JP2002511771A - 新規なカルボキシペプチダーゼインヒビター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒトカルボキシペプチダーゼインヒビター（ＣＡＲＩＮ）及びＣＡＲＩＮを同定しコードするポリヌクレオチドを提供する。また本発明は、発現ベクター、宿主細胞、アゴニスト、抗体、及びアンタゴニストを提供する。また本発明は、ＣＡＲＩＮの発現に関連する疾患の治療方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 新規なカルボキシペプチダーゼインヒビター技術分野 本発明は、新規なヒトカルボキシペプチダーゼインヒビターの核酸及びアミノ 酸配列、及び細胞増殖及びアポトーシスに関連する疾患及び炎症の診断、予防、 及び治療におけるこれらの配列の使用に関するものである。発明の背景 カルボキシペプチダーゼは、多くの生理学的プロセスにおいて機能するプロテ アーゼである。このプロテアーゼは、様々なカルボキシ末端のアミノ酸を取り除 き、この際に酵素やペプチドホルモンを活性化、不活化し、その活性の変調する 。哺乳動物の活性カルボキシペプチダーゼの多くはリソソームに位置しており、 そこでこのカルボキシペプチダーゼは細胞内タンパク質のプロセシング、分解、 及び代謝回転を調節する。植物及び昆虫では、カルボキシペプチダーゼは、貯蔵 タンパク質の移動及びホルモンの活性化を含むタンパク質の翻訳後修飾において 一定の役割を果たす。 カルボキシペプチダーゼの活性の調節は、内在性タンパク質インヒビターによ ってか、或いはプロペプチドのセグメントを酵素によって切断し活性カルボキシ ペプチダーゼを放出することによって行われる。カルボキシペプチダーゼＡ及び Ｂ（それぞれＣＰＡ及びＣＰＢ）は、ペプチド鎖におけるカルボキシ末端ペプチ ド結合の加水分解を触媒する、膵臓で分泌される亜鉛を含むタンパク分解酵素で ある。ラットの脳及び他の非膵臓組織において転写された時、ＣＰＡはプロテア ーゼとしての機能を発揮できない（Normant,E.等(1995)J.Biol.Chem.270:20543- 20549）。このようにプロテアーゼとして機能できないのは、例えば組 織カルボキシペプチダーゼインヒビター（ＴＣＩ）やラテキシン（latexin）の ような組織特異的内在性タンパク質インヒビターが存在するためである（Norman t,E.等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.92:12225-12229;Hatanaka,Y等(1994)Eur.I.Ne urosci.6:973-982）。 ラテキシンとＴＣＩは、それぞれ２２２個及び２２３個のアミノ酸からなる長 さを有する。これらは、幾つかのリン酸化可能部位を有するが、膜特異的シグナ ルペプチド配列は有していない（Normant等前出;Hatanaka等前出）。ＴＣＩは、 非競合性で、かつ概ね不可逆性であり、ＣＰＡの強力なインヒビターである。Ｔ ＣＩは、ＣＰＢに対してはＣＰＡに対する場合ほど強力なインヒビターではなく 、様々な他のプロテアーゼには作用しない。ＴＣＩとラテキシンは、共に脳、肺 、又は消化管を含む多くの組織のサイトゾルにおいて発現され、そこに局在化し ている。ＴＣＩ又はラテキシンが、組織特異的なサイトゾルタンパク質分解の調 節において機能を発揮している可能性が示唆されてきた（Normant等前出）。 新規なヒトカルボキシペプチダーゼインヒビター及びそれをコードするポリヌ クレオチドの発見は、細胞増殖及びアポトーシスに関連する疾患及び炎症の診断 、予防、及び治療において役立つ新たな物質を提供することにより当分野におけ る必要性を満たす。発明の要約 本発明は、配列番号：１に示すアミノ酸配列を有する、実質的に精製されたポ リペプチド、ヒトカルボキシペプチダーゼインヒビター（ＣＡＲＩＮ）又はその 断片を提供する。 また本発明は、配列番号：１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする 単離され実質的に精製されたポリヌクレオチド配列又はその断片、及び前記ポリ ヌクレオチド配列を含む組成物を提供する。また本発 明は、配列番号：１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列に厳密な 条件の下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列、又は前記ポリヌクレオチ ド配列の断片を提供する。更に本発明は、配列番号：１のアミノ酸配列をコード するポリヌクレオチドの相補配列を含むポリヌクレオチド配列、又は前記ポリヌ クレオチド配列の断片又は変異配列を提供する。 また本発明は、配列番号：２の配列を含む単離され精製された配列又はその変 異配列を提供する。更に本発明は、配列番号：２のポリヌクレオチド配列と厳密 な条件の下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を提供する。別の実施態 様では、本発明は、配列番号：２の相補配列を含む単離され精製されたポリヌク レオチド配列、又はその断片又は変異配列を含む組成物を提供する。また本発明 は、配列番号：２の相補配列を含むポリヌクレオチド配列を提供する。 更に本発明は、開示されたポリヌクレオチド配列の何れかの少なくとも断片を 含む発現ベクターを提供する。更に別の実施態様では、このポリヌクレオチド配 列を含む発現ベクターが、宿主細胞に含められる。 また本発明は、配列番号：１のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はその断片 の製造方法であって、（ａ）前記ポリペプチドの発現に適した条件の下でＣＡＲ ＩＮをコードするポリヌクレオチド配列の少なくとも断片を含む発現ベクターを 含む宿主細胞を培養する過程と、（ｂ）前記宿主細胞の培地から前記ポリペプチ ドを回収する過程とを含む、配列番号：１のアミノ酸配列を含むポリペプチド又 はその断片の製造方法を提供する。 また本発明は、配列番号：１のアミノ酸配列を有する実質的に精製されたＣＡ ＲＩＮを、適切な医薬用担体と共に含む医薬品組成物を提供する。 また本発明は、配列番号：１のポリペプチドの効果を低下させる精製されたア ンタゴニストを提供する。或る実施態様では、本発明は、配列番号：１のアミノ 酸配列の少なくとも断片を含むポリペプチドに結合する精製された抗体を提供す る。 更に別の実施例では、本発明は、配列番号：１のポリペプチドの活性を変調す る精製されたアゴニストを提供する。 また本発明は、細胞増殖を刺激する方法であって、精製されたＣＡＲＩＮを含 む医薬品組成物を有効な量細胞に与える過程を含む、細胞増殖を刺激する方法を 提供する。 また本発明は、過剰なアポトーシスに関連する疾患の治療方法であって、その ような治療が必要な患者に、精製されたＣＡＲＩＮを含む医薬品組成物を有効な 量投与する過程を含む、過剰なアポトーシスに関連する疾患の治療方法を提供す る。 また本発明は、癌に関連する疾患の治療方法であって、そのような治療が必要 な患者に、ＣＡＲＩＮのアンタゴニストを有効な量投与する過程を含む、癌に関 連する疾患の治療方法を提供する。 また本発明は、炎症の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に、Ｃ ＡＲＩＮのアンタゴニストを有効な量投与する過程を含む、炎症の治療方法を提 供する。 また本発明は、生物学的サンプルにおけるＣＡＲＩＮをコードするポリヌクレ オチドを検出する方法であって、（ａ）ＣＡＲＩＮ（配列番号：１）に相補的な ポリヌクレオチド配列と、生物学的サンプルの核酸材料とをハイブリダイズさせ 、ハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、（ｂ）前記ハイブリダイゼ ーション複合体を検出する過程であって、前記複合体の存在が、前記生物学的サ ンプルにおけるＣＡＲＩＮをコードするポリヌクレオチドの存在と相関性を有す る、該過程とを含む、 生物学的サンプルにおけるＣＡＲＩＮをコードするポリヌクレオチドを検出する 方法を提供する。好適な実施例では、ハイブリダイゼーションの前に、前記生物 学的サンプルの核酸材料を、ＰＣＲ法により増幅する。図面の簡単な説明 第１Ａ図、第１Ｂ図、及び第１Ｃ図は、ＣＡＲＩＮのアミノ酸配列（配列番号 ：１）及び核酸配列（配列番号：２）を示す。配列のアライメントは、MacDNASI S PRO^TMソフトウェア(Hitachi Software Engineering Co.,Ltd.,San Bruno,CA) を用いて作成した。 第２図は、ＣＡＲＩＮ（配列番号：１）、マウスのラテキシン（GI 1669621； 配列番号：３）、及びラット組織のカルボキシペプチダーゼインヒビター、ＴＣ Ｉ（GI 1101780；配列番号：４）の間のアミノ酸配列アライメントを示す。この 配列アライメントは、DNASTAR^TMソフトウェア（DNASTAR Inc,Madison WI）のマ ルチシーケンスアライメントプログラムを用いて作成した。 第３Ａ図及び第３Ｂ図は、それぞれＣＡＲＩＮ（配列番号：１）及びＴＣＩ（ 配列番号：３）の疎水性プロットを示す。Ｘ軸は正の方向にアミノ酸の位置を表 し、Ｙ軸は負の方向に疎水性のレベルを表す（MacDNASIS PROソフトウェアを用 いて作成）。発明の実施の形態 本発明のタンパク質、核酸配列、及び方法について説明する前に、本発明は、 ここに開示した特定の方法論、プロトコル、細胞系、ベクター、及び試薬に限定 されず、その実施形態を変えて実施できることを理解されたい。また、ここで用 いられる用語法は、特定の実施例のみを説明する目的で用いられたものであり、 請求の範囲のみによって限定される本発明の範囲を限定することを意図したもの ではないということも理解されたい。 本明細書及び請求の範囲において、単数を表す「或る」及び「その(この)」と形 容されたものは、前後関係でそうでないことが明らかである場合以外は、複数の 意味も含んでいることに注意しなければならない。従って、例えば「或る宿主細 胞」なる表記が表すものには、複数のそのような宿主細胞が含まれ、この「抗体 」なる表記は、１種またはそれ以上の種類の抗体及び当業者に周知のその等価物 等も表している。 本明細書における全ての科学技術専門用語は、特別に定義されていない限り、 本発明の属する技術分野において通常の知識を有する者に一般に理解されるのと 同じ意味を有する。ここに説明したものと類似のまたは等価な方法や材料を本発 明の実施や試験において用いることができるが、好適な方法、装置、及び材料は ここに説明する。本明細書に記載された全ての文献は、本発明の関連において用 いられ得る文献で報告された細胞系、ベクター、及び方法論を説明し開示する目 的で引用されたものであり、この引用により本明細書の一部とする。この引用の 記載は、本発明がその権利を有していない、従来発明によって先行開示されたそ のような開示内容に対して本発明が優先することを本発明に許容するためのもの と解釈してはならない。 定義 本明細書において、ＣＡＲＩＮは、任意の種、特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウ ス、ウマ、及び好ましくはヒトを含む哺乳動物から得られる、天然の、合成の、 半合成の、又は組換え体を起源とする実質的に精製されたＣＡＲＩＮのアミノ酸 配列である。 本明細書において、用語「アゴニスト」は、ＣＡＲＩＮに結合したとき、ＣＡ ＲＩＮの効果を強めたり、その効果の持続時間を長くさせる分子である。アゴニ ストには、ＣＡＲＩＮに結合し、その効果を変調する タンパク質、核酸、糖質や、任意の他の分子が含まれ得る。 本明細書において「アレル」或いは「アレル配列」とは、ＣＡＲＩＮの対立形 である。アレルは、核酸配列の少なくとも一箇所の変異によって生じ、変異ｍＲ ＮＡ或いはポリペプチドを生ずるが、そのｍＲＮＡ或いはポリペプチドの構造或 いは機能は、変わる場合もあれば変わらない場合もある。遺伝子によっては、ア レル形が存在しないもの、１つ存在するもの、或いは多数存在するものがある。 一般にアレルを生じる変異はアミノ酸の自然な欠失、付加並びに置換に因るもの である。このタイプの変化はそれぞれ単独で、或いは他の変化と同時に、所定の 配列内で１又は２箇所以上生じ得る。本明細書において、ＣＡＲＩＮをコードす る「変異」核酸配列とは、異なるヌクレオチド残基の欠失、挿入並びに置換を含 み、結果的に同一の、または機能的に等価なＣＡＲＩＮをコードするポリヌクレ オチドとなるものである。この定義には、ＣＡＲＩＮをコードするポリヌクレオ チド配列の正常な染色体上の遺伝子座以外の位置における、アレルとの不適切又 は予期しないハイブリダイゼーション、及びＣＡＲＩＮをコードするポリヌクレ オチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な、或いは 検出が困難な多形性が含まれている。コードされたタンパク質も同様に「変異」 したものであり得、サイレント変化を生ずるアミノ酸残基の欠失、挿入並びに置 換を含み、結果的に機能的に等価なＣＡＲＩＮとなるものであり得る。意図的な アミノ酸置換は、ＣＡＲＩＮの生物学的活性が保持される限りにおいて、残基の 極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性並びにまた両親媒性についての類似性に基 づいてなされ得る。例えば負に荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタ ミン酸が含まれ、正に荷電したアミノ酸にはリジン及びアルギニンが含まれ、近 い親水性値を持つ荷電していない極性頭基を有するアミノ酸には、ロイシン、イ ソロイシン、バリ ン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フ ェニルアラニン並びにチロシンが含まれる。 本明細書において「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプ チド、又はタンパク質の配列及びその断片であり、自然発生又は合成の分子であ る。ＣＡＲＩＮの断片は、好ましくは約５〜約１５個のアミノ酸からなる長さを 有し、ＣＡＲＩＮの生物学的活性又は免疫学的活性を保持しているものである。 ここでは「アミノ酸配列」が、自然発生タンパク質分子のアミノ酸配列を指すも のとして用いられているが、「アミノ酸配列」や類似の用語は、アミノ酸配列を 、列挙されているタンパク質分子に関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限 定する意味で用いられるわけではない。 本明細書において「増幅」は、核酸配列の更なる複製物を生成することであり 、通常は当業者に周知のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を用いて行われる（D ieffenbach,C.W.及びG.S.Dveksler(1995)PCR Primer.a Laboratory Manual，Col d Spring Harbor Press,Plainview,NY）。 本明細書において、用語「アンタゴニスト」は、ＣＡＲＩＮに結合したとき、 ＣＡＲＩＮの生物学的又は免疫学的効果の大きさを低下させたり、持続時間を短 縮させる分子である。アンタゴニストは、ＣＡＲＩＮの作用を低下させるタンパ ク質、核酸、糖質や、任意の他の分子を含んでいることがある。 本明細書において、用語「抗体」は、完全な抗体分子及び例えばFa、F(ab')₂ 、及びFvのようなその断片であって、抗原決定基と結合し得るものである。ＣＡ ＲＩＮポリペプチドに結合する抗体は、完全なポリペプチド、或いは免疫化する 抗原としての目的の小型のペプチドを含むその断片を用いて調製することができ る。動物を免疫化するのに用いられ るポリペプチドまたはペプチドは、翻訳されたｃＤＮＡまたは化学的合成物を起 源とするものであり得、必要ならば担体タンパク質と結合することができる。ペ プチドに化学的に結合する、通常用いられる担体には、ウシ血清アルブミン及び サイログロブリンが含まれる。次にこの結合したペプチドを用いて動物（例えば マウス、ラット、またはウサギ）を免疫化する。 本明細書において、用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の一部 分（即ちエピトープ）である。タンパク質またはタンパク質の断片を用いてホス トの動物を免疫化すると、このタンパク質の種々の領域が、該タンパク質上の所 定の領域または三次元構造に特異的に結合する抗体の産生が誘発され得る。この ような領域または構造を抗原決定基と称する。抗原決定基は、抗体への結合につ いて、元の抗原（即ち免疫応答を引き出すために用いられる免疫原）と競合し得 る。 本明細書において用語「アンチセンス」は、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に 対して相補的なヌクレオチド配列である。「アンチセンス鎖」は、「センス」鎖 に対して相補的な核酸鎖の意味で用いられる。アンチセンス分子はペプチド核酸 を含み、合成や転写を含む任意の方法で作ることができる。この相補的ヌクレオ チドは、一度細胞内に導入されると、細胞によって作られた天然の配列と結合し て二重鎖を形成し、この二重鎖は更なる転写や翻訳を阻害する。「ネガティブ（ −）」なる表現はアンチセンス鎖の意味で時折用いられ、「ポジティブ（＋）」 はセンス鎖の意味で用いられることがある。 本明細書において、用語「生物学的に活性」は、自然発生の分子の構造的機能 、調節機能、又は生化学的機能を有するタンパク質を表す。同様に「免疫学的に 活性」は、天然の、組換え体の、又は合成のＣＡＲＩＮ、若しくはその任意のオ リゴペプチドの、適当な動物や細胞における 特定の免疫応答を誘発し、特定の抗体に結合する能力を指す。 本明細書において、用語「相補的」または「相補性」は、許容的な塩及び温度 条件の下での塩基対によるポリヌクレオチド同士の自然の結合である。