BR112015022375B1 - Imunógenos isolados de proteína f de rsv e seu uso, partícula similar a vírus, nanopartícula de proteína, molécula de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira isolada bacteriana ou de levedura, composição imunogênica e kit - Google Patents

Abstract

PROTEÍNAS F DE RSV PRÉ-FUSÃO E SEU USO. São descritos antígenos do Vírus Sincicial Respiratório (RSV) que incluem uma proteína F de RSV recombinante esta bilizada em uma conformação pré-fusão. Também são descritos ácidos nucleicos que codificam os antígenos e métodos de produção dos antígenos. Métodos para a geração de uma resposta imune em um indivíduo também são descritos. Em algumas modalidades, o método é um método para o tratamento ou a prevenção de uma infecção por RSV em um indivíduo por meio de administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do antígeno ao indivíduo.

Description

PEDIDO RELACIONADO

[0001] O presente pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório dos Estados Unidos N° 61/ 780,910, depositado em 13 de Março de 2013, N° 61/798.389, depositado em 15 de Março de 2013, N° 61/857,613, depositado em 23 de Julho de 2013 e N° 61/863,909, depositado em 9 de Agosto de 2013, cada um dos quais é aqui incorporado por referência na íntegra.

CAMPO

[0002] A presente descrição se refere a polipeptídeos, polinucleotídeos, composições e métodos para seu uso para estimulação e detecção de uma resposta imune ao vírus sincicial respiratório (RSV).

ANTECEDENTES

[0003] O vírus sincicial respiratório (RSV) é um vírus de RNA com envoltório não segmentado fita negativa da família Paramyxoviridae, gênero Pneumovirus. Ele é a causa mais comum de bronquiolite e pneumonia em crianças no primeiro ano de vida. O RSV também provoca infecções repetidas, incluindo doença do trato respiratório inferior grave, as quais podem ocorrer em qualquer idade, especialmente entre idosos ou aqueles com sistema cardíaco, pulmonar ou imune comprometidos. Atualmente, a imunização passiva é usada para prevenir a doença grave causada pela infecção por RSV, especialmente em crianças com prematuridade, displasia broncopulmonar ou doença cardíaca congênita. O tratamento atual inclui a administração de um anticorpo neutralizante de RSV, Palivizumabe (SYNAGIS®; MedImmune, Inc.), o qual se liga a um epitopo conformacional linear de 24 aminoácidos na proteína de fusão (F) de RSV.

[0004] Na natureza, a proteína F de RSV é inicialmente expressa como um precursor polipeptídico único, designado F0. F0 trimeriza no retículo endoplasmático e é processado por uma protease celular de tipo furina em dois sítios conservados, gerando os polipeptídeos F1, F2 e Pep27. O polipeptídeo Pep27 é excisado e não faz parte da proteína F madura. O polipeptídeo F2 se origina a partir da porção N-terminal do precursor F0 e se liga ao polipeptídeo F1 através de duas ligações de dissulfureto. O polipeptídeo F1 se origina a partir da porção C-terminal do precursor F0 e ancora a proteína F madura na membrana através de um domínio transmembrana, o qual está ligado a uma cauda citoplasmática de 24 aminoácidos. Três promotores do heterodímero F2-F1 se montam para formar uma proteína F madura, a qual adota uma conformação pré-fusão metaestável que é disparada para sofrer uma alteração conformacional que funde as membranas celulares do vírus e do alvo. Em virtude de seu papel obrigatório na entrada em RSV, a proteína F de RSV é o alvo de anticorpos neutralizantes e o objeto de desenvolvimento de vacinas; no entanto, assim como outros antígenos de RSV, os esforços anteriores para desenvolver uma vacina com base em proteína F de RSV não têm tido sucesso.

SUMÁRIO

[0005] Conforme descrito aqui, a estrutura tridimensional da proteína F de RSV em sua conformação pré-fusão foi elucidada. A descrição revela, pela primeira vez, os detalhes a nível atômico da conformação pré-fusão F de RSV, a qual apresenta um sítio antigênico único ("sítio antigênico 0") em seu ápice distal da membrana. Usando a estrutura tridimensional da pré-fusão F como um guia, formas de pré- fusão F (antígenos "PreF") estabilizadas foram concebidas e construídas e usadas para gerar respostas imunes neutralizantes de RSV muitas vezes maiores do que aquelas alcançadas com base em imunógenos com base em proteína F de RSV e as quais conferem proteção contra o desafio por RSV em modelos animais. Os antígenos PreF podem ser usados, por exemplo, tanto como vacinas potenciais contra o RSV quanto moléculas diagnósticas.

[0006] Proteínas F de RSV recombinantes isoladas que são estabilizadas em uma conformação pré-fusão, bem como moléculas de ácido nucleico que codificam as proteínas F de RSV recombinantes são descritas. Em várias modalidades, as proteínas F de RSV recombinantes são estabilizadas em uma conformação pré-fusão que se pode se ligar especificamente a um anticorpo específico pré-fusão, tais como os anticorpos D25, 5C4, AM22 e/ou MPE8. Em várias modalidades, a proteína F de RSV recombinante compreende um sítio antigênico 0 que compreende os resíduos 62-69 e 196-209 de uma sequência de proteína F de RSV, tal como SEQ ID NO: 370. Em algumas modalidades, o imunógeno pode se ligar especificamente ao anticorpo após o imunógeno ser incubado a 20°C em solução salina tamponada com fosfato em pH fisiológico durante pelo menos 24 horas na ausência do anticorpo. Em outras modalidades, o imunógeno pode formar uma população homogênea quando dissolvido em uma solução aquosa, em que pelo menos 90% do imunógeno na população podem se ligar especificamente ao anticorpo específico pré-fusão.

[0007] Em algumas modalidades, os polipeptídeos F1 e F2 compreendem as posições 62-69 e 196-209 de proteína F de RSV, respectivamente e o polipeptídeo F2 compreende ou consiste nos resíduos 8-84 das posições 26-109 de proteína F de RSV e o polipeptídeo F1 compreende ou consiste nos resíduos 14-393 das posições 137-529 de proteína F de RSV, em que as posições de proteína F de RSV correspondem à sequência de aminoácidos de um polipeptídeo F0 de referência apresentado como SEQ ID NO: 124.

[0008] Em várias modalidades, a proteína F de RSV recombinante inclui uma ou mais substituições de aminoácidos que estabilizam a proteína na conformação pré-fusão, por exemplo, que estabilizam a porção distal de membrana da proteína F (incluindo a região N-terminal do polipeptídeo F1) na conformação pré-fusão. Por exemplo, a substituição de aminoácidos pode introduzir uma ligação de dissulfureto não natural ou pode ser uma substituição de aminoácidos de preenchimento de cavidade. Em várias modalidades, a proteína F de RSV recombinante inclui substituições S155C e S290C que formam uma ligação de dissulfureto não natural que estabiliza a proteína em uma conformação pré-fusão; isto é, em uma conformação que se liga especificamente a um ou mais anticorpos específicos pré-fusão e/ou apresenta um sítio antigênico, tal como o sítio antigênico 0, que está presente na conformação pré-fusão, mas não pós-fusão da proteína F de RSV. Em outras modalidades, a proteína F de RSV recombinante pode incluir ainda uma substituição F, G, W, Y, H ou M na posição 190, posição 207 ou posições 190 e 207. Em um exemplo não limitativo, a proteína F de RSV recombinante inclui substituições S155C, S290C, S190F e V207L (dita aqui como "DSCav1").

[0009] Em modalidades adicionais, a proteína F de RSV recombinante pode incluir uma ou mais modificações no C-terminal do polipeptídeo F1 (tais como truncamentos e substituições de aminoácidos) as quais, em conjunto com modificações que estabilizam a região distal da membrana do polipeptídeo F, podem aumentar a estabilização da proteína F recombinante na conformação pré-fusão. Modificações exemplificativas incluem ligação do polipeptídeo F1 a um domínio de trimerização (tal como um domínio Foldon) ou introdução de um ou mais resíduos de cisteína na região C-terminal do polipeptídeo F1 (por exemplo, nas posições 512 e 513) que pode formar ligações de dissulfureto interprotômero.

[0010] O antígeno PreF pode ser incluído sobre uma nanopartícula de proteína ou sobre uma partícula similar a vírus. Moléculas de ácido nucleico que codificam os antígenos PreF são também descritas. Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante que é uma proteína F de RSV com uma única cadeia.

[0011] Modalidades adicionais incluem uma proteína de epitopo- arcabouço que inclui as posições 62-69 e 196-209 de proteína F de RSV ou uma permutação circular da mesma ligado a uma proteína de arcabouço heteróloga, em que a proteína de epitopo-arcabouço se liga especificamente a um anticorpo específico pré-fusão.

[0012] Composições que incluem os antígenos PreF, nanopartículas de proteína, molécula de ácido nucleico ou vetor também são fornecidas. A composição pode ser uma composição farmacêutica adequada para administração a um indivíduo e pode também estar contida em uma forma de dosagem unitária. As composições podem incluir adicionalmente um adjuvante.

[0013] Métodos de geração de uma resposta imune em um indivíduo são descritos, bem como métodos de tratamento, inibição ou prevenção de uma infecção por RSV em um indivíduo. Em algumas modalidades dos métodos, a um indivíduo, tal como um indivíduo humano ou bovino, é administrada uma quantidade eficaz de um antígeno e/ou uma molécula de ácido nucleico descrita que codifica um antígeno descrito. Em algumas modalidades, os métodos incluem administração de uma composição imunogênica, incluindo um adjuvante selecionado para induzir a uma resposta imune Th1 em um indivíduo. Em modalidades adicionais, os métodos incluem uma imunização de reforço usando proteínas F de RSV de subtipo A humano e subtipo B humano estabilizadas em uma conformação pré-fusão com as modificações descritas aqui. Métodos para detecção ou isolamento de um anticorpo de ligação de RSV em um indivíduo infectado com RSV são descritos. Em algumas modalidades, as proteínas F de RSV recombinantes podem ser usadas para detectar e quantificar anticorpos alvo em uma resposta de soro policlonal.

[0014] Os objetivos, características e vantagens precedentes e outros das modalidades se tornarão mais evidentes a partir da descrição detalhada a seguir, a qual prossegue com referência às figuras anexas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0015] As Figuras 1A-1C são um conjunto de gráficos e um diagrama que ilustram a neutralização de RSV, o reconhecimento de glicoproteína F e a estrutura cristalina do anticorpo humano D25 em complexo com o trímero de proteína F de RSV pré-fusão. A conformação pré-fusão F de RSV é metastável e, quando expressa em uma forma solúvel, aceita prontamente o estado pós-fusão; uma série de anticorpos potentes, incluindo D25, se ligam a um sítio antigênico recentemente descrito na parte superior da glicoproteína F pré-fusão. (A) Neutralização de RSV por anticorpos, incluindo palivizumabe, o anticorpo profilático aprovado pela FDA para prevenir doença grave pelo RSV. (B) Ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) para medir a ligação do anticorpo à glicoproteína F pós-fusão. (C) Estrutura do trímero D25-RSV em representações de fita e superfície molecular. Um protômero do trímero da glicoproteína F é mostrado como fitas. Superfícies moleculares são mostradas para os outros dois protômeros F. O Fab D25 ligado ao protômero F mostrado em fitas também é exibido na representação de fita, com cadeia pesada sombreada em cinza escuro e cadeia leve sombreada em cinza claro. Os outros Fabs D25 são sombreados também, mas mostrados na representação de superfície.

[0016] As Figuras 2A e 2B são diagramas de um conjunto e uma sequência alinhada com a estrutura secundária de RSV que ilustra o rearranjo estrutural de RSV F. Para mediar a entrada de vírus-célula, as transições da glicoproteína F de RSV a partir de uma conformação pré- fusão metaestável para um conformação pós-fusão estável. (A) pré- fusão e pós-fusão estruturas. Exposição pré-fusão imagens (esquerda) e pós-fusão (direita) Estruturas triméricos, sombreada a mesma que na Figura 1C. Um glicana complexo, mostrado como paus, é modelado em cada um dos três sítios de glicosilação ligados a TV encontrados na proteína madura. Imagens interiores exibir um único protômero RSV F em representação da fita. (B) sequência F de RSV e da estrutura secundária. Os sítios de glicosilação N-ligada estão realçadas por triângulos pretos, os sítios antigênicos são rotuladas e setas para baixo indicam a posição dos sítios de clivagem da furina. Estruturas secundárias são mostrados por baixo da sequência (SEQ ID NO: 370), com cilindros que representam uma hélices e as setas representam fitas β. Resíduos desordenadas ou ausentes são indicados por um "X"; resíduos que se movem ao longo de entre pré-fusão e pós-fusão conformações mostrado com sombra cinzenta e são encaixotados.

[0017] As Figuras 3A-3C apresentam um conjunto de esquemas e de um alinhamento de sequências que ilustra a interface com D25 F de RSV. Anticorpo D25 se liga a um epitopo que abrange dois quaternário protômeros no ápice do trímero pré-fusão F. (A) Close-up da interface entre D25 e cadeias laterais de RSV F. F resíduos que interagem com D25 são rotulados e mostrado como varas. Átomos de oxigênio são sombreados cinza claro e átomos de nitrogênio são sombreados cinza escuro. As ligações de hidrogênio são descritos como linhas pontilhadas. As duas imagens são relacionadas por uma rotação de 90 ° em torno do eixo vertical. (B) Posição e conformação do epitopo sobre os D25 pré-fusão e pós-fusão F moléculas. F de RSV resíduos na interface D25 são mostrados. Polaridade de A4 e a5post indicado com setas, com fragmento N- e C-terminais indicado. (C) conservação da sequência de F resíduos em regiões reconhecidas pela D25. Os aminoácidos em humano RSV de subtipo B (HRSV/B) ou RSV bovino (BRSV), que diferem do HRSV/A encontram-se sublinhados. Ectodomínio é definido como F, os resíduos 26-109 e 137-524.

[0018] As Figuras 4A-4D são gráficos de série e imagens digitais relativos sítio antigênico 0. anticorpos neutralizadores de RSV altamente eficazes como alvo um sítio no vértice da membrana distal do trímero pré-fusão F. (A) A capacidade de anticorpos para bloquear a ligação às células infectadas com RSV D25 foi medida como uma função da concentração de anticorpo. (B) Análise do RSV F/complexos de Fab por microscopia eletrônica de coloração negativa: (Esquerda) reprojeção de um 12 Uma fatia através da estrutura cristalina do RSV F + D25 Fab filtrada para 10 A resolução e cortado para incluir a cavidade F-trímero. (Médio) Alinhado média de 263 partículas de RSV F + D25 Fab. (Direito) Alinhado média de 550 partículas de RSV F + AM22 Fab. Barra de escala no painel do meio é de 50 A. (C) inibição da fusão e da atividade de inibição (D) de fixação para os anticorpos dirigidos sítio antigênico 0 e F-específicos anticorpos dirigidos contra outros sítios antigênicos. Para o ensaio de inibição da fixação, a heparina foi usada como um controle positivo.

[0019] A Figura 5 mostra um diagrama esquemático que ilustra os métodos usados para expressar os complexos de F de RSV e D25. Os plasmídeos que expressam F de RSV (+) DC (F círculo), a cadeia leve D25 (L círculo) e a cadeia pesada D25 (com ou sem um códon terminal na região de charneira, H círculo) foram simultaneamente transfectadas em células HEK293 em suspensão. Alternativamente, a F de RSV (+) Fd plasmídeo pode ser transfectado, com D25 purificados Fab ou IgG adicionado às células 3 horas após a transfecção. Os melhores rendimentos foram obtidos por simultaneamente expressando F e D25 Fab (-1,0 mg de complexo purificado por litro de células).

[0020] A Figura 6 mostra um conjunto de diagramas da fita que ilustra a comparação de D25 ligado a F de RSV para PIV5 pré-fusão. Representação F. fita de RSV-ligada D25 F(+)Fd (esquerda) e PIV5 F- GCNt (à direita). Há uma concordância excelente de elementos de estrutura secundária entre as duas proteínas, apesar de ter apenas 12% de identidade de sequência. Uma das diferenças mais marcantes é a localização do peptídeo de fusão (N-terminal da subunidade F1), também mostrada na Figura 7. A estrutura PIV5 F foi descrito como consistindo em três domínios: I, II e III (Yin et al, Nature, 439, 38 (2006)). Domínio III denominado da membrana do lobo distal, enquanto que os domínios I e II englobam o tambor central e proximal de membrana do lobo. A estrutura aqui mostrada PIV5 clivado foi gerado a partir de PDB ID: 4GIP (Welch et al, Proc. Natl. Acad. ScL, U.S.A. 109, 16672 (2012)), influenza HA (PDB ID: 2HMG; Wilson et al, Nature, 289, 366 (1981)) and Ebola GP (PDB ID: 3CSY; Lee et al, Nature, 454, 177 (2008)).

[0021] A Figura 7 mostra uma série de diagramas que ilustram glicoproteínas virais pré-fusão de tipo I. Estruturas pré-fusão de F RSV F, PIV5 F (PDB ID: 4GIP são mostradas como superfícies moleculares, com cada protômero coloridos de forma diferente na linha inferior, uma esfera é mostrada para o resíduo C-terminal de F2 (RSV e PIV5) ou Hai (Gripe) e uma esfera é mostrado para o resíduo N-terminal do peptídeo de fusão. O RSV e PIV5 são ambos paramixovírus e suas proteínas F - 12 partilhar % de identidade de sequência. Apesar de Ebola GP é uma proteína de tipo I de fusão, que carece de um peptídeo livre N-terminal de fusão em GP2 e em vez disso contém um loop de fusão interno que é frequentemente observado em proteínas de fusão de tipo II e tipo III. Assim, o Ebola GP foi omitido da comparação peptídeo de fusão.

[0022] A Figura 8 é um conjunto de gráficos relativos Neutralização de RSV por IgG e Fab. D25, AM22 e Motavizumabe neutralizar RSV igualmente bem como IgG ou Fab. Note que o eixo-x para a trama Motavizumabe é diferente do que os outros.

[0023] As Figuras 9A e 9B são diagramas de uma série de gráficos que ilustram e propriedades de sítios antigênicos na glicoproteína F de RSV. Apenas os anticorpos dirigidos ao sítio antigênico 0 se ligam especificamente à conformação pré-fusão e tem excepcional potência de neutralização. (A) Para o sítio de 0, uma imagem de uma única ligação para o trímero de proteína F de RSV pré-fusão D25 Fab é mostrado, ao longo de curvas com neutralização de AM22 e D25. Para o sítio I, setas apontam para Pro389, uma mutação de escape conhecidos (Lopez et al, J. Virol., 72, 6922 (1998)). Uma curva de neutralização é mostrado para o anticorpo 131-2a. (Magro et al, J. Virol, 84, 7970 (2010)) como o anticorpo 2F, o anticorpo neutraliza única 131- 2a - 50% do vírus. (B) Para obter os sítios antigênicos II e IV, modelos de Motavizumabe (sítio II) e 101F (Local IV) ligação ao pré-fusão e pós- fusão (McLellan et al, J. Virol, 85, 7788 (2011)) F estruturas eram feita usando as coordenadas de estruturas de anticorpo de peptídeo (McLellan et al, J. Virol, 84, 12236 (2010); McLellan et al,Nat. Struct. Mol BioL, 17, 248 (2010)).

[0024] A Figura 10 mostra uma imagem de uma expressão em gel de poliacrilamida que ilustra da proteína F de RSV recombinante construir com S155C e S290C substituições de aminoácidos e um domínio Foldon ligado ao C-terminal de F1 e um conjunto de diagramas que ilustram que a ligação de dissulfureto entre S 155C e S290C só pode formar na conformação pré-fusão F de RSV.

[0025] A Figura 11 é um conjunto de gráficos que mostram os resultados de ELISA e ensaios de filtração em gel, usando a proteína F de RSV recombinante com construir S155C e S290C substituições de aminoácidos e um domínio Foldon ligado ao C-terminal de F1. Os dados de ELISA indicam que o construto S155C/S290C é ligado especificamente por anticorpos específicos pré-fusão F de RSV. Os perfis de filtração em gel mostram que a construto S155C/S290C existe somente como um trímero, enquanto que os agregados e formar rosetas em solução com um construto de controle de F de RSV sem as substituições/S290C S155C.

[0026] A Figura 12 mostra uma mancha negativa imagens de microscopia electrónica de RSV recombinante com proteína F construir S155C e S290C substituições de aminoácidos e um domínio Foldon ligado ao C-terminal de Fl. As imagens abaixo o grande painel são médias 2D de partículas individuais. Os resultados indicam que a construto S155C/S290C é estabilizada na conformação pré-fusão.

[0027] As Figuras 13-14 mostram um conjunto de gráficos que ilustram a resposta de anticorpos neutralizantes de camundongos administrados RSV nativa (RSV), o RSV inactivado com formalina (FI- RSV), a proteína F de RSV recombinante com construto de substituições de aminoácidos S155C e S290C e um domínio ligado a Foldon o C-terminal de F1 (pré-fusão F) ou um construto de proteína F de RSV estabilizado na conformação pós-fusão (pós-fusão RSV). A resposta dos anticorpos às 5 semanas (Figura 13) e 7 semanas (Figura 14) após a imunização inicial, é mostrada.

[0028] A Figura 15 mostra imagens digitais dos cristais de uma proteína F de RSV recombinante solúvel estabilizado em uma conformação pré-fusão por S155C e S290C substituições. Esquerda, imagens de luz padrão; Direita, imagens ultravioletas, indicativo de proteínas. A formação de cristais a partir de soluções aquosas tamponadas demonstra que esta proteína é substancialmente homogênea na solução.

[0029] A Figura 16 mostra o desenho de um antígeno à base de proteína F de RSV (RSV_A F(+)FdTHS) estabilizado por engenharia mutações ligação de dissulfureto S155C e S290C ("DS"), as mutações- preenchimento de cavidade S190F e V207L ("Cav1") e anexado C domínio-terminal heteróloga trimerização (Fd). O RSV F-estrutura ligada D25 é mostrado com dois dos protômeros exibidos como uma rosa molecular superfície colorida e tan e o terceiro protômero exibido como fitas. Os resíduos N- e C-terminais de F1 que se movem mais do que 5 A entre os pré e pós-fusão conformações são mostrados. Inserções mostram o vínculo engenharia dissulfureto entre os resíduos S155C e S290C (denominado "DS"), bem como as mutações cavidade espacial compacto S190F e V207L (denominados "Cav1"). Um modelo do fago T4 fibritina domínio de trimerização é mostrado na base do trímero pré- fusão. A proteína F de RSV, incluindo o S155C e S290C e S190F e substituições V207L RSV humano subtipo A e o domínio heterólogo Foldon C-terminal apensa, é denominado RSV_A F(+)FdTHS DSCav1. Mutações compatíveis com o reconhecimento D25, mas não suficientemente estáveis para permitir a purificação como um trímero homogêneo, são rotulados e mostrado na representação negra vara.

[0030] A Figura 17 mostra a caracterização antigênica de RSV_A F(+)FdTHS DSCav1. As taxas de associação e de dissociação de D25 solúvel interação, AM22, 5C4, 101F, Motavizumabe e Palivizumabee Fab com imobilizado RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 foram medidos usando um instrumento OctetRED 384 ™ (ForteBio, Melno Park, CA). As constantes de dissociação de equilíbrio para cada um dos anticorpos são fornecidas.

[0031] A Figura 18 mostra a cromatografia de exclusão de tamanho de RSV_A F(+)FdTHS DSCav1. A proteína purificada, após clivagem da trombina para remover os marcadores, foi passado através de uma coluna de exclusão de tamanho Superose 6 16/70. O volume de eluição é consistente com um trímero glicosilado.

[0032] A Figura 19 mostra uma tabela listando características antigênicas e físicas de RSV_A F(+)FdTHS variantes estabilizadas por alterações DS, Cav1 ou DSCav1. A coluna mais à esquerda define a variante F de RSV e o resto das colunas fornecem propriedades variantes, incluindo o rendimento a partir de plasmídeos expressos transitoriamente, antigenicidade contra vários sítios antigênicos e a retenção de (fornecida como uma quantidade fraccionada) depois de 1 hora de ligação de D25 de incubação a várias temperaturas, pH e a pressão osmótica ou de 10 ciclos de congelamento-descongelamento. A variante retém DSCav1 sítio antigênico 0 reconhecimento, com uma melhor estabilidade física, tal como avaliado por uma maior retenção de D25-reatividade após a exposição a condições extremas de temperatura, pH, osmolalidade e congelamento-descongelamento, então ou DS ou variantes Cav1.

[0033] A Figura 20 mostra uma representação em fita do 3.1 Uma estrutura de cristal de RSV_A F(+)FdTHS DSCav1. As fitas mais espessas correspondem ao aumento B-fatores. Apesar mutações estabilizantes, sítio antigênico 0, no ápice trímero, retém uma flexibilidade significativa.

[0034] A Figura 21 mostra a comparação de RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 a representação ligada à D25 RSV F. fita de RSV_A F(+)FdTHS DSCav1, sobreposta com uma representação de fita ligado a D25 RSV F cor branca (PDB ID 4JHW). As imagens são relacionadas por uma rotação de 90 ° em torno do eixo vertical.

[0035] A Figura 22 mostra estabilização mutações em RSV_A F(+)estrutura FdTHS DSCav1. Representação bola-e-vara de RSV_A F(+)estrutura cristalina FdTHS DSCav1 com 2F0-FC densidade de elétrons contornos em 1a é mostrado como uma malha. Estas imagens indicam que a densidade de elétrons correspondente à ligação de dissulfureto entre os resíduos cisteína 155 e 290 (à esquerda), bem como o resíduo Phe190-preenchimento de cavidade (à direita), é observada.

[0036] A Figura 23 mostra a imunogenicidade rato de RSV_A F(+)FdTHS DSCav1. Dez camundongos CB6 por grupo foram imunizados com 10 μg de F RSV_A (+) proteína FdTHS DSCavl misturada com 50 μg de poli I: C adjuvante. As imunizações ocorreram com 0 a 3 semanas e os soros de semana 5 e na semana 7 foram testados para a neutralização de RSV subtipo A (RSV_A) e B (RSV_B). Os valores médios estão indicados por linhas horizontais.

[0037] A Figura 24 mostra primata (NHP) imunogenicidade não humano de RSV_A F(+)FdTHS DSCav1. Quatro macacos rhesus RSV- ingénuos por grupo foram imunizados com 50 μg de F RSV_A (+) proteína FdTHS DSCav1 misturado com 500 μg de poli I: C adjuvante. As imunizações ocorreram às 0 e 4 semanas e soros de seis semanas foram testadas quanto à neutralização de RSV subtipo A (à esquerda) e B (direita). Os valores médios estão indicados por linhas horizontais.

[0038] As Figuras 25A-25C mostram mapas de plasmídeos de vectores de expressão. (A) um mapa do RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 HAP vector de expressão (SEQ ID NO: 384) para a expressão recombinante da proteína F de RSV de subtipo humano Uma incluindo S155C, S290C, S190F e V207L substituições de aminoácidos, fundido com um C domínio com terminação Foldon, sítio de clivagem de trombina, marcador 6xHis e um StrepTag II. (B) Um mapa do RSV_B (Bl) F(+)FdTHS DSCav1 HAP vetor de expressão (SEQ ID NO: 386) para a expressão de proteínas recombinantes RSV F de humano subtipo B (cepa Bl) incluindo S155C, S290C, S190F e V207L amino substituições de ácidos, fundido com um domínio de terminal-C Foldon, sítio de clivagem da trombina, marcador 6xHis e um StrepTag II. (C) Um mapa do RSV_B (18537) F(+)FdTHS DSCav1 HAP vetor de expressão (SEQ ID NO: 388) para a expressão de proteínas recombinantes RSV F de humano subtipo B (estirpe 18537), incluindo S155C, S290C, S190F e V207L amino substituições de ácidos, fundido com um domínio de terminal-C Foldon, sítio de clivagem da trombina, marcador 6xHis e um StrepTag II.

[0039] As Figuras 26A-26D ilustram concepção de uma vacina com base em estrutura para o RSV: um paradigma supersítio. (A) A infecção natural por RSV induz anticorpos diferentes, com uma gama de potências de neutralização viral. (B) Um conjunto de epitopos de anticorpos naturalmente induzidos, altamente potentes define um supersítio de vulnerabilidade viral. São mostrados os fragmentos de ligação ao antígeno do anticorpo D25 potente neutralização reconhecendo um epitopo no ápice do trímero F de RSV. Epitopos espacialmente sobrepostos no ápice trímero também são reconhecidos pelo AM22 e anticorpos 5C4, que partilham as mesmas características de neutralização desejados como D25. Estes epitopos sobrepostos definir sítio antigênico 0 como um supersítio de vulnerabilidade RSV. (C) Após a seleção de um supersítio alvo, um processo iterativo de design, caracterização das propriedades antigênicas e físicos, em nível atômico determinação da estrutura e avaliação da imunogenicidade permite a otimização com base em estrutura de antígenos vacinais que codificam a supersítio alvo. (D) Como o supersítio de vulnerabilidade viral naturalmente provoca anticorpos altamente protetoras, a imunização com "imunógenos Supersítio" mais facilmente induz resposta protetora de imunógenos com bases em regiões virais reconhecidos por anticorpos neutralizantes ou potencialmente não subdominantes.

[0040] A Figura 27 mostra concepção do sítio trimérico solúvel estabilizado 0-F de RSV. Mais de 100 variantes de F de RSV, contendo o domínio de T4 fibritina-trimerização (Foldon) foram concebidos para reter mais estavelmente sítio antigênico 0. Aqui é mostrada a estrutura do trímero F de RSV na sua conformação ligada a D25 com Foldon modelado. O trímero é exibido com dois protômeros como superfícies moleculares sombra cinza claro e rosa e o terceiro promotor como fitas. A fita branca é sombreada nas regiões em que é relativamente fixo entre pré e pós-fusão, enquanto que os resíduos N- e C-terminais que se movem mais do que 5 A entre conformações pré e pós-fusão estão a sombreado cinzento mais escuro. Mutações compatíveis com expressão e reconhecimento inicial D25, mas não suficientemente estáveis para permitir a purificação como um trímero homogêneos são rotulados e mostrado na representação negra vara. Inserções mostram closes de estabilização mutações em representação para as variantes DS, Cav1 e Tric, os quais de forma estável reter sítio antigênico 0 (Figura 31).

[0041] As Figuras 28A-28C mostram estruturas de RSV F trímeros, projetados para preservar sítio antigênico 0. (AC) Seis estruturas para RSV F variantes são mostrados, marcado pela estabilização mutação (DS, Cav1, DS-Cav1 e DS-Cav1-tric) e por a estrutura (cúbico e tetragonal) e cristalização de pH. (A) RSV F trímeros são exibidos em representação Coc-sem-fim, colorido de acordo com fator de mobilidade atômica. Regiões em falta são mostradas como linhas a tracejado. Estes ocorrem em região de membrana-proximal o C-terminal, onde o motivo Foldon não é visto, exceto na estrutura DS-Cav1-Tric (extrema direita). Na estrutura DS, dois loops na região da cabeça também são desordenadas. (B) 0 sítio antigênico de um protômero F de RSV é apresentado em diagrama de fita, com a estrutura de D25-ligado F de RSV em variantes diferentes de cinza e indicado. Mutações estabilizadoras são rotulados e mostrado na representação vara. (C) detalhes em nível atômico são mostrados na representação vara, com regiões de RSV F que mudam de conformação entre pós-fusão pré- fusão e conformação em cinza escuro e aqueles que permanecem constantes em cinza mais claro. São átomos de carbono indicado estabilizadores para a estabilização de mutações. Em Cav1 (pH 5,5) e no DS-Cav1 (pH 5,5) foram observadas novas características que envolve a interação do C-terminal do peptídeo F2 com um íon sulfato e o peptídeo de fusão. Na estrutura DS-Cav1-TriC, as mutações D486H- E487Q-F488W-D489H interagir com os dois protômeros vizinhos em torno do eixo trímero.

[0042] As Figuras 29A-29B mostram os resultados referentes à imunogenicidade de engenharia RSV F trímeros. Proteínas F de RSV modificadas para exibir de forma estável sítio antigênico 0 provocar títulos de neutralização significativamente mais elevados do que os induzidos por pós-fusão F. (A) Os títulos de neutralização de soros de camundongos imunizados com 10 μg de F de RSV (esquerda). Pós- fusão F, bem como F de RSV ligadas por anticorpos AM22 ou D25, foram imunizados com 20 μg por camundongo (à direita). A média geométrica é indicado por uma linha horizontal. (B) títulos de neutralização de soros de macacos rhesus imunizados com 50 μg de variantes de proteína F de RSV. A média geométrica é indicado por uma linha horizontal. Limiar de proteção é indicado por uma linha ponteada e p-valor previsto pós-fusão contra DS-Cav1.

[0043] As Figuras 30A-30D mostram como as propriedades físicas, estruturais e antigênicas de sítio antigênico 0-F de RSV estabilizado correlacionam-se com a imunogenicidade. (A) A estabilidade física do sítio 0 contra imunogenicidade. São mostradas informações transferir estabilidade física como determinado por 7 medições de retenção D25 da atividade na Figura 31 F0i calculada a média (eixo horizontal) e em comparação com os títulos de RSV-protetora induzida da F1g. 29 (eixo vertical). (B) mímica estrutural do sítio 0 contra a imunogenicidade. O encarte mostra a transferência de informações. Mimetismo estrutural (eixo horizontal) é o RMSD entre estruturas diferentes (Figura 28) e ligados a D25 F de RSV para todos os átomos dentro de 10 A de D25. Este é comparar a títulos RSV-protetora induzida de F1g. 29 (eixo vertical). (C) Análise antigênica de soros de macacos imunizados. A ligação dos soros para imobilizada DS-Cav1 (esquerda) ou pós-fusão M (direita) foi medida diretamente (placa, barras pretas) ou após a incubação com excesso pós-fusão F (barras cinzentas escuras) ou DS- Cav1 (barras cinza claro). A resposta média dos soros de quatro macaque é representada graficamente, com barras de erro para o desvio padrão. (D) Correlação de imunogenicidade e antigenicidade de NHP soros. Os títulos médios de neutralização dos soros de quatro Macaque em cada grupo são representados em função da proporção das respostas de ligação à DS-Cav1 e pós-fusão F.

[0044] As Figuras 31A-31B são uma tabela que mostra os resultados da caracterização antigênica e física de RSV F imunógenos proteína. #definido para o estado trimérica, mas se nenhum estado trimérica poderia ser purificado, em seguida, o estado oligomérico das espécies oligoméricas dominantes. Se rendimento total é de <0,1 mg/1, então estado oligomérico é não determinado (ND). * Rendimento é mostrado para o estado oligomérico específico. > 1000 nM = sem ligação a uma concentração μM Fab. N/A = não aplicável.

[0045] A Figura 32 mostra a localização de S155 e S290 nas estruturas F de RSV e pré pós-fusão. Os beta-carbonos de resíduos de serina 155 e 290 são 4,4 Um apart na RSV F-estrutura ligada D25 e 124,2 Um apart na estrutura pós-fusão. As mutações S155C e S290C (denominado "DS") contido na estrutura de conformação do pré-fusão.

[0046] As Figuras 33A-33C mostram a coloração negativa de proteína estabilizada-F. A) e B) mostram campos representativos de amostras coradas negativamente para DS e DS-Cav1. As proteínas são altamente homogênea com <1% e <0,1% de pós-F conformações observadas no DS e DSCav1, respectivamente. Exemplos de pós-F conformações são indicados por setas pretas. Bar = 50 nm. Médias de partículas 2D são mostradas como inserções no canto superior direito ao dobro da ampliação. Barra = 5 nm. C) mostra uma comparação das médias 2D com a média do complexo D25 F + (McLellan et al. 2013). Barra = 5 nm.

[0047] A Figura 34 mostra a D25 anticorpo ELISA base dos sobrenadantes da cultura em bruto está correlacionado (Spearman R = 0,7752 e um valor de P = 0,0041) para a produção de variantes oligoméricos glicoproteína F de RSV purificadas. Glicoproteína F de RSV de produção por 293 células foi determinada por ELISA D25 dos sobrenadantes da cultura em bruto a 4°C, uma semana após coleta e se correlacionava com o rendimento de puros oligoméricos variantes glicoproteína F de RSV (Tabela 1).

[0048] A Figura 35 mostra o teste ELISA com base em motavizumabe anticorpo dos sobrenadantes da cultura em bruto em relação ao rendimento de variantes purificadas glicoproteína F de RSV. (A), F de RSV de produção de glicoproteína por 293 células foi determinada por ELISA para o motavizumabe dos sobrenadantes da cultura em bruto a 4°C imediatamente após coleta e (B) uma semana após coleta. ELISA de dados é plotada versus o rendimento de variantes glicoproteína F de RSV após afinidade estreptactina. Curiosamente, três proteínas, RSV F(+)Fd e duas variantes F137W-F140W e T357C- N371C foram detectadas tão elevadas por motavizumabe ELISA mas baixos rendimentos foram obtidos após purificação em grande escala (pontos mostrados ao longo da ordenada).

[0049] A Figura 36 mostra a caracterização de RSV engenharia glicoproteínas F de exclusão de tamanho usando cromatografia. Variantes F de RSV, uma: Cav1; b: Cav1-Tric; c: DS-Cav1-Tric; d: F488W; E: DS-Cav1; f: Tric, g: DS-Tric; h: DS; exibem perfis de eluição característico de uma proteína trimérica globular, enquanto RSV F variantes i: S190F-V296F; J: K87F-V90L; K: V207L-V220L; 1: V178N; m: S403C-T420C; N: I506K; o: V185E; P: F137W-F140W-F488W; q: D486H-E487Q-D489H exibem perfis de eluição característico de espécies oligoméricas mais elevados. Padrões proteicos de peso molecular conhecido são colocados na base do cromatograma.

[0050] A Figura 37 mostra sítio antigênico 0 mostrado a partir de cima. As regiões de DS que não são visíveis são representadas por linhas tracejadas.

[0051] As Figuras 38A-38B mostram os resultados relativos caracterização antigênica de complexos de imunógeno-adjuvante para imunização primata não humano. (A), F de RSV pós fusão, DS e DS- Cav1 amostra reatividade foi avaliada contra uma μM D25 fragmento de ligação ao antígeno de menos de 3 horas após a formulação de imunógeno com poli I: C e imunizações NHP no dia 0 e (B), semana 4.

[0052] As Figuras 39A-39B mostram a análise de antigênico de soros de murganhos imunizados e de macacos rhesus. A) Os soros de camundongos imunizados com F estabilizado múltiplos variantes de RSV foi avaliada quanto à ligação a imobilizada DS-Cav1 foi medido diretamente ou DS-Cav1 após incubação com fragmentos de ligação ao antígeno em excesso ou D25 Motavizumabe para avaliar os 0 sítio ou sítio II respostas. B) Os soros de macacos rhesus foi avaliada quanto à ligação a imobilizada DS-Cav1 pós-fusão ou F de RSV variantes também bloqueada com fragmentos de ligação ao antígeno ou Motavizumabe D25. A resposta média dos soros de animais é mostrado, com barras de erro para o desvio padrão.

[0053] A Figura 40 mostra as estatísticas de coleta de dados e de refinamento de cristalografia.

[0054] A Figura 41 mostra o efeito da utilização de RSV de subtipo B constrói com as substituições de DS e que os adjuvantes incluindo agonistas de TLR4 pode trabalhar com a proteína F estabilizado. Ratos CB6F1/J foram imunizados com 10 μg da Versão DS S155C/S290C de pré-fusão estabilizado F formulada com 50 μl de Ribi (sistema adjuvante Ribi, Sigma). Os camundongos foram inoculados com 0 e 3 semanas, quer com o subtipo A construto (SEQ ID NO: 185), o subtipo B construir (SEQ ID NO: 1479) ou ambos (10 μ de cada). No ponto de tempo semana 5 (2 semanas após a segunda injeção), o soro foi obtido por ensaios de neutralização. Os dois principais resultados deste experimento foram que, 1) PREFA-DS e DS-PREFS induzir níveis iguais de atividade neutralizante contra SV subtipo A, enquanto PREFS-DS induziu um maior nível de atividade do que PREFS-DS neutralizantes contra RSV subtipo B. Isto sugere que o uso de construtos de RSV de subtipo B podem ter um melhor potencial de neutralização cruzada do que um subtipo ou construções que as versões de híbridos F de RSV que inclui elementos de ambos os subtipos podem ser preferidos. 2) O adjuvante Ribi é uma emulsão de óleo-em-água contendo monofosforil- lipídio A, que é um agonista de RST4 e representativo de alguns dos adjuvantes comerciais. Estes dados mostram que, para além PolyLC (um agonista de TLR3), adjuvantes que incluem agonistas de TLR4 funcionar com o pré-fusão proteína F estabilizado como um antígeno de vacina.

[0055] A Figura 42 mostra que o pré-fusão F estabilizado pode ser formulado em alúmen, bem como PolyLC e reter a imunogenicidade conferida por respostas do anticorpo ao sítio antigênico 0. Os camundongos BALB/c foram imunizados com 20 μg da versão/S290C S155C de DS pré-fusão estabilizado F derivado subtipo A e formulados com alume (gel de hidróxido de alumínio a 10 mg/ml, Brenntag, Frederikssund, Dinamarca) ou PolyLC. Os camundongos foram inoculados com 0 a 3 semanas e no ponto de tempo de 5 semanas (2 semanas após a segunda injeção), o soro foi obtido por ensaios de neutralização.

[0056] A Figura 43 é um diagrama esquemático que ilustra um esquema exemplificativo para a concepção de cadeia simples estabilizado pré-fusão-F de RSV (SCF) antígenos, incluindo as variáveis que estão envolvidas com diversos modelos diferentes de RSV SCF. Elementos de design que pertencem a RSV scF. 9 (BZGJ9 DS-Cav1; SEQ ID NO: 669 estão descritos em cinzento-escuro.

[0057] As Figuras 44A e 44B ilustram o desenho de uma única cadeia RSV F construir nenhuma. 9 (SCF no 9; BZGJ9 DSCav1; SEQ ID NO:. 669). Numeração de resíduos indica os sítios dos vários componentes descritos abaixo. (A) Representações esquemáticas de clivada por furina F de RSV (+) glicoproteína como mostrado na Figura 44B (em cima) e RSV scF n° 9 de design (parte inferior), que mostra o domínio de trimerização Foldon (cinza oval) e o ligante artificial (quadrado cinza) colmatar as espinhas dorsais de polipeptídeos de F2 (esquerda) e F1 (à direita). (B) Base estrutural para o RSV scF n° 9 design usando uma estrutura estabilizada pré-fusão-F de RSV (+) como modelo (PBD ID: 4MMV, aqui incorporada por referência na íntegra). F de RSV (+) é mostrado na representação dos desenhos animados e o domínio de trimerização Foldon mostrado na representação esfera. Mostrada à esquerda é o estabilizado pré-fusão RSV-F(+)trímero, com os três protômeros de cor preta, cinza e branco. Mostrado à direita é um único RSV F(+) protômero mostrando F1 (cinza médio), F2 (cinza escuro), o peptídeo de fusão (indicado) e o domínio Foldon trimerização (cinza claro, indicado). A inserção mostra o peptídeo de fusão, em representação da vara e a localização da sequência ligante flexível (linha a tracejado) que une os resíduos 104 e 147.

[0058] A Figura 45 mostra um quadro relativo à concepção, estado oligomérico e rendimento de produção de engenharia individuais cadeia RSV F construções expressos em células HEK293-F. F de RSV sem construir. 9 DSCav1 (SCF no 9; BZGJ9 DSCav1; SEQ ID NO:. 669), RSV F construir nenhuma. 10 DSCav1 (SCF no 10; BZGJ10 DSCav1; SEQ ID NO:. 670) RSV F construir nenhuma. 11 DSCav1 (SCF no 11; BZGJ11 DSCav1; SEQ ID NO:. 671) são indicados. As sequências de ligação previstas incluem GSGNIGLGG (SEQ ID NO: 364), GSGGNGIGLGG (SEQ ID NO: 359), GSGNVLGG (SEQ ID NO: 361) e GSGNVGLGG (SEQ ID NO: 362). (%) Pré-fusão mutações estabilizadores incluem o seguinte: S155C e S290C (DS); S190F e V207L (Cav1); sem mutações adicionais (um). Todas as variantes conter a mutação L373R ponto. Domínios (==) trimerização incluem o seguinte: L512C e L513C (CC); D486C, E487P e F489C (CPC). (#) Variantes foram frequentemente observados existir em uma mistura de estados oligoméricos cromatografia em tamanho. Se uma fração trimérica mensurável foi observado, em seguida, em seguida, estado oligomérico é listado como "Trímero". Se nenhuma fração trimérico foi observada, em seguida, o estado oligomérico da espécie dominante é fornecida. Se o rendimento total antes da cromatografia tamanho era <0,1 mg/L, em seguida, estado oligomérico é listado como não determinado (ND). Se o estado oligomérico era indistinguível por cromatografia de exclusão de tamanho, estado oligomérico é listado como "agregado". (*) Rendimento mostrado foi calculada pós-Sire purificação e está listado para o estado oligomérico especificado. (Φ) HEK 293F rendimento é estimado com base na proporção observada entre293F rendimento expressão e Freestyle293F expressão rendimento visto no construto scF (-2:1).

