JP2002501378A

JP2002501378A - ヒト腫瘍関連Ｋａｚａｌインヒビタ

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Publication number: JP2002501378A
Application number: JP54426598A
Authority: JP
Inventors: バンドマン、オルガ; ゲグラー、カール・ジェイ; シャー、パルビ
Original assignee: Incyte Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Incyte Corp
Priority date: 1997-04-14
Filing date: 1998-04-14
Publication date: 2002-01-15
Also published as: WO1998046758A1; US5986064A; EP0975759A1; CA2287779A1; AU7121898A; US5851987A

Abstract

(57)【要約】本発明はヒト腫瘍関連Ｋａｚａｌインヒビタ（ＨｕＫＩ）及びＨｕＫＩを同定及びコードするポリヌクレオチドを提供する。また本発明は発現ベクタ、宿主細胞、抗体及びアンタゴニストも提供する。また本発明はＨｕＫＩの発現に関連する疾患の予防及び治療のための方法並びに診断検定法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト腫瘍関連Ｋａｚａｌインヒビタ技術分野本発明は新規のヒド腫瘍関連Ｋａｚａｌインヒビタの核酸配列及びアミノ酸配列に、また炎症及び癌を含む消化器系の障害の診断、予防及び治療におけるこれらの配列の使用法に関連する。背景技術Ｋａｚａｌインヒビタは、全ての脊椎動物に存在すると考えられる膵臓分泌トリプシンインヒビタ（ＰＳＴＩ）に類似の配列を有するセリンプロテアーゼインヒビタ（serpins）である。Ｋａｚａｌ型インヒビタのいくつかの例としては、ブタの腸から単離されたアクロシンートリプシンインヒビタ（ＡＴＩ）及びＰＥＣ−６０（Ｎ−末端Glu及びＣ−末端Cysを有するペプチド）などがある。ＰＳＴＩは膵臓腺房細胞から膵液に分泌される。その生理学的役割は、膵臓及び膵管内の酵素のトリプシンにより触媒された早発活性の予防と考えられる。またＰＳＴＩは血清及び種々の通常並びに悪性組織内に見いだされるため、ＰＳＴＩはさらに別の役割を有する場合がある。Horii，A等は、ヒト（1987;Biochem.B iophys．Res．Commun．149:635-641）及びラット（1989;Biochem.Biophys.Res.C ommun.162:151-159）に由来するＰＳＴＩ遺伝子をクローニングし、特徴付けた。ラット及びヒトＰＳＴＩのいずれも２３アミノ酸シグナル配列を有する７９アミノ酸からなる前駆タンパク質と翻訳された。ＰＳＴＩは６システイン残基を含み、そのうち４つはＫａｚａｌインヒビタコンセンサス配列モチーフCys₃₉−(X7 )−Cys₄₆−(X6)−Tyr₅₃−(X3)−Cys₅₈−(X2)−Cys₆₇に含まれている。腫瘍関連トリプシンインヒビタ（ＴＡＴＩ）は、ＰＳＴＩと同じであり、いくつかの腫瘍及び細胞株により合成される。ＴＡＴＩは最初に卵巣癌の患者の尿において検出された（Stenman，U.H.等(1982)Int．J．Cancer 30:53-57;Huhtala， M.L.等(1982)J．Biol．Chem．257:13713-13716）。またＴＡＴＩは消化管の粘膜においても生成され、それは粘膜細胞にタンパク分解性の崩壊が生じるのを防ぐことができる。血清及び尿内のＴＡＴＩレベルの上昇は特に、粘膜性卵巣癌と共に生じ、非悪性疾患、例えば膵炎、重症感染症及び組織破壊において生じる場合もある（Stenman，U.H.等(1991)Scand．J．Clin．Lab．Invest．51(suppl．(207 ):5-9）。Ｋａｚａｌ型インヒビタのアミノ酸配列の分析により他のserpinsと類似のいくつかの領域が示されるが、位置３２、３９、４６、５８、６１及び７５（ヒトＰＳＴＩ前駆配列番号）において著しく保存的なシステイン残基がそれらのグループの結合を固定し、いくつかのアライメントに糖タンパクホルモン、絨毛性ゴナドトロビン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン及び甲状腺刺激ホルモンの βサブユニットを与える。Ｋａｚａｌ型インヒビタついて報告済みの活性部位Ｐ１−Ｐ’はヒトＰＳＴＩ前駆体の位置４１及び４２における残基内に存在し、それがインヒビタの特異性の原因となる（Liepinsh，E.等(1994)J．Mol．Biol．23 9:137-53;Fink,E等(1990)FEBS Lett.270:222-4）。ＰＳＴＩ相同体ＰＥＣ−６０の前駆体は長さ８６アミノ酸であり、２６アミノ酸シグナル配列を有する。ＰＥＣ−６０はＰＳＴＩに約４１％類似性を有する分泌されたタンパク質であるが、トリプシンを抑制しないばかりでなく、基底血漿インスリンレベルに影響を与えない。ＰＥＣ−６０の既知の役割はインスリンのグリコースにより誘導された分泌のｉｎｖｉｖｏ抑制及びサイクリックアデノシン１リン酸（ｃＡＭＰ）形成の用量依存性還元によるｃＡＭＰの調節である。高レベルのＰＥＣ−６０は骨髄及び末梢血において記録されており、その中間レベルは脾臓において記録されている。ラジオイムノアッセイの結果は、ブタＰＥＣ−６０が単球から形成され、貯蔵され、分泌されることを示す。高レベルのＰＥＣ−６０はカテコールアミン神経細胞において免疫活性であることが知られている（Laazik，J.及びR．Sillard（ 1993）Biochem．Biophys.Res.Commun.197:849-52:Metsis,M.等(1992)J.Biol.Che m．267:19829-32;Ahren,B.等(1992)Pancreas7:443-6）。ＰＥＣ−６０は尾状核におけるドーパミン利用を減少させることが知られており、それはＰＥＣ−６０が中枢神経系の活性及び疾患においてある役割を有することを示唆する（Laasik、上記）。ＰＥＣ−６０にアミノ酸配列類似性を有するＫａｚａｌ型インヒビタは最近、ラット胆汁／膵液において同定され、コレシストキニンの遊離を刺激することが知られている（Agerberth,B.等(1989)Proc.Nat .Acad.Sci.86:8590-4）。ＡＴＩは精巣において合成され、いくつかの種の精液から分離されており、糖タンパク質ホルモンの影響を調節する際にある役割を有している。Ｋａｚａｌ型インヒビタとβサブユニットとの間に配列類似性の領域を与える場合、抑制は生殖組織における糖タンパク質ホルモン受容体を遮断することに依存する（Perry，A.C.等(1993)Biochim．Biophys．Acta1172:159-60;Fin k等、上記）。ＰＳＴＩは、炎症性サイトカインに応じて肝臓及び膵臓のような内臓において発現される。発現は肝臓、心臓、胃或いは結腸癌を患う患者に由来する組織内において報告されたが、それはクローン病、慢性肝炎及び肝硬変にも関連している（Ohmachi，Y.等(1994)J.Hepatol.21:1012-6,Int.J.Pancreatol.15 :65-73;Halme,L.等(1993)Scand.J.Clin.Lab.Invest.53:359-66）。同様に、卵巣癌において検出された腫瘍関連トリプシンインヒビタのレベルは癌の程度或いは段階に対するマーカとして機能する(Medl,M.(1995)Br.J.Cancer 71:1051-4;Pectasid es,D.(1994)Am.J.Clin.Oncol.17:307-12）。新規のヒトＫａｚａｌ型インヒビタ及びそのインヒビタをコードするポリヌクレオチドの発見は、炎症及び癌を含む消化器系の疾患を診断及び治療する際に有用な新規の組成物を提供することができ、当分野の必要性を満たすものである。発明の開示本発明は、以降ＨｕＫＩと呼ばれ、ラット及びヒトからのＰＳＴＩ前駆体に類似性を有するものと特徴付けられる新規のヒト腫瘍関連Ｋａｚａｌインヒビタを特徴とする。それゆえ本発明は、配列番号：１に示されるアミノ酸配列を有する実質的に精製されたＨｕＫＩを特徴とする。本発明の一態様は、ＨｕＫＩをコードする単離され、実質的に精製されたポリヌクレオチドを特徴とする。ある特定の態様では、そのポリヌクレオチドは配列番号：２のヌクレオチド配列である。また本発明は配列番号：２の補体或いはその変異体を含むポリヌクレオチド配列に関連する。さらに本発明は厳密性条件下で配列番号：２にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を特徴とする。さらに本発明はＨｕＫＩをコードするポリヌクレオチドのフラグメント、相補性或いはアンチセンス配列をコードする核酸配列並びにＨｕＫＩをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクタ及び宿主細胞を特徴とする。また本発明はＨｕＫＩに特異に結合する抗体及び実質的に精製されたＨｕＫＩを含む医薬品組成物を特徴とする。また本発明はＨｕＫＩのアンタゴニストも特徴とする。また本発明はＨｕＫＩを精製するための方法及びＨｕＫＩをコードするポリヌクレオチドを検出するための方法を特徴とする。また本発明はＨｕＫＩを投与することによりプロテアーゼが媒介する組織破壊を治療するための方法及びＨｕＫＩのアンタゴニストを投与することにより細胞増殖に関連する疾患を治療するための方法を特徴とする。図面の簡単な説明第１図はＨｕＫＩのアミノ酸配列（配列番号：１）及び核酸配列（配列番号：２）を示す。そのアライメントはMacDNASIS PRO^TMsoftware(Hitachi Software E ngineering Co.,Ltd.,San Bruno,CA)を用いて生成された。第２図は、ＨｕＫＩ(配列番号：１)、ラットＰＳＴＩ前駆体(GI 206469、配列番号：３)及びヒトＰＳＴＩ前駆体（GI 190688、配列番号：４）の間のアミノ酸配列アライメントを示す。そのアライメントはDNASTAR^TMsoftware(DNASTAR Inc, Madison WI)のマルチシーケンスアライメントプログラムを用いて生成された。第３Ａ図及び第３Ｂ図はそれぞれＨｕＫＩ、すなわち配列番号：１及びラットＰＳＴＩ前駆体、すなわち配列番号：３に対する疎水性プロット（MacDNASIS PR O software）を示す。正方向Ｘ軸はアミノ酸位置を表し、負方向Ｙ軸は疎水性を表す。発明を実施するための形態本タンパク質、ヌクレオチド配列並びに方法を記載する前に、本発明は記載される特定の方法、プロトコル、細胞株、ベクタ並びに薬剤に限定されず、変更される場合もあることを理解されたい。また本明細書で用いられる専門用語は、特定の実施例を記載することのみを目的としており、本発明の範囲を制限することを意図するわけではなく、本発明は添付の請求の範囲によってのみ限定されることを理解されたい。本明細書で用いられるように、添付の請求の範囲では、単数形の冠詞並びに「その（前記）」は、文脈において異なるように明確に規定されない限り、複数の指示物を含むことに注意されたい。従って例えば、「ある宿主細胞」が示すものは、複数のそのような宿主細胞を含んでおり、「その抗体」は当業者には既知の１つ或いはそれ以上の抗体及びその等価物を示しており、他も同様である。異なるように規定されなければ、本明細書で用いられる科学技術用語は、本発明が属する分野の当業者に通常理解されているのと同じ意味である。本明細書で記載される内容と類似或いは等価な任意の方法、装置並びに材料が本発明の検証に際して用いられてもよいが、好適な方法、装置並びに材料は本明細書中に記載される。本明細書に記載される全ての発行物は、本発明に関連して用いられる場合がある発行物において報告される細胞株、ベクタ、方法論を記載及び開示するために、参照して本明細書の一部としている。本明細書に記載される内容は、本発明が、先行発明によるそのような開示に先行して権利を有さないことを容認するものと解釈されるべきではない。定義ここで用いる「核酸配列」はオリゴヌクレオチド、ヌクレオチド或いはポリヌクレオチド並びにそのフラグメント或いは部分、さらには一本鎖或いは二本鎖の場合があるゲノム或いは合成起源のＤＮＡ或いはＲＮＡのことであり、センス鎖或いはアンチセンス鎖を表す。同様にここで用いるアミノ酸は、自然発生或いは合成分子からなるオリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、或いはタンパク質配列及びそのフラグメント或いは部分のことである。「アミノ酸配列」は自然発生タンパク質分子のアミノ酸配列を示すものとして表されるが、「ポリペプチド」或いは「タンパク質」のような「アミノ酸配列」等の用語は、示されるタンパク質分子に関連する完全な自然アミノ酸配列にそのアミノ酸配列を限定することを意味しない。ここで用いる「ペプチド核酸」は、リジンのようなアミノ酸残基及びアミノ基が加えられているオリゴマを含む分子のことである。これらの小さな分子は、抗遺伝因子（anti-gene agent）とも呼ばれ、核酸の相補鎖に結合することにより転写伸長を停止する（Nielsen PE等(1993)Anticancer Drug Des 8:53-63）。ここで用いるＨｕＫＩは自然、合成、半合成或いは組換え体の何れかの任意のソースからの任意の種、特にウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウマ及び好適にはヒトを含む哺乳類から得られる実質的に精製されたＨｕＫＩのアミノ酸配列である。ここで用いる「コンセンサス」は、核酸配列のうち、不要な塩基を分解するために再配列されているもの、或いは５’或いは３’方向にXL-PCR(Perkin Elmer, Norwalk,CT)を用いて伸展され、再配列されているもの、或いはGELVIEW Fragmen t Assembly System．(GCG，Madison WI)を用いて２つ以上のインサイト社クローンの重複配列から構築されているもの、或いは伸展及び構築のいずれもが施されているもののことである。ここで用いるＨｕＫＩの「変異体」は、１つ或いはそれ以上のアミノ酸により変更されるアミノ酸配列のことである。変異体は「保存的に」変化する場合があり、その場合置換されたアミノ酸は、例えばロイシンをイソロイシンに置き換える場合のように、類似の構造的及び化学的特性を有する。さらにまれにではあるが、変異体は、グリシンをトリプトファンに置き換える場合のように「非保存的に」変化する場合がある。また類似の少数変異体は、アミノ酸欠失或いは挿入、またはその両方を含む場合もある。生物学的及び免疫学的活性を無くすことなくアミノ酸残基が置換、挿入或いは欠失されるかを確定する際の指標は、当業者に周知のコンピュータプログラム、例えばDNAStar softwareを用いて見出すことができる。ここで用いる「欠失」は、１つ或いはそれ以上のアミノ酸或いはヌクレオチド残基がそれぞれ欠如するアミノ酸配列或いはヌクレオチド配列いずれかにおける変化のことである。ここで用いる「挿入」或いは「付加」は、自然発生分子に比べて、１つ或いはそれ以上のヌクレオチド残基或いはアミノ酸残基がそれぞれ加わるヌクレオチド配列或いはアミノ酸配列における変化のことである。ここで用いる「置換」は、１つ或いはそれ以上のヌクレオチド或いはアミノ酸が、それぞれ異なるヌクレオチド或いはアミノ酸に置き換えられることである。ここで用いる用語「生物学的活性」は、自然発生分子の構造的、調節的或いは生化学的機能を有するタンパク質のことである。同様に「免疫学的活性」は自然、組換え体或いは合成ＨｕＫＩ、又はその任意のオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞において特異な免疫反応を誘発し、かつ特異な抗体と結合する能力のことである。