例えば、 配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は相補的配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に結合する。２つの二本鎖分子 間の相補性は、幾つかの核酸のみが結合している「部分的」なものであるか、若 しくは一本鎖分子間に完全な相補性が存在する場合は完全に相補的なものであり 得る。核酸鎖同士の相補性の程度は、核酸鎖同士のハイブリダイゼーションの効 率及び強度に有意な影響を与える。このことは、核酸鎖同士の結合によって左右 される増幅反応や、ＰＮＡ分子の設計及び使用において特に重要である。 本明細書において「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」とは、広く所定 のポリヌクレオチド配列を含む任意の物質をさす。この組成物は、乾燥した製剤 又は水溶液を含み得る。ＣＡＲＩＮ（配列番号：１）をコードするポリヌクレオ チド配列又はその断片（例えば配列番号：２又はその断片）を含む組成物は、ハ イブリダイゼーションプローブとして利用することができる。このプローブは凍 結乾燥した形態で保存することができ、糖質のような安定化剤と結合させること ができる。ハイブリダイゼーションにおいて、このプローブは、塩（例えばＮａ Ｃｌ）、界面活性剤（例えばＳＤＳ）及び他の物質（例えばデンハート液、乾燥 ミルク、サケの精子ＤＮＡ等）に展開することができる。 本明細書において「コンセンサス」は、再度シークエンシングされて不要な塩 基が分離された核酸配列か、XL-PCR^TM（Perkin Elmer,Norwalk,CT）を用いて５ ’方向及び／または３’方向に延長されて、再度シークエンシングされた核酸配 列か、フラグメントの組み合わせのためのコンピュータプログラム（例えばGELV IEW^TMFragment Assembly system,GCG,Madison WI）を用いて２種以上のインサイ ト 社クローンの重複した配列を組み合わせて作られた核酸配列である。延長と組み 合わせの双方によってコンセンサス配列が作られることもある。 本明細書において、「ポリヌクレオチドの発現と相関性を有する」なる表現は 、ノーザン解析により配列番号：２に類似なリボ核酸の存在が検出されることが 、サンプル内のＣＡＲＩＮをコードするｍＲＮＡの存在を表しており、従って該 タンパク質をコードする遺伝子からの転写物の発現と相関性を有しているという ことを表している。 本明細書において「欠失」は、１個以上のヌクレオチド若しくはアミノ酸残基 が欠けることになる、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における変化である 。 本明細書において、用語「誘導体」は、ＣＡＲＩＮをコードする核酸或いはそ れに相補的な核酸又はコードされたＣＡＲＩＮを化学的に修飾したものを意味す る。このような修飾の例には、水素からアルキル基、アシル基、又はアミノ基へ の置換がある。核酸誘導体は、未修飾のＣＡＲＩＮの生物学的又は免疫学的機能 を保持しているポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドは、元のポリペ プチドの生物学的又は免疫学的機能を保持しており、グリコシル化、ポリエチレ ングリコール化（pegylation）、又は他の任意のプロセスで修飾されたものであ る。 本明細書において、用語「相同性」は、或る程度の相補性を意味する。部分的 な相同と、完全な相同（即ち同一）の場合があり得る。部分的に相補的な配列は 、同一の配列が標的の核酸とハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害す るものであり、このことを機能的な表現「実質的に相同な」で表す。完全に相補 的な配列と標的配列とのハイブリダイゼーションの阻害は、低い厳密性条件の下 で、ハイブリダイゼーションアッセイ（サザンブロット法またはノーザンブロッ ト法、溶液ハイブリダイゼーション等）を用いて検定することができる。実質的 に相同な配 列またはプローブは、低い厳密性条件の下で標的の配列と、完全に相同な配列ま たはプローブとの結合（即ちハイブリッド形成）について競合し、それを阻害す る。このことは、低い厳密性の条件が、非特異的な結合を許容するようなもので あるということを意味するわけではない。低い厳密性条件では、２つの配列の相 互の結合が特異的（即ち選択的）相互作用であることが必要である。非特異的結 合が存在しないことは、部分的な程度の相補性（即ち約３０％未満の同一性）も 有していない第２の標的配列を用いることにより調べることができる。非特異的 結合が存在しない場合、プローブは第２の非相補的標的配列とハイブリダイズし ない。 ヒト人工染色体（ＨＡＣ）は１０Ｋ〜１０ＭのサイズのＤＮＡ配列を含んでお り、安定した分裂染色体の分離及び維持に必要な全ての要素を含む直鎖状の小染 色体である（Harrington,J.J.等(1997)Nat Genet.15:345-355）。 本明細書において、用語「ヒト化抗体」は、元の結合能力をそのまま保持しつ つ、ヒトの抗体により近づけるために非抗体結合領域においてアミノ酸を置換し た抗体分子である。 本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション（ハイブリッド形成）」は 、核酸の鎖が塩基対合を介して相補鎖と結合する過程である。 本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的なＧ塩 基とＣ塩基の間及び相補的なＡ塩基とＴ塩基の間での水素結合の形成によって、 ２つの核酸配列で形成された複合体である。これらの水素結合は、塩基スタッキ ング相互作用（base stacking interaction）により更に安定化し得る。この２ つの相補的核酸配列は水素結合して、逆平行構造をなす。ハイブリダイゼーショ ン複合体は、溶液中で形成されるか（例えばＣ₀ｔ又はＲ₀ｔ解析）、或いは核酸 は溶液中に存在する 一方の核酸と、固体支持体（例えば細胞やその核酸が固定される紙、メンブラン 、フィルター、ピン、またはスライドガラスまたは他の適切な基板）に固定され たもう一方の核酸との間で形成され得る。 本明細書において「挿入」或いは「付加」は、自然発生の分子と比較して、１ 個または２個以上のヌクレオチド、アミノ酸残基がそれぞれ加わるような、ヌク レオチド配列或いはアミノ酸配列の変化を指す。 「マイクロアレイ」とは、基板上に、合成された個々のポリヌクレオチド又は オリゴヌクレオチドを高密度で配列したものである。基板には例えば紙、ナイロ ン又は他のタイプのメンブラン、濾紙、チップ、スライドガラス、又は他の任意 の適切な固体支持体が用いられる。 本明細書において、用語「変調」は、ＣＡＲＩＮの活性の変化である。例えば 、変調によって、タンパク質活性の上昇や低下、結合特性の変化、又はＣＡＲＩ Ｎの生物学的、機能的、免疫学的特性の他の変化がもたらされる。 本明細書において「核酸配列」は、一本鎖か二本鎖の、センス鎖又はアンチセ ンス鎖である、ゲノム起源又は合成起源のＤＮＡ、ＲＮＡや、オリゴヌクレオチ ド、ヌクレオチド、又はポリヌクレオチド、及びその断片又は一部分である。「 断片（フラグメント）」は、長さが６０ヌクレオチド以上の核酸配列であり、最 も好ましくは、長さが１００ヌクレオチド以上又は１０００ヌクレオチド以上、 及び１００００ヌクレオチド以上の断片を含む。 本明細書において「オリゴヌクレオチド」は、ＰＣＲ増幅又はハイブリダイゼ ーションアッセイ、若しくはマイクロアレイで用いることができる核酸配列であ って、長さが約６ヌクレオチド以上、最大６０ヌクレオチド程度、好適には１５ 〜３０ヌクレオチド、より好適には２０〜２５ヌクレオチドであるものを指す。 本明細書において、オリゴヌクレオ チドは、当分野において一般に定義されている用語「アンブリマー」、「プライ マー」、「オリゴマー」、及び「プローブ」と実質的に同義である。 本明細書において「ペプチド核酸」ＰＮＡは、末端がリジンであるアミノ酸残 基のペプチドバックボーンに結合した５ヌクレオチド以上の長さのオリゴヌクレ オチドを含むアンチセンス分子又は抗遺伝子剤を意味する。末端のリジンがこの 物質に安定性を賦与している。ＰＮＡをポリエチレングリコール化して細胞にお けるＰＮＡの寿命を延ばすことができる。このような細胞では、ＰＮＡが相補的 な一本鎖ＤＮＡやＲＮＡに優先的に結合して、転写物の伸長を止める。（Nielse n,P.E.等(1993)Anticancer Drug Des.8:53-63）。 本明細書において、（「所定のタンパク質の一部分」と用いられるような）タ ンパク質に関連する用語「一部分」は、そのタンパク質の断片である。この断片 のサイズは５個のアミノ酸残基から、（全アミノ酸配列−１）個のアミノ酸の範 囲に亘る。従って、「配列番号：１のアミノ酸配列の少なくとも一部分を含む」 タンパク質は、完全長ヒトＣＡＲＩＮとその断片を含む。 本明細書において、用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている 。ＣＡＲＩＮをコードする核酸またはその断片またはＣＡＲＩＮ自体を含む疑い のある生物学的サンプルは、体液や、細胞から単離された染色体、細胞小器官、 又は細胞膜からの抽出物や、細胞や、（溶液中の、または例えばサザンブロット 解析用に固体支持体に結合した）ゲノムのＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡや、 組織や、組織プリントその他を含み得る。 本明細書において、用語「特異的結合」または「特異的に結合する」は、抗体 及びタンパク質またはペプチドの相互作用が、タンパク質上の 特定の構造（即ち抗原決定基、つまりエピトープ）の存在に左右されることを意 味している。つまり、この抗体はタンパク質全体ではなく、特定のタンパク質構 造を認識して結合する。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場 合、標識した「Ａ」及びその抗体を含む反応において、エピトープＡ（つまり結 合していない、無標識のＡ）を含むタンパク質が存在すると、抗体に結合した標 識Ａの量が低下する。 本明細書において、用語「厳密な条件」又は「厳密性」は、核酸、塩、及び温 度によって定義されるようなハイブリダイゼーションの条件をさす。これらの条 件は当分野でよく知られており、同一のポリヌクレオチド配列の同定や検出のた めであるか、或いは近縁なポリヌクレオチド配列の同定や検出のためであるかに よって変えることができる。低い厳密性条件か高い厳密性条件の何れかを含む名 目上の等価な条件は、例えば配列の長さ及び性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成） 、標的の性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）、環境（溶液中に存在するか或いは 固定されているか等）、塩や他の成分の濃度（例えばホルムアミド、デキストラ ン硫酸、及び／またはポリエチレングリコールの有無）、及び反応の温度（プロ ーブの融解温度（Ｔｍ）より５℃下からＴｍの約２０〜２５℃下までの範囲内） のような要素によって決まる。１又は２以上の因子を変更することによって、上 に列挙した条件とは異なるが等価である低い厳密性または高い厳密性の何れかの 条件を作り出すことができる。 本明細書において、用語「実質的に精製」は、天然の環境から取り除かれ、天 然にはそれが結合して存在する他の構成要素から単離又は分離されて、その構成 要素が６０％以上、好ましくは７５％以上、最も好ましくは９０％以上除去され た核酸配列又はアミノ酸配列である。 本明細書において「置換」は、それぞれ１個または２個以上のヌクレオチド或 いはアミノ酸を、異なるヌクレオチド或いはアミノ酸に置換す ることによって生ずる変化である。 本明細書の定義では、「形質転換」は、外来ＤＮＡが入り込みレシピエント細 胞を変化させるプロセスを意味する。このプロセスは、よく知られた種々の方法 を用いた天然または人工の条件の下で生じ得る。形質転換は、外来核酸配列を原 核細胞または真核細胞の宿主細胞に導入するための何らかの既知の方法に基づい ている。この方法は形質転換される宿主細胞によって選択され、以下のものに限 定されないが、ウイルス感染による方法、電気穿孔法（エレクトロポレーション ）、リポフェクション、及び微粒子銃を用いる方法が含まれ得る。このような「 形質転換された」細胞は、そのなかで挿入されたＤＮＡが、自律的に複製するプ ラスミドとして、または宿主の染色体の一部として複製が可能な安定的に形質転 換された細胞を含む。またこのような細胞は、限られた時間の導入ＤＮＡやＲＮ Ａの一過性の発現をする細胞も含む。 本明細書においてＣＡＲＩＮの「変異体」は、１又は２箇所以上のアミノ酸が 変異したアミノ酸配列である。この変異体は「保存的」変化を含むものであり得 、この保存的変化の場合は、例えばロイシンをイソロイシンで置き換える場合の ように置換されるアミノ酸が類似な構造的及び化学的特性を有する。稀に、変異 体が「非保存的」に変化する場合もあり、この非保存的変化の場合は、例えばグ リシンがトリプトファンで置換される。類似した小変化には、アミノ酸の欠失か 挿入、若しくはその両方も含まれる。例えばDNASTARソフトウエアのような良く 知られたコンピュータプログラムを用いて、何れのアミノ酸が生物学的或いは免 疫学的活性を損なわずに置換、挿入、又は除去できるものであるかということ、 及びそのようなアミノ酸がいくつかということを決定することができる。 発明 本発明は、新規なヒトリボヌクレアーゼ（以下ＣＡＲＩＮと称する）、ＣＡＲ ＩＮをコードするポリヌクレオチドの発見、及び細胞増殖及びアポトーシスに関 連する疾患及び炎症の診断、予防、及び治療におけるこれらの物質の使用に基づ くものである。 本発明のＣＡＲＩＮをコードする核酸は、前立腺腫瘍組織ｃＤＮＡライブラリ ー（PROSTUT09）を起源とするインサイト社クローンNo.1649584において、アミ ノ酸配列アライメントのコンピュータ検索によって初めに同定された。コンセン サス配列の配列番号：２は、以下の重複及び／又は延長された核酸配列、即ちイ ンサイト社クローンNo.1981540（LUNGTUT03を起源）、1858852（PROSNOT18を起 源）、388021（THYMNOT02を起源）、99743（ADRENOT01を起源）、及び1649584（ PROSTUT09を起源）から構成されたものである。 或る実施例では、本発明は、第１Ａ図〜第１Ｃ図に示すような配列番号：１の アミノ酸配列を含むポリペプチドを包含する。ＣＡＲＩＮは、２２２個のアミノ 酸からなる長さを有する。ＣＡＲＩＮは、Ｎ（69番）、Ｎ（88番）、及びＮ（15 1番）に３箇所のＮグリコシル化可能部位を、Ｓ（41番）〜Ｄ（44番）、Ｔ（79 番）〜Ｅ（82番）、Ｔ（83番）〜Ｅ（86番）、Ｓ（112番）〜Ｅ（115番）、及び Ｓ（152番）〜Ｄ（155番）に５箇所のカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位を有し 、Ｔ（95番）〜Ｋ（97番）、Ｓ（112番）〜Ｋ（114番）、及びＴ（165番）〜Ｋ （167番）に３箇所のプロテインキナーゼＣリン酸化部位を有する。第２図に示 すように、ＣＡＲＩＮは、マウスラテキシン(GI 1669621;配列番号：３)及びラ ット組織カルボキシペプチダーゼインヒビター、ＴＣＩ（GI 1101780；配列番号 ：４）と化学的及び構造的相同性を有する。詳述すると、ＣＡＲＩＮは、ラテキ シン及びＴＣＩとそれぞれ８５％及び８４％ の配列同一性を共有している。第３Ａ図及び第３Ｂ図に示すように、ＣＡＲＩＮ 及びラテキシンは、かなり類似な疎水性プロットを示す。ノーザン解析の結果か ら、様々なライブラリーにおけるこの配列の発現が分かる。この配列を発現する ライブラリーの２５％以上は不死化又は癌性のものであり、２１％以上は免疫応 答に関連し、２１％以上は乳仔／胎仔の組織又は器官に関連するものである。 また本発明は、ＣＡＲＩＮ変異体を包含する。好適なＣＡＲＩＮ変異体は、Ｃ ＡＲＩＮアミノ酸配列（配列番号：１）と８０％以上、より好適には９０％以上 のアミノ酸配列同一性を有し、且つＣＡＲＩＮの活性の生物学的、免疫学的、又 は他の機能的特徴を保持しているものである。最も好適なＣＡＲＩＮ変異体は、 配列番号：１と９５％以上のアミノ酸配列同一性を有するものである。 また本発明は、ＣＡＲＩＮをコードするポリヌクレオチドを包含する。従って 、ＣＡＲＩＮのアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列を用いてＣＡＲＩＮを 発現する組換え分子を作り出すことができる。特定の実施例では、本発明は、第 １Ａ図〜第１Ｃ図に示すような配列番号：２の核酸配列を含むポリヌクレオチド を包含する。 当業者には理解されるように、遺伝暗号の縮重の結果、任意の既知の自然発生 遺伝子のヌクレオチド配列と最小限の相同性しか有していないものも含めて、多 種のＣＡＲＩＮコーディングヌクレオチド配列が作り出され得る。従って本発明 は、可能なコドン選択に基づく組み合わせを選択することにより作り出され得る 、全ての可能な核酸配列の変異をその範囲に含んでいる。それらの組み合わせは 、自然発生のＣＡＲＩＮのヌクレオチド配列に適用されるような標準的なトリプ レット遺伝暗号に基づいて作り出されるものであり、このような全ての変異は、 ここに具体的に示されたものと考えられたい。 ＣＡＲＩＮ及びその変異体をコードするヌクレオチド配列は、適切に選択され た厳密性条件の下で自然発生配列のヌクレオチド配列とハイブリッド形成可能な ものであるのが好ましいが、実質的に異なるコドンを使用しているＣＡＲＩＮ又 はその変異体をコードするヌクレオチド配列を作り出すことは有益であり得る。 コドン選択では、特定のコドンが宿主によって使用される頻度に従って、特定の 原核細胞又は真核細胞の発現宿主におけるペプチド発現の発生率を高めるように 選択することができる。