[0059] As Figuras 46A e 46B são um conjunto de gráficos que ilustram a caracterização de uma única cadeia de engenharia glicoproteínas F de RSV por cromatografia de exclusão de tamanho. (A) Os perfis de exclusão de tamanho de RSV scF variantes (SCF n° 3, 4, 6, 8, embora 11) e F de RSV <+) contendo DS-Cav1 mutações estabilizantes. Construções de cadeia simples foram expressos em células HEK293F e M (+) DS-Cav1 foi expressa em células 293-F. F(+)DS-Cav1 e FCE n° 3 DS-Cav1, n° 4 DS-Cav1, n° 6 DS-Cav1 e n° 9- DS Cav1 exibem perfis de eluição característico de uma proteína globular trimérica, enquanto que nenhuma scF. DSCav1 11 exibe uma característica de perfil de eluição de uma proteína monomérica globular. RSV scF n° 8 DS-Cav1 e FCE n° 10 DS-Cav1 perfis de exposição de eluição sugerindo uma mistura heterogênea de ambas as espécies monoméricas e triméricas. (B) perfis de exclusão de tamanho de RSV F(+)DS-Cav1 e RSV scF n° 9 contendo diferentes mutações estabilizantes. F(+)DS-Cav1 e FCE n° 9 Cav1 foram expressos em 293- F células e o CCAH restante n° 9 variantes foram expressos em células HEK293F. O ligeiro desvio nos perfis de eluição de scF há 9 variantes sugerem que scF n° 9 é executado com um peso molecular mais elevado do que trimérico F (+). Um asterisco indica que os marcadores de purificação foram clivadas antes da filtração em gel.

[0060] A Figura 47 é uma tabela que resume os resultados da caracterização antigênica de RSV scF N° 9-DS Cav1.

[0061] A Figura 48 é uma tabela que mostra os dados de cristalografia e estatísticas de refinamento para a estrutura tridimensional de RSV scF n° 9-DS Cav1.

[0062] As Figuras 49A e 49B mostram uma série de diagramas relativos à estrutura de cristal de RSV sem scF. 9-DS Cav1 trímero. A orientação do protômero exibidos em representação dos desenhos animados (cinzento escuro) é mantido constante. Linhas tracejadas grossas representam o motivo C-terminal Foldon localizado na região proximal à membrana, o que não é visível na estrutura cristalina. (A) de RSV sem scF. 9 DS-Cav1 trímero exibido com protômeros em representação dos desenhos animados e fita representação (cinza escuro) e representação da superfície molecular (cinza claro). Inserção mostra o alargamento do "GS" scF n° Laço 9 ligante (indicadas) e o protômero adjacente (cinzento escuro), tanto na representação da vara. (B) pré-fusão estabilização mutações no RSV scF n° 9 estrutura DS- Cav1. DS e Cav1 pré-fusão estabilização mutações são indicados e apresentados na representação vara.

[0063] A Figura 50 é um diagrama que ilustra o alinhamento estrutural de RSV sem scF. 9 DS-Cav1 (cinza médio) com o F estrutura (+) DS-Cav1 (cinza claro; RMSD = 0,839 A) e com o F(+)estrutura ligada-D25 (cinza escuro; RMSD = 0,534 A), todos exibidos em representação dos desenhos animados. O encarte mostra um close-up do CCAH n° 9 laço ligante e os peptídeos de fusão de estrutura F(+)DS- Cav1 e o F(+)estrutura ligada-D25.

[0064] A Figura 51 mostra diagramas que ilustram a comparação de RSV scF desenhos n° 3, 4, 6, 8-11 usando a estrutura de cristal de RSV sem scF. 9-DS Cav1. Linhas pontilhadas grossas representam a Foldon motivo C-terminal. RSV scF n° 9 DS-Cav1 protômero exibidos em representação dos desenhos animados (cinza escuro). Inserção mostra o alargamento do "GS" scF n° 9 circuito vinculador em representação vara juntar resíduos 105 (F2) e 145 (F1). Os sítios previstos das sequências de ligação flexíveis para scF projetos n° 3, 4, 6 e 8 (linha tracejada fina) que unem os resíduos 97 (F2) e 150 (F1) são mapeados para o CCAH n° 9 estrutura cristalina DS-Cav1. Os sítios previstos das sequências de ligação para scF projetos n° 3, 4, 6 e 8 (linhas pontilhadas finas) são mapeados para o CCAH n° 9 estrutura DS-Cav1 trímero. Locais de resíduos de ponto final ligante são aproximadas.

[0065] A Figura 52 mostra um conjunto de imagens digitais relativos caracterização dos engenharia de cadeia simples glicoproteínas F de RSV caracterizados por SDS-PAGE eletroforese em gel de purificação pós StrepTag. RSV SCF construções foram expressas em células HEK293F e purificado por His6-tag e cromatografia de afinidade StrepTag.

[0066] A Figura 53 é um conjunto de gráficos e uma tabela de dados fornecendo semana 5 de neutralização para as construções indicadas (10 animais/grupo). As imunizações na semana 0 e Semana 3 com 10 μg de proteína + 50 μg Poly I: C por animal.

[0067] A Figura 54 é um diagrama de fita da vara e destacando-se o resíduo prolina na posição 101 F de RSV na estrutura tridimensional de RSV sem scF. 9 (SEQ ID NO: 669). A estrutura indica que a região de ligação de cadeia simples podem ser melhoradas através da remoção de 101 Prolina ou encurtamento/mutação dos resíduos de agente de ligação e resíduos adjacentes.

[0068] A Figura 55 é um gráfico e um alinhamento de sequências que ilustra a modificação do CCAH n° Constructo 9 (SEQ ID NO: 669) para gerar o BZG J9-1 para BZG J9-10 construções. O alinhamento de sequências mostra BZG J9-1 para BZG J9-10 sequências correspondentes a F de RSV resíduos 97-159 de SEQ ID NO: 698-707, respectivamente. Estas construções foram expressas em células e avaliada por filtração em gel (esquerda).

[0069] A Figura 56 é uma série de gráficos que ilustram diagramas esquemáticos e uma nanopartícula incluindo a ferritina não FCE. 9 proteína, a qual foi gerada por ligação do C-terminal do polipeptídeo de F1 em scF No.9 para uma subunidade ferritina. Esta construto é designada "BZGJ9-DS-Cav1-LongLink-Ferritina" e apresentada como SEQ ID NO: 1429.

[0070] A Figura 57 é um conjunto de gráficos que ilustram a estabilidade física de BZGJ9-DS-Cav1-LongLink-Ferritina em comparação com F de RSV DS-Cav1.

[0071] As Figuras 58A-58C são um conjunto de gráficos e uma tabela que ilustra a imunogenicidade da pré-fusão diferente estabilizado proteínas F de RSV. Os três construções foram testadas F de RSV DSCav1 (SEQ ID NO: 371), BZGJ9-DS-Cav1-LongLink-Ferritina (SEQ ID NO: 1429) e FCE n° 9 (também denominado BZGJ9 DS-Cav1, SEQ ID NO: 669). Animais Macaca mulatta de origem indiana pesando 8.26- 11.34 kg por via intramuscular foram injetados com imunógenos na semana 0 com 50 μg de proteína + 500 μg Ribi por animal, Reforço na Semana 4 com 50 μg de proteína + 500 μg Ribi por animal; imunogenicidade foi avaliada na semana 3,5.

[0072] As Figuras 59A e 59B são um conjunto de diagramas que ilustram a estrutura tridimensional da proteína F de RSV a partir da estirpe 18537 B com as mutações DSCav1 (SEQ ID NO: 372) (A) representação dos desenhos animados de um protômero de RSV F. (B) forma trimérica da glicoproteína de fusão com protômeros adicionais mostrados nas representações de superfície e da fita.

[0073] As Figuras 60A-60D são uma série de imagens que ilustram os pormenores do nível atômico RSV B 18537 F glicoproteína com substituições DSCav1 e que mostram que as substituições DSCav1 pode ser introduzido em uma glicoproteína F de RSV de subtipo B para estabilizar o sítio antigênico 0. (A) DS -Cav1 mutações são realçados. (B) 0 sítio antigênico localizado no vértice do trímero é mostrado na representação da vara em cinzento-escuro. (C) A interação entre o peptídeo de fusão e β cordões 15, 16 e 19 de modo a formar e a folha alongada interprotomérica. (D) A interação entre o C-terminal F2 e o peptídeo de fusão.

[0074] As Figuras 61A e 61B são um conjunto de gráficos e imagens digitais que ilustram caracterização antigênica de RSV B glicoproteína 18537 fusão com substituições DSCav1. Medidas (A) Interferometria de Biocamada de anticorpos específicos do sítio prototípicos foram realizadas por diluição em série de cada molécula de Fab e as taxas de associação e dissociação para as proteínas imobilizadas B 18537 F DSCav1 medidos. (B) comparação estrutural do sítio antigênico 0 a partir da estirpe B 18537 e A2. Superfície exposta resíduos que diferem entre as duas estirpes são rotulados.

[0075] As Figuras 62A e 62B são gráficos que ilustram a purificação da proteína de RSV estirpe B 18.537 F com DSCav1. A. SDS-PAGE da fração de eluição (reduzido e não reduzido) e fração de fluxo passante após purificação por afinidade StrepTagII. B. Gel de filtração de RSV F B18537 glicoproteína em GFB de tampão em uma coluna de 120 ml de Superdex-200 de exclusão de tamanho.

[0076] As Figuras 63-68 ilustram de criação e produção de proteínas recombinantes F de RSV triméricos estabilizados em uma conformação pré-fusão sem um domínio de trimerização do C-terminal para manter a estabilidade da membrana do lobo proximal do RSV F. Em lugar do domínio de trimerização do C-terminal, um anel de ligações de dissulfureto é introduzido no terminal-C do polipeptídeo F1 por substituição de resíduos de cisteína para os aminoácidos da hélice oc10.

[0077] As Figuras 69A-69E são um conjunto de tabelas que mostram dados de ELISA para os indicados variantes RSV F recombinantes. Expressão e estabilidade antigênico de F de RSV variantes (SEQ ID NOs: 859-1018). DNA codificando estas variantes F de RSV foi transfecção na célula no formato de 96 poços sob condições em que as proteínas F de RSV recombinantes são segregadas a partir das células para o meio celular. Cada construto contém uma sequência de comando que faz com que a proteína para entrar no sistema secretor e ser segregado. O meio foi então centrifugado e o sobrenadante usado para o teste de antigenicidade para a ligação ao sítio 0 D25 específica do anticorpo e o anticorpo específico do sítio II Motavizumabe ("Mota", as Figuras 69A-69E). As condições testadas incluem D25 e Mota obrigatório no dia 0 (condições 1 e 2), D25 e vinculativo Mota no dia 0, após incubação a 70°C durante uma hora (condições 3 e 4) e D25 e Mota de ligação após uma semana em 4°C (condições 5 e 6). O controle é a DSCav1 construir com um domínio Foldon. Dados de antigenicidade específicas para cada construto é fornecida nas Figuras 69A-69E, com as condições testadas são anotadas nas linhas de cabeçalho.

[0078] As Figuras 70A-70E são um conjunto de diagramas esquemáticos que ilustram diferentes estratégias de design para gerar RSV F antigênica do sítio 0 Imunógenos. 0 sítio antigênico inclui o sítio de reconhecimento de D25 na superfície exterior da pré-fusão F de RSV OC4 hélice e o loop apenas N-terminal para a hélice de cada protômero OCL. Cinco métodos foram usados para o presente isolado Implantações 0 epitopos sobre a superfície de um imunógeno: A) permutação circular (ou seja, alterando ligantes de estrutura secundária para alterar a conectividade do sítio 0 segmentos por razões de facilidade de criação e estabilidade), B) incorporação do sítio 0 em uma pequena proteína de arcabouço, C) trimerização de permutações circulares ou sítio 0 para coincidir com o nativo sítio 0 trimerização observada no pré-fusão contexto F de RSV (como no painel da esquerda), D), incluindo todos os de domínio III para maior estabilidade 0 sítio da dobra) incorporação de AD para uma plataforma de nanopartículas para imunogenicidade adicionado.

[0079] A Figura 71 é um resumo do sítio mínima 0 imunógenos que foram projetados, fabricados e testados para antigenicidade ao sítio 0 D25 anticorpos específicos, AN22 e 5C4 por ELISA, nas condições indicadas. A tabela mostra o número de sítio 0 imunógenos que caem dentro de cada categoria de concepção e que produziu um resultado de ELISA de pelo menos 1,5.

[0080] As Figuras 72A-72F são um conjunto de tabelas que mostram dados de ELISA para o sítio indicado mínimo obrigatório construções 0 a D25, AN22 ou 5C4 anticorpo. As condições testadas incluem ligação de D25 após 0 e 1 semana a 4°C (condição 1) e 2), ligando D25 após 1 h. a 60°C (condição 3), 70°C (Condição 4), 80°C (Condição 5), 90°C (Condição 6) ou 100°C (Condição 7), a ligação AM22 depois de duas semanas a 4°C (Condição 8), a ligação 5C4 na semana 0 (condição 9). A média de D25, AM22, D25 e ligação após 1 hora a 70°C é também mostrado (estado 10). Classificações de ELISA de> 1,5 são destacadas em cinza escuro; dezenas de 0,5-1,5 são destacadas em cinza claro.

[0081] A Figura 73 é um conjunto de gráficos que ilustram que a imunização com a versão de DS pré-fusão estabilizado F subtipo A ou B ou ambos é induz a atividade neutralizantes contra ambos os subtipos.

[0082] A Figura 74 é um conjunto de gráficos que ilustram que a resposta de anticorpos DSCav1 é durável em camundongos após imunização com duas doses nas semanas 0 e 4.

[0083] A Figura 75 é um conjunto de gráficos que ilustram que o DS de imunização pode prevenir a infecção por RSV em camundongos.

[0084] A Figura 76 é um conjunto de gráficos que ilustram que DS imunização não induz respostas de citocinas tipo 2 em camundongos pós-desafio.

[0085] A Figura 77 é um conjunto de gráficos que ilustram que a resposta imune neutralizante para DSCav1 é impulsionado e sustentada após uma terceira dose, em primatas não humanos, que foram previamente imunizados com DS-Cav1 ou DS nas semanas 0 e 4.

[0086] A Figura 78 é um gráfico que ilustra que o DS-CAV1 pode ser formulado em alúmen eficazmente e retêm a imunogenicidade.

[0087] A Figura 79 é um conjunto de gráficos que ilustram que o alúmen é um adjuvante eficaz para DSCav1 em primatas não humanos.

[0088] A Figura 80 é um gráfico que ilustra que o DS-CAV1 é imunogênica quando expresso a partir de um vector com base em genes, quer isoladamente ou como escorva para um reforço com proteína.

[0089] A Figura 81 é um conjunto de gráficos e uma tabela que ilustra que DS-Cav1 RSV F subtipo A ou B pode aumentar a imunização principal usando a entrega de base gene da proteína de tipo selvagem F em primatas não humanos.

[0090] A Figura 82 é um conjunto de gráficos que ilustram que o DS-Cav1 F de RSV de subtipo A ou B pode aumenta rAd-F (A) preparado-WT de primata não humano.

[0091] A Figura 83 é um conjunto de gráficos que ilustram que a imunização com a versão de DS pré-fusão estabilizado F subtipo A ou B ou ambos é induz a atividade neutralizantes contra ambos os subtipos de RSV.

[0092] A Figura 84 é um gráfico que ilustra que a alteração de glicosilação reduz a imunogenicidade do pré-fusão estabilizado F.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[0093] As sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos enumeradas na listagem de Sequências em anexo são mostradas usando abreviaturas convencionais para as bases de nucleotídeos e código de três letras para os aminoácidos, conforme definido em 37 CFR 1.822. Apenas uma cadeia de cada sequência de ácido nucleico é mostrada, mas a cadeia complementar é compreendido como incluída por qualquer referência à cadeia exibida. A listagem de sequências for apresentado como um arquivo de texto ASCII sob a forma de o arquivo denominado "Sequence.txt" (-3,2 MB), que foi criado em 12 de Março, de 2014 e está incorporada por referência. Na Listagem de Sequências em anexo:

[0094] SEQ ID Nos: 1-128 são as sequências de aminoácidos das proteínas nativas F de RSV de tipo RSV A.

[0095] SEQ ID NOs: 129-177 são as sequências de aminoácidos das proteínas nativas F de RSV de tipo RSV B.

[0096] SEQ ID NOs: 178-184 são as sequências de aminoácidos das proteínas nativas F de RSV a partir de RSV bovino.

[0097] SEQ ID NOs: 185-350 são as sequências de aminoácidos das proteínas recombinantes F de RSV.

[0098] SEQ ID NO: 351 é a sequência de aminoácidos de um domínio Foldon de T4 fibritina.

[0099] SEQ ID NO: 352 e 355-365 são as sequências de aminoácidos de ligantes peptídicos.

[00100] SEQ ID NO: 353 é a sequência de aminoácidos de uma proteína ferritina Helicobacter pylori (GenBank® No. de Acesso EJB64322.1, aqui incorporada por referência como presente na base de dados em 28 de Fevereiro, 2013).

[00101] SEQ ID NO: 354 é a sequência de aminoácidos de uma proteína encapsulina (GenBank® No. de Acesso YP_001738186.1, aqui incorporada por referência como presente na base de dados em 28 de Fevereiro, 2013).

[00102] SEQ ID NOs: 366 e 367 são as sequências de aminoácidos de VH e VL de mab AM22, respectivamente.

[00103] SEQ ID NO: 368 e 369 são as sequências de aminoácidos de VH e VL de mab D25, respectivamente.

[00104] SEQ ID NO: 370 é um RSV recombinante F0 sequência de aminoácidos da proteína variante da cepa A2 prototípico (número de acesso GenBank P03420, aqui incorporada por referência como presente na base de dados em 28 de Fevereiro, 2012), incluindo P102A, I379V e M447V substituições em relação à sequência P03420.

[00105] SEQ ID NO: 371 é a sequência de aminoácidos de uma proteína recombinante de F de RSV de subtipo humano Uma incluindo S155C, S290C, S190F e V207L substituições de aminoácidos, fundido com um domínio Foldon C-terminal, sítio de clivagem de trombina, marcador 6xHis e um StrepTag II. Os quatro resíduos com mutação e o apêndice C-terminal estão sublinhados. MELLILKAMAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKL IKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVCK VLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKQLLPILNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEIT REFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMÇIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTP CWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPK YDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLY VKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELL5AIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGG LVPRGSHHHHHHSAWSHPQFEK (RSV_A F(+)FdTHS DSCavl)

[00106] SEQ ID NO: 372 é a sequência de aminoácidos de uma proteína recombinante de F de RSV de humano subtipo B incluindo S155C, S290C, S190F e V207L substituições de aminoácidos, fundido com um domínio Foldon C-terminal, sítio de clivagem de trombina, marcador 6xHis e um StrepTag II. Os quatro resíduos com mutação e o apêndice C-terminal estão sublinhados. MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSNIKETKCHGTDTKVKL IKQELDKYKNÀVTELQLLMQNTPAÀNNRARREAPQYMNYTINTTKNLNVSI5KKRKRRFLGFLLGVG5AIASGIÀVÇK VLHLEGEVNKIKMALLSTNKAWSLSMGVSVLTFKVLDLKNYINNQLLPILHQQSCRISNIETVIEFQQKMSRLLEIII REFSVNAGVTTPLS TYMLTNSELLSLINDMPI TNDQKKLMSSNVQIVRQQS YSIMC11 KEEVLAYWQLPIYGVIDTP CWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDTIAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFriSK YDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLY VKGEPIINYYDPLVFPSDEFDA5ISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEVWTLLGTFLGG LVPRGSHHHHHHSAWSHPQFEK (RSV_B F(+)FdTHS DSCavl)

[00107] SEQ ID NO: 373 é a sequência de aminoácidos de uma proteína recombinante de F de RSV de RSV bovino incluindo S155C, S290C, S190F e V207L substituições de aminoácidos, fundido com um domínio Foldon C-terminal, sítio de clivagem de trombina, marcador 6xHis e um StrepTag II. Os quatro resíduos com mutação e o apêndice C-terminal estão sublinhados. MAATAMRMIISIIFISTYMTHITLCQNITEEFYQSTCSAVSRGYLSALRTOTYTSWTIELSKIQKNVCKSTDSKVKL IKQELERYNNAVIELQSLMQNEPASFSRAKRGIPELIHYTRNSTKRFYGLMGKKRKRRFLGFLLGIG5AIASGVAVCK VLHLEGEV'NKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTFKVLDLKNYIDKELLPKtmiHDCRISNIETVIEFQQKHNRLLEIA REFSVNAGITTPLSrYMLTNSELL.SLINDMPITNDQKKLMSSHVQIVRQQSYSIMCWKEEVIAYWQLPI YGVIDTP CWKLHTSPLCTTDNKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPTDVNLCNTDIFNTK YDCKIMTSKTDISSSVITSIGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKALY IKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASIAQVNAKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGG LVPRGSHHHHHHSAWSHPQFEK (bRSV F(+)FdTHS DSCβvl)

[00108] SEQ ID NO: 374 é a sequência de aminoácidos de uma proteína recombinante de F de RSV de subtipo humano Uma incluindo S155C, S290C e S190F substituições de aminoácidos, fundido com um domínio Foldon C-terminal, sítio de clivagem de trombina, marcador 6xHis e um StrepTag II. Os três resíduos com mutação e o apêndice C- terminal estão sublinhados.

[00109] SEQ ID NO: 375 é a sequência de aminoácidos de uma proteína recombinante de F de RSV de humano subtipo B incluindo S155C, S290C e S190F substituições de aminoácidos, fundido com um domínio Foldon C-terminal, sítio de clivagem de trombina, marcador 6xHis e um StrepTag II (RS V_B F(+)FdTHS DSS 190F)

[00110] SEQ ID NO: 376 é a sequência de aminoácidos de uma proteína F de RSV recombinante de RSV bovino incluindo S155C, S290C e S190F substituições de aminoácidos, fundido com um domínio Foldon C-terminal, sítio de clivagem de trombina, marcador 6xHis e um StrepTag II.. (BRSV F(+)FdTHS DSS190F)

[00111] SEQ ID NO: 377 é a sequência de aminoácidos de uma proteína F de RSV recombinante de RSV Um incluindo S155C, S290C, S190F, V207L substituições de aminoácidos, fundido com um domínio C-terminal da ferritina. _ £ RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 ferritina)

[00112] SEQ ID NO: 378 é a sequência de aminoácidos de uma proteína F de RSV recombinante de RSV B incluindo S155C, S290C, S190F, V207L substituições de aminoácidos, fundido com um domínio C-terminal da ferritina. (RSV_B F(+)FdTHS DSCav1 ferritina)

[00113] SEQ ID NO: 379 é a sequência de aminoácidos de uma proteína F de RSV recombinante de VSRB incluindo S155C, S290C, S190F, V207L substituições de aminoácidos, fundido com um domínio C-terminal da ferritina. (BRSV F(+)FdTHS DSCav1 ferritina)

[00114] SEQ ID NO: 380 é a sequência de aminoácidos de uma proteína F de RSV recombinante de RSV Um incluindo S155C, S290C, S190F substituições de aminoácidos, fundido com um domínio C- terminal da ferritina. (RSV_A F(+)FdTHS DSS 190F ferritina)

[00115] SEQ ID NO: 381 é a sequência de aminoácidos de uma proteína F de RSV recombinante de RSV B incluindo S155C, S290C, S190F substituições de aminoácidos, fundido com um domínio C- terminal da ferritina. (RSV_B F(+)FdTHS DSS 190F ferritina)

[00116] SEQ ID NO: 382 é a sequência de aminoácidos de uma proteína F de RSV recombinante de VSRB incluindo S155C, S290C, S 190f substituições de aminoácidos, fundido com um domínio C-terminal da ferritina. (BRSV F(+)FdTHS DSS 190F ferritina)

[00117] SEQ ID NO: 383 é uma sequência de nucleotídeos que codifica um exemplificativa de proteína F de RSV recombinante humana do subtipo A, incluindo S155C, S290C e S190F V207L substituições de aminoácidos, fundido com um domínio C-terminal Foldon, sítio de clivagem de trombina, marcador 6xHis e um StrepTag II (codificação de DNA RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 expressa a partir VRC3798).

[00118] SEQ ID NO: 384 é uma sequência de nucleotídeos de um vetor de expressão para a expressão recombinante de proteínas F de RSV de subtipo humano Uma incluindo S155C, S290C, S190F e V207L substituições de aminoácidos, fundido com um domínio Foldon C- terminal, sítio de clivagem de trombina, marcador 6xHis e uma StrepTag II (RSV_A F(+)vetor FdTHS DSCav1 HAP; VRC3798).

[00119] SEQ ID NO: 385 é uma sequência de nucleotídeos exemplificativa que codifica uma proteína recombinante de F de RSV de humano subtipo B (cepa B1) incluindo S155C, S290C, S190F e V207L substituições de aminoácidos, fundido com um domínio Foldon C- terminal, sítio de clivagem de trombina, marcador 6xHis e um StrepTag II (codificação de DNA RSV_B (B1) F(+)FdTHS DSCav1; expressa a partir VRC3764).

[00120] SEQ ID NO: 386 é uma sequência de nucleotídeos de um vetor de expressão para a expressão recombinante de proteínas F de RSV a partir de humano subtipo B (cepa B1) incluindo S155C, S290C, S190F e V207L substituições de aminoácidos, fundido com um domínio Foldon C-terminal, a trombina a clivagem sítio, marcador 6xHis e um StrepTag II (RSV_B (B1) F(+)vetor FdTHS DSCav1 HAP; VRC3764).

[00121] SEQ ID NO: 387 é uma sequência de nucleotídeos exemplificativa que codifica uma proteína recombinante de F de RSV de humano subtipo B (cepa 18537) incluindo S155C, S290C, S190F e V207L substituições de aminoácidos, fundido com um domínio Foldon C-terminal, sítio de clivagem de trombina, marcador 6xHis e um StrepTag II (codificação RS DNA V_B F(+)FdTHS DSCav1; expressas a partir VRC3799).

[00122] SEQ ID NO: 388 é uma sequência de nucleotídeos de um vetor de expressão para a expressão recombinante de proteínas F de RSV a partir de humano subtipo B (cepa 18537) incluindo S155C, S290C, S190F e V207L substituições de aminoácidos, fundido com um domínio Foldon C-terminal, a trombina a clivagem sítio, marcador 6xHis e um StrepTag II (RSV_B F(+)vetor FdTHS DSCav1 HAP; VRC3799).

[00123] SEQ ID NOs: 389-693 são as sequências de aminoácidos das proteínas F de RSV recombinante estabilizadas em uma conformação pré-fusão.

[00124] SEQ ID NOs: 694-697 são as sequências de aminoácidos de polipeptídeos de domínio Foldon modificados.

[00125] SEQ ID NOs: 698-697 são as sequências de aminoácidos de polipeptídeos de domínio Foldon modificados.

[00126] SEQ ID NOs: 698-828, 1429-1442 e 1474-1478 são as sequências de aminoácidos de cadeia simples recombinante proteínas F de RSV.

[00127] SEQ ID NOs: 829-1025 e 1456-1468 são as sequências de aminoácidos das proteínas F de RSV recombinantes ligados a um domínio Foldon clivável ou não ligado a um domínio Foldon.

[00128] SEQ ID NO: 1026 é a sequência de aminoácidos de uma proteína F de RSV sem as substituições de estabilização da pré-fusão.

[00129] SEQ ID NOs: 901-968 são as sequências de aminoácidos das proteínas F de RSV recombinante estabilizadas em uma conformação pré-fusão.

[00130] SEQ ID NOs: 1027-1088 e 1099-1428 são as sequências de aminoácidos de sítio mínima 0 imunógenos que são descritos no Exemplo 14.

COORDENADAS ESTRUTURAIS

[00131] As coordenadas atômicas de a estrutura cristalina da proteína F de RSV Fab ligados por D25 são recitados na Tabela 1 do Pedido Provisório US N ° 61/780.910, depositado em 13 de Março de 2013, o qual é aqui incorporado por referência na íntegra. Estas coordenadas atômicas de a estrutura cristalina da proteína F de RSV Fab ligados por D25 também são depositados como Acesso ao Protein Data Bank N° 4JHW e que é aqui incorporada por referência conforme presente na mesma em 1 de Maio, 2013.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00132] A glicoproteína F de RSV que é uma proteína de fusão de tipo I que facilita a fusão das membranas virais e celulares (Walsh e Hruska, J. Virol., 47, 171 (1983)). Após a síntese inicial, RSV F adota uma conformação pré-fusão metaestável que armazena energia dobrável, que é liberado durante um rearranjo estrutural para uma conformação pós-fusão altamente estável após o contato com as membranas das células do hospedeiro. Três sítios antigênicos (I, II e IV) na proteína F de RSV foram encontrados para induzir atividade neutralizante (Arbiza et al, J. Gen. Virol., 73, 2225 (1992); Lopez et al, J. Virol, 72, 6922 (1998); Lopez et al, J. Virol, 64, 927 (1990)) e todos existir na forma pós-fusão de proteína F de RSV, tal como determinado por estudos estruturais e biofísicas (McLellan et al, J. Virol, 85, 7788 (2011); Swanson et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 108, 9619 (2011)). Absorção de soros humanos com pós-fusão F de RSV, no entanto, não consegue remover a maior parte da atividade neutralizadora F- específicos, o que sugere que a forma pré-fusão F de RSV abriga novos neutralizar sítios antigênicos (Magro et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109, 3089 (2012)).

[00133] Antes do trabalho descrito aqui, uma preparação homogênea da proteína solúvel pré-fusão RSV F não estava disponível, impedindo a determinação da F estrutura pré-fusão e identificação do romance pré- fusão sítios antigênicos F-específicos. Conforme descrito aqui, os anticorpos específicos de proteína F de RSV foram identificados que neutralizam RSV, mas não especificamente se ligam a pós-fusão F de RSV e a estrutura tridimensional de F pré-fusão, reconhecidas por estes anticorpos, foi obtido. Os resultados aqui apresentados revelam pela primeira vez que a conformação pré-fusão F de RSV e o mecanismo de neutralização para uma categoria de anticorpos neutralizantes notavelmente potente pré-fusão F de RSV. Usando a estrutura tridimensional de F pré-fusão como um guia, as formas de F (pré-fusão antígenos "PreF") estabilizado foram construídos e usados para gerar respostas imunes neutralizante de RSV muitas vezes maior do que o alcançado com imunógenos com base na proteína F de RSV anteriores.

I. Termos

[00134] Salvo disposição em contrário, os termos técnicos são usados de acordo com o uso convencional. As definições dos termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas em Benjamin Lewin, Genes VII, publicado pela Oxford University Press, 1999; Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltda., 1994; e Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995; e outras referências similares.

[00135] Conforme usado aqui, as formas singulares "um," "uma," e "o", se referem a ambos o singular bem como no plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Por exemplo, o termo "um antígeno" inclui antígenos individuais ou plurais e pode ser considerado equivalente à frase "pelo menos um antígeno." Conforme usado aqui, o termo "compreende" significa "inclui". Assim, "compreendendo um antígeno" significa "incluindo um antígeno", sem excluir outros elementos. É ainda para ser entendido que quaisquer e todos os tamanhos de bases ou tamanhos de aminoácidos e todos os valores de peso molecular ou massa molecular, dados para ácidos nucleicos ou polipeptídeos são aproximados e são fornecidos com fins descritivos, salvo indicação em contrário. Embora vários métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos aqui possam ser usados, nomeadamente, métodos e materiais adequados são descritos aqui. Em caso de conflito, a presente especificação, incluindo explicações de termos, irá controlar. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser limitativos. Para facilitar a análise das várias modalidades, as seguintes explicações de termos são fornecidos:

[00136] 5C4: Um anticorpo monoclonal neutralizante que se liga especificamente à conformação pré-fusão do RSV Proteína M, mas não para a conformação pós fusão F de RSV. O anticorpo 5C4 incluem regiões de cadeia pesada e leve variável com as sequências de aminoácidos definidas por SEQ ID NOs: 1470 e 1471, respectivamente. Conforme descrito em McLellan et al., Science, 340 (6136): 1113-7, 2013, 5C4 se liga especificamente a um epitopo encontrado na quaternário proteína F de RSV na sua conformação pré-fusão, mas não a conformação pós fusão. Em várias modalidades, o anticorpo 5C4 se liga especificamente aos antígenos PreF descritos aqui. domínio variável de cadeia pesada 5C4: EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTFFHWVKQRPEQGLE WIGRIDPADGHTKYDPKFQGKATITADTSSNTAFLQLSSLTSVDTAVY YCATTITAVVPTPYNAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 1470) domínio variável de cadeia leve kapa de 5C4: DIVLTQSPASLAVSLGQRTTISCRASESVDSFDNSFIHWYQQKPGQP PKLLIFLASSLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQS NEDPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 1471)

[00137] Adjuvante: Um veículo usado para aumentar a antigenicidade. Os adjuvantes incluem uma suspensão de minerais (alúmen, hidróxido de alumínio ou de fosfato) em que o antígeno é adsorvido; ou água-em-óleo, por exemplo, no qual a solução de antígeno é emulsionada em óleo mineral (adjuvante de Freund incompleto), eventualmente com a inclusão de micobactérias mortas (adjuvante completo de Freund) para aumentar ainda mais a antigenicidade (inibe a degradação do antígeno e/ou faz com que o influxo de macrófagos). Os oligonucleotídeos imunoestimuladores (tais como aqueles incluindo um motivo CpG) também podem ser usados como adjuvantes. Os adjuvantes incluem moléculas biológicas (um "adjuvante biológica"), tais como moléculas coestimuladoras. Adjuvantes exemplificativos incluem IL-2, RANTES, GM-CSF, TNF-a, IFN-Y, FEC-G, A-3FL, CD72, B7-1, B7-2, OX-40L, 4-1BBL e toll-like? do receptor (agonistas TLR), tais como agonistas de TLR-9. A pessoa especialista na técnica está familiarizado com adjuvantes (ver, por exemplo, Singh, (ed.) Vacina Os adjuvantes e sistemas de entrega. Wiley-Interscience, 2007). Os adjuvantes podem ser usados em combinação com os antígenos PreF descritos.

[00138] Administração: A introdução de uma composição para um indivíduo por uma via escolhida. A administração pode ser sítio ou sistémica. Por exemplo, se a via escolhida é a administração intravenosa, a composição (tal como uma composição incluindo um imunógeno descrito) é administrado através da introdução da composição em uma veia do indivíduo.

[00139] Agente: qualquer substância ou combinação de substâncias que é útil para alcançar um fim ou resultado; por exemplo, uma substância ou uma combinação de substâncias úteis para a inibição da infecção por RSV em um indivíduo. Agentes incluem proteínas, moléculas de ácido nucleico, pequenas moléculas, compostos, os compostos orgânicos, compostos inorgânicos ou outras moléculas de interesse, tais como vírus, tais como vírus recombinantes. Um agente pode incluir um agente terapêutico (tais como um agente anti-RSV), um agente de diagnóstico ou um agente farmacêutico. Em algumas modalidades, o agente é um agente de polipeptídeo (tal como um polipeptídeo imunogênico RSV) ou um agente antiviral. Aqueles versados na técnica compreenderão que os agentes particulares pode ser útil para conseguir mais do que um resultado.

[00140] AM22: Um anticorpo monoclonal neutralizante que se liga especificamente à conformação pré-fusão da proteína F de RSV, mas não a conformação pós fusão F de RSV. Sequências de proteína e de ácido nucleico AM22 são conhecidos, por exemplo, as sequências de aminoácidos das cadeias pesada e leve do anticorpo AM22 estão estabelecidas no Pedido de Pat. Bar. N° 2012/0070446, que é aqui incorporada na íntegra). Conforme descrito no Exemplo 1, AM22 se liga especificamente a um epitopo (incluído no sítio antigênico 0) incluindo posições encontradas na proteína F de RSV na sua conformação pré- fusão, mas não a conformação pós fusão. Este epitopo é incluído dentro de F de RSV posições 62-69 e 196-209 e localizado no vértice da membrana distal da proteína F de RSV na conformação pré-fusão (ver, por exemplo, as Figuras 9A e 2B). Antes da presente relatório descritivo, não se sabia que AM22 era específico para a conformação pré-fusão. Em várias modalidades, o anticorpo AM22 se liga especificamente aos antígenos PreF descritos aqui.

[00141] Substituições de aminoácidos: A substituição de um aminoácido em um antígeno com um aminoácido diferente ou uma supressão de um aminoácido. Em alguns exemplos, um aminoácido em um antígeno é substituído com um aminoácido de uma proteína homóloga.

[00142] Animal: Um vertebrado viver multicelular ou organismo invertebrado, uma categoria que inclui, por exemplo, mamíferos. O termo mamífero inclui ambos os mamíferos humanos e não humanos. Da mesma forma, o termo "indivíduo" inclui ambos os indivíduos humanos e veterinários, tais como primatas não humanos. Assim, a administração a um indivíduo pode incluir administração a um indivíduo humano. Exemplos não limitativos de matérias veterinárias incluem animais (tais como gatos e cães), gado (por exemplo, gado, cavalos, porcos, ovelhas e cabras) e animais de laboratório (por exemplo, ratos, coelhos, camundongos, cobaias e primatas não humanos).

[00143] Anticorpo: um polipeptídeo que é de natureza substancialmente codificado por um gene de imunoglobulina ou genes de imunoglobulina ou seus fragmentos, que se liga e reconhece especificamente um analito (por exemplo, um antígeno ou imunógeno), tais como uma proteína F de RSV ou um fragmento do mesmo antigênico. Genes de imunoglobulina incluem a capa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon e mu genes da região constante, assim como os genes da região variável de imunoglobulina miríade. O termo "anticorpo", conforme usado aqui, inclui fragmentos de anticorpo produzidos, por exemplo, através da modificação de anticorpos inteiros e por síntese de novo usando metodologias de DNA recombinante.

[00144] Os anticorpos existem, por exemplo, como imunoglobulinas intactas e como um número de fragmentos de anticorpos bem caracterizados. Por exemplo, Fab, Fv e Fvs de cadeia simples (scFv) que se ligam a proteína F de RSV, seria agentes de ligação específicos para a proteína F de RSV. Isto inclui imunoglobulinas intactas e as suas variantes e porções delas bem conhecidas na especialidade, tais como "fragmentos de F (ab) 'Fab 2 fragmentos, proteínas de Fv de cadeia simples (" scFv ") e dissulfureto estabilizado proteínas Fv (" dsFv " ). Uma proteína scFv é uma proteína de fusão em que uma região variável de cadeia leve de uma imunoglobulina e uma região variável da cadeia pesada de uma imunoglobulina está ligado por um ligante, enquanto que na dsFvs, as cadeias foram com mutação para introduzir uma ligação de dissulfureto para estabilizar a associação das cadeias. O termo também inclui formas modificadas geneticamente, tais como anticorpos quiméricos (tais como os anticorpos de murino, anticorpos humanizados) heteroconjugados (tais como os anticorpos biespecíficos). Vide também, Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 3a Ed., W.H. Freeman & Co., New York, 1997.

[00145] Os fragmentos de anticorpos são definidos como se segue: (1) Fab, o fragmento que contém um fragmento monovalente de ligação ao antígeno de uma molécula de anticorpo produzida por digestão do anticorpo inteiro com a enzima papaína para produzir uma cadeia leve intacta e uma porção de uma cadeia pesada; (2) Fab ', o fragmento de uma molécula de anticorpo obtidos por tratamento do anticorpo inteiro com pepsina, seguido de redução, para produzir uma cadeia leve intacta e uma porção da cadeia pesada; dois fragmentos Fab 'são obtidos por molécula de anticorpo; (3) (Fab')2, o fragmento do anticorpo obtido por tratamento do anticorpo inteiro com a enzima pepsina sem redução subsequente; (4) F(ab')2, um dímero de dois fragmentos Fab' mantidos juntos através de duas ligações de dissulfureto; (5) Fv, um fragmento geneticamente modificado que contém a região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia pesada expressas como duas cadeias; e (6) anticorpo de cadeia simples ("SCA"), uma molécula geneticamente modificada que contém a região variável da cadeia leve, a região variável da cadeia pesada, ligadas através de um ligante polipeptídico adequado como uma molécula de cadeia única geneticamente fundida.

[00146] Tipicamente, uma imunoglobulina que ocorre naturalmente (H) tem cadeias pesadas e leves (L) interconectadas por ligações de dissulfureto. Existem dois tipos de cadeia leve, lambda (À) e kappa (K). Existem cinco classes principais de cadeias pesadas (ou isotipos) que determinam a atividade funcional de uma molécula de anticorpo: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. Os anticorpos descritos podem ser de classe comutada.

[00147] Cada cadeia pesada e leve contém uma região constante e uma região variável, (as regiões são também conhecidos como "domínios"). Em várias modalidades, a pesada e dos domínios variáveis da cadeia leve se combinam para se ligarem especificamente ao antígeno. Em modalidades adicionais, o domínio única variável de cadeia pesada é necessária. Por exemplo, anticorpos que ocorrem naturalmente camelídeos que consistem de uma única cadeia pesada são funcional e estável na ausência de cadeia leve (ver, por exemplo, Hamers-Casterman et al, Nature, 363: 446-448, 1993; Sheriff et al, Nat. Struct. Biol, 3: 733-736, 1996). Cadeia leve e pesada domínios variáveis contêm uma região de "quadro" interrompida por três regiões hipervariáveis, também denominadas "regiões determinantes de complementaridade" ou "CDR" (vide, por exemplo, Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). As sequências das regiões de esqueleto de diferentes cadeias leves ou pesadas são relativamente conservadas dentro de uma espécie. A região de estrutura de um anticorpo, isto é, as regiões de esqueleto combinadas da luz e as cadeias pesadas constituintes, servem para posicionar e alinhar as CDR no espaço tridimensional.

[00148] As CDRs são essencialmente responsáveis pela ligação a um epitopo de um antígeno. As fronteiras da sequência de aminoácidos de uma dada CDR pode ser prontamente determinada usando qualquer um de uma pluralidade de esquemas bem conhecidos, incluindo aqueles descritos por Kabat et al. ("Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991; "sistema de numeração de Kabat"), Al- Lazikani et al., (JMB 273,927-948, 1997; "sistema de numeração de Chothia") e Lefranc et al. ("numeração IMGT única para imunoglobulina e domínios variáveis de receptores de células T e domínios da superfamília Ig de tipo V", Dev Comp Immunol, 27: 55-77, 2003; "sistema de numeração IMGT").

[00149] As CDRs de cada cadeia são tipicamente referidos como CDR1, CDR2 e CDR3 (a partir do N-terminal para C-terminal) e são também tipicamente identificados pela cadeia em que a CDR particular está localizada. Assim, uma \ % CDR3 está localizado no domínio variável da cadeia pesada do anticorpo, em que se encontra, enquanto que uma VL CDR1 CDRL é a do domínio variável da cadeia leve do anticorpo, em que se encontra. CDRs da cadeia leve são muitas vezes referidos como CDR LI, CDR L2 e CDR L3. CDRs da cadeia pesada são muitas vezes referidos como CDR Hl, CDR H2 e CDR H3.

[00150] Antígeno: Um composto, composição ou substância que pode estimular a produção de anticorpos ou uma resposta de células T em um animal, incluindo composições que são absorvidos ou injetados em um animal. Um antígeno reage com os produtos de imunidade humoral ou celular específica, incluindo as induzidas por antígenos heterólogos, tais como as proteínas F de RSV recombinantes descritos.

[00151] Exemplos de antígenos incluem, mas não se limitam a, polipeptídeos, peptídeos, lipídios, polissacarídeos, combinações destas (tais como os glicopeptídeos) e os ácidos nucleicos que contêm determinantes antigênicos, tais como as que foram reconhecidas por uma célula imunitária. Em alguns exemplos, incluem antígenos de peptídeos derivados de um patógeno de interesse, tais como o RSV. Em exemplos específicos, um antígeno é derivado de RSV, tal como um antígeno, incluindo uma proteína F de RSV modificado estabilizado em uma conformação pré-fusão. "Epitopo" ou "determinante antigênico" se refere à região de um antígeno ao qual B e/ou células T respondem.

[00152] Agente anti-RSV: Um agente que inibe especificamente a replicação de RSV ou infectar células. Exemplos não limitativos de agentes anti-RSV incluem o anticorpo monoclonal palivizumabe (SYNAGIS®; Medimmune, Inc.) e a pequena molécula antiviral ribavirina (fabricado por muitas fontes, por exemplo, Warrick Pharmaceuticals, Inc.).

[00153] Coordenadas atômicas ou coordenada de estrutura: coordenadas matemáticas derivadas a partir de equações matemáticas relacionadas com os padrões obtidos na difração de um feixe monocromático de raios X pelos átomos (centros de dispersão), tais como um antígeno ou um antígeno em complexo com um anticorpo. Em alguns exemplos que o antígeno pode ser a proteína F de RSV (por exemplo, estabilizada em uma conformação pré-fusão por ligação a um anticorpo específico pré-fusão ou pela introdução de modificações de estabilização) em um cristal. Os dados de difração são usados para calcular um mapa da densidade electrónica da unidade repetitiva do cristal. Os mapas de densidade electrónica são usados para estabelecer as posições dos átomos individuais dentro da célula unitária do cristal. Em um exemplo, o termo "coordenadas estruturais" se refere a coordenadas cartesianas derivados a partir de equações matemáticas relacionadas com os padrões obtidos na difração de um feixe monocromático de raios X, tais como os átomos de por uma proteína F de RSV em forma cristalina.

