけるF1ポリペプチドの対応するC末端領域は、伸長したα10ヘリックス構造を含む。ゆえに、その融合前立体構造の状態にあるRSV Fタンパク質の膜遠位および膜近位ローブは、その融合後立体構造の状態にあるRSV Fタンパク質の対応する領域には欠如しているいくつかの個別の構造要素を含む。図2において、F1ポリペプチドの位置137〜216および461〜513を含む、これらの領域に対応するアミノ酸位置(および配列)は灰色で強調表示されている。
種々のRSVグループ由来の天然RSV Fタンパク質、ならびにそのようなタンパク質をコードする核酸配列および方法は公知である。例えば、いくつかのサブタイプA、B、およびウシ前駆体RSV F0タンパク質の配列は、SEQ ID NO: 1〜184として提供されている。これらの配列のそれぞれに対するGenInfo Identifier(gi)および対応するアクセッション番号、ならびに対応するRSVグループは、表3に提供されている。
融合前立体構造に安定化された組換えRSV Fタンパク質を含む、単離された抗原が本明細書において開示される(「PreF抗原」)。PreF抗原には、免疫原性を増加させるように天然形態から改変されている組換えRSV Fタンパク質またはそのフラグメントが含有される。例えば、開示される組換えRSV Fタンパク質は、融合前立体構造に安定化するように天然RSV配列から改変されている。当業者であれば、開示されるPreF抗原は、脊椎動物(哺乳類、例えばヒトおよび畜牛など)において、RSV(例えば、RSV A、RSV B、またはウシRSV)に対する免疫原性応答を誘導するのに有用であることを解するであろう。ゆえに、いくつかの態様において、開示される抗原は免疫原である。
(a)50℃にて、350mM NaCl pH7.0中で1時間のインキュベーション;
(b)25℃にて、350mM NaCl pH3.5中で1時間のインキュベーション;
(c)25℃にて、350mM NaCl pH10中で1時間のインキュベーション;
(d)25℃にて、10mMモル浸透圧濃度、pH7.0中で1時間のインキュベーション;
(e)25℃にて、3000mMモル浸透圧濃度、pH7.0中で1時間のインキュベーション;
(g)(a)〜(e)のうちの2つもしくはそれ以上の組み合わせ;または
(a)および(b);(a)および(c);(a)および(d);(a)および(e);(b)および(d);(b)および(e);(c)および(d);(c)および(e);(a)、(b)および(d);(a)、(c)および(d);(a)、(b)および(e);もしくは(a)、(c)および(e)の組み合わせ
の後に、RSV Fタンパク質融合前特異的抗体(D25またはAM22など)に特異的に結合する。
本明細書において開示されるPreF抗原は、融合前立体構造に安定化された組換えRSV Fタンパク質を含み、かつF1ポリペプチドおよびF2ポリペプチドを含む。F1ポリペプチド、F2ポリペプチド、またはその両方は、組換えRSV Fタンパク質をその融合前立体構造に安定化させる少なくとも1つの改変(例えば、アミノ酸置換)を含み得る。いくつかの態様において、F2ポリペプチドおよびF1ポリペプチドは、ペプチドリンカーによって連結している(例えば、一本鎖RSV Fタンパク質を含む態様において)。融合前立体構造での組換えRSV Fタンパク質の安定化により、RSV F融合前特異的モノクローナル抗体(すなわち、融合前立体構造の状態にあるRSV Fタンパク質に特異的に結合するが、融合後立体構造には結合しない抗体)に特異的に結合する少なくとも1種の融合前特異的エピトープ(すなわち、RSV Fタンパク質の融合前(融合後ではない)立体構造に存在しているエピトープ)が維持される。ゆえに、開示されるPreF抗原は、融合前特異的抗体(例えば、D25またはAM22抗体)によって特異的に結合され、かつ/またはRSV F融合前特異的立体構造(抗原部位φなど)を含む。
本明細書において開示されるように、RSV Fタンパク質は、その融合前および融合後の立体構造間で構造再編成を受ける。図2Bに示されるように、融合前立体構造におけるF1ポリペプチドのN末端領域(図2Aに示される膜遠位ローブに部分的に対応する)は、表示されるα2、α3、β3、β4、およびα4のヘリックスおよびβシート構造を含み、一方で融合後構造におけるF1ポリペプチドのN末端の対応する領域は、伸長したα5ヘリックス構造を含み、該α2、α3、β3、β4、およびα4のヘリックスおよびβシート構造は欠如している。さらに、融合前立体構造におけるF1ポリペプチドのC末端領域(図2Aに示される膜近位ローブに部分的に対応する)は、表示されるβ22、α9、およびβ23のβシートおよびヘリックス構造を含み、一方で融合後立体構造の構造におけるF1ポリペプチドの対応するC末端領域は、伸長したα10ヘリックス構造および伸長したコイルを含み、該β22、α9、およびβ23のβシートおよびヘリックス構造は欠如している。ゆえに、その融合前立体構造の状態にあるRSV Fタンパク質の膜遠位および膜近位ローブは、その融合後立体構造の状態にあるRSV Fタンパク質の対応する領域には欠如しているいくつかの個別の構造要素を含む。
いくつかの態様において、PreF抗原には、架橋システイン残基のペアを含む少なくとも1つの非天然ジスルフィド結合によって融合前立体構造に安定化された組換えRSV Fタンパク質が含まれる。非天然ジスルフィド結合は、天然RSV Fタンパク質には存在せず、タンパク質操作によって(例えば、非天然ジスルフィド結合を形成する、1個または複数個の置換されたシステイン残基を含めることによって)導入されるものである。例えば、一部の態様において、開示される組換えRSV Fタンパク質のいずれかは、架橋システイン残基のペアを含む、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のジスルフィド結合のうちのいずれか1つによって融合前立体構造に安定化されている。具体的な非限定的な一例において、組換えRSV Fタンパク質は、架橋システイン残基の単一ペアによって融合前立体構造に安定化されている。別の非限定的な例において、開示される組換えRSV Fタンパク質のいずれかは、架橋システイン残基の2つのペアによって融合前立体構造に安定化されている。
融合後RSV Fタンパク質の構造(例えば、McLellan et al., J. Virol., 85, 7788, 2011に開示されるものに開示される)に対する、RSV Fタンパク質の融合前立体構造(例えば、本明細書において開示されるD25 Fabと複合した)の構造比較により、Fが融合後立体構造に移行するために崩壊するに違いない、融合前立体構造におけるいくつかの内部空洞またはポケットが同定される。これらの空洞には、表6に挙げられるものが含まれる。
一部の態様において、PreF抗原には、1個または複数個の再パッキングアミノ酸置換によって、融合前立体構造に安定化された組換えRSV Fタンパク質が含まれる。再パッキング置換は、タンパク質におけるアミノ酸間の引力的相互作用(疎水性相互作用または水素結合形成など)を増加させる、または反発性相互作用(同様に帯電した残基のクラスター間の反発力など)を減少させる。
融合後RSV Fタンパク質の構造(例えば、McLellan et al., J. Virol., 85, 7788, 2011に開示されるものに開示される)に対する、RSV Fタンパク質の融合前立体構造(例えば、本明細書において開示されるD25またはAM22と複合した)の構造比較により、本明細書において記載される融合前RSV F立体構造において溶媒接触可能であるが、融合後RSV F立体構造(McLellan et al., J. Virol., 85, 7788, 2011に開示される)においては溶媒接触不能である、RSV Fタンパク質のいくつかの領域が同定される。
当業者であれば、PreF抗原には、1つまたは複数のジスルフィド結合を導入する、RSV Fタンパク質内の空洞を充填する、RSV Fタンパク質における残基のパッキングを変更する、N結合型グリコシル化部位を導入するアミノ酸置換の組み合わせなど、本明細書において記載される安定化アミノ酸置換のうちの1つまたは複数の組み合わせによって、融合前立体構造に安定化された組換えRSV Fタンパク質が含まれ得ることを解するであろう。例えば、いくつかの態様において、組換えRSV Fタンパク質は、ジスルフィド結合を導入するアミノ酸置換、およびRSV Fタンパク質内の空洞を充填するアミノ酸置換を含む。
いくつかの態様において、PreF抗原には、膜に固定された形態の組換えRSV Fタンパク質(例えば、膜貫通ドメインを有する)が含まれる。他の態様において、PreF抗原には、可溶性形態の組換えRSV Fタンパク質(例えば、膜貫通ドメインまたは他の膜アンカーを有しない)が含まれる。下記に論じられるものを含む、可溶性のまたは膜に固定された組換えRSV Fタンパク質を生成するためのいくつかの異なる手法があることは理解されるであろう。例には、三量体化ドメインの導入、F1のC末端領域を安定化させるジスルフィド結合を形成し得るシステインペアの導入、および膜貫通ドメインの導入(例えば、膜に固定されたPreF抗原を含む適用のための)が含まれる。
いくつかの態様において、PreF抗原は三量体化ドメインに連結されており、例えばPreF抗原には、そのC末端に連結された三量体化ドメインを有するF1ポリペプチドを含む組換えRSV Fタンパク質が含まれ得る。一部の態様において、三量体化ドメインは、組換えRSV Fタンパク質における3つのF1/F2単量体の三量体化を促進する。いくつかの外因性多量体化ドメイン:GCN4ロイシンジッパー(Harbury et al. 1993 Science 262:1401-1407)、肺サーファクタントタンパク質由来の三量体化モチーフ(Hoppe et al. 1994 FEBS Lett 344:191-195)、コラーゲン(McAlinden et al. 2003 J Biol Chem 278:42200-42207)、およびファージT4フィブリチンフォルドン(Miroshnikov et al. 1998 Protein Eng 11:329-414)は、可溶性組換えタンパク質の安定した三量体を促進し、PreF抗原が融合前特異的抗体(例えば、D25またはAM22抗体)によって特異的に結合されかつ/またはRSV F融合前特異的立体構造(抗原部位φなど)を含む限り、そのうちのいずれかをPreF抗原におけるF1ポリペプチドに連結させて、組換えFタンパク質の三量体化を促進することができる。
などのT4フィブリチンフォルドンドメインであり、それはβプロペラ立体構造をとり、自律的に折り畳まれ得かつ三量体化し得る(Tao et al. 1997 Structure 5:789-798)。
一部の態様において、PreF抗原には、組換えRSV Fタンパク質の膜近位ローブを安定化させるために用いられる1つまたは複数のジスルフィド結合を含むF1ポリペプチドを含む組換えRSV Fタンパク質が含まれる。ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を、1個または複数個のアミノ酸置換によって、組換えRSV Fタンパク質内に導入することができる。
(SEQ ID NO: 844の残基512〜524)または
(SEQ ID NO: 849の残基X〜Y)、または
(SEQ ID NO: 853の残基512〜529)
のうちの1つとして明示されるアミノ酸配列を含む。
一部の態様において、組換えRSV Fタンパク質は、例えば膜に固定されたPreF抗原を含む適用のために、F1ポリペプチドに連結された膜貫通ドメインを含む。例えば、膜貫通配列の存在は、膜小胞調製ための膜貫通タンパク質としての発現に有用である。膜貫通ドメインを、本明細書において提供される安定化変異のいずれかを含有するF1タンパク質、例えばS155C/S290Cシステイン置換を有するF1タンパク質など、上記で記載されるものに連結させることができる。加えて、膜貫通ドメインを、RSV F1細胞質テールにさらに連結させることができる。シグナルペプチド、F2ポリペプチド(位置26〜109)、pep27ポリペプチド(位置110〜136)、F1ポリペプチド(位置137〜513)、RSV膜貫通ドメインを含む例は、SEQ ID NO: 323(細胞質ドメインを有しない)およびSEQ ID NO: 324(細胞質ドメインを有する)として提供されている。
一部の態様において、PreF抗原には、組換えRSV Fタンパク質の膜近位ローブを安定化させるために用いられる1個または複数個の空洞充填置換を含むF1ポリペプチドを含む組換えRSV Fタンパク質が含まれる。一部の態様において、PreF抗原には、V207L、ならびにL512F;L513F;L512FおよびL513F;L512YおよびL513Y;L512FおよびL513Y;L512WおよびL513W;L5132WおよびL513Y;S509W;S509F;S509WおよびL512F;またはS509W、L512F、およびL513F置換を有するF1ポリペプチドを含む組換えRSV Fタンパク質が含まれ、該PreF抗原は、融合前特異的抗体(例えば、D25またはAM22抗体)によって特異的に結合され、かつ/またはRSV F融合前特異的立体構造(抗原部位φなど)を含む。そのような置換を有する例示的な配列には、SEQ ID NO: 672〜682が含まれる。
一部の態様において、PreF抗原には、融合前立体構造に安定化されており、かつ抗原部位φ以外の公知の抗原部位を排除するさらなる改変を含む組換えRSV Fタンパク質が含まれる。例えば、組換えRSV Fタンパク質は、抗原部位I、II、またはIVを妨害する改変を含み得る。そのような改変は、例えばこれらの部位に特異的な抗体の結合によって同定され得る。
一部の態様において、組換えRSV Fタンパク質は、RSV F1ポリペプチドおよびRSV F2ポリペプチドを含む単一ポリペプチド鎖を含む、一本鎖RSV Fタンパク質である。開示される一本鎖RSV Fタンパク質は、RSV Fタンパク質のpep27ポリペプチドに隣接するフーリン切断部位を含まず、したがって、細胞内で産生された場合に、Fポリペプチドは、別個のF1およびF2ポリペプチドに切断されない。いくつかの態様において、F1およびF2ポリペプチドの残りの部分は、ペプチドリンカーなどのリンカーによって接合されている。
RSV Fの部位φエピトープは、三量体スパイクの先端に位置し、3種の中和抗体D25、AM22、および5C4によって認識される領域を含む。より具体的には、RSV F/D25複合体の結晶構造によって描出されるように、このエピトープは、ヘリックスα4の外表面(残基196〜209)、ならびにβ2およびα1間の近接ループ(残基63〜68)を含む。RSV Fタンパク質のこれらの最小局面を含み、そして例えばRSVに対する免疫応答を誘導するのに有用であり、かつRSV Fタンパク質抗体への特異的結合にも、例えばそのような抗体を同定するまたは検出するプローブとして有用である免疫原が本明細書において提供される。
一部の態様において、融合前立体構造に安定化された開示される組換えRSV Fタンパク質を含む、ウイルス様粒子(VLP)が提供される。VLPは、ウイルス複製に必要とされるウイルス構成要素を欠いており、ゆえにウイルスの高度に弱毒化された形態に相当する。VLPは、対象に投与された場合に、RSVに対する免疫応答を誘発し得るポリペプチド(例えば、融合前立体構造に安定化された組換えRSV Fタンパク質)を呈示し得る。ウイルス様粒子およびそれらの産生の方法は公知でありかつ当業者によく知られており、そしてヒトパピローマウイルス、HIV(Kang et al., Biol. Chem. 380:353-64 (1999))、セムリキ森林ウイルス(Notka et al., Biol. Chem. 380:341-52 (1999))、ヒトポリオーマウイルス(Goldmann et al., J. Virol. 73:4465-9 (1999))、ロタウイルス(Jiang et al., Vaccine 17:1005-13 (1999))、パルボウイルス(Casal, Biotechnology and Applied Biochemistry, Vol 29, Part 2, pp 141-150 (1999))、イヌパルボウイルス(Hurtado et al., J. Virol. 70:5422-9 (1996))、E型肝炎ウイルス(Li et al., J. Virol. 71:7207-13 (1997))、およびニューカッスル病ウイルスを含む、いくつかのウイルス由来のウイルスタンパク質はVLPを形成することが知られている。例えば、RSV抗原を含有するキメラVLPは、ニューカッスル病ウイルスベースのVLPであり得る。ニューカッスル病ベースのVLPは、マウスにおいて、RSVに対する中和免疫応答を誘発することが以前に示されている。そのようなVLPの形成は、任意の適切な技術によって検出され得る。培地中のVLPの検出のための、当技術分野において公知の適切な技術の例には、例えば電子顕微鏡法技術、動的光散乱(DLS)、選択的クロマトグラフィー分離(例えば、VLPのイオン交換、疎水性相互作用、および/またはサイズ排除クロマトグラフィー分離)、および密度勾配遠心分離が含まれる。
一部の態様において、融合前立体構造に安定化された開示される組換えRSV Fタンパク質のうちの1種または複数種を含むタンパク質粒子が提供され、該タンパク質ナノ粒子は、融合前特異的抗体(例えば、D25またはAM22抗体)によって特異的に結合され、かつ/またはRSV F融合前特異的立体構造(抗原部位φなど)を含む。ナノ粒子の非限定的な例には、フェリチンナノ粒子、エンカプスリンナノ粒子、および硫黄オキシゲナーゼレダクターゼ(SOR)ナノ粒子が含まれ、それらは、それぞれフェリチンタンパク質、エンカプスリンタンパク質、およびSORタンパク質を含む単量体サブユニットの会合体から構成される。融合前立体構造に安定化された開示される組換えRSV Fタンパク質を含むタンパク質ナノ粒子を構築するために、抗原をタンパク質ナノ粒子(フェリチンタンパク質、エンカプスリンタンパク質、またはSORタンパク質など)のサブユニットに連結させる。融合タンパク質は、適当な条件下でナノ粒子に自己会合する。
開示されるPreF抗原(例えば、融合前立体構造に安定化された組換えRSV Fタンパク質、もしくはエピトープ-足場タンパク質、またはそのようなタンパク質を含有するウイルス様粒子もしくはタンパク質ナノ粒子)をコードするポリヌクレオチドも提供される。これらのポリヌクレオチドには、該抗原をコードするDNA、cDNA、およびRNA配列が含まれる。
融合前立体構造に安定化された組換えRSV Fタンパク質をコードする核酸分子を、例えば宿主細胞内での抗原の発現のために、または本明細書において開示される、対象の免疫のために、ウイルスベクター内に含めることができる。一部の態様において、ウイルスベクターを、プライム-ブーストワクチン接種の一部として対象に投与する。いくつかの態様において、ウイルスベクターを、プライム-ブーストワクチン接種における使用のためのプライマーワクチンまたはブースターワクチンなどのワクチン内に含める。
開示されるPreF抗原、ウイルスベクター、および核酸分子を、治療的および予防的製剤を含む薬学的組成物中に含めることができ、かつ1種または複数種のアジュバント、および任意で、抗ウイルス薬などの他の治療用成分と一緒に組み合わせることができる。いくつかの態様において、開示されるPreF抗原、ウイルスベクター、または核酸分子のうちの1つまたは複数を含む組成物は、免疫原性組成物である。組成物は、本明細書において開示される組換えRSV Fタンパク質、(本明細書において開示される組換えRSV Fタンパク質のいずれかを含むタンパク質ナノ粒子など)、本明細書において開示される組換えRSV Fタンパク質のいずれかを含むウイルス様粒子、本明細書において開示される組換えRSV Fタンパク質のいずれかをコードする核酸分子、または本明細書において開示される組換えRSV Fタンパク質のいずれかをコードするもしくは含むベクターを含む、PreF抗原のいずれかを含み得る。