ＣＡＲＩＮ及びその誘導体をコードするヌクレオチド配 列を、コードされるアミノ酸配列を変えないように実質的に変更する理由は、例 えば自然発生配列から作り出される転写物より長い半減期のような、より望まし い特性を有するＲＮＡ転写物を作り出すためである。 本発明の範囲には、ＣＡＲＩＮ又はその誘導体をコードするＤＮＡ配列又はそ の一部の、完全な合成ケミストリによる作製も含まれる。作製したこの合成遺伝 子を、この出願時点において周知の試薬を用いて任意の入手可能なＤＮＡベクタ ー及び細胞系に挿入することができる。更に、合成ケミストリを用いてＣＡＲＩ Ｎをコードする配列又はその任意の一部分に突然変異を誘発させることができる 。 また本発明の範囲に含まれるものとして、種々の厳密性条件の下で請求項に記 載のヌクレオチド配列、特に配列番号：２のヌクレオチド配列とハイブリダイズ し得るポリヌクレオチド配列がある。ハイブリダイゼーション条件については、 Wahl,G.M．及びS.L.Berger(1987;Methods Enzymol.152:399-407)及びKimmel,A.R .(1987;Methods in Enzymol.152:507-511)に記載されている。 当業者が一般に利用可能な周知のＤＮＡ配列決定のための方法を、本発明の実 施において用いることができる。この方法では酵素、例えばＤ Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Perkin Elmer）、熱安定性T7ポリメラーゼ （Amersham,Chicago IL）、或いはGibco BRL（Gaithersburg MD)Methods社から 市販されているELONGASE増幅システムのような校正エキソヌクレアーゼと組換え 体ポリメラーゼとの組み合わせのような酵素を使用する。このプロセスは、Hami lton Micro Lab2200（Hamilton,Reno,NV）、Peltier Thermal Cycler(PTC200；M J Reserch,Watertown MA)並びにABI377 DNAシーケンサ(Perkin Elmer)のような 装置を用いて自動化するのが好ましい。 ＣＡＲＩＮをコードする核酸配列は、部分的なヌクレオチド配列と、プロモー ター及び調節エレメントのような上流配列を検出するための当業者には周知の様 々な方法とを用いて伸長させることができる。例えば、使用可能の方法の一つで ある「制限部位」ＰＣＲ法では、汎用プライマーを用いて既知の位置に隣接する 未知の配列を得る（Sarkar,G.(1993)PCR Methods Applic 2:318-322）。詳述す ると、まずゲノムＤＮＡを、既知の領域に対して特異的なプライマー及びリンカ ー配列に対するプライマーの存在下で増幅する。増幅された配列を、その同じリ ンカープライマー及び最初のプライマーの内部に含まれる別の特異的プライマー を用いてＰＣＲの２巡目にかける。ＰＣＲの各回の生成物を、適切なＲＮＡポリ メラーゼを用いて転写させ、逆転写酵素を用いて配列決定する。 逆ＰＣＲ法を用いて、既知領域に基づく多様なプライマーを利用した配列の増 幅、または伸長を行うことができる（Triglia,T.等（1988）Nucleic Acids Res 16:8186）。プライマーは、OLIGO 4.06（National Biosciences社,Plymouth MN ）や他の適切なプログラムを用いて、長さが２２〜３０ヌクレオチドで、５０％ 以上のＧＣ含量を有し、かつ約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニールするよ うに設計する。この方法ではいくつかの制限酵素を用いて遺伝子の既知領域の適 当な断片を作 り出す。次にこの断片を分子内ライゲーションにより環状にし、ＰＣＲ用の鋳型 として使用する。 使用できる別の方法にはキャプチャＰＣＲ法があり、この方法ではヒト及び酵 母菌人工染色体ＤＮＡ内の既知の配列に隣接するＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅する（ Lagerstrom,M.等（1991）PCR Methods Applic 1:111-119）。この方法では、Ｐ ＣＲ処理の前に、ＤＮＡ分子の未知の部分に、複数の制限酵素による消化及びラ イゲーションによって組換え二本鎖配列を配置しておくこともできる。 未知の配列を得るために用いることができる別の方法は、Parker,J.D.等の方 法（1991;Nucleic Acids Res 19:3055-3060）である。更に、ＰＣＲ、ネスト化 プライマー、PromoterFinder^TMライブラリーを用いて、ゲノムＤＮＡ内歩行を行 うことができる（Clontech,Palo Alto CA）。このプロセスは、ライブラリーを スクリーニングする必要がなく、イントロン／エクソン接合部を探し出すのに有 用である。完全長ｃＤＮＡをスクリーニングするときに好適なライブラリーは、 サイズ選択された、より大きなｃＤＮＡを含むライブラリーである。またランダ ムプライミングした（random primed）ライブラリーは、遺伝子の５’及び上流 領域を含む配列をより多く含むという点で好適である。ランダムプライミングし たライブラリーは、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリーで完全長ｃＤＮＡが得られない 場合に特に有用である。またゲノムライブラリーは、５’及び３’非翻訳領域へ の配列の伸長のために役立つことがある。 配列決定やＰＣＲの産物のヌクレオチド配列をサイズ分析したり確認するため には、市販のキャピラリー電気泳動システムを用いることができる。特に、キャ ピラリーシークエンシングでは、電気泳動による分離のための流動性ポリマー、 レーザーで活性化される４つの異なる蛍光色素（各ヌクレオチドに対して１つ） を使用し、ＣＣＤカメラにより放射 線の波長の検出を行う。出力／光強度は適切なソフトウエア（例えばPerkin elm er製のGenotyper^TM及びSequence Navigator^TM）を用いて電気信号に変換され、 サンプルの負荷からコンピュータ解析及び電子データ表示までの全過程がコンピ ュータ制御される。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプル内に限られた量 だけ存在するＤＮＡ小片の配列決定に特に適している。 本発明の別の実施例では、ＣＡＲＩＮをコードするポリヌクレオチド配列また はその断片を組換えＤＮＡ分子において用いて、ＣＡＲＩＮ、融合タンパク質或 いはその機能的等価物の適切な宿主細胞内での発現を誘導することができる。遺 伝暗号固有の縮重のために、実質的に同一であるか機能的に等価なアミノ酸配列 をコードする他のＤＮＡ配列も作り出され得、これらの配列をＣＡＲＩＮのクロ ーニングや発現のために用いることができる。 当業者には理解できるように、非自然発生コドンを有するＣＡＲＩＮコードデ ィングヌクレオチド配列を作り出すことは有益であり得る。特定の原核細胞或い は真核細胞の宿主において選好されるコドンを選択して、例えば、ＣＡＲＩＮ発 現率を増大させたり、或いは自然発生配列から生成された転写物より長い半減期 のような望ましい特性を有する組換えＲＮＡ転写物を生成することができる。 本発明のヌクレオチド配列は、ＣＡＲＩＮをコードする配列を改変する目的で 既知の方法を用いて組換えることができる。組換えの目的には、例えば、限定は しないが遺伝子産物のクローニング、プロセシング及び／又は発現を改変するこ とが含まれる。無作為断片によるＤＮＡ再編成や遺伝子断片及び合成オリゴヌク レオチドのＰＣＲ再会合によって、ヌクレオチド配列を組換えることができる。 例えば、特定部位突然変異誘発のような当業者には周知の技術を用いて突然変異 を誘発させることに よって、新しい制限部位の挿入、グリコシル化パターンの変更、コドン選好の変 化、スプライスバリアントの生成等をもたらすことができる。 本発明の別の実施例では、未改変ＣＡＲＩＮコーディング配列、変異ＣＡＲＩ Ｎコーディング配列、又は組換えＣＡＲＩＮコーディング配列を異種の配列に結 合して、融合タンパク質をコードする配列にすることができる。例えば、ＣＡＲ ＩＮ活性のインヒビターをペプチドライブラリーからスクリーニングする場合、 市販の抗体により認識される異なるペプチドを発現するキメラＣＡＲＩＮタンパ ク質をコードすることが有用である。融合タンパク質はＣＡＲＩＮ配列と異種の タンパク質配列との間の位置に切断部位を有するように設計することもでき、こ れによってＣＡＲＩＮを切断して、ヘテロの部分から分けて精製することが可能 となる。 本発明の別の実施例では、当業者によく知られた化学的方法（Caruthers.M.H. 等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 7:215-223;Horn,T.等（1980）Nucl.Acids Res Symp.Ser.225-232参照）を用いて、ＣＡＲＩＮコーディング配列の全体、或い はその一部を合成することができる。或いは、化学的方法を用いてタンパク質自 体を作り出して、ＣＡＲＩＮアミノ酸配列の全体或いはその一部を合成すること ができる。例えば、種々の固相技術（Roberge,J.Y.等(1995)Science 269:202-20 4）でペプチド合成を行うことができ、合成の自動化は、例えばABI 431Aペプチ ドシンセサイザ（Perkin Elmer）を用いることにより達成することができる。 この新たに合成されたペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィにより実 質的に精製することができる（例えばCreighton T．(1983)Proteins Structure And Molecular Principles ,WH Freeman and Co.,NY参照）。合成されたペプチド の組成は、アミノ酸解析或いはシーク エンシングにより確認することができる（例えばエドマン分解法；Creighton， 前出）。さらにＣＡＲＩＮのアミノ酸配列或いはその任意の部分を、その直接の 合成の際の改変することにより、及び／又は化学的方法を用いて他のタンパク質 或いはその任意の部分に由来する配列との結合することにより、変異体ポリペプ チドを作り出すことができる。 生物学的に活性なＣＡＲＩＮを発現させるためには、ＣＡＲＩＮをコードする ヌクレオチド配列或いはその機能的等価物を、適切な発現ベクター、すなわち挿 入されたコーディング配列の転写及び翻訳に必要な要素を含むベクターに挿入す る。 ＣＡＲＩＮコーディング配列及び適切な転写や翻訳の調節領域を含む発現ベク ターを作製するために当業者に周知の方法が用いられる。これらの方法には、in vitro組換えＤＮＡ技術、合成技術、並びにin vivo組換え技術、又は遺伝子組 換え技術が含まれる。このような技術は、Sambrook,J.等(1989)Molecular Cloni ng ，A Laboratory Manual ,Cold Spring Harbor Press,Planview NY及びAusubel, F.M.等Current Protocol in Molecular Biology,John Wiley &Sons,New York,NY に記載されている。 種々の発現ベクター／宿主系を、ＣＡＲＩＮコーディング配列を保持し、かつ 発現するために利用することができる。このようなものには、以下に限定するも のではないが、組換えバクテリオファージ、プラスミド或いはコスミドＤＮＡ発 現ベクターで形質転換した細菌のような微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転 換した酵母菌や、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）を感染させ た昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス CaMV、タバコモザイクウイルスTMV）をトランスフェクトした、或いは細菌の発 現ベクター（例えばTi、或いはpBR322プラスミド）で形質転換した植物細胞 系や、或いは動物細胞系が含まれる。 これらの系の「調節領域」或いは「制御配列」は、転写及び翻訳を実行するた めに宿主細胞のタンパク質と相互作用するベクターの非翻訳領域、即ちエンハン サー、プロモーター及び３’非翻訳領域である。このようなエレメントの、作用 の強さ及び特異性は様々であり得る。利用されるベクター及び宿主に応じて、構 成的及び誘導的プロモーターを含む任意の数の適切な転写及び翻訳エレメントを 用いることができる。例え （Stratagene,LaJolla CA）またはpSportI^TMプラスミド（Gibco BRL）等のハイ ブリッドlacZプロモーターのような誘導的プロモーターを用いることができる。 バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターは、昆虫細胞において用いることが できる。植物細胞のゲノムに由来するプロモーター或いはエンハンサ（例えば熱 ショック,RUBISCO及び貯蔵タンパク質遺伝子）、若しくは植物ウイルスに由来す るプロモーター或いはエンハンサ（例えばウイルス性プロモータ或いはリーダ一 配列）を、ベクターにクローン化してもよい。哺乳動物細胞では、哺乳動物の遺 伝子或いは哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが最適である。ＣＡＲＩＮをコ ードする配列の多数の複製を含む細胞系を作る必要がある場合には、SV40或いは EBVに基づくベクターを適切な選択マーカーと共に用いる。 細菌系では、ＣＡＲＩＮの用途に応じて多数の発現ベクターを選択することが できる。例えば抗体誘発のために大量のＣＡＲＩＮが必要とされる場合は、容易 に精製される融合タンパク質を高レベルで発現できるベクターが望ましい。その ようなベクターには、以下のものに限定はしないが、多機能の大腸菌クローニン グ、発現ベクター、例えば する配列を、アミノ末端メチオニン及び後続のβ−ガラクトシダーゼの７残基の 配列を備えたフレーム内においてベクターに結合してハイブリッドタンパク質を 生成できる）や、pINベクター（Van Heeke,G.及びS.M.Schuster（1989）J.Biol. Chem.264:5503-5509）等が含まれる。またpGEXベクター（Promage、Madison WI ）も、グルタチオンＳ−トランスファーゼ（GST）を有する融合タンパク質とし て異種ポリペプチドを発現するため用いることができる。一般に、そのような融 合タンパク質は可溶性であり、グルタチオンアガロースビーズへ吸着させた後、 遊離グルタチオンの存在下で溶出させることにより溶解した細胞から容易に精製 できる。そのような系において生成されるタンパク質は、ヘパリン、トロンビン 或いはＸＡ因子プロテアーゼ切断部位を含めて、目的のクローン化ポリペプチド をGST部分から随意に放出させることができるように設計することができる。 酵母菌、サッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）では、α因 子、アルコールオキシダーゼ及びPGHのような構成的或いは誘導的プロモーター を含む多数のベクターを用いることができる。その概要を知るには、Ausubel等 （前出）及びGrant等（1987）Methods Enzymol 153:516-544を参照されたい。 植物発現ベクターを用いる場合には、ＣＡＲＩＮをコードする配列の発現は、 多数のプロモーターの何れかで促進される。例えばCaMVの35S及び19Sプロモータ ーのようなウイルスのプロモーターを、単独で、或いはTMV（Takamatsu,N.等（1 987）EMBO J 6:307-311）由来のオメガリーダー配列と共に用いることができる 。或いは、RUBISCOの小サブユニット、熱ショックプロモーターのような植物プ ロモーターを用いてもよい（Coruzzi,G.等（1984）EMBO J 3:1671-1680）;Brogl ie,R.等(1984)Science 224:838-843;及びWinter,J.等(1991)Results Probl. Cell Differ.17:85-105）。これらの作製物は、直接のＤＮＡ形質転換或いは病 原体によるトランスフェクションにより植物細胞内に導入できる。このような技 術の種々の一般に入手可能な文献に記載されている（例えばHobbs,S.又はMurry, L.E.McGraw Hill Yearbook of Science and Technology（1992）McGraw Hill NY ,pp191-196を参照されたい）。 昆虫系もＣＡＲＩＮの発現のために用いることができる。例えば、そのような 系の一つでは、Spodoptera frugiperda細胞或いはTrichoplusiaの幼虫において 外来遺伝子を発現するためのベクターとして、Autographa californica核多角体 病ウイルス（AcNPV）を用いる。ＣＡＲＩＮをコードする配列は、ポリヘドリン 遺伝子のようなウイルスの非必須領域にクローン化して、ポリヘドリンプロモー ターの制御下に置くことができる。ＣＡＲＩＮコーディング配列の挿入が成功す ると、ポリヘドリン遺伝子が不活性になり、コートタンパク質膜が欠如した変異 体ウイルスが生成される。次に、この変異体ウイルスを用いて、S.frugiperda細 胞或いはTrichoplusiaの幼虫へ感染させ、その中でＣＡＲＩＮを発現させる（En gelhard,E.K.等（1994）Proc.Natl.Acad.Sci.91:3224-3227）。 哺乳動物の宿主細胞では、多数のウイルス性発現系を利用することができる。 発現ベクターとしてアデノウイルスが用いられる場合には、ＣＡＲＩＮをコード する配列は、後期プロモータ及び三連リーダー配列からなるアデノウイルス転写 物／翻訳物複合体内に結合され得る。ウイルスのゲノムの非必須E1又はE3領域へ 挿入することにより、感染した宿主細胞でＣＡＲＩＮを発現できる生ウイルスが 得られる（Logan,J.