[00154] Aqueles versados na técnica entenderão que um conjunto de coordenadas estruturais determinadas por cristalografia de raios X não está isenta de erro padrão. Para a finalidade da presente relatório descritivo, qualquer conjunto de coordenadas de estrutura que têm um desvio quadrático médio dos átomos da estrutura da proteína (N, Ca, C e S) inferior a cerca de 1,0 Angstroms, quando superimpostas, tal como cerca de 0,75 ou cerca de 0,5 ou cerca de 0,25 Angstroms, usando átomos estruturais, devem (na ausência de uma declaração explícita em contrário) ser considerado idêntico.

[00155] Cavidade de preenchimento de substituição de aminoácidos: uma substituição de aminoácidos que preenche uma cavidade no interior do núcleo da proteína da proteína F de RSV, por exemplo uma cavidade presente em um protômero de a proteína F de RSV ou uma cavidade entre protômeros da proteína F de RSV. As cavidades são essencialmente anula dentro de uma proteína dobrada onde os aminoácidos ou cadeias laterais de aminoácidos que não estão presentes. Em várias modalidades, uma substituição de aminoácido cavidade de preenchimento é introduzido para encher uma cavidade no núcleo da proteína F de RSV presente no pré-fusão proteína F de RSV que o colapso conformação (por exemplo, o volume, reduziram) depois da transição para a conformação pós-fusão.

[00156] Permutação circular: Uma proteína recombinante modificado, no qual as ligações entre as diferentes regiões de uma estrutura terciária de proteína é modificada, de modo a que a ordem relativa das diferentes regiões da sequência primária é alterada, mas o posicionamento das regiões na estrutura terciária é preservada. Por exemplo, com uma folha de cadeia antiparalela 4, com a cadeia A, B, C e D, que tem a seguinte N e C terminais e conectividade: Nterm - fita A - ligante - fita B - ligante - fita C ligante - D fita - Cterm, permutações circulares das 4 fitas, A, B, C e D ao alterar a ligação de ligante entre fitas que incluem Permutação com N- e C-terminals alterados Nterm - fita C - ligante - fita D - ligante - fita A - ligante - fita B - Cterm, Permutação com N-término preservado: Nterm - fita A - ligante - fita D - ligante - fita C - ligante - fita B - C term, Permutação com C-terminal preservado: Nterm - fita C - ligante - fita B - ligante - fita A - ligante - fita D - C term.

[00157] Contato: Colocação em associação física direta; inclui tanto na forma sólida e líquida. Como contatar inclui o contato entre uma molécula e uma outra molécula, por exemplo o aminoácido na superfície de um polipeptídeo, tal como um antígeno, que o contato outro polipeptídeo, tal como um anticorpo. Como contatar também inclui a administração, como a administração de um antígeno descrita a um indivíduo por uma via escolhida.

[00158] Controle: Um padrão de referência. Em algumas modalidades, o controle é uma amostra de controle negativo obtido a partir de um paciente saudável. Em outras modalidades, o controle é uma amostra de controle positivo obtido a partir de um paciente com diagnóstico de infecção por RSV. Em ainda outras modalidades, o controle é um controle histórico ou valor de referência padrão ou intervalo de valores (tal como uma amostra de controle previamente testados, tais como um grupo de pacientes com RSV com prognóstico conhecida ou resultado ou grupo de amostras que representam a linha de base ou normal os valores).

[00159] A diferença entre uma amostra de teste e um controle pode ser um aumento ou uma diminuição inversamente. A diferença pode ser uma diferença qualitativa ou quantitativa a diferença, por exemplo, uma diferença estatisticamente significativa. Em alguns exemplos, a diferença é um aumento ou diminuição, relativamente a um controle, de pelo menos cerca de 5%, tal como pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 100%, pelo menos cerca de 150%, pelo menos cerca de 200%, pelo menos cerca de 250%, pelo menos cerca de 300%, pelo menos cerca de 350%, pelo menos cerca de 400%, pelo menos cerca de 500% ou maior do que 500%.

[00160] D25: Um anticorpo monoclonal neutralizante que se liga especificamente à conformação pré-fusão da proteína F de RSV, mas não a conformação pós fusão F de RSV. Sequências de proteína e de ácido nucleico D25 são conhecidos, por exemplo, as sequências de aminoácidos das cadeias pesada e leve do anticorpo D25 estão estabelecidas no Pedido de Patente dos Estados Unidos No 2010/0239593, que é aqui incorporada na íntegra; vide também, Kwakkenbos et al., Nat. Med., 16: 123-128, 2009). Conforme descrito no Exemplo 1, D25 se liga especificamente a um epitopo quaternário (incluído no sítio antigênico 0) encontrada na proteína F de RSV na sua conformação pré-fusão, mas não a conformação pós fusão. Este epitopo é incluído dentro de F de RSV posições 62-69 e 196-209 e localizado no vértice da membrana distal da proteína F de RSV na conformação pré-fusão (ver, por exemplo, as Figuras 9A e 2B). Antes do presente relatório descritivo, não se sabia que era D25 específico para a conformação pré-fusão F de RSV). Em várias modalidades, o anticorpo D25 se liga especificamente aos antígenos PreF descritos aqui.

[00161] Variante degenerada e variante conservativa: Um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que inclui uma sequência que é degenerada em resultado do código genético. Por exemplo, um polinucleotídeo que codifica um antígeno descrito ou um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno descrito, que inclui uma sequência que é degenerada em resultado do código genético. Existem 20 aminoácidos naturais, a maioria dos quais são especificados por mais de um códon. Por isso, todas as sequências nucleotídicas degeneradas estão incluídas, desde que a sequência de aminoácidos do antígeno ou anticorpo que se liga o antígeno codificado pela sequência de nucleotídeos é inalterada. Devido à degenerescência do código genético, um grande número de ácidos nucleicos funcionalmente idênticos codifica qualquer dado polipeptídeo. Por exemplo, os códons CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG e codificam todos o aminoácido arginina. Assim, em cada posição em que uma arginina é especificada dentro de uma sequência de codificação de proteína, o códon pode ser alterado para qualquer dos códons correspondentes descritos sem alterar a proteína codificada. Tais variações de ácido nucleico são "variações silenciosas", que são uma espécie de variações conservativas. Cada sequcia de ido nucleico aqui que codifica um polipeptídeo também descreve qualquer possível variação silenciosa. Um perito reconhecerá que cada códon em um ácido nucleico (excepto AUG, que é normalmente o único códon para a metionina) pode ser modificado para produzir uma molécula funcionalmente idêntica através de técnicas convencionais. Por conseguinte, cada "variação silenciosa" de um ácido nucleico que codifica para um polipeptídeo está implícita em cada sequência descrita.

[00162] Aqueles versados na técnica reconhecerá que substituições individuais, eliminações ou adições que alteram, adicionam ou eliminar um único aminoácido ou uma pequena percentagem de aminoácidos (por exemplo, menos do que 5%, em algumas modalidades menos de 1%) em uma sequência codificada são variações conservativas, onde as alterações resultam na substituição de um aminoácido por um aminoácido quimicamente similar.

[00163] As substituições de aminoácidos conservativas proporcionam aminoácidos funcionalmente similares são bem conhecidos na técnica. Os seis grupos seguintes contêm cada um aminoácidos que são substituições conservativas entre si:

[00164] 1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);

[00165] 2) Ácido aspártico (D), ácido Glutâmico (E);

[00166] 3) Asparagina (N), Glutamina (Q);

[00167] 4) Arginina (R), Lisina (K);

[00168] 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); e

[00169] 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W).

[00170] Nem todas as posições de resíduos dentro de uma proteína irão tolerar uma substituição de outro modo "conservativas". Por exemplo, se um resíduo de aminoácido é essencial para a função da proteína, até mesmo uma substituição de outra forma conservativa pode interromper essa atividade, por exemplo, ligação de um anticorpo para um epitopo alvo específico pode ser interrompida por uma mutação conservativa no epitopo alvo.

[00171] Epitopo: um determinante antigênico. Estes são determinados grupos químicos ou sequências peptídicas em uma molécula que é antigênica, de tal modo que elas induzem uma resposta imune específica, por exemplo, um epitopo representa a região de um antígeno ao qual B e/ou células T respondem. Um anticorpo liga a um epitopo antigênico particular, tal como um epitopo de uma proteína F de RSV, por exemplo, um D25 ou AM22 epitopo presente na conformação pré-fusão da proteína F de RSV.

[00172] Os epitopos podem ser formados tanto a partir de aminoácidos contíguos ou não contíguos aminoácidos justapostos por dobragem terciária de uma proteína. Os epitopos formados a partir de aminoácidos contíguos são tipicamente mantidas a exposição a solventes desnaturantes enquanto que os epitopos formados por dobragem terciária são tipicamente perdidos no tratamento com solventes desnaturantes. Um epitopo tipicamente inclui pelo menos 3 e mais geralmente, pelo menos 5, de cerca de 9 ou cerca de 8-10 aminoácidos em uma conformação espacial única. De raios-x Os métodos para determinar a conformação espacial de epitopos incluem, por exemplo, cristalografia e ressonância magnética nuclear. Os epitopos também podem incluir a modificação pós-tradução de aminoácidos, tais como a glicosilação N-ligada.

[00173] Em uma modalidade, as células T respondem ao epitopo, quando o epitopo é apresentado em conjunto com uma molécula de MHC. Os epitopos podem ser formados tanto a partir de aminoácidos contíguos ou não contíguos aminoácidos justapostos por dobragem terciária de uma proteína. Os epitopos formados a partir de aminoácidos contíguos são tipicamente mantidas a exposição a solventes desnaturantes enquanto que os epitopos formados por dobragem terciária são tipicamente perdidos no tratamento com solventes desnaturantes. Um epitopo tipicamente inclui pelo menos 3 e mais geralmente, pelo menos 5, de cerca de 9 ou cerca de 8-10 aminoácidos em uma conformação espacial única. Métodos de determinação da conformação espacial de epitopos incluem cristalografia de raios-x, por exemplo e de ressonância magnética nuclear.

[00174] Um "epitopo alvo" é um epitopo específico em um antígeno que se liga especificamente a um anticorpo de interesse, tal como um anticorpo monoclonal. Em alguns exemplos, um epitopo alvo inclui os resíduos de aminoácidos que contatam com o anticorpo de interesse, de tal modo que o epitopo alvo pode ser selecionado por os resíduos de aminoácidos determinadas para estar em contato com o anticorpo de interesse.

[00175] Quantidade eficaz: Uma quantidade de agente, tal como um antígeno PreF ou ácido nucleico que codifica um antígeno PreF ou outro agente que é suficiente para gerar uma resposta desejada, tal como uma resposta imune à proteína F de RSV ou uma redução ou eliminação de um sinal ou sintoma de uma doença ou condição, tal como infecção por RSV. Por exemplo, esta pode ser a quantidade necessária para inibir a replicação virai ou a alterar de forma mensurável sintomas externos da infecção viral. Em geral, essa quantidade será suficiente para inibir de forma mensurável vírus (por, exemplo RSV) replicação ou da capacidade de infecção. Quando administrado a um indivíduo, uma dosagem será geralmente usada que irá alcançar as concentrações nos tecidos-alvo (por exemplo, no tecido respiratório) que foi mostrado para alcançar inibição in vitro da replicação viral. Em alguns exemplos, uma "quantidade eficaz" é aquela que trata (incluindo profilaxia) de um ou mais sintomas e/ou causas de qualquer um de um transtorno ou doença subjacente, por exemplo para tratar a infecção por RSV. Em um exemplo, uma quantidade eficaz é uma quantidade terapeuticamente eficaz. Em um exemplo, uma quantidade eficaz é uma quantidade que evita que um ou mais sinais ou sintomas de uma doença ou estado de desenvolvimento particular, tal como um ou mais sinais ou sintomas associados com a infecção por RSV.

[00176] Expressão: A tradução de um ácido nucleico para uma proteína. As proteínas podem ser expressas e permanecer intracelular, tornar-se um componente da membrana de superfície da célula ou seja segregada para o meio ou matriz extracelular.

[00177] Sequências de controle da expressão: sequências de ácido nucleico que regulam a expressão de uma sequência de ácido nucleico heterólogo a que está operacionalmente ligada. Sequências de controle de expressão estão operacionalmente ligadas a uma sequência de ácido nucleico quando as sequências de controle de expressão controlam e regulam a transcrição e, quando adequado, a tradução da sequência de ácido nucleico. Assim, sequências de controle de expressão podem incluir promotores adequados, potencializadores, terminadores de transcrição, um códon de iniciação (ATG) na frente de um gene que codifica proteína, sinais de splicing para íntrons, manutenção da estrutura de leitura correta daquele gene para permitir a tradução adequada do RNAm e parar de códons. O termo "sequências de controle" pretende incluir, no mínimo, componentes cuja presença possa influenciar a expressão e pode também incluir componentes adicionais cuja presença é vantajosa, por exemplo, sequências líder e sequências parceiro de fusão. Sequências de controle de expressão podem incluir um promotor.

[00178] Um promotor é uma sequência mínima suficiente para dirigir a transcrição direta. Também incluídos são os elementos promotores que são suficientes para tornar o promotor dependente de expressão de genes controlável para o tipo específico de células, específica do tecido ou indutível através de sinais ou agentes externos; tais elementos podem estar localizados na extremidade 5 'ou 3' do gene de regiões. Tanto promotores constitutivos e indutíveis são incluídos (vide, por exemplo, Bitter et al., Methods in Enzymology 153: 516-544, 1987). Por exemplo, quando se clona em sistemas bacterianos, podem ser usados promotores indutíveis tais como pL do bacteriófago lambda, plac, ptrp, ptac (ptrp-lac promotor híbrido) e assim por diante. Em uma modalidade, quando se clona em sistemas de células de mamíferos, os promotores derivados do genoma de células de mamíferos (tais como o promotor de metalotioneína) ou de vírus de mamíferos (tais como a repetição terminal longa do retrovírus, o promotor tardio do adenovírus; o promotor 7.5K do vírus da varíola) pode ser usado. Os promotores produzidos por técnicas de DNA recombinante ou sintéticas podem também ser usados para proporcionar a transcrição das sequências de ácido nucleico.

[00179] Um polinucleotídeo pode ser inserido em um vetor de expressão que contém uma sequência promotora que facilita a transcrição eficiente da sequência genética inserida do hospedeiro. O vetor de expressão contém tipicamente uma origem de replicação, um promotor, bem como sequências de ácidos nucleicos específicos que permitem a seleção fenotípica das células transformadas.

[00180] Ferritina: Uma proteína que armazena ferro e libera-lo de uma forma controlada. A proteína é produzida por quase todos os organismos vivos. A ferritina monta em um complexo de proteína globular que em alguns casos é constituída por 24 subunidades proteicas. Em alguns exemplos, a ferritina é usada para formar uma nanopartícula que apresenta antígenos na sua superfície, por exemplo um antígeno de RSV, tais como os antígenos de proteínas RS VF descritos estabilizados em uma conformação pré-fusão.

[00181] Domínio Foldon: uma sequência de aminoácidos que naturalmente forma uma estrutura trimérica. Em alguns exemplos, um domínio Foldon podem ser incluídos na sequência de aminoácidos de um antígeno da proteína F de RSV descrito estabilizado em uma conformação pré-fusão de modo a que o antígeno vai formar um trímero. Em um exemplo, um domínio é o domínio Foldon T4 Foldon apresentada como SEQ ID NO: 351 (GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTF). Várias modalidades incluem um domínio Foldon que pode ser clivado a partir de uma proteína purificada, por exemplo, por incorporação de um sítio de trombina clivam adjacente ao domínio Foldon que pode ser usado para fins de clivagem.

[00182] Glicoproteína (GP): Uma proteína que contém cadeias de oligossacarídeos (glicanas) ligadas covalentemente a cadeias laterais de polipeptídeo. O hidrato de carbono é ligada à proteína em uma modificação pós-traducional ou cotraducional. Este processo é conhecido como a glicosilação. Em proteínas que possuem segmentos que se estendem no meio extracelular, os segmentos extracelulares são frequentemente glicosilada. As glicoproteínas são muitas vezes as proteínas de membrana integrais importantes, em que desempenham um papel em interações célula-célula. Em alguns exemplos de uma glicoproteína é uma glicoproteína de RSV, tal como um antígeno de proteína F de RSV estabilizado em uma conformação pré-fusão ou um fragmento do mesmo imunogênico.

[00183] Sítio de glicosilação: uma sequência de aminoácidos na superfície de um polipeptídeo, tal como uma proteína, a qual acomoda a colocação de um glicana. Um sítio de glicosilação ligado a N é a sequência tripleto de NX (S/T) onde N é asparagina, X representa qualquer resíduo exceto a prolina e (S/T) é um resíduo de serina ou treonina. Um glicana é um oligossacarídeo ou polissacarídeo. Glicana pode também ser usado para se referir à porção de hidrato de carbono de um glicoconjugado, tal como uma glicoproteína, glicolipídio ou um proteoglicana.

[00184] Proteínas homólogas: proteínas que têm uma estrutura e função semelhantes, por exemplo, proteínas de duas ou mais espécies ou estirpes virais que tenham uma estrutura e função similares nas duas ou mais espécies ou estirpes virais. Por exemplo, uma proteína F de RSV a partir de RSV A é uma proteína homóloga a uma proteína F de RSV a partir de RSV bovino. Proteínas homólogas partilham características semelhantes de enovelamento de proteínas e pode ser considerado homólogos estruturais.

[00185] Proteínas homólogas tipicamente compartilhar um elevado grau de conservação da sequência, tal como pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94% ou pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou, pelo menos, 99 conservação% sequência e um elevado grau de identidade de sequência, tal como pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92 %, pelo menos 93%, pelo menos 94% ou pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[00186] Células hospedeiras: As células em que um vetor pode ser propagado e o seu DNA expresso. A célula pode ser procariótica ou eucariótica. O termo inclui também qualquer descendência da célula hospedeira indivíduo. Deverá ser entendido que toda a descendência pode não ser idêntica à célula parental uma vez que pode haver mutações que ocorrem durante a replicação. No entanto, tal descendência está incluída quando o termo "célula hospedeira" é usado.

[00187] Imunógeno: uma proteína ou uma sua porção que seja capaz de induzir a uma resposta imune em um mamífero, tal como um mamífero infectado ou em risco de infecção com um agente patogênico. A administração de um imunógeno pode conduzir a imunidade protetora e/ou imunidade preventiva contra um agente patogênico de interesse. Em alguns exemplos, um imunógeno inclui um antígeno PreF descrito.

[00188] Resposta imune: A resposta de uma célula do sistema imunitário, tais como células B, células T ou de monócitos, a um estímulo. Em uma modalidade, a resposta é específica para um antígeno particular (uma "resposta especifica para o antígeno"). Em uma modalidade, uma resposta imune é uma resposta de células T, tal como uma resposta de células T CD4 + ou CD8 +, uma resposta. Em uma outra modalidade, a resposta é uma resposta de células B e resulta na produção de anticorpos específicos.

[00189] Uma resposta imune tendenciosa de "Th1" é caracterizada pela presença de células T auxiliares CD4 + que produzem IL-2 e IFN- Y, e, assim, pela secreção ou na presença de IL-2 e IFN-Y. Em contraste, um "Th2" resposta imune tendenciosa é caracterizado por uma preponderância de células auxiliares T CD4 + que produzem IL-4, IL-5 e IL-13.

[00190] Composição imunogênica: Uma composição que compreende um antígeno que induz uma resposta imune, tal como uma resposta de CTL mensurável contra vírus que expressam o antígeno ou uma resposta de células B mensurável (tais como a produção de anticorpos) contra o antígeno. Como tal, uma composição imunogênica inclui um ou mais antígenos (por exemplo, antígenos polipeptídicos) ou epitopos antigênicos. Uma composição imunogênica também pode incluir um ou mais componentes adicionais, capazes de induzir ou intensificar uma resposta imune, tal como um excipiente, transportador e/ou adjuvante. Em determinados casos, as composições imunogênicas são administradas para induzir a uma resposta imune que protege contra os sintomas do indivíduo ou condições induzidas por um agente patogênico. Em alguns casos, os sintomas ou doença causada por um agente patogênico é impedida (ou reduzida ou melhorada) por inibição da replicação do agente patogênico (por exemplo, RSV) após a exposição do indivíduo ao agente patogênico. Em um exemplo, uma "composição imunogênica" inclui uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão, que induz uma resposta de CTL mensurável contra o vírus expressando a proteína F de RSV ou induz uma resposta de células B mensurável (tais como a produção de anticorpos) contra RSV proteína F. Se refere ainda a ácidos nucleicos isolados que codificam um antígeno, tal como um ácido nucleico que pode ser usada para expressar o antígeno (e assim, ser usado para eliciar uma resposta imune contra esse polipeptídeo).

[00191] Para uso in vitro, uma composição imunogênica pode incluir um antígeno ou ácido nucleico que codifica um antígeno. Para uso in vivo, a composição imunogênica tipicamente incluirá a proteína, peptídeo imunogênico ou ácido nucleico em transportadores farmaceuticamente aceitáveis e/ou outros agentes. Qualquer peptídeo particular, tal como uma proteína F de RSV descrito estabilizado em uma conformação pré-fusão ou um ácido nucleico que codifica para uma proteína F de RSV descrito estabilizado em uma conformação pré- fusão, podem ser prontamente testados quanto à sua capacidade para induzir a uma resposta de CTL ou de célula B por técnica- ensaios reconhecidos. As composições imunogênicas podem incluir adjuvantes, que são bem conhecidos de um perito na técnica.

[00192] Condições imunologicamente reativas: inclui referência a condições que permitem que um anticorpo criado contra um epitopo particular se ligar ao epitopo que a um grau detectavelmente maior do que e/ou para a exclusão substancial dos, que se ligam a substancialmente todos os outros epitopos. Imunologicamente reativos condições são dependentes do formato da reação de ligação de anticorpos e, tipicamente, são aqueles usados em protocolos de imunoensaio ou aquelas condições encontradas in vivo. As condições imunologicamente reativos usados nos métodos são "condições fisiológicas", que incluem as condições de referência (tais como a temperatura, a osmolaridade, pH) que são típicas no interior de um mamífero vivo ou uma célula de mamífero. Enquanto que se reconhece que alguns órgãos são sujeitas a condições extremas, o ambiente intra- organismo ao e intracelular é normalmente cerca de pH 7 (tal como desde pH 6,0 a pH 8,0, mais tipicamente pH 6,5 a 7,5), contém água como o solvente predominante e existe a uma temperatura acima de 0°C e abaixo de 50°C. A osmolaridade está dentro da gama que é favorável à viabilidade e proliferação celular.

[00193] Sonda imune: Uma molécula que pode ser usada para a seleção de anticorpos a partir de soros os quais são dirigidos contra um epitopo ou antígeno específico, incluindo a partir de soros de doentes humanos. Em alguns exemplos, o descrito F de RSV proteínas estabilizadas em uma conformação pré-fusão pode ser usado como sondas imunológicas, tanto na seleção positiva e negativa de anticorpos específicos para a proteína F de RSV em uma conformação pré-fusão.

[00194] Superfície imunogênica: Uma superfície de uma molécula, por exemplo a proteína F de RSV, capaz de desencadear uma resposta imune. Uma superfície imunogênica inclui as características definidoras do que a superfície, por exemplo, a forma tridimensional e a carga de superfície. Em alguns exemplos, uma superfície imunogênico é definida pelos aminoácidos na superfície de uma proteína ou peptídeo que estão em contato com um anticorpo, tal como um anticorpo de neutralização, quando a proteína e o anticorpo são ligados em conjunto. Um epitopo inclui uma superfície alvo imunogênico. Superfície imunogênico é sinônimo de superfície antigênica.

[00195] Inibir ou tratar uma doença: a inibição do desenvolvimento completo de uma doença ou condição, por exemplo, em um indivíduo que esteja em risco de uma doença, tal como a infecção por RSV. "Tratamento" se refere a uma intervenção terapêutica que melhora um sintoma ou sinal de uma doença ou condição patológica depois de ter começado a desenvolver-se. O termo "melhorar," com referência a uma doença ou condição patológica, se refere a qualquer efeito benéfico do tratamento observável. O efeito benéfico pode ser evidenciado, por exemplo, por um atraso no aparecimento de sintomas clínicos da doença em um indivíduo susceptível, uma redução da gravidade de alguns ou de todos os sintomas clínicos da doença, uma progressão mais lenta da doença, uma melhoria na a saúde em geral ou bem-estar do indivíduo ou por outros parâmetros bem conhecidos na técnica que são específicos para a doença particular. Um tratamento "profilática" é um tratamento administrado a um indivíduo que não exibe sinais de uma doença ou exibe única primeiros sinais com a finalidade de diminuir o risco de desenvolver a patologia.

[00196] O termo "reduz" é um termo relativo, de modo a que um agente reduz uma resposta ou condição, se a resposta ou condição é quantitativamente diminuída após a administração do agente ou se é diminuída depois da administração do agente, em comparação com um agente de referência. Da mesma forma, o termo "evita" não significa necessariamente que um agente elimina completamente a resposta ou condição, desde que pelo menos uma característica da resposta ou condição é eliminada. Assim, uma composição imunogênica que reduz ou previne uma infecção ou uma resposta, como uma resposta patológica, por exemplo, vacina contra a doença virai melhorada, pode, mas não elimina necessariamente completamente uma infecção ou tal resposta, desde que a infecção ou resposta é mensuravelmente reduzida, por exemplo, em pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos cerca de 70% ou cerca de 80% ou mesmo de cerca de 90% de (isto é, 10% ou menos do que) a infecção ou resposta no ausência do agente ou em comparação com um agente de referência.

[00197] Isolado: Um componente biológico"isolado" (tal como uma proteína, por exemplo um antígeno PreF descrito ou ácido nucleico que codifica um tal antígeno) foi substancialmente separado ou purificado a partir de outros componentes biológicos, tais como outros componentes biológicos em que o componente naturalmente ocorre, tal como outro DNA cromossómico e extracromossômico, RNA e proteínas. Proteínas, peptídeos e ácidos nucleicos que tenham sido "isolado" incluem proteínas purificadas por métodos de purificação convencionais. O termo também abrange proteínas ou peptídeos preparados por expressão recombinante em uma célula hospedeira, bem como proteínas quimicamente sintetizados, os peptídeos e moléculas de ácido nucleico. Isolado não requer uma pureza absoluta e pode incluir a proteína, peptídeo ou moléculas de ácido nucleico que são pelo menos 50% isolado, tal como pelo menos 75%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mesmo isolado de 99,9%. Os antígenos PreF descritos aqui (por exemplo, um isolado recombinante proteína F de RSV estabilizado em uma conformação pré-fusão) são isoladas a partir de Proteínas F de RSV em uma conformação pós-fusão, por exemplo, são, pelo menos, 80% isolado, pelo menos, 90%, 95 %, 98%, 99% ou mesmo 99,9% isolada a partir de proteínas F de RSV em uma conformação pós-fusão. Em várias modalidades, o antígeno PreF está substancialmente separado de Proteínas F de RSV que não incluem antígeno sítio de 0 e/ou não está especificamente ligada por um anticorpo monoclonal específico pré-fusão (tais como D25 ou AM22), por exemplo, o antígeno PreF pode ser pelo menos 80% isolado, pelo menos, 90%, 95%, 98%, 99% ou mesmo 99,9% isolado a partir de Proteínas F de RSV que não incluem antígeno sítio de 0 e/ou não está especificamente ligada por um pré-fusão anticorpo monoclonal específico, tais como D25 ou AM22.

[00198] Kd: A constante para uma dada interação, tais como uma interação ligando-polipeptídeo ou uma interação anticorpo-antígeno dissociação. Por exemplo, para a interação biomolecular de um anticorpo (tal como D25) e um antígeno (tal como a proteína F de RSV), que é a concentração dos componentes individuais da interação biomolecular dividida pela concentração do complexo. Os métodos para determinar o Kd de um anticorpo: antígeno interação são familiares para aqueles versados na técnica.

[00199] Marcador: Um composto ou composição detectável que é conjugado direta ou indiretamente, a uma outra molécula para facilitar a detecção da dita molécula., Exemplos não limitativos específicos de marcadores incluem marcadores fluorescentes, enzimáticos ligações e isótopos radioativos. Em alguns exemplos, um antígeno PreF descrito é marcado com um marcador detectável. Em alguns exemplos, a etiqueta está ligado a um antígeno descrito ou ácido nucleico que codifica um tal antígeno.

[00200] Ligante: Uma molécula bifuncional que pode ser usado para ligar duas ou mais moléculas de uma molécula em contígua, por exemplo, para ligar uma molécula transportadora para um polipeptídeo imunogênico. Os exemplos não limitativos de ligantes peptídicos incluem um grupo (G4S)1, (G4S)2 ou um grupo (648)3 peptídeo ligante.

[00201] Os termos "conjugar", "juntar", "união" ou "ligando" pode referir-se fazer duas moléculas em uma molécula contígua; por exemplo, ligando dois outros polipeptídeos em um único polipeptídeo contíguo ou ligação covalente de uma molécula de veículo ou outra molécula imunogênica de um polipeptídeo, tal como uma proteína F de RSV recombinante como descrito aqui. A ligação pode ser por meios químicos ou recombinantes. "Chemical significa" se refere a uma reação, por exemplo, entre a porção de polipeptídeo imunogênico e a molécula transportadora de modo a que existe uma ligação covalente formada entre as duas moléculas para formar uma molécula.

[00202] MPE8: Um anticorpo monoclonal neutralizante que se liga especificamente à conformação pré-fusão da proteína F de RSV, mas não para a conformação pós fusão F de RSV. Conforme descrito em Corti et al. (Nature, 501 (7467) 439-443, 2013, aqui incorporado por referência na íntegra) do anticorpo MPE8 liga a um epitopo encontrado na pré-, mas não pós-, conformações de fusão da proteína F de RSV. O epitopo MPE8 não faz parte do sítio antigênico 0. A cadeia pesada e leve da região variável são sequências apresentadas como SEQ ID NOS: 1472 e 1473, respectivamente.

[00203] Antígeno nativo ou de sequência nativa: um antígeno ou sequência que não tenha sido modificado por mutação seletiva, por exemplo, mutação seletiva para focar a antigenicidade do antígeno a um epitopo alvo. Antígeno nativo ou de sequência nativa também são ditos como antígeno de tipo selvagem ou de sequência de tipo selvagem.

[00204] Ácido nucleico: Um polímero composto por unidades de nucleotídeos (ribonucleotídeos, desoxirribonucleotídeos, relacionadas que ocorrem naturalmente, variantes estruturais e análogos sintéticos que não ocorrem naturalmente dos mesmos) ligados por meio de ligações fosfodiéster que ocorrem naturalmente, relacionadas e variantes estruturais análogos não naturais sintéticos dos mesmos. Assim, o termo inclui polímeros de nucleotídeos em que os nucleotídeos e as ligações entre eles incluem análogos sintéticos que não ocorrem naturalmente, tais como, por exemplo e sem limitação, fosforotioatos, fosforamidatos, fosfonatos de metila, fosfonatos quirais-metila, 2-O- metil-ribonucleotídeos, ácidos nucleicos peptídicos-(PNAS) e assim por diante. Tais polinucleotídeos podem ser sintetizados, por exemplo, usando um sintetizador de DNA automatizado. O termo "oligonucleotídeo" se refere tipicamente a polinucleotídeos curtos, em geral, não superior a cerca de 50 nucleotídeos. Deve entender-se que quando uma sequência de nucleotídeos é representada por uma sequência de DNA (isto é, A, T, G, C), o que também inclui uma sequência de RNA (isto é, A, U, G, C) em que "L" substitui "T."

[00205] "Nucleotídeo" inclui, mas não está limitado a, um monómero que inclui uma base ligada a um açúcar, tal como uma pirimidina, purina ou análogos sintéticos dos mesmos ou uma base ligada a um aminoácido, como em um ácido peptídeo nucleico (PNA ). Um nucleotídeo é um monómero em um polinucleotídeo. Uma sequência de nucleotídeos se refere à sequência de bases de um polinucleotídeo.

[00206] Notação convencional é aqui usada para descrever sequências de nucleotídeos: a extremidade do lado esquerdo de uma sequência de nucleotídeos de cadeia simples é a extremidade 5 '; a direção à esquerda de uma sequência de nucleotídeos de cadeia dupla é dito como a 5'-sentido. A direção de 5 'para 3' a adição de nucleotídeos transcritos de RNA nascentes é designado por sentido da transcrição. A cadeia de DNA possuindo a mesma sequência que um RNAm é designada por "cadeia codificadora;" sequências na cadeia de DNA possuindo a mesma sequência que um RNAm transcrito a partir desse DNA e que estão localizadas 5 'para a extremidade 5' do transcrito de RNA são denominadas "sequências a montante"; sequências na cadeia de DNA possuindo a mesma sequência que o RNA e que são 3 'relativamente à extremidade 3' do transcrito de RNA de codificação são ditos como "sequências a jusante".

[00207] "cDNA" refere-se a um DNA que é complementar ou idêntico a um RNAm, quer em cadeia simples ou dupla forma de cadeia.

[00208] "Codificação" refere-se à propriedade inerente de sequências específicas de nucleotídeos de um polinucleotídeo, tal como um gene, um DNAc ou um RNAm, que servem como moldes para a síntese de outros polímeros e macromoléculas em processos biológicos, tendo ou uma sequência definida de nucleotídeos (por exemplo, RNAr, RNAt e RNAm) ou uma sequência de aminoácidos definida e as propriedades biológicas delas resultante. Assim, um gene codifica para uma proteína se a transcrição e tradução do RNAm produzido por esse gene produzem a proteína em uma célula ou outro sistema biológico. Tanto a cadeia codificante, a sequência de nucleotídeos de que é idêntica à sequência de RNAm e é normalmente fornecido na listagem de sequências e cadeia não codificante, usada como modelo para a transcrição, de um gene ou DNAc podem ser ditos como codificando a proteína ou outro produto de gene ou DNAc que. Salvo especificação em contrário, uma "sequência nucleotídica que codifica uma sequência de aminoácido" inclui todas as sequências de nucleotídeos que são versões degeneradas uma da outra e que codificam para a mesma sequência de aminoácidos. As sequências de nucleotídeos que codificam para proteínas e o RNA podem incluir intrões. Em alguns exemplos, um ácido nucleico que codifica um antígeno PreF descrito.

[00209] Operativamente ligado: uma primeira sequência de ácido nucleico está operacionalmente ligada a uma segunda sequência de ácido nucleico quando a primeira sequência de ácido nucleico é colocado em uma relação funcional com a segunda sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor está operativamente ligado a uma sequência de codificação se o promotor afeta a transcrição ou a expressão da sequência de codificação. Geralmente, sequências de DNA operativamente ligadas são contíguas e, quando é necessário unir duas regiões de codificação de proteínas, no mesmo quadro de leitura.

[00210] Anticorpo específico pré-fusão: Um anticorpo que se liga especificamente à proteína F de RSV em uma conformação pré-fusão, mas não se liga especificamente à proteína F de RSV em uma conformação pós-fusão. Anticorpos específicos pré-fusão exemplificativas incluem a D25, AM22, 5C4 e anticorpos MPE8

[00211] Polipeptídeo: qualquer cadeia de aminoácidos, independentemente do comprimento ou modificação pós-tradução (por exemplo, glicosilação ou fosforilação). "Polipeptídeo" aplica-se a polímeros de aminoácidos incluindo polímeros de aminoácidos e de polímeros de aminoácidos de ocorrência não natural que ocorre naturalmente, bem como em que um ou mais resíduos de aminoácido é um aminoácido não natural, por exemplo, um mimético químico artificial de um correspondente aminoácido de ocorrência natural. Um "resíduo" refere-se a um aminoácido ou mimético aminoácido incorporado em um polipeptídeo por uma ligação amida ou ligação amida mimética. Um polipeptídeo tem um terminal amino (N-terminal) e uma extremidade (C- terminal) da extremidade carboxila C-terminal. "Polipeptídeo" é usado de forma intercambiável com o peptídeo ou proteína e é aqui usados alternadamente para referir um polímero de resíduos de aminoácidos.

[00212] Uma única cadeia polipeptídica contígua de resíduos de aminoácido pode incluir vários polipeptídeos. Por exemplo, o RSV F0 polipeptídeo inclui um peptídeo sinal N-terminal, um polipeptídeo de F2, um polipeptídeo pep27 e um polipeptídeo incluindo F1 domínio extracelular, domínio transmembrana e cauda citosólica. Além disso, em algumas modalidades uma proteína F de RSV recombinante é uma única cadeia de proteína F de RSV que inclui um polipeptídeo de RSV F2 ligado a um polipeptídeo de RSV F1 por um ligante peptídico.

[00213] Em muitos casos, um polipeptídeo se dobra em uma estrutura tridimensional específicas e podem incluir resíduos de aminoácidos expostos à superfície e os resíduos de aminoácido não expostos à superfície. Em alguns casos, uma proteína pode incluir vários polipeptídeos que se dobram em conjunto em uma unidade funcional. Por exemplo, a proteína F de RSV é composto por heterodímeros F1 F2 que trimerizam para uma proteína multimérica. "Resíduos de aminoácidos expostos à superfície" são aqueles aminoácidos que possuem um determinado grau de exposição na superfície da proteína, por exemplo, de tal modo que eles possam entrar em contato com o solvente, quando a proteína está em solução. Em contraste, os aminoácidos não expostas da superfície são aqueles resíduos de aminoácidos que não são expostos na superfície da proteína, de tal modo que não contate solução quando a proteína está em solução. Em alguns exemplos, os resíduos de aminoácidos não são expostos à superfície da parte central da proteína.

[00214] Um "núcleo proteico" é o interior de uma proteína dobrada, a qual é substancialmente livre de exposição a solventes, tais como solvente, sob a forma de moléculas de água na solução. Tipicamente, o núcleo da proteína é predominantemente composto por aminoácidos hidrofóbicos ou apoiares. Em alguns exemplos, uma proteína núcleo pode conter aminoácidos carregados, por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico, arginina e/ou lisina. A inclusão de aminoácidos carregados descompensado (um grupo amino pode ser compensada carregada sob a forma de uma ponte salina) no núcleo da proteína podem levar a uma proteína desestabilizado. Isto é, uma proteína com uma Tm mais baixa, em seguida, uma proteína semelhante sem um aminoácido carregado não compensada no núcleo da proteína. Em outros exemplos, um núcleo de proteína pode ter uma cavidade no interior do núcleo da proteína. As cavidades são essencialmente anula dentro de uma proteína dobrada onde os aminoácidos ou cadeias laterais de aminoácidos que não estão presentes. Tais cavidades podem também desestabilizar uma proteína em relação a uma proteína semelhante sem uma cavidade. Assim, durante a criação de uma forma estabilizada de uma proteína, pode ser vantajoso para substituir resíduos de aminoácidos no interior do núcleo, a fim de preencher cavidades presentes na proteína do tipo selvagem.

[00215] Aminoácidos de um peptídeo, polipeptídeo ou proteína estão geralmente ligados quimicamente entre si através de ligações amida (CONH). Além disso, os aminoácidos podem ser ligados por outras ligações químicas. Por exemplo, ligações para os aminoácidos ou análogos de aminoácidos pode incluir CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2 -, - CH=CH— (cis e trans), -COCH2 —, -CH(OH)CH2- e -CHH2SO- (Estes e outros podem ser encontrados em Spatola, in Chemistry e Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, página 267 (1983); Spatola, A. F., Vega Data (Março de 1983), Vol. 1, Edição 3, Peptide Backbone Modifications (revisão geral); Morley, Trends Pharm Sci páginas 463-468, 1980; Hudson, et al, Int J Pept Prot Res 14: 177-185, 1979; Spatola et al. Life Sci 38: 1243-1249, 1986; Harm. Chem. Soc Perkin Trans. 1307-314, 1982; Almquist et al. J.Med. Chem. 23: 1392-1398, 1980; Jennings- White et al. Tetrahedron Lett 23: 2533, 1982; Holladay et al. Tetrahedron. Lett 24: 4401-4404, 1983; e Hruby, Life Sci 31:189-199, 1982.

[00216] Modificações peptídicas: peptídeos, tais como as proteínas de SVF descritos estabilizados em uma conformação pré-fusão pode ser modificado, por exemplo, para incluir uma substituição de aminoácidos em comparação com uma sequência de proteína nativa RS V ou por uma variedade de técnicas químicas para a produção de derivados possuindo essencialmente o mesma atividade e conformação que os peptídeos não modificados e, opcionalmente, ter outras propriedades desejáveis. Por exemplo, os grupos ácido carboxílico da proteína, quer no carbóxi término ou cadeia lateral, podem ser proporcionados sob a forma de um sal de um cátion farmaceuticamente aceitável ou estéril içado para formar um éster de alquilo C1-C16 ou convertido em uma amida de fórmula NR1R2 em que R1 e R2 são cada um independentemente H ou C1-C16 alquila ou combinados para formar um anel heterocíclico, tal como um anel de 5 ou 6 membros. Os grupos amino do peptídeo, quer do terminal amino ou cadeia lateral, pode estar na forma de um sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável, tal como HCl, HBr, ácidos acético, benzoico, toluenossulfônico, maleico, tartárico e outros sais orgânicos ou podem ser modificados para C1-C16 alquila ou dialquil-amino ou ainda convertidos em uma amida.

[00217] Os grupos hidroxila das cadeias laterais de peptídeo podem ser convertidos em C1-C16 alcóxi ou um éster de C1-C16 alquila, usando técnicas bem reconhecidas. Fenila e fenólicos anéis de as cadeias laterais de peptídeo pode ser substituído com um ou mais átomos de halogéneo, tais como F, Cl, Br ou I ou com C1-C16 alquila, C1-C16 alcóxi, ácidos carboxílicos e seus ésteres ou amidas de tais ácidos carboxílicos. Grupos metileno das cadeias laterais peptídeo pode ser estendido para homólogos de C2-C4 alquilenos. Os tióis podem ser protegidos com qualquer um de um número de grupos protetores bem conhecidos, tais como os grupos acetamida.

[00218] Veículos farmaceuticamente aceitáveis: Veículos farmaceuticamente aceitáveis são de uso convencional. Remington's Pharmaceutical Sciences, por E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 19a Edição, 1995 descreve composições e formulações apropriadas para administração dos imunógenos farmacêuticos descritos.

[00219] Em geral, a natureza do veículo dependerá do modo de administração particular a ser empregue. Por exemplo, formulações parenterais em geral compreendem fluidos injetáveis que incluem fluidos farmaceuticamente e fisiologicamente aceitáveis, tais como água, solução salina fisiológica, soluções salinas equilibradas, dextrose aquosa, glicerol ou semelhantes como veículo. Para composições sólidas (por exemplo, formas em pó, pílula, comprimido ou cápsula), veículos sólidos não tóxicos convencionais podem incluir, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido ou estearato de magnésio. Em adição aos transportadores biologicamente neutros, as composições farmacêuticas a serem administradas podem conter quantidades menores de substâncias auxiliares não tóxicas, tais como agentes umectantes ou emulsificantes, conservantes e agentes de tamponamento de pH e assim por diante, por exemplo acetato de sódio ou monolaurato de sorbitano. Em modalidades particulares, adequadas para administração a um indivíduo, o transportador pode ser esterilizada e/ou em suspensão ou de outro modo contidos em uma forma de dosagem unitária contendo uma ou mais doses medidas da composição adequada para induzir a resposta imune anti-SV desejado. Ele também pode ser acompanhado de medicamentos para a sua utilização para fins de tratamento. A forma de dosagem unitária pode ser, por exemplo, em um recipiente selado, que contém conteúdo estéril ou uma seringa para injeção em um paciente ou liofilizada para solubilização e administração subsequente ou em uma dosagem de liberação controlada ou sólido.

[00220] Vacinação de reforço: uma imunoterapia incluindo administração de uma primeira composição imunogênica (a vacina iniciador), seguida pela administração de um segundo composto imunogênico (a vacina de reforço) a um indivíduo para induzir a uma resposta imune. A vacina de iniciadores e/ou da vacina de reforço incluem um vetor (tal como um vetor, RNA ou vetor de DNA viral) que expressa o antígeno para o qual a resposta imune é dirigida. A vacina de reforço é administrado ao indivíduo após a vacina iniciador; aqueles versados na técnica compreenderão um intervalo de tempo adequado entre a administração da vacina de iniciadores e a vacina de reforço e exemplos de tais intervalos de tempo são descritos aqui. Em algumas modalidades, o iniciador de vacina, a vacina de reforço ou ambas as vacinas contra iniciador e a vacina de reforço incluem, adicionalmente, um adjuvante. Em um exemplo não limitativo, a vacina é uma vacina iniciador com base em DNA (ou outra vacina com base na distribuição de genes) e a vacina de reforço é uma vacina com base subunidade de proteína ou nanopartículas de proteína.