いくつかの態様において、開示されるPreF抗原、またはPreF抗原をコードする、発現する、もしくは含む核酸もしくはウイルスベクターを用いて、対象においてRSVに対する免疫応答を誘導する。ゆえに、いくつかの態様において、開示されるPreF抗原、または該抗原をコードする、発現する、もしくは含む核酸もしくはウイルスベクターのうちの1つまたは複数を含む免疫原性組成物の治療上有効量を対象に投与して、RSVに対する免疫応答を生じさせることができる。
キットも提供される。例として、対象におけるRSV感染症を治療するもしくは阻止するためのキット、または対象の血清におけるRSV Fタンパク質融合前特異的抗体の存在を検出するためのキットが挙げられる。キットは、典型的に、PreF抗原、または該抗原をコードする、発現する、もしくは含む核酸もしくはウイルスベクターのうちの1つまたは複数を含む。
さらなる態様が、2013年8月8日に提出された、優先米国仮出願第61/863,909号の135〜158ページのH節において開示されており、それは参照によりその全体が本明細書に具体的に組み入れられる。
RSV F融合前特異的抗体に特異的に結合する融合前立体構造に組換えRSV Fタンパク質を安定化させる、天然RSV Fタンパク質と比較して少なくとも1個のアミノ酸置換を含む組換えRSV Fタンパク質またはそのフラグメント
を含む単離された免疫原であって、該抗体が、融合後立体構造の状態にあるRSV Fタンパク質には特異的に結合しない、単離された免疫原。
抗体の非存在下で少なくとも24時間生理的pHでリン酸緩衝生理食塩水における20℃でのインキュベーション後に該抗体に特異的に結合する免疫原。
組換えRSV Fタンパク質またはそのフラグメントの融合前立体構造が、融合前特異的抗体に特異的に結合する抗原部位φを含み、かつ該抗原部位φが、SEQ ID NO: 1〜184のうちの1つとして明示される天然RSV Fタンパク質配列の残基62〜69および196〜209を含む、条項1または条項2の免疫原。
D25、AM22、5C4、またはMPE8融合前特異的抗体に特異的に結合する、条項1〜3のいずれか一項の免疫原。
天然RSV Fタンパク質が、ヒトサブタイプA、ヒトサブタイプB、またはウシのRSV Fタンパク質である、条項1〜4のいずれか一項の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質またはそのフラグメントが、F1ポリペプチドおよびF2ポリペプチドを含み、かつ任意で、pep27ポリペプチドまたはその一部を含まない、条項1〜5のいずれか一項の免疫原。
F2およびF1ポリペプチドが、それぞれRSV Fの位置62〜69および196〜209を含み、かつ
F2ポリペプチドが、RSV Fの位置26〜109の8〜84個の残基を含むかまたはそれらからなり;かつ
F1ポリペプチドが、RSV Fの位置137〜529の14〜393個の残基を含むかまたはそれらからなり、
該RSV Fの位置が、SEQ ID NO: 124として明示される参照F0ポリペプチドのアミノ酸配列に対応する、
条項6の免疫原。
F2ポリペプチドのC末端残基およびF1ポリペプチドのN末端残基が、それぞれRSV Fの位置97および137;97および145;97および150;102および144;102および145;102および146;102および147;103および144;103および145;103および146;103および147;104および144;104および145;104および146;104および147;105および144;105および145;105および146;105および147;または105および150を含む、条項7の免疫原。
F2およびF1ポリペプチドが、それぞれ26〜109および137〜513;26〜107および137〜513;26〜107および145〜513;26〜105および137〜513;26〜105および145〜513;26〜103および145〜513;26〜109および137〜529;26〜107および137〜529;26〜107および145〜529;26〜105および137〜529;26〜105および145〜529;26〜103および145〜529;46〜103および147〜310;46〜104および146〜310;50〜96および149〜306;51〜103および146〜307;51〜103および139〜307;50〜105および146〜306;または53〜97および148から305〜320の中の1箇所までであるRSV Fの位置を含むかまたはそれらからなる、条項7の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質が、SEQ ID NO: 1〜184のうちのいずれか1つとして明示される天然RSV Fタンパク質配列の、それぞれアミノ酸26〜103および145〜310と少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むF2ポリペプチドおよびF1ポリペプチドを含むかまたはそれらからなる、前項のいずれか一項の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質が、SEQ ID NO: 124の、それぞれアミノ酸26〜103および145〜310と少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むF2ポリペプチドおよびF1ポリペプチドを含むかまたはそれらからなる、前項のいずれか一項の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質が、SEQ ID NO: 124の、それぞれアミノ酸26〜103および145〜513と少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むF2ポリペプチドおよびF1ポリペプチドを含むかまたはそれらからなる、前項のいずれか一項の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質が、SEQ ID NO: 124の、それぞれアミノ酸26〜103および145〜529と少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むF2ポリペプチドおよびF1ポリペプチドを含むかまたはそれらからなる、前項のいずれか一項の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質が、SEQ ID NO: 124の、それぞれアミノ酸26〜103および145〜551と少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むF2ポリペプチドおよびF1ポリペプチドを含むかまたはそれらからなる、前項のいずれか一項の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質が一本鎖RSV Fタンパク質であり、かつF2およびF1ポリペプチドが異種ペプチドリンカーによって連結しているかまたは直接連結している、前項のいずれか一項の免疫原。
F2ポリペプチドの位置105が、F1ポリペプチドの位置145にGly-Serリンカーによって連結している;または
F2ポリペプチドの位置103が、F1ポリペプチドの位置145に直接連結している、
条項15の免疫原。
異種ペプチドリンカーが、SEQ ID NO: 356〜365もしくは1443〜1453のうちの1つとして明示されるアミノ酸配列を含むか、またはG、S、GG、GS、SG、GGG、もしくはGSGリンカーである、条項16または条項16の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質が、
(a)システインペア間の第1のジスルフィド結合;
(b)空洞充填アミノ酸置換;
(c)再パッキングアミノ酸置換;
(d)N結合型グリコシル化部位;
(e)(a)〜(d)のうちの2つもしくはそれ以上の組み合わせ;または
(f)(a)および(b)の組み合わせ
によって、RSV Fタンパク質融合前立体構造に安定化されている、前項のいずれか一項の単離された免疫原。
システインのペアが、第1のシステインおよび第2のシステインを含み、かつ
第1のシステインおよび第2のシステインが、F1ポリペプチドの位置137〜216にあるか;
第1のシステインおよび第2のシステインが、F1ポリペプチドの位置461〜513にあるか;または
第1のシステインおよび第2のシステインが、F1ポリペプチドのそれぞれ位置137〜216および461〜513にあり;かつ
該アミノ酸位置が、SEQ ID NO: 124として明示される参照F0ポリペプチドのアミノ酸配列に対応する、
条項18の単離された免疫原。
第1のシステインが、RSV Fの位置137〜216の中の1箇所にアミノ酸置換によって導入されており、かつ第2のシステインが、RSV Fの位置271〜460の中の1箇所にアミノ酸置換によって導入されている、条項18の免疫原。
システインのペアが、それぞれがCα炭素およびCβ炭素を含む第1のシステインおよび第2のシステインを含み、かつ
(a)第1のシステインが、RSV Fの位置137〜216または461〜513の中の1箇所にアミノ酸置換によって導入されており、かつ第2のシステインが、RSV Fの位置26〜61、77〜97、または271〜460の中の1箇所にアミノ酸置換によって導入されており;かつ
(b)表1に提供される構造座標によって明示される三次元構造において、各Cβ炭素に対する最適な回転異性体を用いた際、第1のシステイン位置のCα炭素が、第2のシステイン位置のCα炭素から2.0〜8.0Åであり、かつ/または第1のシステイン位置のCβ炭素が、第2のシステイン位置のCβ炭素から2.0〜5.5Åである、
条項19または条項20の免疫原。
システインのペアが、それぞれがCα炭素およびCβ炭素を含む第1のシステインおよび第2のシステインを含み、かつ
(a)第1のシステインおよび第2のシステインが、RSV Fの位置137〜216もしくはRSV Fの位置461〜513にアミノ酸置換によって導入されているか;または第1のシステインが、RSV Fの位置137〜216にアミノ酸置換によって導入されており、かつ第2のシステインが、RSV Fの位置461〜513にアミノ酸置換によって導入されており;かつ
(b)表1に提供される構造座標によって明示される三次元構造において、各Cβ炭素に対する最適な回転異性体を用いた際、第1のシステイン位置のCα炭素が、第2のシステイン位置のCα炭素から2.0〜8.0Åであり、かつ/または第1のシステイン位置のCβ炭素が、第2のシステイン位置のCβ炭素から2.0〜5.5Åである、条項19または条項20の免疫原。
ジスルフィド結合が、プロトマー内またはプロトマー間ジスルフィド結合を含む、条項18の免疫原。
非天然ジスルフィド結合が、
RSV Fの位置155および290;151および288;137および337;397および487;138および353;341および352;403および420;319および413;401および417;381および388;320および415;319および415;331および401;320および335;406および413;381および391;357および371;403および417;321および334;338および394;288および300;60および194;33および469;54および154;59および192;46および311;48および308;または30および410の間のプロトマー内ジスルフィド結合;
RSV Fの位置400および489;144および406;153および461;149および458;143および404;346および454;399および494;146および407;374および454;369および455;402および141;74および218;183および428の間のプロトマー間ジスルフィド結合であって、組換えRSV Fタンパク質が、位置182/183間のG挿入;183および428を含み、かつ組換えRSV Fタンパク質が、位置427/428間のC挿入;145および460を含み、かつ組換えRSV Fタンパク質が、位置146/147間のAA挿入;183および423を含み、かつ組換えRSV Fタンパク質が、位置182/183間のAAA挿入;または330および430を含み、かつ組換えRSV Fタンパク質が、位置329/330間のCAA挿入を含む、プロトマー間ジスルフィド結合;
RSV Fの位置155および290の間のプロトマー内ジスルフィド結合であって、組換えRSV Fタンパク質が、RSV Fの位置74および218;141および402;146および460の間の非天然ジスルフィド結合、ならびに位置460/461間のG挿入;345および454、ならびに位置453/454間のC挿入;374および454、ならびに位置453/454間のC挿入;239および279、ならびに位置238/239間のC挿入;330および493、ならびに位置329/330間のC挿入;183および428、ならびに位置182/183間のG挿入;または183および428、ならびに位置427/428間のC挿入をさらに含む、プロトマー内ジスルフィド結合
を含む、条項23の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質が、
プロトマー内ジスルフィド結合、ならびに以下の置換セット:S155CおよびS290C;G151CおよびI288C;F137CおよびT337C;T397CおよびE487C;L138CおよびP353C;W341CおよびF352C;S403CおよびT420C;S319CおよびI413C;D401CおよびY417C;L381CおよびN388C;P320CおよびS415C;S319CおよびS415C;N331CおよびD401C;P320CおよびT335C;V406CおよびI413C;L381CおよびY391C;T357CおよびN371C;S403CおよびY417C;L321CおよびL334C;D338CおよびK394C;I288CおよびV300C;E60CおよびD194C;Y33CおよびV469C;T54CおよびV154C;I59CおよびV192C;S46CおよびT311C;L48CおよびV308C;E30CおよびL410Cのうちの1つもしくは複数;または
プロトマー間ジスルフィド結合、ならびに以下の置換セット:T400CおよびD489C;V144CおよびV406C;A153CおよびK461C;A149CおよびY458C;G143CおよびS404C;S346CおよびN454C;K399CおよびQ494C;S146CおよびI407C;T374CおよびN454C;T369CおよびT455C;もしくはV402CおよびL141C;A74CおよびE218C;S155C、S290C、L141C、およびV402C;S155C、S290C、A74C、およびE218C;N183CおよびN428C、ならびに位置182/183間のG挿入;N183CおよびN427G、ならびに位置427/428間のC挿入;S145Cおよび460C、ならびに位置146/147間のAA挿入;N183CおよびK423C、ならびに位置182/183間のAAA挿入;A329CおよびS430C、ならびに位置329/330間のCAA挿入のうちの1つもしくは複数;または
RSV Fの位置155と290との間のプロトマー内ジスルフィド結合、ならびにさらなる非天然ジスルフィド結合、S155CおよびS290C置換、ならびに以下のアミノ酸置換セット:S146CおよびN460C、ならびに位置460/461間のG挿入;N345CおよびN454G、ならびに位置453/454間のC挿入;T374CおよびN454G、ならびに位置453/454間のC挿入;S238GおよびQ279C、ならびに位置238/239間のC挿入;およびS493C、ならびに位置329/330間のC挿入;N183CおよびN428C、ならびに位置182/183間のG挿入;もしくはN183CおよびN427G、ならびに位置427/428間のC挿入のうちの1つもしくは複数
を含む、条項23の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質が、
SEQ ID NO: 185、189、201、202、205、207、209、213、244、245、247、257〜262、264〜275、277〜282、284、296〜299、302、303、338〜340のうちの1つにある残基137〜513として明示されるアミノ酸配列を含むF1ポリペプチド;または
SEQ ID NO: 190、211、212、243、246、263、276、283、285のうちの1つにある、それぞれ残基26〜109および137〜513として明示されるアミノ酸配列を含むF2ポリペプチドおよびF1ポリペプチド
を含み、該アミノ酸位置が、SEQ ID NO: 124として明示される参照F0ポリペプチドのアミノ酸配列に対応する、
条項23の免疫原。
非天然ジスルフィド結合が、RSV Fの位置155と290との間のプロトマー内ジスルフィド結合を含む、条項23の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質が、S155CおよびS290C置換を含む、条項23の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質が、SEQ ID NO: 185の残基26〜109および137〜513、残基26〜103および145〜513、または残基26〜105および145〜513と少なくとも80%の同一性を含むアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる、条項23の免疫原。
位置190、位置207、または位置190および207におけるF、L、W、Y、H、またはM置換を含む空洞充填アミノ酸置換を含む、条項18〜29のいずれか一項の免疫原。
190F;190L;190W;190Y;190H;190M;190Fおよび207L;190Fおよび207F;190Fおよび207W;190Lおよび207L;190Lおよび207F;190Lおよび207W;190Wおよび207L;190Wおよび207F;190Wおよび207W;190Yおよび207L;190Yおよび207F;190Yおよび207W;190Hおよび207L;190Hおよび207F;190Hおよび207W;190Mおよび207L;190Mおよび207F;190Mおよび207W;207Lおよび220L;296Fおよび190F;220Lおよび153W;203W;83Wおよび260W;58Wおよび298L;または87Fおよび90Lのうちの1つを含む空洞充填アミノ酸置換を含む、条項18〜29のいずれか一項の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質が、SEQ ID NO: 191、193、196〜197、もしくは248、もしくは371〜376のうちの1つにある位置137〜513、またはSEQ ID NO: 192、195、もしくは194のうちの1つにある位置26〜109および137〜513を含む、条項31の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質が、SEQ ID NO: 191の残基26〜109および137〜513、残基26〜103および145〜513、または残基26〜105および145〜513と少なくとも80%の同一性を含むアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる、条項30の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質が、位置155および290におけるシステイン置換間の非天然ジスルフィド結合、ならびに位置190、位置207、または位置190および207におけるF、L、W、Y、H、またはM空洞充填置換を含む、条項18の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質が、S155C、S290C、およびS190F置換、またはS155C、S290C、S190F、およびV207L置換を含む、条項18の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質が、