ここで用いる用語「アゴニスト」は、ＨｕＫＩに結合される際に、ＨｕＫＩの量を増加するか、或いは活性の期間を延長する分子のことである。アゴニストはタンパク質、核酸、炭水化物或いはＨｕＫＩに結合する任意の他の分子を含む場合がある。ここで用いる「アンタゴニスト」は、ＨｕＫＩに結合される際に、ＨｕＫＩの生物学的或いは免疫学的活性を減少させる分子のことである。アンタゴニストはタンパク質、核酸、炭水化物或いはＨｕＫＩに結合する任意の他の分子を含む場合がある。ここで用いる用語「調節」は、ＨｕＫＩの生物学的活性の変化或いは変更のことである。調節はタンパク質活性の増減、結合特性の変化、或いはＨｕＫＩの生物学的、機能的或いは免疫学的特性の任意の他の変化である。ここで用いる「擬態」は、その構造がＨｕＫＩ或いはその一部の構造の知識から発生し、Ｋａｚａｌインヒビタ様分子の作用のいくつか或いは全てに影響を与えることができる分子のことである。ここで用いる用語「誘導体」は、ＨｕＫＩをコードする核酸配列或いはそのコードされたＨｕＫＩの化学修飾体のことである。そのような修飾の例示は、水素をアルキル基、アシル基或いはアミノ基に置換することである。核酸誘導体は、自然分子の本質的な生物学的特性を保持するポリペプチドをコードするであろう。ここで用いる用語「実質的に精製された」は、自然環境から除去されるか、単離されるか或いは分離された核酸配列或いはアミノ酸配列のことであり、それらは自然に関連する他の組成物から少なくとも６０％、好適には７５％、最も好適には９０％取り除かれている。ここで用いる「増幅」は、核酸配列の付加的な複製の生成のことであり、一般に、当分野において周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて実行される（Dieffenbach,C.W.and G.S.Dveksler(1995)PCR Primer ，a Lavoratgry Man ual ，Cold Spring Harbor Press，Plainview,NY）。ここで用いる用語「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖が塩基対を介して相補鎖と結合する任意のプロセスのことである。ここで用いる用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補性のＧとＣ塩基との間に、並びに相補性のＡとＴ塩基との間に水素結合を形成することにより２つの核酸配列間に形成される複合体のことである。これらの水素結合は、塩基スタッキング相互作用によりさらに安定化する場合もある。２つの相補性核酸配列は、逆平行形状において水素結合する。ハイブリダイゼーション複合体は、溶液(例えばＣ₀ｔ或いはＲ₀ｔ分析)内に、又は溶液中に存在する核酸配列と固形支持体(例えば、in situハイブリダイゼーションの場合に細胞が固定されている膜、フィルタ、チップ、ピン、或いはスライドガラス)上に固定化される別の核酸配列との間に形成されることができる。ここで用いる「相補」或いは「相補性」は、塩基対による許容塩類及び温度条件下でのポリヌクレオチドの自然結合のことである。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」の場合、相補性配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に結合する。２つの一本鎖分子間の相補性は、核酸のあるものだけが結合する「部分的」であるか、或いは全相補性が一本鎖分子間に存在する場合には完全である場合もある。核酸鎖間の相補性の度合いは、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に著しく影響する。これは核酸鎖間の結合に依存する増幅反応において重要である。ここで用いられる用語「相同性」は相補性の度合いのことである。部分的相同性或いは完全相同性（すなわち同一）がある。部分的相同性配列は、同一配列が標的核酸にハイブリダイズするのを少なくとも部分的に抑制する配列である。この場合に実用的な用語「実質的に相同性の」を用いることが好ましい。完全に相補性の配列の標的配列へのハイブリダイゼーションの抑制は、低い厳密性の条件下でハイブリダイゼーション検定法を用いて検査されることができる（サザンブロット或いはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーション等）。実質的に相同性の配列或いはプローブは、低い厳密性の条件下で完全に相同性の配列及びプローブの標的配列への結合と競合し、それを抑制するであろう。低い厳密性の条件は非特異な結合が許容されるような条件であるということは言うまでもない。低い厳密性条件は、２つの配列の互いへの結合が特異な（すなわち選択的な）相互作用であることを必要とする。非特異な結合の欠如は、部分的な度合いの相補性さえ存在しない(例えば約３０％同一性より小さい)第２の標的配列の使用により検査される場合もある。非特異な結合が存在しない場合、そのプローブは第２の非相補性標的配列にハイブリダイズしないであろう。当分野において知られるように、多くの等価な条件を用いて、低或いは高厳密性条件のいずれかを構成することができる。その配列の長さ及び性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物）、標的の性質（溶液中或いは固定化状態等で存在するＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物）及び塩類及び他の組成物の濃度（例えばホルムアミド、硫酸デキストラン並びにまたポリエチレングリコールの存在或いは不在）のような要因が考慮され、ハイブリダイゼーション溶液は、上記条件とは異なるが、等価な低或いは高厳密性の何れかの条件を生成するために変更されることができる。ここで用いる「厳密性条件」は、約Ｔｍ−５℃（プローブの融解温度Ｔｍより５℃低い温度）からＴｍより約２０〜２５℃低い温度までの範囲において生じる「厳密性」である。ハイブリダイゼーションの厳密性を変更して、同一或いは関連するポリヌクレオチド配列を同定或いは検出することができることは当業者には理解されよう。ここで用いる用語「アンチセンス」は、特異なＤＮＡ或いはＲＮＡ配列に相補性をなすヌクレオチド配列のことである。用語「アンチセンス鎖」は、「センス」鎖に相補性をなす核酸鎖を示すために用いられる。アンチセンス分子は、相補鎖が合成できるようにするウイルス性プロモータに対して反対の配向をなす対象の遺伝子を結合することによる合成を含む任意の方法により生成されることができる。一度細胞内に導入されれば、この転写された鎖は、二重鎖を形成するためにその細胞により形成される自然配列と結合する。その際これらの二重鎖はそれ以上の転写或いは翻訳のいずれかを阻害する。このようにして突然変異体表現型が生成される場合がある。記号「負」はアンチセンス鎖を示す際に用いられる場合があり、「正」はセンス鎖を示す場合に用いられることがある。ここで用いる用語「部分」は、タンパク質に関して（「所与のタンパク質の一部」をなすような）そのタンパク質のフラグメントを示す。そのフラグメントは４アミノ酸残基から、全アミノ酸配列から１アミノ酸を引いたものにまで及ぶ場合がある。こうして「配列番号：１のアミノ酸配列の少なくとも一部を含む」タンパク質は、完全長ヒトＨｕＫＩ及びそのフラグメントを含む。ここで用いる「形質転換」は、外来ＤＮＡが侵入し、受容体細胞を変化させるプロセスを意味する。それは当分野において周知の種々の方法を用いて自然或いは人工の条件下で生じさせることができる。形質転換は、外来核酸配列を原核或いは真核宿主細胞に挿入するための任意の既知の方法に基づく場合がある。その方法は形質転換される宿主細胞に基づいて選択され、限定はしないが、ウイルス感染、電気穿孔法、リポフェクション並びに粒子照射を含む場合がある。そのように「形質転換された」細胞は、安定に形質転換された細胞を含んでおり、挿入されたＤＮＡが自動的に複製するプラスミド或いはその宿主染色体の一部の何れかとして複製されることができる。またその細胞は、限られた期間だけ挿入されたＤＮＡ或いはＲＮＡを一時的に発現する細胞も含む。ここで用いる用語「抗原決定基」は、分子の特定の抗体と接触する部分（すなわちエピトープ）のことである。タンパク質或いはそのフラグメントを用いて宿主動物を免疫する際、タンパク質の多くの領域が、タンパク質上の所与の領域或いは三次元構造体に特異に結合する抗体の生成を誘発する場合がある。これらの領域或いは構造体は抗原決定基と呼ばれる。抗原決定基は、抗体に結合するために、無傷の抗原（すなわち免疫反応を誘発するために用いられるイムノゲン）と競合する場合がある。ここで用いる用語「特異な結合」或いは「特異に結合する」は、抗体及びタンパク質或いはペプチドの相互作用に関して、その相互作用がタンパク質上の特定の構造体（すなわち抗原決定基或いはエピトープ）の存在に依存するということを意味する。言い換えると、その抗体は一般のタンパク質とは異なる特異なタンパク質構造体を識別し、かつ結合する。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異である場合に、標識された「Ａ」及びその抗体を含む反応におけるエピトープＡ（或いは遊離し、標識されないＡ）を含むタンパク質の存在が、その抗体に結合される標識されたＡの量を低減するであろう。ここで用いる用語「サンプル」は幅広い意味に用いられる。ＨｕＫＩ或いはそのフラグメントをコードする核酸を含むと予想される生体サンプルは、細胞、細胞から分離した染色体（例えば中期染色体のスプレッド）、ゲノムＤＮＡ（溶液中にあるか、或いはサザン分析の場合にように固体支持体に結合されている）、ＲＮＡ(溶液中にあるか、或いはノーザン分析の場合のように固体支持体に結合されている)、ｃＤＮＡ(溶液中にあるか、或いは固体支持体に結合されている) 、細胞或いは組織からの抽出物等を含む。ここで用いる用語「ポリヌクレオチドの発現と相関をなす」は、ノーザン分析による配列番号：２に類似のリボ核酸の存在の検出が、サンプル内のＨｕＫＩをコードするｍＲＮＡの存在を示しており、それによりそのタンパク質をコードするポリヌクレオチドからの転写物の発現と相関をなすということを示す。ここで用いる配列番号：２のポリヌクレオチドの「変更」は、欠失、挿入並びにハイブリダイゼーション検定法を用いて検出される場合がある点突然変異を含む、ＨｕＫＩをコードするポリヌクレオチドの配列における任意の変更を含む。本定義には、ＨｕＫＩをコードするゲノムＤＮＡ配列に対する変更の検出（例えば配列番号：２にハイブリダイズできる制限フラグメント長多形性のパターンにおける変更による）、配列番号：２の選択されたフラグメントがゲノムＤＮＡのサンプルにハイブリダイズできないことの検出（例えばアレル特異性オリゴヌクレオチドプローブを用いる）及びＨｕＫＩをコードするポリヌクレオチド配列に対する通常の染色体位置とは異なる位置へのハイブリダイゼーションのような不適当な或いは予想外のハイブリダイゼーションの検出（例えば中期染色体スプレッドに対して蛍光性in situハイブリダイゼーション[ＦＩＳＨ]を用いる）が含まれる。ここで用いる用語「抗体」は、エピトープ決定基を結合することができる、Ｆａ、Ｆ（ａｂ’）₂及びＦｖのような無傷の分子及びそのフラグメントのことである。ＨｕＫＩポリペプチドを結合する抗体は、抗原を免疫するのに応じて、対象の小さなペプチドを含む無傷のポリペプチド或いはフラグメントを用いて生成されることができる。動物を免疫するために用いられるポリペプチド或いはペプチドは、ＲＮＡの遷移から引き出されるか或いは化学的に合成され、所望に応じて担体タンパク質に抱合されることができる。ペプチドに化学的に結合される通常用いられる担体は、ウシ血清アルブミン及びサイログロブリンを含む。その後結合されたペプチドを用いて動物（例えばマウス、ラット或いはウサギ）を免疫する。ここで用いる用語「ヒト化抗体」は、ヒト抗体により似せるためにアミノ酸が非抗原結合領域内において置換されているが、その一方で元の結合能力を保持している抗体分子のことである。発明本発明は、新規のヒト腫瘍関連Ｋａｚａｌインヒビタ（ＨｕＫＩ）、ＨｕＫＩをコードするポリヌクレオチド及び癌及び炎症を含む消化器系の傷害の診断、予防或いは治療に対するこれらの組成物の使用法に基づくものである。本発明のヒトＨｕＫＩをコードする核酸は、アミノ酸配列アライメントに対するコンピュータ生成検索を通して観血性２段階腺癌（ＣＯＬＮＮＯＴ０８）に関連する結腸組織から作成されたｃＤＮＡライブラリからのインサイト社クローン１８４３６９２において最初に同定された。配列番号：２はインサイト社クローン１８４３６９２（ＣＯＬＮＮＯＴ０８）の伸展物に由来した。一実施例では、本発明は第１図に示されるような配列番号：１のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。ＨｕＫＩは長さ８５アミノ酸であり、ラットＰＳＴＩ前駆体（GI 206469、配列番号：３）及びヒトＰＳＴＩ前駆体（GI 190988、配列番号：４）と化学的及び構造的相同性を有する。詳細には、ＨｕＫＩはラット及びヒトからのＰＳＴＩ前駆体とそれぞれ３７％及び３４％アミノ酸同一性を共有する（第２図）。第３Ａ図及び第３Ｂ図に示されるように、ＨｕＫＩ及びラットＰＳＴＩは同様の疎水性プロットを有する。ＨｕＫＩは６システイン及びＫａｚａｌセリンプロテアーゼインヒビタ配列モチーフCys₄₅−(X7)−Cys₅₃−(X6) −Tyr₆₀−(X3)-Cys₆₄−(X2)−Cys₆₇を含む。ノーザン分析は、観血性２段階腺癌と関連する結腸組織におけるＨｕＫＩの発現を示す。また本発明はＨｕＫＩ変異体を含む。好適なＨｕＫＩ変異体はＨｕＫＩアミノ酸配列（配列番号：１）に少なくとも８０％、より好ましくは９０％のアミノ酸配列同一性を有するものである。最も好ましいＨｕＫＩ変異体は配列番号：１に少なくとも９５％アミノ酸同一性を有するものである。また本発明はＨｕＫＩをコードするポリヌクレオチドを含む。従ってＨｕＫＩのアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列を用いて、ＨｕＫＩを発現する組換え体分子を生成することができる。ある特定の実施例では、本発明は第１図に示されるような配列番号：２の核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む。遺伝子コードの縮重の結果として、ＨｕＫＩをコードする多数のヌクレオチド配列が生成され、その中には任意の既知の自然発生遺伝子のヌクレオチド配列に最低限の相同性を示すものもあるということは当業者には明らかであろう。このように本発明は、可能なコドン選択に基いて組み合わせを選択することにより形成されるようになるヌクレオチド配列のあらゆる可能な変異体を考慮する。これらの組み合わせは、自然発生ＨｕＫＩのヌクレオチド配列に適用されるような標準的なトリプレット遺伝子コードに従って形成され、全てのそのような変異体が明確に開示されているものと考慮されたい。ＨｕＫＩ及びその変異体をコードするヌクレオチド配列は、適当に選択された厳密性条件下で、自然発生ＨｕＫＩのヌクレオチド配列にハイブリダイズできることが好ましいが、実質的に異なるコドン使用法を有するＨｕＫＩ或いはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を生成することが有利な場合もある。コドンを選択して、特定のコドンが宿主によって利用される頻度に応じて、ペプチドの発現が特定の原核或いは真核発現宿主において生じる割合を増加してもよい。コードされたアミノ酸配列を変更することなくＨｕＫＩ及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する他の理由は、より長い半減期といった、自然発生配列から生成された転写物より望ましい特性を有するＲＮＡ転写物を生成することを含む。