及びShenk,T．(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.81:3655-3659）。 さらに、哺乳類宿主細胞内の発現を増加させるためにラウス肉腫ウイルス（RSV ）エンハンサのような転写エンハンサを用いることができる。 また、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）を用いることにより、プラスミドに含められ て発現され得るものより大きいＤＮＡの断片を供給することもできる。６〜１０ ＭのＨＡＣを構築し、治療の目的で、従来のデリバリー方法（リポソーム、ポリ カチオンのアミノポリマー、又は小胞）を利用して供給することができる。 また、ＣＡＲＩＮをコードする配列の効率的な翻訳のためには、特定の開始シ グナルも必要である。これらのシグナルには、ATG開始コドン及び隣接する配列 が含まれる。ＣＡＲＩＮ及びその開始コドン及び上流配列が適切な発現ベクター 内に挿入された場合には、別の転写または翻訳の制御シグナルは不要である。し かしながらコーディング配列又はその一部のみが挿入される場合には、ATG開始 コドンを含む外来の翻訳制御シグナルを与えなければならない。さらに、全イン サートの転写が確実に行われるようにするために、開始コドンは正しい読み枠に 存在しなければならない。外来転写エレメント及び開始コドンは、自然及び合成 両方の様々な起源に由来するものであり得る。例えば文献（Scharf,D.等（1994 ）Results Probl.Cell Differ.20:125-162）に記載されているもののような、特 定の細胞系に適切なエンハンサーを含めることにより、発現の効率を高めること ができる。 さらに宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節したり、発現したタンパク 質を望ましい形にプロセシングする能力で選択される。このようなポリペプチド の修飾には、以下のものに限定はしないが、アセチル化、カルボキシル化、グリ コシル化、リン酸化、脂質化（lipidation）並びにアシル化が含まれる。またタ ンパク質の「プレプロ」部分を切り離す翻訳後プロセシングも、正しい挿入、折 り畳み、及び／又は機能の発揮のために重要である。そのような翻訳後の作用の ための特定の細胞装置及び特徴的な機構を有している異なる宿主細胞（例えばCH O、HeLa、 MDCK、293、WI38）はAmerican Type Culture Collection（ATCC;Bethesda,MD） より市販されており、導入される外来タンパク質の正しい修飾やプロセシングが 確実に行われるようにするために、これを選択することができる。 長期間にわたって組換えタンパク質の高収率の産生を確保するためには安定し た発現が望ましい。例えば、ウイルスの複製起源及び／または内在性発現エレメ ント及び選択マーカー遺伝子を、同一のベクター上、或いは別のベクター上に含 む発現ベクターを用いて、ＣＡＲＩＮを安定的に発現する株細胞を形質転換する ことができる。ベクターの導入の後、細胞を、選択培地に切り替える前に濃縮培 地内で１〜２日間増殖させる。選択マーカーの目的は、選択のための耐性を与え 、その存在によって導入された配列をうまく発現する細胞を増殖、回収できるよ うにすることである。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞 の型に適した組織培養技術を用いて増殖することができる。 形質転換された株細胞を回収するために任意の数の選択系を用いることができ る。選択系には、以下のものに限定はしないが、単純ヘルペスウイルスチミジン キナーゼ（tk）（Wigler,M.等（1977）Cell 11:223-32）及びアデニンホスホリ ボシルトランスフェラーゼ（aprt）(Lowy,I.等（1980）Cell 22:817-23)遺伝子 が含まれ、それぞれtk^-及びaprt^-細胞において用いられる。また代謝拮抗物質、 抗生物質或いは除草剤への耐性を選択の基礎として用いることができる。例えば dhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え（Wigler,M.等(1980)Natl Acad Sci 77:3567）、nptはアミノ配糖体のネオマイシン及びG-418に対する耐性を与え（C olberre-Garapin,F.等（1981）J Mol Biol 150:1）、als或いはpatはクロルスル フロン（chlorsulfuron）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（p hosphinotricin acetyltransferase）に対 する耐性を与える（Murry，前出）。さらに選択に利用できる遺伝子として、例 えば細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようにするtrpB、 細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール（histinol）を利用できるようにする hisDが文献に記載されている(Hartman,S.C.及びR.C.Mulligan（1988）Proc.Natl .Acad.Sci.85:8047-51)。最近になって、形質転換体を特定するためばかりでは なく、特定ベクター系による一過性の或いは安定的なタンパク質発現の量を定量 するために広く用いられる、例えばアントシアニン、β−グルクロニダーゼ及び その基質、GUS、及びルシフェラーゼ及びその基質、ルシフェリンのような可視 マーカーがよく利用されるようになった（Rhodes,C.A.等（1995）Methods Mol.B iol.55:121-131）。 マーカー遺伝子発現の存在／不存在によって目的の遺伝子の存在も示唆される が、その存在及び発現は確認すべきである。例えばＣＡＲＩＮをコードする配列 がマーカー遺伝子配列内に挿入された場合は、ＣＡＲＩＮをコードする配列を含 む組換え体細胞をマーカー遺伝子の機能の存在により確認できる。或いは、マー カー遺伝子をＣＡＲＩＮをコードする配列と直列に配置して、両者が単一のプロ モータの制御下となるようにすることができる。誘導に応じてのマーカー遺伝子 の発現、つまり選択は、通常直列に配置された配列の発現をも同時に示すことに なる。 或いは、当業者には周知の様々な方法により、ＣＡＲＩＮをコードする核酸配 列を含みＣＡＲＩＮを発現する宿主細胞を識別できる。このような方法には、以 下のものに限定はしないが、DNA-DNA或いはDNA-RNAハイブリダイゼーション及び 、核酸及びタンパク質を検出及び／又は定量するための膜ベース、溶液ベース或 いはチップベースの技術を含むタンパク質バイオアッセイ或いはイムノアッセイ が含まれる。 ＣＡＲＩＮをコードする配列のプローブ、一部分、或いは断片を用い るDNA-DNA又はDNA-RNAハイブリダイゼーショまたは増幅により、ＣＡＲＩＮポリ ヌクレオチド配列の存在を検出することができる。核酸増幅に基づくアッセイで は、ＣＡＲＩＮをコードするＤＮＡ或いはＲＮＡを含む形質転換体を検出するた めに、核酸配列に基づくオリゴヌクレオチド或いはオリゴマーを用いる。 ＣＡＲＩＮポリペプチドの発現を検出し、測定するための、このタンパク質に 特異的なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれかを用いる種々の プロトコルが当業者には周知である。このようなプロトコルの例には、酵素結合 免疫検定法（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）及び蛍光表示式細胞分取器 法（FACS）を含まれる。ＣＡＲＩＮポリペプチド上で２つの非干渉なエピトープ に対して反応するモノクローナル抗体を利用する二部位モノクローナルベースイ ムノアッセイ（two-site,monoclonal-based immunoassay）が好適であるが、競 合的結合アッセイも用いられる。これらアッセイの並びに他のアッセイは、他の 文献、Hampton,R.等（1990;Serological Methods ，a Laboratory Manual,APS Pr ess,St.Paul MN）及びMaddox,D.E.等（1983,J.Exp.Med.158:1211-1216）に記載 されている。 さらに多くの標識及び結合技術が当業者には周知であり、種々の核酸及びアミ ノ酸のアッセイにおいて用いることができる。近縁な配列を検出するための、標 識されたハイブリダイゼーションプローブやＰＣＲプローブを作成するための手 段には、オリゴ標識、ニックトランスレーション法、末端標識、或いは標識ヌク レオチドを用いるＰＣＲ増幅などが含まれる。或いは、ＣＡＲＩＮコーディング 配列、或いはその任意の部分を、ｍＲＮＡプローブの作成のためのベクターにク ローン化する。そのようなベクターは当分野では周知で、市販されており、これ を用いて、例えばT7、T3、或いはSP6のような適切なＲＮＡポリメラーゼ及び標 識されたヌクレオチドを加えることによってin vitroでＲＮＡプローブを合成す ることができる。これらの方法は、種々の市販のキット（Pharmacia Upjohn（Ka lamazoo,MI）；Promega（Madison WI）；及びU.S.Biochemical Corp.(Cleveland OH））を用いて実施することができる。適切なリポーター分子、すなわち標識 には、放射性核種、酵素、フルオレセント（蛍光剤）、化学発光剤或いは色素剤 や、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子等が含まれる。 ＣＡＲＩＮをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞を、コー ドされたタンパク質を細胞培地で発現させ、そこから回収するのに適した条件下 で培養することができる。組換え体細胞により生成されるタンパク質は、用いら れる配列及び／またはベクターに応じて、細胞内に分泌、つまり細胞内に含まれ るようにすることができる。当業者には理解されるように、ＣＡＲＩＮをコード するポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、原核細胞か真核細胞の細胞膜を通 してのＣＡＲＩＮ分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計することができ る。また他の作製物を用いて、ＣＡＲＩＮをコードする配列を、可溶性タンパク 質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に結 合することができる。そのような精製を容易にするドメインには、以下のものに 限定はしないが、固定化金属上での精製を可能にするヒスチジントリプトファン モジュールのような金属キレートペプチド、固定化免疫グロブリン上での精製を 可能にするプロテインＡドメイン、並びにFLAGS延長／アフィニティ精製システ ムにおいて用いられるドメイン（Immunex Corp.,Seattle WA）が含まれる。精製 ドメインとＣＡＲＩＮの間にＸＡ因子またはエンテロキナーゼ（Invitrogen,San Diego CA）に対して特異的な配列のような切断可能なリンカー配列を含めるの は精製を促進するのに役立つ。ＣＡＲＩＮをコードする配列とと もに、６個のヒスチジン残基、それに続くチオレドキシン及びエンテロキナーゼ 切断部位をコードする核酸配列を含むこのような発現ベクターの１つは、融合タ ンパク質を発現する。ヒスチジン残基がIMIAC(Porath,J等（1992;Protein Exp.P urif.3:263-281）に記載のような固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフ ィー)での精製を促進するとともに、エンテロキナーゼ切断部位が融合タンパク 質からのＣＡＲＩＮの精製のための手段となる。融合タンパク質を含むベクター についての解説は、Kroll,D.J.等（1993;DNA Cell Biol.12:441-453）に記載さ れている。 組換え体の産生に加えて、ＣＡＲＩＮの断片を、固相技術を用いた直接的なペ プチド合成で作り出すこともできる（Merrifield J.(1963)J.Am.Chem.Soc.85:21 49-2154参照）。タンパク質合成は手作業で行えるが、自動化することもできる 。自動的な合成は、例えば、Applied Biosystem 431Aペプチドシンセサイザ（Pe rkin Elmer）を用いて行うことができる。ＣＡＲＩＮの種々の断片を個別に化学 的に合成し、化学的方法を用いて結合して完全長分子を作り出しすことも可能で ある。 治療 ＣＡＲＩＮ、マウスラテキシン（ＧＩ １６６９６２１）及びラット組織カル ボキシペプチダーゼ、ＴＣＩ（ＧＩ １１０１７８０）との間には化学的及び構 造的相同性がある。ノーザン分析は、ＣＡＲＩＮの発現が細胞増殖、癌、炎症、 免疫反応及び胎児／乳児発育に関連することを示す。 胎児発育中に、ＣＡＲＩＮの発現が減少することにより、被検者に対する有害 反応を伴わずにアポトーシスは増加するようになる。しかしながら他の状況及び 成体では、ＣＡＲＩＮの発現が減少することにより、被検者にとって有害である アポトーシスが増加するようになる。それゆ え一実施例では、ＣＡＲＩＮ或いはそのフラグメント又は誘導体が被検者に投与 され、アポトーシスの増加に関連する疾患を予防或いは治療することができる。 そのような疾患は、限定はしないが、エイズ及び他の感染性或いは遺伝性免疫不 全症、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、網膜色素変性 症及び小脳変性症のような神経変性疾患、再生不良性貧血のような脊髄形成異常 症候群、心筋梗塞、脳卒中及び再潅流障害のような虚血性障害、アルコール誘発 肝障害、肝硬変及びラチリスムのような毒素誘発性障害、悪液質のような萎縮病 、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎のようなウイルス性感染及び骨粗鬆症を含む。 別の実施例では、ＣＡＲＩＮに特異なアゴニストを用いて、限定はしないが上 記疾患を含むアポトーシス増加に関連する疾患を予防或いは治療することができ る。 さらに別の実施例では、ＣＡＲＩＮを発現することができるベクタ或いはその フラグメント又は誘導体を用いて、限定はしないが上記疾患を含むアポトーシス 増加に関連する疾患を予防或いは治療することができる。 さらに別の実施例では、ＣＡＲＩＮ或いはそのフラグメント又は誘導体を細胞 に加えて、細胞増殖を刺激することができる。詳細には、ＣＡＲＩＮは、細胞の 再生或いは分化を促すために、リポソーム、ウイルス系ベクタ或いはエレクトロ インジェクションのような送達機構を用いてin vivoで細胞に加えられることが できる。さらにＣＡＲＩＮを細胞、細胞株、組織或いは器官培養物をin vitro或 いはex vivoで加えて、異種或いは自己移植に用いるために細胞増殖を刺激する ことができる。ある場合にはその細胞は、感染症或いは癌を抑制できるように、 又は鎌形赤血球貧血症、βサラセミア、嚢胞性繊維症、ハンチントン舞踏病のよ うな疾患における遺伝性欠陥を補正できるように選択されるであろう。 さらにの別の実施例では、ＣＡＲＩＮに特異なアゴニストが細胞に投与され、 上記のような細胞増殖を刺激することができる。 さらに別の実施例では、ＣＡＲＩＮ或いはそのフラグメント又は誘導体を発現 することができるベクタを、上記のように、送達機構を用いてin vivoで細胞に 或いは細胞増殖を刺激するために細胞に投与することができる。 ＣＡＲＩＮの発現の増加は、細胞増殖の増加に関連して現れる。それゆえ一実 施例では、ＣＡＲＩＮのアンタゴニスト、或いはそのフラグメント又は誘導体が 被検者に投与され、細胞増殖に関連する疾患を予防或いは治療することができる 。そのような疾患は、限定はしないが、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄 腫、肉腫及び奇形腫、並びに詳細には副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、子宮頚 、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺 、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺及び子宮の癌を含む 種々の種類の癌を含む。一態様では、ＣＡＲＩＮに特異な抗体をアンタゴニスト として直接或いは標的又は送達機構として間接的に、ＣＡＲＩＮを発現する細胞 又は組織に医薬品因子を運ぶために用いることができる。 さらに別の実施例では、ＣＡＲＩＮをコードするポリヌクレオチドの相補配列 或いはアンチセンスを発現するベクタ、或いはそのフラグメント又は誘導体が被 検者に投与され、限定はしないが上記種類の癌を含む細胞増殖に関連する疾患を 予防或いは治療することができる。 さらに別の実施例では、ＣＡＲＩＮのアンタゴニスト或いはそのフラグメント 又は誘導体を被検者に投与して、任意のタイプの炎症、詳細にはある特定の疾患 から生じる炎症を予防或いは治療することができる。関連する炎症を伴うそのよ うな疾患は、限定はしないが、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、 貧血症、喘息、アテローム性硬化症、 気管支炎、胆嚢炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、 糖尿病、肺気腫、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、痛風、グレーブス病、過好酸球増加 症、過敏性腸症候群、紅斑性狼瘡、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋或いは心 膜炎症、変形性関節炎、骨粗鬆症、膵臓炎、多発性筋炎、リウマチ様関節炎、強 皮症、シェーングレーン症候群及び自己免疫性甲状腺炎、さらに癌、血液透析、 体外循環の合併症、ウイルス性、細菌性、真菌性、寄生性、原生動物性及び寄生 虫様性感染及び外傷を含む。