SEQ ID NO: 185(DS、サブタイプA)、371(DS-Cav1、サブタイプA)、372(DSCav1、サブタイプB)、373(DSCav1、ウシ)、374(DS S190F、サブタイプA)、375(DS、S190F、サブタイプB)、または376(DS、S190F、ウシ)のうちの1つにある、それぞれ残基26〜109および137〜513、またはそれぞれ26〜103および145〜513、またはそれぞれ26〜105および145〜513と少なくとも80%の同一性を含むアミノ酸配列
を含むかまたはそれらからなる、条項18の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質が、再パッキングアミノ酸置換によってRSV Fタンパク質融合前立体構造に安定化されており、F1ポリペプチドが、64L、79V、86W、193V、195F、198F、199F、203F、207L、および214L;64L、79L、86W、193V、195F、198F、199F、203F、および214L;64W、79V、86W、193V、195F、198F、199F、203F、207L、および214L;79V、86F、193V、195F、198F、199F、203F、207L、および214L;64V、79V、86W、193V、195F、198F、199Y、203F、207L、および214L;64F、79V、86W、193V、195F、198F、199F、203F、207L、および214L;64L、79V、86W、193V、195F、199F、203F、207L、および214L;56I、58I、164I、171I、179L、181F、187I、291V、296I、および298I;56I、58I、164I、179L、189F、291V、296I、および298I;56L、58I、158W、164L、167V、171I、179L、181F、187I、291V、および296L;56L、58I、158Y、164L、167V、187I、189F、291V、および296L;56I、58W、164I、167F、171I、179L、181V、187I、291V、および296I;56I、58I、64L、79V、86W、164I、179L、189F、193V、195F、198F、199F、203F、207L、214L、291V、296I、および298I;56I、58I、79V、86F、164I、179L、189F、193V、195F、198F、199F、203F、207L、214L、291V、296I、および298I;56I、58W、64L、79V、86W、164I、167F、171I、179L、181V、187I、193V、195F、198F、199F、203F、207L、214L、291V、および296I;56I、58W、79V、86F、164I、167F、171I、179L、181V、187I、193V、195F、198F、199F、203F、207L、214L、291V、および296I;486N、487Q、489N、および491A;486H、487Q、および489H;400V、486L、487L、および489L;400V、486I、487L、および489I;400V、485I、486L、487L、489L、494L、および498L;400V、485I、486I、487L、489I、494L、および498L;399I、400V、485I、486L、487L、489L、494L、497L、および498L;399I、400V、485I、486I、487L、489I、494L、497L、および498L;375W、391F、および394M;375W、391F、および394W;375W、391F、394M、486N、 487Q、489N、および491A;375W、391F、394M、486H、487Q、および489H;375W、391F、394W、486N、487Q、489N、および491A;375W、391F、394W、486H、487Q、および489H;375W、391F、394M、400V、486L、487L、489L、494L、および498M;375W、391F、394M、400V、486I、487L、489I、494L、および498M;375W、391F、394W、400V、486L、487L、489L、494L、および498M;375W、391F、394W、400V、486I、487L、489I、494L、および498M;137Wおよび339M;137Wおよび140W;137W、140W、および488W;486N、487Q、489N、491A、および488W;486H、487Q、489H、および488W;400V、486L、487L、489L、および488W;400V、486I、487L、489I、および488W;486N、487Q、489N、491A、137W、および140W;486H、487Q、489H、137W、および140W;400V、486L、487L、489L、137W、および140W;375W、391F、394M、137W、および140W;または375W、391F、394M、137W、140W、および339M置換のうちの1つに明示されるアミノ酸置換を含み、かつ該アミノ酸位置が、SEQ ID NO: 124として明示される参照F0ポリペプチドのアミノ酸配列に対応する、条項18の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質が、再パッキングアミノ酸置換によってRSV Fタンパク質融合前立体構造に安定化されており、F1ポリペプチドが、I64L、I79V、Y86W、L193V、L195F、Y198F、I199F、L203F、V207L、およびI214L;I64L、I79L、Y86W、L193V、L195F、Y198F、I199F、L203F、およびI214L;I64W、I79V、Y86W、L193V、L195F、Y198F、I199F、L203F、V207L、およびI214L;I79V、Y86F、L193V、L195F、Y198F、I199F、L203F、V207L、およびI214L;I64V、I79V、Y86W、L193V、L195F、Y198F、I199Y、L203F、V207L、およびI214L;I64F、I79V、Y86W、L193V、L195F、Y198F、I199F、L203F、V207L、およびI214L;I64L、I79V、Y86W、L193V、L195F、I199F、L203F、V207L、およびI214L;V56I、T58I、V164I、L171I、V179L、L181F、V187I、I291V、V296I、およびA298I;V56I、T58I、V164I、V179L、T189F、I291V、V296I、およびA298I;V56L、T58I、L158W、V164L、I167V、L171I、V179L、L181F、V187I、I291V、およびV296L;V56L、T58I、L158Y、V164L、I167V、V187I、T189F、I291V、およびV296L;V56I、T58W、V164I、I167F、L171I、V179L、L181V、V187I、I291V、およびV296I;V56I、T58I、I64L、I79V、Y86W、V164I、V179L、T189F、L193V、L195F、Y198F、I199F、L203F、V207L、I214L、I291V、V296I、およびA298I;V56I、T58I、I79V、Y86F、V164I、V179L、T189F、L193V、L195F、Y198F、I199F、L203F、V207L、I214L、I291V、V296I、およびA298I;V56I、T58W、I64L、I79V、Y86W、V164I、I167F、L171I、V179L、L181V、V187I、L193V、L195F、Y198F、I199F、L203F、V207L、I214L、I291V、およびV296I;V56I、T58W、I79V、Y86F、V164I、I167F、L171I、V179L、L181V、V187I、L193V、L195F、Y198F、I199F、L203F、V207L、I214L、I291V、およびV296I;D486N、E487Q、D489N、およびS491A;D486H、E487Q、およびD489H;T400V、D486L、E487L、およびD489L;T400V、D486I、E487L、およびD489I;T400V、S485I、D486L、E487L、D489L、Q494L、およびK498L;T400V、S485I、D486I、E487L、D489I、Q494L、およびK498L;K399I、T400V、S485I、D486L、E487L、D489L、Q494L、E497L、およびK498L;K399I、T400V、S485I、D486I、E487L、D489I、Q494L、E497L、およびK498L;L375W、Y391F、およびK394M;L375W、Y391F、およびK394W;L375W、Y391F、K394M、D486N、E487Q、D489N、およびS491A;L375W、Y391F、K394M、D486H、E487Q、およびD489H;L375W、Y391F、K394W、D486N、E487Q、D489N、およびS491A;L375W、Y391F、K394W、D486H、E487Q、およびD489H;L375W、Y391F、K394M、T400V、D486L、E487L、D489L、Q494L、およびK498M;L375W、Y391F、K394M、T400V、D486I、E487L、D489I、Q494L、およびK498M;L375W、Y391F、K394W、T400V、D486L、E487L、D489L、Q494L、およびK498M;L375W、Y391F、K394W、T400V、D486I、E487L、D489I、Q494L、およびK498M;F137WおよびR339M;F137WおよびF140W;F137W、F140W、およびF488W;D486N、E487Q、D489N、S491A、およびF488W;D486H、E487Q、D489H、およびF488W;T400V、D486L、E487L、D489L、およびF488W;T400V、D486I、E487L、D489I、およびF488W;D486N、E487Q、D489N、S491A、F137W、およびF140W;D486H、E487Q、D489H、F137W、およびF140W;T400V、D486L、E487L、D489L、F137W、およびF140W;L375W、Y391F、K394M、F137W、およびF140W;またはL375W、Y391F、K394M、F137W、F140W、およびR339Mのうちの1つに明示されるアミノ酸置換を含み、かつ該アミノ酸位置が、SEQ ID NO: 124として明示される参照F0ポリペプチドのアミノ酸配列に対応する、条項37の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質が、再パッキングアミノ酸置換によってRSV Fタンパク質融合前立体構造に安定化されており、F1ポリペプチドが、SEQ ID NO: 227〜242、249〜256、286〜295、または326〜337のうちの1つにある位置137〜513を含む、条項38の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質が、N結合型グリコシル化部位によってRSV Fタンパク質融合前立体構造に安定化されており、該N結合型グリコシル化部位が、F1ポリペプチドの位置506、175、178、276、476、185、160、503、157のうちの1つ、またはそれらの位置のうちの2つもしくはそれ以上の組み合わせにあり、該アミノ酸位置が、SEQ ID NO: 124として明示される参照F0ポリペプチドのアミノ酸配列に対応する、条項18〜39のいずれか一項の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質が、
(a)I506NおよびK508T;(b)A177S;(c)V178N;(d)V278T;(e)Y478T;(f)V185NおよびV187T;(g)L160NおよびG162S;(h)L503NおよびF505S;(i)V157N;または(j)(a)〜(j)のうちの2つもしくはそれ以上の組み合わせ、
のうちの1つを含み、かつ該アミノ酸位置が、SEQ ID NO: 124として明示される参照F0ポリペプチドのアミノ酸配列に対応する、条項40の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質が、N結合型グリコシル化部位によってRSV Fタンパク質融合前立体構造に安定化されており、かつF1ポリペプチドが、SEQ ID NO: 198〜200、203〜204、214〜217のうちの1つにある位置137〜513を含む、条項41の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質が、RSV Fタンパク質融合前立体構造に安定化されており、S238CおよびE92C;L193CおよびI59C;I59CおよびL297C;L297CおよびI292C;K176CおよびS190C;T189CおよびA177C;T58CおよびK191C;A424CおよびV450C;L171CおよびK191C;K176CおよびS190C;K77CおよびI217C;K427CおよびD448C;G151CおよびN302C;G151CおよびV300C;T189CおよびV56C;L171CおよびK191C;L230F;L158F;L230FおよびL158F;L203F;V187F;Y198F;Y198W;L204F;Y53FおよびL188F;V187FおよびL203F;Y198FおよびL203F;L141W;L142F;L142W;V144F;V144W;V90F;L83F;V185FおよびT54A;I395F;V90F、V185F、およびT54A;L83FおよびV90F;L83F、V185F、およびT54A;L230F、V90F、およびI395F;I395F、V185F、およびT54A;L203F、V90F、L230F、L158F、S509F、I395F、V185F、およびT54A;I221Y;F140W;F137W;S190LおよびV192L;V187F、S190L、およびV192L;V187L、S190L、およびV192L;V185F、V187L、S190L、およびV192L;V154L、V157L、V185L、およびV187L;V154L、V185L、およびV187L;V187F;T58L A298L;T58L、V154L、V185L、V187L、およびA298L;Y458W;L158FおよびI167A;L158WおよびI167A;L158F;L158W;V56L、I167L、およびA298L;V56L、I167L、およびA298M;V56LおよびA167L;I167F;I167M;V154F;V56L、I167L、A298L、およびV154F;I199L、L203F;I199L、L203F、P205Q、およびI206T;I199L、L203F、P205E、およびI206K;I199L、L203F、およびV207F;I199L、L203F、P205Q、I206T、およびV207F;I199L、L203F、P205E、I206K、およびV207F;I199L、L203F、およびL83F;I199L、L203F、P205Q、I206T、およびL83F;I199L、L203F、P205E、I206K、およびL83F;I199L、L203F、S190L、およびV192L;I199L、L203F、P205Q、I206T、V187F、およびS190L、V192L;S55A、S190M、L203F、V207I、およびV296I;Y53F、S55A、K176I、S190L、V207I、S259L、D263L、およびV296I;L158F、V207M、およびV296I;V56L、V207M、およびV296I;V56L、V207I、およびV296I;V56I、V207M 、and V296I;V154L、V207M、およびV296I;Y198F、V207I、T219W、およびV296I;Y198F、V207I、T219I、およびV296I;Y198F、V207M、T219W、およびV296I;198F、V207M、T219I、およびV296I;Y198F、V207M、T219L、およびV296I;S190Y;S190W;I206F、V207M、T219V、およびV296I;Y198F、V207M、T219L、およびK226M;Y198F、V207M、T219L、およびK226W;Y198F、V207M、T219L、およびK226L;L158F、L203F、V207I、およびV296I;F488W;F488R;V207L;S190F; S190M; L503E、I506K、およびS509F;L503E、I506K、S509F、およびF505W;L503E、I506K、S509F、L230F、およびL158F;Q279C、およびS238C;Q501F;E82V、V207M、N227L、およびV296I;E82V、V207I、N227L、およびV296I;L158F、Y198F、V207M、S215G、N216P、およびT219L;L158F、Y198F、V207M、S213G、S215G、およびT219L;V56L、E82V、L203F、V207M、N227L、L230F、およびV296I;E82V、L158F、L203F、V207M、N227L、L230F、およびV296I;E82V、L203F、V207M、K226M、N227L、L230F、およびV296I;またはL203F、V207I、S180C、S186C、およびV296Iのうちの1つとして明示されるアミノ酸置換を含み、該アミノ酸位置が、SEQ ID NO: 124として明示される参照F0ポリペプチドのアミノ酸配列に対応する、条項18のいずれか1項の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質が、
S155CおよびS290C置換、ならびに以下の置換セット:L513C、514E、および515C;L513C、514E、515E、および516C;L512C、513E、および514C;またはL512C、513E、514E、および515Cのうちの1つをさらに含み;