また本発明は、合成化学的に完全に、ＨｕＫＩ及びその誘導体をコードするＤＮＡ配列或いはその一部の生成することを含む。生成後、本特許出願の出願時点で当分野において周知の薬剤を用いて、合成配列が、任意の多くの入手可能なＤＮＡベクタ及び細胞系に挿入されることができる。さらに合成化学的に、ＨｕＫＩ或いは任意のその一部をコードする配列に突然変異を導入することもできる。また本発明には、種々の厳密性の条件下で請求の範囲に記載されているヌクレオチド配列、特に配列番号：２に示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列が含まれる。ハイブリダイゼーション条件は、Wahl,G.M及びS.L.Berger(1987;Methods Enzymol.Vol152:399-407)及びKimme l，A.R.(1987;Methods Enzymol．Vol 152:507-511)に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度（Ｔｍ）に基づいており、定義された厳密性において用いられることができる。本発明により含まれるＨｕＫＩをコードする変更核酸配列は、同一或いは機能的に等価なＨｕＫＩをコードするポリヌクレオチドをもたらす種々のヌクレオチドの欠失、挿入或いは置換を含む。またコードされたタンパク質は、サイレント変化を生成し、機能的に等価なＨｕＫＩをもたらすアミノ酸残基の欠失、挿入或いは置換も含む。故意のアミノ酸置換は、ＨｕＫＩの生物活性が保持される限り、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性並びにまた両親媒性における類似性に基づいて行うことができる。例えば、負に帯電したアミノ酸はアスパラギン酸及びグルタミン酸を含み、正に帯電したアミノ酸はリジン及びアルギニンを含み、同様の親水値を有する帯電していない極性頭基（polar head group）有するアミノ酸はロイシン、イソロイシン及びバリン、グリシン及びアラニン、アスパラギン及びグルタミン、セリン及びスレオニン、フェニルアラニン及びチロシンを含む。ＨｕＫＩをコードする遺伝子のアレルも本発明の範囲内に含まれる。ここで用いる「アレル」或いは「アレル配列」は、核酸配列における少なくとも１つの突然変異から生じる遺伝子の代替形である。アレルは変更されたｍＲＮＡ或いはポリペプチドを生じ、その構造或いは機能は変更される場合もあれば、変更されない場合もある。任意の所与の遺伝子は、１つ或いは多くのアレル形を有する場合もあれば、全く有さない場合もある。アレルを引き起こす通常の突然変異は一般に、ヌクレオチドの自然の欠失、付加或いは置換に起因する。これらの種類の変化はそれぞれ単独で、或いは他との組み合わせにおいて、所与の配列において１回或いは２回以上生じる場合がある。当分野において周知で、一般に入手可能なＤＮＡ配列決定のための方法が本発明の任意の実施例を実行するために用いられる。これらの方法はDNA polymerase I,Sequenase（登録商標）(US Biochemical Corp,Cleveland OH))のKlenow frag ment、Taq polymerase(Perkin Elmer)、耐熱性T7 polymerase(Amersham，Chicag o IL)或いはGibco BRL(Gaithersburg MD)により市販されているELONGASE Amplif ication Systemのような組換えポリメラーゼとプルーフリーディングエキソヌクレアーゼの組み合わせのような酵素を利用する。このプロセスはHamilton Micro Lab 2200(Hamilton，Reno NV)，Peltier Thermal Cycler（PTC200;MJ Research ，Watertown MA）及びthe ABI 377 DNA sequencers(Perkin Elmer)のような機器を用いて自動化することが好ましい。ＨｕＫＩをコードする核酸配列は、部分ヌクレオチド配列を利用して、かつプロモータ及び調節エレメントのような上流配列を検出するための当分野において既知の種々の方法を用いて伸展させることができる。例えば、用いられる場合がある１つの方法、「制限部位」ＰＣＲは、汎用プライマを用いて既知の位置に隣接する未知の配列を回収する(Sarkar．G(1993)PCR Methods Applic 2:318-322) 。詳細には、ゲノムＤＮＡはリンカー配列に対するプライマ及び既知の領域に特異なプライマの存在時に最初に増幅される。その後増幅された配列は、同じリンカープライマ及び第１のプライマに内在する別の特異なプライマを用いて第２巡目のＰＣＲにかけられる。各回のＰＣＲの生成物は、適当なＲＮＡポリメラーゼを用いて転写され、逆転写酵素を用いて配列される。また逆ＰＣＲを利用して、既知領域に基づく多岐プライマを用いて配列を増幅或いは伸展することもできる(Triglia T等(1988)Nucleic Acids Res 16:8186)。プライマはOLIGO4.06 Primer Analysis Software(1992;National Biosciences I nc,Plymouth MN)或いは別の適当なプログラムを用いて設計され、長さが２２− ３０ヌクレオチドになり、５０％以上のＧＣ含量を有し、さらに約６８−７２℃ の温度で標的配列にアニールすることができる。その方法はいくつかの制限酵素を用いて、遺伝子の既知の領域内に適当なフラグメントを生成する。その後そのフラグメントは、分子内連結反応により環状にされ、ＰＣＲテンプレートとして用いられる。用いられる場合がある別の方法は、ヒトの既知の配列に隣接するＤＮＡフラグメントと酵母菌人工染色体ＤＮＡとをＰＣＲ増幅することを伴う捕獲ＰＣR(Lage rstrom M等(1991)PCR Methods Applic 1:111-19)である。この方法では、多数の制限酵素消化及び連結を用いて、ＰＣＲを実行する前に遺伝子操作された二本鎖配列をＤＮＡ分子の未知の部分に配置することができる。未知の配列を回収するために用いられることがある別の方法は、Parker JD等( 1991;Nucleic Acids Res 19:3055-60)による方法である。さらにある方法はＰＣＲ、入れ子状プライマ及びPromoterFinder（登録商標）libraryを用いて、ゲノムＤＮＡに歩行することができる（Clontech,Palo Alto CA）。このプロセスによりライブラリをスクリーニングする必要がなくなり、イントロン／エクソン接合部を見つける際に有用である。完全長ｃＤＮＡに対してスクリーニングする際に、より長いｃＤＮＡを含むように大きさを選択されたライブラリを用いることが好ましい。またランダムに初回抗原刺激を受けたライブラリも、それらが遺伝子の５’及び上流領域を含むより大きな配列を含むという点で好ましい。ランダムに初回抗原刺激を受けたライブラリの使用は、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリが完全長ｃＤＮＡを産生しない状況では特に好ましい。ゲノムライブラリは５’及び３’非転写調節領域に伸展するために有用な場合がある。市販の毛細管電気泳動システムを用いて、配列決定或いはＰＣＲ生成物の大きさを解析したり、或いはヌクレオチド配列を確認したりすることができる。特に毛細管配列決定は、電気泳動分離のための流動性ポリマ、レーザにより活性化される（各ヌクレオチドに対して１種類の）４つの異なる蛍光性染料及びＣＣＤカメラによる放射波長の検出を用いる場合がある。出力／光強度が適当なソフトウエア（例えばGenotyper^TM及びSequence Navigator^TM、Perkin Elmer）を用いて電気信号に変換され、サンプルの装填からコンピュータ解析及び電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制御される。毛細管電気泳動法は、特定のサンプルの限定された量内に存在する場合があるＤＮＡの小片の配列決定に特に好ましい。本発明の別の実施例では、ＨｕＫＩをコードするポリペプチド或いはそのフラグメント、または融合タンパク質或いはその機能的等価物が、適当な宿主細胞においてＨｕＫＩの発現をもたらす組換え体ＤＮＡ分子に用いられる場合がある。ゲノムコードの固有の縮重により、概ね同一か或いは機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が生成され、この配列を用いてＨｕＫＩをクローニングし、発現することもできる。非自然発生コドンを有するＨｕＫＩをコードするヌクレオチド配列を生成することが有利な場合もあることは当業者には理解されよう。例えば、特定の原核或いは真核宿主により選択されたコドンを選択して、タンパク質発現の割合の増大したり、或いは自然発生配列から生成される転写物より長い半減期のような所望の特性を有する組換え体ＲＮＡ転写物を生成したりすることができる。本発明のヌクレオチド配列は、限定はしないが、遺伝子生成物のクローニング、プロセッシング並びにまた発現を修飾する変更を含む種々の理由によりＨｕＫＩをコードする配列を変更するために、当分野において周知の方法を用いて遺伝子操作されることができる。遺伝子フラグメント及び合成オリゴヌクレオチドのランダムなフラグメント化及びＰＣＲ再構築によるＤＮＡ混合を用いて、ヌクレオチド配列を遺伝子操作することができる。例えば、位置指定突然変異誘発を用いて、新しい制限部位の挿入、グリコシレーションパターンの変更、コドン優先度の変更、スプライシング変異体の生成、或いは他の突然変異等を行うこともできる。本発明の別の実施例では、ＨｕＫＩをコードする自然、修飾或いは組換え体ポリヌクレオチドは、融合タンパク質をコードするために異種配列に結合されることもできる。例えば、ＨｕＫＩ活性のインヒビタ用のペプチドライブラリをスクリーニングするために、市販されている抗体により識別されるキメラＨｕＫＩタンパク質をコードすることが有用な場合もある。また融合タンパク質は、ＨｕＫＩをコードする配列と異種タンパク質配列との間に位置する分割部位を含むように遺伝子操作されることもでき、それによりＨｕＫＩは分割され、概ね異種部分から離れて精製されるようになる。本発明の別の実施例では、当分野で周知の化学的方法を用いて、ＨｕＫＩをコードする配列が、全体的に或いは部分的に合成されることができる(Caruthers M H等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 215-23,HornT等(1980)Nuc Acids Res Symp S er 225-32参照)。別法では、タンパク質自体が、ＨｕＫＩのアミノ酸配列或いは一部を合成するために化学的方法を用いて生成される場合がある。例えばペプチド合成は種々の固相技術（Roberge JY等(1995)Science 269:202-204）を用いて実行されることができ、自動合成は、例えばABI 431A Peptide Synthesizer(Per kin Elmer)を製造業者により提供される取扱説明書に従って用いて達成することができる。新たに合成されたペプチドは、調製用高速液体クロマトグラフィにより実質的に精製されることができる(例えばCreighton(1983)Proteins,Structures and Mo lecular Principles,WH Freeman and Co,New York NY)。合成ペプチドの組成物は、アミノ酸分析及び配列決定により確認することができる（例えばEdman degr adation procedure;Creighton,上記）。さらにＨｕＫＩのアミノ酸配列或いはその任意の一部は、直接合成中に変更されるか、並びにまた他のタンパク質或いはその任意の一部からの配列を用いる化学的方法により結合され、変異体ポリペプチドを生成することもできる。生物学的活性ＨｕＫＩを発現するために、ＨｕＫＩをコードするヌクレオチド配列或いはその機能的等価物が、適当な発現ベクタ、すなわち挿入されたコード化配列の転写及び翻訳のために必要なエレメントを含むベクタ内に挿入されてもよい。当業者に周知の方法を用いて、ＨｕＫＩをコードする配列及び適当な転写或いは翻訳制御エレメントを含む発現ベクタを構成することができる。これらの方法は、ｉｎｖｉｔｒｏ組換え体ＤＮＡ技術、合成技術並びにｉｎｖｉｖｏゲノム再組換えを含む。そのような技術はSambrook等(1989)Molecular Cloning，A L aboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Plainview NY及びAusubel FM等（1989）Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New Y ork NYに記載されている。種々の発現ベクタ／宿主系を利用して、ＨｕＫＩをコードする配列を含有し、発現する場合もある。これらは、限定するわけではないが、組換え体バクテリオファージ、プラスミド或いはコスミドＤＮＡ発現ベクタと形質転換されたバクテリア、酵母菌発現ベクタと形質転換された酵母菌、ウイルス発現ベクタで感染した昆虫細胞系（例えばバキュロウイルス）、ウイルス発現ベクタと形質転換された植物細胞系（例えば、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ、タバコモザイクウイルスＴＭＶ）或いはバクテリア発現ベクタと形質転換された植物細胞系（例えば、Ｔｉ或いはｐＢＲ３２２プラスミド）又は動物細胞系のような微生物を含む。「制御エレメント」或いは「調節配列」はベクタの非翻訳領域、すなわちエンハンサ、プロモータ並びに５’及び３’非翻訳領域であり、転写及び翻訳を実行するために宿主細胞タンパク質と相互作用する。そのようなエレメントは強度及び特異性において異なる場合がある。用いられるベクタ系及び宿主により、構成的及び誘導性プロモータを含む、任意の数の適当な転写及び翻訳エレメントを用いることができる。例えばバクテリア系においてクローニングする際に、Bluescript（登録商標）ファージミド(Stratagene,LaJolla CA)のハイブリッドｌａｃＺプロモータ或いはpSport １プラスミド(Gibco BRL) 等の誘導性プロモータを用いることができる。バキュロウイルスポリヘドリン（ polyhedrin）プロモータは昆虫細胞に用いられる。植物細胞のゲノムに由来するプロモータ或いはエンハンサ（例えば熱ショックＲＵＢＩＳＣＯ及び貯蔵タンパク質遺伝子）或いは植物ウイルスに由来するプロモータ或いはエンハンサ（例えばウイルス性プロモータ或いはリーダ配列）が、ベクタにクローニングされる場合もある。哺乳動物細胞系では、哺乳動物遺伝子或いは哺乳動物ウイルスに由来するプロモータが好ましい。ＨｕＫＩをコードする配列の多数の複製を含む細胞株を発生させる必要がある場合には、ＳＶ４０或いはＥＢＶ系のベクタを適当な選択可能マーカと共に用いることができる。バクテリア系では、いくつかの発現ベクタが、ＨｕＫＩのための使用に応じて選択されてもよい。例えば大量のＨｕＫＩが抗体を誘導するために必要とされるとき、容易に精製される融合タンパク質を高レベルで発現させるベクタを用いることができる。そのようなベクタは、限定するわけではないが、ＨｕＫＩをコードする配列が、アミノ末端Ｍｅｔ及び後続のβ−ガラクトシダーゼの７残基に対する配列の枠内のベクタに結合されることができ、ハイブリッドタンパク質が生成される、多機能Ｅ．ｃｏｌｉクローニング及びBluescript（登録商標）(Strat agene)のような発現ベクタ、並びにｐＩＮベクタ(Van Heeke & Schuster(1989)J Biol Chem 264:5503-5509)等を含む。