一態様では、ＣＡＲＩＮに特異な抗体をアンタゴニ ストとして直接或いは標的又は送達機構として間接的に、ＣＡＲＩＮを発現する 細胞又は組織に医薬品因子を運ぶために用いることができる。 さらに別の実施例では、ＣＡＲＩＮ或いはそのフラグメント又は誘導体をコー ドするポリヌクレオチドの相補配列或いはアンチセンスを発現するベクタが被検 者に投与され、限定はしないが、上記炎症を含む任意の種類の炎症を予防或いは 治療することができる。 他の実施例では、本発明の治療タンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニス ト、相補配列或いはベクタの任意のものが、他の適当な治療薬剤と組み合わせて 投与される場合もある。併用療法において用いるのに適した薬剤の選択は、従来 の製薬原理に基づいて当業者により行われることができる。治療薬剤の組み合わ せは相互依存的に作用し、上記種々の疾患の治療及び予防に影響を与えるように なる。このアプローチを用いて、少ない投与量の薬剤で治療有効度を達成し、そ れにより有害な副作用に対する危険性を低減することができる。 ＣＡＲＩＮのアンタゴニスト或いはインヒビタは当業者に広く知られた方法を 用いて生成されることができる。詳細には、精製されたＣＡＲＩＮを用いて抗体 を生成するか、或いは医薬品因子のライブラリをスクリーニングし、ＣＡＲＩＮ と特異に結合するものを同定することができ る。 ＣＡＲＩＮに対する抗体は当業者に周知の方法を用いて生成することができる 。そのような抗体は、限定はしないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメ ラ、一本鎖、Ｆａｂフラグメント及びＦａｂ発現ライブラリにより生成されるフ ラグメントを含む場合がある。中和性抗体(ダイマ形成を抑制する抗体)が特に治 療上の使用に適している。 抗体を生成する場合、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト等を含む種々の宿 主を、ＣＡＲＩＮ或いはその任意のフラグメント又は免疫原特性を有するオリゴ ペプチドを注射することにより免疫することができる。宿主種に応じて、種々の アジュバントを用いて免疫学的反応を高めることができる。そのようなアジュバ ントは、限定はしないが、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのよう なミネラルゲル、及びリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペ プチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールの ような表面活性物質を含む。ヒトに用いられるアジュバントの中では、ＢＣＧ（ カルメット−ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム‐パルヴムが特に好ましい。 ＣＡＲＩＮに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチ ド、或いはフラグメントは、少なくとも５アミノ酸からなるアミノ酸配列を有し 、より好ましくは少なくとも１０アミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。それ らは自然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であり、小さな自然発生分子か らなる完全なアミノ酸配列を含むことが好ましい。ＣＡＲＩＮアミノ酸の短い伸 展部はキーホールリンペットヘモシアニン及びキメラ分子に対して生成される抗 体のような別のタンパク質の伸展部と融合されるようになる。 ＣＡＲＩＮに対するモノクローナル抗体は、培養中の持続細胞株によ る抗体分子の生成を実現する任意の技術を用いて調製されることができる。これ らの技術は、限定はしないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ 技術及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術を含む（Koehler等(1975)Nature 256:495- 497、Kozbor等(1985)J.Immunol Methods 81:31-42、Cote等(1983)Proc Natl Aca d Sci 80:2026-2030、Cole,S.P等(1984)Mol.Cell Biol.62:109-120）。 さらに「キメラ抗体」を生成するために開発された技術、適当な抗原特異性及 び生物活性を有する分子を得るためのマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子へのス プライシングを用いることができる（Morrison等(1984)Proc Natl Acad Sci 81: 6851-6855:Neuberger等(1984)Nature 312:604-608;Takeda等(1985)Nature 314:4 52-454）。別法では、一本鎖抗体の生成のために記載される技術が、ＣＡＲＩＮ 特異性一本鎖抗体を生成するように、当分野で知られた方法を用いて適合されて もよい。関連する特異性を有するが、個別のイディオタイプ組成物からなる抗体 が、ランダムに組み合わせた免疫グロビンライブラリからの鎖混合により生成さ れることもできる（Burton D.R.(1991)Proc Natl Acad Sci 88:11120-3）。 また抗体は、リンパ球集団においてｉｎ ｖｉｖｏで生成を誘発することによ り、或いは組換え免疫グロブリンライブラリ又は論文(Orlandi等(1989,Proc Nat l Acad Sci 86:3833-3837、Winter G and Milstein C(1991;Nature 349:293-299 )に開示されるような非常に特異性の結合剤のパネルをスクリーニングすること により生成することもできる。 またＣＡＲＩＮに対する特異な結合部位を含む抗体フラグメントを発生させる こともできる。例えば、そのようなフラグメントは、限定はしないが、抗体分子 のペプシン消化により生成することができるＦ（ａｂ’）２フラグメント及びＦ （ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架 橋を還元することにより生成することができるＦａｂフラグメントを含む。別法 では、Ｆａｂ発現ライブラリを構成して、所望の特異性を有するモノクローナル Ｆａｂフラグメントを迅速にしかも容易に同定できるようにする（Huse WD等(19 89)Science 256:1275-1281）。 種々のイムノアッセイを用いて、所望の特異性を有する抗体を同定するために スクリーニングすることができる。確立された特異性を有するポリクローナル抗 体或いはモノクローナル抗体のいずれかを用いる結合タンパク競合測定法或いは 免疫放射測定法用の種々のプロトコルが、当分野では周知である。そのようなイ ムノアッセイは典型的には、ＣＡＲＩＮとその特異性抗体との間の複合形成体を 測定することを含む。２つの非干渉性ＣＡＲＩＮエピトープに反応するモノクロ ーナル抗体を利用する２部位モノクローナル系イムノアッセイが好ましいが、結 合タンパク質競合測定法を用いることもできる(Maddox上記)。 本発明の別の実施例では、ＣＡＲＩＮをコードするポリヌクレオチド或いはそ の任意のフラグメント、又は相補配列が治療のために用いられる場合がある。一 態様では、ＣＡＲＩＮをコードするポリヌクレオチドに対する相補配列が、ｍＲ ＮＡの転写を遮断することが望ましい状況において用いられる。詳細には、細胞 は、ＣＡＲＩＮをコードするポリヌクレオチドに相補的な配列と形質転換される ことができる。このように相補分子或いはフラグメントを用いて、ＣＡＲＩＮ活 性を調節するか、或いは遺伝子機能の調節を実現することができる。そのような 技術は当分野では周知であり、センス或いはアンチセンスオリゴヌクレオチド又 はより大きなフラグメントが、ＣＡＲＩＮをコードする配列のコード化或いは調 節領域に沿った種々の位置から設計されることができる。 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス或いはワクシニアウイル スに、また種々の細菌性プラスミドに由来する発現ベクタが、 標的となる器官、組織或いは細胞集団にヌクレオチド配列を送達するために用い られる場合がある。当業者には周知の方法を用いて、ＣＡＲＩＮをコードする遺 伝子のポリヌクレオチドに相補的な核酸配列を発現する組換えベクタを構成する ことができる。これらの技術は、Sambrook等(上記)及びAusubel等(上記)の両方 に記載される。 ＣＡＲＩＮをコードする遺伝子は、細胞或いは組織を、ＣＡＲＩＮをコードす る高レベルのポリヌクレオチド或いはそのフラグメントを発現する発現ベクタと 形質転換することにより遮断されるようになる。そのような構成体は、翻訳でき ないセンス或いはアンチセンス配列を細胞内に導入するために用いられる。ＤＮ Ａ内に統合されない場合であっても、そのようなベクタは、内因性ヌクレアーゼ により無能にされるまで、ＲＮＡ分子を転写し続けることができる。一過性の発 現は、非複製ベクタを用いて一ヶ月或いはそれ以上の間持続し、適当な複製エレ メントがベクタ系の一部であるならさらに長く持続するようになる。 上記のように遺伝子発現の調節は、ＣＡＲＩＮをコードする遺伝子の制御、５ ’或いは調節領域（シグナル配列、プロモータ、エンハンサ及びイントロン）に 対する相補配列或いはアンチセンス分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ或いはＰＮＡ）を設計 することにより得られるようになる。転写開始部位、例えば開始部位からの位置 −１０と＋１０との間に由来するオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に三重ら せん塩基対技術を用いて抑制を実現することができる。二重らせんの能力の抑制 がポリメラーゼ、転写因子或いは調節分子を結合するのに十分に開放されるよう になるため、三重らせん対は有用である。三重ＤＮＡを用いる最近の治療の進歩 は、論文(Gee JE等(1994)In:Huber BE and BI Carr,Molecular and Immunologic Approaches,Futura Publishing Co.Mt Kisco NY)に記載されている。また相補 配列或いはアンチセンス分子は、転写物がリボソ ームに結合するのを防ぐことによりｍＲＮＡの翻訳を遮断するように設計するこ とができる。 リボザイム、すなわち酵素ＲＮＡ分子が、ＲＮＡの特異な切断を触媒するため に用いられる場合がある。リボザイム作用の機構は、相補的標的ＲＮＡへのリボ ザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションを伴い、それにヌクレオチド鎖 切断分割が伴う。用いられる例は、ＣＡＲＩＮをコードする配列のヌクレオチド 鎖切断分割に特異にしかも有効に触媒作用することができる遺伝子操作されたハ ンマヘッドモチーフリボザイムを含む。 任意の潜在的なＲＮＡ標的内の特異なリボザイム切断部位は、配列を含むリボ ザイム切断部位ＧＵＡ、ＧＵＵ及びＧＵＣに対して標的分子を走査することによ り最初に同定される。一度同定されれば、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対 応する１５〜２０の間のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列は、オリゴヌクレオ チドを無能にする副構造的な特徴に対して評価されることができる。また候補標 的の適合性も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的なオリゴヌクレオ チドとのハイブリダイゼーションに対する容易性を検査することにより評価する ことができる。 本発明の相補性リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子の合成に関して当分 野で知られた任意の方法により調製することができる。これらは、固相ホスホラ ミダイト化学合成のようなオリゴヌクレオチドを化学的に合成するための方法を 含む。別法では、ＲＮＡ分子は、ＣＡＲＩＮをコードするＤＮＡ配列のｉｎ ｖ ｉｔｒｏ 及びｉｎ ｖｉｖｏ転写により生成することができる。そのようなＤＮ Ａ配列は、Ｔ７或いはＳＰ６のような適当なＲＮＡポリメラーゼプロモータを用 いて種々のベクタ内に組み込むことができる。別法では、これらのｃＤＮＡ構成 体は、相 補ＲＮＡを合成し、細胞株、細胞或いは組織内に構成的に或いは誘導的に導入す ることができる。 ＲＮＡ分子を修飾して細胞内安定性及び半減期を改善することもできる。可能 な修飾は、限定はしないが、分子の５’並びにまた３’末端でのフランキング配 列の付加、或いは分子のバックボーンにおけるホスホジエステラーゼ連鎖ではな くホスホロチオネート或いは２’Ｏ−メチルの使用を含む。この概念はＰＮＡの 生成に固有のものであり、イノシン、キュェオシン及びワイブトシン並びにアセ チル−、メチル−、チオ−、及び内因性エンドヌクレアーゼにより容易に識別さ れないアデニン、シチジン、グアニン、チミン及びウリジンの同様に修飾された 形成体のような従来にはない塩基を含有することにより、これら分子の全体に拡 張されることができる。 細胞或いは組織内にベクタを導入するために多くの方法が利用可能であり、ｉ ｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏで使用するのに同様に適し ている。ｅｘ ｖｉｖｏ治療の場合、ベクタは、患者から取り出された基幹細胞 内に導入され、同じ患者に戻される自家移植物に対してクローンのように繁殖す ることができる。形質移入、リポソーム注射或いはポリカチオンアミノポリマに よる送達(Goldman,C.K.等(1997)Nature Biotechnology 15:462-66、参照して本 明細書の一部としている)は、当分野で周知の方法を用いて実現することができ る。 上記治療方法の任意の方法は、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル 、そして最も好ましくはヒトのような哺乳類を含む、治療を要する被検者に適用 されることができる。 本発明のさらに別の実施例は、上記任意の治療効果のために、製薬的に許容可 能な担体と共に用いられる医薬品組成物の投与に関連する。そのような医薬品組 成物は、ＣＡＲＩＮ、ＣＡＲＩＮに対する抗体、擬態、 アゴニスト、アンタゴニスト或いはＣＡＲＩＮのインヒビタからなることができ る。組成物は単独で、或いは限定はしないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロ ース及び水を含む任意の無菌の生体適合性医薬品担体において投与されることが ある、安定化化合物のような少なくとも１つの他の薬剤との組み合わせて投与さ れることができる。これらの組成物は単独で、或いは他の薬剤、薬物或いはホル モンと組み合わせて患者に投与してもよい。 本発明に用いられる医薬品組成物は、限定はしないが、経口、静脈内、筋肉内 、動脈内、骨髄内、クモ膜下、心室内、経皮、皮下、腹膜内、鼻腔内、腸内、局 所、舌下、直腸手段を含む任意の経路により投与されることができる。 活性処方成分に加えて、これらの医薬品組成物は、製薬的に用いることができ るプレパラートへの活性化合物の処理を容易にする医薬品添加物及び補助剤を含 む適当な製薬的に許容可能な担体を含む場合もある。さらに製剤及び投与に関す る技術についての詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences(Maack Publis hing Co.Easton PA)の最新版に見出される。 経口投与の場合の医薬品組成物は、経口投与に適した投与量の当分野で周知の 製薬的に許容可能な担体を用いて調剤することができる。そのような担体により 、医薬品組成物は、患者が経口摂取するための錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤 、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤等として調剤されることができ る。 経口投与するための医薬品調剤は、活性化合物と固形の医薬品添加物とを混合 して、選択的にはその混合物を細かく砕いて、さらに所望に応じて、錠剤或いは 糖衣剤コアを得るために適当な補助剤を加えた後、顆粒剤の混合物を処理して得 られるようになる。適当な医薬品添加物は、 ラクトース、スクロース、マンニトール或いはソルビトールを含む糖、トウモロ コシ、小麦、米、じゃがいも或いは他の植物からのデンプン、メチルセルロース 、ヒドロキシプロピルメチルセルロース或いはカルボキシルメチルセルロースナ トリウムのようなセルロース、及びアラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴ ム、並びにゼラチン及びコラーゲンのようなタンパク質を含む炭水化物或いはタ ンパク質賦形剤である。必要なら、架橋結合されたポリビニルピロリドン、寒天 、アルギン酸或いはアルギン酸ナトリウムのようなその塩を含む、崩壊剤或いは 可溶化剤が加えられてもよい。 糖衣剤コアは濃縮糖液のような適当なコーティングと共に用いられ、その濃縮 糖液はアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル（carbop ol gel）、ポリエチレングリコール並びにまた二酸化チタン、ラッカー溶液及び 適当な有機溶剤或いは溶剤混合物を含む場合もある。