S155C、S290C、およびS190F置換、ならびに以下の置換セット:F488W、L513C、A514E、およびI515C;F488W、L513C、A514E、G515E、および516C;F488W、L512C、L513E、およびA514C;F488W、L512C、L513E、A514E、およびG515C;A424C、V450C、L171C、K191C、F488W、L513C、A514E、およびI515C;A424C、V450C、L171C、K191C、F488W、L513C、A514E、G515E、および516C;A424C、V450C、L171C、K191C、F488W、L512C、L513E、およびA514C;A424C、V450C、L171C、K191C、F488W、L512C、L513E、A514E、およびG515C;K77C、I217C、A424C、V450C、L171C、K191C、F488W、L513C、L514E、およびA515C;K77C、I217C、A424C、V450C、L171C、K191C、F488W、L513C、L514E、およびA515E; K77C、I217C、A424C、V450C、L171C、K191C、F488W、L512C、L513E、およびA514C;またはK77C、I217C、A424C、V450C、L171C、K191C、F488W、L512C、L513E、A514E、およびG515Cのうちの1つをさらに含み;
S155C、S290、S190F、およびV207L置換、ならびに以下の置換セット:L503E、およびI506K;L503E、I506K、およびF505W;L503E、I506K、L230F、およびL158F;L503E、I506K、S509F、F505W、L230F、およびL158F;L160K、V178T、L258K、V384T、I431S、およびL467Q;F477K、L481Q、V482K、L503Q、およびI506K;L160K、V178T、L258K、V384T、I431S、L467Q、F477K、L481Q、V482K、L503Q、およびI506K;L512C、およびL513C;L512C、L513C、L160K、V178T、L258K、V384T、I431S、およびL467Q;L512C、L513C、F477K、L481Q、V482K、L503Q、およびI506K;L512C、L513C、L160K、V178T、L258K、V384T、I431S、L467Q、F477K、L481Q、V482K、L503Q、およびI506K;F505W; F505W L160K、V178T、L258K、V384T、I431S、およびL467Q;F505W F477K、L481Q、V482K、L503Q、およびI506K;F505W L160K、V178T、L258K、V384T、I431S、L467Q、F477K、L481Q、V482K、L503Q、およびI506K;L512C、L513C、およびF505W;L512C、L513C F505W L160K、V178T、L258K、V384T、I431S、およびL467Q;L512C、L513C F505W F477K、L481Q、V482K、L503Q、およびI506K;L512C、L513C F505W L160K、V178T、L258K、V384T、I431S、L467Q、F477K、L481Q、V482K、L503Q、およびI506K;I506K、S509F、L83F、およびV90F;I506K、S509F、L83F、V90F、L230F、およびL158F;I506K、S509F、F505W、L83F、V90F、L230F、V185F、およびT54A;L83F、V90F、L230F、およびI395F;I506K、S509F、F505W、L83F、V90F、L230F、L158F、I395F、V185F、およびT54A;L512C、およびL513C;または486DEF〜CPCのうちの1つをさらに含み、
該アミノ酸位置が、SEQ ID NO: 124として明示される参照F0ポリペプチドのアミノ酸配列に対応する、
条項18の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質が、RSV Fタンパク質融合前に安定化されており、かつSEQ ID NO: 338〜433、434〜544、672〜682のうちの1つにあるそれぞれ位置26〜109および137〜513として明示されるアミノ酸配列を含むF2およびF1ポリペプチドを含む、条項18の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質が、
表5bの行1〜16(より新しい鎖間ジスルフィド);
表6bの行1〜84(より新しい空洞充填);
表8bの行1〜54(DSCav-1とのより新しい組み合わせ);または
表8cの行1〜13(より新しい空洞充填+曝露された疎水性残基の置き換え)
のうちの1つに明示されるアミノ酸置換
を含み、かつ
アミノ酸位置が、SEQ ID NO: 124として明示される参照F0ポリペプチドのアミノ酸配列に対応する、
条項1〜18のいずれか一項の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質が一本鎖タンパク質であり、かつSEQ ID NO: 698〜828または1474〜1478のうちのいずれか1つと少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含む、条項1〜18のいずれか一項の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質が一本鎖タンパク質であり、かつSEQ ID NO: 698〜828または1474〜1478のうちのいずれか1つと少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、任意で、対応するSEQ ID NOに挙げられたタンパク質タグまたはリーダー配列を有しない、条項1〜18のいずれか一項の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質が三量体化ドメインを含み、フォルドンドメインと組換えRSV Fタンパク質との間にプロテアーゼ切断部位をさらに含む、条項1〜18のいずれか一項の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質が、SEQ ID NO: 829〜1025のうちの1つに対応する表23の行に挙げられたアミノ酸置換を含む、条項1〜18のいずれか一項の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質が、SEQ ID NO: 969〜1025のうちの1つに対応する表23の行に挙げられたアミノ酸置換を含む、条項1〜18のいずれか一項の免疫原。
免疫原が、以下のアミノ酸置換:
DSCav1-F137C、およびR339C;DSCav1-F137CおよびT337C;DSCav1-G139CおよびQ354C;F137C、R339C;F137C、T337C;G139C、Q354C;L260F;L260W;L260Y;L260R;L188F;L188W;L188Y;L188R;I57F;I57W;I57R;L252F;L252W;L252R;V192F;V192W;V192R;S150CおよびY458C;A149CおよびN460C;S146C、およびN460C;A149CおよびY458C;V220F;V220W;V220M;T219F;T219M;T219W; T219R;I221F;I221Y;I221W;Q224D、およびL78K;V278F Q279F N277D、およびS99K;Q361F;V402F;T400F;T400W;H486F;H486W;I217F;I217Y;I217W;F190V;K226L;T58I、およびA298M;F190VおよびK226L;F190V、およびT58I、A298M;K226L、T58I、およびA298M;T58I、A298M、F190VおよびK226L
のうちの1つまたは複数を含み、かつ任意で、S155CおよびS290C置換、またはS155C、S290C、S190F、およびV207L置換をさらに含む、条項1〜18のいずれか一項の免疫原。
SEQ ID NO: 829〜1025のうちの1つであるアミノ酸配列と少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、任意で、対応するSEQ ID NOに挙げられたタンパク質タグまたはリーダー配列を有しない、条項1〜18のいずれか一項の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質が三量体化ドメインを含み、フォルドンドメインと組換えRSV Fタンパク質との間にプロテアーゼ切断部位をさらに含む、条項53のいずれか1項の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質が、SEQ ID NO: 901〜968のうちの1つに対応する表24の行に挙げられたアミノ酸置換を含む、条項1〜18のいずれか一項の免疫原。
SEQ ID NO: 901〜968のうちの1つであるアミノ酸配列と少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、任意で、対応するSEQ ID NOに挙げられたタンパク質タグまたはリーダー配列を有しない、条項1〜18のいずれか一項の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質またはそのフラグメントが、SEQ ID NO: 1〜184のうちのいずれか1つに明示される以下のRSV F2およびF1位置:
(a)それぞれ56〜97および189〜211;(b)それぞれ58〜97および192〜242;(c)それぞれ59〜97および194〜240;(d)それぞれ60〜75および193〜218;(e)それぞれ60〜94および192〜229;(f)それぞれ60〜94および192〜232;(g)それぞれ60〜94および193〜237;(h)それぞれ60〜95および192〜240;(i)それぞれ60〜96および192〜239;(j)それぞれ60〜97および192〜242;(k)それぞれ60〜97および194〜239;(l)それぞれ61〜96および192〜235;(m)それぞれ61〜96および192〜240;(n)それぞれ62〜69および196〜209;または(o)(a)〜(m)のうちのいずれか1つに挙げられたF2およびF1位置の円順列変異、
と少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなり、該RSV F2およびF1位置が、異種リンカーによって接合されている、条項7の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質またはそのフラグメントが、SEQ ID NO: 1〜184のうちのいずれか1つに明示される以下のRSV F2およびF1位置:
(a)それぞれ46〜103および147〜310;(b)それぞれ46〜104および146〜310;(c)それぞれ50〜96および149〜306;(d)それぞれ51〜103および146〜307;(e)それぞれ51〜103および139〜307;(f)それぞれ50〜105および146〜306;(g)53〜97、および148から305〜320の中の1箇所まで;(h)(a)〜(g)のうちのいずれか1つに挙げられたF2およびF1位置の円順列変異、
と少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなり、該RSV F2およびF1位置が、異種リンカーによって接合されているかまたは直接連結している、条項7の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質またはそのフラグメントが、表20に挙げられた最小部位φ免疫原のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含む、条項57または58の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質またはそのフラグメントが、SEQ ID NO: 1027〜1218のうちの1つであるアミノ酸配列と少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含む、条項57または58の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質またはそのフラグメントが、SEQ ID NO: 1027〜1218のうちの1つであるアミノ酸配列と少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、任意で、対応するSEQ ID NOに挙げられたタンパク質タグまたはリーダー配列を有しない、条項57または58の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質が、位置155および290におけるシステイン置換、ならびに位置190、位置207、または位置190および207におけるF、L、W、Y、H、またはM置換を含む、条項58〜61のいずれか一項の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質が、S155CおよびS290C置換;S155C、S290C、およびS190F置換;またはS155C、S290C、S190F、およびV207L置換を含む、条項58〜61のいずれか一項の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質またはそのフラグメントが、SEQ ID NO: 1027〜1218のうちのいずれか1つのF1−リンカー−F2配列またはF2−リンカー−F1配列を含むかまたはそれらからなる、条項58〜61のいずれか一項の免疫原。
異種リンカーが、SEQ ID NO: 1443〜1455のうちのいずれか1つとして明示されるアミノ酸配列、またはG、S、GG、GS、SG、GGG、もしくはGSGリンカーを含むかまたはそれらからなる、条項57〜64のいずれか一項の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質またはそのフラグメントの多量体を含む、前項のいずれか一項の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質が足場タンパク質に連結している、前項のいずれか一項の免疫原。
F1ポリペプチドが、RSVの位置492から位置510〜529の中の1箇所までを含むRSV α10ヘリックスを含み、かつF1ポリペプチドが、非天然プロトマー間ジスルフィド結合を形成する少なくとも2個のシステイン置換を含む、条項1〜56のいずれか一項の免疫原。
F1ポリペプチドの位置512〜524が、CCHNVNAGKSTTN(SEQ ID NO: 844の残基512〜524)もしくはCCHNVNACCSTTN(SEQ ID NO: 849の残基X〜Y)として明示されるアミノ酸配列を含むか;またはF1ポリペプチドの位置512〜529が、CCHNVNACCSTTNICCTT(SEQ ID NO: 853の残基512〜529)として明示されるアミノ酸配列を含む、条項68の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質が、F1の位置:
(a)486および487;
(b)512および513;
(c)519および520;
(d)526および527;
(e)486および487、該F1ポリペプチドは、位置486と487との間に挿入されたPをさらに含む;
(f)330および493、該F1ポリペプチドは、位置329と330との間に挿入されたCをさらに含む;または
(g)330および493、該F1ポリペプチドは、位置329と330との間に挿入されたC、ならびに位置492と493との間のG挿入をさらに含む、
における架橋システインのペアを含むさらなるジスルフィド結合をさらに含み、
該アミノ酸位置が、SEQ ID NO: 124として明示される参照F0ポリペプチドのアミノ酸配列に対応する、
前項のいずれか一項の単離された免疫原。
組換えRSV Fタンパク質もしくはそのフラグメントまたはエピトープ足場タンパク質が三量体化ドメインに連結している、前項のいずれか一項の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質のF1ポリペプチドのC末端が三量体化ドメインに連結している、条項71の免疫原。
三量体化ドメインがフォルドンドメインである、条項71または条項72の免疫原。
F1ポリペプチドと三量体化ドメインとの間にプロテアーゼ切断部位をさらに含む、条項71〜73のいずれか一項の免疫原。
プロテアーゼ切断部位と三量体化ドメインとの間に膜貫通ドメインをさらに含む、条項74の免疫原。
RSV Fタンパク質が、
(a)F2ポリペプチド、およびフォルドンドメインに連結されたF1ポリペプチドが、SEQ ID NO: 185、189、190、201、202、205、207、209、211、212、213、244、245、247、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、277、278、279、280、281、282、284、302、303、243、246、276、283、285、296、297、298、もしくは299のうちのいずれか1つの、それぞれ位置26〜109および137〜544として明示されるアミノ酸配列を含む、ジスルフィド結合;
(b)F2ポリペプチド、およびフォルドンドメインに連結されたF1ポリペプチドが、SEQ ID NO: 191、193、196、197、248、192、195、もしくは194のうちのいずれか1つの、それぞれ位置26〜109および137〜544として明示されるアミノ酸配列を含む、空洞充填アミノ酸置換;
(c)F2ポリペプチド、およびフォルドンドメインに連結されたF1ポリペプチドが、SEQ ID NO: 249、250、251、252、253、254、255、256、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、もしくは337のうちのいずれか1つの、それぞれ位置26〜109および137〜544として明示されるアミノ酸配列を含む、再パッキングアミノ酸置換;または
(d)F2ポリペプチド、およびフォルドンドメインに連結されたF1ポリペプチドが、SEQ ID NO: 198、199、200、203、204、214、215、216、もしくは217からなる群より選択されるSEQ ID NOのうちのいずれか1つの、それぞれ位置26〜109および137〜544として明示されるアミノ酸配列を含む、N結合型グリコシル化部位;
(e)F2ポリペプチド、およびフォルドンドメインに連結されたF1ポリペプチドが、SEQ ID NO: 371、372、373、374、375、376からなる群より選択されるSEQ ID NOのうちのいずれか1つの、それぞれ位置26〜109および137〜544として明示されるアミノ酸配列を含む、ジスルフィド結合および空洞充填置換
によってFタンパク質融合前立体構造に安定化されており、かつ
該アミノ酸位置が、SEQ ID NO: 124として明示される参照F0ポリペプチドのアミノ酸配列に対応する、
条項75の単離された免疫原。
F2ポリペプチド、およびフォルドンドメインに連結されたF1ポリペプチドが、SEQ ID NO: 552;553;554;555;556;557;558;559;560;561;562;563;564;565;566;567;568;569;570;571;572;573;574;575;576;577;578;579;580;581;582;583;584;585;586;587;588;589;590;591;592;593;および601;683;684;685;686;687;688;689;690;691;692;または693のうちのいずれか1つの、それぞれ位置26〜109および137〜548として明示されるアミノ酸配列を含み、