またｐＧＥＸベクタ(Promega, Madison WI)を用いて、外来のポリペプチドをグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)を有する融合タンパク質として発現してもよい。一般にそのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビードへの吸収及びそれに後続する遊離グルタチオンの存在時の溶出により分離した細胞から容易に精製することができる。そのような系内で形成されるタンパク質はヘパリン、トロンビン或いは第ＸＡ因子プロテアーゼ分割部位を含むように設計され、対象のクローニングされたポリペプチドが自由にＧＳＴ成分から遊離されるようにする。酵母菌、サッカロミセス‐セレビジエでは、α因子、アルコールオキシダーゼ及びＰＧＨのような構成的及び誘導性プロモータを含むいくつかのベクタを用いることができる。再確認する場合には、Ausubel等(上記)及びGrant等(1987)Meth ods in Enzymology 153:516-544を参照されたい。植物発現ベクタが用いられる場合には、ＨｕＫＩをコードする配列の発現は、いくつかのプロモータの任意のものにより行われる。例えばＣａＭＶの３５Ｓ及び１９Ｓプロモータのようなウイルス性プロモータは単独で、或いはＴＭＶからのω−リーダ配列と共に用いることができる（Takamatsu等(1987)EMBO J 6:307- 311）。別法では、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットのような植物プロモータ或いは熱ショックプロモータ（Coruzzi等（1984）EMBO J 3:1671-1680;Broglie等（1984）Science 224:838-843及びWinter J and Sinibaldi RM(1991)Results Pr obl Cell Differ 17:85-105）を用いる場合もある。これらの構成体は、直接ＤＮＡ形質転換或いは病原体媒介形質移入により植物細胞内に導入されることができる。その技術は一般に入手できるいくつかの概説に記載される（例えば、Hobb s Ｓ orMurry LE in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology(1992)M cGraw Hill New York NY,pp.191- 196を参照されたい）。また昆虫系もＨｕＫＩを発現するために用いることができる。例えばある系では、Autographa californica核多角体病ウイルス(ＡｃＮＰＶ)をベクタとして用いて、ヨトウガ細胞或いはイクラサキンウワバ幼虫（Trichoplusia larvae）において外来遺伝子を発現する。ＨｕＫＩをコードする配列は、ポリヘドリン（po lyhedrin）遺伝子のようなウイルスの非必須領域にクローニングし、ポリヘドリンプロモータの制御下に置かれる。ＨｕＫＩをコードする配列を有効に挿入することにより、ポリヘドリン遺伝子は非活性になり、コートタンパク質を欠如する組換え体ウイルスが生成される。その後組換え体ウイルスを用いて、ＨｕＫＩが発現される、例えばヨトウガ細胞或いはイクラサキンウワバ幼虫を感染させる（ Engelhard EK等(1994),Proc Nat Acad Sci 91:3224-3227）。哺乳類宿主細胞では、いくつかのウイルス性発現系が利用される場合がある。アデノウイルスが発現ベクタとして用いられる場合には、ＨｕＫＩをコードする配列は、後期プロモータ及び３連のリーダ配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体に結合される場合がある。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１或いはＥ３領域内の挿入により、感染した宿主細胞においてＨｕＫＩを発現することができる生ウイルスを得ることができる（Logan and Shenk(1984)Proc Natl Acad Sci 81:3 655-59）。さらにラウス肉腫（ＲＳＶ）エンハンサのような転写エンハンサを用いて、哺乳動物宿主細胞内の発現を増加させることができる。また特異な開始シグナルを用いて、ＨｕＫＩをコードする配列のより効率的な転写を達成することもできる。そのシグナルはＡＴＧ開始コドン及び隣接配列を含む。ＨｕＫＩをコードする配列、その開始コドン及び上流配列が適当な発現ベクタ内に挿入される場合には、追加の転写或いは翻訳制御シグナルは不要である。しかしながらコードする配列或いはその一部のみが挿入される場合には、ＡＴＧ開始コドンを含む外来の翻訳制御シグナルが与えられるべきである。さらに開始コドンは、全挿入物を確実に転写するために、正確な読み枠内に置かれなければならない。外来転写エレメント及び開始コドンは、自然及び合成両方の種々の起源からなることができる。発現の効率は、論文に記載されるように、使用される特定の細胞系に適したエンハンサを含有することにより高められる場合がある（Scharf D等(1994)Results Probl Cell Differ 20:125-162）。さらに宿主細胞株は、挿入した配列の発現を調節できるように、或いは所望のように発現したタンパク質を処理できるように選択されることができる。そのようなポリペプチドの調節は、限定はしないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化或いはアシル化を含む。またタンパク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセッシングを用いて、正確な挿入、折りたたみ並びにまた機能を促進することができる。CHO,HeLa,MDCK,HEK293及びWI38のような種々の宿主細胞が、そのような翻訳後活性のために特異な細胞機構及び特性機構を有しており、外来タンパク質の正確な調節及びプロセッシングを確実にするように選択することができる。長期間組換え体タンパク質を歩留まり高く生産する場合、安定した発現が望ましい。例えば、ＨｕＫＩを安定して発現する細胞株は、複製或いは内性発現エレメントのウイルス起源及び同じ或いは別のベクタにおける選択可能マーカ遺伝子を含む発現ベクタを用いて形質転換されことができる。ベクタの導入に続いて、細胞を強化培地内で１〜２日間成長させ、その後選択培地に切り替えるようにする。選択可能マーカの目的は、選択への耐性を与えることであり、その存在により、導入された配列を有効に発現する細胞が成長し、回収されるようになる。安定して形質転換された細胞の耐性クローンは、細胞タイプに適した組織培養技術を用いて増殖させることができる。任意の数の選択系を用いて、形質転換された細胞株を回収することができる。これらは、限定はしないが、それぞれｔｋ−細胞或いはａｐｒｔ−細胞において用いることができる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler,M等(1977) Cell 11:223-32）及びアデニンフォスフォリボシール転換酵素遺伝子（Lowy I等 (1980)Cell 22:817-23）含む。また代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤耐性を選択のための基準として用いることができる。例えば、ｄｈｆｒはメトトレキセートへの耐性を与え（Wigler M等(1980)Proc Natl Acad Sci 77:3567-70）、ｎｐｔはアミノグリコシッドネオマイシン及びＧ−４１８への耐性を与え（Colber e-Garapin F等(1981)J Mol Biol 150:1-14）、ａｌｓ或いはｐａｔはそれぞれクロルスルフロン及びホスフィノトリシン（phosphinotricin）アセチル基転移酵素への耐性を与える（Murry、上記）。さらに選択可能遺伝子が記載されており、例えば、ｔｒｐＢにより細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようになり、ｈｉｓＤにより細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール（hi stinol）を利用できるようになる（Hartman S.C及びR.C Mulligan(1988)Proc Na tl Acad Sci 85:8047-51）。最近、アントシアニン、β−グルクロニダーゼ及びその基質ＧＵＳ並びにルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリンのようなマーカと共に可視マーカを使用することが普及しており、転換体を同定するのみならず、特異なベクタ系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現の量を定量するために幅広く用いられる（Rhodes CA等(1995)Methods Mol Biol 55:121-131）。マーカ遺伝子発現の存在／不在は、対象の遺伝子が存在することを示唆するが、その存在及び発現は確認される必要がある。例えば、ＨｕＫＩをコードする配列がマーカ遺伝子配列内に挿入される場合には、ＨｕＫＩをコードする配列を含む組換え体細胞は、マーカ遺伝子機能の欠如により同定されることができる。別法では、マーカ遺伝子は、単一のプロモータの制御下でＨｕＫＩをコードする配列と直列に配置される。誘導及び選択に応じたマーカ遺伝子の発現は通常、同様に直列の遺伝子の発現を示す。別法では、ＨｕＫＩをコードする核酸配列を含み、ＨｕＫＩを発現する宿主細胞は、当業者に知られる種々の手順により同定されることができる。この手順は、限定はしないが、核酸或いはタンパク質の検出並びにまた定量化のための膜、溶液或いはチップ系技術を含むＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション及びタンパク質バイオアッセイ或いはイムノアッセイ技術を含む。ＨｕＫＩをコードするポリヌクレオチド配列の存在は、ＨｕＫＩをコードするポリヌクレオチドのプローブ、一部或いはフラグメントを用いるＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション或いは増幅により検出されることができる。核酸増幅系アッセイは、ＨｕＫＩをコードするＤＮＡ或いはＲＮＡを含む形質転換体を検出するために、ＨｕＫＩをコードする配列に基づくオリゴヌクレオチド或いはオリゴマを使用することを伴う。ここで用いる「オリゴヌクレオチド」或いは「オリゴマ」は、少なくとも約１０ヌクレオチドから６０ヌクレオチドの核酸配列、好ましくは約１５−３０ヌクレオチドの核酸配列、より好ましくは２０−２５ヌクレオチドの核酸配列であり、プローブ或いはアンプライマとして用いることができる。ＨｕＫＩの発現を検出し、測定するための種々のプロトコルは、そのタンパク質に対して特異なポリクローナル抗体或いはモノクローナル抗体のいずれかを用いており、当業者には周知である。例えば酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＥ）などである。ＨｕＫＩにおける２つの非干渉性エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる２部位のモノクローナル系イムノアツセイ（mo noclonal-based immunoassay）が好ましいが、結合タンパク競合測定法が用いられてもよい。ここで記載した検定法及び他の検定法は、Hampton R等(1990，Sero logical Methods，a Laboratory Manual，APS Press，St．Paul MN)及びMaddox DE等(1983,J Exp'Med 158:1211-1216)に記載される。幅広い標識及び接合技術が当業者には知られており、種々の核酸及びアミノ酸検定法において用いることができる。ＨｕＫＩをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識化ハイブリダイゼーション或いはＰＣＲプローブを生成するための手段は、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化或いは標識化ヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅を含む。別法では、ＨｕＫＩをコードする配列或いはその任意の一部が、ｍＲＮＡプローブの生成のためにベクタ内にクローニングされる場合もある。そのようなベクタが当分野において知られ、市販されており、Ｔ７、Ｔ３、或いはＳＰ６のような適当なＲＮＡポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドを加えることによりｉｎｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するために用いることができる。これらの手順は種々の市販のキット（Pharmacia&upjohn(Kalamazoo,MI)、Promega(Madison WI)及びUS Bioc hemical Corp(Cleveland OH)）を用いて行われる。適当なリポータ分子或いは標識が用いられる場合もあり、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤或いは色素生産剤並びに基質、コファクタ、インヒビタ、磁気粒子等を含む。ＨｕＫＩをコードするヌクレオチド配列と形質転換された宿主細胞は、細胞培養からのタンパク質の発現及び回収のために適した条件下で培養されることができる。組換え体細胞により生成されるタンパク質は、用いられる配列並びにまたベクタにより、分泌されるか或いは細胞内に含有される。ＨｕＫＩをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクタは、原核細胞膜或いは真核細胞膜を介してＨｕＫＩの分泌を促すシグナル配列を含むように設計することができることは当業者には理解されよう。他の組換え体構造を用いて、可溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチド領域をコードするヌクレオチド配列にＨｕＫＩをコードする配列を結合する場合もある。そのような精製を容易にする領域は、限定はしないが、固定化金属上で精製できるようにするヒスチジン−トリプトファンモジュールのような金属キレート化ペプチド、固定化免疫グロブリン上で精製できるようにするタンパク質Ａドメイン及びＦＬＡＧＳ伸展／親和性精製系（Immunex Corp.,Seatile,WA）において用いられるドメインを含む。精製ドメインとＨｕＫＩとの間に第ＸＡ因子或いはエンテロキナーゼ（Invitrogen,San D iego,CA）に対して特異な配列のような分割可能リンカー配列を含有することにより、精製が容易になる場合もある。１つのそのような発現ベクタが、ＨｕＫＩ及びチオレドキシン或いはエンテロキナーゼ分割部位に先行する６ヒスチジン残基をコードする核酸を含む融合タンパク質の発現をもたらす。ヒスチジン残基は、ＩＭＩＡＣ(Porath,J．等(1992,Prot.Exp.Purif.3:263-281)に記載されるような固定化金属イオン親和性クロマトクグラフィ）において精製を容易にし、一方エンテロキナーゼ分割部位は融合タンパク質からのＨｕＫＩを精製するための手段を提供する。融合タンパク質を含むベクタの議論はKroll,D.J.等(1993;DNA Ce ll Biol.12:441-453)に与えられる。組換え体生成物に加えて、ＨｕＫＩのフラグメントは、固相技術（Merrifield J(1963)J Am Chem Soc 85:2149-2154）を用いる直接ペプチド合成により生成される場合もある。