染料或いは色素が製品識別 、或いは活性化合物の量、すなわち投与量を特徴付けるために、錠剤或いは糖衣 錠コーティングに加えられる場合もある。 経口投与される医薬品製剤は、ゼラチンからなる押込嵌合式のプッシュフィッ トカプセル剤、並びにゼラチン及びグリコール或いはソルビトールのようなコー ティングからなる軟らかく封止されたソフトシールカプセル剤を含む。プッシュ フィットカプセル剤は、ラクトース或いはデンプンのような賦形剤或いは結合剤 、タルク或いはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、さらに選択的に安定 化剤と混合された活性処方成分を含むことができる。ソフトカプセル剤では、活 性化合物は、脂肪油、パラフィン油、或いは安定化剤を用いる場合、用いない場 合があるが液体ポリエチレングリコールのような適当な溶液内に溶解或いは懸濁 される場合がある。 非経口投与のための医薬品製剤は、活性化合物の水溶液を含む。注射するため に、本発明の医薬品組成物は、水溶液内で、好ましくはハンクス溶液、リンガー 溶液或いは生理緩衝食塩水のような生体適合性緩衝液内で調製される。水性の注 入懸濁液は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール或いはデ キストランのように、懸濁液を増粘する物質を含む場合がある。さらに活性化合 物の懸濁液は、適当な油性の注射懸濁液として調製される場合もある。適当な親 油性溶剤或いは溶媒は、ゴマ油のような脂肪油、或いはオレイン酸エチル又はト リグリセリドのような合成脂肪酸エステル、或いはリポソームを含む。選択に応 じて懸濁液は、高濃縮の溶液の調製を可能とするために化合物の可溶性を増加さ せる適当な安定化剤或いは薬剤を含む場合もある。 局所或いは鼻腔投与の場合、特定の障壁を浸透させるのに適した浸透剤が調製 において用いられる。そのような浸透剤は当分野で一般に知られている。 本発明の医薬品組成物は、当分野において知られた、例えば、従来の混合、溶 解、顆粒化、糖衣形成、微粒子化、乳状化、カプセル化、包括（entrapping）或 いは凍結乾燥処理による方法で製造される。 医薬品組成物は塩類として提供され、限定はしないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳 酸、酒石酸、リンゴ酸、琥珀酸等の多くの酸を用いて形成することができる。塩 類は、対応する遊離塩基形の場合より、水性或いはプロトン性溶剤において可溶 性を有する傾向がある。他の場合に好ましい製剤は、使用前に緩衝剤と結合され たｐＨ範囲４．５−５．５の１ｍＭ−５０ｍＭヒスチジン、０．１％−２％スク ロース、２％−７％マンニトールの任意のもの或いは全てを含む凍結乾燥粉末で ある。 医薬品組成物が調製された後、それらは適当な容器に入れられ、指示された条 件の治療のためにラベルを貼付される。ＣＡＲＩＮの投与の場 合、そのようなラベル貼付は、投与の量、頻度並びに方法を含むであろう。 本発明に用いるために適した医薬品組成物は、活性処方成分が目的を果たすた めの有効な量だけ含まれる組成物を含む。有効な量を投与することは、当業者の 能力内で果たすことができる。 任意の化合物の場合、製薬的に有効な量は、例えば腫瘍性細胞の細胞培養アッ セイ、或いは通常マウス、ウサギ、イヌ或いはブタの動物標本のいずれかにおい て最初に見積もられる。また動物標本を用いて、所望の濃縮範囲及び投与の経路 が確定される。その後その情報を用いて、ヒトに投与するための有効な量及び経 路を確定することができる。 製薬的に有効な量は、症状或いは状態を改善する、例えばＣＡＲＩＮ或いはそ のフラグメント、ＣＡＲＩＮの抗体、アゴニスト、アンタゴニスト、或いはＣＡ ＲＩＮのインヒビタの主成分の量である。そのような化合物の治療に対する有効 度及び毒性は、細胞培養或いは実験動物における標準的な製薬的手順、例えばＥ Ｄ５０（集団の５０％において製薬的に有効な量）及びＬＤ５０（集団の５０％ が致死する量）により確定することができる。治療効果と毒性効果の投与量比が 治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指 数を示す医薬品組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られる データは、ヒトに投与するための量の範囲を処方する際に用いられる。そのよう な化合物の投与量は、毒性が非常に少ないか或いは全くなくＥＤ５０を含む血中 濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、用いられる投与形態、患者の感 度及び投与経路によりこの範囲内で変化する。 厳密な投与量は、治療を要する患者に関連する要因により医師によって確定さ れるであろう。量及び投与を調整して、十分なレベルの活性成分を与えたり、或 いは所望の効果を維持することもある。考慮される場 合がある要因は疾患状態の重症度、被検者の健康状態、患者の年齢、体重及び性 別、食事、投与の時間及び頻度、薬物の組み合わせ、反応への敏感度、並びに治 療に対する耐性／反応を含む。特定の製剤の半減期及びクリアランス率に応じて 、３〜４日毎、毎週或いは２週間毎に一度、長時間作用性の医薬品組成物が投与 される場合もある。 通常の投与量は０．１μｇ〜１００，０００μｇまで変化し、投与の経路にも よるが、全投与量は約１ｇまでである。詳細な投与量及び送達の方法に関する手 引きは文献に与えられており、一般に当分野の開業医が利用できる。当業者は、 タンパク質或いはそのインヒビタの場合とは異なる製剤を、ヌクレオチドの場合 に用いるであろう。同様にポリヌクレオチド或いはポリペプチドの送達は特定の 細胞、状態、位置等に対して特異であろう。 診断 別の実施例では、ＣＡＲＩＮを特異に結合する抗体が、ＣＡＲＩＮの発現によ り特徴付けられる状態或いは疾患の診断のために、又はＣＡＲＩＮ、アゴニスト 、アンタゴニスト或いはインヒビタを用いて治療中の患者をモニタするための検 定法において用いることができる。診断のために有用な抗体は、治療の場合に上 記した方法と同様の方法で調製することができる。ＣＡＲＩＮに対する診断検定 法は、抗体及び標識を用いて、ヒト体液或いは細胞又は組織の抽出物においてＣ ＡＲＩＮを検出する方法を含む。抗体は、修飾と共に、或いは修飾を用いずに用 いられる場合があり、リポータ分子と共有結合で、或いは非共有結合での何れか で結合することにより標識化されることができる。当分野において知られる種々 のリポータ分子を用いることができ、そのいくつかが上記される。 ＣＡＲＩＮを測定するためのＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ及びＦＡＣＳを含む種々のプ ロトコルが当分野において知られており、ＣＡＲＩＮ発現の変更されたレベル或 いは異常なレベルを診断するための方法を提供する。ＣＡＲＩＮ発現のための正 常或いは標準的な値は、正常な哺乳動物被検者、好ましくはヒトから取り出され た体液或いは細胞抽出物を複合体形成に適した条件下でＣＡＲＩＮに対する抗体 と結合することにより確立される。標準的な複合体形成量は種々の方法により定 量することができるが、光計測による手段が好ましい。被検者において発現した ＣＡＲＩＮの量、制御及び疾患、生検組織からのサンプルが標準値と比較される 。標準値と被検者値との間の偏差が疾患を診断するためのパラメータを確立する 。 本発明の別の実施例では、ＣＡＲＩＮをコードするポリヌクレオチドを診断の ために用いることができる。用いられるポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチド 配列、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子及びＰＮＡを含む。ポリヌクレオチド を用いて、ＣＡＲＩＮの発現が疾患と相関をなす可能性がある生検組織の遺伝子 発現を検出かつ定量することができる。診断検定法を用いて、ＣＡＲＩＮの存否 及び過剰発現を識別することができ、さらに治療処置中のＣＡＲＩＮレベルの調 節をモニタすることができる。 一態様では、ＣＡＲＩＮ或いは密接に関連する分子をコードするゲノム配列を 含むポリヌクレオチド配列を検出することができるＰＣＲプローブを用いるハイ ブリダイゼーションにより、ＣＡＲＩＮをコードする核酸配列を同定することが できる。非常に特異な領域、例えば５’調節領域内の１０個の特有のヌクレオチ ド、或いは特異性の低い領域、例えば特に３’コード化領域の何れかからなるプ ローブの特異性及びそのハイブリダイゼーション或いは増幅の厳密性（最大、高 、中間或いは低） が、そのプローブがＣＡＲＩＮをコードする自然発生配列のみを同定するか、或 いは関連する配列を同定するかを確定するであろう。 またプローブは関連する配列の検出に用いることもでき、ＣＡＲＩＮをコード する配列の任意のものからのヌクレオチドの少なくとも５０％を含むことが好ま しい。本発明のハイブリダイゼーションプローブはＤＮＡ或いはＲＮＡであり、 配列番号：２のヌクレオチド配列に、或いはプロモータ、エンハンサエレメント 及び自然発生ＣＡＲＩＮのイントロンを含むゲノム配列に由来する。 ＣＡＲＩＮをコードするＤＮＡのための特異なハイブリダイゼーションプロー ブを生成するための手段は、ＣＡＲＩＮ或いはＣＡＲＩＮ誘導体をコードする核 酸配列を、ｍＲＮＡプローブの生成のためにベクタにクローニングする過程を含 む。そのようなベクタは当分野では周知で、市販されており、適当なＲＮＡポリ メラーゼ及び適当な標識化ヌクレオチドを加えることによりｉｎ ｖｉｔｒｏで ＲＮＡプローブを合成するために用いることができる。ハイブリダイゼーション プローブは、種々のリポータ群、例えば３２Ｐ或いは３５Ｓのような放射性核種 、又はアビジン／ビオチン結合系等を介してプローブに結合されるアルカリ性フ ォスファターゼのような酵素標識により標識されることができる。 ＣＡＲＩＮをコードするポリヌクレオチド配列はＣＡＲＩＮの発現に関連する 疾患の診断のために用いることができる。そのような疾患の例は、腺癌、白血病 、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫及び奇形腫、並びに詳細には副腎、膀胱、骨 、骨髄、脳、乳房、子宮頚、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋 肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、乳腺、 甲状腺及び子宮の癌を含む種々の種類の癌、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、 アレルギー、貧血症、喘息、アテローム性硬化症、気管支炎、胆嚢炎、クローン 病、潰瘍 性大腸炎、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、萎縮性胃炎、糸球体 腎炎、痛風、グレーブス病、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、紅斑性狼瘡、多 発性硬化症、重症筋無力症、心筋或いは心膜炎症、変形性関節炎、骨粗鬆症、膵 臓炎、多発性筋炎、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーングレーン症候群及び自 己免疫性甲状腺炎、さらに癌、血液透析、体外循環の合併症、ウイルス性、細菌 性、真菌性、寄生性、原生動物性及び寄生虫様性感染及び外傷のような炎症に関 連する疾患、及びエイズ及び他の感染性或いは遺伝性免疫不全症、アルツハイマ ー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、網膜色素変性症及び小脳変性症の ような神経変性疾患、再生不良性貧血のような脊髄形成異常症候群、心筋梗塞、 脳卒中及び再潅流障害のような虚血性障害、アルコール誘発肝障害、肝硬変及び ラチリスムのような毒素誘発障害、悪液質のような萎縮病、Ｂ型肝炎及びＣ型肝 炎のようなウイルス性感染及び骨粗鬆症を含むアポトーシスに関連する疾患を含 む。ＣＡＲＩＮをコードするポリヌクレオチド配列は、サザン分析或いはノーザ ン分析、ドットブロット、又は他の膜系技術において、又はＰＣＲ技術において 、又は変更されたＣＡＲＩＮ発現を検出するために患者生検からの体液或いは組 織を利用するディップスティック、ｐｉｎ、ＥＬＩＳＡ検定法或いはマイクロア レイにおいて用いることができる。そのような定性的或いは定量的方法は当分野 において周知である。 特定の態様では、ＣＡＲＩＮをコードするヌクレオチド配列は、種々の癌、特 に上記したような癌の活性化或いは誘発を検出する検定法において有用である。 ＣＡＲＩＮをコードするヌクレオチド配列は標準的な方法において標識され、ハ イブリダイゼーション複合体の形成に適した条件下で患者からの体液或いは組織 サンプルに加えられることができる。適当な時間インキュベートした後、サンプ ルは洗浄され、そのシグナル が定量され、標準値と比較される。生検された或いは抽出されたサンプルのシグ ナルの量が比較制御サンプルのシグナルの量から著しく変更されている場合には 、そのヌクレオチド配列はサンプル内のヌクレオチド配列とハイブリダイズされ ており、サンプル内のＣＡＲＩＮをコードするヌクレオチド配列の変更レベルの 存在が関連する疾患の存在を示す。またそのような検定法を用いて、動物実験、 臨床試験或いは個々の患者の治療をモニタする際に特定の治療措置の有効度を評 価することができる。 ＣＡＲＩＮの発現に関連する疾患を診断する基準を与えるために、発現に対す る正常或いは標準値が確立される。これは、動物或いはヒトいずれかの正常な被 検者から取り出された体液或いは細胞抽出物を、当分野で周知の複合体形成に適 した条件下でＣＡＲＩＮをコードする配列或いはそのフラグメントと結合するこ とにより与えられる。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な被検者から得 られた値を、既知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが用いられる実験 から得られた値と比較することにより定量することができる。正常サンプルから 得られた標準値が、疾患の症状がある被検者のサンプルから得られた値と比較さ れる。標準値と被検者値との間の偏差を用いて、疾患状態の存在を立証する。 一度疾患が確定され、治療プロトコルが開始されれば、その患者の発現のレベ ルが正常な患者において観測されるレベルに接近し始めるか否かを評価するため に、ハイブリダイゼーション検定法が規則的に繰り返される。継続的な検定法か ら得られる結果を用いて、数日から数ヶ月の期間に渡る治療の有効度を示すこと ができる。 癌の場合、個々の患者からの生検組織内の異常な量の転写物の存在が、疾患の 発生に対する素因を示すか、或いは実際の臨床的な症状が発生す る前に疾患を検出するための手段を提供する。この種のより決定的な診断により 、専門医は、予防措置或いは初期段階での積極的な治療を行うことができ、それ により癌の発生を予防したり、或いは進行するのを防ぐこともできる。 ＣＡＲＩＮをコードする配列から設計されるオリゴヌクレオチドに対するさら なる診断的な使用は、ＰＣＲの使用を含む場合がある。そのようなオリゴマは化 学的に合成されるか、酵素的に生成されるか、或いはｉｎ ｖｉｔｒｏで生成さ れてもよい。オリゴマは、２つのヌクレオチド配列、すなわち１つがセンス方向 （５’−＞３’）を有し、もう１つがアンチセンス方向（３’＜−５’）を有す るヌクレオチド配列からなり、特異な遺伝子或いは条件の同定のために最適化さ れた条件下で用いられることが好ましい。同一の２つのオリゴマ、入れ子状の組 のオリゴマ、或いはオリゴマの縮重プールであっても、密接に関連するＤＮＡ或 いはＲＮＡ配列を検出並びにまた定量するために低い厳密性条件下で用いること ができる。 またＣＡＲＩＮの発現を定量するために用いることができる方法は、ヌクレオ チドの放射標識化或いはビオチン標識化、或いは制御核酸の相互増幅並びに実験 結果が書き込まれる標準曲線を含む（Melby,P.C．等(1993)J.Immunol.Methods,1 59:235-244;Duplaa,C．等(1993)Anal.Blochem.229-236）。多数サンプルを定量 する速度は、ＥＬＩＳＡフォーマットの検定法を実行することにより加速するこ とができ、その際対象のオリゴマは種々の希釈法において表され、スペクトル光 計測反応或いは色計測反応が迅速な定量化をもたらすようになる。 さらに別の実施例では、ここで記載されたポリヌクレオチド配列の任意のもの に由来するオリゴヌクレオチドをマイクロアレイのプローブとして用いることも できる。マイクロアレイを用いて、多数の遺伝子の発 現レベルを同時にモニタし（転写画像を生成するために）、遺伝子変異配列、突 然変異及び多形性を同定することができる。この情報は、遺伝子機能を確定し、 疾患の遺伝的基礎を理解し、かつ疾患を診断する際に有用であり、また治療薬剤 の活性を発生及びモニタする際に有用であろう。 一実施例では、全て参照してその全体を本明細書の一部としているＰＣＴ出願 ＷＯ９５／１１９９５(chee等)、Lockhart,D.J.等(1996;Nat.Biotech.14:1675-1 680)及びSchena,M等(1996;Proc.Natl.Acad.Sci.93:10614-10619)に記載される方 法に従ってマイクロアレイが準備及び使用される。 マイクロアレイは、多数の固有の一本鎖核酸配列、通常固形支持体に固定され るｃＤＮＡの合成アンチセンスオリゴヌクレオチド或いはフラグメントのいずれ がからなることが好ましい。マイクロアレイは、既知の５’或いは３’配列に渡 る連続的なオリゴヌクレオチドを含むか、或いは完全長配列又はその配列の長さ に沿った特定の領域から選択される固有のオリゴヌクレオチドを含む場合がある 。