該アミノ酸位置が、SEQ ID NO: 124として明示される参照F0ポリペプチドのアミノ酸配列に対応する、
条項75の単離された免疫原。
組換えRSV Fタンパク質もしくはそのフラグメントまたはエピトープ足場タンパク質が、タンパク質ナノ粒子サブユニットに連結している、前項のいずれか一項の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質もしくはそのフラグメントまたはエピトープ足場タンパク質のC末端が、タンパク質ナノ粒子サブユニットに連結している、条項78の免疫原。
タンパク質ナノ粒子サブユニットが、フェリチン、エンカプスリン、硫黄オキシゲナーゼレダクターゼ(SOR)、ルマジンシンターゼ、またはピルビン酸デヒドロゲナーゼのナノ粒子サブユニットである、条項78または条項79の免疫原。
フェリチンナノ粒子サブユニットが、SEQ ID NO: 350の残基517〜679と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ任意で、フェリチンポリペプチド内にC31S、C31A、またはC31V置換を含み;
SORサブユニットが、SEQ ID NO: 344またはSEQ ID NO: 345の残基516〜825と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;
ルマジンシンターゼサブユニットが、SEQ ID NO: 346もしくはSEQ ID NO: 348の残基517〜670、またはSEQ ID NO: 347の残基517〜669と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;または
ピルビン酸デヒドロゲナーゼシンターゼサブユニットが、SEQ ID NO: 349の残基516〜757と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
条項78の免疫原。
SEQ ID NO: 827〜828または1429〜1442のうちの1つと少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むフェリチンサブユニットに連結された一本鎖RSV Fタンパク質を含む、条項78の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質またはそのフラグメントがナノ粒子サブユニットに連結されており、かつ表21に挙げられた、タンパク質ナノ粒子に連結された最小部位φ免疫原のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含む、条項78の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質またはそのフラグメントがナノ粒子サブユニットに連結されており、SEQ ID NO: 1219〜1428のうちの1つであるアミノ酸配列と少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含む、条項78の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質またはそのフラグメントがナノ粒子サブユニットに連結されており、かつSEQ ID NO: 1219〜1428のうちの1つであるアミノ酸配列と少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含み、任意で、対応するSEQ ID NOに挙げられたタンパク質タグまたはリーダー配列を有しない、条項78の免疫原。
組換えRSV Fタンパク質が、室温で生理的pHにおいてリン酸緩衝生理食塩水中で三量体を形成する、前項のいずれか一項の免疫原。
免疫原が、水溶液中でインキュベートされた場合に免疫原の均質集団を形成し、該溶液中でインキュベートされた免疫原の少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、および/または少なくとも95%が、
(a)50℃にて、350mM NaCl pH7.0中で1時間のインキュベーション;
(b)25℃にて、350mM NaCl pH3.5中で1時間のインキュベーション;
(c)25℃にて、350mM NaCl pH10中で1時間のインキュベーション;
(d)25℃にて、10mMモル浸透圧濃度、pH7.0中で1時間のインキュベーション;
(e)25℃にて、3000mMモル浸透圧濃度、pH7.0中で1時間のインキュベーション;もしくは
(f)350mM NaCl pH7.0中で10回の凍結融解サイクル;または
(g)(a)〜(f)のうちの2つもしくはそれ以上の組み合わせ
の後に融合前特異的抗体に特異的に結合し、該免疫原が融合前特異的抗体の非存在下で該溶液中でインキュベートされる、前項のいずれか一項の免疫原。
(a)組換えRSV Fタンパク質またはそのフラグメントが、RSV Fの位置481と489との間またはRSV Fの位置509と510との間にジスルフィド結合を含まず;
(b)組換えRSV Fタンパク質またはそのフラグメントが、RSV Fの位置481、489、509、510、またはそれらの組み合わせにおいてシステイン残基を含まず;
(c)(a)および(b)の組み合わせである、
前項のいずれか一項の免疫原。
F1ポリペプチドのC末端が膜貫通ドメインに連結している、条項1〜70のいずれか一項の単離された免疫原。
膜貫通ドメインがRSV F膜貫通ドメインである、条項89の単離された免疫原。
膜貫通ドメインのC末端がRSV F細胞質ドメインに連結している、条項89または90の単離された免疫原。
非特異的架橋によっては融合前立体構造に安定化されない、前項のいずれか一項の単離された免疫原。
条項1〜70のいずれか一項の免疫原を含む、ウイルス様粒子。
条項1〜85のいずれか一項の免疫原を含む、タンパク質ナノ粒子。
フェリチンナノ粒子、エンカプスリンナノ粒子、硫黄オキシゲナーゼレダクターゼ(SOR)ナノ粒子、ルマジンシンターゼナノ粒子、またはピルビン酸デヒドロゲナーゼナノ粒子である、条項94のタンパク質ナノ粒子。
モノクローナル抗体D25またはAM22のFabが、1μMまたはそれ未満のKdで免疫原、ウイルス様粒子、またはタンパク質ナノ粒子に特異的に結合する、条項1〜92のいずれか一項の免疫原。
免疫原が、モノクローナル抗体D25の非存在下において、1個の残基あたり2.0Å未満というそれらの座標の平均二乗偏差(RMSD)を伴って、表1に明示される原子座標によって規定されるモノクローナル抗体D25と複合したSEQ ID NO: 370の残基62〜69および196〜209を含むD25エピトープの三次元構造上に構造的に重ね合わせることができる三次元構造を含むD25エピトープを含み、該RMSDが、ポリペプチド骨格原子であるN、Cα、C、Oに関して、少なくとも3個の連続的アミノ酸について測定される、条項1〜85のいずれか一項の単離された免疫原。
条項1〜92のいずれか一項の単離された免疫原をコードする、核酸分子。
免疫原の前駆体タンパク質をコードする、条項98の核酸分子。
前駆体タンパク質が、N末端からC末端方向に、シグナルペプチド、F2ポリペプチド、Pep27ポリペプチド、およびF1ポリペプチドを含む、条項99の核酸分子。
Pep27ポリペプチドが、SEQ ID NO: 1〜184または370のうちのいずれか1つの位置110〜136として明示されるアミノ酸配列を含み、該アミノ酸位置が、SEQ ID NO: 124として明示される参照F0ポリペプチドのアミノ酸配列に対応する、条項100の核酸分子。
シグナルペプチドが、SEQ ID NO: 1〜184または370のうちのいずれか1つの位置1〜25として明示されるアミノ酸配列を含み、該アミノ酸位置が、SEQ ID NO: 124として明示される参照F0ポリペプチドのアミノ酸配列に対応する、条項101の核酸分子。
ヒトまたはウシ細胞内での発現にコドン最適化された、条項99〜102のいずれか一項の核酸分子。
プロモーターに機能的に連結された、条項99〜103のいずれか一項の核酸分子。
条項104の核酸分子を含む、ベクター。
ウイルスベクターである、条項105のベクター。
ウシパラインフルエンザウイルスベクター、ヒトパラインフルエンザウイルスベクター、ニューカッスル病ウイルスベクター、センダイウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、弱毒化RSVベクター、パラミクソウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ベネズエラウマ脳炎ベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、水疱性口内炎ウイルスベクター、ピコルナウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターである、条項106のウイルスベクター。
細菌ベクターである、条項106のベクター。
マイコバクテリアベクター、サルモネラベクター、シゲラ(shigella)ベクター、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)ベクター、またはラクトバチルス(lactobacillus)ベクターである、条項108の細菌ベクター。
SEQ ID NO: 383、SEQ ID NO: 384、SEQ ID NO: 385、またはSEQ ID NO: 386として明示されるヌクレオチド配列を含む、条項98〜109のいずれか一項の核酸分子またはベクター。
条項105〜110のいずれか一項のベクターを含む、単離された宿主細胞。
条項1〜110のいずれか一項の免疫原、ウイルス様粒子、タンパク質ナノ粒子、核酸分子、またはベクターの有効量、および薬学的に許容される担体を含む、免疫原性組成物。
アジュバントをさらに含む、条項112の免疫原性組成物。
アジュバントが、アルミニウム、水中油型組成物、MF59、AS01、AS03、AS04、MPL、QS21、CpGオリゴヌクレオチド、TLR7アゴニスト、TLR4アゴニスト、またはそれらのうちの2つもしくはそれ以上の組み合わせである、条項113の免疫原性組成物。
アジュバントがTh1免疫応答を促進する、条項113の免疫原性組成物。
免疫原に特異的に結合するRSV F融合前特異的抗体をさらに含む、条項112のいずれか1項の免疫原性組成物。
RSV Fタンパク質サブタイプAおよびBに基づく組換えRSV Fタンパク質またはそのフラグメントの混合物を含む、条項112のいずれか1項の免疫原性組成物。
ヒトサブタイプA RSV Fタンパク質がS155C、S290C、およびS190F置換を含み、かつヒトサブタイプB RSV Fタンパク質がS155C、S290C、およびS190F置換を含む;または
ヒトサブタイプA RSV Fタンパク質がS155C、S290C、S190F、およびV207L置換を含み、かつヒトサブタイプB RSV Fタンパク質がS155C、S290C、S190F、およびV207L置換を含む、
条項117の免疫原性組成物。
免疫応答を生じさせるために条項112〜118のいずれか一項の免疫原性組成物の有効量を対象に投与する工程を含む、対象においてRSV Fに対する免疫応答を生じさせるための方法。
免疫応答がTh1免疫応答を含む、条項119の方法。
条項112〜120のいずれか一項の免疫原性組成物の治療上有効量を対象に投与し、それによって対象におけるRSV感染症を治療するまたは阻止する工程を含む、対象におけるRSV感染症を治療するまたは阻止するための方法。
免疫原性組成物のプライム-ブースト投与を含む、条項119〜121のいずれか一項の方法。
プライムおよびブーストが、RSV Fタンパク質サブタイプAおよびBに基づく組換えRSV Fタンパク質もしくはそのフラグメントまたは核酸分子またはタンパク質ナノ粒子の混合物の投与を含む、条項122の方法。
条項1〜110のいずれか一項の免疫原、ウイルス様粒子、タンパク質ナノ粒子、核酸分子、またはベクターの有効量を提供する工程;
組換えRSV Fタンパク質またはタンパク質ナノ粒子とRSV F結合抗体との間で免疫複合体を形成するのに十分な条件下で、対象由来の生物学的サンプルを組換えRSV Fタンパク質またはタンパク質ナノ粒子と接触させる工程;および
免疫複合体を検出し、それによって対象におけるRSV F結合抗体を検出するまたは単離する工程
を含む、対象におけるRSV F結合抗体を検出するまたは単離するための方法。
対象が、RSV感染症の危険性があるまたはRSV感染症を有する、条項119〜124のいずれか一項の方法。
RSV感染症が、ヒトRSVサブタイプA、ヒトRSVサブタイプB、またはウシRSVの感染症である、条項125の方法。
対象がヒトまたは獣医学的対象である、条項119〜126のいずれか一項の方法。
条項1〜110のいずれか一項の免疫原、ウイルス様粒子、タンパク質ナノ粒子、核酸分子、またはベクター、およびキットを使用するための指示書を含む、キット。
(「配列セットF」)のうちのいずれか1つと少なくとも80%(少なくとも90%、少なくとも95%、もしくは少なくとも98%、または100%など)同一なアミノ酸配列を含み得、該組換えRSV Fポリペプチドは、RSV F融合前特異的抗体(D25など)に特異的に結合し、かつ/またはRSV F融合前特異的抗原部位(抗原部位φなど)を含む。いくつかの態様において、24時間20℃でpH7.4にてPBS中でのインキュベーション後に、免疫原は該抗体に特異的に結合する、または抗原部位を含む。一部の態様において、組換えRSV Fポリペプチドは、配列セットF由来の配列のうちの1つを含み、かつ20個まで(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、または19個までなど)のアミノ酸置換(保存的アミノ酸置換など)をさらに含み、該組換えRSV Fポリペプチドは、RSV F融合前特異的抗体(D25など)に特異的に結合し、かつ/またはRSV F融合前特異的抗原部位(抗原部位φなど)を含む。当業者であれば、上記で挙げられた配列は、リーダー配列、精製タグ、精製タグを除去するためのプロテアーゼ切断部位、三量体化ドメイン、タンパク質ナノ粒子サブユニットドメイン、または組換えRSV Fタンパク質とは無関係である他の配列を含み得ることを解するであろう。いくつかの態様において、本明細書において提供される免疫原は、上記配列のうちの1つである組換えRSV Fタンパク質を含むが、リーダー配列、精製タグ、精製タグを除去するためのプロテアーゼ切断部位、三量体化ドメイン、タンパク質ナノ粒子サブユニットドメイン、または組換えRSV Fタンパク質とは無関係である他の配列を含まない。組換えRSV Fタンパク質を用いて、対象においてRSVに対する免疫応答を生じさせる方法、または対象におけるRSV感染症を阻止するもしくは治療する方法と、これらのタンパク質配列をコードする核酸分子も提供される。
以下の実施例は、ある特定の態様の特定の特質を例証するために提供されるが、特許請求の範囲は、例示されるそうした特質に限定されるべきではない。
ヒト抗体に結合している呼吸器合胞体ウイルス融合前F三量体の構造
呼吸器合胞体ウイルス(RSV)融合(F)糖タンパク質の融合前立体構造は、ヒト血清中のほとんどのRSV中和抗体の標的であるが、その準安定性により、特徴付けが妨げられてきた。この障壁を克服するために、Fの融合後立体構造に結合せず、かつ予防的抗体パリビズマブ(Synagis(登録商標))よりも>10倍強力である抗体を同定した。F糖タンパク質と複合した、これら抗体のうちの1つであるD25に対する共結晶構造により、D25はFをその融合前状態にロックすることが明らかとなっている。融合前および融合後のF立体構造の比較により、RSV侵入に必要とされる再編成が規定される。D25-F糖タンパク質構造により、融合前特異的でありかつ特徴が四次的である、F糖タンパク質の上部にある新たな脆弱性部位である抗原部位φが明らかとなっている。抗原部位φの規定と合わせた融合前RSV F三量体構造により、向上したワクチン抗原の設計が可能となり、かつRSV介在性疾患の受動的阻止のための新たな手法が導かれるはずである。
ウイルスおよび細胞。以前に記載されているように、ウイルスストックを調製しかつ維持した(Graham et al., J. Med. Virol., 26, 153 (1988))。以前に報告されているように、RSVを発現する緑色蛍光タンパク質(GFP)RSV-GFPを構築した(Hallak et al., Virology. 271, 264 (2000))。フローサイトメトリーに基づく中和および融合アッセイに用いられたRSV-GFPストックの力価は、2.5×107pfu/mlであった。接着アッセイに用いられたRSV A2ストックの力価は、1.02×108pfu/mlであった。HEp-2細胞を、10%ウシ胎仔血清を含有するイーグル最小必須培地(10%EMEM)中で維持し、かつグルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシンを補給した。
RSV Fタンパク質の安定化
本実施例は、融合前立体構造に安定化された例示的なRSV Fタンパク質の設計を例証する。融合後RSV Fタンパク質の構造(PDBアクセッション番号3RRRとして寄託された座標を有する、例えばMcLellan et al., J. Virol., 85, 7788, 2011に開示される)と比較した、D25 Fabと複合した(すなわち、融合前立体構造の状態にある)RSV Fタンパク質の結晶構造は、膜近位および膜遠位ローブの両方において、融合前および融合後の立体構造間の劇的な構造再編成を示し、RSV Fの融合前立体構造の安定化のためのガイダンスを提供する。融合前および融合後のRSV F構造の比較に基づくと、F1サブユニットのN末端およびC末端に位置する、大きな立体構造変化を起こす2つの領域がある。例えば、図2に図解されるように、F1ポリペプチドの位置137〜216および461〜513は、融合前および融合後のFタンパク質立体構造間で構造再編成を受けるが、一方でF1ポリペプチドの位置271〜460は比較的不変のままである。本実施例は、RSV Fタンパク質をその融合前立体構造に安定化させるいくつかのストラテジーを例証する。
融合前立体構造においてプロトマー内ジスルフィド結合を形成するのに十分に近い距離内にあるが、融合後立体構造においてはそうでない、2個のシステイン残基の導入は、Fタンパク質を融合前立体構造にロックし得る。分子内ジスルフィド結合は、三量体内の単一F2/F1プロトマー内で形成され得、ゆえに3つのプロトマーを一緒には架橋しないと考えられる。具体的には、融合前および融合後の構造において、立体構造を変化させる領域と立体構造を変化させない領域との間に形成されるジスルフィド結合は、該タンパク質を融合前立体構造にロックするはずである。一例は、Ser155が、立体構造を変化させる領域に位置し、一方でSer290が、立体構造を変化させない領域にある、S155C/S290C変異体のものである。加えて、F1の位置137〜216内に位置する2個の残基、またはF1の位置461〜513内に位置する2個の残基、またはF1の位置137〜216内の1個の残基およびF1の位置461〜513内の第2の残基など、両方が立体構造を変化させる2つの領域間でのジスルフィド結合の形成も、該タンパク質を融合前立体構造にロックするのに十分であり得る。