タンパク質合成は手動技術を用いて或いは自動化により実行されることができる。例えば、Applied Biosyste ms 431A Peptide Synthesizer(Perkin Elmer)を製造者により提供される取扱説明書に従って用いて、自動合成を実現してもよい。ＨｕＫＩの種々のフラグメントは化学的に個別に合成されるか、或いは化学的方法を用いて結合され、完全長分子を生成することができる。治療ＨｕＫＩとラット及びヒトからのＫａｚａｌ型インヒビタＰＳＴＩとの間に化学的及び構造的相同性がある。癌関連結腸組織における発現と共にいくつかのＫａｚａｌ型インヒビタファミリとしてのＨｕＫＩの同定は、ＨｕＫＩが、炎症性サイトカインに応じて発現され、疾患組織内に存在するセリンプロテアーゼ或いは糖タンパク質ホルモンの抑制において作用することを示唆する。それゆえＨｕＫＩは組織損傷の抑制及び細胞増殖、詳細には炎症及び癌を含む消化器系の疾患における調節においてある役割を有する。ＨｕＫＩとその生成及び消化酵素の放出を制御する受容体との間の相互作用或いは酵素自体が、消化器疾患の進行を著しく低減することができる。それゆえ一実施例では、ＨｕＫＩ或いはそのフラグメント又は誘導体が被検者に投与され、プロテアーゼが媒介する組織破壊を治療或いは予防することができる。そのような組織破壊は、限定はしないが、消化性潰瘍、膵炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、胆嚢炎、過敏性大腸症候群、萎縮性胃炎、虚血／再潅流傷害、外傷後炎症、癌の炎症性合併症、或いは特に消化器系の任意の他の感染症又は炎症を含む障害に関連する場合がある。別の実施例では、ＨｕＫＩ、或いはそのフラグメント又は誘導体を発現することができるベクターも被検者に投与され、上記疾患を含む疾患に関連するプロテアーゼ媒介性組織破壊を治療或いは予防することができる。別の実施例では、ＨｕＫＩのアンタゴニストが被検者に投与され、細胞増殖に関連する障害を治療或いは予防することができる。そのような疾患は、限定はしないが、結腸直腸ポリープ、腸管化生及び腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫及び肉腫を含む癌、詳細には結腸、直腸、小腸、膵臓、胃、肝臓、食道及び胆嚢のような消化器系の癌を含む。ある態様では、ＨｕＫＩに特異な抗体が、アンタゴニストとして直接、或いはＨｕＫＩを発現する細胞又は組織に医薬品因子を運ぶための標的或いは送達機構として間接的に用いられることができる。別の実施例では、ＨｕＫＩをコードするポリヌクレオチドの補体或いはアンチセンス配列を発現するベクタが、上記種類の状態を含む増殖及び分化に関連する疾患を治療或いは予防するために被検者に投与されることができる。他の実施例では、上記治療タンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、アンチセンス配列或いはベクタの任意のものが、他の適当な治療薬剤と組み合わせて投与される場合もある。併用療法において用いるのに適した薬剤の選択は、従来の製薬原理に基づいて当業者により行われることができる。治療薬剤の組み合わせは相互依存的に作用し、上記種々の疾患の治療及び予防に影響を与えるようになる。このアプローチを用いて、少ない投与量の薬剤で治療有効度を達成し、それにより有害な副作用に対する可能性を低減することができる。ＨｕＫＩのアンタゴニストは当業者に広く知られた方法を用いて生成されることができる。詳細には生成されたＨｕＫＩを用いて抗体を生成するか、或いは医薬品因子のライブラリをスクリーニングし、ＨｕＫＩと特異に結合するものを同定することができる。ＨｕＫＩに特異な抗体は当業者に周知の方法を用いて生成することができる。そのような抗体は、限定はしないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Fabフラグメント及びFab発現ライブラリにより生成されるフラグメントを含む場合がある。中和性抗体（ダイマ形成を抑制する抗体）が特に治療上の使用に適している。抗体を生成する場合、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト等を含む種々の宿主は、ＨｕＫＩ或いはその任意のフラグメント又は免疫原特性を有するオリゴペプチドを注射することにより免疫することができる。宿主種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることができる。そのようなアジュバントは、限定はしないが、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、及びリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールのような表面活性物質を含む。ヒトに用いられるアジュバントの中では、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム‐パルヴムが特に好ましい。ＨｕＫＩに対する抗体を誘発するために用いられるペプチド、フラグメント或いはオリゴペプチドは、少なくとも５アミノ酸からなるアミノ酸配列を有し、より好ましくは少なくとも１０アミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。それらは自然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であり、小さな自然発生分子の完全なアミノ酸配列を含むことが好ましい。ＨｕＫＩアミノ酸の短い伸展部はキーホールリンペットヘモシアニン及びキメラ分子に対して生成される抗体のような別のタンパク質の伸展部と融合される場合がある。ＨｕＫＩに対するモノクローナル抗体は、培養中の持続細胞株による抗体分子の生成を実現する任意の技術を用いて調製されることができる。これらの技術は、限定はしないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術を含む（Koehler等（1975）Nature 25 6:495-497、Kozbor等（1985）J.Immunol Methods 81:31-42、Cote等(1983)Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030、Cole,S.P等(1984)Mol.Cell Biol.62:109-120）。さらに「キメラ抗体」を生成するために開発された技術、適当な抗原特異性及び生物活性を有する分子を得るためのマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子へのスプライシングを用いることができる（Morrison等(1984)Proc Natl Acad Sci 81: 6851-6855:Neuberger等(1984)Nature 312:604-608;Takeda等(1985)Nature 314:4 52-454）。別法では、一本鎖抗体の生成のために記載される技術が、ＨｕＫＩ特異性一本鎖抗体を生成するために、当分野で知られた方法を用いて適合されてもよい。関連する特異性を有するが、個別のイディオタイプ組成物からなる抗体が、ランダムに組み合わせた免疫グロビンライブラリからの鎖混合により生成される場合もある（Burton D.R.(1991)Proc Natl Acad Sci 88:11120-3）。また抗体は、リンパ球集団においてｉｎｖｉｖｏ生成を誘発することにより、或いは組換え体免疫グロブリン又は論文（Orlandi等(1989，Proc Natl Acad S ci 86:3833-3837、Winter G and Milstein C(1991;Nature 349:293-299)に開示されるような概ね特異性の結合剤のパネルをスクリーニングすることにより生成することもできる。またＨｕＫＩに対する特異な結合部位を含む抗体フラグメントを発生させることもできる。例えば、そのようなフラグメントは、限定はしないが、抗体分子のペプシン消化により生成することができるＦ（ａｂ’）２フラグメント及びＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成することができるＦａｂフラグメントを含む。別法では、Ｆａｂ発現ライブラリを構成して、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速にしかも容易に同定できるようにする（Huse WD 等(1989)Science 256:1275-1281）。種々のイムノアッセイを用いて、所望の特異性を有する抗体を同定するためにスクリーニングすることができる。確立された特異性を有するポリクローナル抗体或いはモノクローナル抗体のいずれかを用いる結合タンパク競合測定法或いは免疫放射測定法用の種々のプロトコルが、当分野では周知である。そのようなイムノアッセイは典型的には、ＨｕＫＩとその特異性抗体との間の複合形成体を測定することを含む。２つの非干渉性ＨｕＫＩエピトープに反応するモノクローナル抗体を利用する２部位モノクローナル抗体用イムノアッセイが好ましいが、結合タンパク質競合測定法を用いることもできる(Maddox上記)。本発明の別の実施例では、ＨｕＫＩをコードするポリヌクレオチド或いはその任意のフラグメント、又はアンチセンス分子が治療のために用いられる場合がある。一態様では、ＨｕＫＩをコードするポリヌクレオチドに対するアンチセンスが、ｍＲＮＡの転写を阻止することが望ましい状況において用いられる。詳細には、細胞は、ＨｕＫＩをコードするポリヌクレオチドに対して相補性の配列と形質転換されことができる。このようにアンチセンス分子を用いて、ＨｕＫＩ活性を調節するか、或いは遺伝子機能の調節を実現することができる。そのような技術は当分野では周知であり、センス或いはアンチセンスオリゴマ又はより大きなフラグメントが、ＨｕＫＩをコードする配列のコード化或いは調節領域に沿った種々の位置から設計されることができる。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス或いはワクシニアウイルスに、また種々の細菌性プラスミドに由来する発現ベクタが、標的となる器官、組織或いは細胞集団にヌクレオチド配列を送達するために用いられる場合がある。当業者には周知の方法を用いて、ＨｕＫＩをコードする遺伝子のポリヌクレオチドに相補性のアンチセンス分子を発現する組換え体ベクタを構成することができる。これらの技術は、Sambrook等(上記)及びAusube l等(上記)の両方に記載される。ＨｕＫＩをコードする遺伝子は、細胞或いは組織を、ＨｕＫＩをコードする高レベルのポリヌクレオチド或いはそのフラグメントを発現する発現ベクタと形質転換することにより遮断されるようになる。そのような構成体は、非翻訳センス或いはアンチセンス配列を細胞内に導入するために用いられる。ＤＮＡ内に統合されない場合であっても、そのようなベクタは、内因性ヌクレアーゼにより無能にされるまで、ＲＮＡ分子を転写し続けることができる。一過性の発現は、非複製ベクタを用いて一ヶ月或いはそれ以上の間持続し、適当な複製エレメントがベクタ系の一部であるならさらに長く持続するようになる。上記のように遺伝子発現の調節は、ＨｕＫＩをコードする遺伝子の調節領域、すなわちプロモータ、エンハンサ並びにイントロンに対してアンチセンス分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ或いはＰＮＡを設計することにより得られるようになる。転写開始部位、例えば開始部位からの位置−１０と＋１０との間に由来するオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に三重らせん塩基対技術を用いて抑制を実現することができる。二重らせんの能力の抑制がポリメラーゼ、転写因子或いは調節分子の結合のために十分に開放されるようになるため、三重らせん対は有用である。三重ＤＮＡを用いる最近の治療の進歩は、論文(Gee JE等(1994)In:Huber BE and B I Carr,Molecular and Immunologic Approaches，Futura Publishing Co.Mt Kis co NY)に記載されている。またアンチセンス分子は、転写物がリボソームに結合するのを防ぐことによりｍＲＮＡの翻訳を阻止するように設計されることができる。リボザイム、すなわち酵素ＲＮＡ分子が、ＲＮＡの特異性分割を触媒するために用いられる場合がある。リボザイム作用の機構は、相補的標的ＲＮＡに対するリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションを伴い、それにヌクレオチド鎖切断分割が伴う。用いられる例は、ＨｕＫＩをコードする配列のヌクレオチド鎖切断分割に特異にしかも有効に触媒作用することができる遺伝子操作されたハンマヘッド状リボザイムを含む。任意の潜在的なＲＮＡ標的内の特異なリボザイム分割部位は、後続する配列ＧＵＡ、ＧＵＵ並びにＧＵＣを含むリボザイム分割部位に対して標的分子を走査することにより最初に同定される。一度同定されれば、分割部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列は、オリゴヌクレオチドを無能にする副構造的な特徴に対して評価されることができる。また候補標的の適合性も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的なオリゴヌクレオチドを用いるハイブリダイゼーションに対する容易性を検査することにより評価することができる。本発明のアンチセンス分子及びリボザイムは、核酸分子の合成に関して当分野で知られた任意の方法により調製されることができる。これらは、固相ホスホラミダイト化学合成のようなオリゴヌクレオチドを化学的に合成するための方法を含む。別法では、ＲＮＡ分子は、ＨｕＫＩをコードするＤＮＡ配列のｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏ転写により生成することができる。そのようなＤＮＡ配列は、Ｔ７或いはＳＰ６のような適当なＲＮＡポリメラーゼプロモータを用いて種々のベクタ内に組み込まれることができる。別法では、アンチセンスｃＤＮＡ構成体は、アンチセンスＲＮＡを合成し、細胞株、細胞或いは組織内に構造的に或いは誘導的に導入されることができる。ＲＮＡ分子を修飾して細胞内安定性及び半減期を改善することもできる。可能な修飾は、限定はしないが、分子の５’並びにまた３’末端でのフランキング配列の付加、或いは分子のバックボーン内のホスホジエステラーゼ連鎖ではなくホスホロチオネート或いは２’Ｏ−メチルの使用を含む。この概念はＰＮＡの生成に固有のものであり、イノシン、キュェオシン及びワイブトシン並びにアセチル −、メチル−、チオ−、及び内因性エンドヌクレアーゼにより容易に識別されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン及びウリジンの同様に修飾された形成体のような従来にはない塩基を含有することにより、これら分子の全体に拡張されることができる。細胞或いは組織内にベクタを導入するために多くの方法が利用可能であり、ｉｎｖｉｖｏ、ｉｎｖｉｔｒｏ及びｅｘｖｉｖｏに使用するのに同様に適している。ｅｘｖｉｖｏ治療の場合、ベクタは、患者から取り出された基幹細胞内に導入され、同じ患者に戻される自家移植物に対してクローンのように繁殖することができる。形質移入及びリポソーム注射による送達は、当分野で周知の方法を用いて達成することができる。上記治療方法の任意の方法は、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、そして最も好ましくはヒトのような哺乳類を含む、治療を要する被検者に適用されることができる。