マイクロアレイに用いられるポリヌクレオチドは、少なくとも配列のあるフラ グメントが既知である対象の遺伝子に特異なオリゴヌクレオチドであるか、或い は特定の細胞タイプ、発生状態或いは疾患状態に共通する１つ或いはそれ以上の 未同定のｃＤＮＡに特異なオリゴヌクレオチドである。 あるマイクロアレイの場合に既知の配列に対するオリゴヌクレオチドを生成す るために、対象の遺伝子が、ヌクレオチド配列の５’或いはより好ましくは３’ 末端で開始するコンピュータアルゴリズムを用いて試験される。そのアルゴリズ ムは、その遺伝子に対して固有で、ハイブリダイゼーションに適した範囲内にＧ Ｃ含有物を有し、ハイブリダイゼーションに干渉することがある予測される副構 造体のない所定の長さのオ リゴマを同定する。そのオリゴマは、光配向化学処理（light-directed chemica l process）を用いて支持体上の指定された領域で合成される。支持体は紙、ナ イロン或いは他の種類の膜、フィルタ、チップ、スライドガラス或いは任意の他 の適切な固定支持体である。 別の態様ではオリゴマは、参照してその全体を本明細書の一部としているＰＣ Ｔ出願ＷＯ９５／２５１１１６（Baldeschweiler等）に記載されるような、化学 的結合手順及びインクジェット吐着装置を用いることにより支持体の表面上で合 成されることができる。別の態様では、ドット（或いはスロット）ブロットに類 似の「グリッド（gridded）」アレイを用いて、真空系、熱、紫外線（ＵＶ）、 機械的或いは化学的結合手順を利用して、支持体の表面にｃＤＮＡフラグメント 或いはオリゴヌクレオチドを配列及び結合することができる。アレイは手動で或 いは市販の開発された（スロットブロット或いはドットブロット装置）機器及び 装置（ロボット式機器を含む）を用いて生成され、８ドット、２４ドット、９６ ドット、３８４ドット、１５３６ドット或いは６１４４ドット、又は市販の機器 を有効に使用するのに適した任意の他の数量のグリッドを含む。 マイクロアレイを用いてサンプルの分析を行うために、生検サンプルからのＲ ＮＡ或いはＤＮＡがハイブリダイゼーションプローブに加工される。ｍＲＮＡが 単離され、ｃＤＮＡがアンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ）を形成するためのテンプ レートとして生成及び使用される。ａＲＮＡは、蛍光性ヌクレオチドの存在下で 増幅され、標識されたプローブはマイクロアレイでインキュベートされ、プロー ブ配列がマイクロアレイの相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするよう にする。インキュベーションの条件は、ハイブリダイゼーションが正確な相補的 一致或いは種々の低い相補性の度合で生じるように調整される。ハイブリダイズ さ れなかったプローブを除去した後、スキャナを用いて蛍光のレベル及びパターン を確定する。スキャナで読取られた画像は検査され、マイクロアレイ上の各オリ ゴヌクレオチド配列の相補性の度合及び相対的な存在比を確定する。生検サンプ ルは任意の体液（例えば血液、尿、唾液、粘液、胃液等）、培養された細胞、バ イオプシ或いは他の組織標本から得ることができる。同時に、個々の配列の全て に対して、検出系を用いて、ハイブリダイゼーションの存否或いは量を測定する ことができる。このデータは、サンプル内の配列、突然変異、変異配列或いは多 形性についての大規模な相関調査の場合に用いることができる。 本発明の別の実施例では、ＣＡＲＩＮをコードする核酸配列を用いて、自然発 生ゲノム配列をマッピングするために有用なハイブリダイゼーションプローブを 生成することもできる。その配列は特定の染色体に或いは染色体の特異領域に、 又はPrice CM(1993;Blood Rev 7:127-34)及びTrask BJ(1991;Trends Genet 7:14 9-54)に記載されるような、例えばヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母菌人工染色 体（ＹＡＣ）、細菌性人工染色体（ＢＡＣ）、細菌性Ｐ１構造体或いは単一染色 体ｃＤＮＡライブラリのような人工染色体構造に遺伝子座が決定されるようにな る。 蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Verma等(1988)Human Chromosom es :A Manual of Basic Techniques,Pergamon Press,New York NYに記載されるＦ ＩＳＨ）は、他の物理的な染色体マッピング技術及び遺伝マップデータと相関を なす。遺伝子マップデータの例は種々の科学雑誌或いはOnline Mendelian Inher itance in Man（ＯＭＩＭ）に見出すことができる。物理的染色体マップ上のＣ ＡＲＩＮをコードする遺伝子の位置と特定の疾患或いは特定の疾患に対する素因 との間の相関は、その遺伝的疾患に関連するＤＮＡの領域の境界を定めることを 可能にする。本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者と 保菌者、すなわち感染した個体との間の遺伝子配列の差を検出することができる 。 染色体標本のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び確立された染色体マ ーカを用いる連鎖分析のような物理的マッピング技術が、遺伝子マップを拡張す るために用いることができる。マウスのような別の哺乳動物種の染色体上の遺伝 子の配置が、特定のヒト染色体の数或いは腕が未知であっても、関連するマーカ を明らかにできる場合もある。新規の配列は、物理的なマッピングにより染色体 腕或いはその一部に割り当てることができる。これは、位置クローニング或いは 他の遺伝子発見技術を用いる疾患遺伝子を検索する研究者に貴重な情報を与える 。一度疾患或いは症候群が、特定のゲノム領域、例えばＡＴから１１ｑ２２−２ ３まで(Gatti等(1998)Nature 336:577-580)への遺伝子連鎖により自然のまま局 在されていれば、その領域に対する任意の配列マッピングが、さらなる研究のた めの関連或いは調節遺伝子を表すことができる。また本発明のヌクレオチド配列 を用いて、正常個体と保菌者、すなわち感染個体との間における転座、逆位等に より染色体位置内の差を検出することができる。 本発明の別の実施例では、ＣＡＲＩＮ、その触媒作用或いは免疫原性フラグメ ント又はオリゴペプチドを用いて、種々の薬物スクリーニング技術の任意のもの において化合物のライブラリをスクリーニングすることができる。そのようなス クリーニングにおいて用いられるフラグメントは溶液中に遊離するか、固形支持 体に付着するか、細胞表面上に支持されるか、或いは細胞内に配置されてもよい 。ＣＡＲＩＮと被試験薬剤との間に形成される結合複合体が測定される場合もあ る。 薬物スクリーニングに用いる場合がある別の技術は、ＰＣＴ出願ＷＯ８４／０ ３５６４に記載されるような、対象のタンパク質への適当な結 合親和性を有する化合物の高スループットスクリーニングを実現する。 この方法では、ＣＡＲＩＮに適用されるような、多数の異なる小さな検査化合物 がプラスチックピン或いはある他の表面のような固体支持体上で合成される。検 査化合物はＣＡＲＩＮ或いはそのフラグメントと反応し、洗浄される。その後結 合されたＣＡＲＩＮが当分野で周知の方法により検出される。また精製されたＣ ＡＲＩＮは、上記の薬物スクリーニング技術において用いるためのプレート上に 直接コーティングされることもできる。別法では、非中和性抗体を用いて、ペプ チドを捕捉し、それを固体支持体上に固定化することもできる。 別の実施例では、ＣＡＲＩＮを特異に結合することができる中和性抗体がＣＡ ＲＩＮを結合するための検査化合物と競合する、競合薬物スクリーニングアッセ イを使用する。この方法では、抗体を用いて、ＣＡＲＩＮと１つ或いはそれ以上 の抗原決定基を共有するあらゆるペプチドの存在を検出することができる。 さらに別の実施例では、その新規の技術が、限定はしないがトリプレット遺伝 子コード及び特異な塩基対相互作用のような特性を含む現在知られているヌクレ オチド配列の特性に依存する場合には、ＣＡＲＩＮをコードするヌクレオチド配 列を、将来開発されるあらゆる分子生物学技術において用いることができる。 以下の例は、本発明を例示するために与えるものであり、本発明を制限するも のではない。実施例 Ｉ ＰＲＯＳＴＵＴ０９ｃＤＮＡライブラリ構成 ＰＲＯＳＴＵＴ０９ｃＤＮＡライブラリは６６歳白人男性から得られた前立腺 腫瘍から構成された。手術は根治的前立腺切除、根治的胆嚢切 除及び腸への尿の迂回を含んだ。病理報告は、前立腺尿道内に位置する浸潤性３ 段階（grade 3）移行上皮癌を示しており、前立腺周囲腺を含み、発散的に前立 腺実質に前後から浸潤するように広がった。尿管（左右、多数の再切除後）及び 前立腺尿道を含む最終的な手術周辺部は、腫瘍に対して陰性であった。移行上皮 癌の広範な関与に加えて、右側前立腺は腺癌の微視的な病巣、すなわち前立腺に 限られ、被膜への浸透を示さないＧｌｅａｓｏｎ段階３＋２の腺癌を含んだ。多 数の左右骨盤リンパ節は腫瘍に対して陰性であった。患者は悪性腫瘍と診断され た。 凍結組織はBrinkmann Homogenizer Polytron PT-3000(Brinkmann Instruments ,WestburyNJ)を用いて均質化かつ溶解された。溶解生成物は５．７Ｍ ＣｓＣｌ 緩衝材上で、周囲温度において毎分２５，０００回転で１８時間Beckman L8-70M Ultracentrifuge(Beckman Instruments)においてBeckman SW28ロータを用いて 遠心分離された。ＲＮＡは、酸性フェノールｐＨ４．７を用いて抽出され、０． ３Ｍ酢酸ナトリウム及び２．５体積のエタノールを用いて沈殿され、リボヌクレ アーゼ遊離水内に再懸濁され、３７℃でデオキシリボヌクレアーゼ処理された。 ＲＮＡ抽出及び沈殿は上記のように繰り返された。その後ＲＮＡはQiagen Oligo tex kit(QIAGEN Inc.)を用いて単離され、ｃＤＮＡライブラリを構成するために 用いられた。 ＲＮＡは、ｃＤＮＡ合成及びプラスミドクローニングのためにSuper Script P lasmid System(Cat.No.18248-013:Gibco/BRL Gaithersburg,MD)の推奨プロトコ ルに従って処理された。ｃＤＮＡはSepharose CL4B column(Cat.No.275105-01 P harmacia)上で分画され、４００ｂｐを超えるそのｃＤＮＡはｐＩＮＣＹＩに結 合された。その後プラスミドｐＩＮＣＹＩはDH5a（登録商標）コンピテント細胞 (Cat.No.18258-012 Gibco/BRL)に形質転換された。 ＩＩ ｃＤＮＡクローンの単離及び配列決定 プラスミドＤＮＡは細胞から遊離され、REAL Prep 96 Plasmid Kit(Catalog N o.26173,QIAGEN)を用いて精製された。このキットにより、マルチチャネル試薬 ディスペンサを用いて、９６ウエルブロック内の９６サンプルを同時に精製する ことができる。推奨プロトコルを用いたが以下の点を変更した。１）細菌は、２ ５ｍｇ／Ｌのカルベニシリン及び０．４％のグリセロールで１ｍｌの無菌のTerr ific Broth（Catalog No.22711.Gibco/BRL）において培養された。２）接種後、 培養株は１９時間インキュベートされ、インキュベーション終了時に細胞は０． ３ｍｌの溶解緩衝液で溶解された。３）イソプロパノール沈殿に続いて、プラス ミドＤＮＡペレットが０．１ｍｌの蒸留水に再懸濁された。プロトコルの最後の ステップを終了した後、サンプルは４℃で保管するために９６ウエルブロックに 移された。 ｃＤＮＡは、Peltier Thermal Cyclers(PTC200 from MJ Research,Watertown MA)及びApplied Biosystems 377 DNA Sequencing Systemsと共にHamilton Micro Lab 2200(Hamilton,Reno NV)を用いて、Sanger F等(1975;J Mol Biol 94:441f) の方法により配列決定され、読み枠が確定された。 ＩＩＩ ｃＤＮＡクローン及び推定されたタンパク質の相同性検索 配列表のヌクレオチド配列及びそれに由来するアミノ酸配列は、GenBank、Swi ssProt,BLOCKS及びPima IIのようなデータベースへの問合せ配列として用いられ た。そのデータベースは以前に同定され、注釈を付けた配列を含んでおり、ＢＬ ＡＳＴを用いて相同性（類似性）の領域の検索が行われた。ＢＬＡＳＴはBasic Local Alignment Search Tool（Altschul.S.F.(1993)J.Mol.Evol.36:290-300,Altschul等(1990)J.Mol.Bio l.215:403-410）を表している。 ＢＬＡＳＴはヌクレオチド及びアミノ酸配列の両方のアライメントを生成し、 配列類似性を確定した。そのアライメントの局部的な性質のため、ＢＬＡＳＴは 厳密な一致を判定する際に、或いは原核（細菌）又は真核（動物、真菌或いは植 物）起源からなる相同体を同定する際に特に有用であった。ここで他のアルゴリ ズム、例えば参照して本明細書の一部としているSmith T.等(1992,Protein Engi neering 5:35-51)に記載されるアルゴリズムが、主要配列パターン及び副次的な 構造間隙の問題を取り扱う際に用いられる。本出願において開示される配列は少 なくとも４９ヌクレオチドの長さを有し、不要な塩基は１２％未満である（この 場合Ａ、Ｃ、Ｇ或いはＴではなくＮが記録される）。 ＢＬＡＳＴアプローチはKarlin.S汲びS.F.Atschul(1993;Proc.Nat.Acad.Sci.9 0:5873-7)に詳述され、参照して本明細書において用いられており、問合せ配列 とデータベース配列との間の一致を検索し、見い出されたあらゆる一致の統計的 有意性を評価し、ユーザにより選択された有意な閾値を満足する一致のみを報告 した。この応用例では、閾値はヌクレオチドの場合１０^-25、ペプチドの場合１ ０^-14に設定された。 インサイト社ヌクレオチド配列が霊長類（pri）、齧歯類（rod）及び哺乳類配 列（mam）の場合にGenBankデータベースに対して検索され、その後同じクローン から推定されたアミノ酸配列が、GenBank機能タンパク質データベース、哺乳動 物（mamp）、脊椎動物（vrtp）及び真核生物（eukp）に対して相同体を検索され た。ある特定の一致に対して関連したデータベースがGixxx±pとして報告された (ここでxxxはpri、rod等であり、存在する場合にはｐはペプチドである)。 ＩＶ ノーザン分析 ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技 術であり、特定の細胞種或いは組織からのＲＮＡが結合されている膜への標識さ れたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う（Sambrook等、上記）。 ＢＬＡＳＴ（Altschul SF 1993及び1990上記）を用いる類似のコンピュータ技 術を用いて、ＧｅｎＢａｎｋ或いはLIFESEQ^TMdatabase（インサイト社）のよう なヌクレオチドデータベース内の同一或いは関連する分子を検索する。この分析 は多くの膜系ハイブリダイゼーションより非常に速度が速い。さらにコンピュー タ検索の感度を変更して、任意の特定の一致が、厳密な一致或いは相同的一致の 何れとして分類されるかを確定することができる。 検索の基準は、 （％配列同一性×％最大ＢＬＡＳＴスコア）／１００ として定義される積スコアである。積スコアは、２つの配列間の類似度及び配列 一致の長さの両方を考慮する。例えば、積スコア４０の場合、その一致は１−２ ％誤差の範囲内で正確であり、７０ではその一致は正確であろう。相同性分子は 通常、１５−４０間の積スコアを示す分子を選択することにより同定されるが、 それより低いスコアでも関連した分子が同定される場合もある。 ノーザン分析の結果は、ＣＡＲＩＮをコードする転写物が発生するライブラリ のリストとして報告される。また存在量及び存在比も報告される。存在量は、特 定の転写物がｃＤＮＡライブラリ内に現れる回数を直接表し、存在率は、存在量 をｃＤＮＡライブラリ内で試験された配列の全数で割った値である。 Ｖ ＣＡＲＩＮをコードするポリヌクレオチドの伸展 インサイト社クローン１６４９５８４の核酸配列を用いて、部分ヌクレオチド 配列を完全長まで伸展するためにオリゴヌクレオチドプライマを設計した。１つ のプライマを合成してアンチセンス方向の伸展を開始し、他のプライマを合成し てセンス方向の配列を伸展した。プライマを用いて、対象の領域に対する新規で 未知のヌクレオチド配列を含むアンプリコンを「外側に」発生させる既知の配列 の伸展を容易にした。初期プライマは、OLIGO 4.06(National Biosciences)或い は他の適当なプログラムを用いてｃＤＮＡから設計され、長さが約２２−３０の ヌクレオチドになり、５０％以上のＧＣ含有物を有し、約６８−７２℃の温度で 標的配列にアニーリングするようにした。ヘアピン構造及びプライマープライマ ２量体化をもたらすことになるヌクレオチドの伸展は避けられた。 選択されたヒトｃＤＮＡライブラリ（Gibco/BRL）を用いて配列を伸展した。 ２つ以上の伸展が必要或いは望まれる場合には、既知領域をさらに伸展させるた めに、追加のプライマの組が設計される。 XL-PCR kit(Perkin Elmer)の取扱説明書に従って、酵素及び反応混合物を完全 に混合することにより、高い忠実度の増幅が得られた。各プライマを４０ｐｍｏ ｌかつキット全ての他の成分を推奨された濃度で開始する場合、ＰＣＲがPeltie r Thermal Cycler(PTC200;MJ Research,Watertown MA)及び以下のパラメータを 用いて実行された。 