融合前立体構造においてプロトマー間ジスルフィド結合を形成するのに十分に近い距離内にあるが、融合後立体構造においてはそうでない、2個のシステイン残基の導入は、Fタンパク質を融合前立体構造にロックし得る。プロトマー間ジスルフィド結合は、三量体内の近接プロトマー間で形成されると考えられ、ゆえに3つのプロトマーを一緒に架橋すると考えられる。具体的には、融合前および融合後の構造において、立体構造を変化させる領域と立体構造を変化させない領域との間に形成されるジスルフィド結合は、該タンパク質を融合前立体構造にロックするはずである。一例は、Ala153が立体構造を変化させる領域に位置し、一方でLys461が立体構造を変化させない領域にある、A153C/K461C変異体のものである。加えて、F1の位置137〜216内に位置する2個の残基、またはF1の位置461〜513内に位置する2個の残基、またはF1の位置137〜216内の1個の残基とF1の位置461〜513内のもう1個の残基など、両方が立体構造を変化させる2つの領域間でのジスルフィド結合の形成も、該タンパク質を融合前立体構造にロックするのに十分であり得る。
融合後RSV Fタンパク質の構造(例えば、McLellan et al., J. Virol., 85, 7788, 2011に開示される;その融合後立体構造の状態にあるRSV Fタンパク質の構造座標は、PDBアクセッション番号3RRRとして蛋白質構造データバンク(PDB)に寄託されている)と比較した、D25 Fabと複合した(すなわち、融合前立体構造の状態にある)RSV Fタンパク質の結晶構造の比較により、Fが融合後立体構造に移行するために崩壊するに違いない、融合前立体構造におけるいくつかの内部空洞またはポケットが同定される。これらの空洞は、表14に挙げられている。したがって、これらの内部空洞を充填することは、融合後立体構造への移行を阻止することによって、Fを融合前状態に安定化させる。空洞は、小さな側鎖を有するものの代わりに大きな側鎖を有するアミノ酸で置換することによって充填される。空洞は、プロトマー内の空洞またはプロトマー間の空洞であり得る。RSVタンパク質をその融合前立体構造に安定化させるRSV F空洞充填改変の一例は、S190F/V207L変異体である。
加えて、RSV Fタンパク質の融合前立体構造は、疎水性相互作用または水素結合形成を増強させるなどによって、近隣残基の相互作用を増加させることによって安定化し得る。さらに、RSV Fタンパク質の融合前立体構造は、融合前立体構造の準安定性につながる、近隣残基の好ましくないまたは反発性の相互作用を低下させることによって安定化し得る。これは、同様に帯電した残基のクラスターを排除することによって達成され得る。そのような改変の例は、表15に示されている。表15は、表示される置換を含有し、かつシグナルペプチド、F2ポリペプチド(位置26〜109)、pep27ポリペプチド(位置110〜136)、F1ポリペプチド(位置137〜513)、三量体化ドメイン(フォルドンドメイン)、およびトロンビン切断部位(LVPRGS(SEQ ID NO: 185の位置547〜552))、および精製タグ(hisタグ(HHHHHH(SEQ ID NO: 185の位置553〜558))およびStrep Tag II(SAWSHPQFEK(SEQ ID NO: 185の位置559〜568)))を含む前駆体F0構築物に対応するSEQ ID NOも挙げている。
加えて、融合前RSV F立体構造において溶媒接触可能であるが、融合後RSV F立体構造においては溶媒接触不能であると考えられるN結合型グリコシル化部位の導入は、融合後状態をとることを阻止することによって、RSV Fを融合前状態に安定化させ得る。N結合型グリコシル化部位を創出するために、Asn-X-Ser/Thrという配列(式中、Xは、Proを除く任意のアミノ酸である)が導入され得る。これは、天然Asn残基に対して2残基C末端側でのSer/Thrアミノ酸の置換によって、または天然Ser/Thr残基に対して2残基N末端側でのAsnアミノ酸の置換によって、または1個の非プロリンアミノ酸によって分離されたAsnおよびSer/Thr残基の両方の置換によって達成され得る。
PreF抗原の膜近位ローブの安定化
上述のように、融合後RSV Fタンパク質の構造(PDBアクセッション番号3RRRとして寄託された座標を有する、例えばMcLellan et al., J. Virol., 85, 7788, 2011に開示される)と比較した、D25 Fabと複合した(すなわち、融合前立体構造の状態にある)RSV Fタンパク質の結晶構造は、膜遠位ローブにおいて、融合前および融合後の立体構造間の劇的な構造再編成を示す。融合前および融合後のRSV F構造の比較に基づくと、F1サブユニットのN末端およびC末端に位置する、大きな立体構造変化を起こす2つの領域がある。例えば、図2に図解されるように、F1ポリペプチドの位置137〜216および461〜513は、融合前および融合後のFタンパク質立体構造間で構造再編成を受けるが、一方でF1ポリペプチドの位置271〜460は比較的不変のままである。本実施例は、RSV Fタンパク質の膜近位ローブを含む、F1のC末端領域を安定化させるいくつかのストラテジーを例証する。三量体化ドメイン(上述のもの)の導入、F1のC末端領域を安定化させるジスルフィド結合を形成し得るシステインペアの導入、および膜貫通ドメインの導入(例えば、膜結合型PreF抗原を含む適用のための)を含めた、様々なストラテジーを同定した。
Fタンパク質の膜近位ローブを安定化させるための1つのストラテジーは、F1のC末端部分を安定化させるジスルフィド結合を導入する1個または複数個のシステイン置換を導入することである(例えば、可溶性PreF抗原を含む適用のための)。そのようなストラテジーを、本明細書において提供される安定化改変のいずれか、例えばS155C/S290Cシステイン置換を有するF1タンパク質など、実施例2に記載されるものと組み合わせることができる。1つのストラテジーには、融合前立体構造の状態にあるF1タンパク質のC末端領域を連結させるプロトマー間ジスルフィド結合を形成するのに十分に近い距離内にある2個のシステイン残基の導入が含まれる。プロトマー間ジスルフィド結合は、三量体内の近接プロトマー間で形成されると考えられ、ゆえに3つのプロトマーを一緒に架橋すると考えられる。上記で記載される方法を用いて、RSV Fタンパク質のいくつかの残基のペアを、対応する残基ペアの位置にシステインが導入された場合にプロトマー間ジスルフィド結合を形成するのに融合前立体構造において十分に接近していると判定した。
(a)486および487
(b)486および487;位置486/487間のP挿入を有する
(c)512および513
(d)493;329/330間のC挿入
(e)493;329/330間のC挿入、および492/493間のG挿入。
Fタンパク質の膜近位ローブを安定させるための別のストラテジーは、例えば膜に固定されたPreF抗原を含む適用のために、F1タンパク質に膜貫通ドメインを含めることである。例えば、膜貫通配列の存在は、膜小胞調製のための膜貫通タンパク質としての発現に有用である。膜貫通ドメインを、本明細書において提供される安定化変異のいずれかを含有するF1タンパク質、例えばS155C/S290Cシステイン置換を有するF1タンパク質など、実施例2に記載されるものに連結させることができる。加えて、膜貫通ドメインを、RSV F1細胞質テールにさらに連結させることができる。シグナルペプチド、F2ポリペプチド(位置26〜109)、pep27ポリペプチド(位置110〜136)、F1ポリペプチド(位置137〜513)、RSV膜貫通ドメインを含む前駆体F0構築物の例は、SEQ ID NO: 323(細胞質ドメインを有しない)および324(細胞質ドメインを有する)として提供されている。
一本鎖PreF抗原
本実施例は、Fタンパク質プロトマーが、F2/F1ヘテロ二量体ではなく単一ポリペプチド鎖として形成されるように、天然フーリン切断部位を欠いている組換えRSV Fタンパク質を例証する。
ジスルフィド結合および三量体化ドメインで安定化されたRSV Fタンパク質
本実施例は、ジスルフィド結合および三量体化ドメインで安定化されたRSV Fタンパク質の産生を例証する。図10に図解されるように、位置155および290におけるセリン残基(リボン図において矢印および赤色の強調表示によって示されている)は、RSV Fタンパク質の融合前立体構造においては互いに近接しているが、RSV Fタンパク質の融合後立体構造においてはそうではない。さらに、これらの残基の側鎖は、互いに向かって配向されている。しかしながら、セリン155、バリン154、およびリジン156に近接した残基の側鎖は、セリン290の側鎖から離れて配向されている。これらの知見を考慮して、S155CおよびS290C置換を有する、組換えRSV Fタンパク質を構築した。この155/290構築物におけるシステイン残基は、組換えRSV Fタンパク質を融合前立体構造にロックすると考えられるジスルフィド結合を形成するであろうこと、しかしながら位置154または156(位置155ではなく)におけるシステインの組み入れは、安定化ジスルフィド結合を産生しないであろうことが予想された。
として明示されるRSV Fタンパク質をコードするように、標準的な分子生物学技術を用いて変異させた。
PreF抗原を用いた、中和免疫応答の誘導
本実施例は、対象においてRSV中和免疫応答を誘発するPreF抗原の使用を例証する。
1)5×106pfuの生きたRSV A2(RSV)を鼻腔内に;
2)ホルマリン不活性化した、alum沈殿させたRSV(FI-RSV)を筋肉内に(IM);
3)polyI:C 50μg中、安定化融合前RSV F(RSVF(+)FdTHS S155C、S290C;融合前F)20μgをIM;
4)polyI:C 50μg中、融合後RSV F三量体(融合後RSV)20μgをIM。
開示される抗原を用いた対象の治療
本実施例は、開示されるPreF抗原、またはPreF抗原をコードする、発現する、もしくは含む核酸もしくはウイルスベクターのうちの1つまたは複数の投与によって、RSV感染症を有するまたは有する危険性がある対象を治療するために用いられ得る方法を記載する。特定の例において、該方法は、RSV感染症を有している、有すると考えられる、または有する危険性がある(例えば、損なわれた免疫、生理的状態、またはRSVへの曝露に起因する)対象をスクリーニングする工程を含む。例えば血清学的試験、身体検査、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、放射線学的スクリーニング、または当業者に公知の他の診断技術を用いて、未知の感染状態の対象を検査して、彼らが感染症を有するかどうかを判定することができる。一部の例において、RSV感染症を有するまたはRSV感染症を獲得する危険性がある対象が選択される。RSV感染症を有し、それによって、開示されるPreF抗原、またはPreF抗原をコードする、発現する、もしくは含む核酸もしくはウイルスベクターの投与によって治療可能であることが見出された(または知られる)対象が、該PreF抗原、またはPreF抗原をコードする、発現する、もしくは含む核酸もしくはウイルスベクターを受けるために選択される。RSV感染症を発症する危険性がある対象、例えば高齢者、免疫欠陥がある人、および乳児などの非常に若い人も選択され得る。
ジスルフィド結合、空洞充填置換、および三量体化ドメインで安定化されたRSV Fタンパク質
本実施例は、ジスルフィド結合および三量体化ドメインで安定化されたRSV Fタンパク質の産生を例証する。
呼吸器合胞体ウイルスに対する融合糖タンパク質ワクチンについての構造ベースの設計
摘要。呼吸器合胞体ウイルス(RSV)は、5歳を下回る子どもに対する入院原因の第1位である。RSVに対する防御的体液性応答を誘発するために、融合(F)糖タンパク質の融合前状態に特異的な準安定性部位である抗原部位φに対して、この部位は天然感染によって誘発される高度に強力なRSV中和抗体の主要な標的であるため、努力を集中させた。pHおよび温度の極限に対して抗原部位φを保った、Fの安定化バージョンを操作する、構造ベースの設計を用いた。6種の安定化Fの結晶構造は、導入されたシステイン残基および充填された疎水性空洞についての原子レベルでの詳細を提供し、かつわずかに異なる「融合前」F立体構造を明らかにした。マウスおよび非ヒト霊長類の両方において、RSV Fの部位φ安定化変種による免疫は、その融合後状態にあるRSV Fによって誘発されたものよりも3〜15倍高いRSV特異的中和活性を誘発した。ゆえに、ウイルス脆弱性の超部位を提示する原子レベルの設計は、ワクチン開発に対して変革的効果を有し得る。
並外れて強力なRSV中和抗体によるその認識が理由で、抗原部位φが標的超部位として選出され、D25抗体と複合したその構造は本明細書において記載されている(図26B)。部位φを安定して提示するRSV Fの変種を操作するために、D25が結合するRSV Fの構造を解析した。機械的には、タンパク質立体構造を安定化させるいくつかの手段がある。その認識に支障をきたすことなく部位φを安定化させるメカニズムを、RSV Fエクトドメイン(McLellan et al., J. Virol. 85, 7788 (2011))のC末端に付随したT4ファージフィブリチン三量体化ドメイン(「フォルドン」)(Efimov et al., J Mol Biol 242, 470 (1994);Boudko et al., European journal of biochemistry / FEBS 269, 833 (2002))と組み合わせてついて試験した。
DS、Cav1、およびTriC変種は、多様な物理的特性および抗原特性を呈示した。DS変種は、pHおよび温度の極限に対して最も安定性が低かったが、より恒久的に三量体状態に安定化され、一方でCav1およびTriCに関しては、三量体から凝集体への一定の相互変換が観察された。DS、Cav1、およびTriCを組み合わせることによって、RSV Fのより最適な変種が獲得され得るかどうかを査定するために、すべての組み合わせを作製した。
原子レベルでのフィードバックを提供するために、RSV Fの部位φ安定化変種の結晶構造を決定した(図28)。DS、Cav1、DS-Cav1、およびDS-Cav1-TriC変種すべてを、同様の1.5M酒石酸(tartrate)pH9.5条件で結晶化し、これらの立方晶は、それぞれ3.1Å、3.1Å、3.8Å、および2.8Åの分解能に対してX線を回折した(図40)。D25結合型RSV F構造をサーチモデルとして用いることによって分子置換溶液を獲得し、これらは、結晶学的3回転に沿って整列した三量体F軸を有する、非対称ユニットの状態にある単一RSV Fプロトマーを明らかにした。1.7M硫酸アンモニウムpH5.5条件から、Cav1の正方晶およびDS-Cav1の立方晶も獲得し、これらは、それぞれ2.4Åおよび3.0Åの分解能に対して回折した(図40)。分子置換により、正方格子は、非対称ユニットの状態にある完全なRSV F三量体を有すること、および酒石酸立方格子に高度に関連していることが明らかとなった。全体として、これらの構造は、操作されたRSV F変種が、実質的にD25結合型立体構造の状態にあることを明らかにした(操作されたRSV F変種は、D25結合型立体構造からの0.68〜1.5Å、および融合後立体構造からのおよそ30ÅというC-平均二乗偏差を有した)。
RSV防御的体液性応答の誘発に対する部位φ安定化の効果を査定するために、50μg polyI:Cアジュバントと組み合わせた10μg RSV Fを0週目および3週目に各マウスに注入して、CB6マウスを様々な形態のRSV Fで免疫し、かつ5週目の血清がHEp-2細胞のRSV感染を阻止し得る能力を測定した。DS、Cav1、およびTriCはそれぞれ、高力価の中和活性を誘発した(1826〜2422という幾何平均50%有効濃度(EC50))。このレベルは、融合後F(504 EC50)によって誘発されたものよりも約3倍高く、かつ防御的閾値よりも約20倍高かった。比較すると、DS-Cav1は、融合後Fよりも大体7倍高くかつ防御的閾値よりも40倍高い、3937 EC50という中和活性を誘発した(図29A)。(パリビズマブ(Synagis(登録商標))が15mg/kgの濃度で投薬された場合、低値での血清レベルは、乳児において重度の疾患からの防御を提供する約40μg/mlである。中和アッセイにおいて、血清中の40μg/mlのパリビズマブは、100というEC50をもたらす。この力価は、RSVを抗原投与されたマウスおよびコットンラットにおける、下気道感染症からの完全な防御とも関連する。)
設計、物理的特性および抗原特性、原子レベルの構造、ならびに免疫原性の間の相互関係によって生み出された情報の行列(図26C)は、さらなる最適化のための基礎を提供する(Nabel, Science 326, 53 (2009))。例えば、操作されたRSV Fの様々な抗原特性および物理的特性と、RSV防御的応答の誘発との間の関係性についての洞察を得るために、特性(図31)と免疫原性(図29)とを相関させることができる。そのような相関により、物理的極限に対する部位φ安定性を増加させる(しかしながら、三量体収量もD25アフィニティーも増加させない)ことは、免疫があると誘発される防御的力価を増加させるはずであることが示され(図30A)、それによってさらなる最適化についての設計洞察が提供される。同様に、RSV Fの様々な立体構造状態または領域(図28)と免疫原性(図29)との間の相関により、最も防御的な応答を提供する、RSV Fの立体構造についての設計洞察が提供される。この場合、結果は、そのD25結合型立体構造における抗原部位φの構造擬態を増強させることにより、防御的力価の向上につながるはずであることを示している(図30B)。
ウイルスおよび細胞。以前に記載されているように、ウイルスストックを調製しかつ維持した(Graham et al., J. Med. Virol., 26, 153 (1988))。以前に報告されているように、RSVを発現する緑色蛍光タンパク質(GFP)RSV-GFPを構築し、用意した(Hallak et al., Virology. 271, 264 (2000))。フローサイトメトリーに基づく中和および融合アッセイに用いたRSV-GFPストックの力価は、2.5×107pfu/mlであった。接着アッセイに用いたRSV A2ストックの力価は、1.02×108pfu/mlであった。HEp-2細胞を、10%ウシ胎仔血清を含有するイーグル最小必須培地(10%EMEM)中で維持し、かつグルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシンを補給した。
融合前立体構造に安定化された一本鎖RSV Fタンパク質
本実施例は、Fタンパク質プロトマーが、F2/F1ヘテロ二量体ではなく単一ポリペプチド鎖として形成されるように、天然フーリン切断部位を欠いているさらなる組換えRSV Fタンパク質を例証する。さらなる融合前安定化一本鎖RSV Fタンパク質の設計を図解した概略図は、図43および44に提供されている。
DSCav1変異を有する、B18537系統由来のRSV Fタンパク質の構造
本実施例は、RSVサブタイプにわたる、安定化DSCav1置換を有するRSVタンパク質の類似性を例証した。DSCav1置換を、B18537系統由来のRSV Fタンパク質に導入した。そして、C末端フォルドンドメインを含む、結果として生じた組換えタンパク質の三次元構造を、上記で記載されるものと同様の方法を用いて解明した。図59〜62に示されるように、DSCav1置換をRSV F糖タンパク質Bサブタイプに導入することに成功し、抗原部位φを安定化させて、融合前特異的抗体に特異的に結合するサブタイプBバックグラウンドのDSCav1変異体を生成することができた。下記の表25は、RSV FサブタイプBに対するDSCav1についての結晶データの概要を提供している。