本発明のさらに別の実施例は、上記任意の治療効果のために、製薬的に許容可能な担体と共に用いられる医薬品組成物の投与に関連する。そのような医薬品組成物は、ＨｕＫＩ、ＨｕＫＩに対する抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト或いはＨｕＫＩのインヒビタからなることができる。組成物は単独で、或いは限定はしないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース及び水を含む任意の無菌の生体適合性医薬品担体において投与されることがある、安定化化合物のような少なくとも１つの他の薬剤との組み合わせて投与されることができる。これらの組成物は単独で、或いは他の薬剤、薬物或いはホルモンと組み合わせて患者に投与してもよい。本発明に用いられる医薬品組成物は、限定はしないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下、心室内、経皮、皮下、腹膜内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、直腸手段を含む任意の経路により投与されることができる。活性処方成分に加えて、これらの医薬品組成物は、製薬的に用いることができるプレパラート内への活性化合物の処理を容易にする医薬品添加物及び補助剤を含む適当な製薬的に許容可能な担体を含む場合もある。さらに製剤及び投与に関する技術についての詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences(Maack Publ ishing Co.Easton PA)の最新版に見出される。経口投与の場合の医薬品組成物は、経口投与に適した投与量の当分野で周知の製薬的に許容可能な担体を用いて調剤することができる。そのような担体により、医薬品組成物は、患者が経口摂取するための錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤等として調剤されることができる。経口投与するための医薬品調剤は、活性化合物と固形の医薬品添加物とを混合して、選択的にはその混合物を細かく砕いて、さらに所望に応じて、錠剤或いは糖衣剤コアを得るために適当な補助剤を加えた後、顆粒剤の混合物を処理して得られるようになる。適当な医薬品添加物は、ラクトース、スクロース、マンニトール或いはソルビトールを含む糖、トウモロコシ、小麦、米、じゃがいも或いは他の植物からのデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース或いはカルボキシルメチルセルロースナトリウムのようなセルロース、及びアラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴム、並びにゼラチン及びコラーゲンのようなタンパク質を含む炭水化物或いはタンパク質賦形剤である。必要なら、架橋結合されたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸或いはアルギン酸ナトリウムのようなその塩を含む、崩壊剤或いは可溶化剤が加えられてもよい。糖衣剤コアは濃縮糖液のような適当なコーティングと共に用いられ、その濃縮糖液はアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル（carbop ol gel）、ポリエチレングリコール並びにまた二酸化チタン、ラッカー溶液及び適当な有機溶剤或いは溶剤混合物を含む場合もある。染料或いは色素が製品識別、或いは活性化合物の量、すなわち投与量を特徴付けるために、錠剤或いは糖衣錠コーティングに加えられる場合もある。経口投与される医薬品製剤は、ゼラチンからなる押込嵌合式のプッシュフィットカプセル剤、並びにゼラチン及びグリコール或いはソルビトールのようなコーティングからなる軟らかく封止されたソフトシールカプセル剤を含む。プッシュフィットカプセル剤は、ラクトース或いはデンプンのような賦形剤或いは結合剤、タルク或いはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、さらに選択的に安定化剤と混合された活性処方成分を含むことができる。ソフトカプセル剤では、活性化合物は、脂肪油、パラフィン油、或いは安定化剤を用いる場合、用いない場合があるが液体ポリエチレングリコールのような適当な溶液内に溶解或いは懸濁される場合がある。非経口投与のための医薬品製剤は、活性化合物の水溶液を含む。注射するために、本発明の医薬品組成物は、水溶液内で、好ましくはハンクス溶液、リンガー溶液或いは生理緩衝食塩水のような生体適合性緩衝液内で調製される。水性の注入懸濁液は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール或いはデキストランのように、懸濁液を増粘する物質を含む場合がある。さらに活性化合物の懸濁液は、適当な油性の注射懸濁液として調製される場合もある。適当な親油性溶剤或いは溶媒は、ゴマ油のような脂肪油、或いはオレイン酸エチル又はトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、或いはリポソームを含む。さらに懸濁液は、高濃縮の溶液の調製を可能とするために化合物の可溶性を増加させる適当な安定化剤或いは薬剤を含む場合もある。局所或いは鼻腔投与の場合、特定の障壁を浸透させるのに適した浸透剤が調製において用いられる。そのような浸透剤は当分野で一般に知られている。本発明の医薬品組成物は、当分野において知られた、例えば、従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣形成、微粒子化、乳状化、カプセル化、包括（entrapping）或いは凍結乾燥処理による方法で製造される。医薬品組成物は塩類として提供され、限定はしないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、琥珀酸等の多くの酸を用いて形成することができる。塩類は、対応する遊離塩基形の場合より、水性或いはプロトン性溶剤において可溶性をなす傾向がある。他の場合に好ましい製剤は、使用前に緩衝剤と結合されたｐＨ範囲４．５−５．５の１ｍＭ−５０ｍＭヒスチジン、０．１％−２％スクロース、２％−７％マンニトールの任意のもの或いは全てを含む凍結乾燥粉末である。医薬品組成物が調製された後、それらは適当な容器に入れられ、指示された条件の治療のためにラベルを貼付される。ＨｕＫＩの投与の場合、そのようなラベル貼付は、投与の量、頻度並びに方法を含むであろう。本発明に用いるために適した医薬品組成物は、活性処方成分が目的を果たすための有効な量だけ含まれる組成物を含む。有効な量を投与することは、当業者の能力内で果たすことができる。任意の化合物の場合、製薬的に有効な量は、例えば腫瘍性細胞の細胞培養アッセイ、或いは通常マウス、ウサギ、イヌ或いはブタの動物標本のいずれかにおいて最初に見積もられる。また動物標本を用いて、所望の濃縮範囲及び投与の経路が確定される。その後その情報を用いて、ヒトに投与するための有効な量及び経路を確定することができる。製薬的に有効な量は、症状或いは状態を改善する、例えばＨｕＫＩ或いはそのフラグメント、ＨｕＫＩの抗体、アゴニスト、アンタゴニスト、或いはＨｕＫＩのインヒビタの主成分の量である。そのような化合物の治療に対する有効度及び毒性は、細胞培養或いは実験動物における標準的な製薬的手順、例えばＥＤ５０（集団の５０％において製薬的に有効な量）及びＬＤ５０（集団の５０％が致死する量）により確定することができる。治療効果と毒性効果の投与量比が治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示す医薬品組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られるデータは、ヒトに投与するための量の範囲を処方する際に用いられる。そのような化合物の投与量は、毒性が非常に少ないか或いは全くなくＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、用いられる投与形態、患者の感度及び投与経路によりこの範囲内で変化する。厳密な投与量は、治療される患者を診察する個々の医師により選択される。量及び投与を調整して、十分なレベルの活性成分を与えたり、或いは所望の効果を維持したりする。考慮される場合がある要因は疾患状態の重症度、被検者の健康状態、患者の年齢、体重及び性別、食事、投与の時間及び頻度、薬物の組み合わせ、反応への敏感度、並びに治療に対する耐性／反応を含む。特定の製剤の半減期及びクリアランス率に応じて、３〜４日毎、毎週或いは２週間毎に一度、長時間作用性の医薬品組成物が投与される場合もある。通常の投与量は０．１μｇ〜１００，０００μｇまで変化し、投与の経路にもよるが、全投与量は約１ｇまでである。詳細な投与量及び送達の方法に関する手引きは文献に与えられており、一般に当分野の開業医が利用できる。当業者は、タンパク質或いはそのインヒビタの場合とは異なる製剤を、ヌクレオチドの場合に用いるであろう。同様にポリヌクレオチド或いはポリペプチドの送達は特定の細胞、状態、位置等に対して特異であろう。診断別の実施例では、ＨｕＫＩを特異に結合する抗体が、ＨｕＫＩの発現により特徴付けられる状態或いは疾患の診断のために、又はＨｕＫＩ、アゴニスト、アンタゴニスト或いはインヒビタを用いて治療されている患者をモニタするための検定法において用いることができる。診断のために有用な抗体は、治療の場合に上記した方法と同様の方法で調製されることができる。ＨｕＫＩに対する診断検定法は、抗体及び標識を用いて、ヒト体液或いは細胞又は組織の抽出物においてＨｕＫＩを検出する方法を含む。抗体は、修飾と共に、或いは修飾を用いずに用いられる場合があり、リポータ分子と共有結合で、或いは非共有結合での何れかで結合することにより標識化されることができる。当分野において知られる種々のリポータ分子を用いることができ、そのいくつかが上記される。ＨｕＫＩを測定するためのＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ及びＦＡＣＳを含む種々のプロトコルが当分野において知られており、ＨｕＫＩ発現の変更されたレベル或いは異常なレベルを診断するための方法を提供する。ＨｕＫＩ発現のための正常或いは標準的な値は、正常な哺乳動物被検者、好ましくはヒトから取り出された体液或いは細胞抽出物を複合体形成に適した条件下でＨｕＫＩに対する抗体と結合することにより確立される。標準的な複合体形成量は種々の方法により定量されることができるが、光計測による手段が好ましい。被検者において発現したＨｕＫＩの量、制御及び疾患、生検組織からのサンプルが標準値と比較される。標準値と被検者値との間の偏差が疾患を診断するためのパラメータを確立する。本発明の別の実施例では、ＨｕＫＩをコードするポリヌクレオチドを診断のために用いることができる。用いられるポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチド配列、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子及びＰＮＡを含む。ポリヌクレオチドを用いて、ＨｕＫＩの発現が疾患と相関をなす可能性がある生検組織の遺伝子発現を検出かつ定量することができる。診断検定法を用いて、ＨｕＫＩの不在、存在及び過剰発現を識別することができ、さらに治療処置中のＨｕＫＩレベルの調節をモニタすることができる。一態様では、ＨｕＫＩ或いは密接に関連する分子をコードするゲノム配列を含むポリヌクレオチド配列を検出することができるＰＣＲプローブを用いるハイブリダイゼーションにより、ＨｕＫＩをコードする核酸配列を同定することができる。非常に特異な領域、例えば５’調節領域内の１０個の特有のヌクレオチド、或いは特異性の低い領域、例えば特に３’コード化領域の何れかからなるプローブの特異性及びそのハイブリダイゼーション或いは増幅の厳密性（最大、高、中間或いは低）が、そのプローブがＨｕＫＩをコードする自然発生配列のみを同定するか、或いは関連する配列を同定するかを確定するであろう。またプローブは関連する配列の検出に用いることもでき、ＨｕＫＩをコードする配列の任意のものからのヌクレオチドの少なくとも５０％を含むことが好ましい。本発明のハイブリダイゼーションプローブはＤＮＡ或いはＲＮＡであり、配列番号：２のヌクレオチド配列に、或いはプロモータ、エンハンサエレメント及び自然発生ＨｕＫＩのイントロンを含むゲノム配列に由来する。ＨｕＫＩをコードするポリヌクレオチド配列は、ＨｕＫＩの発現に関連する障害の診断に用いることができる。そのような障害の例としては、消化性潰瘍、膵炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、胆嚢炎、過敏性大腸症候群、萎縮性胃炎、虚血／再潅流傷害、外傷後炎症、癌の炎症性合併症、結腸直腸ポリープ、腸管化生及び腺癌、白血病、リンパ脛、黒色腫及び肉腫を含む癌、詳細には結腸、直腸、小腸、膵臓、胃、肝臓、食道及び胆嚢のような消化器系の癌などがある。ＨｕＫＩをコードするポリヌクレオチド配列は、サザン分析或いはノーザン分析、ドットブロット、又は他の膜系技術において、又はＰＣＲ技術において、又は変更されたＨｕＫＩ発現を検出するために患者生検からの体液或いは組織を利用するディップスティック、ｐＩＮ、ＥＬＩＳＡ或いはチップ検定法において用いることができる。そのような定性的或いは定量的方法は当分野において周知である。特定の態様では、ＨｕＫＩをコードするヌクレオチド配列は、種々の癌、特に上記したような癌の活性化或いは誘発を検出する検定法において有用である。ＨｕＫＩをコードするヌクレオチド配列は標準的な方法において標識され、ハイブリダイゼーション複合体の形成に適した条件下で患者からの体液或いは組織サンプルに加えられることができる。適当な時間インキュベートした後、サンプルは洗浄され、そのシグナルが定量され、標準値と比較される。生検された或いは抽出されたサンプルのシグナルの量が比較制御サンプルのシグナルの量から著しく変更されている場合には、そのヌクレオチド配列はサンプル内のヌクレオチド配列とハイブリダイズされており、サンプル内のＨｕＫＩをコードするヌクレオチド配列の変更レベルの存在が関連する疾患の存在を示す。またそのような検定法を用いて、動物実験、臨床試験或いは個々の患者の治療をモニタする際に特定の治療措置の有効度を評価することができる。ＨｕＫＩの発現に関連する疾患を診断する基準を与えるために、発現に対する正常或いは標準値が確立される。これは、動物或いはヒトいずれかの正常な被検者から取り出された体液或いは細胞抽出物を、当分野で周知の複合体形成に適した条件下でＨｕＫＩをコードする配列或いはそのフラグメントと結合することにより与えられる。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な被検者から得られた値を、既知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが用いられる実験から得られた値と比較することにより定量することができる。正常サンプルから得られた標準値が、疾患の症状がある被検者のサンプルから得られた値と比較される。標準値と被検者値との間の偏差を用いて、疾患状態の存在を立証する。一度疾患が確定され、治療プロトコルが開始されれば、その患者の発現のレベルが正常な患者において観測されるレベルに接近し始めるか否かを評価するために、ハイブリダイゼーション検定法が規則的に繰り返される。継続的な検定法から得られる結果を用いて、数日から数ヶ月の期間に渡る治療の有効度を示すことができる。癌の場合、個々の患者からの生検組織内の異常な量の転写物の存在が、疾患の発生に対する素因を示すか、或いは実際の臨床的な症状が発生する前に疾患を検出するための手段を提供する。