ステップ１ １分間９４℃（初期変性） ステップ２ １分間６５℃ ステップ３ ６分間６８℃ ステップ４ １５秒間９４℃ ステップ５ １分間６５℃ ステップ６ ７分間６８℃ ステップ７ さらに１５サイクル間ステップ４−６の繰返し ステップ８ １５秒間９４℃ ステップ９ １分間６５℃ ステップ１０ ７分１５秒間６８℃ ステップ１１ １２サイクル間ステップ８−１０の繰返し ステップ１２ ８分間７２℃ ステップ１３ ４℃（保持） 反応混合物の５−１０μｌ部分標本が低濃度（約０．６−０．８％）アガロー スミニゲル上で電気泳動法により分析され、どの反応物が配列の伸展に成功した かを判定した。最も大きな生成物を含むと考えられる帯がゲルから切除され、QI A Quick^TM(QIAGEN Inc.Chatsworth,CA)を用いて精製され、再結合及びクローニ ングを容易にするためにクレノウ酵素を用いて、オーバーハングから切除された 。 エタノール沈殿後、その生成物は１３μｌの連結緩衝液中に再溶解され、１μ ｌＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５ユニット）及び１μｌＴ４ポリヌクレオチドキナ ーゼが加えられ、その混合物は２〜３時間室温で、或いは１６℃で一晩の間イン キュベートされた。コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（４０μｌの適当な媒質内に ある）が３μｌの連結混合物と形質転換され、８０μｌのＳＯＣ媒質内で培養さ れた（Sambrook J等、上記）。３７℃で１時間インキュベートした後、Ｅ．ｃｏ ｌｉ 混合物が、２ｘＣａｒｂを含むLuria Bertani(LB)-agar(Sambrook J等、上 記)上に蒔かれた。翌日、いくつかのコロニーが各プレートから無作為に選び取 られ、適当な市販の無菌９６ウエル微量定量プレートの個々のウエル内に置かれ た１５０μｌの液体ＬＢ／２ｘＣａｒｂ媒質内で培養された。その翌日、各５μ ｌの一晩おいた培養株が有菌の９６ウエルプレー トに移され、水で１：１０に希釈された後、５μｌの各サンプルがＰＣＲアレイ 内に移された。 ＰＣＲ増幅の場合、４ユニットのｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ベクタプライ マ及び伸展反応のために用いられる１つ或いは両方の遺伝子特異性プライマを含 む１８μｌの濃縮ＰＣＲ反応混合物（３．３ｘ）が各ウエルに加えられた。増幅 は以下の条件で実行された。 ステップ１ ６０秒間９４℃ ステップ２ ２０秒間９４℃ ステップ３ ３０秒間５５℃ ステップ４ ９０秒間７２℃ ステップ５ さらに２９サイクルの間ステップ２−４の繰返し ステップ６ １８０秒間７２℃ ステップ７ ４℃（保持） ＰＣＲ反応物の部分標本が、分子重量マーカと共にアガロースゲル上で処理さ れた。ＰＣＲ生成物の大きさが、元の部分ｃＤＮＡと比較され、適当なクローン が選択され、プラスミドに結合され、そして配列決定された。 同様にして、配列番号：２のヌクレオチド配列を用いて、上記手順、５’伸展 用に設計されたオリゴヌクレオチド及び適当なゲノムライブラリを用いて５’調 節配列を得る。 ＶＩ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識化及び使用 配列番号：２に由来するハイブリダイゼーションプローブが、ｃＤＮＡ、ゲノ ムＤＮＡ或いはｍＲＮＡをスクリーニングするために用いられる。約２０塩基対 からなるオリゴヌクレオチドの標識化が特に記載されるが、より大きなヌクレオ チドフラグメントにも概ね同じ手順が用いら れる。オリゴヌクレオチドは、OLIGO 4.06(National Biosciences)のような最新 のソフトウエアを用いて設計され、５０ｐｍｏｌの各オリゴマと２５０μＣｉの [γ-³²Ｐ]アデノシン三リン酸(Amersham)及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ(Du Pont NEN,Boston MA)とを組み合わせることにより標識される。標識されたオリ ゴヌクレオチドは、Sephadex G-25 super fine resin column(Pharmacia & Upjo hn)を用いて実質的に精製される。センス及びアンチセンスオリゴヌクレオチド それぞれの毎分１０⁷カウント含む部分標本は、エンドヌクレアーゼ(Ase I,Bgl II,Eco RI,Pst I,Xba 1.或いはPvu II，DuPont NEN（登録商標))の１つで消化さ れるヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜系ハイブリダイゼーション分析において用い られる。 各消化物からのＤＮＡは、０．７％アガロースゲルに上で分画され、ナイロン 膜(Nytran Plus,Schleicher & Schuell,Durham NH)に転写される。ハイブリダイ ゼーションは４０℃で１６時間実行される。非特異性シグナルを除去するために 、ブロットは、０．１×クエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナ トリウムまでの徐々に厳密性を増す条件下で室温にて連続して洗浄される。XOMA T AR^TMfilm(Kodak,Rochester NY)が数時間Phosphoimager cassette(Molecular D ynamics,Synnyvale CA)内でブロットに露光された後、ハイブリダイゼーション パターンが視覚的に比較される。 ＶＩＩ マイクロアレイ マイクロアレイ用のオリゴヌクレオチドを生成するために、上記ヌクレオチド 配列が、そのヌクレオチド配列の３’末端で開始するコンピュータアルゴリズム を用いて検査される。そのアルゴリズムは、その遺伝子に固有で、ハイブリダイ ゼーションに適した範囲内のＧＣ含有物を有 し、ハイブリダイゼーションに干渉すると考えられる予測された副構造体がない 所定の長さのオリゴマを同定する。そのアルゴリズムは、長さが２０ヌクレオチ ド（２０量体）からなる２０の特異な配列のオリゴヌクレオチドを同定する。各 配列の中央の１つのヌクレオチドが変化している、一致したオリゴヌクレオチド の組みが形成される。このプロセスはマイクロアレイ内の各遺伝子に対して繰り 返され、２０個の２０ｍｅｒからなる二重の組みが、光配向化学処理（Chee,M. 等、PCT/WO95/11995、参照して本明細書の一部としている）を用いてシリコンチ ップの表面上で合成及び配列される。 別法では、化学的結合手順及びインクジェット吐着装置を用いることにより支 持体の表面上でオリゴマを合成する（Baldeschweiler等、PCT出願WO95/251116、 参照してその全体を本明細書の一部としている）。別の方法では、ドット（或い はスロット）ブロットに類似の「グリッド（gridded）」アレイを用いて、真空 系、熱、紫外線（ＵＶ）、機械的或いは化学的結合手順を利用して、支持体の表 面にｃＤＮＡフラグメント或いはオリゴヌクレオチドを配列及び結合することが できる。アレイは手動で或いは市販の機器及び装置を用いて生成され、８ドット 、２４ドット、９６ドット、３８４ドット、１５３６ドット或いは６１４４ドッ トのグリッドを含む。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズされなかった プローブを除去するためにマイクロアレイは洗浄され、スキャナを用いて蛍光の レベル及びパターンを確定する。スキャナで読取られた画像は検査され、マイク ロアレイ上の各オリゴヌクレオチド配列の相補性の度合及び相対的な存在量を確 定する。 ＶＩＩＩ 相補ポリヌクレオチド ＣＡＲＩＮをコードする配列に相補的な配列或いはその任意の一部用 いて、自然発生ＣＡＲＩＮの発現を減少或いは抑制する。約１５−約３０塩基対 を含むオリゴヌクレオチドの使用が特に記載されるが、より小さな或いはより大 きなｃＤＮＡフラグメントにも概ね同じ方法が用いられる。適当なオリゴヌクレ オチドはOligo4.06ソフトウエア及びＣＡＲＩＮ、配列番号：１のコード配列を 用いて設計される。転写を抑制するために、相補オリゴヌクレオチドは最も固有 の５’配列から設計され、コード配列へのプロモータ結合を防ぐために用いられ る。翻訳を抑制するために、相補オリゴヌクレオチドは、ＣＡＲＩＮをコードす る転写物へのリボソーム結合を防ぐように設計される。 ＩＸ ＣＡＲＩＮの発現 ＣＡＲＩＮの発現は、ｃＤＮＡを適当なベクタにサブクローニングし、ベクタ を宿主細胞に形質転換することにより達成される。この場合には、クローニング ベクタを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ内でＣＡＲＩＮを発現する。クローニング部位の 上流では、このベクタはβ−ガラクトシダーゼのためのプロモータを含み、それ にアミノ末端Ｍｅｔ及びそれに後続するβ−ガラクトシダーゼの７残基を含む配 列が続く。これらの８残基の直後は、転写のために有用なバクテリオファージプ ロモータ及びいくつかの特有の制限部位を含むリンカーである。 単離され、標準的な方法を用いてＩＰＴＧと形質転換された細菌株の誘発は、 β−ガラクトシダーゼの最初の８残基、リンカーの約５〜１５残基及び完全長タ ンパク質からなる融合タンパク質を生成する。シグナル残基は、活性に対する後 続の検定法において直接用いることができるバクテリア成長媒質内へのＣＡＲＩ Ｎの分泌を促す。 Ｘ ＣＡＲＩＮ活性の例示 ＣＡＲＩＮ活性に対する検定法がNormant(1995、上記)に記載された。 詳細には５０μｌのＣＰＡを含むサンプルが、ＣＡＲＩＮの存否何れかの状態で 放射ヨウ素標識されたBolton-Hunter試薬結合Ａｒｇ−Ｐｈｅ（１０⁵ｄｐｍ、５ ０μｌ）でインキュベートされる。その反応は５０μ１０．２Ｍ ＨＣＬを加え ることにより停止される。遊離した¹²⁵Ｉ標識化Bolton-Hunter試薬は、逆相クロ マトグラフィにより回収され、ＣＡＲＩＮ活性が評価される。 ＸＩ ＣＡＲＩＮ特異性抗体の生成 ＰＡＧＥ電気泳動法(Sambrook、上記)、或いは他の精製技術を用いて実質的に 精製されるＣＡＲＩＮを用いて、ウサギを免疫し、標準的なプロトコルを用いて 抗体を生成する。配列番号：２から推定されるアミノ酸配列は、DNAStar softwa re(DNASTAR Inc)を用いて分析され、免疫原性の高い領域を確定し、対応するオ リゴポリペプチドを合成かつ使用して、当業者に知られた手段により抗体を産生 させる。Ｃ−末端付近、或いは親水性領域内のエピトープのような適当なエピト ープの選択は、Ausubel等（上記）などに記載される。 典型的にはオリゴペプチドは長さ１５残基で、ｆｍｏｃ（フルオレニルメトキ シカルボニル）化学法を用いるApplied Biosystems Peptide Synthesizer Model 431Aを用いて合成され、M-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester（MB S:Ausubel等、上記）と反応することによりキーホールリンペットヘモシアニン( KLH,Sigma,St.Louis,MO)に結合される。ウサギは、完全なフロイントアジュバン ト内でオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体で免疫される。その結果生じる抗血清は、 例えば、プラスチックにペプチドを結合し、１％ＢＳＡで遮断し、ウサギ抗血清 と反応させ、洗浄し、さらに放射ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギ ＩｇＧと反応させることにより、抗ペプチド活性に対して検査される。 ＸＩＩ 特異性抗体を用いる自然発生ＣＡＲＩＮの精製 自然発生或いは組換えＣＡＲＩＮは、ＣＡＲＩＮに対して特異な抗体を用いる 免疫親和性クロマトグラフィにより実質的に精製される。免疫親和性カラムが、 ＣＡＲＩＮ抗体を、CnBr-activated Sepharose(Pharmacia & Upjohn)のような活 性化されたクロマトグラフ樹脂に共有結合させることにより構成される。結合後 、製造者の取扱説明書に従って樹脂は遮断及び洗浄される。 ＣＡＲＩＮを含む培地を免疫親和性カラム上を通過させ、カラムは、ＣＡＲＩ Ｎを選択吸収させる条件下（例えば洗浄剤中に高イオン強度緩衝剤を入れたもの ）で洗浄される。カラムは、抗体／ＣＡＲＩＮ結合を分裂させる条件下（ｐＨ２ −３の緩衝剤或いは尿素或いはチオシアネートイオンのような高濃度のカオトロ ープ）で溶出され、ＣＡＲＩＮが回収される。 ＸＩＩＩ ＣＡＲＩＮと相互作用する分子の同定 ＣＡＲＩＮ或いはその生物学的活性フラグメントが、¹²⁵I Bolton-Hunter試薬 (Bolton AE等(1973)Biochem J 133:529)を用いて標識される。多数のウエルプレ ートのウエル内に以前に配列された候補分子が、標識されたＣＡＲＩＮでインキ ュベートされ、洗浄され、標識されたＣＡＲＩＮ複合体を有する任意のウエルが 検定される。種々のＣＡＲＩＮ濃度から得られたデータを用いて、数、親和性及 びＣＡＲＩＮと候補分子との関係を示す値を計算する。 上記明細書中に記載された全ての特許出願及び特許は参照して本明細書の一部 としている。記載された本発明の方法及びシステムの種々の変 更例及び変形例は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく当業者には明ら かとなろう。本発明は特定の好適な実施例に関連して記載されてきたが、請求さ れる本発明はそのような特定の実施例に不当に制限されるべきでないことを理解 されたい。実際に、本発明を実施するために記載された形態の種々の変更例は、 分子生物学或いは関連する分野の当業者には明らかであり、以下の請求の範囲内 に入るものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/38 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/64 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＴ ，ＡＵ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ， ＦＩ，ＧＢ，ＩＬ，ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｒ Ｕ，ＳＥ，ＳＧ，ＵＳ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．配列番号：１のアミノ酸配列を含む実質的に精製されたヒトカルボキシペプ チダーゼインヒビター又はその断片。 ２．請求項１のヒトカルボキシペプチダーゼインヒビターをコードする単離され 精製されたポリヌクレオチド配列。 ３．請求項２のポリヌクレオチド配列と厳密な条件の下でハイブリダイズするポ リヌクレオチド配列。 ４．請求項２のポリヌクレオチド配列を含む組成物。 ５．配列番号：２の配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチド配列又はそ の変異配列。 ６．請求項５のポリヌクレオチド配列を含む組成物。 ７．請求項２のポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列又はその 変異配列。 ８．請求項７のポリヌクレオチド配列を含む組成物。 ９．請求項２のポリヌクレオチド配列の少なくとも断片を含む発現ベクター。 １０．請求項９のベクターを含む宿主細胞。 １１．配列番号：１のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はその断片の製造方法 であって、 （ａ）前記ポリペプチドの発現に適した条件の下で請求項１０の宿主細胞を培 養する過程と、 （ｂ）前記宿主細胞の培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むこと を特徴とする配列番号：１のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はその断片の製 造方法。 １２．配列番号：１のアミノ酸配列を有する実質的に精製されたヒトカルボキシ ペプチダーゼインヒビターを、適切な医薬用担体と共に含む医 薬品組成物。 １３．請求項１のポリペプチドに特異的に結合する精製された抗体。 １４．請求項１のポリペプチドの活性を変調する精製されたアゴニスト。 １５．請求項１のポリペプチドの効果を低下させる精製されたアンタゴニスト。 １６．細胞増殖を刺激する方法であって、 請求項１２の医薬品組成物を有効な量細胞に与える過程を含む細胞増殖を刺激 する方法。 １７．過剰なアポトーシスに関連する疾患の治療方法であって、 そのような治療が必要な患者に、請求項１２の医薬品組成物を有効な量投与す る過程を含む過剰なアポトーシスに関連する疾患の治療方法。 １８．癌に関連する疾患の治療方法であって、 そのような治療が必要な患者に、請求項１５のアンタゴニストを有効な量投与 する過程を含む癌に関連する疾患の治療方法。 １９．炎症の治療方法であって、 そのような治療が必要な患者に、請求項１５のアンタゴニストを有効な量投与 する過程を含む炎症の治療方法。 ２０．生物学的サンプルにおけるヒトカルボキシペプチダーゼインヒビターをコ ードするポリヌクレオチドの検出方法であって、 （ａ）請求項７のポリヌクレオチドと、生物学的サンプルの核酸材料とをハイ ブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、 （ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、前記複合 体の存在が、前記生物学的サンプルにおけるヒトカルボキシペプチダーゼインヒ ビターをコードするポリヌクレオチドの存在と相関性を有する、該過程とを含む ことを特徴とする生物学的サンプルにおける ヒトカルボキシペプチダーゼインヒビターをコードするポリヌクレオチドの検出 方法。