[00221] Nanopartícula de proteína: Uma subunidade múltipla na forma de poliedro estrutura com base em proteína. As subunidades são, cada um composto por proteínas ou polipeptídeos (por exemplo, um polipeptídeo glicosilado), e, opcionalmente, de características únicas ou múltiplas dos seguintes: ácidos nucleicos, grupos prostéticos, orgânicos e compostos inorgânicos. Exemplos não limitativos de nanopartículas de proteínas incluem as nanopartículas de ferritina (vide, por exemplo, Zhang, Y. Int J. Mol Sci, 12: 5406-5421, 2011, aqui incorporado por referência), nanopartículas encapsulina (Vide, por exemplo, Sutter et al., Nature Struct and Mol Biol., 15: 939-947, 2008, aqui incorporado por referência), enxofre oxigenase redutase (SOR) nanopartículas (vide, por exemplo, Urich et al., Science, 311: 996-1000, 2006, aqui incorporado por referência), nanopartículas sintase lumazina (vide, por exemplo, Zhang et al., J. Mol Biol, 306: 1099-1114, 2001) ou nanopartículas de piruvato desidrogenase (vide, por exemplo, Izard et al., PNAS 96: 12401245, 1999, aqui incorporado por referência). A ferritina, encapsulina, SOR, sintase lumazina e piruvato desidrogenase são proteínas monoméricas que se automontar em complexos de proteína globular que em alguns casos, consiste em 24, 60, subunidades 24, 60, 60 e proteína, respectivamente. Em alguns exemplos, a ferritina, encapsulina, SOR, sintase lumazina ou piruvato desidrogenase monómeros estão ligados a um antígeno descritos (por exemplo, um recombinante RS proteína VF estabilizado em uma conformação pré- fusão) e automontada em uma nanopartícula proteína que apresenta os antígenos descritos na sua superfície, o que pode ser administrado a um indivíduo para estimular uma resposta imune ao antígeno.

[00222] Recombinante: Um ácido nucleico recombinante é uma que tem uma sequência que não é de ocorrência natural ou tem uma sequência que é feito por uma combinação artificial de dois segmentos separados em contrário de sequência. Esta combinação artificial pode ser realizado por síntese química ou, mais vulgarmente, pela manipulação artificial de segmentos isolados de ácidos nucleicos, por exemplo, por técnicas de engenharia genética. Uma proteína recombinante é uma que tem uma sequência que não é de ocorrência natural ou tem uma sequência que é feito por uma combinação artificial de dois segmentos separados de sequência de outro modo. Em várias modalidades, uma proteína recombinante é codificada por um heteróloga (por exemplo, recombinante) de ácido nucleico que foi introduzido em uma célula hospedeira, tal como uma célula bacteriana ou eucariótica. O ácido nucleico pode ser introduzida, por exemplo, em um vetor de expressão tendo sinais capazes de expressar a proteína codificada pelo ácido nucleico introduzido ou o ácido nucleico pode ser integrado no cromossoma da célula hospedeira.

[00223] Substituição de reacondicionamento de aminoácidos: uma substituição de aminoácidos que aumenta as interações dos resíduos vizinhos, a uma proteína, por exemplo, através do aumento interações hidrofóbicas ou a formação de hidrogénio-ligação ou através da redução interações desfavoráveis ou repulsivas de resíduos vizinhos, por exemplo, através da eliminação de aglomerados de forma semelhante resíduos carregados. Em várias modalidades, a substituição de aminoácidos reacondicionamento é introduzido para aumentar as interações de resíduos vizinhos da RSV F pré-fusão proteína conformação, que não estão em estreita proximidade no pós- fusão conformação RSV F. Tipicamente, a introdução de uma substituição de aminoácido reacondicionamento irá aumentar a Tm do pré-fusão conformação da proteína F de RSV e reduzir a Tm do pós- fusão conformação da proteína F de RSV.

[00224] Vírus Sincicial Respiratório (RSV): Um vírus de RNA com envelope negativo não segmentado de cadeia simples da família Paramyxoviridae. É a causa mais comum de bronquiolite e pneumonia em crianças no primeiro ano de vida e infecta quase todas as crianças de 3 anos de idade. RSV também provoca infecções repetidas, incluindo doença do trato respiratório inferior grave, que pode ocorrer em qualquer idade, especialmente entre os idosos ou aqueles com cardíaca comprometida, pulmonar ou sistemas imunitários. Nos Estados Unidos, bronquiolite por RSV é a principal causa de hospitalização em lactentes e uma das principais causas da asma e pieira durante toda a infância (Shay et al., JAMA, 282, 1440 (1999); Hall et al., N. Engl J. Med., 360, 588 (2009)). Globalmente, RSV é responsável por 66,000-199,000 mortes a cada ano para crianças com menos de cinco anos de idade (Nair et al, Lancet, 375, 1545 (2010)) e é responsável por 6,7% das mortes de recém-nascidos um mês a um ano de idade - mais do que qualquer outro agente patogênico único, exceto a malária (Lozano et al., Lancet, 380, 2095 (2013)).

[00225] O genoma de RSV tem ~15.000 nucleotídeos de comprimento e inclui 10 genes que codificam proteínas, incluindo 11 as glicoproteínas SH, G e F. O F medeia proteína de fusão, permitindo a entrada do vírus no citoplasma da célula e também promover a formação de sincícios. Dois subtipos de estirpes de RSV humanos têm sido descritos, os subtipos A e B, com base em diferenças na antigenicidade da glicoproteína G. Estirpes de RSV para outras espécies também são conhecidos, incluindo o RSV bovino. Exemplos de sequências de RSV cepa são conhecidos do vulgar perito na técnica. Além disso, vários modelos de infecção por RSV humano estão disponíveis, incluindo organismos modelo infectadas com hRSV, bem como organismos-modelo infectados com espécies de RSV específica, tais como a utilização de infecção de VSRB em bovinos (vide, por exemplo, Berna et al., Am J. Physiol Cellular Lung Mol Physiol, 301: L148-L156, 2011).

[00226] Vários métodos de diagnóstico da infecção pelo VSR são conhecidos, incluindo o uso de Imunofluorescência direta de detecção (DFA), cromatográfica de detecção rápida e detecção de RNA viral por RT PCR. A quantificação da carga virai pode ser determinada, por exemplo, por placas de ensaio, imunoensaio enzima de captura (EIA) ou PCR. Quantificação dos níveis de anticorpos pode ser realizada por um ensaio de neutralização específica do subtipo ou ELISA. RSV tratamento atual é a administração passiva do anticorpo monoclonal de palivizumabee (SYNAGIS®), que reconhece a proteína F de RSV (Johnson et al., J. Infect Dis, 176, 1215 (1997); Beeler e Coelingh van Wyke, J. Virol, 63, 2941 (1989)) e reduz a incidência de doença grave (The Impact-RSV Study Group, Pediatrics, 102, 531 (1998)). (vide também, por exemplo, Nam e Kun (Eds.). Respiratory Syncytial Virus: Prevention, Diagnosis and Treatment. Nova Biomedical Nova Science Publisher, 2011; e Cane (Ed.) Respiratory Syncytial Virus. Elsevier Science, 2007).

[00227] Existem vários subtipos de RSV, incluindo humano subtipo A, subtipo B humana, bovina e subtipo. Dentro dos subtipos de RSV, existem estirpes individuais de cada subtipo. Por exemplo, SEQ ID Nos: 1-128 aqui proporcionados incluem sequências de proteína F de RSV para muitas estirpes do subtipo A de RSV, que (como mostrado na Tabela 3 abaixo) são altamente homólogas.

[00228] Proteína de fusão de RSV (F): uma glicoproteína do envelope de RSV que facilita a fusão das membranas virais e celulares. Na natureza, a proteína F de RSV é inicialmente sintetizado como um precursor polipeptídico único de aproximadamente 574 aminoácidos de comprimento, designados F0. F0 inclui um peptídeo de sinal N-terminal que dirige a localização para o retículo endoplasmático, onde o peptídeo de sinal (aproximadamente os primeiros 25 resíduos de F0) é clivado proteoliticamente. Os restantes resíduos F0 oligomerizar para formar um trímero, que está novamente proteoliticamente processadas por uma protease celular em duas sequências de consenso de clivagem de furina conservada (aproximadamente F0 posições 109 e 136, por exemplo, RARR109 (SEQ ID NO: 124, resíduos 106-109) e RKRRne (SEQ ID NO: 124, resíduos 133-136) para gerar dois fragmentos ligados por dissulfureto, F1 e F2 O menor destes fragmentos, F2, origina a partir da porção N-terminal do precursor de F0 e inclui aproximadamente os resíduos 26-. 109 de F0. O maior destes fragmentos, FI, inclui a porção C-terminal do precursor de F0 (aproximadamente resíduos 137-574), incluindo uma região extracelular/luminal (~ resíduos 137-524), um domínio transmembrana (525 -Resíduos -550) e um domínio citoplasmático (-Resíduos 551-574) na extremidade C-terminal.

[00229] Três protômeros F2-F1 oligomerizam na proteína F madura, que adota uma metaestável "pré-fusão" conformação que é disparado para sofrer uma mudança conformacional (para uma conformação "pós- fusão") em contato com uma membrana da célula alvo. Esta mudança conformacional expõe uma sequência hidrofóbica, conhecido como o peptídeo de fusão, o qual está localizado na extremidade N-terminal do polipeptídeo F1 e que se associa com a membrana celular do hospedeiro e promove a fusão da membrana do vírus ou uma célula infectada, com a membrana da célula alvo.

[00230] Um determinado número de anticorpos neutralizantes que se ligam especificamente aos sítios antigênicos na proteína F de RSV foram identificadas. Estes incluem anticorpos monoclonais 131-2a e 2F, que se ligam ao sítio I antigênico (centrado em torno resíduo P389); anticorpos monoclonais e palivizumabe e motavizumabe, que se ligam ao sítio antigênico II (centrado em torno resíduos 254-277); e anticorpos monoclonais e mAbl9 101F, que se ligam ao sítio antigênico IV (centrado em torno resíduos 429-437).

[00231] Proteína F de RSV com uma única cadeia: A proteína F de RSV recombinante que é expresso como uma única cadeia polipeptídica de RSV incluindo o polipeptídeo e o polipeptídeo F1 F2 de RSV. A cadeia simples de proteína F de RSV trimeriza para formar um ectodomínio da proteína F de RSV. Uma cadeia única proteína F de RSV não inclui os sítios de clivagem de furina que flanqueiam o pep27 polipeptídeo de proteína F de RSV; Portanto, quando produzidas em células, o polipeptídeo não clivado é F0 F1 e F2 em polipeptídeos separados. Em algumas modalidades, uma única cadeia de proteína F de RSV inclui eliminação dos dois sítios de clivagem da furina, o polipeptídeo pep27 e o peptídeo de fusão. Em uma modalidade, a posição 103 ou 105 está ligado à posição 145 da proteína de RSV para gerar a construto de cadeia única. Em várias modalidades, as porções restantes do F1 e F2 polipeptídeos são unidos por um ligante, tal como um ligante peptídico.

[00232] Polipeptídeo F0 de RSV (F0): O precursor da proteína F de RSV, incluindo os aminoácidos de um peptídeo N-terminal de sinal, um polipeptídeo F2, um polipeptídeo pep27 e um polipeptídeo F1 incluindo o domínio extracelular F1, domínio transmembrana e da cauda citosólica. O polipeptídeo nativo F0 é proteoliticamente processado em um sítio de clivagem de sequência de sinal e dois sítios de clivagem de furina (aproximadamente F0 posições 109 e 136, por exemplo, RARR109 (SEQ ID NO: 124, resíduos 106-109) e RKRRne (SEQ ID NO:. 124, 133-136), os resíduos resultantes na F1 e F2fragments Exemplos de polipeptídeos de F0 de muitos subgrupos de RSV diferentes são conhecidos, incluindo os subgrupos de A, B e bovina, exemplos das quais são aqui apresentadas como SEQ ID NOs: 1 -128, 129-177 e 178-184, respectivamente.

[00233] Polipeptídeo F1 de RSV (F1): uma cadeia peptídica da proteína F de RSV. Tal como aqui se utiliza, "polipeptídeo F1" refere-se a ambos os polipeptídeos F1 nativa e polipeptídeos F1 incluindo as modificações (por exemplo, substituições de aminoácidos, inserções ou supressão) da sequência nativa, por exemplo, as modificações concebidas para estabilizar uma proteína F recombinante (incluindo o polipeptídeo F1 modificada) em um RSV F pré-fusão proteína conformação. F1 nativo inclui aproximadamente os resíduos 137-574 do precursor de F0 de RSV e inclui (a partir de N- para C-terminal) um região extracelular/luminal (~ resíduos 137-524), um domínio transmembrana (-Resíduos 525-550) e um domínio citoplasmático (Resíduos 551-574). Várias modalidades incluem um polipeptídeo F1 modificada a partir de uma sequência F1 nativa, por exemplo, um polipeptídeo F1 que falta a transmembrana e o domínio citosólico e/ou inclui um ou mais substituições de aminoácidos que estabilizam uma proteína F recombinante (contendo o polipeptídeo F1) em uma conformação pré-fusão. Em um exemplo, uma proteína F de RSV descrito inclui um polipeptídeo F1 com deleção de domínios transmembrana e citosólicas e as substituições de cisteína nas posições 155 e 290. Em outro exemplo, uma proteína F de RSV descrito inclui um polipeptídeo F1 com supressão da transmembrana e domínios citosólicos, substituições de cisteína nas posições 155 e 290 e uma substituição na posição 190. fenilalanina Em outro exemplo, uma proteína F de RSV descrito inclui um polipeptídeo F1 com deleção de domínios transmembrana e citosólicos, as substituições de cisteína nas posições 155 e 290, uma substituição de fenilalanina na posição 190 e uma substituição de leucina na posição 207. Em várias modalidades, o polipeptídeo F1 inclui uma ligação C-terminal a um domínio de trimerização. Muitos exemplos de sequências F1 nativas são conhecidos os quais são aqui proporcionados como aproximadamente posições 137-524 da SEQ ID NOs: 1-184.

[00234] Polipeptídeo F2 de RSV (F2): Uma cadeia polipeptídica da proteína F de RSV. Tal como aqui se utiliza, "polipeptídeo F2" refere-se a ambos os polipeptídeos F2 nativa e polipeptídeos F2 incluindo as modificações (por exemplo, substituições de aminoácidos) da sequência nativa, por exemplo, as modificações concebidas para estabilizar uma proteína F recombinante (incluindo o polipeptídeo F2 modificado) em uma conformação pré-fusão proteína F de RSV. F2 nativo inclui cerca de resíduos 26-109 do precursor RSV F0. Em proteína F de RSV nativa, o polipeptídeo F2 está ligada ao polipeptídeo F1 por duas ligações de dissulfureto. Muitos exemplos de sequências nativas F2 são conhecidos os quais são aqui proporcionados como aproximadamente posições 26-109 da SEQ ID NOs: 1-184.

[00235] Polipeptídeo pep27 de RSV (pep27): Um polipeptídeo de 27 aminoácidos que é excisada a partir do precursor de F0 durante a maturação da proteína F de RSV. pep27 é flanqueado por dois sítios de clivagem de furina que são clivadas por uma protease celular, durante a maturação da proteína F para gerar o F1 e F2polypeptide. Exemplos de sequências pep27 nativas são conhecidos os quais são aqui proporcionados como posições 110-136 da SEQ ID NOs: 1-184.

[00236] Conformação de proteína F de RSV pré-fusão: A conformação estrutural adotada pela proteína RSV F antes de disparo do evento fusogênico que leva à transição de RSV F para a conformação pós-fusão e após transformação em uma proteína madura RSV F no sistema de secreção. A estrutura tridimensional de uma proteína F de RSV exemplificativa em uma conformação pré-fusão é descrito aqui (vide Exemplo 1) e as coordenadas estruturais do exemplificativa de proteína F de RSV em uma conformação pré-fusão ligado pelo anticorpo D25-specific pré-fusão são fornecidos na Tabela 1. Tal como aqui demonstrado, a conformação pré-fusão F de RSV é similar em estrutura global para a conformação pré-fusão de outros paramixovírus, tais como (PIV, ver F1g. 7), embora com algumas diferenças significativas. No estado pré-fusão, a proteína F de RSV inclui um sítio antigênico no ápice distal de membrana ("sítio antigênico 0", ver Exemplo 1), que inclui F de RSV resíduos 62-69 e 196-209 e também inclui os epitopos da D25 e os anticorpos AM22. Conforme usado aqui, uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão pode ser ligado especificamente por um anticorpo que é específico para a conformação pré-fusão da proteína F de RSV, tal como um anticorpo que se liga especificamente a um epitopo dentro de sítio antigênico 0, durante exemplo, o anticorpo AM22 ou D25. Anticorpos específicos pré-fusão adicionais incluem os anticorpos 5C4 e MPE8.

[00237] Conformação de proteína F de RSV pós-fusão: A conformação estrutural adotada pela proteína F de RSV que não é a conformação pré-fusão e em que a N- e C- terminais da proteína F de RSV são proximais em uma bobina estável. A conformação da proteína de fusão pós F de RSV foi descrito no nível atômico (vide, por exemplo, McLellan et al., J. Virol, 85, 7788, 2011; Swanson et al., Proc Natl Acad Sci USA, 108, 9619, 2011; e coordenadas estruturais depositados no N° de Acesso PDB 3RRR; cada uma das quais é aqui incorporada por referência). A conformação pós-fusão da proteína F de RSV é similar à conhecida para outras glicoproteínas paramixovírus, incluindo a proteína PIV5 F. Na conformação pós-fusão, a proteína F de RSV não inclui sítio antigênico 0, e, por conseguinte, não inclui o epitopo P25 e não está especificamente ligada por D25 ou AM22. A conformação de RSV pós-fusão ocorre, por exemplo, após a fusão da proteína M à membrana celular. A sequência de uma proteína F de RSV que, quando expresso, pode dobrar em uma conformação pós-fusão, são fornecidas como SEQ ID NO: 1469.

[00238] Antígeno resurfaced ou imunógeno resurfaced: Um imunógeno polipeptídeo derivado de um antígeno de tipo selvagem em que os resíduos de aminoácidos fora ou exterior para um epitopo alvo são com mutação de uma maneira sistemática a concentrar-se a imunogenicidade do antígeno para o epitopo alvo selecionado. Em alguns exemplos resurfaced um antígeno é dito como um imunógeno antigenicamente de manto ou antígeno antigenicamente de manto.

[00239] Desvio quadrático médio (RMSD): A raiz quadrada da média aritmética dos quadrados dos desvios da média. Em várias modalidades, RMSD é usado como um meio de expressar o desvio ou a variação a partir das coordenadas estruturais de uma estrutura tridimensional de referência. Este número é tipicamente calculada após sobreposição óptima de duas estruturas, como a raiz quadrada da média quadrados distâncias entre os átomos de Ca equivalente. Em algumas modalidades, a estrutura tridimensional de referência inclui as coordenadas estruturais da proteína F de RSV ligado ao anticorpo monoclonal D25, aqui apresentadas na Tabela 1.

[00240] Identidade/similaridade de sequência: A identidade/simi- laridade entre duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou duas ou mais sequências de aminoácidos, é expresso em termos da identidade ou semelhança entre as sequências. A identidade de sequência pode ser medida em termos de percentagem de identidade; Quanto maior a porcentagem, mais idênticas as sequências são. Homólogos ou ortólogos de sequências de ácidos nucleicos ou de aminoácidos possuem um grau relativamente elevado de identidade de sequência/similaridade quando alinhadas usando métodos padrão.

[00241] Métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Programas e algoritmos de alinhamento Vários são descritas: Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981; Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443, 1970; Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73: 237-44, 1988; Higgins & Sharp, CABIOS 5: 151-3, 1989; Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16: 10881-90, 1988; Huang et al.,. Appls Comp. Biosciences 8, 155-65, 1992; e Pearson et al., Meth. Mol. Bio. 24:. 307-31, 1994. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-10, 1990, apresenta uma análise detalhada dos métodos de alinhamento de sequências e cálculos de homologia.

[00242] Uma vez alinhado, o número de correspondências é determinado pela contagem do número de posições em que um resíduo de nucleotídeos ou de aminoácidos idêntica está presente em ambas as sequências. A percentagem de identidade de sequência é determinado pela divisão do número de correspondências, quer por o comprimento da sequência apresentada na sequência identificada ou por um comprimento articulada (tal como 100 nucleotídeos consecutivos ou resíduos de aminoácidos de uma sequência apresentada em uma sequência identificada ), seguido pela multiplicação do valor resultante por 100. Por exemplo, uma sequência de peptídeo que tem 1166 partidas quando alinhado com uma sequência de ensaio com 1554 aminoácidos é de 75,0 por cento idêntica à sequência de teste (1166 + 1554 * 100 = 75,0). O valor da percentagem de identidade de sequência é arredondado para o décimo mais próximo. Por exemplo, 75,11, 75,12, 75,13, 75,14 e são arredondados para baixo para 75,1, enquanto 75,15, 75,16, 75,17, 75,18, 75,19 e são arredondados para 75,2. O valor de comprimento será sempre um número inteiro.

[00243] O NCBI Básico Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol Biol 215: 403, 1990) está disponível a partir de várias fontes, incluindo o National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD) e em a internet, para uso em conexão com o programas de análise de sequência blastp, blastn, blastx, tblastn e tblastx. Uma descrição de como para determinar a identidade de sequência usando este programa está disponível no sítio do NCBI na internet.

[00244] Homólogos e variantes de um polipeptídeo são tipicamente caracterizados pela posse de pelo menos cerca de 75%, por exemplo pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência contado sobre o alinhamento de comprimento completo com a sequência de aminoácido de interesse. Proteínas com ainda maior semelhança com as sequências de referência irá mostrar aumento identidades percentuais quando avaliados por este método, tal como pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência. Quando menos do que toda a sequência está a ser comparada para identidade de sequência, homólogos e variantes possuir tipicamente pelo menos 80% de identidade de sequência ao longo de curtas janelas de 10-20 aminoácidos e podem possuir identidades de sequência de pelo menos 85% ou pelo menos 90% ou 95% dependendo da sua semelhança com a sequência de referência. Os métodos para determinar a identidade de sequência sobre tais janelas curtas estão disponíveis no sítio do NCBI na internet. Um perito na técnica apreciará que estas gamas de identidade de sequência são fornecidos apenas para orientação; é inteiramente possível que fortemente homólogos significativos pode ser obtido que caem fora dos intervalos previstos.

[00245] Para comparação de sequências de ácidos nucleicos de sequências, tipicamente uma sequência atua como sequência de referência, para a qual as sequências de teste são comparadas. Quando se utiliza um algoritmo de comparação de sequências, as sequências teste e de referência são introduzidas em um computador, as coordenadas de subsequências são designadas, se necessário e os parâmetros do programa do algoritmo de sequência são designados. Os parâmetros do programa padrão são usados. Os métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. O alinhamento óptimo de sequências para comparação pode ser realizado, por exemplo, pelo algoritmo de homologia sítio de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981, pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443, 1970, pela busca de método similaridade de Pearson e Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988, por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no pacote de software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) ou por alinhamento manual e inspeção visual (vide, por exemplo, Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4a Ed, Cold Spring Harbor, New York, 2012) e Ausubel et al. (em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, suplemento 104, 2013). Um exemplo de um algoritmo útil é PILEUP. O PILEUP utiliza uma simplificação do método de alinhamento progressivo de Feng & Doolittle, J. Mol Evol 35: 351-360, 1987. O método usado é similar ao o método descrito por Higgins & Sharp CABIOS 5: 151-153, 1989. Usando PILEUP, uma sequência de referência é comparada a outras sequências teste para determinar a relação de percentagem de identidade de sequência usando os seguintes parâmetros: peso do intervalo por defeito (3,00), do intervalo por defeito peso do comprimento (0,10) e intervalos finais ponderados. PILEUP pode ser obtido a partir do pacote de software de análise de sequência GCG, por exemplo, versão 7.0 (Devereaux et al., Nuc. Acids Res. 12: 387-395, 1984.

[00246] Outro exemplo de algoritmos que são adequados para determinar a percentagem de identidade de sequência e semelhança de sequências é o algoritmo BLAST e BLAST 2.0 , que são descritos em Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990 e Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 de 1977. Software para a realização de análises de BLAST está disponível publicamente através do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (ncbi.nlm.nih.gov). O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeos) utiliza por padrão um comprimento de palavra (W) de 11, os alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 e uma comparação de ambas as fitas. O programa BLASTP (para sequências de aminoácidos) utiliza por padrão um comprimento de palavra (W) de 3, e expectativa (E) de 10, e a matriz de pontuação BLOSUM62 (vide Henikoff &Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89 : 10915, 1989). Um oligonucleotídeo é uma sequência polinucleotídica linear de até cerca de 100 bases de nucleotídeos de comprimento.

[00247] Outros indícios de semelhança de sequência entre dois ácidos nucleicos é a capacidade para hibridizar. Quanto mais semelhantes são as sequências dos dois ácidos nucleicos, mais rigorosas as condições em que irão hibridizar. O rigor das condições de hibridização são dependentes da sequência e são diferentes sob diferentes parâmetros ambientais. Assim, as condições de hibridização particulares resultam em graus de rigor que irão variar dependendo da natureza do método de hibridização de escolha e da composição e do comprimento das sequências de ácido nucleico que hibridizam. Geralmente, a temperatura de hibridização e a força iónica (especialmente concentração de Na+ e/ou Mg++) do tampão de hibridização irá determinar o rigor da hibridização, embora os tempos de lavagem também influenciem o rigor. Geralmente, as condições rigorosas são selecionadas para serem cerca de 5° C a 20°C abaixo do ponto de fusão térmica (Tm) para a sequência especifica, a uma força iónica e pH definidos. A Tm é a temperatura (sob força iónica e pH definidos) à qual 50% da sequência alvo hibridiza com uma sonda perfeitamente correspondente. Condições de hibridização de ácido nucleico e de cálculo de rigor pode ser encontrada, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001; Tijssen, Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I: Theory and Nucleic Acid Preparation, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Ltd., NY, NY, 1993; e Ausubel et al. Short Protocols in Molecular Biology, 4th ed., John Wiley & Sons, Inc., 1999.

[00248] Tal como aqui utilizado, referência a "pelo menos 80% de identidade" refere-se a "pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94% , pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou mesmo 100% de identidade "com uma sequência de referência definida.

[00249] Peptídeo sinal: Uma sequência amino ácido curta (por exemplo, cerca de 18-25 aminoácidos de comprimento) que direciona a secreção de proteínas sintetizadas de novo ou de membrana a ou através de membranas (por exemplo, a membrana do retículo endoplasmático). Os peptídeos sinal são tipicamente localizados na extremidade N-terminal de um polipeptídeo e são removidos por peptidases de sinal após o polipeptídeo ter atravessado a membrana. Sequências de peptídeo sinal contêm, tipicamente, três características estruturais comuns: uma região polar básica (região N) N-terminal, um núcleo hidrofóbico, e uma região C-hidrofílica). Exemplos de sequências de peptídeos de sinal estão indicados como resíduos 1-25 de SEQ ID Nos: 1-182 (F de RSV peptídeos sinal de proteínas de A, B e RSV bovina).

[00250] Se liga especificamente: Quando se refere à formação de um complexo de proteína anticorpo:antígeno, refere-se a uma reação de ligação que determina a presença de uma proteína, peptídeo, ou polissacarídeo (por exemplo, uma glicoproteína) alvo, na presença de uma população heterogênea de proteínas e outros produtos biológicos. Assim, sob condições designadas, um anticorpo liga-se preferencialmente a uma proteína, peptídeo ou polissacarídeo (tal como um antígeno presente na superfície de um agente patogênico, por exemplo, F de RSV) alvo particular e não se liga numa quantidade significativa a outras proteínas ou polissacarídeos presentes na amostra ou objeto. Um anticorpo que se liga especificamente à conformação anterior à fusão de proteína F de RSV (por exemplo, e o anticorpo que se liga especificamente ao sítio antigênico 0) não se ligam especificamente à conformação pós-fusão de proteína F de RSV. A ligação específica pode ser determinada por métodos conhecidos na arte. Com referência a um complexo anticorpo:antígeno ou Fab:antígeno, de ligação específica do antígeno e o anticorpo tem um Kd (ou Kd aparente) de menos de cerca de 10-6 molar, tal como menos do que cerca de 10-7 molar, 10-8 Molar, 10-9, ou mesmo inferior a cerca de 10-10 Molar.

[00251] Proteína solúvel: Uma proteína capaz de se dissolver no líquido aquoso à temperatura ambiente e permanecer dissolvida. A solubilidade de uma proteína podem mudar dependendo da concentração da proteína no líquido à base de água, o estado de tamponação do líquido, a concentração de outros solutos no líquido, por exemplo a concentração de sal e proteína, e o calor do líquido. Em várias concretizações, uma proteína solúvel é aquela que dissolve a uma concentração de pelo menos 0,5 mg/ml em solução salina tamponada com fosfato (pH 7,4) à temperatura ambiente e permanece dissolvida durante pelo menos 48 horas.

[00252] Agente terapêutico: Um composto químico, molécula pequena, ou outra composição, tal como molécula de ácido nucleico, capaz de induzir um efeito terapêutico ou profiláctico desejado quando adequadamente administrado a um sujeito.

[00253] Quantidade terapeuticamente eficaz de uma quantidade eficaz: A quantidade de agente, tal como um antígeno divulgado ou composição imunogênica contendo um antígeno descrito, que é suficiente para prevenir, tratar (incluindo a profilaxia), reduzir e/ou melhorar os sintomas e/ou causas subjacentes de qualquer um de uma desordem ou doença, por exemplo, para prevenir, inibir e/ou tratar a infecção por RSV. Em algumas concretizações, uma quantidade terapeuticamente eficaz é suficiente para reduzir ou eliminar um sintoma de uma doença, tal como a infecção por RSV. Por exemplo, esta pode ser a quantidade necessária para inibir a replicação viral ou alterar de forma mensurável sintomas externos da infecção viral. Em geral, essa quantidade será suficiente para inibir replicação ou infecciosidade de vírus (por, exemplo RSV) de forma mensurável. Quando administrado a um indivíduo, uma dosagem será geralmente utilizada que irá alcançar as concentrações nos tecidos-alvo que tenham sido demonstradas por alcançar a inibição in vitro da replicação viral. Entende-se que para se obter uma resposta imune protetora contra um agente patogênico pode requerer administrações múltiplas da composição imunogênica. Assim, uma quantidade terapeuticamente eficaz abrange uma dose fracionada que contribui em combinação com administrações anteriores ou posteriores para alcançar uma resposta imune protetora.

[00254] Domínio transmembranar: uma sequência de aminoácidos que se insere uma camada dupla de lipídeo, tal como a bicamada lipídica de uma célula ou partícula viral ou semelhante a vírus. Um domínio transmembranar podem ser usado para ancorar um antígeno a uma membrana. Em alguns exemplos, um domínio transmembranar é um domínio transmembranar de uma proteína F de RSV. Exemplos de domínios de transmembranares F de RSV são familiares ao técnico no assunto, e fornecidos aqui. Por exemplo, as sequências de aminoácidos dos domínios transmembranares exemplares F de RSV são fornecidos como aproximadamente posições 525-550 de SEQ ID NOs: 1-183.

[00255] Transformada: Uma célula transformada é uma célula na qual uma molécula de ácido nucleico foi introduzida por meio de técnicas de biologia molecular. Tal como aqui utilizado, o termo abrange todas as técnicas de transformação pelas quais uma molécula de ácido nucleico pode ser introduzida em tal célula, incluindo a transfecção com vetores virais, transformação com vetores plasmidiais, e introdução de DNA por eletroporação, lipofecção, e canhão de aceleração de partículas.

[00256] Vacina: Uma composição farmacêutica que induz uma resposta imune profilática ou terapêutica num indivíduo. Em alguns casos, a resposta imune é uma resposta imune protetora. Tipicamente, uma vacina provoca uma resposta imune específica para o antígeno a um antígeno de um agente patogénico, por exemplo, um patógeno viral, ou a um constituinte celular associado com uma condição patológica. Uma vacina pode incluir um polinucleotídeo (por exemplo, um ácido nucleico que codifica um antígeno descrito), um peptídeo ou polipeptídeo (tal como um antígeno descrito), um vírus, uma célula ou um ou mais constituintes celulares.

[00257] Vetor: Uma molécula de ácido nucleico tal como introduzida numa célula hospedeira, produzindo assim uma célula hospedeira transformada. Vetores de DNA recombinante são vetores possuindo DNA recombinante. Um vetor pode incluir sequências de ácidos nucleicos que permitem a sua replicação numa célula hospedeira, tais como uma origem de replicação. Um vetor pode também incluir um ou mais genes marcadores selecionáveis e outros elementos genéticos conhecidos na técnica. Os vetores virais são vetores de DNA recombinante tendo, pelo menos, algumas sequências de ácido nucleico derivadas de um ou mais vírus.

[00258] Um vetor viral deficiente na replicação que requer complementação de uma ou mais regiões do genoma viral necessário para a replicação, como resultado de, por exemplo, uma deficiência em pelo menos uma função do gene essencial para a replicação. Por exemplo, de modo que o vetor viral não se replica nas células hospedeiras típicas, especialmente aqueles em um paciente humano, que possam ser infectados pelo vetor viral no decorrer de um método terapêutico. Exemplos de vetores e sistemas para a sua utilização virais deficientes na replicação são conhecidos na técnica e incluem; por exemplo, vetores deficientes na replicação LCMV (vide, por exemplo, Pat. US No. 2010/0297172 Pub., aqui incorporados por referência na sua totalidade) e vetores adenovirais deficientes em replicação (vide, por exemplo, PCT App. Pub. No. WO2000/00628, aqui incorporado por referência).

[00259] Vírus: O vírus é constituído essencialmente por um núcleo de ácido nucleico rodeado por uma camada de proteína e tem a capacidade de se replicar somente dentro de uma célula viva. "A replicação viral" é a produção de vírus adicional pela ocorrência de pelo menos um ciclo de vida viral. Um vírus pode subverter as funções normais das células hospedeiras, fazendo com que a célula a se comportar de uma maneira determinada pelo vírus. Por exemplo, uma infecção virai pode resultar na produção de uma célula de uma citocina ou a resposta a uma citocina, em que a célula não infectada normalmente não fazê-lo. Em alguns exemplos, um vírus é um agente patogênico.

[00260] Partícula similar a vírus (VLP): Um não replicante, casca virai, derivada de qualquer um de vários vírus. As VLPs são geralmente constituídos por uma ou mais proteínas virais, tais como, mas não limitados a, aqueles ditos como proteínas da cápside, revestimento, casca, de superfície e/ou proteínas de envelope ou polipeptídeos de formação de partículas derivadas destas proteínas. As VLPs podem formar-se espontaneamente sobre a expressão recombinante da proteína em um sistema de expressão adequado. Métodos para a produção de VLP particulares são conhecidos na técnica. A presença de partículas VLP seguinte expressão recombinante de proteínas virais pode ser detectada usando técnicas convencionais conhecidas na técnica, tais como por microscopia electrónica, caracterização biofísica e assim por diante. Além disso, as VLP podem ser isolados por meio de técnicas conhecidas, como por exemplo centrifugação em gradiente de densidade e identificados pela densidade de bandas característico. Vide, por exemplo, Baker et al. (1991) Biophys. J. 60: 1445-1456; e Hagensee et al. (1994) J. Virol. 68: 4503-4505; Vincente, J. Invertebr Pathol 2011; Schneider-Ohrum e Ross, Curr. Top. Microbiol. Immunol, 354: 53073, 2012).

11. Descrição de Diversas Modalidades

[00261] É descrito aqui que a proteína F de RSV é submetido a um rearranjo estrutural dramático entre as suas conformações e pré-pós- fusão (vide Exemplo 1, abaixo). Como mostrado na Figura 2B, a região N-terminal do polipeptídeo F1 na conformação pré-fusão (correspondente em parte à lóbulo distal membrana mostrado na Figura 2A) inclui o OC2 indicada, OC3, β3, β4 e OC4 helicoidal e estruturas de folha beta, enquanto a região correspondente do terminal N do polipeptídeo F1 na estrutura pós-fusão inclui uma estrutura helicoidal oc5 estendida. Além disso, a região do C-terminal do polipeptídeo F1 na conformação pré-fusão (correspondente em parte à lóbulo proximal membrana mostrado na Figura 2A) inclui o β22 indicada, oc9 e β23 de folhas beta e estruturas helicoidais, enquanto que o correspondente C- região terminal do polipeptídeo da F1 na estrutura pós-fusão conformação inclui uma estrutura helicoidal estendida. Assim, a membrana lóbulos distais e proximais da membrana da proteína F de RSV na sua conformação pré-fusão incluem vários elementos estruturais distintas que estão ausentes as regiões correspondentes da proteína F de RSV na sua conformação pós-fusão. Posições de aminoácidos (e as correspondentes sequências) para estas regiões são destacados a cinzento na F1g. 2, incluindo posições de 137-216, 461513 e do polipeptídeo F1.

[00262] Antígenos de proteína F de RSV são fornecidos que são estabilizadas ou "bloqueado" em uma conformação pré-fusão, denominado a antígenos PreF." Usando o design orientado-estrutura, posições dos RSV F1 e F 2 polipeptídeos são direcionados para a modificação (por exemplo, substituição de aminoácidos) para dificultar ou impedir transição da proteína F de RSV a partir de uma pré para pós- fusão conformação. Tais antígenos têm utilidade, por exemplo, como imunógenos para induzir a uma resposta de neutralização para a proteína F de RSV.

A. Proteínas F de RSV Nativas

[00263] Proteínas F de RSV nativas de diferentes grupos de RSV, bem como sequências de ácidos nucleicos que codificam tais proteínas e métodos, são conhecidos. Por exemplo, a sequência de vários subtipo A, B e RSV bovino precursor F0 proteínas proporcionadas como SEQ ID Nos: 1-184. O Genlnfo Identificador (GI) e o número de acesso correspondente, para cada uma destas sequências, bem como o grupo de RSV correspondente são fornecidos na Tabela 3: Tabela 3. Sequências de proteína exemplificativas de proteína F de RSV de subtipo A, B e bovina

[00264] A proteína F de RSV apresenta notável conservação da sequência entre os subtipos RSV (vide Tabela 3, que mostra identidade de sequência de pares média entre subtipos e segmentos de proteína F). Por exemplo, RSV subtipos A e B partes de 90% de identidade de sequência e subtipos RSV A e B cada% sequência partes 81 identificar com proteína BRSV F, do outro lado da molécula precursora F0. Dentro RSV subtipos a identidade de sequência F0 é ainda maior; por exemplo, dentro de cada RSV A, B e subtipos das espécies bovinas, a proteína precursora F0 RSV tem -98% de identidade de sequência. Quase todas as proteínas precursoras de RSV F0 são identificados aproximadamente 574 aminoácidos de comprimento, com pequenas diferenças de comprimento, tipicamente, em virtude de comprimento da cauda citoplasmática C-terminal. A identidade de sequência entre as proteínas F de RSV é ilustrada na Tabela 4: Tabela 4. Identidade de sequência de proteína F de RSV

[00265] Tendo em vista a conservação de sequências F de RSV, a pessoa com conhecimentos correntes na técnica pode facilmente comparar as posições de aminoácidos entre diferentes sequências nativas F de RSV, para identificar correspondentes posições de aminoácidos F de RSV entre diferentes estirpes e subtipos RSV. Por exemplo, através de RSV nativa quase todos identificados F0 proteínas precursoras, os sítios de clivagem de furina caem nas mesmas posições de aminoácidos. Assim, a conservação de sequências de proteína F de RSV através estirpes e subtipos permite o uso de uma sequência F de RSV de referência para a comparação de aminoácidos em posições particulares da proteína F de RSV. Para os fins da presente relatório descritivo (a não ser que contexto indique o contrário), as posições de aminoácidos da proteína F de RSV são dados com referência à referência F0 polipeptídeo precursor da proteína apresentada como SEQ ID NO.: 124 (correspondente a GenBank® Prec No. P03420, incorporada por referência como presente em GenBank® em 28 de fevereiro de 2013).

B. Antígenos PreF

[00266] Antígenos isolados são descrito aqui que incluem uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré fusão ("antígenos") PreF. Os antígenos PreF conter uma proteína F de RSV recombinante ou um fragmento do mesmo que tenha sido modificado de uma forma nativa para aumentar a imunogenicidade. Por exemplo, as proteínas F de RSV recombinante descritos foram modificados a partir da sequência de RSV nativa para ser estabilizado em uma conformação pré-fusão. A pessoa perita na técnica irá apreciar que os antígenos PreF descritos são úteis para induzir respostas imunogênicas em animais vertebrados (por exemplo, mamíferos, por exemplo, os seres humanos e gado) para RSV (por exemplo RSV A, RSV B ou RSV bovino). Assim, em várias modalidades, os antígenos são descritos imunógenos.

[00267] O anticorpo reconhece um epitopo D25 quaternário incluindo múltiplos protômeros da proteína F de RSV. Este epitopo está contido dentro de um sítio antigênico ("sítio antigênico 0") localizado no vértice da membrana distal de glicoproteína F de RSV (vide, por exemplo, F1g. 1C), quando está em uma conformação pré-fusão. Enquanto os elementos estruturais secundários do epitopo esta permanece praticamente inalterado entre pré e pós-fusão F conformações, a sua orientação relativa muda substancialmente, com a hélice girando a4-- 180 ° em relação à fita β2 em conformações pré e pós-fusão ( ver, por exemplo, Figura 3B). As mudanças conformacionais na estrutura da proteína F de RSV entre as pré- e pós-fusão conformações determinar a presença do epitopo de D25 na proteína F de RSV. Por conseguinte, em diversas modalidades, um antígeno PreF incluindo uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão podem ser identificados por determinação da ligação do anticorpo monoclonal D25 para o antígeno específico. A pessoa com conhecimentos correntes na técnica irão apreciar que outros anticorpos que se ligam especificamente ao sítio antigênico 0 da proteína F de RSV (tal como o anticorpo AM22 ou 5C4 anticorpo) ou de outros anticorpos que são pré-fusão específico, mas não se ligam 0 sítio antigênico (tais como MPE8) também pode ser usado para identificar um antígeno PreF incluindo uma proteína F de RSV estabilizado em uma conformação pré- fusão.

[00268] Assim, os antígenos PreF descritos aqui são especificamente ligada por um anticorpo que é específico para a conformação pré-fusão F de RSV, mas não a conformação pós-fusão. Em várias modalidades, o antígeno é PreF especificamente ligada pela D25 e/ou o anticorpo AM22, o qual (conforme descrito aqui) são anticorpos específicos para o não pós-fusão conformação da proteína F de RSV. Em vários exemplos, o anticorpo específico pré-fusão (tais como D25 ou AM22) se liga especificamente ao antígeno PreF com uma constante de dissociação inferior a cerca de 10 "6 molar, tal como menos do que cerca de 10" 7 molar, 10 "8 molar ou menos do que 10 "9 molar. A ligação específica pode ser determinada por métodos conhecidos na técnica. A determinação de ligação específica pode ser facilmente realizada usando ou adaptando procedimentos de rotina, tais como ELISA, imunocompetição, ressonância de plasma de superfície ou outros ensaios imunossorventes (descrito em muitos textos padrão, incluindo Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1999).

[00269] Em outras modalidades, o antígeno PreF não está especificamente ligada por um anticorpo que se liga a conformação pós- fusão da proteína F de RSV. Por exemplo, um anticorpo específico para o pacote de seis hélices encontrada apenas na conformação pós-fusão de proteína F de RSV (por exemplo, conforme descrito em Magro et al., Proc Natl Acad Sci USA, 109: 3089-3094, 2012 ). Em vários exemplos, a constante de anticorpo específico para o pós-fusão F de RSV de ligação ao antígeno PreF dissociação é maior do que 10 "5 molar, tal como pelo menos 10" 5 molar, de 10 "4 molar ou 10" 3.

[00270] Em várias modalidades, qualquer dos antígenos PreF inclui um epitopo pré-fusão proteína F de RSV (tal como um epitopo D25 ou AM22) em uma proteína F de RSV-específico pré-fusão conformação ligada ao anticorpo (tal como um D25 ou conformação ligada AM22). Por exemplo, em várias modalidades, qualquer dos antígenos PreF inclui um epitopo em um D25 ou AM22 confirmação ligados a epitopo (por exemplo, a conformação definida pelas coordenadas estruturais fornecidos na Tabela 1), quando o antígeno PreF não é limitado pelo D25 ou AM22, isto é, o antígeno está PreF estabilizado na conformação ou D25- AM22-ligado. Os métodos para determinar se um antígeno PreF descrito inclui um epitopo pré-fusão proteína F de RSV (tal como um D25 ou AM22 epitopo) em uma pré-fusão proteína monoclonal específico ligada ao anticorpo conformação F de RSV (tal como um D25 ou AM22 conformação ligada) são conhecidos para o pessoa de habilidade ordinária na técnica e aqui adicionalmente descrito (vide, por exemplo, McLellan et al., Nature, 480: 336-343, 2011; e Publicação de Pedido de Patente US N° 2010/0068217, cada um dos quais é aqui incorporado por referência na íntegra). Por exemplo, a estrutura tridimensional descrito fragmento D25 do Fab no complexo com a proteína F de RSV pode ser comparada com a estrutura tridimensional de qualquer um dos antígenos descritos PreF.

[00271] Os versados na técnica apreciarão que um antígeno PreF descrito pode incluir um epitopo em uma conformação ligada ao anticorpo monoclonal específico pré-fusão embora as coordenadas estruturais do antígeno não são estritamente idênticos aos da proteína F pré-fusão como descrito aqui. Por exemplo, em várias modalidades, qualquer dos antígenos PreF descritos incluem um específico do pré- fusão epitopo F de RSV (tal como um D25 ou AM22 epitopo) que, na ausência do pré-fusão F de RSV anticorpo monoclonal específico pode ser estruturalmente sobrepõe ao epitopo correspondente em complexo com o anticorpo monoclonal específico F de RSV pré-fusão com um desvio quadrático médio (RMSD) das suas coordenadas de menos de 1,0, 0,75, 0,5, 0,45, 0,4, 0,35, 0,3 ou 0,25 de A/resíduo, em que o RMSD é medida ao longo o esqueleto do polipeptídeo átomos N, Ca, C, O, durante, pelo menos, três aminoácidos consecutivos.