この種のより決定的な診断により、専門医は、予防措置或いは初期段階での積極的な治療を行うことができ、それにより癌の発生を予防したり、或いは進行するのを防げたりすることができる。ＨｕＫＩをコードする配列から設計されるオリゴヌクレオチドに対するさらなる診断的な使用は、ＰＣＲの使用を含む場合がある。そのようなオリゴマは化学的に合成されるか、酵素的に生成されるか、或いは組換え体源から生成されてもよい。オリゴマは、２つのヌクレオチド配列、すなわち１つがセンス方向（５’−＞３’）を有し、もう１つがアンチセンス方向（３ ’＜−５’）を有するヌクレオチド配列からなり、特異な遺伝子或いは条件の同定のために最適化された条件下で用いられることが好ましい。同一の２つのオリゴマ、入れ子状の組のオリゴマ、或いはオリゴマの縮重プールであっても、密接に関連するＤＮＡ或いはＲＮＡ配列を検出並びにまた定量するための低い厳密性条件下で用いることができる。またＨｕＫＩの発現を定量するために用いることができる方法は、ヌクレオチドの放射標識化或いはビオチン標識化、或いは制御核酸の相互増幅並びに実験結果を書き込める標準曲線を含む（Melby，P.C．等(1993)J.Immunol.Methods,159: 235-244;Duplaa,C.等(1993)Anal．Blochem.229-236）。多数サンプルを定量する速度は、ＥＬＩＳＡフォーマットの検定法を実行することにより加速することができ、その際対象のオリゴマは種々の希釈法において表され、スペクトル光計測反応或いは色計測反応が迅速な定量化をもたらすようになる。本発明の別の実施例では、ＨｕＫＩをコードする核酸配列を用いて、自然発生ゲノム配列をマッピングするために有用なハイブリダイゼーションプローブを生成することもできる。その配列は、周知の技術を用いて特定の染色体に、或いは染色体の特異領域に遺伝子座が決定されるようになる。そのような技術は、ＦＩＳＨ、ＦＡＣＳ、或いはPrice CM(1993;Blood Rev 7:127-34)及びTrask BJ(1991 ;Trends Genet 7:149-54)に記載されるような、酵母菌人工染色体、細菌性人工染色体、細菌性Ｐ１構造体或いは単一染色体ｃＤＮＡライブラリのような人工染色体構造を含む。ＦＩＳＨ（Verma等(1988)Human Chromosomes:A Manual of Basic Technioues,Pergamon Press,New York NYに記載される）は、他の物理的な染色体マッピング技術及び遺伝マップデータと相関をなす。遺伝子マップデータの例は1994 Genome Issue of Science(265:1981f)に見出すことができる。物理的染色体マップ上のＨｕＫＩをコードする遺伝子の位置と特定の疾患或いは特定の疾患に対する素因との間の相関は、その遺伝的疾患に関連するＤＮＡの領域の境界を定めることを可能にする。本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者と保菌者、すなわち感染した個体との間の遺伝子配列の差を検出することができる。染色体標本のｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び確立された染色体マーカを用いる連鎖分析のような物理的マッピング技術が、遺伝子マップを拡張するために用いることができる。マウスのような別の哺乳動物種の染色体上の遺伝子の配置が、特定のヒト染色体の数或いは腕が未知であっても、関連したマーカを明らかにできる場合もある。新規の配列は、物理的なマッピングにより染色体腕或いはその一部に割り当てることができる。これは、位置クローニング或いは他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を検索する研究者に貴重な情報を与える。一度疾患或いは症候群が、特定のゲノム領域、例えばATから11q22-23まで(Gat ti等(1998)Nature 336:577-580)への遺伝子連鎖により自然のまま局在されていれば、その領域に対する任意の配列マッピングが、さらなる研究のための関連或いは調節遺伝子を表すことができる。また本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常個体と保菌者、すなわち感染個体との間における転座、逆位等により染色体位置内の差を検出することができる。本発明の別の実施例では、ＨｕＫＩ、その触媒作用或いは免疫原性フラグメント又はオリゴペプチドを用いて、種々の薬物スクリーニング技術の任意のものにおいて化合物のライブラリをスクリーニングすることができる。そのようなスクリーニングにおいて用いられるフラグメントは溶液中に遊離するか、固形支持体に付着するか、細胞表面上に支持されるか、或いは細胞内に配置されてもよい。ＨｕＫＩと被試験薬剤との間に形成される結合複合体が測定される場合もある。薬物スクリーニングに用いる場合がある別の技術は、ＰＣＴ出願ＷＯ８４／０３５６４に記載されるような、対象のタンパク質への適当な結合親和性を有する化合物の高スループットスクリーニングを実現する。この方法では、ＨｕＫＩに適用されるような、多数の異なる小さな検査化合物がプラスチックピン或いはある他の表面のような固体基質上で合成される。検査化合物はＨｕＫＩ或いはそのフラグメントと反応し、洗浄される。その後結合されたＨｕＫＩが当分野で周知の方法により検出される。また精製されたＨｕＫＩは、上記の薬物スクリーニング技術において用いるためのプレート上に直接コーティングされることもできる。別法では、非中和性抗体を用いて、ペプチドを捕捉し、それを固体支持体上に固定化することができる。別の実施例では、ＨｕＫＩを特異に結合することができる中和性抗体がＨｕＫＩを結合するための検査化合物と競合する、競合薬物スクリーニングアッセイを使用する。この方法では、抗体を用いて、ＨｕＫＩと１つ或いはそれ以上の抗原決定基を共有するあらゆるペプチドの存在を検出することができる。さらに別の実施例では、その新規の技術が、限定はしないがトリプレット遺伝子コード及び特異な塩基対相互作用のような特性を含む現在知られているヌクレオチド配列の特性に依存する場合には、ＨｕＫＩをコードするヌクレオチド配列を、さらに発展していくあらゆる分子生物学技術において用いることができる。以下の例は、本発明を例示するために与えるものであり、本発明を制限するものではない。産業上の利用可能性ＩＣＯＬＮＮＯＴ０８ｃＤＮＡライブラリ構成ＣＯＬＮＮＯＴ０８ｃＤＮＡライブラリは、腸の別の部分における腺癌を除去するために左側結腸半切除をした６０歳白人男性から得られた微視的に正常な結腸組織から構成された。その患者には、血栓静脈炎、前立腺炎症性疾患及び直腸の切除の病歴があった。腸の腺癌に加えて、患者のリンパ節の１つには転移性腺癌があった。患者の家族の経歴には、母親にアテローム性硬化症及び兄弟に結腸の悪性腫瘍があった。凍結組織は、グアニジニウムイソチオシアネート溶液中でBrinkmann Homogeni zer Polytron PT-3000(Brinkmann Instruments，Westbury NJ)を用いて均質化、かつ溶解された。溶解生成物は５．７ＭＣｓＣＬ緩衝材上で、周囲温度において２５，０００ｍｉｎ^-1で１８時間Beckman L8-70M Ultracentrifuge(Beckman I nstruments)においてBeckman SW28ロータを用いて遠心分離された。ＲＮＡは、酸性フェノールｐＨ４．０を用いて抽出され、０．３M酢酸ナトリウム及び２．５体積のエタノールを用いて沈殿され、リボヌクレアーゼ遊離水内に再懸濁され、３７℃でデオキシリボヌクレアーゼ処理された。抽出及び沈殿は繰り返された。その後ＲＮＡはQlagen Oligotex kit(QIAGEN Inc．Chatsworth CA)を用いて分離され、ｃＤＮＡライブラリを構成するために用いられた。ｍＲＮＡは、SuperScript Plasmid System(Cat．No.18248-013:Gaithersburg ，MD)における推奨プロトコルに従って処理された。ＣＯＬＮＮＯＴ０８ｃＤＮＡはSepharose CL4B column(Cat.No.275105-01.Pharmacia)上で分割され、４００ｂｐを超えるｃＤＮＡはｐＩＮＣＹ１に結合された。その後プラスミドｐＩＮＣＹ１はDH5a（登録商標）形質転換受容性細胞(Cat.No.18258-012 Gibco/BRL)に形質転換された。ＩＩｃＤＮＡクローンの単離及び配列決定プラスミドＤＮＡは細胞から遊離され、REAL Prep 96 Plasmid Kit(Catalog N o.26173,QIAGEN,Inc.)を用いて精製された。推奨プロトコルを用いたが以下の点が異なる。１）細菌は、２５ｍｇ／Ｌのカルビンシリン及び０．４％のグリセロールを有する１ｍｌの無菌のTerrific Broth（Catalog No.22711.LIFE TECHNOLO GIES^TM）中で培養された。２）接種後、培養株は１９時間インキュベートされ、インキュベーション終了時に細胞は０．３ｍｌの溶解緩衝液で溶解された。３）イソプロパノール沈殿に続いて、プラスミドＤＮＡペレットが０．１ｍｌの蒸留水内に再懸濁された。プロトコルの最後のステップを終了した後、サンプルは４ ℃で保管するために９６−ウエルブロックに移された。ｃＤＮＡは、Peltier Thermal Cyclers(PTC200 from MJ Research，Watertown MA)及びApplied Biosystems 377 DNA Sequencing Systemsと共にHamilton Micr o Lab 2200(Hamilton,Reno NV)を用いて、Sanger F等(1975;J Mol Biol 94:441f )の方法により配列決定され、読み枠が確定された。ＩＩＩｃＤＮＡクローン及び推定されたタンパク質の相同性検索読み枠が確定された後に、配列表のヌクレオチド配列及びそれに由来するアミノ酸配列がGenBank、SwissProt,BLOCKS及びPima IIのようなデータベースに対する問合せ配列として用いられた。そのデータベースは以前に同定され、注釈を付けた配列を含んでおり、Basic Local Alignment Search Tool（Altschul(1993) 上記,Altschul(1990)上記）を表すＢＬＡＳＴを用いて相同性（類似性）の領域に対する検索が行われた。ＢＬＡＳＴはヌクレオチド及びアミノ酸配列の両方のアライメントを生成し、配列類似性を確定する。そのアライメントの局部的な性質のため、ＢＬＡＳＴは厳密な一致を判定する際に、或いは原核（細菌）又は真核（動物、真菌或いは植物）の起源の中の相同性を同定する際に特に有用であった。ここでSmith R.F及びT.F.smith(1992，Protein Engineering 5:35-51)に記載されるアルゴリズムのような他のアルゴリズムが参照して用いられており、主要配列パターン及び副次的な構造間隙の問題を取り扱う際に用いられた。本出願において開示される配列は少なくとも４９ヌクレオチドの長さを有し、不要な塩基は１２％以下である（この場合Ａ、Ｃ、Ｇ或いはＴではなくＮが記録される）。ＢＬＡＳＴアプローチは、Karlin等（上記）に詳述され、参照して本明細書において用いられており、問合せ配列とデータベース配列との間の一致を検索する。ＢＬＡＳＴは見い出されたあらゆる一致の統計的有意性を評価し、ユーザにより選択された有意性の閾値を満足する一致のみを報告する。この応用例では、閾値はヌクレオチドの場合１０^-25、ペプチドの場合１０^-14に設定された。インサイト社ヌクレオチド配列が霊長類（pri）、齧歯類（rod）及び他の哺乳類配列（mam）の場合のGenBankデータベースに対して検索され、その後同じクローンに由来するアミノ酸配列がGenBank機能タンパク質データベース、哺乳動物（mamp）、脊椎動物（vrtp）及び真核生物（eukp）に対して相同性を検索された。ある特定の一致に対して関連したデータベースがGixxx±pとして報告された( ここでxxxはpri、rod等であり、存在する場合にはｐはペプチドである)。ＩＶノーザン分析ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技術であり、特定の細胞種或いは組織からのＲＮＡが結合されている膜への標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う（Sambrook等、上記）。ＢＬＡＳＴ（Altschul SF 1993及び1990上記）を用いる類推コンピュータ技術（analogous computer technique）を用いて、GenBank或いはLIFESEQ^TM databas e(Incyte Pharmaceuticals)のようなヌクレオチドデータベース内の同じ分子或いは関連する分子を検索する。この分析は多数の膜系ハイブリダイゼーションより非常に速度が速い。さらにコンピュータ検索の感度を変更して、任意の特定の一致が、厳密な一致、或いは相同的一致の何れとして分類されるかを確定することができる。検索の基準は、（％配列密度×％最大ＢＬＡＳＴスコア）／１００として定義される積スコアである。積スコアは、２つの配列間の類似度及び配列一致の長さの両方を考慮する。例えば、積スコア４０の場合、その一致は１−２％誤差の範囲内で正確であり、７０ではその一致は正確であろう。相同性の分子は通常、１５−４０間の積スコアを示す分子を選択することにより同定されるが、それより低いスコアでも関連した分子が同定される場合もある。ノーザン分析の結果は、ＨｕＫＩをコードする転写物が発生するライブラリのリストとして報告される。また存在量及び存在比も報告される。存在量は、特定の転写物がｃＤＮＡライブラリ内に現れる回数を直接表し、存在率は、存在量をｃＤＮＡライブラリ内で試験された配列の全数で割った値である。ＶＨｕＫＩをコードするポリヌクレオチドの伸展インサイト社クローン１８４３６９２或いは配列番号：２の核酸配列を用いて、部分ヌクレオチド配列を完全長まで伸展するか、或いはゲノムライブラリから５'又は３’、イントロン或いは他の制御配列を得るためのオリゴヌクレオチドプライマを設計する。１つのプライマを合成して、アンチセンス方向（ＸＬＲ）に伸展を開始し、他のプライマを合成して、センス方向（ＸＬＦ）に配列を伸展する。プライマを用いて、対象の領域に対する新規で未知のヌクレオチド配列を含むアンプリコンを「外側に」発生させる既知の配列の伸展を容易にする。初期プライマは、OLIGO 4.06(National Biosciences)或いは他の適当なプログラムを用いてｃＤＮＡから設計され、長さ２２−３０のヌクレオチドになり、５０％以上のＧＣ含有物を有し、約６８−７２℃の温度で標的配列にアニーリングする。ヘアピン構造及びプライマ−プライマ２量体化をもたらすことになるヌクレオチドのあらゆる伸長は避けられる。元の選択されたｃＤＮＡライブラリ或いはヒトゲノムライブラリを用いて配列を伸展する。後者は５’上流領域を得るのに最も有用である。さらに伸展が必要或いは要望される場合には、既知領域をさらに伸展させるために、追加のプライマの組が設計される。 XL-PCR kit(Perkin Elmer)の取扱説明書に従って、完全に酵素及び反応混合物を混合することにより、高い忠実度の増幅が得られる。各プライマを４０ｐｍｏｌで、かつキット全ての他の成分を推奨された濃度で開始する際に、ＰＣＲはPe ltier Thermal Cycler(PTC200;MJ Research,Watertown MA)及び以下のパラメータを用いて実行される。ステップ１１分間９４℃（初期変性）ステップ２１分間６５℃ ステップ３６分間６８℃ ステップ４１５秒間９４℃ ステップ５１分間６５℃ ステップ６７分間６８℃ ステップ７さらに１５サイクル間ステップ４−６の繰返しステップ８１５秒間９４℃ ステップ９１分間６５℃ ステップ１０７分１５秒間６８℃ ステップ１１１２サイクル間ステップ８−１０の繰返しステップ１２８分間７２℃ ステップ１３４℃（保持）反応混合物の５−１０μｌ部分標本が低濃度（約０．