三量体化ドメインを有しない組換えRSV Fタンパク質の設計および産生
本実施例は、融合前立体構造に安定化されているが、RSV Fタンパク質の膜近位ローブの安定性を維持するC末端三量体化ドメインを含まない、組換えRSV Fタンパク質の設計および産生を例証した。
RSV Fエクトドメインの膜遠位部分を安定化させるさらなる変異
本実施例は、RSV Fに対してなされた、該タンパク質をその融合前立体構造に安定化させるさらなる変異を例証する。
最小部位φ免疫原
RSV Fの部位φエピトープは、三量体スパイクの先端に位置し、3種の中和抗体D25、AM22、および5C4によって認識される領域を含む。より具体的には、RSV F/D25複合体の結晶構造によって描出されるように、このエピトープは、ヘリックスα4の外表面(残基196〜210)、ならびにβ2およびα1間の近接ループ(残基63〜68)を含む。本実施例は、最小隣接残基のみを有する部位φを提示する抗原の設計および特徴付けを例証し、これは部位φ免疫応答を誘発するために用いることができ、かつ全長の融合前安定化RSV F三量体よりも産生するのに費用効果があり得る。
4つの主な設計構想:円順列変異、足場を組んだ円順列変異、ドメインIII免疫原、および多量体化を利用して、最小部位φ免疫原を設計した。
部位φ円順列変異:TZ-13(354567-108)平均:3.18(SEQ ID NO: 1040)
足場を有する部位φ円順列変異:JG_2KN0(354567-417)平均:3.00(SEQ ID NO: 1053)
ドメインIII:E-CP_RBD51-307_14mutDS-Cav1_THS(354567-273)平均:3.17(SEQ ID NO: 1156)
ドメインIII二量体:GSJnh4-TWIN(354567-693)平均:3.06(SEQ ID NO: 1194)
部位φ円順列変異:TZ-19(354567-126)平均:3.08(SEQ ID NO: 1106)
ドメインIII(2つが結び付いている):RSVF(+)THS_s_to_hp2_フォルドン(354567-210)平均:3.08(SEQ ID NO: 1170)、およびMS_08(354567-447)平均:3.08(SEQ ID NO: 1188)
ドメインIII二量体:GSJnh4Fd-TWIN(354567-705)平均:3.01(SEQ ID NO: 1212)
フェリチン上の部位φ円順列変異:2m0e-resurf1-フェリチン(354567-621)平均:2.81(SEQ ID NO: 1276)
フェリチン上のドメインIII:GSJnh2F(354567-471)平均:3.10(SEQ ID NO: 1220)
非フェリチンオリゴマー上の単量体:LS1-E-CP_RBD51-307_11mutDS-Cav1_THS(354567-315)平均:2.72(SEQ ID NO: 1281)
付加的なもの:MP11(354567-642)平均:3.05(SEQ ID NO: 1263)
ナノ粒子上のドメインIII(2):GSJnh2Fd-F(354567-483)平均:2.57(SEQ ID NO: 1266)、およびGSJnh4Fd-F(354567-489)平均:2.02(SEQ ID NO: 1268)
融合前安定化Fタンパク質の免疫原性
一連のアッセイ(上記で提供されるものに加えて)を実施して、融合前立体構造に安定化されている本明細書において提供される組換えRSV Fタンパク質の免疫原性を例証した。結果は、融合前立体構造に安定化された提供される組換えRSV Fタンパク質を用いて、複数の動物モデルにおいて免疫応答を誘導し得ること、さらに、この免疫応答の誘導が、将来的なウイルスの攻撃を防御することを示している。
DS(サブタイプA)=RSV A2 F(+)FdTHS S155C、S290C(SEQ ID NO: 185)
DS(サブタイプB)=RSV B18537 F(+)FdTHS S155C、S290C(SEQ ID NO: 1479)
DS-Cav1(サブタイプA)=RSV A2 F(+)FdTHS S155C、S290C、S190F、V207L(SEQ ID NO: 371)
DS-Cav1(サブタイプB)=RSV B18537 F(+)FdTHS S155C、S290C、S190F、V207L(SEQ ID NO: 372)
融合後F(サブタイプA)=RSV A2 F(+) dFPTHS
Claims (107)
- 天然RSV Fタンパク質と比較して、非天然ジスルフィド結合を形成するS155CおよびS290C置換を含む組換えRSV Fタンパク質を含む免疫原であって、該組換えRSV Fタンパク質が、RSV F融合前特異的抗体に特異的に結合する、免疫原。
- 組換えRSV Fタンパク質が、SEQ ID NO: 124の、それぞれアミノ酸26〜103および145〜310と少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むF2ポリペプチドおよびF1ポリペプチドを含むかまたはそれらからなる、請求項1記載の免疫原。
- 組換えRSV Fタンパク質が、SEQ ID NO: 124の、それぞれアミノ酸26〜103および145〜513と少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むF2ポリペプチドおよびF1ポリペプチドを含むかまたはそれらからなる、請求項1記載の免疫原。
- 組換えRSV Fタンパク質が、SEQ ID NO: 124の、それぞれアミノ酸26〜103および145〜529と少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むF2ポリペプチドおよびF1ポリペプチドを含むかまたはそれらからなる、請求項1記載の免疫原。
- 組換えRSV Fタンパク質が、SEQ ID NO: 124の、それぞれアミノ酸26〜103および145〜551と少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むF2ポリペプチドおよびF1ポリペプチドを含むかまたはそれらからなる、請求項1記載の免疫原。
- 組換えRSV Fタンパク質が、位置190、位置207、または位置190および207において、F、L、W、Y、H、またはM置換をさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の免疫原。
- 組換えRSV Fタンパク質が、S155C、S290C、およびS190F置換、またはS155C、S290C、S190F、およびV207L置換を含む、請求項6記載の免疫原。
- 組換えRSV Fタンパク質が、
1つまたは複数の非天然ジスルフィド結合を形成する、位置512および513、位置519および520、または位置526および527のうちの1つまたは複数におけるシステイン置換のペア
をさらに含む、請求項4〜7のいずれか一項記載の免疫原。 - 組換えRSV Fタンパク質が一本鎖RSV Fタンパク質である、請求項1〜8のいずれか一項記載の免疫原。
- D25またはAM22融合前特異的抗体に特異的に結合する、請求項1〜9のいずれか一項記載の免疫原。
- F2ポリペプチドおよびF1ポリペプチドが異種ペプチドリンカーによって連結しているかまたは直接連結しており、かつ組換えRSV Fタンパク質がpep27ポリペプチドを含まない、請求項1〜10のいずれか一項記載の免疫原。
- 組換えRSV Fタンパク質が三量体化ドメインに連結している、請求項1〜11のいずれか一項記載の免疫原。
- 組換えRSV Fタンパク質がタンパク質ナノ粒子サブユニットに連結している、請求項1〜12のいずれか一項記載の免疫原。
- RSV F融合前特異的抗体に特異的に結合する融合前立体構造に組換えRSV Fタンパク質を安定化させる、天然RSV Fタンパク質と比較して少なくとも1個のアミノ酸置換を含む組換えRSV Fタンパク質またはそのフラグメント
を含む単離された免疫原であって、
該免疫原が、該抗体の非存在下で少なくとも24時間生理的pHでリン酸緩衝生理食塩水における20℃でのインキュベーション後に該抗体に特異的に結合し、かつ該抗体が、融合後立体構造の状態にあるRSV Fタンパク質には結合しない、単離された免疫原。 - 組換えRSV Fタンパク質またはそのフラグメントの融合前立体構造が、融合前特異的抗体に特異的に結合する抗原部位φを含み、かつ該抗原部位φが、SEQ ID NO: 1〜184のうちの1つとして明示される天然RSV Fタンパク質配列の残基62〜69および196〜209を含む、請求項14記載の免疫原。
- D25、AM22、5C4、またはMPE8融合前特異的抗体に特異的に結合する、請求項14または請求項15記載の免疫原。
- 天然RSV Fタンパク質が、RSV A、B、またはウシRSV Fタンパク質である、請求項14〜16のいずれか一項記載の免疫原。
- 組換えRSV Fタンパク質またはそのフラグメントが、F1ポリペプチドおよびF2ポリペプチドを含み、かつ任意で、pep27ポリペプチドまたはその一部を含まない、請求項14〜17のいずれか一項記載の免疫原。
- F2およびF1ポリペプチドがそれぞれRSV Fの位置62〜69および196〜209を含み、かつ
該F2ポリペプチドがRSV Fの位置26〜109の8〜84個の残基を含むかまたはそれらからなり、かつ
該F1ポリペプチドがRSV Fの位置137〜529の14〜393個の残基を含むかまたはそれらからなり、
該RSV Fの位置が、SEQ ID NO: 124として明示される参照F0ポリペプチドのアミノ酸配列に対応する、
請求項18記載の免疫原。 - F2ポリペプチドのC末端残基およびF1ポリペプチドのN末端残基が、それぞれRSV Fの位置97および137;97および145;97および150;102および144;102および145;102および146;102および147;103および144;103および145;103および146;103および147;104および144;104および145;104および146;104および147;105および144;105および145;105および146;105および147;または105および150を含む、請求項19記載の免疫原。
- F2およびF1ポリペプチドが、それぞれ26〜109および137〜513;26〜107および137〜513;26〜107および145〜513;26〜105および137〜513;26〜105および145〜513;26〜103および145〜513;26〜109および137〜529;26〜107および137〜529;26〜107および145〜529;26〜105および137〜529;26〜105および145〜529;26〜103および145〜529;46〜103および147〜310;46〜104および146〜310;50〜96および149〜306;51〜103および146〜307;51〜103および139〜307;50〜105および146〜306;または53〜97および148から305〜320の中の1箇所までであるRSV Fの位置を含むかまたはそれらからなる、請求項19記載の免疫原。
- F1およびF2ポリペプチドが、SEQ ID NO: 1〜184のうちのいずれか1つとして明示される天然RSV Fタンパク質配列の対応する配列と少なくとも80%同一である、請求項18〜21のいずれか一項記載の免疫原。
- 組換えRSV Fタンパク質が一本鎖RSV Fタンパク質であり、かつF2およびF1ポリペプチドが異種ペプチドリンカーによって連結しているかまたは直接連結している、請求項18〜22のいずれか一項記載の免疫原。
- F2ポリペプチドの位置105が、F1ポリペプチドの位置145にGly-Serリンカーによって連結している;または
F2ポリペプチドの位置103が、F1ポリペプチドの位置145に直接連結している、
請求項23記載の免疫原。 - 異種ペプチドリンカーが、SEQ ID NO: 356〜365もしくは1443〜1453のうちの1つとして明示されるアミノ酸配列を含む、またはG、S、GG、GS、SG、GGG、もしくはGSGリンカーである、請求項23または請求項24記載の免疫原。
- 組換えRSV Fタンパク質が、
(a)システインペア間の非天然ジスルフィド結合;
(b)空洞充填アミノ酸置換;
(c)再パッキングアミノ酸置換;
(d)N結合型グリコシル化部位;または
(e)(a)〜(d)のうちの2つもしくはそれ以上の組み合わせ
によって、RSV Fタンパク質融合前立体構造に安定化されている、請求項14〜25のいずれか一項記載の免疫原。 - システインのペアが第1のシステインおよび第2のシステインを含み、かつ第1のシステインが、RSV Fの位置137〜216の中の1箇所にアミノ酸置換によって導入されており、かつ第2のシステインが、RSV Fの位置271〜460の中の1箇所にアミノ酸置換によって導入されている、請求項26記載の免疫原。
- システインのペアが、それぞれがCα炭素およびCβ炭素を含む第1のシステインおよび第2のシステインを含み、かつ
(a)第1のシステインが、RSV Fの位置137〜216または461〜513の中の1箇所にアミノ酸置換によって導入されており、かつ第2のシステインが、RSV Fの位置26〜61、77〜97、または271〜460の中の1箇所にアミノ酸置換によって導入されており;かつ
(b)表1に提供される構造座標によって明示される三次元構造において、各Cβ炭素に対する最適な回転異性体を用いた際、第1のシステイン位置のCα炭素が、第2のシステイン位置のCα炭素から2.0〜8.0Åであり、かつ/または第1のシステイン位置のCβ炭素が、第2のシステイン位置のCβ炭素から2.0〜5.5Åである、請求項26記載の免疫原。 - システインのペアが、それぞれがCα炭素およびCβ炭素を含む第1のシステインおよび第2のシステインを含み、かつ
(a)第1のシステインおよび第2のシステインが、RSV Fの位置137〜216もしくはRSV Fの位置461〜513にアミノ酸置換によって導入されているか;または第1のシステインが、RSV Fの位置137〜216にアミノ酸置換によって導入されており、かつ第2のシステインが、RSV Fの位置461〜513にアミノ酸置換によって導入されており;かつ
(b)表1に提供される構造座標によって明示される三次元構造において、各Cβ炭素に対する最適な回転異性体を用いた際、第1のシステイン位置のCα炭素が、第2のシステイン位置のCα炭素から2.0〜8.0Åであり、かつ/または第1のシステイン位置のCβ炭素が、第2のシステイン位置のCβ炭素から2.0〜5.5Åである、請求項26記載の免疫原。 - 非天然ジスルフィド結合が、RSV Fの位置155と290との間のプロトマー内ジスルフィド結合を含む、請求項26記載の免疫原。
- 組換えRSV Fタンパク質が、S155CおよびS290C置換を含む、請求項30記載の免疫原。
- 組換えRSV Fタンパク質が、SEQ ID NO: 185の残基26〜109および137〜513、残基26〜103および145〜513、または残基26〜105および145〜513と少なくとも80%の同一性を含むアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる、請求項31記載の免疫原。
- 位置190、位置207、または位置190および207におけるF、L、W、Y、H、またはM置換を含む空洞充填アミノ酸置換を含む、請求項26〜32のいずれか一項記載の免疫原。
- 190F;190L;190W;190Y;190H;190M;190Fおよび207L;190Fおよび207F;190Fおよび207W;190Lおよび207L;190Lおよび207F;190Lおよび207W;190Wおよび207L;190Wおよび207F;190Wおよび207W;190Yおよび207L;190Yおよび207F;190Yおよび207W;190Hおよび207L;190Hおよび207F;190Hおよび207W;190Mおよび207L;または190Mおよび207F;190Mおよび207Wのうちの1つを含む空洞充填アミノ酸置換を含む、請求項33記載の免疫原。
- 組換えRSV Fタンパク質が、SEQ ID NO: 191の残基26〜109および137〜513、残基26〜103および145〜513、または残基26〜105および145〜513と少なくとも80%の同一性を含むアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる、請求項34記載の免疫原。
- 組換えRSV Fタンパク質が、位置155および290におけるシステイン置換間の非天然ジスルフィド結合、ならびに位置190、位置207、または位置190および207におけるF、L、W、Y、H、またはM空洞充填置換を含む、請求項26記載の免疫原。
- 組換えRSV Fタンパク質が、S155C、S290C、およびS190F置換、またはS155C、S290C、S190F、およびV207L置換を含む、請求項36記載の免疫原。
- 組換えRSV Fタンパク質が、
SEQ ID NO: 185(DS、サブタイプA)、1479(DS、サブタイプB)、371(DS-Cav1、サブタイプA)、372(DSCav1、サブタイプB)、373(DSCav1、ウシ)、374(DS S190F、サブタイプA)、375(DS、S190F、サブタイプB)、または376(DS、S190F、ウシ)のうちの1つにある、それぞれ残基26〜109および137〜513、またはそれぞれ26〜103および145〜513、またはそれぞれ26〜105および145〜513と少なくとも80%の同一性を含むアミノ酸配列
を含むかまたはそれらからなる、請求項26記載の免疫原。 - 組換えRSV Fタンパク質が、
SEQ ID NO: 669の残基26〜476(BZGJ9 DS-Cav1)
SEQ ID NO: 706の残基26〜472(BZGJ9-9 DS-Cav1)
SEQ ID NO: 707の残基26〜474(BZGJ9-10 DS-Cav1)
と少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含む、請求項26記載の免疫原。 - F1ポリペプチドが、RSVの位置492から位置510〜529の中の1箇所までを含むRSV α10ヘリックスを含み、かつF1ポリペプチドが、非天然プロトマー間ジスルフィド結合を形成する少なくとも2個のシステイン置換を含む、請求項26〜39のいずれか一項記載の免疫原。
- 組換えRSV Fタンパク質またはそのフラグメントが、SEQ ID NO: 1〜184のうちのいずれか1つに明示される、以下のRSV F2およびF1位置:
(a)それぞれ56〜97および189〜211;
(b)それぞれ58〜97および192〜242;
(c)それぞれ59〜97および194〜240;
(d)それぞれ60〜75および193〜218;
(e)それぞれ60〜94および192〜229;
(f)それぞれ60〜94および192〜232;
(g)それぞれ60〜94および193〜237;
(h)それぞれ60〜95および192〜240;
(i)それぞれ60〜96および192〜239;
(j)それぞれ60〜97および192〜242;
(k)それぞれ60〜97および194〜239;
(l)それぞれ61〜96および192〜235;
(m)それぞれ61〜96および192〜240;
(n)それぞれ62〜69および196〜209;または
(o)(a)〜(m)のうちのいずれか1つに挙げられたF2およびF1位置の円順列変異(circular permutation)