[00272] Em várias modalidades, o antígeno é PreF solúvel em solução aquosa. Por exemplo, em algumas modalidades, o antígeno é PreF solúvel em uma solução que carece de detergente. Em algumas modalidades, o antígeno PreF se dissolve a uma concentração de pelo menos 0,5 mg/mL (tal como pelo menos 1,0 mg/ml, 1,5 mg/ml, 2,0 mg/ml, 3,0 mg/ml, 4,0 mg/ml ou pelo menos 5,0 mg/ml) em solução salina tamponada com fosfato (pH 7,4) à temperatura ambiente (por exemplo, 20-22 graus Celsius) e permanece dissolvida durante, pelo menos, durante pelo menos 12 horas (tal como, pelo menos, 24 horas, pelo menos 48 horas, em menos uma semana, pelo menos duas semanas ou mais tempo). Em uma modalidade, a solução salina tamponada com fosfato inclui de NaCl (137 mM), KCl (2,7 mM), Na2HP04 (10 mM), KH2P04 (1,8 mM) a pH 7,4. Em algumas modalidades, a solução salina tamponada com fosfato inclui ainda CaCl2 (1 mM) e MgCl2 (0,5 mM). A pessoa especialista na técnica está familiarizado com métodos de determinação se uma proteína permaneça em solução ao longo do tempo. Por exemplo, a concentração da proteína dissolvida em uma solução aquosa pode ser testados ao longo do tempo, usando métodos convencionais.

[00273] Em várias modalidades, qualquer dos antígenos PreF descritos podem ser usados para induzir a uma resposta imune para RSV em um indivíduo. Em várias modalidades, a indução de resposta imune inclui a produção de anticorpos neutralizantes para RSV. Métodos para testar a atividade de neutralização são conhecidos por aqueles versados na técnica e aqui adicionalmente descritos e incluem, porém sem limitações, neutralização por redução de placas (PRNT) ensaios, ensaios de microneutralização (vide, por exemplo, Anderson et al., J. Clin Microbiol, 22: 1050-1052, 1985) ou ensaios com base ems em citometria de fluxo (vide, por exemplo, Chen et al., J. Immunol Methods, 362: 180-184, 2010). Os ensaios de neutralização adicionais são descritos aqui e familiares para aqueles versados na técnica.

[00274] Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante que, quando dissolvido em uma solução aquosa, forma uma população de proteínas F de RSV recombinante estabilizadas em uma conformação pré-fusão. A solução aquosa pode ser, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato a um pH fisiológico, tal como pH 7,4. Em algumas modalidades, a população é uma população homogênea, incluindo uma ou mais proteínas recombinantes F de RSV, que são, por exemplo, todos estabilizados em uma conformação pré-fusão. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 90% das Proteínas F de RSV recombinantes (por exemplo, pelo menos cerca de 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,9% das proteínas F de RSV) na população homogênea são estabilizadas na conformação pré-fusão. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 90% dos Proteínas F de RSV recombinantes (por exemplo, pelo menos cerca de 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,9% das proteínas F de RSV) na população homogênea está especificamente ligada por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou incluir uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0). Será entendido que uma população homogênea de proteínas F de RSV em uma conformação particular pode incluir variações (tais como variações de modificação de proteínas, por exemplo, do estado de glicosilação), que não alteram o estado conformacional da proteína F de RSV. Em várias modalidades, a população de proteína F de RSV recombinante permanece homogênea ao longo do tempo. Por exemplo, o antígeno PreF pode incluir uma proteína F de RSV recombinante que, quando dissolvido em uma solução aquosa, forma uma população de Proteínas F de RSV recombinantes que é estabilizado em uma conformação pré-fusão durante pelo menos 12 horas, tal como pelo menos 24 horas, em Pelo menos 48 horas, pelo menos, uma semana, pelo menos duas semanas ou mais.

[00275] Em várias modalidades, os antígenos são PreF isolado substancialmente separado de proteínas F de RSV em uma conformação pós-fusão. Assim, o antígeno PreF pode ser, por exemplo, pelo menos 80% isolado, pelo menos, 90%, 95%, 98%, 99%, 99,9% ou mesmo separado de proteínas F de RSV em uma conformação pós- fusão. Em várias modalidades, os antígenos são separados também PreF de RSV a partir de proteínas que não incluem antígeno 0 sítio e/ou não estão ligados especificamente por um anticorpo monoclonal específico pré-fusão (tais como D25 ou AM22). Por exemplo, o antígeno PreF pode ser, pelo menos, 80% isolado, pelo menos, 90%, 95%, 98%, 99% ou mesmo 99,9% separados de Proteínas F de RSV que não incluem antígeno sítio de 0 e/ou não são especificamente ligado por um anticorpo monoclonal específico pré-fusão (tais como D25 ou AM22).

[00276] Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína de RSV recombinante F que, quando incubada em uma solução aquosa, forma uma população de Proteínas F de RSV recombinantes estabilizados em uma conformação pré-fusão, em que pelo menos 70% (tal como pelo menos 80% ou pelo menos 90% ou pelo menos 95% ou pelo menos 98%) dos antígenos isolados na população ligam-se especificamente a um anticorpo específico para proteína F de RSV pré-fusão (tais como D25 ou AM22) depois (a) incubação durante uma hora em NaCl a 350 mM, pH de 7,0, a 50°C; (b) incubação durante uma hora em NaCl a 350 mM, pH de 3,5, a 25°C; (c) incubação durante uma hora em NaCl a 350 mM, pH de 10, a 25°C; (d) incubação durante uma hora em osmolaridade de 10 mM, pH de 7,0, a 25°C; (e) incubação durante uma hora em osmolaridade de 3000 mM, pH de 7,0, a 25°C; (g) uma combinação de dois ou mais de (a) - (e); ou uma combinação de (a) e (b); (a) e (c); (a) e (d); (a) e (e); (b) e (d); (b) e (e); (c) e (d); (c) e (e); (a), (b) e (d); (a), (c) e (d); (a), (b) e (e); ou (a), (c) e (e).

[00277] Em outras modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína de RSV recombinante F que, quando incubada em uma solução aquosa, forma uma população de Proteínas F de RSV recombinantes estabilizados em uma conformação pré-fusão, em que pelo menos 60% (tal como pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90%) dos antígenos isolados na população se ligam especificamente ao anticorpo específico pré-fusão depois de dez ciclos de congelamento e descongelamento em NaCl a 350 mM, pH de 7,0.

[00278] Em algumas modalidades, os antígenos PreF são fornecidos como uma população homogênea que não inclui detectável proteína F de RSV em uma conformação pós-fusão. Proteína F de RSV é detectável por microscopia eletrônica de coloração negativa e/ou a ligação específica por um anticorpo pós-fusão.

1. Proteínas F de RSV recombinantes estabilizadas em uma conformação pré-fusão

[00279] Os antígenos PreF descritos aqui incluem uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão e incluem um polipeptídeo F1 e F2 um polipeptídeo. O polipeptídeo F1, F2 polipeptídeo ou ambos, podem incluir pelo menos uma modificação (por exemplo, uma substituição de um aminoácido), que estabiliza a proteína F de RSV recombinante na sua conformação pré-fusão. Em várias modalidades, o polipeptídeo e o polipeptídeo F2 F1 estão ligados por um ligante peptídico (por exemplo, em modalidades incluindo uma única cadeia de proteína F de RSV). A estabilização da proteína F de RSV recombinante na conformação pré-fusão preserva pelo menos um epitopo específico pré-fusão (ou seja, um epitopo presente na pré-(mas não pós-) conformação de fusão da proteína F de RSV) que se liga especificamente a um F de RSV específicos do pré-fusão anticorpo monoclonal (ou seja, um anticorpo que se liga especificamente à proteína F de RSV em uma conformação pré-fusão, mas não uma conformação pós fusão). Deste modo, os antígenos PreF são descritos especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0).

[00280] Em alguns exemplos, o antígeno PreF inclui uma proteína recombinante F de RSV que inclui um F1 e/ou F2 polipeptídeo a partir de um RSV Um vírus, por exemplo, um F1 e/ou F2 polipeptídeo a partir de um RSV F0 proteína fornecida como uma de SEQ ID NOs: 1-128 ou 370, que é modificado para estabilizar a proteína F de RSV recombinante em uma conformação pré-fusão. Em alguns exemplos, o antígeno PreF inclui uma proteína recombinante F de RSV que inclui um F1 e/ou F2 polipeptídeo a partir de um vírus RSV B, por exemplo, um F1 e/ou F2 polipeptídeo a partir de um RSV F0 proteína fornecida como uma de SEQ ID NOs: 129-177, que é modificado para estabilizar a proteína F de RSV recombinante em uma conformação pré-fusão. Em alguns exemplos, o antígeno PreF inclui uma proteína recombinante F de RSV que inclui um F1 e/ou F2 polipeptídeo a partir de um vírus RSV bovino, por exemplo, um F1 e/ou F2 polipeptídeo a partir de um RSV F0 proteína fornecida como uma de SEQ ID NOs: 178-184, que é modificado para estabilizar a proteína F de RSV recombinante em uma conformação pré-fusão. F1 e/ou F2 polipeptídeos de outros subtipos de RSV também podem ser usados. A proteína F de RSV recombinante pode incluir modificações das sequências de RSV nativo, tais como substituições de aminoácidos, deleções ou inserções, glicosilação e/ou a ligação covalente de proteínas não relacionadas (por exemplo, um marcador de proteína), enquanto o antígeno PreF retém a proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão. Proteínas F de RSV dos diferentes subgrupos de RSV, bem como sequências de ácidos nucleicos que codificam tais proteínas e métodos para a manipulação e inserção de tais sequências de ácidos nucleicos em vetores, são descritos aqui e conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Tan et al., PLoS ONE, 7: e51439, 2011; Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, NY (1994)).

[00281] Em algumas modalidades, a proteína F de RSV recombinante compreende ou é constituído por um polipeptídeo de F2 e um polipeptídeo F1 compreendendo sequências de aminoácidos pelo menos 80% idênticas aos aminoácidos 26-103 e 145-310, respectivamente, de um conjunto de sequências F de RSV proteína nativa apresentada como qualquer uma de SEQ ID Nos: 1-184, tal como SEQ ID NO: 124.

[00282] Em algumas modalidades, a proteína F de RSV recombinante compreende ou é constituído por um polipeptídeo de F2 e um polipeptídeo F1 compreendendo sequências de aminoácidos pelo menos 80% (tal como pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou mesmo 100% ) idênticos aos aminoácidos 26-103 e 145-513, respectivamente, de uma sequência nativa da proteína F de RSV apresentada como qualquer uma de SEQ ID Nos: 1-184, tal como SEQ ID NO: 124.

[00283] Em algumas modalidades, a proteína F de RSV recombinante compreende ou é constituído por um polipeptídeo de F2 e um polipeptídeo F1 compreendendo sequências de aminoácidos pelo menos 80% (tal como pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou mesmo 100% ) idênticos aos aminoácidos 26-103 e 145-529, respectivamente, de uma sequência nativa da proteína F de RSV apresentada como qualquer uma de SEQ ID Nos: 1-184, tal como SEQ ID NO: 124.

[00284] Em algumas modalidades, a proteína F de RSV recombinante compreende ou é constituído por um polipeptídeo de F2 e um polipeptídeo F1 compreendendo sequências de aminoácidos pelo menos 80% (tal como pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou mesmo 100% ) idênticos aos aminoácidos 26-103 e 145-551, respectivamente, de uma sequência nativa da proteína F de RSV apresentada como qualquer uma de SEQ ID Nos: 1-184, tal como SEQ ID NO: 124.

[00285] Em alguns exemplos, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo um F1 e/ou polipeptídeo F2 incluindo uma sequência de polipeptídeo que possui pelo menos 75% (por exemplo pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) de identidade de sequência com uma F1 RSV e/ou a partir de um RSV F2polypeptide Um vírus, por exemplo, um F1 e/ou um polipeptídeo a partir de F2 de RSV F0 proteína fornecida como uma de SEQ ID Nos: 1-128 ou 370. Em outros exemplos, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo um F1 e/ou F2 polipeptídeo incluindo uma sequência de polipeptídeo que possui pelo menos 75% (por exemplo pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) de identidade de sequência com uma F1 RSV e/ou F2polypeptide de um vírus RSV B, por exemplo, um F1 e/ou um polipeptídeo a partir de F2 de RSV F0 proteína fornecida como uma das ID SEQ NOs: 129-177. Em outros exemplos, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo um F1 e/ou polipeptídeo F2 incluindo uma sequência de polipeptídeo que possui pelo menos 75% (por exemplo pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) de identidade de sequência com uma F1 RSV e/ou F2polypeptide de um vírus RSV bovino, por exemplo, um F1 e/ou um polipeptídeo a partir de F2 de RSV F0 proteína fornecida como uma das ID SEQ NOs: 178-184.

[00286] Em várias modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F1 que inclui ou consiste em pelo menos 300 aminoácidos consecutivos (tal como pelo menos 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420 ou 430 aminoácidos consecutivos) a partir de uma sequência de polipeptídeo nativa F1, tais como as posições 137-513 de uma de SEQ ID Nos: 1-184 ou 370, incluindo quaisquer sequências polipeptídicas tendo pelo menos 75% (por exemplo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) de identidade de sequência com uma sequência nativa polipeptídeo F1, tais Dado que as posições 137-513 de qualquer uma de SEQ ID Nos: 1-184 ou 370. Por exemplo, em algumas modalidades, o antígeno inclui uma proteína PreF recombinante inclui um polipeptídeo incluindo F1 ou que consiste nas posições 137-513, 137-481, 137-491 ou posição 137 da extremidade C- terminal ou posiciona-137 para o domínio transmembrana, de qualquer uma de SEQ ID Nos: 1-184 ou 370, incluindo quaisquer sequências polipeptídicas tendo pelo menos 75% (por exemplo, a menos, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) de identidade de sequência com uma sequência de polipeptídeo nativa F1, tais como as posições 137513 ou posição 137 da extremidade C-terminal ou posições 137 -para o domínio transmembrana, qualquer uma das ID SEQ NOs: 1-184 ou 370. aqueles versados na técnica apreciarão que o antígeno PreF incluindo a proteína F de RSV recombinante pode incluir um polipeptídeo F1 com N- ou C- truncamentos terminais (por exemplo, supressão de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 ou mais aminoácidos) comparado a região extracelular de um polipeptídeo F1 nativo (por exemplo, as posições 137-524), enquanto o antígeno PreF é especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0).

[00287] Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui um polipeptídeo F1 incluindo um comprimento máximo, por exemplo, não mais do que 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430 ou não mais de 440 aminoácidos de comprimento. O polipeptídeo F1 pode incluir, consistir ou consistir essencialmente de as sequências descritas. As sequências F1 polipeptídicas contíguas descritos também podem ser unidos em ambas as extremidades com outras sequências independentes (para examinador, sequências de proteínas não RSV F1, RSV não sequências de proteína F, não RSV, envelope viral não ou sequências de proteínas não virais).

[00288] Em várias modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F2 que inclui ou consiste em pelo menos 60 aminoácidos consecutivos (tal como pelo menos 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 ou 109 aminoácidos consecutivos) a partir de uma sequência de polipeptídeo nativa F2, tais como as posições de qualquer uma de 26-109 uma de SEQ ID Nos: 1-184 ou 370, incluindo uma sequência de polipeptídeo que possui pelo menos 75% (por exemplo pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) para F1 polipeptídeo uma sequência nativa, tal como as posições 26-109 qualquer uma de SEQ ID Nos: 1-184 ou 370. Por exemplo, em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F2 que inclui ou consiste em 70-109 aminoácidos consecutivos (tais como 60-100, 75-95, 80-90, 75-85, 80-95, 81-89, 8288, 83-87, 83-84, 84-85 ou aminoácidos consecutivos ) a partir de uma sequência de polipeptídeo nativa F2, tais como as posições 26-109 qualquer uma de SEQ ID Nos: 1-184 ou 370, incluindo quaisquer sequências polipeptídicas tendo pelo menos 75% (por exemplo pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) de identidade de sequência com uma sequência de polipeptídeo nativa F2, tais como as posições 137-513 qualquer uma de SEQ ID Nos: 1-184 ou 370.

[00289] Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui um polipeptídeo F2 também é de um comprimento máximo, por exemplo, não mais do que 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87,. 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 aminoácidos de comprimento. O polipeptídeo F2 podem incluir, consistir ou consistir essencialmente de as sequências descritas. As sequências de polipeptídeo F2 contíguas descritas também podem ser unidas em ambas as extremidades com outras sequências independentes (para examinador, RSV não sequências proteicas F2, RSV não sequências de proteína F, não RSV, envelope viral não ou sequências de proteínas virais não).

[00290] Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui uma RS proteína VF recombinante incluindo um polipeptídeo F2 que inclui ou consiste em pelo menos 60 aminoácidos consecutivos (tal como pelo menos 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87,. 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 ou 109 aminoácidos consecutivos) a partir de um polipeptídeo F2 de sequência nativa, tais como as posições de qualquer 26-109 uma de SEQ ID Nos: 1-184 ou 370, incluindo sequências polipeptídicas tendo pelo menos 75% (por exemplo pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) para uma F2 sequência polipeptídica nativa, tais como os aminoácidos 26-109 qualquer uma de SEQ ID Nos: 1-184 ou 370 e inclui ainda um polipeptídeo incluindo F1 ou consistindo em pelo menos 300 aminoácidos consecutivos (tal como pelo menos 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420 ou 430 aminoácidos consecutivos) a partir de uma sequência de polipeptídeo nativa F1, tais como as posições 137-513 de uma de SEQ ID Nos: 1184 ou 370, incluindo quaisquer sequências polipeptídicas tendo pelo menos 75% (por exemplo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) de identidade de sequência com uma sequência de polipeptídeo nativa F1, tais como as posições 137-513 de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1 -184 ou 370.

[00291] Em um exemplo não limitativo, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo incluindo F1 posições 26-109 e 137-513, respectivamente, de qualquer uma de SEQ ID Nos: 1-184 ou 370, incluindo sequências polipeptídicas tendo pelo menos 75% (por exemplo pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência) para posições de 26-109 e 137-513, respectivamente, de qualquer uma de SEQ ID Nos: 1-184 ou 370.

[00292] Como dito acima, a proteína F de RSV é inicialmente sintetizado como uma proteína precursora F0 e é clivada em múltiplos sítios (incluindo dois sítios de clivagem de furina conservado) durante a maturação em células eucarióticas. Assim, a proteína F de RSV nativo falta o peptídeo de sinal N-terminal e o peptídeo pep27 (ou uma parte dele) da proteína precursora F0. Em várias modalidades, as proteínas F de RSV recombinantes descritos estabilizados na conformação pré- fusão não incluir o peptídeo de sinal (ou uma parte da mesma) e/ou que não incluem o peptídeo pep27 (ou uma porção do mesmo). aqueles versados na técnica apreciarão que F proteínas de RSV recombinante a que falta o peptídeo de sinal F de RSV e/ou pep27 peptídeo pode ser gerado através da expressão do polipeptídeo recombinante F0 nas células, onde o peptídeo sinal e o peptídeo pep27 vai ser excisado do F0 precursora por proteases celulares.

[00293] Várias modalidades incluem um antígeno PreF incluindo um multímero de qualquer uma das proteínas F de RSV recombinantes descritas, por exemplo, um multímero incluindo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais do descrito RSV recombinante F proteínas. Em vários exemplos, qualquer um dos RSV recombinante F descritas proteínas pode ser ligado (por exemplo, através de um ligante peptídico) a outra das proteínas F de RSV recombinantes para formar o multímero.

[00294] É entendido na técnica que algumas variações podem ser feitas na sequência de aminoácidos de uma proteína sem afetar a atividade da proteína. Tais variações incluem a inserção de resíduos de aminoácidos, eliminações de resíduos de aminoácidos e substituições de resíduos de aminoácidos. Estas variações na sequência podem ser naturalmente as variações que ocorrem ou que podem ser manipuladas através do uso da técnica de engenharia genética conhecidas por aqueles versados na técnica. Exemplos de tais técnicas são encontrados em Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. et al., em Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, páginas 9,31-9,57) ou em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1989), 6.3.1-6.3.6, ambos os quais são aqui incorporadas por referência na íntegra. Assim, em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui um polipeptídeo F1, F2 um polipeptídeo ou tanto um polipeptídeo F1 e F2, que incluem uma ou mais substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de RSV nativa correspondente. Por exemplo, em algumas modalidades, o polipeptídeo F1, F2 polipeptídeo ou ambos, o polipeptídeo F1 e o polipeptídeo F2, incluem-se a 20 (tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19) substituições de aminoácidos em comparação com uma sequência F1 polipeptídeo nativo, como uma sequência de RSV nativa apresentada como qualquer uma de SEQ ID NOs: 1 -184 ou 370, em que o antígeno PreF é especificamente ligado por um pré F de RSV anticorpo específico (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0). Em modalidades adicionais, o polipeptídeo F1, F2 polipeptídeo ou ambos, o polipeptídeo F1 e o polipeptídeo F2, incluem-se a 20 (tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19) substituições conservativas de aminoácidos em comparação com uma sequência de polipeptídeo nativa F1, tal como uma sequência de RSV nativa apresentada como qualquer uma de SEQ ID Nos: 1-184 ou 370, em que o antígeno PreF é especificamente ligado por um F de RSV anticorpo específico (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0). Por exemplo, em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante em uma conformação pré-fusão que é modificado para aumentar a expressão da proteína para fins produções de proteína, por exemplo, por eliminação de um ou mais sinais de localização nuclear presente no F de RSV proteína. A manipulação da sequência de nucleotídeos que codifica a sequência F1 ou F2polypeptide (tais como uma sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo F0 incluindo os polipeptídeos F1 e F2) usando procedimentos padrão, incluindo em um não limitativo, modalidade, a mutagênese específica, dirigida ao sítio ou noutro específico, não limitativo, modalidade, a PCR, podem ser usados para produzir tais variantes. Alternativamente, os polipeptídeos F1 e F2 podem ser sintetizados usando métodos padronizados. As modificações mais simples envolvem a substituição de um ou mais aminoácidos por aminoácidos que têm propriedades bioquímicas similares. Estas denominadas substituições conservativas são susceptíveis de ter um impacto mínimo sobre a atividade da proteína resultante.

a. Modificações de Estabilização de Membrana Distal

[00295] Conforme descrito aqui, a proteína F de RSV é submetido a um rearranjo estrutural entre as suas conformações pré e pós-fusão. Como mostrado na Figura 2B, a região N-terminal do polipeptídeo F1 na conformação pré-fusão (correspondente em parte à lóbulo distal membrana mostrado na Figura 2A) inclui o OC2 indicada, OC3, β3, β4 e OC4 helicoidal e estruturas de folha beta, enquanto a região correspondente do terminal N do polipeptídeo F1 na estrutura pós-fusão inclui uma estrutura helicoidal alargada - OC2, OC3, β3, β4 e OC4 helicoidal de folhas beta e estruturas estão ausentes. Além disso, a região C-terminal do polipeptídeo F1 na conformação pré-fusão (correspondente em parte à lóbulo proximal membrana mostrado na Figura 2A) inclui o indicado β22, oc9 e β23 de folhas beta e estruturas helicoidais, enquanto que a correspondente região C-terminal do polipeptídeo F1 na estrutura pós-fusão conformação inclui uma estrutura estendida bobina helicoidal e alargada - a β22, oc9 e β23 de folhas beta e estruturas helicoidais estão ausentes. Assim, a membrana lóbulos distais e proximais da membrana da proteína F de RSV na sua conformação pré-fusão incluem vários elementos estruturais distintas que estão ausentes as regiões correspondentes da proteína F de RSV na sua conformação pós-fusão.

[00296] Guiado pelas características estruturais identificadas no pré e pós-fusão conformações da proteína F de RSV, vários modos de estabilização da proteína F de RSV em uma conformação pré-fusão estão disponíveis, incluindo substituições de aminoácidos que introduzem uma ou mais ligações de dissulfureto não naturais, encher cavidades no interior da proteína F de RSV, alterar o empacotamento de resíduos na proteína F de RSV, introduzir sítios de glicosilação ligados a N e as suas combinações. As modificações estabilizar aqui proporcionados são modificações que estabilizam a proteína F de RSV recombinante na conformação pré-fusão alvo. Em várias modalidades, a proteína F de RSV não é estabilizada por ligação reticulada não específica, tal como o glutaraldeído a reticulação, por exemplo glutaraldeído reticulação de membrana ligada a trímeros F de RSV.

[00297] Em algumas modalidades não limitativas, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão por introdução de uma ligação de dissulfureto, em que a proteína F de RSV recombinante inclui S 155C e S290C; G151C e I288C; A153C e K461C; A149C e Y458C; G143C e S404S substituições; ou substituições de aminoácidos e V469C Y33C. Exemplos de proteínas precursoras de tais proteínas F de RSV recombinantes (incluindo um domínio Foldon ligado ao C-terminal do polipeptídeo FL) não limitativos são aqui apresentadas como SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 209 e SEQ ID NO: 211. De acordo com outras modalidades não limitativos, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão por introdução de uma ligação de dissulfureto e uma ou mais substituições de preenchimento da cavidade, em que a proteína F de RSV recombinante inclui S155C, substituições S290C e um grande resíduo hidrofóbico na posição 190 e/ou na posição 207 (por exemplo, uma substituição S190F, S190W ou S190L e/ou um V207L, V207F ou V207W). Exemplos de proteínas precursoras de tais proteínas recombinantes precursoras RSV F (incluindo um domínio Foldon ligado ao C-terminal do polipeptídeo FL) não limitativos são aqui apresentadas como SEQ ID NO: 371, SEQ ID NO: 372, SEQ ID NO : 373, SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 375 e SEQ ID NO: 376.

[00298] Muitas das sequências de proteínas F de RSV recombinantes descritas aqui incluem a sequência de sítios de clivagem de protease (tais como sítios de trombina), marcadores proteicas (tais como um marcador His, um marcador Strep II, um marcador Avi, etc., que não são essenciais para a função da proteína F de RSV, tal como para a indução de uma resposta imune em um indivíduo. aqueles versados na técnica reconhecerão tais sequências e quando apropriado, compreender que essas marcas ou sítios de clivagem da protease não estão incluídos no uma proteína F de RSV recombinante descrito,

i. Ligações de dissulfureto não naturais

[00299] Em várias modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão por pelo menos uma ligação de dissulfureto não natural incluindo um par de resíduos de cisteína com ligações reticuladas. Uma ligação de dissulfureto não natural é um que não ocorre em uma proteína F de RSV nativa e é introduzido por engenharia de proteínas (por exemplo, através da inclusão de um ou mais resíduos de cisteína substituídos que formam a ligação de dissulfureto não natural). Por exemplo, em algumas modalidades, qualquer da proteína recombinante descrito RSV F está estabilizada em uma conformação pré-fusão por qualquer um de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 pontes dissulfureto incluindo um par de ligação reticulada de resíduos de cisteína. Em um exemplo específico não limitativo, a proteína F de RSV recombinante é estabilizada em uma conformação pré-fusão por um único par de resíduos de cisteína com ligações reticuladas. Em um outro exemplo não limitativo, de qualquer proteína recombinante no RSV F descrito é estabilizada em uma conformação pré-fusão por dois pares de resíduos de cisteína com ligações reticuladas.

[00300] Os resíduos de cisteína que formam a ligação de dissulfureto pode ser introduzido no RSV F nativa sequência da proteína por uma ou mais substituições de aminoácidos. Por exemplo, em algumas modalidades, uma única substituição de aminoácido que introduz um resíduo de cisteína forma uma ponte de dissulfureto com um resíduo de cisteína presente na sequência da proteína F de RSV nativa. Em modalidades adicionais, dois resíduos de cisteína são introduzidos em uma sequência de RSV nativa para formar a ligação de dissulfureto. A localização da cisteína (ou cisteínas) de uma ligação de dissulfureto para estabilizar a proteína F de RSV em uma conformação pré-fusão pode ser prontamente determinado aqueles versados na técnica, usando a estrutura descrita de proteína F de RSV na sua conformação pré-fusão e a estrutura previamente identificados de proteína F de RSV na sua conformação pós fusão.

[00301] Por exemplo, as posições de aminoácidos das cisteínas estão tipicamente dentro de uma distância suficientemente próxima para a formação de uma ligação de dissulfureto na conformação pré- fusão da proteína F de RSV. Os métodos de utilização de dados estrutura tridimensional para determinar se dois resíduos estão a uma distância suficientemente perto um do outro para a formação de ligações de dissulfureto são conhecidos (vide, por exemplo, Peterson et al., Protein Engineering 12: 535-548, 1999 e Dombkowski, Bioinformatics, 19: 1852-1853, 3002 (que descreve DISULFIDE BY DESIGN™) cada um dos quais é aqui incorporado por referência). Por exemplo, os resíduos podem ser selecionados manualmente, com base na estrutura tridimensional da proteína F de RSV em uma conformação pré-fusão aqui proporcionado ou um software, tal como DISULFIDE BY DESIGN™, pode ser usado. Sem estar limitado pela teoria, a distância ideal para a formação de uma ligação de dissulfureto são geralmente considerados como sendo cerca de ~5,6A para a distância Cα-Cα, ~2,02 A para a distância Sy-Sy e 3,5-4,25 A para a distância C-C (usando o rotâmero ideal). Os versados na técnica apreciarão que as variações de estas distâncias são incluídos quando selecionando resíduos em uma estrutura tridimensional que pode ser substituído por cisteínas para a introdução de uma ligação de dissulfureto. Por exemplo, em algumas modalidades os resíduos selecionados têm uma distância Cα-Cα de menos de 7,0 A e/ou uma distância C-C inferior a 4,7A. Em algumas modalidades os resíduos selecionados têm uma distância Cα-Cα de 2,08,0 A e/ou uma distância C-C de 2,0-5,5 A. Em várias modalidades, as posições de aminoácidos das cisteínas estão a uma distância suficientemente próxima para a formação de uma ligação de dissulfureto no pré-fusão, mas não pós-fusão, conformação da proteína F de RSV.

[00302] Os versados na técnica podem determinar prontamente a posição relativa de um aminoácido particular entre os pré e pós-fusão conformações da proteína F de RSV, por exemplo, comparando as estruturas pré-fusão aqui definidos pelas coordenadas estruturais previstos no quadro 1, com a estrutura pós-fusão anteriormente identificados descrito no McLellan et al., J. Virol., 85, 7788, 2011, com as coordenadas estruturais depositado como N° de Acesso PDB 3RRR). Os métodos de determinar a posição relativa de um aminoácido particular entre as duas estruturas de proteínas (por exemplo, entre as estruturas tridimensionais pré e pós-fusão da proteína F de RSV) são conhecidos. Por exemplo, a pessoa com conhecimentos correntes na técnica pode utilizar os métodos de sobreposição conhecidas para comparar as duas estruturas (por exemplo, os métodos que utilizam o programa LSQKAB (Kabsch W. Acta. Cryst. A32 922-923 (1976)). Em um exemplo, a estruturas pré-pós-fusão e pode ser sobreposta por LSQKAB usando para alinhar F posições de proteína 26-60, 77-97, 220322, 332-459 e definida pelas coordenadas estruturais fornecidos na Tabela 1, com as posições de proteína F 26-60, 77-97, 220-322, 332459 e definida pelas coordenadas estruturais como depositados N° de Acesso PDB 3RRR e comparar a distância entre o átomo de Ca para cada resíduo em estruturas pré e pós-fusão para identificar o desvio de resíduos particulares entre as duas estruturas.

[00303] Em várias modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína recombinante F de RSV estabilizado em uma conformação pré-fusão por uma ligação de dissulfureto entre um resíduo de cisteína introduzido em uma posição de aminoácido que muda de conformação e uma cisteína introduzido em uma posição de aminoácido que não altere a conformação, entre o pré e pós-estruturas de fusão, respectivamente. Por exemplo, em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo substituições de aminoácidos que introduzem um par de cisteínas, em que a primeira cisteína está em uma posição de aminoácidos da proteína F de RSV que tem um desvio quadrático médio de pelo menos 5 (tal como pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9 ou pelo menos 10) Angstroms entre a estrutura tridimensional das proteínas pré e pós- fusão conformações F de RSV e o segundo é cisteína em uma posição de aminoácidos da proteína F de RSV que tem um desvio quadrático médio de menos do que 4 (tal como inferior a 3, 2 ou 1) Angstroms entre a estrutura tridimensional da proteína F de RSV pré- e pós- conformações de fusão, em que o antígeno PreF é especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou que inclua uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0).

[00304] Com base em uma comparação entre as pré- e pós-F de RSV estruturas de fusão, existem pelo menos duas regiões que são submetidos a grandes alterações conformacionais, localizado no terminal N e C-terminais da subunidade F1 (resíduos 137-216 e 461513, respectivamente). Por exemplo, como ilustrado na Figura 2B, as posições 137-216 e 461-513 do polipeptídeo F1 sofrer rearranjo estrutural entre as conformações Pré e Pós-proteína F, enquanto que as posições 217-460 do polipeptídeo F1 mantêm-se relativamente inalterada. Assim, em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré- fusão por uma ligação de dissulfureto entre uma primeira cisteína em uma das posições 137-216 ou 461-513 do polipeptídeo F1 e uma segunda cisteína em uma de posições 217-460 do polipeptídeo F1. Em outras modalidades, o antígeno inclui uma proteína PreF F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão por uma ligação de dissulfureto entre uma primeira cisteína em uma das posições 137-216 ou 461-513 do polipeptídeo F1 e uma segunda cisteína na posição de o polipeptídeo F2, tal como uma das posições 26-109 (por exemplo, uma das posições 26-61 ou 77-97) do polipeptídeo F2.

[00305] Em modalidades adicionais, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré- fusão por uma ligação de dissulfureto entre as cisteínas que são introduzidos em posições de aminoácidos que alteram a conformação entre as estruturas pré- e pós-fusão, respectivamente. Por exemplo, em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo substituições de aminoácidos que introduzem um par de cisteínas, em que a primeira cisteína e a segunda cisteína está em uma posição de aminoácidos da proteína F de RSV que tem uma média de raiz desvio quadrado de pelo menos 5 (tal como pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9 ou pelo menos 10) Angstroms entre a estrutura tridimensional das proteínas pré e pós- fusão conformações F de RSV, em que o antígeno PreF inclui atividade de ligação específica a um anticorpo específico pré-fusão-F de RSV (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui um epitopo específico de RSV F pré-fusão (por exemplo, um D25 ou epitopo AM22). Em algumas de tais modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão por uma ligação de dissulfureto entre um a primeira cisteína e a segunda cisteína nas posições 137-216 do polipeptídeo F1. Em modalidades adicionais, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão por uma ligação de dissulfureto entre a primeira cisteína e a segunda cisteína nas posições 461-513 do polipeptídeo F1. Em outras modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão por uma ligação de dissulfureto entre a primeira cisteína e a segunda cisteína nas posições 137-216 e 461-513, respectivamente, do polipeptídeo F1.

[00306] Os versados na técnica podem determinar prontamente a localização de um aminoácido particular nos períodos pré e pós-fusão conformações da proteína F de RSV (e qualquer diferença em uma posição intermédia entre as duas conformações) usando as coordenadas estruturais da estrutura tridimensional da proteína F de RSV na conformação pré-fusão (os quais são apresentados na Tabela 1) e as coordenadas estruturais da estrutura tridimensional da proteína F de RSV na conformação pós-fusão (os quais são estabelecidos no N° de Acesso ao Protein Databank 3RRR). Por exemplo, tais métodos de comparação estão descritos no Exemplo 1. A Tabela 5 fornece exemplos de pares de cisteína e substituições de aminoácidos que podem ser usados para estabilizar uma proteína F de RSV em uma conformação pré-fusão. Tabela 5a. Pares de cisteína exemplificativos para estabilização de ligação de dissulfureto

[00307] Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo um ou mais (tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10) de ligações de dissulfureto, incluindo ligação de dissulfureto entre resíduos de cisteína localizados no RSV F posições listadas em uma ou mais das linhas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 ou 54 da coluna 2 da Tabela 5, em que o antígeno PreF é especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0).

[00308] Em outras modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo um ou mais (tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10) de ligações de dissulfureto, incluindo ligações de dissulfureto entre resíduos de cisteína que são introduzidos pelas substituições de aminoácidos cisteína listados em uma ou mais das linhas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 ou 54 da coluna 3 da Tabela 5, em que o antígeno PreF é especificamente ligado por um anticorpo específico de fusão pré (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0).

[00309] A SEQ ID NOs listados na coluna 4 da Tabela 5 estabelecido sequências de amino ácidos, incluindo as substituições indicadas, bem como, um peptídeo de sinal, F2 polipeptídicas (posições 26-109), um polipeptídeo pep27 (posições 110-136), um F1 polipeptídicas (posições 137-513), um domínio de trimerização (um domínio Foldon) e um sítio de clivagem de trombina (LVPRGS (posições 547-552 da SEQ ID NO: 185)) e os marcadores de purificação (marcador His (HHHHHH (posições 553-558 de SEQ ID NO: 185)) e Strep Tag II (SAWSHPQFEK (posições 559-568 da SEQ ID NO: 185))).

[00310] Assim, em modalidades adicionais, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV que inclui um polipeptídeo F1 e um polipeptídeo F2 como definido em qualquer uma de SEQ ID NOs listados na coluna 4 da Tabela 5, tal como um ID SEQ NO listados em uma de linhas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 ou 54 da coluna 4 da Tabela 5, em que o antígeno PreF é especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui um F de RSV conformação específica pré-fusão ( tal como sítio antigênico 0). Por exemplo, o antígeno PreF pode incluir uma proteína F de RSV que inclui um polipeptídeo e um polipeptídeo F1 F2, em que F2 e o polipeptídeo F1 incluem a sequência de aminoácidos apresentada como posições 26-109 e 137-513, respectivamente, de qualquer um da SEQ ID NOs indicados na coluna 4 do quadro 5, tal como um ID SEQ NO listados em uma das linhas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 ou da coluna 4 da Tabela 5, em que o antígeno PreF é especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0).

[00311] Em outras modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo um ou mais (tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10) de ligações de dissulfureto intra-protômero, incluindo ligação de dissulfureto entre resíduos de cisteína situado nas RSV F posições do polipeptídeo F1 enumerados no de uma ou mais das linhas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21 da coluna 2 Tabela 5. Por exemplo, o antígeno PreF pode incluir uma proteína F de RSV recombinante incluindo um ou mais (tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10) pontes dissulfureto intra-protômero, incluindo pontes dissulfureto entre resíduos de cisteína que são introduzidas pelas substituições de aminoácidos do polipeptídeo F1 enumerados de uma ou mais das linhas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21 da coluna 3 da Tabela 5. Em qualquer uma destas modalidades, o antígeno PreF é especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0).

[00312] Em outras modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo um ou mais (tal como 2, 3, 4, 5, 6 ou 7) ligações intra-protômero dissulfureto, incluindo ligação de dissulfureto entre resíduos de cisteína localizados no F de RSV posições dos polipeptídeos F2 e F1 enumerados no de uma ou mais das linhas 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28 de coluna 2 do quadro 5. Por exemplo, o antígeno PreF pode incluir um RSV proteína recombinante incluindo F um ou mais (tal como 2, 3, 4, 5, 6 ou 7) ligações intra-protômero dissulfureto, incluindo ligação de dissulfureto entre resíduos de cisteína que são introduzidos pelas substituições de aminoácidos do polipeptídeo F2 e F1 listados na de um ou mais as linhas 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28 da coluna 3 da Tabela 5. Em qualquer uma destas modalidades, o antígeno PreF é especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0).

[00313] Em outras modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo um ou mais (tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10) de ligações de dissulfureto interprotômero, incluindo ligação de dissulfureto entre resíduos de cisteína situado nas RSV F posições do polipeptídeo F1 listados em uma ou mais das linhas 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 ou 39 de coluna 2 do quadro 5. Por exemplo, o antígeno PreF pode incluir uma proteína F de RSV recombinante incluindo um ou mais (tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10) ligações interprotômero dissulfureto, incluindo ligação de dissulfureto entre resíduos de cisteína que são introduzidos por as substituições de aminoácidos do polipeptídeo F1 enumerados no de uma ou mais das linhas 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 ou 39 da coluna 3 do quadro 5. Em qualquer dessas modalidades, o PreF antígeno é ligado especificamente por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré- fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0).

[00314] Em outras modalidades, o antígeno inclui uma proteína PreF F de RSV recombinante incluindo uma ligação de dissulfureto interprotômero entre resíduos de cisteína localizados nas posições F de RSV do F2 e polipeptídeos F1 listado na coluna 2 da linha 40 do Quadro 5. Em outras modalidades, PreF o antígeno inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo uma ligação de dissulfureto interprotômero entre resíduos de cisteína que são introduzidos por as substituições de aminoácidos no polipeptídeo F1 e F2 listadas na coluna 3 da linha 40 do Quadro 5. Em qualquer uma destas modalidades, PreF o antígeno é ligado especificamente por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré- fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0).

[00315] Em algumas modalidades, os aminoácidos podem ser inseridos (ou suprimido) a partir da sequência de proteína M para ajustar o alinhamento dos resíduos na estrutura da proteína F, de tal modo que pares de resíduos particulares estão a uma distância suficientemente próxima para formar um interprotômero ou entre ligação de dissulfureto na pré-fusão, mas não pós-fusão, conformação. Em muitas dessas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína recombinante F de RSV que inclui uma ponte de dissulfureto entre resíduos de cisteína localizados nas F de RSV posições do polipeptídeo F1, bem como a inserção de aminoácido, listada em uma ou mais das linhas 41, 42, ou, 43 da coluna 2 da Tabela 5. Em outras modalidades, o antígeno inclui uma proteína PreF F de RSV recombinante que inclui uma ponte de dissulfureto entre resíduos de cisteína que são introduzidos por as substituições de aminoácidos de polipeptídeos F1, bem como a inserção de aminoácidos, listados na de uma ou mais das linhas 41, 42, ou, 43 da coluna 3 da Tabela 5.

[00316] Em um exemplo, o antígeno inclui uma proteína PreF F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão inclui uma ligação de dissulfureto entre as cisteínas em 155 e posiciona FI 290, tal como uma proteína recombinante com FI polipeptídeo S155C e S290C substituições.

[00317] Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo uma combinação de duas ou mais das ligações de dissulfureto entre resíduos de cisteína listados na Tabela 5 ou Tabela 5b, em que o antígeno PreF é especificamente ligado por um anticorpo específico do pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui um F de RSV conformação específica fusão pré (como sítio antigênico 0). Deverá ser entendido que algumas combinações não vai resultar em uma proteína F de RSV estabilizado em uma conformação pré-fusão; tais combinações podem ser identificados através de métodos descritos aqui, por exemplo, confirmando que o antígeno contém um tal polipeptídeo é especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui um F de RSV conformação específica pré-fusão ( tal como sítio antigênico 0).

[00318] Em outras modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo uma ligação não naturais dissulfureto de estabilização da proteína F em uma conformação pré-fusão, em que a proteína F inclui as substituições indicadas em um dos linha 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 da coluna 3 da Tabela 5b, em que os resíduos de cisteína são inseridos na proteína M para a formação da ligação de dissulfureto não natural. Em qualquer destas modalidades, o antígeno PreF é especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0).

[00319] A SEQ ID NOs listados na coluna 4 da Tabela 5b estabelecido sequências de aminoácidos incluindo as substituições indicadas, bem como, um peptídeo de sinal, F2 polipeptídeo (26-109 posições), um polipeptídeo pep27 (posições 110-136), um F1 polipeptídicas (posições 137-513), um domínio de trimerização (um domínio Foldon) e um sítio de clivagem de trombina (LVPRGS (posições 547-552 da SEQ ID NO: 185)) e marcadores de purificação (marcador His (HHHHHH (posições 553-558 de SEQ ID NO: 185)) e Strep Tag II (SAWSHPQFEK (posições 559-568 da SEQ ID NO: 185))). Assim, em modalidades adicionais, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV que inclui um polipeptídeo F1 e um polipeptídeo F2 como definido em qualquer uma das SEQ ID NOs listados na coluna 4 da Tabela 5b, tais como SEQ ID NO listados em uma da linha 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 da coluna 4 da Tabela 5b, em que o antígeno PreF está especificamente ligada por um anticorpo específico (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0). Por exemplo, o antígeno PreF pode incluir uma proteína F de RSV que inclui um polipeptídeo e um polipeptídeo F1 F2, em que F2 e o polipeptídeo F1 incluem a sequência de aminoácidos apresentada como posições 26-109 e 137-513, respectivamente, de qualquer um da ID SEQ NOs listados na coluna 4 da Tabela 5b, tais como SEQ ID NO listados em uma das linhas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 da coluna 4 da Tabela 5b, em que o antígeno PreF é especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou F de RSV inclui uma conformação específica pré- fusão (tal como sítio antigênico 0 ). Tabela 5b. Exemplos de substituições e sequências de proteína F estabilizada

ii. Substituições de aminoácidos de preenchimento de cavidade

[00320] A comparação da estrutura de conformação pré-fusão da proteína F de RSV (por exemplo, em complexo com D25 Fab, como descrito aqui) para a estrutura da proteína F de RSV pós-fusão (descrito, por exemplo, conforme descrito em McLellan et al., J. Virol., 85, 7788, 2011) identifica várias cavidades ou bolsas internas na conformação pré-fusão que deve entrar em colapso para o F para a transição para a conformação pós-fusão. Estas cavidades incluem os listados na Tabela 6.