６−０．８％）アガロースミニゲル上で電気泳動法により分析され、どの反応物が配列の伸展に成功したかを判定する。最も大きな生成物を含むと考えられる帯が選択され、そのゲルから取り出される。さらに精製は、QIA Quick^TM(QIAGEN Inc.Chatsworth，CA)のような市販のゲル抽出方法を使用することを含む。ＤＮＡを回収した後、クレノウ酵素を用いて、再連結及びクローニングを容易にするブラントエンドを生成する一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを切除する。エタノール沈殿後、その生成物は１３μｌの連結緩衝液中に再溶解され、１μ ｌＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５ユニット）及び１μｌＴ４ポリヌクレオチドキナーゼが加えられ、その混合物は２〜３時間室温で、或いは１６℃で一晩の間インキュベートされる。コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（４０μｌの適当な媒質内にある）が３μｌの連結混合物と形質転換され、８０μｌのＳＯＣ媒質内で培養される（Sambrook J等、上記）。３７℃で１時間インキュベートした後、全形質転換混合物が、２ｘＣａｒｂを含むLuria Bertani(LB)-agar(Sambrook J等、上記) 上に蒔かれる。翌日、いくつかのコロニーが各プレートから無作為に選び取られ、適当な市販の無菌の９６ウエル微量定量プレートの個々のウエル内に配置される１５０μｌの液体ＬＢ／２ｘＣａｒｂ媒質内で培養される。その翌日、各５μｌの一晩おいた培養株が有菌の９６ウエルプレートに移され、水で１：１０に希釈された後、５μｌの各サンプルがＰＣＲアレイ内に移される。ＰＣＲ増幅の場合、４ユニットのｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ベクタプライマ及び伸展反応のために用いられる１つ或いは両方の遺伝子特異性プライマを含む１８μｌの濃縮ＰＣＲ反応混合物（３．３ｘ）が各ウエルに加えられる。増幅は以下の条件で実行される。ステップ１６０秒間９４℃ ステップ２２０秒間９４℃ ステップ３３０秒間５５℃ ステップ４９０秒間７２℃ ステップ５さらに２９サイクルの間ステップ２−４の繰返しステップ６１８０秒間７２℃ ステップ７４℃（保持）ＰＣＲ反応物の部分標本が、分子重量マーカと共にアガロースゲル上で処理される。ＰＣＲ生成物の大きさが、元の部分ｃＤＮＡと比較され、適当なクローンが選択され、プラスミドに連結され、そして配列決定される。ＶＩハイブリダイゼーションプローブの標識化及び使用配列番号：２に由来するハイブリダイゼーションプローブが、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ或いはｍＲＮＡをスクリーニングするために用いられる。約２０塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識化が特に記載されるが、より大きなｃＤＮＡフラグメントにも概ね同じ手順が用いられる。オリゴヌクレオチドは、OLIGO 4.06(National Biosciences)のような当分野で用いられるソフトウエアにより設計され、５０ｐｍｏｌの各オリゴマと２５０μＣｉの[ γ-³²Ｐ]アデノシン三リン酸(Amersham)及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ(DuP ont NEN(登録商標),Boston MA)とを組み合わせることにより標識される。標識されたオリゴヌクレオチドは、Sephadex G-25 super fine resin column(Pharmaci a&Upjohn)を用いて実質的に精製される。センス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドをそれぞれ毎分１０⁷カウント含む部分は、エンドヌクレアーゼ(Ase I,Bg l Il,Eco RI,Pst I,Xba 1.或いはPvu II、DuPont NEN(登録商標))の１つを用いて消化されるヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜系ハイブリダイゼーション分析において用いられる。各消化物からのＤＮＡは、０．７％アガロースゲルにおいて分画され、ナイロン膜(Nytran Plus,Schleicher & Schuell,Durham NH)に転写される。ハイブリダイゼーションは４０℃で１６時間実行される。非特異性シグナルを除去するために、ブロットは、０．１×クエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウムまでの徐々に厳密性を増す条件下で室温にて連続して洗浄される。XO MAT AR^TM film(Kodak，Rochester NY)が数時間Phosphoimager cassette(Molecul ar Dynamics，Synnyvale CA)内でブロットに露光された後、ハイブリダイゼーションパターンが視覚的に比較される。ＶＩＩアンチセンス分子ＨｕＫＩをコードする配列或いはその任意の一部のアンチセンス分子又は補体を用いて、自然発生ＨｕＫＩのｉｎｖｉｖｏ及びｉｎｖｉｔｒｏ発現を抑制する。約２０塩基対を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用が特に記載されるが、より大きなｃＤＮＡフラグメントにも概ね同じ方法が用いられる。第１図に示されるようなＨｕＫＩをコードする配列に基づくオリゴヌクレオチドを用いて、自然発生ＨｕＫＩの発現を抑制する。相補性オリゴヌクレオチドは、第１図に示されるような最も特有な５’配列から設計され、プロモータが上流非翻訳化配列に結合するのを防ぐことにより転写を抑制するか、或いはリボソームが結合するのを防ぐことにより、ＨｕＫＩをコードする転写物の翻訳を抑制するかのいずれかに用いられる。配列番号：２のシグナル及び５’配列の適当な一部を用いる際に、有効なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、第１図に示されるようなポリペプチドのシグナル或いは５’コード化配列に翻訳する領域に及ぶ任意の１５−２０ヌクレオチドを含む。ＶＩＩＩＨｕＫＩの発現ＨｕＫＩの発現は、適当なベクタ内にｃＤＮＡをサブクローニングし、ベクタを宿主細胞に形質転換することにより達成される。この場合に、ｃＤＮＡライブラリの発生のために用いられるクローニングベクタを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ内でＨｕＫＩを発現する。クローニング部位の上流では、このベクタはβ−ガラクトシダーゼのためのプロモータを含み、アミノ末端Ｍｅｔ及びそれに後続するβ− ガラクトシダーゼの７残基を含む配列が後続する。これらの８残基の直後は、転写のために有用なバクテリオファージプロモータ及びいくつかの特有の制限部位を含むリンカーである。標準的な方法を用いてＩＰＴＧを有する分離され、形質転換された細菌株の誘発は、β−ガラクトシダーゼの最初の８残基、リンカーの約５〜１５残基及び完全長タンパク質からなる融合タンパク質を生成する。シグナル残基は、バクテリア成長媒質内へのＨｕＫＩの分泌を促す。ＩＸＨｕＫＩ活性の例示ＨｕＫＩをコードするポリヌクレオチド配列は、哺乳類ベクタ内に配置され、肝臓癌細胞に形質転換された。細胞及び培養抽出物においてＩＬ−２を用いて剌激する場合及び刺激しない場合において一時的な発現が定量される。位相差顕微鏡を用いて、細胞分裂の速さが、形質転換された肝臓癌細胞及び形質転換されない肝臓癌細胞集団においてモニタされ、選択された放射標識アミノ酸を培地に与えた後に、細胞内ＨｕＫＩ活性の部位がその同じ細胞のオートラジオグラフィを用いて検査される。ｃＡＭＰターンオーバの速度に対するＨｕＫＩ発現の影響が、γ標識³²Ｐ−ＡＴＰからの放射活性³²Ｐを供給するパルスチェイス実験及びγラジオアイソトープカウンタを用いて形質転換された細胞及び形質転換されない細胞において検査される。その細胞は３７℃でインキュベートされ、細胞の収集時間にトリクロロ酢酸を加えることにより酵素反応が終了される。酸抽出物は中和され、ゲル電気泳動にかけ、一リン酸、二リン酸及び三リン酸ヌクレオチド画分を分離する。一リン酸画分が切除され、カウントされる。形質転換集団と非形質転換集団との間で回収される放射活性の差は、一時的に発現したＨｕＫＩによるｃＡＭＰの調節に比例する。ＸＨｕＫＩ特異性抗体の生成ＰＡＧＥ電気泳動法(Sambrook、上記)、或いは他の精製技術を用いて実質的に精製されるＨｕＫＩを用いて、ウサギを免疫し、標準的なプロトコルを用いて抗体を生成する。配列番号：２に由来するアミノ酸配列は、DNAStar software(DNA Star Inc)を用いて分析され、免疫原性の高い領域を確定し、対応するオリゴポリペプチドを合成かつ使用して、当業者に知られた手段により抗体を産生させる。Ｃ−末端付近、或いは親水性領域内にあるような適当なエピトープの選択は、Ausube等（上記）などに記載される。典型的にはオリゴペプチドは長さ１５残基で、ｆｍｏｃ（フルオレニルメトキシカルボニル）化学作用を用いるApplied Biosystems Peptide Synthesizer Mod el 431Aを用いて合成され、M-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester（ MBS:Ausubel等、上記）と反応することによりキーホールリンペットヘモシアニン(KLH，Sigma，St.Louis，MO)に結合される。ウサギは、完全なフロイントアジュバント内でオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体で免疫される。その結果生じる抗血清は、例えば、プラスチックにペプチドを結合し、１％ＢＳＡで遮断し、ウサギ抗血清と反応させ、洗浄し、さらに放射ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させることにより、抗ペプチド活性に対して検査される。ＸＩ特異性抗体を用いる自然発生ＨｕＫＩの精製自然発生或いは組換え体ＨｕＫＩは、ＨｕＫＩに対して特異な抗体を用いる免疫親和性クロマトグラフィにより実質的に精製される。免疫親和性カラムが、ＨｕＫＩ抗体を、CnBr-activated Sepharose(Pharmacia & Upjohn)のような活性化されたクロマトグラフ樹脂に共有結合することにより構成される。結合後、製造者の取扱説明書に従って樹脂は遮断及び洗浄される。ＨｕＫＩを含む媒質を免疫親和性カラム上を通過させ、カラムは、ＨｕＫＩを選択吸収させる条件下（例えば洗浄剤中に高イオン強度緩衝剤を入れたもの）で洗浄される。カラムは、抗体／ＨｕＫＩ結合を分裂させる条件下（ｐＨ２−３の緩衝剤或いは尿素或いはチオシアネートイオンのような高濃度のカオトロープ）で溶離され、ＨｕＫＩが回収される。ＸＩＩＨｕＫＩと相互作用する分子の同定ＨｕＫＩ或いはその生物学的活性フラグメントは、¹²⁵I Bolton-Hunter reage nt(Bolton AE and Hunter WM(1973)Biochem J 133:529)を用いて標識される。９６ウエルプレートのウエル内に以前に配列された候補分子が、標識されたＨｕＫＩでインキュベートされ、洗浄され、標識されたＨｕＫＩ複合体を有する任意のウエルが検定される。種々のＨｕＫＩ濃度から得られたデータを用いて、数、親和性及びＨｕＫＩと候補分子との関係を示す値を計算する。上記明細書中に記載された全ての特許出願及び特許は参照して本明細書の一部としている。記載された本発明の方法及びシステムの種々の変更例及び変形例は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく当業者には明らかとなろう。本発明は特定の好適な実施例に関連して記載されてきたが、請求される本発明はそのような特定の実施例に不当に制限されるべきでないことを理解されたい。実際に、本発明を実施するために記載された形態の種々の変更例は、分子生物学或いは関連する分野の当業者には明らかであり、以下の請求の範囲内に入るものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 1/00 Ｃ０７Ｋ 14/81 35/00 16/38 Ｃ０７Ｋ 14/81 Ｃ１２Ｎ 1/21 16/38 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＭＣ１２Ｑ 1/68 ＤＧ０１Ｎ 33/53 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＩＬ，ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＲＵ，ＳＥ，ＳＧ，ＵＳ (72)発明者シャー、パルビアメリカ合衆国カリフォルニア州94087・サニーベイル・＃５・クイーンシャルロットドライブ 1608

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号：１のアミノ酸配列或いはそのフラグメントを含む実質的に精製されたヒト腫瘍関連Ｋａｚａｌインヒビタ。２．請求項１のヒト腫瘍関連Ｋａｚａｌインヒビタをコードする単離され、精製されたポリヌクレオチド配列。３．請求項２のポリヌクレオチド配列に厳密性条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列。４．請求項２のポリヌクレオチド配列を含むハイブリダイゼーションプローブ。５．配列番号：２或いはその変異体を含む単離され、精製されたポリヌクレオチド配列。６．請求項２のポリヌクレオチド配列或いはその誘導体に相補性を有するポリヌクレオチド配列。７．請求項６のポリヌクレオチド配列を含むハイブリダイゼーションプローブ。８．請求項２のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクタ。９．請求項８のベクタを含む宿主細胞。１０．配列番号：１のアミノ酸配列を含むポリペプチドを精製するための方法であって、前記方法が、ａ）ポリペプチドの発現に適した条件下で請求項９の宿主細胞を培養する過程と、ｂ）宿主細胞培地株からポリペプチドを回収する過程とを有することを特徴とする方法。１１．適当な医薬品担体と共に配列番号：１のアミノ酸配列を含む実質的に精製されたヒト腫瘍関連Ｋａｚａｌインヒビタを含む医薬品組成物。１２．請求項１のポリペプチドに特異に結合する精製された抗体。１３．請求項１のポリペプチドに特異に結合し、その活性を調節する精製されたアンタゴニスト。１４．請求項１１の医薬品組成物の有効量を、治療を要する被検者に投与する過程を含むプロテアーゼ媒介性組織破壊を治療するための方法。１５．請求項１３のアンタゴニストの有効量を、その治療を必要とする被検者に投与することを含む細胞増殖に関連する疾患を治療するための方法。１６．生体サンプルにおいてヒト腫瘍関連Ｋａｚａｌインヒビタをコードするポリヌクレオチドの検出するための方法であって、ａ）請求項６のポリヌクレオチドを生体サンプルの核酸物質にハイブリダイズし、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程とを有し、前記ハイブリダイゼーション複合体の存在が前記生体サンプルのヒト腫瘍関連Ｋａｚａｌインヒビタをコードするポリヌクレオチドの存在に相関をなすことを特徴とする方法。