と少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなり、該RSV F2およびF1位置が異種リンカーによって接合されている、請求項19記載の免疫原。 - 組換えRSV Fタンパク質またはそのフラグメントが、SEQ ID NO: 1〜184のうちのいずれか1つに明示される、以下のRSV F2およびF1位置:
(a)それぞれ46〜103および147〜310;
(b)それぞれ46〜104および146〜310;
(c)それぞれ50〜96および149〜306;
(d)それぞれ51〜103および146〜307;
(e)それぞれ51〜103および139〜307;
(f)それぞれ50〜105および146〜306;
(g)53〜97および148から305〜320の中の1箇所まで;または
(h)(a)〜(g)のうちのいずれか1つに挙げられたF2およびF1位置の円順列変異
と少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなり、該RSV F2およびF1位置が種リンカーによって接合されているかまたは直接連結している、請求項19記載の免疫原。 - 組換えRSV Fタンパク質が、位置155および290におけるシステイン置換、ならびに位置190、位置207、または位置190および207におけるF、L、W、Y、H、またはM置換を含む、請求項43記載の免疫原。
- 組換えRSV Fタンパク質が、S155CおよびS290C置換;S155C、S290C、およびS190F置換;またはS155C、S290C、S190F、およびV207L置換を含む、請求項44記載の免疫原。
- 異種リンカーが、SEQ ID NO: 1443〜1455のうちのいずれか1つとして明示されるアミノ酸配列、またはG、S、GG、GS、SG、GGG、もしくはGSGリンカーを含むかまたはそれらからなる、請求項42〜44のいずれか一項記載の免疫原。
- 組換えRSV Fタンパク質が足場タンパク質に連結している、前記請求項のいずれか一項記載の免疫原。
- RSV F融合前エピトープを含むポリペプチドに共有結合で連結された異種足場タンパク質を含むエピトープ-足場タンパク質を含む免疫原であって、RSV F融合前特異的抗体が該エピトープ-足場タンパク質に特異的に結合する、免疫原。
- RSV Fタンパク質融合前エピトープが、異種ペプチドリンカーによって連結されたRSV Fの位置62〜69および196〜209、またはその円順列変異体(circular permutant)を含むかまたはそれらからなり、該位置が、SEQ ID NO: 124として明示される参照F0ポリペプチドのアミノ酸配列に対応する、請求項48記載の免疫原。
- 異種足場タンパク質が、2KNO、2A90、2W59、3U2E、2VJ1、1CHD、1PQZ、または2MOE足場タンパク質のうちの1つである、請求項48または請求項49記載の免疫原。
- エピトープ足場タンパク質が、RSV Fタンパク質と少なくとも80%同一なアミノ配列、およびSEQ ID NO: 1053のうちのいずれか1つに明示される足場タンパク質配列を含むかまたはそれらからなる、請求項50記載の免疫原。
- SEQ ID NO: 1040の残基1〜128(TZ-13);
SEQ ID NO: 1053の残基1〜126(JG_2KN0);
SEQ ID NO: 1106の残基1〜187(TZ-19);
SEQ ID NO: 1156の残基27〜247(E-CP_RBD51-307_14mutDS-Cav1_THS);
SEQ ID NO: 1170の残基26〜282(RSVF(+)THS_s_to_hp2_foldon9);
SEQ ID NO: 1188の残基21〜283(MS_08);
SEQ ID NO: 1194の残基27〜553(GSJnh4-TWIN);または
SEQ ID NO: 1212の残基26〜580(GSJnh4Fd-TWIN)
と少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含む、請求項42または請求項43記載の免疫原。 - 組換えRSV Fタンパク質またはそのフラグメントの多量体を含む、前記請求項のいずれか一項記載の免疫原。
- 組換えRSV Fタンパク質もしくはそのフラグメントまたはエピトープ足場タンパク質が、三量体化ドメインに連結している、前記請求項のいずれか一項記載の免疫原。
- 組換えRSV Fタンパク質のF1ポリペプチドのC末端が、三量体化ドメインに連結している、請求項54記載の免疫原。
- 三量体化ドメインがフォルドンドメインである、請求項54または請求項55記載の免疫原。
- F1ポリペプチドと三量体化ドメインとの間にプロテアーゼ切断部位をさらに含む、請求項54〜56のいずれか一項記載の免疫原。
- プロテアーゼ切断部位と三量体化ドメインとの間に膜貫通ドメインをさらに含む、請求項57記載の免疫原。
- 三量体化ドメインに連結された組換えRSV Fタンパク質が、
SEQ ID NO: 185(DS、サブタイプA)、1479(DS、サブタイプB)、371(DS-Cav1、サブタイプA)、372(DSCav1、サブタイプB)、373(DSCav1、ウシ)、374(DS S190F、サブタイプA)、375(DS、S190F、サブタイプB)、または376(DS、S190F、ウシ)のうちの1つにある残基26〜109および137〜544、または26〜103および145〜544と少なくとも80%の同一性を含むアミノ酸配列
を含むかまたはそれらからなる、請求項54記載の免疫原。 - 三量体化ドメインに連結された組換えRSV Fタンパク質が、
SEQ ID NO: 669の残基26〜476(BZGJ9 DSCav1)
SEQ ID NO: 706の残基26〜472(BZGJ9-9 DSCav1)
SEQ ID NO: 707の残基26〜474(BZGJ9-10 DSCav1)
の残基と少なくとも80%の同一性を含むアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる、請求項54記載の免疫原。 - 組換えRSV Fタンパク質もしくはそのフラグメントまたはエピトープ足場タンパク質が、タンパク質ナノ粒子サブユニットに連結している、前記請求項のいずれか一項記載の免疫原。
- 組換えRSV Fタンパク質もしくはそのフラグメントまたはエピトープ足場タンパク質のC末端が、タンパク質ナノ粒子サブユニットに連結している、前記請求項のいずれか一項記載の免疫原。
- タンパク質ナノ粒子サブユニットが、フェリチン、エンカプスリン、硫黄オキシゲナーゼレダクターゼ(SOR)、ルマジンシンターゼ、またはピルビン酸デヒドロゲナーゼのナノ粒子サブユニットである、請求項61または請求項62記載の免疫原。
- フェリチンナノ粒子サブユニットが、SEQ ID NO: 350の残基517〜679と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ任意で、フェリチンポリペプチド内にC31S、C31A、またはC31V置換を含み;
SORサブユニットが、SEQ ID NO: 344またはSEQ ID NO: 345の残基516〜825と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;
ルマジンシンターゼサブユニットが、SEQ ID NO: 346もしくはSEQ ID NO: 348の残基517〜670、またはSEQ ID NO: 347の残基517〜669と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;または
ピルビン酸デヒドロゲナーゼシンターゼサブユニットが、SEQ ID NO: 349の残基516〜757と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項63記載の免疫原。 - フェリチンに連結された組換えRSV Fタンパク質が、SEQ ID NO: 377〜382(A、B、ウシ-DSCav1、およびDS S190Fフェリチン粒子)のうちのいずれか1つの残基26〜105および137〜679と少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなり、フェリチンに連結された組換えRSV Fタンパク質が、融合前特異的抗体に特異的に結合するフェリチンナノ粒子を形成する、請求項63記載の免疫原。
- フェリチンに連結された組換えRSV Fタンパク質が、
SEQ ID NO: 1429の残基28〜664(BZGJ9 DS-Cav1 Longlinkフェリチン);
SEQ ID NO: 1430の残基28〜663(BZGJ9-9 DS-Cav1 Longlinkフェリチン);または
SEQ ID NO: 1431の残基28〜665(BZGJ9-10 DS-Cav1 Longlinkフェリチン)
と少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる、請求項63記載の免疫原。 - SEQ ID NO: 1220の残基56〜500(GSJnh2F);
SEQ ID NO: 1263の残基48〜429(MP11);
SEQ ID NO: 1266の残基56〜536(GSJnh2Fd-F);
SEQ ID NO: 1268の残基56〜526(GSJnh4Fd-F);
SEQ ID NO: 1275の残基53〜256(m0e-resurf1-フェリチン);または
SEQ ID NO: 1281の残基52〜437(LS1-E-CP_RBD51-307_11mutDS-Cav1_THS)
と少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含む、請求項63記載の免疫原。 - 組換えRSV Fタンパク質が精製タグに連結している、前記請求項のいずれか一項記載の免疫原。
- 組換えRSV Fタンパク質が、生理的pHにおいてリン酸緩衝生理食塩水中で三量体を形成する、前記請求項のいずれか一項記載の免疫原。
- 免疫原が、水溶液中でインキュベートされた場合に免疫原の均質集団を形成し、該溶液中でインキュベートされた免疫原の少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、および/または少なくとも95%が、
(a)50℃にて、350mM NaCl pH7.0中で1時間のインキュベーション;
(b)25℃にて、350mM NaCl pH3.5中で1時間のインキュベーション;
(c)25℃にて、350mM NaCl pH10中で1時間のインキュベーション;
(d)25℃にて、10mMモル浸透圧濃度、pH7.0中で1時間のインキュベーション;
(e)25℃にて、3000mMモル浸透圧濃度、pH7.0中で1時間のインキュベーション;もしくは
(f)350mM NaCl pH7.0中で10回の凍結融解サイクル;または
(g)(a)〜(f)のうちの2つもしくはそれ以上の組み合わせ
の後に融合前特異的抗体に特異的に結合し、該免疫原が融合前特異的抗体の非存在下で該溶液中でインキュベートされる、前記請求項のいずれか一項記載の免疫原。 - (a)組換えRSV Fタンパク質またはそのフラグメントが、RSV Fの位置481と489との間またはRSV Fの位置509と510との間にジスルフィド結合を含まず;
(b)組換えRSV Fタンパク質またはそのフラグメントが、RSV Fの位置481、489、509、510、またはそれらの組み合わせにおいてシステイン残基を含まず;
(c)(a)および(b)の組み合わせである、
前記請求項のいずれか一項記載の免疫原。 - 請求項1〜61のいずれか一項記載の免疫原を含む、ウイルス様粒子。
- 請求項1〜67のいずれか一項記載の免疫原を含む、タンパク質ナノ粒子。
- タンパク質ナノ粒子が、フェリチンナノ粒子、エンカプスリンナノ粒子、硫黄オキシゲナーゼレダクターゼ(SOR)ナノ粒子、ルマジンシンターゼナノ粒子、またはピルビン酸デヒドロゲナーゼナノ粒子である、請求項73記載のタンパク質ナノ粒子。
- モノクローナル抗体D25またはAM22のFabが、1μMまたはそれ未満のKdで免疫原、ウイルス様粒子、またはタンパク質ナノ粒子に特異的に結合する、請求項1〜74のいずれか一項記載の免疫原、ウイルス様粒子、またはタンパク質ナノ粒子。
- 請求項1〜75のいずれか一項記載の免疫原またはタンパク質ナノ粒子をコードする核酸分子。
- 核酸分子が、免疫原またはタンパク質ナノ粒子の前駆体タンパク質をコードする、請求項76記載の核酸分子。
- 前駆体タンパク質が、N末端からC末端方向に、シグナルペプチド、F2ポリペプチド、Pep27ポリペプチド、およびF1ポリペプチドを含む、請求項77記載の核酸分子。
- ヒトまたはウシ細胞内での発現にコドン最適化された、請求項76〜78のいずれか一項記載の核酸分子。
- プロモーターに機能的に連結された、請求項76〜79のいずれか一項記載の核酸分子。
- 請求項80記載の核酸分子を含む、ベクター。
- ウイルスベクターである、請求項81記載のベクター。
- ウシパラインフルエンザウイルスベクター、ヒトパラインフルエンザウイルスベクター、ニューカッスル病ウイルスベクター、センダイウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、弱毒化RSVベクター、パラミクソウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ベネズエラウマ脳炎ベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、水疱性口内炎ウイルスベクター、ピコルナウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターである、請求項82記載のウイルスベクター。
- SEQ ID NO: 383、SEQ ID NO: 384、SEQ ID NO: 385、またはSEQ ID NO: 386として明示されるヌクレオチド配列を含む、請求項76〜83のいずれか一項記載の核酸分子またはベクター。
- 請求項81〜82のいずれか一項記載のベクターを含む、単離された宿主細胞。
- 請求項1〜84のいずれか一項記載の免疫原、ウイルス様粒子、タンパク質ナノ粒子、核酸分子、またはベクターの有効量、および薬学的に許容される担体を含む、免疫原性組成物。
- アジュバントをさらに含む、請求項86記載の免疫原性組成物。
- アジュバントが、alum、水中油型組成物、MF59、AS01、AS03、AS04、MPL、QS21、CpGオリゴヌクレオチド、TLR7アゴニスト、TLR4アゴニスト、TLR3アゴニスト、またはそれらのうちの2つもしくはそれ以上の組み合わせである、請求項87記載の免疫原性組成物。
- アジュバントがTh1免疫応答を促進する、請求項87記載の免疫原性組成物。
- 組成物中の免疫原、ウイルス様粒子、またはタンパク質ナノ粒子の少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、および/または少なくとも98%が、生理的pHかつ4℃で少なくとも24時間および/または少なくとも1週間リン酸緩衝生理食塩水中でのインキュベーション後に融合前特異的抗体に特異的に結合する、請求項86〜89のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
- 組成物中の免疫原、エピトープ足場タンパク質、またはタンパク質ナノ粒子の少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または少なくとも95%が、
(a)50℃にて、350mM NaCl pH7.0中で1時間のインキュベーション;
(b)25℃にて、350mM NaCl pH3.5中で1時間のインキュベーション;
(c)25℃にて、350mM NaCl pH10中で1時間のインキュベーション;
(d)25℃にて、10mMモル浸透圧濃度、pH7.0中で1時間のインキュベーション;
(e)25℃にて、3000mMモル浸透圧濃度、pH7.0中で1時間のインキュベーション;もしくは
(f)350mM NaCl pH7.0中で10回の凍結融解サイクル;または
(g)(a)〜(f)のうちの2つもしくはそれ以上の組み合わせ
の後に融合前特異的抗体に特異的に結合する、請求項86〜90のいずれか一項記載の免疫原性組成物。 - RSV Fタンパク質サブタイプAおよびBに基づく組換えRSV Fタンパク質またはそのフラグメントの混合物を含む、請求項86〜91のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
- 免疫原に特異的に結合するRSV F融合前特異的抗体をさらに含む、請求項86〜92のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
- 免疫応答を生じさせるために請求項86〜93のいずれか一項記載の免疫原性組成物の有効量を対象に投与する工程を含む、対象においてRSV Fに対する免疫応答を生じさせるための方法。
- 免疫応答がTh1免疫応答を含む、請求項94記載の方法。
- 請求項86〜93のいずれか一項記載の免疫原性組成物の治療上有効量を対象に投与し、それによって対象におけるRSV感染症を治療するまたは阻止する工程を含む、対象におけるRSV感染症を治療するまたは阻止するための方法。
- 免疫原性組成物のプライム-ブースト投与を含む、請求項94〜96のいずれか一項記載の方法。
- 抗RSV剤の治療上有効量を対象に投与する工程をさらに含む、請求項94〜97のいずれか一項記載の方法。
- 請求項1〜75のいずれか一項記載の免疫原、ウイルス様粒子、またはタンパク質ナノ粒子の有効量を提供する工程;
組換えRSV Fタンパク質またはタンパク質ナノ粒子とRSV F結合抗体との間で免疫複合体を形成するのに十分な条件下で、対象由来の生物学的サンプルを組換えRSV Fタンパク質またはタンパク質ナノ粒子と接触させる工程;および
免疫複合体を検出し、それによって対象におけるRSV F結合抗体を検出するまたは単離する工程
を含む、対象におけるRSV F結合抗体を検出するまたは単離するための方法。 - 対象が、RSV感染症の危険性があるまたはRSV感染症を有する、請求項94〜99のいずれか一項記載の方法。
- RSV感染症が、ヒトRSVサブタイプA、ヒトRSVサブタイプB、またはウシRSVの感染症である、請求項100記載の方法。
- 対象がヒトまたは獣医学的対象である、請求項94〜101のいずれか一項記載の方法。
- 対象が、1歳未満、65歳を上回る、または妊娠している、請求項94〜101のいずれか一項記載の方法。
- 対象が、出産可能な年齢の女性、学齢期の子ども、2〜5歳、生後6〜12ヶ月、または生後6ヶ月未満である、請求項94〜101のいずれか一項記載の方法。
- 請求項1〜93のいずれか一項記載の免疫原、ウイルス様粒子、タンパク質ナノ粒子、核酸分子、ベクター、宿主細胞、または免疫原性組成物、およびキットを使用するための指示書を含む、キット。
- 対象におけるRSV感染症を阻害するまたは阻止するための、請求項1〜93のいずれか一項記載の免疫原、ウイルス様粒子、タンパク質ナノ粒子、核酸分子、ベクター、または免疫原性組成物の使用。
- 対象においてRSV Fタンパク質に対する免疫応答を誘導するための、請求項1〜93のいずれか一項記載の免疫原、ウイルス様粒子、タンパク質ナノ粒子、核酸分子、ベクター、または免疫原性組成物の使用。
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