[00321] Portanto, em diversas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão por substituições de ácidos um ou mais aminoácidos que introduzem um aminoácido que reduz o volume de uma cavidade interna que colapsa na conformação pós-fusão de proteína F de RSV. Por exemplo, as cavidades são preenchidas por substituição de aminoácidos com cadeias laterais grandes para aqueles com cadeias laterais pequenas. As cavidades podem ser cavidades intra-protômero ou cavidades interprotômero. Um exemplo de uma substituição de aminoácido de preenchimento cavidade F de RSV para estabilizar a proteína de RSV na sua conformação pré-fusão uma proteína F de RSV com S190F e substituições V207L. Em outra modalidade, a substituição de aminoácidos de preenchimento da cavidade para estabilizar a proteína de RSV na sua conformação pré- fusão uma proteína F de RSV inclui um S190F, S190L, S190W, S190H, S190M, S190Y ou substituição.

[00322] Os versados na técnica pode utilizar os métodos aqui proporcionados para comparar as estruturas das conformações de fusão pré e pós de a proteína F de RSV para identificar cavidades adequadas e substituições de aminoácidos para o preenchimento das cavidades identificados. Exemplos de cavidades e substituições de aminoácidos para reduzir o volume destas cavidades são fornecidos na Tabela 6. Tabela 6. Substituições de aminoácidos de preenchimento de cavidade exemplificativas

[00323] As cavidades indicadas são ditas por um pequeno resíduo de encosto da cavidade que pode ter uma mutação para um resíduo maior para encher a cavidade. Deve entender-se que outros resíduos (para além daquele a cavidade tem o nome) pode também ter uma mutação para preencher a mesma cavidade.

[00324] Assim, em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem o volume de uma ou mais das cavidades ditas na coluna 2 da Tabela 6, em que o antígeno PreF está especificamente ligada por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0). Em modalidades adicionais, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos listados na da linha 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 da coluna 3 da Tabela 6, em que o antígeno PreF é especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0).

[00325] A SEQ ID NOs listadas na Tabela 6 estabelecido sequências de aminoácidos incluindo as substituições indicadas, bem como, um peptídeo de sinal, F2 polipeptídeo (posições 26-109), um polipeptídeo pep27 (posições 110-136), um polipeptídeo (posições F1 137-513), um domínio de trimerização (um domínio Foldon) e um sítio de clivagem da trombina (LVPRGS (posições 547-552 da SEQ ID NO: 185)) e marcadores de purificação (marcador His (HHHHHH (posições 553-558 da SEQ ID NO: 185)) e Strep Tag II (SAWSHPQFEK (posições 559-568 da SEQ ID NO: 185))). Assim, em modalidades adicionais, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F1 e F2 um polipeptídeo como definido em qualquer uma das SEQ ID NOs listado na fila de 1, 2, 3, 4, 5, 6,7 ou 8 da coluna de 4 Tabela 6, em que o antígeno PreF é especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0). Por exemplo, o antígeno PreF pode incluir uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F1 e F2 um polipeptídeo conforme estabelecido como posições 26-109 e 137-513, respectivamente, como definido em qualquer uma das SEQ ID NOs listados na de a linha 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 da coluna 4 do Quadro 6, em que o antígeno PreF é especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0).

[00326] Em modalidades adicionais, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo as substituições de aminoácidos listados em uma das linhas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 ou 84 da coluna 3 do quadro 6b, em que o PreF antígeno é ligado especificamente por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0).

[00327] A SEQ ID NOs listadas na Tabela 6a estabelecido sequências de aminoácidos incluindo as substituições indicadas, um peptídeo de sinal de polipeptídeos F2 (posições 26-109), um polipeptídeo pep27 (posições 110-136), um polipeptídeo F1 (posições 137-513), um domínio de trimerização (um domínio Foldon) e um sítio de clivagem da trombina (LVPRGS (posições 547-552 da SEQ ID NO: 185)) e marcadores de purificação (marcador His (HHHHHH (posições 553-558 da SEQ ID NO: 185)) e Strep Tag II (SAWSHPQFEK (posições 559-568 da SEQ ID NO: 185))). Assim, em modalidades adicionais, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F1 e um polipeptídeo F2 como definido em qualquer uma das SEQ ID NOs listados em uma das linhas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 ou 84 da coluna 4 da Tabela 6b, em que o antígeno PreF é especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui um F de RSV conformação específica pré- fusão (tais como sítio antigênico 0). Por exemplo, o antígeno PreF pode incluir uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F1 e F2 um polipeptídeo conforme estabelecido como posições 26-109 e 137-513, respectivamente, como definido em qualquer uma das SEQ ID NOs listados em uma da linha 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 ou 84 da coluna 4 da Tabela 6b, em que o antígeno PreF é especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico Ø). Tabela 6b. Substituição de aminoácidos de preenchimento de cavidade exemplificativa

iii. Substituições de Reacondicionamento

[00328] Em algumas modalidades, o antígeno inclui uma proteína PreF F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré- fusão por uma ou mais substituições de aminoácidos reacondicionamento. Substituições de reacondicionamento aumentar interações atrativas (tais como as interações hidrofóbicas ou a formação de ligação de hidrogénio-) ou diminuir as interações repulsivas (tais como as forças repulsivas entre os agrupamentos de resíduos carregados de forma similar), entre os aminoácidos em uma proteína.

[00329] Os versados na técnica pode utilizar os métodos aqui proporcionados para comparar as estruturas dos pré e pós-fusão conformações da proteína F de RSV para identificar sítios adequados de interações repulsivas e/ou de atração entre F de RSV resíduos de proteínas e amino substituições de ácido para reduzir ou aumentar estas interações, respectivamente. Por exemplo, através da identificação de interações repulsivas na estrutura da proteína F de RSV na conformação pré-fusão aqui proporcionado e a introdução de substituições que reduzem essas interações repulsivas. Alternativamente, a proteína F de RSV pode incluir substituições que aumentam as interações atrativas entre os resíduos de proteína F de RSV na conformação pré-fusão da proteína F de RSV, mas não a conformação pós-fusão da proteína F de RSV. Exemplos de substituições de aminoácidos são fornecidos na Tabela 7. Tabela 7. Substituições de aminoácidos de reacondicionamento

[00330] Assim, em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo as substituições de aminoácidos listados em uma das linhas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 ou 47 da coluna 2 da Tabela 7, em que o antígeno PreF é especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0).

[00331] A SEQ ID NOs listados na Tabela 7 adiante definido sequências de aminoácidos incluindo as substituições indicadas, bem como, um peptídeo de sinal, F2polypeptide posições (26-109), um polipeptídeo pep27 (posições 110-136), um polipeptídeo F1 (posições 137 -513), um domínio de trimerização (um domínio Foldon) e um sítio de clivagem da trombina (LVPRGS (posições 547-552 da SEQ ID NO: 185)) e marcadores de purificação (marcador His (HHHHHH (posições 553-558 da SEQ ID NO : 185)) e Strep Tag II (SAWSHPQFEK (posições 559-568 da SEQ ID NO: 185))). Assim, em modalidades adicionais, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F1 e um polipeptídeo F2 conforme estabelecido em uma das linhas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 ou 47 da coluna 3 da Tabela 7, em que o antígeno PreF é especificamente ligado por um anticorpo específico pré- fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0). Por exemplo, o antígeno PreF pode incluir uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F1 e F2 um polipeptídeo conforme estabelecido como posições 26-109 e 137-513, respectivamente, como definido em qualquer uma das SEQ ID NOs listados em uma de linhas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 ou 47 da coluna 3 do Tabela 7, em que o antígeno PreF é especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0).

[00332] Várias modalidades incluem combinações das substituições de aminoácidos acima listadas.

iv. Sítios de glicosilação N-ligada

[00333] A comparação da estrutura de conformação pré-fusão da proteína F de RSV (por exemplo, em complexo com D25 ou AM22 como descrito aqui) para a estrutura da proteína F de RSV pós-fusão (descrito, por exemplo, conforme descrito em McLellan et al., J. Virol., 85, 7788, 2011) identifica várias regiões da proteína F de RSV, que são acessíveis-solvente na pré-fusão F de RSV conformação descrito aqui, mas com solvente-inacessível no pós-fusão F de RSV conformação (conforme descrito em McLellan et al., J. Virol., 85, 7788, 2011).

[00334] Assim, em algumas modalidades, o antígeno inclui uma proteína PreF F de RSV recombinante incluindo uma substituição de aminoácido que introduz um sítio de glicosilação ligado a N na posição que é acessível no solvente pré-fusão F de RSV conformação descrito aqui, mas no solvente-inacessível o pós-fusão F de RSV conformação (conforme descrito na McLellan et al., J. Virol., 85, 7788, 2011). Estas substituições de aminoácidos estabilizam a proteína F de RSV recombinante na conformação pré-fusão através do aumento da energia necessária para a proteína a adotar o estado pós-fusão.

[00335] Para criar um sítio de glicosilação ligada a N, a sequência Asn-X-Ser/Thr (onde X é qualquer aminoácido exceto Pro) precisa de ser introduzido. Isto pode ser conseguido por substituição de um aminoácido Ser/Thr terminal de dois resíduos C até um resíduo Asn nativa ou por substituição de um aminoácido Asn dois resíduos N- terminal a um resíduo nativo Ser/Thr ou por substituição de ambos um resíduo Asn e Ser/Thr separados por um aminoácido não prolina. Assim, em vários enquadramentos, qualquer uma das proteínas F de RSV recombinante descritos são glicosiladas. Por exemplo, a proteína F de RSV inclui uma substituição de aminoácido que introduz um sítio de glicosilação ligada a N na proteína F de RSV que é solvente-acessível na pré-fusão F de RSV conformação descrito aqui, mas solvente- inacessíveis na conformação pós-fusão de F de RSV como descrito em McLellan et al., J. Virol., 85, 7788, 2011). Exemplos de modificações da instalação de glicosilação ligados a N estão apresentados na Tabela 8. Tabela 8. Exemplos de glicosilação N-ligada

[00336] Em algumas modalidades, um antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré- fusão por um sítio de glicosilação ligada a N em um ou mais de (tais como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 de ) posiciona 506, 175, 178, 276, 476, 185, 160, 503 ou 157 do polipeptídeo F1, em que o antígeno PreF é especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0). Por exemplo, o polipeptídeo F1 pode incluir uma substituição de aminoácido que introduz um sítio de glicosilação ligada a N em um ou mais de (tais como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 de) posiciona 506, 175, 178, 276, 476, 185, 160, 503 ou 157 do polipeptídeo F1.

[00337] As SEQ ID NOs listadas na Tabela 8 estabelecido sequências de aminoácidos incluindo as substituições indicadas, bem como, um peptídeo de sinal, F2 polipeptídeo (26-109 posições), um polipeptídeo pep27 (posições 110-136), um polipeptídeo (posições F1 137-513), um domínio de trimerização (um domínio Foldon) e um sítio de clivagem da trombina (LVPRGS (posições 547-552 da SEQ ID NO: 185)) e marcadores de purificação (marcador His (HHHHHH (posições 553-558 da SEQ ID NO: 185)) e Strep Tag II (SAWSHPQFEK (posições 559-568 da SEQ ID NO: 185))). Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui um polipeptídeo incluindo F1 I506N e K508T substituições para introduzir um sítio de glicosilação ligado a N na posição 506. Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui um polipeptídeo incluindo uma A177S F1 substituição para introduzir uma glicosilação N-ligada sítio na posição 175. Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui um polipeptídeo incluindo uma substituição F1 V178N para introduzir um sítio de glicosilação ligado a N na posição 178. Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui um polipeptídeo F1 incluindo uma substituição para introduzir um V278T sítio de glicosilação ligado a N na posição 276. Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui um polipeptídeo incluindo uma substituição F1 Y478T para introduzir um sítio de glicosilação ligado a N na posição 476. Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui um polipeptídeo incluindo F1 e V185N V187T substituições para introduzir um sítio de glicosilação ligado a N na posição 185. Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui um polipeptídeo incluindo substituições F1 L160N G162S e para introduzir um sítio de glicosilação ligado a N na posição 160. Em algumas modalidades, o antígeno inclui PreF um polipeptídeo incluindo L503N F1 e F505S substituições para introduzir um sítio de glicosilação ligado a N na posição 503. Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui um polipeptídeo incluindo uma substituição F1 V157N para introduzir um sítio de glicosilação ligado a N na posição 157. Em qualquer dos Nestas modalidades, o antígeno PreF é especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou F de RSV inclui uma conformação específica pré- fusão (tal como sítio antigênico 0).

[00338] Em modalidades adicionais, o polipeptídeo compreende os resíduos 137-513 F1 da SEQ ID NO: 198 (sítio de glicosilação ligado a N na posição 506); SEQ ID NO: 199 (sítio de glicosilação ligado a N na posição 175) posição 178) posição 276) posição 476) posição 185) posição 160) SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: 200 (sítio de 203 (sítio de 204 (sítio de 214 (sítio de 215 (sítio de 216 (sítio de ligado a N na ligado a N na ligado a N na ligado a N na ligado a N na ligado a N na posição 503); ou SEQ ID NO: 217 (N-ligada sítio de glicosilação na posição 157), em que o antígeno PreF é especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui um F de RSV conformação específica pré-fusão (tal como sítio antigênico 0).

[00339] Métodos para preparar polipeptídeos glicosilados são descritos aqui e são familiares para aqueles versados na técnica. Por exemplo, tais métodos são descritos na Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No 2007/0224211, Patente dos Estados Unidos No 7.029.872; 7.834.159, 7.807.405, Wang e Lomino, ACS Chem. Biol., 7: 110-122, 2011 e Nettleship et al., Methods Mol. Biol, 498: 245-263, 2009, cada um dos quais é aqui incorporado por referência. Em algumas modalidades, os antígenos PreF glicosiladas são produzidas por expressão da proteína F de RSV recombinante em células de mamífero, tais como células HEK293 ou derivados destes, tais como células GnTI (ATCC N° CRL-3022). Em algumas modalidades, os antígenos de proteína F de RSV são produzidos por expressão dos antígenos de proteína F de RSV em células de mamíferos, tais como células HEK293 ou seus derivados, com Swainsonina adicionados ao meio de modo a inibir a determinados aspectos da maquinaria de glicosilação, por exemplo, a promover a produção de glicanas híbridas.

[00340] Em várias modalidades, o polipeptídeo F1 inclui dois ou mais dos sítios de glicosilação N-ligada listados na Tabela 8.

v. Modificações de estabilização exemplificativas

[00341] Os versados na técnica apreciarão que o antígeno PreF pode incluir uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão por combinações de um ou mais dos estabilizantes substituições de aminoácidos descritos aqui, tais como uma combinação de substituições de aminoácidos que introduzem uma ou mais ligações de dissulfureto, encher cavidades no interior da proteína F de RSV, alterar o empacotamento de resíduos na proteína F de RSV, introduzir sítios de glicosilação N-ligados. Por exemplo, em várias modalidades, a proteína F de RSV recombinante inclui substituições de aminoácidos que introduzem uma ligação de dissulfureto e que preenchem cavidades dentro da proteína F de RSV.

[00342] Em algumas modalidades, uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão inclui uma ligação de dissulfureto entre um par de cisteínas nas posições 155 e 290 e uma substituição de aminoácido na posição de preenchimento de cavidade 190; ou uma ligação de dissulfureto entre um par de cisteínas nas posições 155 e 290, uma substituição de aminoácido na posição preenchimento de cavidade 190 e uma substituição de aminoácido na posição de preenchimento da cavidade 207. Por exemplo, o preenchimento de cavidade substituição na posição 190 e/ou na posição 207 pode ser uma grande substituição de um aminoácido aromático ou hidrófobo (por exemplo, tirosina, leucina, fenilalanina, histidina, triptofano ou).

[00343] Em algumas modalidades, o polipeptídeo F1 da proteína F de RSV recombinante inclui S155C, S290C e S190F substituições de aminoácidos. Em algumas modalidades, o polipeptídeo F1 da proteína F de RSV recombinante inclui S155C, S290C e S 190W substituições de aminoácidos. Em algumas modalidades, o polipeptídeo F1 da proteína F de RSV recombinante inclui S 155C, S290C e substituições de aminoácidos S190L.

[00344] Em algumas modalidades, o polipeptídeo F1 da proteína F de RSV recombinante inclui S155C, S290C, S190F, V207L e substituições de aminoácidos. Em algumas modalidades, o polipeptídeo F1 da proteína F de RSV recombinante inclui S155C, S290C, S190W, V207L e substituições de aminoácidos. Em algumas modalidades, o polipeptídeo F1 da proteína F de RSV recombinante inclui S155C, S290C, S190L, V207L e substituições de aminoácidos. Em algumas modalidades, o polipeptídeo F1 da proteína F de RSV recombinante inclui S155C, S290C, S190F e V207F substituições de aminoácidos. Em algumas modalidades, o polipeptídeo F1 da proteína F de RSV recombinante inclui S155C, S290C, S190W e V207F substituições de aminoácidos. Em algumas modalidades, o polipeptídeo F1 da proteína F de RSV recombinante inclui S155C, S290C, S190L e V207F substituições de aminoácidos. Em algumas modalidades, o polipeptídeo F1 da proteína F de RSV recombinante inclui S155C, S290C, S190F e substituições de aminoácidos V207W. Em algumas modalidades, o polipeptídeo F1 da proteína F de RSV recombinante inclui S155C, S290C, S190W e substituições de aminoácidos V207W. Em algumas modalidades, o polipeptídeo F1 da proteína F de RSV recombinante inclui S 155C, S290C, S190L e substituições de aminoácidos V207W.

[00345] Em várias modalidades, a proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão inclui um polipeptídeo F1 e um polipeptídeo F2 de um RSV humano Um subtipo, um subtipo de RSV B humana ou um RSV bovino, em que o polipeptídeo F1 inclui uma das combinações acima de substituições de estabilização.

[00346] Em algumas modalidades, a proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão inclui um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo incluindo F1 posições 26-109 e 137513, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-184 ou 370 e mais inclui S155C, S290C e S190F substituições de aminoácidos. Em algumas modalidades, a proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão inclui um F2polypeptide e um polipeptídeo incluindo F1 posições 26-109 e 137-513, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-184 ou 370 e inclui adicionalmente S155C, S290C e S190W substituições de aminoácidos. Em algumas modalidades, a proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão inclui um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo incluindo F1 posições 26-109 e 137-513, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-184 ou 370 e mais inclui S155C, S290C e S190L substituições de aminoácidos. Em algumas modalidades, a proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré- fusão inclui um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo incluindo F1 posições 26-109 e 137-513, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-184 ou 370 e mais inclui S155C, S290C e S190H substituições de aminoácidos. Em algumas modalidades, a proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão inclui um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo incluindo F1 posições 26-109 e 137513, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-184 ou 370 e mais inclui S155C, S290C e S190M substituições de aminoácidos. Em algumas modalidades, a proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão inclui um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo incluindo F1 posições 26-109 e 137-513, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-184 ou 370 e mais inclui S155C, S290C e S190Y substituições de aminoácidos.

[00347] Em algumas modalidades, a proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão inclui um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo incluindo F1 posições 26-109 e 137513, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-184 ou 370 e mais inclui S 155C, S290C, S190F e substituições de aminoácidos V207L. Em algumas modalidades, a proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão inclui um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo incluindo F1 posições 26-109 e 137-513, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-184 ou 370 e mais inclui S155C, S290C, S190W, V207L e substituições de aminoácidos. Em algumas modalidades, a proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão inclui um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo incluindo F1 posições 26-109 e 137513, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-184 ou 370 e mais inclui S155C, S290C, S190L, V207L e substituições de aminoácidos. Em algumas modalidades, a proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão inclui um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo incluindo F1 posições 26-109 e 137513, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-184 ou 370 e mais inclui S155C, S290C, S190H, V207L e substituições de aminoácidos. Em algumas modalidades, a proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão inclui um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo incluindo F1 posições 26-109 e 137513, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-184 ou 370 e mais inclui S155C, S290C, S190M, V207L e substituições de aminoácidos. Em algumas modalidades, a proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão inclui um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo incluindo F1 posições 26-109 e 137- 513, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-184 ou 370 e mais inclui S155C, S290C, S190Y, V207L e substituições de aminoácidos.

[00348] Em algumas modalidades, a proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão inclui um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo incluindo F1 posições 26-109 e 137513, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-184 ou 370 e mais inclui S155C, S290C, S190F e V207F substituições de aminoácidos. Em algumas modalidades, a proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão inclui um F2polypeptide e um polipeptídeo incluindo F1 posições 26-109 e 137513, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-184 ou 370 e inclui adicionalmente S155C, S290C, S190W e V207F substituições de aminoácidos. Em algumas modalidades, a proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão inclui um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo incluindo F1 posições 26-109 e 137513, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-184 ou 370 e mais inclui S155C, S290C, S190L e V207F substituições de aminoácidos. Em algumas modalidades, a proteína F de RSV recombinante estabilizado em um pré-conformação de fusão inclui um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo incluindo F1 posições 26-109 e 137513, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-184 ou 370 e inclui ainda S155C, S290C, S190H e V207F substituições de aminoácidos. Em algumas modalidades, a proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão inclui um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo incluindo F1 posições 26-109 e 137513, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-184 ou 370 e mais inclui S155C, S290C, S190M e V207F substituições de aminoácidos. Em algumas modalidades, a proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão inclui um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo incluindo F1 posições 26-109 e 137513, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-184 ou 370 e mais inclui S155C, S290C, S190Y e V207F substituições de aminoácidos.

[00349] Em algumas modalidades, a proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão inclui um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo incluindo F1 posições 26-109 e 137513, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-184 ou 370 e mais inclui S155C, S290C, S190F e substituições de aminoácidos V207W. Em algumas modalidades, a proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão inclui um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo incluindo F1 posições 26-109 e 137-513, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-184 ou 370 e mais inclui S155C, S290C, S190W e substituições de aminoácidos V207W. Em algumas modalidades, a proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão inclui um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo incluindo F1 posições 26-109 e 137-513, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-184 ou 370 e mais inclui S155C, S290C, S190L e substituições de aminoácidos V207W. Em algumas modalidades, a proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão inclui um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo incluindo F1 posições 26-109 e 137-513, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-184 ou 370 e mais inclui S155C, S290C, S190H e substituições de aminoácidos V207W. Em algumas modalidades, a proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão inclui um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo incluindo F1 posições 26-109 e 137-513, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-184 ou 370 e mais inclui S155C, S290C, S190M e substituições de aminoácidos V207W. Em algumas modalidades, a proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão inclui um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo incluindo F1 posições 26-109 e 137-513, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-184 ou 370 e mais inclui S155C, S290C, S190Y e substituições de aminoácidos V207W.

[00350] Em algumas modalidades, a proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão inclui um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo incluindo F1 posições 26-109 e 137513, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-184 ou 370 e mais inclui S155C, S290C, S190F, V207L e substituições de aminoácidos F488W. Em algumas modalidades, a proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão inclui um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo incluindo F1 posições 26-109 e 137513, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-184 ou 370 e mais inclui S155C, S290C, S190F e substituições de aminoácidos F488W.

[00351] Em algumas modalidades, a proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão inclui um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo incluindo F1 posições 26-109 e 137513, respectivamente, da SEQ ID NO: 371 (RSV A com S155C, S290C e S190F substituições V207L), SEQ ID NO: 372 (RSV B com S155C, S290C, S190F e substituições V207L), SEQ ID NO: RSV 373 (bovina com S155C, S290C, S190F e substituições V207L), SEQ ID NO: 374 (RSV A com S155C, S290C e substituições S190F), SEQ ID NO: 375 (RSV B com S155C, S290C e substituições S190F); ou SEQ ID NO: 376 (RSV bovino com substituições S155C, S290C e S190F).

[00352] Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína recombinante RSV F estabilizado em uma conformação pré- fusão que inclui as substituições de aminoácidos listados em uma das linhas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 ou 54 da coluna 3 do Quadro 8b. A proteína F de RSV estabilizado pode ser ligado especificamente por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré- fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0). Tabela 8b: Exemplos de substituições da proteína F de RSV recombinante e sequências com e sem um domínio Foldon clivável de trombina C-terminal Tabela 8b – continuação Tabela 8b – continuação Tabela 8b – continuação Tabela 8b – continuação Tabela 8b – continuação Tabela 8b – continuação Tabela 8b – continuação

[00353] As SEQ ID NOs listadas na Tabela 8b estabelecido sequências de aminoácidos incluindo as substituições indicadas, um peptídeo de sinal, F2 polipeptídeo (26-109 posições), um polipeptídeo pep27 (posições 110-136), um polipeptídeo F1 (posições 137-513) e um sítio de clivagem de trombina (LVPRGS (posições 547-552 da SEQ ID NO: 185)) e marcadores de purificação (marcador His (HHHHHH (posições 553-558 da SEQ ID NO: 185)) e II (Strep Tag (SAWSHPQFEK posições 559-568 da SEQ ID NO: 185))) ou um sítio de clivagem da trombina (LVPRGS (posições 547-552 da SEQ ID NO: 185)), um domínio de trimerização (um domínio Foldon) e as marcadores de purificação (marcador His (HHHHHH (posições 553-558 da SEQ ID NO: 185)) e Strep Tag II (SAWSHPQFEK (posições 559-568 da SEQ ID NO: 185))). Assim, em algumas modalidades, o antígeno inclui uma proteína PreF F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F1 (por exemplo, aprox. Posiciona 137-513) e F2 um polipeptídeo (por exemplo, aprox. Posiciona 26-109), como estabelecido na SEQ ID NÃO de uma das linhas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 59, 50, 51, 52, 53, 54 ou da coluna 4 (sem domínio Foldon) ou coluna 5 (com domínio Foldon clivável) da Tabela 8b.

[00354] Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína recombinante RSV F estabilizado em uma conformação pré- fusão que inclui as substituições de aminoácidos listados em uma das linhas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13, de coluna 3 do quadro 8c. A proteína F de RSV estabilizado pode ser ligado especificamente por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0).

[00355] As SEQ ID NOs listadas na Tabela 8c apresentam sequências de aminoácidos incluindo as substituições indicadas, um peptídeo de sinal, F2 polipeptídeo (26-109 posições), um polipeptídeo pep27 (posições 110-136), um polipeptídeo F1 (posições 137-513), um sítio de clivagem da trombina (LVPRGS (posições 547-552 da SEQ ID NO: 185)) e os marcadores de purificação (marcador His (HHHHHH (posições 553-558 da SEQ ID NO: 185)) e Strep Tag II (SAWSHPQFEK ( posições 559-568 da SEQ ID NO: 185))). Assim, em modalidades adicionais, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F1 (por exemplo, aprox. Posiciona 137-513) e F2 um polipeptídeo (por exemplo, aprox. Posiciona 26-109), como estabelecido na SEQ ID NÃO de uma das linhas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou da coluna 4 da Tabela 8c. Tabela 8c: Exemplos de substituições e sequências de proteína F de RSV recombinantes

b. Modificações de estabilização de membrana proximal

[00356] Em várias modalidades, o antígeno PreF inclui uma forma ancorada membrana da proteína F de RSV recombinante (por exemplo, com um domínio transmembrana). Em outras modalidades, o antígeno PreF inclui uma forma solúvel da proteína F de RSV recombinante (por exemplo, sem um domínio transmembrana ou outra âncora na membrana). Deve entender-se que existem várias abordagens diferentes para a geração de uma proteína recombinante solúvel ou F de RSV membrana ancorada, incluindo os discutidos abaixo. Os exemplos incluem a introdução de um domínio de trimerização, a introdução de pares de cisteína que podem formar uma ligação de dissulfureto que estabiliza a região C-terminal de F1 e introdução de um domínio transmembrana (por exemplo, para aplicações que incluem um antígeno PreF ancorado à membrana).

[00357] Além disso, conforme descrito aqui, a estrutura da proteína F de RSV, em complexo com D25 Fab (isto é, em uma conformação pré-fusão) em comparação com a estrutura do pós-fusão proteína F de RSV (descrito, por exemplo, em McLellan et al., J. Virol., 85, 7788, 2011, com coordenadas depositados como PDB Accession No. 3RRR) mostram rearranjos estruturais entre conformações pré e pós-fusão em ambos os lobos da membrana proximal e distal à membrana. Várias modalidades incluem uma modificação dirigida para a estabilização da membrana do lobo proximal da proteína F de RSV pré-fusão conformação. Deve entender-se que estas modificações não são estritamente necessárias para estabilizar uma proteína F de RSV recombinante em uma conformação pré-fusão, mas que, em alguns casos, eles são combinados com outras modificações pré-fusão estabilização, tais como os descritos acima.

i. Domínio de Trimerização

[00358] Em várias modalidades, o antígeno PreF é ligado a um domínio de trimerização, por exemplo, o antígeno PreF pode incluir uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F1 com um domínio de trimerização ligado ao seu C-terminal. Em algumas modalidades, o domínio de trimerização promove a trimerização dos três monómeros F1/F2 na proteína F de RSV recombinante. Vários domínios de multimerização exógenos promovem trímeros estáveis de proteínas recombinantes solúveis: o fecho de leucinas GCN4 (Harbury et al 1993 Science 262:. 1401-1407), o motivo de trimerização da proteína tensoativo pulmonar (Hoppe et al., 5 de fevereiro de 1994, Lett 344: 191-195), colágeno (McAlinden et al., 2003 Biol Chem 278: 42200-42207) e o fago T4 fibritina Foldon (Miroshnikov et al. 1998 Protein Eng. 11: 329-414), qualquer um dos quais pode ser ligada ao polipeptídeo F1 do antígeno PreF para promover a trimerização da proteína F recombinante, enquanto o antígeno PreF é especificamente ligado por um anticorpo específico para (por exemplo, pré-fusão, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0).

[00359] Em alguns exemplos, o antígeno PreF pode ser ligado a um domínio de fecho de leucinas GCN4, por exemplo, o antígeno PreF pode incluir uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F1 com um domínio de fecho de leucinas GCN4 ligado ao seu C- terminal. Em exemplos específicos, leucina GCN4 domínio de fecho são fornecidas na série CSGJ de construções descritas aqui.

[00360] Em alguns exemplos, o antígeno PreF pode ser ligado a um domínio Foldon, por exemplo, o antígeno PreF pode incluir uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F1 com um domínio Foldon ligado ao seu C-terminal. Em exemplos específicos, o domínio Foldon é um domínio de T4 fibritina Foldon, tal como a sequência de aminoácidos GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTF (SEQ ID NO: 351), que adota uma conformação e-hélice e pode dobrar e trimerizam de forma autónoma (Tao et al 1997 Estrutura. 5: 789-798).

[00361] Em alguns exemplos específicos, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante ligada a um domínio Foldon de fibritina T4, inclui um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo F1 ligado a um domínio Foldon como definido em uma das SEQ ID NOs: 185, 189-303 ou 371376. Tipicamente, o motivo multimerização heteróloga está posicionada C-terminal ao domínio F1. Opcionalmente, o domínio de multimerização está ligado ao polipeptídeo F1 através de um ligante, tal como um ligante de aminoácidos, tal como a sequência de GG. O ligante também pode ser um ligante mais longo (por exemplo, incluindo a sequência GG, tal como a sequência de aminoácidos: GGSGGSGGS; SEQ ID NO: 352). Numerosos ligantes conformacionalmente neutros são conhecidos na técnica que podem ser usados neste contexto, sem perturbar a conformação do antígeno PreF. Algumas modalidades incluem um sítio de clivagem de protease para a remoção do domínio Foldon do polipeptídeo F1, tais como, mas não limitado a, um sítio de trombina entre o polipeptídeo F1 e o domínio Foldon.

[00362] Em algumas modalidades, o antígeno inclui uma proteína PreF F de RSV recombinante incluindo qualquer uma das modificações do domínio de trimerização listados acima combinada com qualquer uma das modificações indicadas na seção de II.B. Por exemplo, em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo qualquer uma das modificações do domínio de trimerização listadas acima em combinação com um ou mais de a modificação de ligações de dissulfureto listados em uma das filas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 ou 51 da Tabela 5 e/ou uma ou mais das modificações de preenchimento cavidade listados em uma das linhas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 da Tabela 6 e/ou uma ou mais das modificações reacondicionamento listados em uma das linhas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 ou 47 da Tabela 7 e/ou uma ou mais das modificações de glicosilação listados em um ou linhas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 do Quadro 8, em que o antígeno PreF é especificamente ligadas por um anticorpo específico pré-fusão {por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0).

[00363] Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo qualquer uma das modificações do domínio de trimerização listados acima ligado a um polipeptídeo F1 incluindo uma ligação de dissulfureto entre um par de cisteínas nas posições 155 e 290 e uma substituição de aminoácidos de preenchimento de cavidade na posição 190; ou uma ligação de dissulfureto entre um par de cisteínas nas posições 155 e 290, uma substituição de aminoácido na posição de preenchimento da cavidade 190 e uma substituição de aminoácido na posição de preenchimento de cavidade 207.

[00364] Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo qualquer uma das modificações do domínio de trimerização listados acima ligado a um polipeptídeo F1 incluindo S155C, S290C e S190F substituições de aminoácidos, S155C, S290C e S190W substituições de aminoácidos ou substituições de aminoácidos S155C, S290C e S190L. Em outras modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo qualquer uma das modificações do domínio de trimerização listados acima ligado a um polipeptídeo F1 incluindo S155C, S290C, S190F e V207L substituições de aminoácidos, S155C, S290C, S190W e aminoácidos V207L substituições, S155C, S290C, S190L e V207L substituições de aminoácidos, S155C, S290C, S190F e V207F substituições de aminoácidos, S155C, S290C, S190W e V207F substituições de aminoácidos, S 155C, S290C, S190L e V207F substituições de aminoácidos, S155C, S290C, S190F e V207W substituições de aminoácidos, S155C, S290C, S190W e substituições de aminoácidos V207W ou S155C, S290C, S190L e V207W substituições de aminoácidos.

[00365] Por exemplo, em algumas modalidades, o antígeno inclui uma proteína PreF F de RSV recombinante estabilizada em uma proteína F de RSV pré-fusão conformação, em que o polipeptídeo e o polipeptídeo F2 F1 ligado ao domínio Foldon incluem a sequência de aminoácidos apresentada como posições 26-109 e 137-544, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO : 209, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 268, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 270, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 272, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 274, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 278, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 280, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 282, SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO : 302, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 276, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 285 ou SEQ ID NO: 263; ou posições 26-109 e 137-545, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 262, SEQ ID NO: 296, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 298 ou SEQ ID NO: 299, em que o antígeno PreF é especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui um F de RSV conformação específica pré- fusão (como sítio antigênico 0).

[00366] Em algumas modalidades, o antígeno inclui uma proteína PreF F de RSV recombinante estabilizada em uma proteína F de RSV pré-fusão conformação, em que o polipeptídeo e o polipeptídeo F2 F1 ligado ao domínio Foldon incluem a sequência de aminoácidos apresentada como posições 26-109 e 137- 544, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID NO: 371 (RSV A com S155C, S290C e substituições V207L S190F), SEQ ID NO: 372 (RSV B com substituições S155C, S290C e S190F e V207L), SEQ ID NO: RSV 373 (bovina com S155C, S290C, S190F e substituições V207L), SEQ ID NO: 374 (RSV A com S155C, substituições S290C e S190F), SEQ ID NO: 375 (RSV B com S155C, S290C e substituições) S190F; ou SEQ ID NO: 376 (RSV bovino com S155C, S290C e substituições S190F), em que o antígeno PreF é especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui um F de RSV pré- fusão específica conformação (tal como sítio antigênico 0).

[00367] Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F1 e um polipeptídeo F2 de um RSV humano Um subtipo, um subtipo de RSV B humana ou um RSV bovino, em que o polipeptídeo F1 está ligado a qualquer um dos trimerização modificações do domínio listados acima e o polipeptídeo F1 inclui ainda qualquer uma das modificações de estabilização descritos aqui (por exemplo, uma das combinações acima de substituições de estabilização, tal como S155C, S290C e substituições S190F ou S155C, S290C, S190F e substituições V207L).

[00368] Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante estabilizada por um F de RSV pré- fusão proteína conformação e inclui uma ou mais cavidades de preenchimento de substituição de aminoácidos e um domínio Foldon, em que o polipeptídeo F2 e o polipeptídeo F1 ligada à Foldon domínio incluem a sequência de aminoácidos apresentada como posições 26109 e 137-544, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 195 ou SEQ ID NO: 194; em que o antígeno PreF é especificamente ligado por um anticorpo específico pré- fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0).

[00369] Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante estabilizada por um F de RSV pré- fusão proteína conformação e inclui uma ou mais reacondicionamento substituições de aminoácidos e um domínio Foldon, em que o polipeptídeo F2 e o polipeptídeo F1 ligado ao domínio Foldon incluir a sequência de aminoácidos apresentada como posições 26-109 e 137544, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 292, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 296, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 330, SEQ ID NO: 331, SEQ ID NO: 332, SEQ ID NO: 333, SEQ ID NO: 334, SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 336 ou SEQ ID NO : 337; em que o antígeno PreF é especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0).

[00370] Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante estabilizada por um F de RSV pré- fusão proteína conformação e inclui um ou mais sítios de glicosilação ligados a N e um domínio Foldon, em que o polipeptídeo F2 e o polipeptídeo F1 ligado ao domínio Foldon incluem a sequência de aminoácidos apresentada como posições 26-109 e 137-544, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID NOs selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216 ou SEQ ID NO: 217 ; em que o antígeno PreF é especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0).

[00371] Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo as substituições de aminoácidos listados em uma das linhas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 da coluna 3 da Tabela 5b, em que o polipeptídeo F1 da proteína F de RSV recombinante está ligado a um domínio Foldon. Algumas modalidades incluem um sítio de clivagem da protease para a remoção do domínio do polipeptídeo Foldon FI, por exemplo, um sítio de clivagem de trombina.

[00372] Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína recombinante F de RSV é estabilizada por um F de RSV pré- fusão proteína conformação, incluindo um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo F1 ligado a um domínio Foldon, em que o polipeptídeo F2 e o polipeptídeo F1 ligado ao domínio Foldon incluir a sequência de aminoácidos apresentada como posições 26-109 e 137-544, respectivamente, de uma das SEQ ID NOs listados em uma fileira de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 da coluna 4 da Tabela 5b,. Em várias modalidades, o polipeptídeo F1 ligado ao domínio Foldon inclui adicionalmente um sítio de clivagem de protease, tais como, mas não limitado a, um sítio de trombina, entre o polipeptídeo e o domínio FI Foldon.

[00373] Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo as substituições de aminoácidos listados em uma das linhas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 ou 84 da coluna 3 da Tabela 6b, em que o FI polipeptídeo da proteína F de RSV recombinante está ligado a um domínio Foldon.

[00374] Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína recombinante F de RSV é estabilizada por um F de RSV pré- fusão proteína conformação, incluindo um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo F1 ligado a um domínio Foldon, em que o polipeptídeo F2 e o polipeptídeo F1 ligado ao domínio Foldon incluir a sequência de aminoácidos apresentada como posições 26-109 e 137-544, respectivamente, de uma das SEQ ID NOs listados em uma fileira de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 ou 84 de coluna 4 da Tabela 6B.

[00375] Em outras modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante estabilizada por um F de RSV pré-fusão proteína conformação, em que a proteína F de RSV recombinante inclui as substituições de aminoácidos listados em uma das linhas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 59, 50, 51, 52, 53 ou 54 da coluna 3 do Tabela 8b, em que o polipeptídeo da proteína Fl RS VF recombinante está ligado a um domínio Foldon. Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína recombinante F de RSV é estabilizada por um F de RSV pré- fusão proteína conformação, incluindo um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo F1 ligado a um domínio Foldon, em que o polipeptídeo F2 e o polipeptídeo F1 ligado ao domínio Foldon incluir a sequência de aminoácidos apresentada como posições 26-109 e 137-544, respectivamente, de uma das SEQ ID NOs listados em uma fileira de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 ou 54 de coluna 5 do quadro 8b. Estas sequências incluem um sítio de clivagem da trombina entre o polipeptídeo F1 e o domínio Foldon.

[00376] Em outras modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante estabilizada por um F de RSV pré-fusão proteína conformação, em que a proteína F de RSV recombinante inclui as substituições de aminoácidos indicados na linha 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 da coluna 3 da Tabela 8c, em que o polipeptídeo F1 da proteína F de RSV recombinante está ligado a um domínio Foldon. Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína recombinante F de RSV é estabilizada por um F de RSV pré-fusão proteína conformação, incluindo um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo F1 ligado a um domínio Foldon, em que o polipeptídeo F2 e o polipeptídeo F1 ligado ao domínio Foldon incluir a sequência de aminoácidos apresentada como posições 26-109 e 137-544, respectivamente, da SEQ ID NO listados na linha 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 da coluna 4 da Tabela 8c.

[00377] Domínios Foldon modificados podem também ser usados, tal como um domínio Foldon incluindo uma sequência de aminoácidos apresentada como GYIPE APRDGQC Y VRCDGEWVLLS TF (SEQ ID NO: 694), GYIPECPRDGQAYVCKDGEWVLLSTF (SEQ ID NO: 695), GYIPEAPRDGQCYCRKDGEWVLLSTF (SEQ ID NO: 696 ) ou GYIPEAPRDGQACVRKDGECVLLSTF (SEQ ID NO: 697). Estes domínios Foldon modificados incluem substituições de aminoácidos que dão dois resíduos de cisteína para a formação de ligações de dissulfureto de estabilização. Exemplos de sequências de proteína F de RSV, incluindo as substituições de aminoácidos DSCav1 ligados aos domínios Foldon modificados incluem aqueles apresentados como SEQ ID NO: 651, SEQ ID NO: 652, SEQ ID NO: 653 e SEQ ID NO: 654. Em algumas modalidades, qualquer uma das proteínas F de RSV recombinantes descritos podem ser ligados a um domínio Foldon modificado como descrito aqui.

ii. Ligações de Dissulfureto

[00378] Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F1 incluindo uma ou mais ligações de dissulfureto que são usados para estabilizar a membrana do lobo proximal da proteína F de RSV recombinante. Os resíduos de cisteína que formam a ligação de dissulfureto pode ser introduzido na proteína F de RSV recombinante com um ou mais substituições de aminoácidos.

[00379] A localização da cisteína (ou cisteínas) de uma ligação de dissulfureto para estabilizar a membrana do lobo proximal da proteína F de RSV em uma conformação pré-fusão pode ser prontamente determinado aqueles versados na técnica, usando métodos descritos aqui e familiar para aqueles versados na técnica. Em algumas modalidades, um anel de ligações de dissulfureto é introduzido no terminal-C do polipeptídeo F1 por substituição de resíduos de cisteína para os aminoácidos da hélice α10. Os três hélices α10 do ectodomínio F de RSV para um enrolamento de bobina que estabilizou a porção proximal da membrana da proteína. Quando expresso em células, de ligações de dissulfureto interprotômero formam entre as cisteínas introduzidas na hélice, desse modo "bloqueio" os três hélices do em estreita proximidade e impedir o movimento do domínio proximal da membrana a partir da conformação pós-fusão. A hélice α10 da proteína F de RSV inclui os resíduos 492 para o domínio transmembrana (resíduos 529).

[00380] Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo uma ligação de dissulfureto entre os resíduos cisteína localizados na F de RSV as posições 486 e 487 ou entre os resíduos de cisteína localizados no F de RSV as posições 512 e 513, em que o antígeno PreF está especificamente ligada por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0). Em algumas de tais modalidades, o polipeptídeo inclui F1 D486C E487C e substituições e L513C L512C substituições ou D486C, E487C, L512C e substituições L513C respectivamente.

[00381] Em algumas modalidades, os aminoácidos podem ser inseridos (ou suprimido) a partir da sequência de proteína M para ajustar o alinhamento dos resíduos na estrutura da proteína F, de tal modo que pares de resíduos particulares estão a uma distância suficientemente próxima para formar uma ligação de dissulfureto. Em algumas de tais modalidades, o antígeno inclui uma proteína PreF F de RSV recombinante que inclui uma ponte de dissulfureto entre resíduos de cisteína localizados no 486 e 487; com uma inserção de prolina entre as posições 486 e 487, em que o antígeno PreF é especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0). Em algumas de tais modalidades, o polipeptídeo inclui F1 D486C E487C e substituições e uma inserção de prolina entre as posições 486 e 487.

[00382] Em modalidades adicionais, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo uma ligação de dissulfureto entre um resíduo de cisteína localizado na posição 493 e um resíduo de cisteína inserido entre as posições 329 e 330, em que o antígeno PreF é especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão ( por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0). Em algumas de tais modalidades, o polipeptídeo inclui F1 substituição S493C e um resíduo de cisteína inserido entre as posições 329 e 330.

[00383] Em modalidades adicionais, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo uma ligação de dissulfureto entre um resíduo de cisteína localizado na posição 493 e um resíduo de cisteína inserido entre as posições 329 e 330 e inclui ainda uma inserção de glicina entre os resíduos 492 e 493, em que o antígeno PreF é ligado especificamente por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0). Em algumas de tais modalidades, o polipeptídeo inclui F1 substituição S493C, um resíduo de cisteína inserido entre as posições 329 e 330 e uma inserção de glicina entre os resíduos 492 e 493

[00384] Em modalidades adicionais, a proteína F de RSV recombinante inclui substituições de cisteína na hélice α10 nas posições 525 e 526, 512 e 513 e/ou 519 e 520, que podem formar interprotômero ligações de dissulfureto para estabilizar a região C-terminal do polipeptídeo F1. Por exemplo, em algumas modalidades, a proteína F de RSV recombinante inclui qualquer dos "motivos" listados na Tabela 23. Em modalidades adicionais, a proteína F de RSV recombinante inclui uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% (tal como pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica) à sequência de aminoácidos apresentada como qualquer uma de SEQ ID NOs: 8291025 orl456-1468, opcionalmente sem purificação, incluindo as marcas ou domínios de trimerização incluídos nestas sequências.

[00385] Em algumas modalidades, a proteína F de RSV recombinante se estende do C-terminal a partir da posição 512, a sequência de aminoácidos descrita como um dos CCHNVNAGKSTTN (resíduos 512-524 de SEQ ID NO: 844) ou CCHNVNACCSTTN (resíduos X-Y de SEQ ID NO: 849); ou CCHNVNACCSTTNICCTT (resíduos 512-529 de SEQ ID NO: 853).

[00386] Em algumas modalidades, o antígeno inclui uma proteína PreF F de RSV recombinante incluindo qualquer das modificações acima ligação de dissulfureto para a estabilização da membrana do lobo proximal da proteína F de RSV, combinadas com qualquer uma das modificações de estabilização indicados na seção II.BI. Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo qualquer uma das modificações de ligações de dissulfureto para a estabilização da membrana do lobo proximal da proteína F de RSV listadas acima em combinação com as substituições de ligação de dissulfureto listados em uma das linhas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 ou 51 da Tabela 5 ou a linha 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 da Tabela 5b ou as substituições de preenchimento cavidade listados em uma das linha 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 do Tabela 6 ou uma das linha 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 ou 84 da coluna 3 do tabela 6b ou as substituições reacondicionamento listados em uma das linhas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 ou 47 de Tabela 7 ou as modificações de glicosilação indicados em uma das linhas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 da Tabela 8 ou as substituições indicadas na linha 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 59, 50, 51, 52, 53 ou 54 de coluna 3 de 8b Tabela ou as substituições indicadas na linha 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 da coluna 3 da Tabela 8c, em que o antígeno PreF é especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0).

[00387] Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo qualquer uma das modificações de ligações de dissulfureto para a estabilização da membrana do lobo proximal da proteína F de RSV listado acima e inclui ainda um polipeptídeo F1 incluindo uma ligação de dissulfureto entre um par de cisteínas nas posições 155 e 290 e uma cavidade de preenchimento de substituição de aminoácidos na posição 190; ou uma ligação de dissulfureto entre um par de cisteínas nas posições 155 e 290, uma substituição de aminoácido na posição de preenchimento da cavidade 190 e uma substituição de aminoácido na posição de preenchimento de cavidade 207.

[00388] Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo qualquer uma das modificações de ligações de dissulfureto para a estabilização da membrana do lobo proximal da proteína F de RSV listado acima e inclui ainda um polipeptídeo F1 incluindo S155C, S290C e S190F substituições de aminoácidos, S155C, S290C e S190W substituições de aminoácidos ou S155C, S290C e S190L substituições de aminoácidos. Em outras modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo qualquer uma das modificações de ligações de dissulfureto para a estabilização da membrana do lobo proximal da proteína F de RSV listado acima e inclui ainda uma polipeptídeo F1 incluindo S155C, S290C, S190F e aminoácidos V207L substituições, S155C, S290C, S190W e V207L substituições de aminoácidos, S155C, S290C, S190L e V207L substituições de aminoácidos, S 155C, S290C, S190F e V207F substituições de aminoácidos, S155C, S290C, S190W e V207F substituições de aminoácidos, S155C, S290C, S 190L e V207F substituições de aminoácidos, S155C, S290C, S190F e V207W substituições de aminoácidos, S155C, S290C, S190W e V207W substituições de aminoácidos ou S155C, S290C, S 190L e substituições de aminoácidos V207W.

[00389] Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo F1 incluindo a sequência de aminoácidos apresentada como posições 26-109 e 137-513, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID NO: 371 ( RSV A com S155C, S290C, S190F e substituições V207L), SEQ ID NO: 372 (RSV B com S155C, S290C, S190F e substituições V207L), SEQ ID NO: RSV 373 (bovina com S155C, S290C, S190F e V207L substituições), SEQ ID NO: 374 (RSV A com S155C, S290C e substituições S190F), SEQ ID NO: 375 (RSV B com substituições S155C, S290C e S190F); ou SEQ ID NO: 376 (RSV bovino com S155C, substituições S290C e S190F), em que a proteína recombinante F de RSV inclui ainda qualquer uma das modificações de ligações de dissulfureto para a estabilização da membrana do lobo proximal da proteína F de RSV listados acima, em que o antígeno PreF é ligado especificamente por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0).

[00390] Em várias modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F1 e um polipeptídeo F2 de um RSV humano Um subtipo, um subtipo de RSV B humana ou um RSV bovino, em que a proteína recombinante F de RSV inclui ainda qualquer um dos modificações de ligações de dissulfureto para a estabilização da membrana do lobo proximal da proteína F de RSV listados acima e em que o polipeptídeo F1 inclui ainda qualquer da modificações de estabilização descritas aqui (por exemplo, uma das combinações acima de substituições de estabilização, tal como S155C, S290C e substituições S190F, S155C ou, S290C, S190F e substituições V207L).

iii. Domínios Transmembrana

[00391] Em algumas modalidades, a proteína F de RSV recombinante inclui um domínio transmembrana ligada ao polipeptídeo F1, por exemplo, para uma aplicação, incluindo uma membrana ancorada antígeno PreF). Por exemplo, a presença das sequências transmembrana é útil para a expressão como uma proteína transmembrana para a preparação de vesículas de membrana. O domínio transmembrana podem ser ligados a uma proteína F1 contendo qualquer uma das mutações aqui proporcionados estabilizadores, por exemplo, os descritos acima, tal como uma proteína F1 com uma substituição de cisteína S155C/S290C. Além disso, o domínio transmembrana pode ser ainda ligada a uma cauda citosólica RSV F1. Exemplos, incluindo um peptídeo de sinal, F2 polipeptídeo (26-109) posições, polipeptídeo pep27 (posições 110-136), F1 polipeptídeo (posições 137-513), um domínio transmembrana de RSV são fornecidas como SEQ ID NO: 323 (sem um domínio citosólico) e SEQ ID NO: 324 (com um domínio citosólico).

[00392] Em algumas modalidades, o antígeno inclui uma proteína PreF F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F1 ligado a um domínio transmembrana, combinadas com qualquer uma das modificações de estabilização indicados na secção ll.B.la. Por exemplo, em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F1 ligado a um domínio transmembrana e inclui ainda as substituições de ligação de dissulfureto listados em uma das linhas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 ou 51 da Tabela 5 ou linha 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 da Tabela 5b ou o preenchimento da cavidade substituições listadas em uma das linhas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 da Tabela 6 ou uma das linhas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 ou 84 da coluna 3 da Tabela 6b ou as substituições de reacondicionamento listados em uma das linhas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 ou 47 da Tabela 7 ou as modificações de glicosilação listados em uma das linhas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 da Tabela 8 ou as substituições indicadas na linha 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 59, 50, 51, 52, 53 ou 54 da coluna 3 do Tabela 8b ou as substituições listadas na linha 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 da coluna 3 da Tabela 8c, em que o antígeno PreF é especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0).

[00393] Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F1 ligado a um domínio transmembrana, em que o polipeptídeo F1 inclui ainda uma ponte de dissulfureto entre um par de cisteínas nas posições 155 e 290 e de um ácido amino-preenchimento de cavidade substituição na posição 190; ou uma ligação de dissulfureto entre um par de cisteínas nas posições 155 e 290, uma substituição de aminoácido na posição de preenchimento da cavidade 190 e uma substituição de aminoácido na posição de preenchimento de cavidade 207.

[00394] Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F1 ligado a um domínio transmembrana, em que o polipeptídeo F1 inclui ainda S155C, S290C e S190F substituições de aminoácidos, S155C, S290C e S190W substituições de aminoácidos ou S155C, S290C e S190L substituições de aminoácidos. Em outras modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F1 ligado a um domínio transmembrana, em que o polipeptídeo F1 inclui ainda S155C, S290C, S190F e V207L substituições de aminoácidos, S155C, S290C, S190W e V207L amino substituições de ácidos, S155C, S290C, S190L, V207L e substituições de aminoácidos, S155C, S290C, S190F e V207F substituições de aminoácidos, S155C, S290C, S190W e V207F substituições de aminoácidos, S155C, S290C, S190L e V207F substituições de aminoácidos, S155C, S290C, S190F e V207W substituições de aminoácidos, S155C, S290C, S190W e V207W substituições de aminoácidos ou S155C, S290C, S190L e V207W substituições de aminoácidos.

[00395] Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo F1 ligado a um domínio transmembrana, em que o polipeptídeo F2 e o polipeptídeo F1 ligado ao domínio transmembrana incluem a sequência de aminoácidos apresentada como posições 26 - 109 e 137-513, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID NO: 371 (RSV A com S155C, S290C e substituições V207L S190F), SEQ ID NO: 372 (RSV B com S155C, S290C e S190F V207L substituições), SEQ ID NO: 373 (RSV bovino com S 155C, S290C, S190F e substituições V207L), SEQ ID NO: 374 (RSV A com S155C, S290C e substituições S190F), SEQ ID NO: 375 (RSV B com S155C, S290C e S 190f substituições); ou SEQ ID NO: 376 (RSV bovino com S155C, S290C e substituições S190F), em que o antígeno PreF é especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui um F de RSV específica pré-fusão conformação (tal como sítio antigênico 0).

[00396] Em várias modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F1 e um polipeptídeo F2 de um RSV humano Um subtipo, um subtipo de RSV B humana ou um RSV bovino, em que o polipeptídeo F1 está ligado a qualquer um dos transmembrana domínios listados acima e o polipeptídeo F1 inclui ainda qualquer uma das modificações de estabilização descritos aqui (por exemplo, uma das combinações acima de substituições de estabilização, tal como S155C, S290C e substituições S190F ou S155C, S290C, S190F e substituições V207L).

iv. Substituições de preenchimento de cavidade

[00397] Em algumas modalidades, o antígeno inclui uma proteína PreF F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F1 incluindo uma ou mais substituições de preenchimento de cavidade, que são usados para estabilizar a membrana do lobo proximal da proteína F de RSV recombinante. Em algumas modalidades, o antígeno inclui uma proteína PreF F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo com V207L Fl e L512F; L513F; L512F e L513F; L512Y e L513Y; L512F e L513Y; L512W e L513W; L5132W e L513Y; S509W; S509F; S509W e L512F; ou S509W, L512F e substituições L513F, em que o antígeno PreF é especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0). Exemplos de sequências com tais substituições incluem SEQ ID NOS: 672-682.

c. Sítios antigênicos

[00398] Em algumas modalidades, o antígeno inclui uma proteína PreF F de RSV recombinante que é estabilizado em uma conformação pré-fusão e inclui modificação adicional para eliminar um conhecido sítio antigênico diferente do sítio antigênico 0. Por exemplo, a proteína F de RSV recombinante pode incluir uma modificação que perturba sítio antigênico I, II ou IV. Tais modificações podem ser identificados, por exemplo, por ligação de anticorpos específicos para estes sítios.

[00399] Em algumas modalidades, os antígenos são desde que incluem uma proteína F de RSV recombinante que inclui a modificação para eliminar sítio 0. Tais antígenos antigênicas são úteis, por exemplo, como reagentes de controle.

[00400] Modificações exemplificativas para remover o sítio antigênico 0 e/ou sítio antigênico II são listadas na Tabela 8c1. Tabela 8c1: Exemplos de substituições e sequências da proteína F de RSV recombinante

[00401] d. Proteínas F de RSV com uma única cadeia

[00402] Em algumas modalidades, a proteína F de RSV recombinante é uma proteína F de RSV de cadeia simples, que inclui uma única cadeia de polipeptídeo, incluindo o polipeptídeo RSV F1 e F2 de RSV do polipeptídeo. A cadeia única descrito RSV F proteínas não incluem os sítios de clivagem de furina flanqueando o polipeptídeo pep27 de proteína RSV F; Portanto, quando produzidas em células, o polipeptídeo F é não clivada em FI e F2 polipeptídeos separados. Em várias modalidades, as porções restantes do F1 e F2 polipeptídeos são unidas por um ligante, tal como um ligante peptídico.

[00403] Em várias modalidades, uma única cadeia de polipeptídeo incluindo a F2, pep27 e sequências F1 é produzido. A cadeia única RSV F proteínas pode incluir a sequência pep27 ou esta sequência pode ser excluído. Além disso, em exemplos em que a sequência pep27 é eliminada, um ligante (tais como um ligante peptídico), opcionalmente, pode ser colocado entre os polipeptídeos F1 e F2 na cadeia única proteína F de RSV recombinante. Em algumas modalidades, uma única cadeia de proteína F de RSV inclui eliminação de F de RSV as posições 98-149 ou 106-149, que remove os dois sítios de clivagem de furina, o polipeptídeo pep27 e o peptídeo de fusão. Em algumas modalidades, uma única cadeia de proteína F de RSV inclui eliminação de F de RSV as posições 98-136, 98-144, 98-149, 106-136, 104-144, 106-144 ou.

[00404] Em várias modalidades, as mutações de estabilização descritas aqui (por exemplo, nas seções (BIa) a (BIc) acima pode ser incluído na cadeia única proteína F de RSV. Por exemplo, em algumas modalidades, a cadeia simples de proteína F de RSV incluem S155C S290C e substituições; S155C, S290C e substituições S190F ou S155C, S290C, S190F e substituições V207L. Em algumas modalidades, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante no formato de cadeia simples é estabilizada por um conformação pré-fusão que inclui as substituições de aminoácidos listados em uma das linhas 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 da coluna 3 Tabela de 8d. A proteína F de RSV estabilizado pode ser ligado especificamente por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0).

[00405] Exemplos de sequências são listados na Tabela 8d. As SEQ ID NOs listadas na Tabela 8d estabelecido sequências de aminoácidos incluindo as substituições indicadas, um peptídeo de sinal, F2 polipeptídeo (26-109 posições), um polipeptídeo pep27 (posições 110136), um polipeptídeo F1 (posições 137-513) e um sítio de clivagem de trombina (LVPRGS (posições 547-552 da SEQ ID NO: 185)) e marcadores de purificação (marcador His (HHHHHH (posições 553-558 da SEQ ID NO: 185)) e Strep Tag II (SAWSHPQFEK (posições 559-568 da SEQ ID NO : 185))) ou um sítio de clivagem de trombina (LVPRGS (posições 547-552 da SEQ ID NO: 185)), um domínio de trimerização (um domínio Foldon) e marcadores de purificação (marcador His (HHHHHH (posições 553-558 de SEQ ID NO: 185)) e Strep Tag II (SAWSHPQFEK (posições 559-568 da SEQ ID NO: 185))). Assim, em modalidades adicionais, o antígeno PreF inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F1 (por exemplo, aprox. Posiciona 137-513) e F2 um polipeptídeo (por exemplo, aprox. Posiciona 26-109), como estabelecido na SEQ ID NO listado no de uma das linhas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 da coluna 4 (sem domínio Foldon) ou coluna 5 (com clivável Foldon domínio) do Tabela 8d. Cadeia simples exemplificativa mutações F de RSV e sequências de proteína adicionais são descritos aqui, por exemplo, como descrito na Tabela 8e (por exemplo, linhas 34-43) e na Tabela 18. Tabela 8d. Proteínas F de RSV recombinante com uma única cadeia

[00406] As sequências de proteínas F de RSV com uma única cadeia adicionais que são estabilizadas em uma confirmação pré-fusão são fornecidos na Tabela 19, incluindo cadeia simples Proteínas F de RSV com domínios Foldon não cliváveis, domínios Foldon cliváveis e ligada à proteína de subunidades de nanopartículas.

2. Imunógenos com sítio 0 mínimo

[00407] O sítio 0 epitopo de F de RSV está localizado no vértice da ponta de trímero e inclui a região reconhecida pelos anticorpos neutralizantes três D25, AM22 e 5C4. Mais especificamente, como delineado pela estrutura cristalina do complexo/D25 F de RSV, este epitopo compreende a superfície exterior da hélice (resíduos 196-209 OC4) e o loop adjacente (resíduos 63-68) e entre β2 ai. Aqui proporcionados são imunógenos que incluem estes aspectos mínimos de a proteína F de RSV e que são úteis, por exemplo, para induzir a uma resposta imune para RSV e também para a ligação específica de anticorpos de proteína F de RSV, por exemplo, como sondas para identificar ou detectar tais anticorpos.

[00408] Portanto, em algumas modalidades, a proteína F de RSV recombinante inclui a região mínima necessária para estimular uma resposta imune para RSV. Em algumas modalidades, a proteína F de RSV inclui ou consiste de uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica a uma sequência apresentada na Tabela 20. Em modalidades adicionais, a proteína F de RSV recombinante compreende permutação circular do sítio antigênico 0, tal como apresentado na Tabela 20, tal como tal como estabelecido em SEQ ID NOs: 1027-1052.

[00409] A região do epitopo mínimo pode ser ligada a uma proteína de arcabouço para estabilizar o epitopo em uma conformação antigênica. Por exemplo, qualquer sítio de 0 antígeno mínima aqui listados podem ser ligados a um 2KNO, 2A90, 2W59, 3U2E, 2VJ1, 1CHD, 1PQZ ou uma proteína de arcabouço 2MOE. Estes são os identificadores de referência para sequências específicas localizado na base de dados PDB e são aqui incorporados por referência, como presente na base de dados em 11 de Março, 2014. Os exemplos de imunógeno com sítio 0 mínimo ligado a antígeno a uma proteína de arcabouço são aqui fornecidos na Tabela 20.

[00410] Qualquer antígeno com sítio 0 do mínimo pode ser ligado a uma nanopartícula subunidade de proteína, por exemplo uma subunidade ferritina ou uma subunidade de lumazina sintase, para gerar uma nanopartículas de proteína. Exemplos PARTICULARES mínima do sítio de 0 antígenos ligados a uma subunidade de nanopartículas de proteína são aqui fornecidos na Tabela 21.

[00411] Em várias modalidades, o antígeno inclui uma proteína PreF epitopo de arcabouço incluindo um epitopo específico da proteína F de RSV pré-fusão em uma conformação específica pré-fusão. Em alguns exemplos, a proteína de epitopo-arcabouço inclui qualquer uma das proteínas recombinantes F de RSV estabilizados em uma conformação pré-fusão como descrito aqui. O epitopo específico pré-fusão pode ser colocado em qualquer sítio na proteína de arcabouço (por exemplo, no N-terminal, C-terminal ou um loop interno), enquanto o antígeno PreF incluindo a proteína de epitopo-arcabouço é especificamente ligado por um anticorpo específico (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0).

[00412] Os métodos para a identificação e seleção de arcabouços são descrito aqui e conhecido daqueles versados na técnica. Por exemplo, em métodos de sobreposição e enxertia de novo desenho de epitopo de arcabouços são descritos na Publicação do Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 2010/0068217, aqui incorporada por referência na íntegra.

[00413] "Superposição" epitopo de arcabouços são com bases em proteínas de arcabouço com um segmento exposto com conformação similar à do alvo aos átomos estruturais neste "superposição-região" pode ser estruturalmente sobreposta sobre o epitopo alvo com raiz mínimo desvio médio quadrado (RMSD) das suas coordenadas. Arcabouços adequados são identificados por computacionalmente procura através de uma biblioteca de estruturas de cristal da proteína; epitopo de arcabouços são concebidos por colocar os resíduos de epitopo na região de sobreposição e fazer mutações adicionais na superfície circundante do arcabouço para evitar choque ou outras interações com o anticorpo.

[00414] "Alongamento" epitopo de arcabouços utilizar proteínas de arcabouço que pode acomodar a substituição de um segmento com o exposto cristalizado conformação do epitopo alvo. Para cada arcabouço adequado identificado por computacionalmente pesquisar através de todas as estruturas de cristal da proteína, um segmento exposto passa a ter o epitopo alvo e as cadeias laterais vizinhas são redesenhados (mutado) para acomodar e estabilizar o epitopo inserido. F1nalmente, como com sobreposição epitopo de arcabouços, as mutações são feitas na superfície do arcabouço e fora do epitopo, para evitar choque ou outras interações com o anticorpo. Arcabouços de enxerto requer que o segmento substituído e epitopo inserido tem de translação e rotação transformações similares entre o seu N- e C-terminal e que o esqueleto peptídico circundante não colidir com o epitopo inserido. Uma diferença entre o enxerto e superposição é que o enxerto tenta imitar a conformação epitopo exatamente, enquanto superposição permite pequenos desvios estruturais.

[00415] "De novo" epitopo de arcabouços são computacionalmente projetado a partir do zero para apresentar de forma otimizada a conformação cristalizado do epitopo. Este método baseia-se na concepção computacional de uma nova dobra (Kuhlman, B. et al 2003 Ciência 302:. 1364-1368). O de novo permite concepção de imunógenos que são mínimas em tamanho, para que eles não apresentam epitopos indesejados e também altamente estáveis contra a desnaturação térmica ou química.

[00416] O arcabouço pode ser uma estrutura de suporte heteróloga. Em várias modalidades, a proteína nativa de arcabouço (sem inserção epitopo) não é uma proteína de envelope virai. Em modalidades adicionais, a proteína de arcabouço não é uma proteína de RSV. Em ainda outras modalidades, a proteína de arcabouço não é uma proteína virai.

[00417] Em modalidades adicionais, a proteína de epitopo- arcabouço inclui a sequência de aminoácidos apresentada como qualquer uma de SEQ ID NOs: 341-343 ou um polipeptídeo com pelo menos 80% de identidade de sequência (tal como pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência) com qualquer uma das ID SEQ NOs: 341-343 e em que a proteína de epitopo-arcabouço é especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0). Em modalidades adicionais, a proteína F de RSV é qualquer uma de SEQ ID NOs: 341-343, em que a sequência de aminoácidos da proteína F de RSV tem até 20 substituições de aminoácidos e em que a proteína de epitopo-arcabouço é especificamente ligado por um pré-fusão anticorpo específico (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0), na ausência de ligação pelo anticorpo específico do pré-fusão correspondente (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22). Alternativamente, o polipeptídeo pode ter nenhuma ou até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, ácido 18 ou 19 aminoácidos substituições.

[00418] A proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão pode ser colocado em qualquer lugar no arcabouço, enquanto a proteína de epitopo-arcabouço resultante é especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui um F de RSV conformação específica pré-fusão (tal como sítio antigênico 0), na ausência de ligação pelo anticorpo específico do pré-fusão correspondente (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22). Os métodos para determinar se uma determinada proteína de epitopo-arcabouço é especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) são descritos aqui e conhecidos do vulgar perito na técnica (vide, por exemplo, o Pedido Internacional Pub. Nos. WO 2006/091455 e WO 2005/111621). Além disso, a formação de um complexo anticorpo- antígeno pode ser ensaiada usando um número de testes de diagnóstico bem definidos incluindo formatos de imunoensaios convencionais para detectar e/ou quantificar anticorpos específicos para o antígeno. Tais ensaios incluem, por exemplo, imunoensaios enzimáticos, por exemplo, ELISA, ensaios com base em células, citometria de fluxo, radioimunoensaios e coloração imuno-histoquímica. Numerosos ensaios de ligação de proteínas competitiva e não competitiva são conhecidos na técnica e muitos estão disponíveis comercialmente. Os métodos para determinar se uma determinada proteína de epitopo-arcabouço inclui uma conformação específica pré- fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0), na ausência de ligação pelo anticorpo específico do pré-fusão correspondente (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) também são descritos aqui e ainda conhecido por aqueles versados na técnica.

3. Partículas similares a vírus

[00419] Em algumas modalidades, uma partícula similar a vírus (VLP) que é fornecida inclui uma proteína F de RSV recombinante descrito estabilizado em uma conformação pré-fusão. VLP carecem dos componentes virais que são necessários para a replicação do vírus e, assim, representam uma forma altamente atenuada de um vírus. As VLPs podem exibir um polipeptídeo (por exemplo, uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão) que é capaz de induzir a uma resposta imune para RSV quando administrado a um indivíduo. Vírus como partículas e métodos para a sua produção são conhecidos e familiares para aqueles versados na técnica e as proteínas virais de vários vírus são conhecidos para formar partículas VLP, incluindo o vírus do papiloma humano, VIH (Kang et al., Biol. Chem 380: 353-64 (1999)), vírus Forest Semliki (Notka et al., Biol. Chem 380: 341-52 (1999)), vírus de polioma humano (Goldmann et al., J. Virol 73: 4465-9 (1999 )), rotavírus (Jiang et al., Vaccine 17: 1005-1013 (1999)), parvovírus (Casal, Biotechnology e Applied Biochemistry, Vol 29, Parte 2, páginas 141-150 (1999)), parvovírus canino (Hurtado et al., J. Virol 70: 5422-9 (1996)), vírus da hepatite E (Li et al., J. Virol. 71: 7207-13 (1997)) e vírus da doença de Newcastle. Por exemplo, uma VLP quimérica contendo um antígeno de RSV e pode ser uma VLP com base em vírus da doença de Newcastle. VLPs com bases doença de Newcastle foram anteriormente mostrado para induzir a uma resposta imune neutralizante para RSV em camundongos. A formação de tais VLP pode ser detectada por qualquer técnica adequada. Como exemplos de técnicas adequadas conhecidas na técnica para a detecção de partículas VLP em um meio incluem, por exemplo,, Técnicas de microscopia eletrônica, dispersão de luz dinâmica (DLS), separação cromatográfica seletiva (por exemplo, permuta iônica, interação hidrofóbica e/ou separação cromatográfica por exclusão de tamanho da VLP) e centrifugação em gradiente de densidade.

[00420] Em algumas modalidades, a partícula similar a vírus inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo F1 (tal como um polipeptídeo F1 ligado a um domínio transmembrana), em que o polipeptídeo F1 inclui uma ligação de dissulfureto entre um par de cisteínas nas posições 155 e 290 e uma substituição de aminoácido na posição de preenchimento de cavidade 190; ou uma ligação de dissulfureto entre um par de cisteínas nas posições 155 e 290, uma substituição de aminoácido na posição de preenchimento da cavidade 190 e uma substituição de aminoácido na posição de preenchimento de cavidade 207.

[00421] Em algumas modalidades, a partícula similar a vírus inclui uma proteína recombinante F de RSV que inclui um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo F1 (tal como um polipeptídeo F1 ligado a um domínio transmembrana), em que o polipeptídeo includesS155C FL, S290C e S190F substituições de aminoácidos, S155C, S290C e S190W substituições de aminoácidos ou S155C, S290C e S190L substituições de aminoácidos. Em outras modalidades, a partícula similar a vírus inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo F1 (tal como um polipeptídeo F1 ligado a um domínio transmembrana), em que o polipeptídeo F1 inclui S155C, S290C, S190F e aminoácidos V207L substituições, S155C, S290C, S 190W e V207L substituições de aminoácidos, S155C, S290C, S190L e V207L substituições de aminoácidos, S155C, S290C, S190F e V207F substituições de aminoácidos, S 155C, S290C, S190W e aminoácidos V207F substituições, S155C, S290C, S190L e V207F substituições de aminoácidos, S155C, S290C, S190F e V207W substituições de aminoácidos, S155C, S290C, S 190W e V207W substituições de aminoácidos ou S155C, S290C, S190L e aminoácidos V207W substituições.

[00422] Em algumas modalidades, a partícula similar a vírus inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo F1 (tal como um polipeptídeo F1 ligado a um domínio transmembrana), em que o polipeptídeo F2 e o polipeptídeo F1 incluem a sequência de aminoácidos apresentada Dado que as posições 26-109 e 137-513, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID NO: 371 (RSV A com S155C, S290C e substituições V207L S190F), SEQ ID NO: 372 (RSV B com S155C, S290C e S190F substituições V207L), SEQ ID NO: RSV 373 (bovina com S155C, S290C, S190F e substituições V207L), SEQ ID NO: 374 (RSV A com S155C, substituições S290C e S190F), SEQ ID NO: 375 (RSV B com S155C, S290C e substituições) S190F; ou SEQ ID NO: 376 (RSV bovino com substituições S155C, S290C e S190F).

[00423] Em várias modalidades, a partícula similar a vírus inclui uma proteína recombinante F de RSV que inclui um polipeptídeo F1 (tal como um polipeptídeo F1 ligado a um domínio transmembrana) e um polipeptídeo F2 de um RSV humano Um subtipo, um subtipo de RSV B humana ou um bovino RSV, em que o polipeptídeo F1 inclui qualquer uma das modificações de estabilização descritos aqui (por exemplo, uma das combinações acima de substituições de estabilização, tal como S155C, S290C e substituições S190F, S155C ou, S290C, S190F e substituições V207L).

4. Nanopartículas de Proteína

[00424] Em algumas modalidades uma nanopartícula de proteína é fornecida que inclui um ou mais de qualquer dos a proteína F de RSV recombinante descrito estabilizado em uma conformação pré-fusão, em que a nanopartícula proteína é especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0). Exemplo não limitativo de nanopartículas incluem nanopartículas ferritina, um nanopartículas encapsulina e enxofre oxigenase redutase (SOR) nanopartículas, que são constituídos por um conjunto de subunidades monoméricas, incluindo proteínas de ferritina, proteínas e proteínas encapsulina SOR, respectivamente. Para construir nanopartículas de proteínas incluindo a proteína F de RSV recombinante descrito estabilizado em uma conformação pré-fusão, o antígeno é ligado a uma subunidade da nanopartículas de proteína (tal como uma proteína ferritina, uma proteína ou uma proteína encapsulina SOR). A proteína de fusão monta para uma nanopartícula sob condições apropriadas.

[00425] Nanopartículas de ferritina e a sua utilização para fins de imunização (por exemplo, para a imunização contra os antígenos da gripe) foi descrito na técnica (vide, por exemplo, Kanekiyo et al., Nature, 499: 102-106, 2013, aqui incorporada por referência na íntegra).

[00426] Em algumas modalidades, qualquer dos F de RSV as proteínas recombinantes descritas estabilizados em uma conformação pré-fusão estão ligados a um polipeptídeo ferritina ou híbrido de diferentes polipeptídeos ferritina para a construto de uma nanopartícula proteína ferritina, em que a nanopartícula ferritina é especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão ( por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0). A ferritina é uma proteína globular, que é encontrado em todos os animais, bactérias e plantas e que atua em primeiro lugar para controlar a velocidade e localização do polinuclear de Fe(III) 203 formação através do transporte de íons de ferro hidratados e protões para e a partir de um núcleo mineralizado. A forma globular de ferritina é composta de subunidades monoméricas, que são polipeptídeos possuindo um peso molecular de aproximadamente 17-20 kDa. Um exemplo da sequência de um tal subunidade monomérica é representada por SEQ ID NO: 353. Cada subunidade monomérica tem a topologia de um conjunto de hélice, que inclui um motivo de quatro hélices antiparalelas, com um quinto hélice mais curto (hélice C-terminal) que encontra- aproximadamente perpendicular ao longo eixo do feixe de 4 hélices. De acordo com a convenção, as hélices estão marcados A, B, C, D e E do terminal N, respectivamente. A sequência N-terminal, adjacente ao eixo da cápside de três vezes e se estende para a superfície, enquanto as hélices no eixo quatro vezes com a extremidade C-terminal que se prolonga para dentro do núcleo da cápside. A consequência desta embalagem cria dois poros na superfície da cápside. Espera-se que um ou ambos destes poros representar o ponto em que o ferro hidratado e difunde-se para fora da cápside. Após a produção, estas proteínas de subunidades monoméricas montagem em proteína ferritina globular. Assim, a forma globular de ferritina compreende 24 monomérico, proteínas de subunidade e tem uma estrutura de cápside-432 como ter simetria. Métodos de construto de nanopartículas de ferritina são conhecidos por aqueles versados na técnica e são aqui adicionalmente descritos (vide, por exemplo, Zhang, J. Mol Int., 12: 5406-5421, 2011, que é aqui incorporado por referência na íntegra).

[00427] Em exemplos específicos, o polipeptídeo ferritina é a E. coli, ferritina, ferritina de Helicobacter pylori, ferritina de cadeia leve humano, ferritina de rã gigante ou um híbrido das mesmas, tal como ferritina híbrida I'-humana, rã gigante ferritina híbrido ou homem-rã-touro ferritina híbrido. Exemplos de sequências de aminoácidos de polipeptídeos de ferritina e sequências de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos de ferritina para utilização nos antígenos de proteína F de RSV descritos estabilizados em uma conformação pré-fusão pode ser encontrado no GenBank®, por exemplo os números de acesso no ZP_03085328, ZP_06990637, EJB64322.1, AAA35832, NP_000137 AAA49532, AAA49525, AAA49524 e AAA49523, que são especificamente incorporadas por referência na íntegra, como disponível 28 de Fevereiro de 2013. Em uma modalidade, qualquer das proteínas F de RSV recombinantes descritos estabilizados em uma conformação pré-fusão está ligada a uma proteína ferritina incluindo uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% (tal como pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 97%) idêntico à sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 353. Um exemplo específico de as proteínas F de RSV recombinantes descritos estabilizados em uma conformação pré-fusão ligada a uma proteína ferritina incluem a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 350.

[00428] Em algumas modalidades, o polipeptídeo da ferritina é uma ferritina de Helicobacter pylori (tal como um polipeptídeo ferritina apresentada como SEQ ID NO: 353) e inclui uma substituição do resíduo de cisteína na posição 31, tais como um C31S, C31 A ou C31V substituição. Qualquer um dos F de RSV as proteínas recombinantes descritas (por exemplo, um polipeptídeo F de RSV com S155C, S290C e substituições S190F ou com S155C, S290C, S190F e substituições V207L) pode ser ligado a uma ferritina de Helicobacter pylori (tal como um conjunto polipeptídeo ferritina apresentada como SEQ ID NO: 353), que inclui ainda uma substituição do resíduo de cisteína na posição 31 do polipeptídeo ferritina, tal como um C31S, C31A ou C31V substituição.

[00429] Em algumas modalidades, a nanopartícula da proteína ferritina inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo F1, em que o polipeptídeo F1 está ligada à proteína ferritina e em que o polipeptídeo F1 inclui uma ligação de dissulfureto entre um par de cisteínas nas posições 155 e 290 e uma cavidade de preenchimento de substituição de aminoácidos na posição 190; ou uma ligação de dissulfureto entre um par de cisteínas nas posições 155 e 290, uma substituição de aminoácido na posição de preenchimento da cavidade 190 e uma substituição de aminoácido na posição de preenchimento de cavidade 207.

[00430] Em algumas modalidades, a nanopartícula da proteína ferritina inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo F1, em que o polipeptídeo F1 está ligada à proteína ferritina e em que o polipeptídeo F1 inclui S155C, S290C e S190F substituições de aminoácidos, S155C, S290C e S190W substituições de aminoácidos ou S155C, S290C e S190L substituições de aminoácidos. Em outras modalidades, a nanopartícula da proteína ferritina inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo F1, em que o polipeptídeo F1 está ligada à proteína ferritina e em que o polipeptídeo F1 inclui S155C, S290C, S190F e aminoácidos V207L substituições, S155C, S290C, S190W e V207L substituições de aminoácidos, S155C, S290C, S190L e V207L substituições de aminoácidos, S155C, S290C, S190F e V207F substituições de aminoácidos, S155C, S290C, S190W e V207F substituições de aminoácidos, S155C, S290C, S190L e V207F substituições de aminoácidos, S155C, S290C, S190F e V207W substituições de aminoácidos, S155C, S290C, S190W e V207W substituições de aminoácidos ou S155C, S290C, S190L e V207W substituições de aminoácidos.

[00431] A proteína F de RSV incluída na nanopartícula de ferritina pode ser um humano subtipo A, subtipo B humana ou bovina proteína F de RSV incluem as substituições descritos aqui para a estabilização pré-fusão.

[00432] Em algumas modalidades, a nanopartícula da proteína ferritina inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo F1, em que o polipeptídeo F1 está ligada à proteína ferritina e em que o polipeptídeo F2 e o polipeptídeo F1 incluem a sequência de aminoácidos apresentada Dado que as posições 26-109 e 137-513, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID NO: 371 (RSV A com S155C, S290C e substituições V207L S190F), SEQ ID NO: 372 (RSV B com S155C, S290C e S190F substituições V207L), SEQ ID NO: RSV 373 (bovina com S155C, S290C, S190F e substituições V207L), SEQ ID NO: 374 (RSV A com S155C, substituições S290C e S190F), SEQ ID NO: 375 (RSV B com S155C, S290C e substituições) S190F; ou SEQ ID NO: 376 (RSV bovino com substituições S155C, S290C e S190F). Em uma modalidade não limitativa, a

[00433] Em diversas modalidades, a nanopartícula da proteína ferritina inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F1 e um polipeptídeo F2 de um RSV humano Um subtipo, um subtipo de RSV B humana ou um RSV bovino, em que o polipeptídeo F1 inclui qualquer uma das modificações de estabilização descritas aqui (por exemplo, uma das combinações acima de substituições de estabilização, tal como S 155C, S290C e substituições S190F, S155C ou substituições, S290C, S190F e V207L).

[00434] Em algumas modalidades, a nanopartícula de proteína ferritina inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo F1, em que o polipeptídeo F1 está ligada à proteína ferritina e em que o polipeptídeo F2 e o polipeptídeo F1 ligada à proteína ferritina incluem o aminoácido sequência apresentada como posições 26-109 e 137-679, respectivamente, da SEQ ID NO: 377 (RSV Um incluindo S155C, S290C, S190F, V207L substituições de aminoácidos, com C-terminal domínio ferritina) ou SEQ ID NOs: 378- 382.

[00435] Em algumas modalidades da nanopartícula ferritina inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo F1, em que o polipeptídeo F1 está ligada a ferritina e em que o polipeptídeo F2 e o polipeptídeo F1 ligado a ferritina incluir as substituições de aminoácidos listados na fileira 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 ou 49 de coluna 3 da Tabela 8e. Em algumas modalidades da nanopartícula ferritina inclui uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo F1, em que o polipeptídeo F1 está ligada à proteína ferritina e em que o polipeptídeo F2 e o polipeptídeo F1 ligada à proteína ferritina incluem o aminoácido sequência dos polipeptídeos F1 e F2 definido na SEQ ID NO listados na linha 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 ou 49 da coluna 4 da tabela 8e. Será apreciado que a SEQ ID NOs. 602-617 e 620-634 e 645-650 listados na Tabela 8e incluem sequência de sinal e sequências de polipeptídeos pep27, que são removidos por processamento proteolítico quando a proteína F correspondente é feita em células eucariotas, bem como os marcadores de proteína C-terminal. Tabela 8e: Exemplos de mutações da proteína F de RSV e sequências para a produção de nanopartículas de ferritina Tabela 8e: -continuação Tabela 8e: -continuação Tabela 8e: -continuação

[00436] Em modalidades adicionais, qualquer um dos antígenos da proteína F de RSV descritos estabilizados em uma conformação pré- fusão estão ligados a um polipeptídeo encapsulina para construir uma nanopartícula encapsulina, em que a nanopartícula encapsulina é especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0). Encapsulina proteínas são uma família conservada de proteínas bacterianas, também conhecidas como proteínas do tipo linocina que formam grandes conjuntos de proteínas que funcionam como um compartimento mínima para empacotar enzimas. O conjunto encapsulina é composta de subunidades monoméricas, que são polipeptídeos possuindo um peso molecular de aproximadamente 30 kDa. Um exemplo da sequência de uma tal subunidade monomérica são fornecidas como SEQ ID NO: 354. Após a produção, a subunidades monoméricas em conjunto o encapsulina globular incluindo 60 subunidades monoméricas. Métodos de construto de nanopartículas encapsulina são conhecidos do vulgar perito na técnica e mais adiante (vide descrito, por exemplo, Sutter et al., Nature Struct and Mol Biol., 15: 939-947, 2008, que é aqui incorporada por referência na íntegra). Em exemplos específicos, o polipeptídeo é encapsulina bacteriana, tal como encapsulina de E. coli ou encapsulina de Thermotoga maritima. Uma sequência encapsulina exemplificativa para uso com os antígenos de proteína F de RSV descritos estabilizados em uma conformação pré- fusão é apresentada como SEQ ID NO: 354.

[00437] Em modalidades adicionais, qualquer uma das proteínas F de RSV recombinante descritos estabilizados em uma conformação pré- fusão estão ligados a um oxigenase redutase de enxofre (SOR) para a construto de um polipeptídeo de nanopartículas SOR, em que a nanopartícula SOR é especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0). SOR proteínas são proteínas microbianas (por exemplo a partir do que formam conjuntos de 24 subunidades de proteína. Os métodos de construto de SOR nanopartículas são conhecidos do vulgar perito na técnica (vide, por exemplo, Urich et al., Science, 311: 9961000, 2006, que é aqui incorporada por referência na íntegra). Exemplos específicos do F de RSV recombinante descrito proteínas estabilizadas em uma conformação pré-fusão ligada a uma proteína SOR incluem as sequências de aminoácidos definidas por SEQ ID NO: 344 e SEQ ID NO: 345.

[00438] Em modalidades adicionais, qualquer uma das proteínas recombinantes F de RSV descritos estabilizados em uma conformação pré-fusão estão ligados a um polipeptídeo de sintase de lumazina para construir uma nanopartícula lumazina sintase, em que a sintase de nanopartículas lumazina está especificamente ligada por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0). Os exemplos específicos de Proteínas F de RSV recombinantes descritos estabilizados em uma conformação pré-fusão ligada a uma proteína sintase lumazina incluem as sequências de aminoácidos definidas por SEQ ID NOs: 346-348.

[00439] Em modalidades adicionais, qualquer um dos F de RSV as proteínas recombinantes descritas estabilizados em uma conformação pré-fusão estão ligados a um polipeptídeo piruvato desidrogenase para construir uma nanopartícula de piruvato-desidrogenase, em que a nanopartícula piruvato desidrogenase é especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma conformação específica pré-fusão F de RSV (tal como sítio antigênico 0). Um exemplo específico de F de RSV as proteínas recombinantes descritas estabilizados em uma conformação pré-fusão ligada a uma proteína de piruvato desidrogenase incluem a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 349.

[00440] Em alguns exemplos, qualquer uma das proteínas recombinantes F de RSV descritos estabilizados em uma conformação pré-fusão está ligado ao N ou C-terminal de uma ferritina, encapsulina, SOR, sintase lumazina ou proteína desidrogenase de piruvato, por exemplo, com um ligante, tal como um ligante Ser-Gly. Quando as construções têm sido feitas em células HEK 293 Freestyle, as proteínas de fusão são secretadas a partir das células e automontagem em nanopartículas. As nanopartículas podem ser purificadas usando técnicas conhecidas, por exemplo, por alguns processos de cromatografia, por exemplo, diferentes Mono Q (permuta aniônica) seguido por cromatografia de exclusão de tamanho (Superose® 6).

[00441] Várias modalidades incluem uma subunidade monomérica de uma proteína ferritina, encapsulina, SOR, sintase lumazina ou piruvato desidrogenase ou qualquer porção do mesmo que é capaz de dirigir a automontagem de subunidades monoméricas em forma globular da proteína. As sequências de aminoácidos a partir de subunidades monoméricas de qualquer ferritina conhecido, encapsulina, SOR, sintase lumazina ou proteína desidrogenase de piruvato pode ser usada para produzir proteínas com as proteínas F de RSV recombinantes descritos estabilizados em uma conformação pré- fusão, contanto que a subunidade monomérica é capaz de automontagem em uma nanopartícula visualizadas as proteínas F de RSV recombinante estabilizadas em uma conformação pré-fusão na sua superfície.

[00442] As proteínas de fusão não precisam compreender a sequência de comprimento completo de um polipeptídeo da subunidade monomérica de uma proteína ferritina, encapsulina, SOR, sintase lumazina ou piruvato desidrogenase. Porções ou regiões do polipeptídeo, subunidade monomérica pode ser usado, desde que a porção compreende sequências de aminoácidos que dirigem a automontagem de subunidades monoméricas em forma globular da proteína.

[00443] Em algumas modalidades, pode ser útil para a engenharia mutações na sequência de aminoácidos da ferritina monomérica, encapsulina, SOR, sintase lumazina ou piruvato desidrogenase subunidades. Por exemplo, pode ser útil para alterar sítios, tais como sítios de reconhecimento da enzima ou sítios de glicosilação, de modo a dar as propriedades benéficas da proteína de fusão (por exemplo, meia-vida).

[00444] Será entendido por aqueles versados na técnica que a fusão de qualquer das F de RSV as proteínas recombinantes descritas estabilizados em uma conformação pré-fusão para a ferritina, encapsulina, SOR, sintase lumazina ou proteína desidrogenase de piruvato deve ser feito de tal modo que o descrito recombinante Proteínas F de RSV estabilizadas em uma porção pré-fusão conformação da proteína de fusão não interfira com a automontagem das ferritina, encapsulina, SOR, sintase lumazina ou piruvato desidrogenase subunidades monoméricas para a proteína globular e que a ferritina, encapsulina, SOR, lumazina sintase ou piruvato desidrogenase porção de proteína da proteína de fusão não interfere com a capacidade do antígeno de proteína F de RSV recombinante descrito estabilizado em uma conformação pré-fusão para induzir a uma resposta imune para RSV. Em algumas modalidades, a ferritina, encapsulina, SOR, sintase lumazina ou piruvato desidrogenase proteína e proteína F de RSV descrito recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão podem ser unidas diretamente, sem afetar a atividade de qualquer porção. Em outras modalidades, a ferritina, encapsulina, SOR, sintase lumazina ou proteína desidrogenase de piruvato e a proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão são unidas usando um ligante (também dito como um espaçador) de sequência. A sequência ligante foi concebida para posicionar a porção de desidrogenase ferritina, encapsulina, SOR, sintase lumazina ou piruvato da proteína de fusão e da proteína F de RSV recombinante descrito estabilizado em uma porção pré-fusão conformação da proteína de fusão, no que respeita um ao outro, tal que a proteína de fusão mantém a capacidade de montar em nanopartículas e também provocar uma resposta imune para RSV. Em várias modalidades, as sequências de ligantes compreendem os aminoácidos. Aminoácidos preferível usar são aqueles que têm cadeias laterais pequenas e/ou aqueles que não são cobrados. Tais aminoácidos são menos propensos a interferir com a dobragem correta e a atividade da proteína de fusão. Portanto, os ácidos aminados preferidos para usar em sequências ligantes, quer isoladamente ou em combinação são serina, glicina e alanina. Um exemplo de uma tal sequência de ligação é SGG. Os aminoácidos podem ser adicionados ou subtraídos, conforme necessário. Os peritos na técnica são capazes de determinar sequências ligantes apropriados para a construto de proteínas de nanopartículas.

[00445] Em determinadas modalidades, as nanopartículas de proteína tem um peso molecular de 100 a 5000 kDa, tal como aproximadamente 500 a 4600 kDa. Em algumas modalidades, uma nanopartícula de ferritina tem um peso molecular aproximado de 650 kDa, uma nanopartícula Encapsulina tem um peso molecular aproximado de 2.100 kDa, uma nanopartícula SOR tem um peso molecular aproximado de 1.000 kDa, uma nanopartícula de lumazina sintase tem um peso molecular aproximado de 4000 kDa e uma nanopartícula piruvato desidrogenase tem um peso molecular aproximado de 4600 kDa, quando a nanopartículas de proteína incluem uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão.

[00446] As proteínas descritas F de RSV recombinante estabilizadas em uma conformação pré-fusão ligado a ferritina, encapsulina, SOR, sintase lumazina ou proteínas piruvato desidrogenase pode automontagem em nanopartículas de proteína de múltiplas subunidades, denominadas nanopartículas ferritina, nanopartículas encapsulina, nanopartículas SOR, nanopartículas lumazina sintase e nanopartículas piruvato desidrogenase, respectivamente. As nanopartículas incluem as proteínas F de RSV recombinantes descritos estabilizados em uma conformação substancialmente pré-fusão têm as mesmas características estruturais da ferritina nativa, encapsulina, SO, lumazina sintase ou nanopartículas piruvato desidrogenase que não incluem os RSV F proteínas recombinantes descritos estabilizadas em uma conformação pré-fusão. Isto é, elas contêm 24, 60, 24, 60 ou 60 subunidades (respectivamente) e assim por diante têm simetria correspondente. No caso de nanopartículas construídos de subunidades monoméricas incluindo uma proteína F de RSV recombinante descrito estabilizado em uma conformação pré-fusão, tais nanopartículas são especificamente ligado por um anticorpo específico pré-fusão (por exemplo, anticorpo D25 ou AM22) e/ou inclui uma pré- fusão F de RSV conformação específica (como sítio antigênico 0).

c. Polinucleotídeos que codificam antígenos

[00447] Os polinucleotídeos que codificam os antígenos PreF descritos (por exemplo, uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão ou proteína arcabouço, vírus ou partícula similar a nanopartícula ou proteína contendo tais proteínas) são também fornecidos. Estes polinucleotídeos incluem sequências de DNA, cDNA e RNA que codificam o antígeno.

[00448] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica um precursor de F0 polipeptídeo que, quando expresso em uma célula apropriada, é transformado em um antígeno PreF descrito. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica um precursor de F0 polipeptídeo que, quando expresso em uma célula apropriada, é transformado em um antígeno PreF descritos, em que o precursor de F0 polipeptídeo inclui, a partir de N- para C-terminal, um peptídeo de sinal, um F2 polipeptídeo, um polipeptídeo Pep27 e um polipeptídeo F1. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Pep27 inclui a sequência de aminoácidos apresentada como posições 110-136 de qualquer SEQ ID Nos: 1-184 ou 370, em que as posições de aminoácidos correspondem à sequência de aminoácidos de um polipeptídeo F0 de referência estabelecidos como SEQ ID NO: 124. Em algumas modalidades, o peptídeo de sinal inclui a sequência de aminoácidos apresentada como posições -25 1 de qualquer uma SEQ ID NO: 1-184 ou 370, em que as posições de aminoácidos corresponde à sequência de aminoácidos de um polipeptídeo F0 de referência apresentada como SEQ ID NO: 124.

[00449] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica um precursor de F0 polipeptídeo que, quando expresso em uma célula apropriada, é transformado em um antígeno PreF descritos, em que o precursor de F0 polipeptídeo inclui a sequência de aminoácidos apresentada como qualquer uma de SEQ ID NOs: 185 ou 189-303. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica um precursor de F0 polipeptídeo que, quando expresso em uma célula apropriada, é transformado em um antígeno PreF descritos, em que o precursor de F0 polipeptídeo inclui a sequência de aminoácidos apresentada como resíduos 1-513 de qualquer uma de SEQ ID NOs: 185 ou 189-303.

[00450] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica um precursor de F0 polipeptídeo que, quando expresso em uma célula apropriada, é transformado em um antígeno PreF descritos incluindo uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo F1 e em que o polipeptídeo F1 inclui uma ligação de dissulfureto entre um par de cisteínas nas posições 155 e 290 e uma substituição de aminoácido na posição de preenchimento de cavidade 190; ou uma ligação de dissulfureto entre um par de cisteínas nas posições 155 e 290, uma substituição de aminoácido na posição de preenchimento da cavidade 190 e uma substituição de aminoácido na posição de preenchimento de cavidade 207.

[00451] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica um precursor de F0 polipeptídeo que, quando expresso em uma célula apropriada, é transformado em um antígeno PreF descritos incluindo uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo F1 e em que o polipeptídeo F1 inclui S155C, S290C e S 190f substituições de aminoácidos, S155C, S290C e S190W substituições de aminoácidos ou S155C, S290C e S190L substituições de aminoácidos. Em outras modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica um precursor de F0 polipeptídeo que, quando expresso em uma célula apropriada, é transformado em um antígeno PreF descritos incluindo uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo F1 e em que o polipeptídeo F1 inclui S155C, S290C, S190F e V207L substituições de aminoácidos, S155C, S290C, S190W e V207L substituições de aminoácidos, S155C, S290C, S190L e V207L substituições de aminoácidos, S155C, S290C, S190F e V207F substituições de aminoácidos, S155C, S290C, S190W e V207F substituições de aminoácidos, S 155C, S290C, S190L e V207F substituições de aminoácidos, S155C, S290C, S190F e V207W substituições de aminoácidos, S155C, S290C, S190W e V207W substituições de aminoácidos ou S155C, S290C, S190L e V207W substituições de aminoácidos.

[00452] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica um precursor de F0 polipeptídeo que, quando expresso em uma célula apropriada, é transformado em um antígeno PreF descritos incluindo uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo F1, em que o polipeptídeo F2 e polipeptídeo F2 incluir a sequência de aminoácidos apresentada como posições 26-109 e 137-513, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID NO: 371 (RSV A com S155C, S290C e substituições V207L S190F), SEQ ID NO: 372 ( RSV B com S155C, S290C, S190F e substituições V207L), SEQ ID NO: 373 (RSV bovino com S155C, S290C, S190F e substituições V207L), SEQ ID NO: 374 (RSV A com S155C, substituições S290C e S190F), SEQ ID NO: 375 (RSV B com S155C, S290C e substituições S190F); ou SEQ ID NO: 376 (RSV bovino com substituições S155C, S290C e S190F).

[00453] Em várias modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica um precursor de F0 polipeptídeo que, quando expresso em uma célula apropriada, é transformado em um antígeno PreF descritos incluindo uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo F1 a partir de um RSV humano Um subtipo, um subtipo B de RSV humano ou um RSV bovino, em que o polipeptídeo F1 inclui qualquer uma das modificações de estabilização descritos aqui (por exemplo, uma das combinações acima de estabilização substituições tais como S 155C, substituições S290C e S190F ou S155C, S290C, S190F e substituições V207L).

[00454] Em um exemplo não limitativo de molécula de ácido nucleico que codifica um precursor de polipeptídeo F0 que, quando expresso em uma célula apropriada, é transformado em um antígeno PreF descritos incluindo uma proteína F de RSV recombinante incluindo um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo F1, em que o polipeptídeo F1 está ligado a uma proteína ferritina e em que o polipeptídeo e o polipeptídeo F2 F1 ligada à proteína ferritina incluem a sequência de aminoácidos apresentada como posições 26-109 e 137-679, respectivamente, da SEQ ID NO: 377 (RSV Um incluindo S155C, S290C, S190F, V207L substituições de aminoácidos, com ferritina de domínio C-terminal) ou SEQ ID NOs: 378-382.

[00455] Em um exemplo não limitante, a molécula de ácido nucleico inclui a sequência apresentada como SEQ ID NO: 383 (proteína F de RSV de subtipo humano Uma incluindo S155C, S290C, S190F e V207L substituições de aminoácidos, fundido com um domínio Foldon C- terminal, sítio de clivagem de trombina, marcador 6xHis e um StrepTag II).

[00456] Em outro exemplo não limitante, a molécula de ácido nucleico é um vetor de expressão e inclui a sequência apresentada como SEQ ID NO: 384 (proteína F de RSV de subtipo humano Uma incluindo S155C, S290C, S190F e V207L substituições de aminoácidos, fundido com um C-terminal de domínio Foldon, sítio de clivagem de trombina, marcador 6xHis e um StrepTag II).

[00457] Os métodos para a manipulação e inserção dos ácidos nucleicos da presente relatório descritivo em vetores são bem conhecidos na técnica (vide por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates e John Wiley & Sons, New York, NY, 1994).

[00458] Um ácido nucleico que codifica antígenos PreF (por exemplo, uma proteína recombinante de F de RSV estabilizado em uma conformação pré-fusão ou proteína de epitopo-arcabouço ou similar a vírus de partículas ou nanopartículas contendo proteínas tais proteínas) pode ser clonado ou amplificado por métodos in vitro, tais como a reação em cadeia de polimerase (PCR), a reação em cadeia de ligase (LCR), o sistema de amplificação com base em na transcrição (TAS), o sistema de autorreplicação de sequência sustentada (3SR) e o sistema de amplificação de replicase Q (QB). Por exemplo, um polinucleotídeo que codifica a proteína pode ser isolado por reação em cadeia de polimerase de cDNA usando iniciadores com base na sequência de DNA da molécula. Uma grande variedade de metodologias de clonagem e amplificação in vitro em são bem conhecidos para as pessoas peritas na técnica. Métodos de PCR estão descritos em, por exemplo, Patente dos USA No. 4.683.195; Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263, 1987; e Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, New York, 1989). Os polinucleotídeos também podem ser isolados por pesquisa de bibliotecas de DNA genômico ou cDNA com sondas selecionadas de sequências de polinucleotídeo desejado, sob condições de hibridação rigorosas.

[00459] Os polinucleotídeos que codificam antígenos PreF (por exemplo, uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão ou proteína de epitopo-arcabouço ou de partículas ou nanopartículas contendo proteínas tais proteínas similares a vírus) inclui um DNA recombinante que é incorporado em um vetor em uma autonomamente replicar plasmídeo ou vírus ou no DNA genômico de um procariota ou eucariota ou que existe como uma molécula separada (tal como um cDNA) independente de outras sequências. Os nucleotídeos podem ser ribonucleotídeos, deoxirribonucleotídeos ou formas modificadas de qualquer nucleotídeo. O termo inclui formas simples e duplas de DNA.

[00460] As sequências de DNA que codificam antígenos PreF (por exemplo, uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão ou proteína de epitopo-arcabouço ou similar a vírus de partículas ou nanopartículas contendo proteínas tais proteínas) podem ser expressas in vitro por transferência de DNA para uma célula hospedeira adequada. A célula pode ser procariótica ou eucariótica. O termo inclui também qualquer descendência da célula hospedeira indivíduo. Deverá ser entendido que toda a descendência pode não ser idêntica à célula parental uma vez que pode haver mutações que ocorrem durante a replicação. Métodos de transferência estável, significando que o DNA estranho é continuamente mantido no hospedeiro, são conhecidos na técnica.

[00461] As sequências de polinucleotídeo que codificam os antígenos PreF (por exemplo, uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão ou proteína de epitopo- arcabouço ou um vírus ou partícula similar a nanopartículas de proteína contendo tais proteínas) pode ser operativamente ligada a sequências de controle da expressão. Uma sequência de controle de expressão operativamente ligada a uma sequência de codificação está ligada de tal modo que a expressão da sequência de codificação é conseguida sob condições compatíveis com as sequências de controle de expressão. As sequências de controle de expressão incluem, porém sem limitações, promotores adequados, potencializadores, terminadores de transcrição, um códon de iniciação (isto é, ATG) na frente de um gene que codifica proteína, sinais de splicing para íntrons, manutenção da estrutura de leitura correta daquele gene para permitir a tradução adequada do RNAm e códons terminal.

[00462] Hospedeiros podem incluir micróbios, leveduras, insetos e mamíferos. Métodos de expressão de sequências de DNA possuindo sequências eucarióticas ou virais em procariotas são bem conhecidos na técnica. Exemplos não limitativos de células hospedeiras adequadas incluem bactérias, Archea, insetos, fungos (por exemplo, leveduras), plantas, animais e células (por exemplo, células de mamíferos, tais como seres humanos). Exemplos de células de utilização incluem Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Salmonella typhimurium, células SF9, células C129, células 293, Neurospora e linhagens de células mieloide e linfoides imortalizadas de mamífero. As técnicas para a propagação de células de mamíferos em cultura são bem conhecidos (vide, Jakoby e Pastan, (eds), 1979, Cell Culture. Methods in Enzymology, Volume 58, Academic Press, Inc., Harcourt Brace Jovanovich, NY). Exemplos de linhas celulares hospedeiras de mamífero vulgarmente usadas são as células VERO e HeLa, células CHO e WI38, BHK e COS, linhas de células, apesar de poderem ser usadas linhas de células, tais como células concebidos para proporcionar maior expressão, padrões de glicosilação desejáveis ou outras características. Em algumas modalidades, as células hospedeiras incluem células HEK293 ou derivados destes, tais como GnTI. As células (ATCC N° CRL-3022).

[00463] A transformação de uma célula hospedeira com DNA recombinante pode ser realizada através de técnicas convencionais tal como são bem conhecidos dos peritos na técnica. Quando o hospedeiro é procariótico, tal como, mas não limitadas a, E. coli, as células competentes que são capazes de absorção de DNA pode ser preparado a partir de células colhidas após a fase de crescimento exponencial e subsequentemente tratadas pelo método usando procedimentos bem conhecidos na técnica. Alternativamente, MgCh ou RbC1 pode ser usado. A transformação também pode ser realizada após a formação de um protoplasto da célula hospedeira, se desejado ou por eletroporação.

[00464] Quando o hospedeiro é um eucariota, métodos de transfecção de DNA, tais como precipitação com fosfato de cálcio, procedimentos mecânicos convencionais, tais como microinjeção, eletroporação, inserção de um plasmídeo encerrado em lipossomas ou vetores virais podem ser usados. As células eucarióticas também podem ser cotransformadas com sequências de polinucleotídeo que codifica um antígeno descrito e uma segunda molécula de DNA estranho que codifica um fenótipo selecionável, como o gene de quinase de timidina do Herpes simplex. Outro método é utilizar um vetor virai eucariótico, tal como o vírus símio 40 (SV40) ou o vírus do papiloma bovino, para infectar transitoriamente ou transformar as células eucarióticas e expressar a proteína (vide, por exemplo, Eukaryotic Viral Vetors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982).

D. Vetores Virais

[00465] As moléculas de ácido nucleico que codificam para uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré- fusão pode ser incluído em um vetor viral, por exemplo, para a expressão do antígeno em uma célula hospedeira ou para a imunização de um indivíduo, conforme descrito aqui. Em algumas modalidades, os vetores virais são administrados a um indivíduo como parte de uma vacinação de reforço. Em várias modalidades, os vetores virais são incluídos em uma vacina, tal como uma vacina iniciador ou uma vacina de reforço para utilização em uma vacinação de reforço.

[00466] Em vários exemplos, o vetor viral que codifica a proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão pode ser competente para replicação. Por exemplo, o vetor viral pode ter uma mutação (por exemplo, inserção de ácido nucleico que codifica o antígeno PreF) no genoma viral que não inibem a replicação viral em células hospedeiras. O vetor viral pode ser também condicionalmente replicação competente. Em outros exemplos, o vetor viral em células hospedeiras é deficiente na replicação.

[00467] Em várias modalidades, a proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão é expressa por um vetor virai que pode ser entregue através do trato respiratório. Por exemplo, um (PIV) vetor paramixovírus, tal como o vírus da parainfluenza bovina (bPIV) vetor (por exemplo, um bPIV-1, bPIV-2 ou BPV-3 vetor) ou humano vetor de PIV, um metapneumovírus (MPV) vetor, um vetor viral Sendai ou um vetor de vírus do sarampo, é usado para expressar um antígeno descrito. Um vetor viral expressa o BPIV3 F de RSV e as proteínas hPIVF (MEDI-534) está atualmente em ensaios clínicos como vacina RSV. Exemplos de paramixovírus (PIV) para o vetor que expressam antígenos são conhecidos daqueles versados na técnica (vide, por exemplo, Publicações de Pedido de Patente 2012/0045471, 2011/0212488, 2010/0297730, 2010/0278813, 2010/0167270, 2010/0119547, 2009/0263883, 2009/0017517, 2009/0004722, 2008/0096263, 2006/0216700, 2005/0147623, 2005/0142148, 2005/0019891, 2004/0208895, 2004/0005545, 2003/0232061, 2003/0095987 e 2003/0072773; cada uma das quais é aqui incorporada por referência na íntegra). Em outro exemplo, um vetor viral doença de Newcastle é usado para expressar um antígeno descrito (vide, por exemplo, McGinnes et al., J. Virol., 85: 366-377, 2011, descreve proteínas F de RSV e G expressas em doença de Newcastle como partículas, aqui incorporada por referência na íntegra). Em outro exemplo, um vetor de vírus Sendai é usado para expressar um antígeno descrito (vide, por exemplo, Jones et al., Vaccine, 30: 959-968, 2012, aqui incorporada por referência na íntegra, a qual descreve o uso de um vírus Sendai vacina de RSV para induzir a uma resposta imune em primatas).

[00468] Os vetores virais adicionais, também estão disponíveis para a expressão dos antígenos descritos, incluindo including polioma (isto é, SV40 (Madzakera, 1992, J. Gen. Virol, 73:15331536), adenovírus (Berkner, 1992, Cur. Top. Microbiol Immunol, 158:39-6; Berliner et al, 1988, Bio Techniques, 6:616-629; Gorziglia et al, 1992, J. Virol, 66:4407-4412; Quantin et al, 1992, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 89:2581-2584; Rosenfeld et al, 1992, Cell, 68:143-155; Wilkinson et al, 1992, Nucl. Acids Res., 20:2233-2239; Stratford-Perricaudet et al, 1990, Hum. Gene Ther., 1:241-256), vírus da varíola (Mackett et al, 1992, Biotechnology, 24:495-499), virus adenoassociado (Muzyczka, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol, 158:91-123; On et al, 1990, Gene, 89:279-282), vírus do herpes, incluindo HSV e EBV e CMV (Margolskee, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol, 158:67-90; Johnson et al, 1992, J. Virol, 66:2 9522965; Fink et al, 1992, Hum. Gene Ther. 3:11-19; Breakfield et al, 1987, Mol NeurobioL, 1:337-371; Fresse et al, 1990, Biochem. Pharmacol, 40:2189-2199), virus Sindbis (H. Herweijer et al, 1995, Human Gene Therapy 6:1161-1167; Patentes dos Estados Unidos Nos 5.091.309 e 5.2217.879), alfavírus (S. Schlesinger, 1993, Trends Biotechnol. 11:18-22; I. Frolov et al, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11371-11377) e retrovirus de aven (Brandyopadhyay et al, 1984, Mol. Cell Biol, 4:749-754; Petropouplos et al, 1992, J. Virol, 66:3391-3397), de murino (Miller, 1992, Curr Top. Microbiol. Immunol, 158:1-24; Miller et al, 1985, Mol. Cell Biol, 5:431-437; Sorge et al, 1984, Mol. Cell Biol, 4:1730-1737; Mann et al, 1985, J. Virol, 54:401-407) e humanos (Page et al, 1990, J. Virol, 64:5370-5276; Buchschalcher et al, 1992, J. Virol, 66:2731-2739). Vetores de baculovírus (virus da poliedrose multinuclear de Autographa californica; AcMNPV) também são conhecidos na técnica e podem ser obtidos de fonts comerciais (tais como PharMingen, San Diego, Calif.; Protein Sciences Corp., Meriden, Conn.; Stratagene, La Jolla, Calif.). Vetores virais adicionais são familiares para aqueles versados na técnica.

[00469] Em várias modalidades, os métodos e composições descritos aqui incluem um vetor adenoviral que expressa uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão. Adenovírus a partir de várias origens, subtipos ou mistura de subtipos pode ser usado como a fonte do genoma viral para o vetor adenoviral. Não humano de adenovírus (por exemplo, símia, chimpanzé, gorila, aviária, canino, ovino ou os adenovírus de bovino) pode ser usada para gerar o vetor adenoviral. Por exemplo, um símio adenovírus pode ser usado como a fonte do genoma viral do vetor adenoviral. Um adenovírus símio pode ser de serotipo 1, 3, 7, 11, 16, 18, 19, 20, 27, 33, 38, 39, 48, 49, 50 ou qualquer outro serotipo adenoviral de símio. Um adenovírus símio podem ser ditas usando qualquer abreviatura adequado conhecido na técnica, tal como, por exemplo, SV, SAdV, a SAV ou SAV. Em alguns exemplos, um vetor adenoviral de símio é um vetor adenoviral de símio do sorotipo 3, 7, 11, 16, 18, 19, 20, 27, 33, 38 ou 39. Em um exemplo, um chimpanzé serotipo C Ad3 vetor é usado (vide, por exemplo, Peruzzi et al., Vaccine, 27: 1293-1300, 2009). Adenovírus humano pode ser usado como a fonte do genoma viral para o vetor adenoviral. Adenovírus humano pode ser de vários subgrupos ou serotipos. Por exemplo, um adenovírus pode ser de subgrupo A (por exemplo, os serotipos 12, 18 e 31), subgrupo B (por exemplo, os serotipos 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35 e 50), subgrupo C (por exemplo, os serotipos 1, 2, 5 e 6), subgrupo D (por exemplo, os serotipos 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 36-39 e 4248), subgrupo E (por exemplo, o serótipo 4), subgrupo F (por exemplo, os serotipos de 40 e 41), um serotipo não classificados (por exemplo, serotipos 49 e 51) ou qualquer outro serotipo adenoviral. aqueles versados na técnica está familiarizado com a replicação competente e vetores adenovirais deficientes (incluindo isoladamente e multiplicar replicação deficiente vetores adenovirais). Exemplos de vetores adenovirais deficientes na replicação, incluindo os vetores adenovirais deficientes na replicação se multiplicam, são descritos nas Patentes dos Estados Unidos Nos 5.837.511; 5.851.806; 5.994.106; 6.127.175; 6.482.616; e 7.195.896 e Pedidos de Patente Internacional Nos. WO 94/28152, WO 95/02697, WO 95/16772, WO 95/34671, WO 96/22378, WO 97/12986, WO 97/21826, WO 03/02231 e 1.

E. Composições

[00470] Os antígenos PreF descritos, vetores virais e moléculas de ácido nucleico podem ser incluídos em uma composição farmacêutica, incluindo formulações terapêuticas e profiláticas e podem ser combinados em conjunto com um ou mais adjuvantes e, opcionalmente, outros ingredientes terapêuticos, tais como fármacos antivirais. Em várias modalidades, as composições incluindo um ou mais dos antígenos PreF descritos, vetores virais ou moléculas de ácido nucleico são composições imunogênicas. A composição pode incluir qualquer um dos antígenos PreF incluindo uma proteína F de RSV recombinante, como descrito aqui, (tal como uma nanopartícula de proteínas, incluindo qualquer um dos Proteínas F de RSV recombinantes, como descrito aqui), uma partícula similar a vírus, incluindo qualquer um dos proteínas F de RSV recombinantes, como descrito aqui, uma molécula de ácido nucleico que codifica qualquer uma das proteínas recombinantes F de RSV, como descrito aqui ou um vetor que codifica ou incluindo qualquer de F de RSV as proteínas recombinantes, como descrito aqui.

[00471] Em algumas modalidades, a composição inclui um primeiro antígeno isolado incluindo uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão por qualquer das substituições descritas aqui (tal como S155C, S290C e substituições S190F ou S155C, S290C, S190F e substituições V207L), em que a proteína F de RSV estabilizado é com base em um subtipo de proteína A F de RSV e um segundo antígeno isolado incluindo uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão por qualquer das substituições descritas aqui (tal como substituições S155C, S290C e S190F ou S155C, S290C, S190F e substituições V207L), em que a proteína F de RSV é estabilizado com base em um subtipo da proteína F de RSV.

[00472] Em algumas modalidades, a composição inclui uma primeira nanopartículas de proteínas, incluindo uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão por qualquer das substituições descritas aqui (tal como S155C, S290C e substituições S190F ou S155C, S290C, S190F e substituições V207L), em que a proteína F de RSV estabilizado é com base em um subtipo de proteína A F de RSV e uma segunda nanopartícula de proteínas, incluindo uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão por qualquer das substituições descritas aqui (tal como S155C, S290C e substituições S190F ou S155C, S290C, S190F e V207L substituições), em que a proteína F de RSV estabilizado é com base em um subtipo B proteína F de RSV.

[00473] Em algumas modalidades, a composição inclui um primeiro vetor viral incluindo uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão por qualquer das substituições descritas aqui (tal como S155C, S290C e substituições S190F ou S155C, S290C, S190F e substituições V207L), em que a proteína F de RSV estabilizado é com base em um subtipo de proteína A F de RSV e um segundo vetor viral incluindo uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão por qualquer das substituições descritas aqui (tal como S155C, S290C e substituições S190F ou S155C, S290C, S190F e V207L substituições), em que a proteína F de RSV estabilizado é com base em um subtipo B proteína F de RSV.

[00474] Em algumas modalidades, a composição inclui uma primeira partícula similar a vírus, incluindo uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão por qualquer das substituições descritas aqui (tal como S155C, S290C e substituições S190F ou S155C, S290C, S190F e V207L substituições), em que a proteína F de RSV estabilizado é com base em um subtipo de proteína A F de RSV e uma segunda partícula similar a vírus, incluindo uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré- fusão por qualquer das substituições descritas aqui (tal como S155C, S290C e substituições ou S155C S190F, S290C, S190F e substituições V207L), em que a proteína F de RSV é estabilizada com base em um subtipo da proteína F de RSV. B

[00475] Em algumas modalidades, a composição inclui uma primeira molécula de ácido nucleico (tal como um vetor de expressão) que codifica para uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão por qualquer das substituições descritas aqui (tal como S155C, S290C e substituições S190F ou S155C, S290C, S190F e substituições V207L), em que a proteína F de RSV estabilizado é com base em um subtipo de proteína A F de RSV e uma segunda molécula de ácido nucleico (tal como um vetor de expressão) que inclui uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão pela qualquer das substituições descritas aqui (tal como S 155C, S290C e substituições ou S155C S190F, S290C, S190F e substituições V207L), em que a proteína F de RSV estabilizado é com base em um subtipo B proteína F de RSV.

[00476] Tais composições farmacêuticas podem ser administradas a indivíduos por uma variedade de modos de administração conhecidas daqueles versados na técnica, por exemplo, nasal, pulmonar, por via intramuscular, subcutânea, intravenosa, intraperitoneal ou vias parentéricas.

[00477] Para formular as composições, os antígenos PreF descritos, vetores virais ou moléculas de ácido nucleico podem ser combinadas com vários aditivos farmaceuticamente aceitáveis, bem como uma base ou veículo para a dispersão do conjugado. Aditivos desejados incluem, porém sem limitações, agentes de controle do pH, tais como arginina, hidróxido de sódio, glicina, ácido clorídrico, ácido cítrico e assim por diante. Além disso, os anestésicos sítios (por exemplo, álcool benzílico), agentes de isotonicidade (por exemplo, cloreto de sódio, manitol, sorbitol), inibidores de adsorção (por exemplo, TWEEN 80), agentes melhorador de solubilidade (por exemplo, ciclodextrinas e seus derivados), estabilizantes (por exemplo, albumina de soro) e agentes redutores (por exemplo, glutationa) podem ser incluídos. Os adjuvantes, tais como hidróxido de alumínio (ALHYDROGEL®, disponível a partir de Brenntag Biosector, Copenhagem, Dinamarca e AMPHOGEL®, Wyeth Laboratories, Madison, NJ), adjuvante de Freund, MPL™ (monofosforil lipídio A 3-O-desacilado; Corixa, Hamilton, rN), IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, MA) agonistas de LT (tais como agonistas de TLR-9), dentre muitos outros adjuvantes adequados bem conhecidos na técnica, podem ser incluídos nas composições.

[00478] Quando a composição é um líquido, a tonicidade da formulação, tal como medido com referência à tonicidade de 0,9% (peso/v) de solução salina fisiológica, tomado como unidade é tipicamente ajustado para um valor pelo qual nenhum dano tecidual substancial, irreversíveis ser induzida no sítio da administração. Geralmente, a tonicidade da solução é ajustado para um valor de cerca de 0,3 a cerca de 3,0, tal como cerca de 0,5 a cerca de 2,0 ou cerca de 0,8 a cerca de 1,7.

[00479] Os antígenos PreF descritos, vetores virais ou moléculas de ácido nucleico podem ser dispersos em uma base ou veículo, o qual pode incluir um composto hidrófilo que tem uma capacidade para dispersar os antígenos e quaisquer aditivos desejados. A base pode ser selecionada a partir de uma vasta gama de compostos adequados, incluindo, mas não limitado a, copolímeros de ácidos policarboxílicos ou seus sais, anidridos carboxílicos (por exemplo, anidrido maleico) com outros monômeros (por exemplo, (met)acrilato de metila, ácido acrílico e assim por diante), polímeros de vinilo, hidrofílico, tais como acetato de polivinila, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, derivados de celulose, tais como hidróxi metil celulose, polímeros de hidróxi propil celulose e assim por diante e naturais, tais como quitosana, colágeno, alginato de sódio, gelatina, ácido hialurônico e sais de metais não tóxicos dos mesmos. Muitas vezes, um polímero biodegradável é selecionado como uma base ou um veículo, por exemplo, ácido poliláctico, poli (ácido láctico-ácido glicólico), copolímero de ácido poli-hidroxibutírico, poli (ácido glicólico-ácido hidroxibutírico) copolímero e as suas misturas. Alternativamente ou adicionalmente, os ésteres de ácidos gordos sintéticos, tais como ésteres de poliglicerina de ácidos gordos, ésteres de ácidos gordos de sacarose e assim por diante podem ser empregues como veículos. Os polímeros hidrofílicos e outros veículos podem ser usados sozinhos ou em combinação e integridade estrutural melhorada pode ser transmitido ao veículo por cristalização parcial, ligação iônica, ligação reticulada e assim por diante. O veículo pode ser fornecida em uma variedade de formas, incluindo soluções fluidas ou viscosas, géis, pastas, pós, microesferas e películas, por exemplo para aplicação direta a uma superfície mucosa.

[00480] Os antígenos PreF descritos, vetores virais ou moléculas de ácido nucleico podem ser combinadas com a base ou veículo de acordo com uma variedade de métodos e a liberação dos antígenos pode ser, por difusão, a desintegração do veículo ou a formação de canais de água associada. Em algumas circunstâncias, os antígenos descritos ou um ácido nucleico ou um vetor que codifica a viral, que expressam ou incluindo o antígeno, é disperso em microcápsulas (microesferas) ou nanocápsulas (nanoesferas) preparados a partir de um polímero adequado, por exemplo, 2-cianoacrilato de isobutila (vide, por exemplo, Michael et al., J. Pharmacol Pharm. 43: 1-5, 1991) e dispersa em um meio de dispersão biocompatível, que produz a liberação prolongada e a atividade biológica ao longo de um tempo prolongado.

[00481] As composições farmacêuticas podem conter substâncias como veículos farmaceuticamente aceitáveis conforme necessário para aproximar às condições fisiológicas, tais como ajuste de pH e agentes de tamponamento, agentes de ajustamento da tonicidade, agentes de umedecimento e assim por diante, por exemplo, acetato de sódio, lactato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, monolaurato de sorbitano e oleato de trietanolamina. Para composições sólidas, veículos convencionais não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis que podem ser usados incluem, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, talco, celulose, glicose, sacarose, carbonato de magnésio e assim por diante.

[00482] As composições farmacêuticas para a administração dos antígenos PreF descritos, vetores virais ou moléculas de ácido nucleico podem também ser formuladas como uma solução, microemulsão ou outra estrutura ordenada adequada para alta concentração de ingredientes ativos. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, polietileno glicol líquido e assim por diante) e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez adequada para soluções pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, através da manutenção de um tamanho de partícula desejado no caso das formulações dispersíveis e pelo uso de tensoativos. Em muitos casos, será desejável incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol e sorbitol ou cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada dos antígenos descritos pode ser conseguida incluindo na composição um agente que retarda a absorção, por exemplo, sais monoestearato e gelatina.

[00483] Em determinadas modalidades, os antígenos PreF descritos, vetores virais ou moléculas de ácido nucleico pode ser administrado em uma formulação -release tempo, por exemplo em uma composição que inclui um polímero de liberação lenta. Estas composições podem ser preparadas com veículos que protegerão contra a liberação rápida, por exemplo, um veículo de liberação controlada, tal como um polímero, sistema de distribuição microencapsulado ou gel bioadesivo. Distribuição prolongada em várias composições da presente descrição pode ser conseguida incluindo na composição agentes que retardam a absorção, por exemplo, hidrogéis de monoestearato de alumínio e gelatina. Quando formulações de liberação controlada são desejadas, ligantes de liberação controlada adequados para utilização de acordo com a invenção incluem qualquer material de liberação controlada biocompatível que é inerte para o agente ativo e que é capaz de incorporar o antígeno descritas e/ou outro agente biologicamente ativo. Numerosos desses materiais são conhecidos na técnica. Úteis ligantes de liberação controlada são materiais que são metabolizadas lentamente, sob condições fisiológicas, na sequência da sua distribuição (por exemplo, a uma superfície mucosa ou na presença de fluidos corporais). Aglutinantes apropriados incluem, porém sem limitações, polímeros biocompatíveis e copolímeros bem conhecidos na técnica para utilização em formulações de liberação sustentada. Tais compostos são biocompatíveis, não tóxicos e inertes para os tecidos circundantes e não provocam efeitos secundários adversos significativos, tais como irritação nasal, resposta imune, inflamação ou similares. Eles são metabolizados em produtos metabólicos que são também biocompatíveis e facilmente eliminados do corpo. Numerosos sistemas de distribuição controlada de proteínas terapêuticas são conhecidos (por exemplo, Patente dos Estados Unidos No 5.055.303; Patente dos Estados Unidos No 5.188.837; Patente dos Estados Unidos No 4.235.871; Patente dos Estados Unidos No 4.501.728; Patente dos Estados Unidos No 4.837.028; Patente dos Estados Unidos No ° 4.957.735; e A Patente dos Estados Unidos No 5.019.369; Patente dos Estados Unidos No 5.055.303; Patente dos Estados Unidos No 5.514.670; Patente dos Estados Unidos No 5.413.797; Patente dos Estados Unidos No 5.268.164; Patente dos Estados Unidos No 5.004.697; Patente dos Estados Unidos N° 4.902.505; Patente dos Estados Unidos No 5.506.206; Patente dos Estados Unidos No 5.271.961; Patente dos Estados Unidos No 5.254.342; e Patente dos Estados Unidos No 5.534.496).

[00484] Exemplos de materiais poliméricos para utilização incluem, porém sem limitações, matrizes poliméricas derivadas de poliésteres copolímeros e homopoliméricos contendo ligações éster hidrolizáveis. Um determinado número deles é conhecido na técnica como sendo biodegradáveis e para levar a produtos de degradação que têm pouca ou nenhuma toxicidade. Exemplos de polímeros incluem ácidos poliglicólicos e polilácticos, ácidos (poli)láctico-co-glicólico DL-láctico, ácido (poli)láctico-co-glicólico D-láctico) e ácido (poli)láctico-co-glicólico. Outros polímeros biodegradáveis ou biodegradáveis úteis incluem, porém sem limitações, polímeros tais como (poli)epsilon-caprolactona, ácido (poli)-épsilon-caprolactona-láctico, poli (ácido-épsilon. caprolactona-co-glicólico), poli (ácido butírico beta hidroxi-), poli (alquil- 2-cianoacrilato), hidrogéis, tais como poli (metacrilato de hidroxietila), poliamidas, poli (aminoácidos) (por exemplo, L-leucina, ácido glutâmico, ácido L-aspártico e assim por diante), poli (éster de ureia), poli (2- hidroxietil-aspartamida DL), polímeros de poliacetal, poliortoésteres, policarbonato, polimaleamidas, polissacarídeos e seus copolímeros. Muitos métodos para a preparação dessas formulações são bem conhecidos daqueles versados na técnica (vide, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978). Outras formulações úteis incluem as microcápsulas de liberação controlada (Patentes dos Estados Unidos Nos 4.652.441 e 4.917.893), láctico copolímeros de ácido glicólico-ácido úteis no fabricação de microcápsulas e outras formulações (Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.677.191 e 4.728.721) e composições de liberação controlada para peptídeos solúveis em água (Patente dos Estados Unidos N° 4.675.189).

[00485] As composições farmacêuticas são tipicamente estéreis e estáveis sob as condições de fabricação, armazenamento e utilização. As soluções estéreis podem ser preparadas por incorporação dos antígenos descritos PreF, vetores virais ou moléculas de ácido nucleico na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes aqui enumerados, como requerido, seguido de esterilização por filtração. Geralmente, as dispersões são preparadas por incorporação do antígeno descritas e/ou outro agente biologicamente ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários de entre os enumerados aqui. No caso de pós estéreis, os métodos de preparação incluem a secagem em vácuo e liofilização que produz um pó do antígeno descrito mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma sua solução previamente esterilizada por filtração. A prevenção da ação de microrganismos pode ser conseguida por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e assim por diante.

[00486] Métodos atuais para preparação de composições administráveis serão conhecidos ou evidentes para aqueles versados na técnica e são descritos em mais pormenor em publicações como Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pensilvânia, 1995.

[00487] Em várias modalidades, as composições incluem um adjuvante. Os versados na técnica está familiarizado com adjuvantes, por exemplo, aqueles que podem ser incluídos em uma composição imunogênica. Em várias modalidades, o adjuvante é selecionado para induzir a uma resposta imune Th1 enviesada em um indivíduo administrada uma composição imunogênica contendo o adjuvante e um antígenos descritos ou um ácido nucleico ou um vetor que codifica a viral, que expressa o antígeno ou inclusive.

[00488] Um adjuvante adequado é um derivado de lipopolissacarídeo bacteriano não tóxico. Um exemplo de um derivado não tóxico adequado de lipídio A, é A ou monofosforil-lipídio, mais particularmente monofosforil-lipídio A 3-desacilado (3D-MPL). Vide, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos 4.436.727; 4.877.611; 4.866.034 e 4.912.094. 3D-MPL principalmente promove respostas de células T CD4 + com um fenótipo de IFN-y (TH1). 3D-MPL pode ser produzido de acordo com os métodos descritos em GB2220211 A. Quimicamente é uma mistura de 3-desacilado com monofosforil-lipídio A 3, 4, 5 ou 6 cadeias aciladas. Nas composições, pequenas partículas 3D-MPL pode ser usado. Pequenas partículas 3D-MPL tem um tamanho de partícula de tal modo que ele pode ser esterilizada por filtração através de um filtro de 0,22 μm. Tais preparações são descritos em W094/21292.

[00489] Em outras modalidades, o lipopolissacarídeo pode ser um β (1-6) dissacarídeo de glucosamina, conforme descrito na Pat. N ° 6.005.099 e na Patente EP N ° 0 729 473 B1. Aqueles versados na técnica seria facilmente capaz de produzir vários lipopolissacarídeos, tais como 3D-MPL, com base nos ensinamentos destas referências. Além dos acima mencionados (imunoestimuladores que são similares quanto à estrutura ao LPS ou MPL ou 3D-MPL), monossacarídeo acilado e derivados de dissacarídeo, que são uma subporção com a estrutura acima de MPL são também adjuvantes adequados.

[00490] Em várias modalidades, um receptor (TLR) agonista do tipo Toll é usado como um adjuvante. Por exemplo, um antígeno PreF descritos podem ser combinados com um agonista dos TLR em uma composição imunogênica usada para estimular uma resposta imune neutralizante para RSV. Por exemplo, o agonista dos TLR pode ser um agonista dos TLR-4, tais como um derivado sintético de lipídio A (vide, por exemplo, WO 95/14026, WO 01/46127 e) um fosfato de alquilo glucosaminida (AGP; vide, por exemplo, o documento WO 98./50399 ou Patente dos USA N ° 6.303.347; 6.764.840). Outros ligantes de TLR-4 adequados, capazes de provocar uma resposta de sinalização através de TLR-4 são, por exemplo, lipopolissacarídeo a partir de bactérias gram-negativas e os seus derivados ou seus fragmentos, em particular, um derivado não tóxico de LPS (tal como 3D- MPL). Outros agonistas de TLR adequados são os seguintes: proteína de choque térmico (HSP) 10, 60, 65, 70, 75 ou 90; Um tensoativo de proteína, fragmentos de oligossacarídeos de hialuronana, sulfato de heparana, fragmentos de peptídeos de fibronectina, fibrinogénio e -defensin-2 e dipeptídeo muramila (MDP). Em uma modalidade, o agonista dos TLR é a HSP 60, 70 ou 90. Outros adequados ligantes de TLR-4 são conforme descrito no documento WO 2003/011223 e WO 2003/099195 em.

[00491] Agonistas TLR adicionais (tais como um agente que é capaz de provocar uma resposta de sinalização por meio de uma via de sinalização dos TLR) são também úteis como adjuvantes, tais como agonistas para o TLR2, TLR3, TLR7, TLR8 e/ou TLR9. Portanto, em uma modalidade, a composição inclui adicionalmente um adjuvante que é selecionado a partir do grupo que consiste em: um TLR-1 agonista, um agonista dos TLR-2, TLR-3 agonista, um agonista dos TLR-4, TLR- 5 agonista, um TLR- 6 agonista, agonista dos TLR-7, um agonista dos TLR-8, TLR-9 agonista ou uma sua combinação.

[00492] Em uma modalidade, um agonista dos TLR é usado que é capaz de provocar uma resposta de sinalização através de TLR-1, por exemplo um ou mais de entre: lipopeptídeos tri-acilados (LPS); fenol- solúvel modulina; LP de Mycobacterium tuberculosis; S- (2,3-bis (palmitoiloxi)-(2-RS)-propil)-N-palmitoil-(R) -Cys-(S) -Ser- (S) -L ys (4) - OH, tricloridrato (Pam3Cys) LP, que imita o terminal amino acetilado de uma lipoproteína de bactérias e OspA de Borrelia burgdorferi. Em outra modalidade, um agonista dos TLR é usado que é capaz de causar uma sinalização de resposta através de TLR-2, tal como um ou mais de uma lipoproteína, um peptidoglicana, lipopeptídeos bacterianos um de M. tuberculosis, B. burgdorferi ou T. pallidum; peptidoglicanas de espécies, incluindo Staphylococcus aureus; lipoteicoico ácidos, ácido manurônico, porinas de Neisseria, fímbrias bacterianas, fatores de virulência Yersina, vírions de CMV, sarampo hemaglutinina e zimosana de levedura. Em algumas modalidades, um agonista dos TLR é usado que é capaz de provocar uma resposta de sinalização através de TLR-3, tais como um ou mais de RNA de cadeia dupla (RNAcd) ou ácido poli-inosínico- policitidílico (Poli IC), um padrão molecular ácido nucleico associada com infecção viral. Em outras modalidades, um agonista dos TLR é usado que é capaz de provocar uma resposta de sinalização através de TLR-5, tais como a flagelina bacteriana. Em modalidades adicionais, um agonista dos TLR é usado que é capaz de provocar uma resposta de sinalização através de TLR-6, tais como um ou mais de lipoproteína micobacteriana, LP di-acilado e modulina solúvel em fenol. Agonistas do TLR6 adicionais são descritos no documento WO 2003/043572. Em uma modalidade, um agonista dos TLR é usado que é capaz de provocar uma resposta de sinalização através de TLR 7, tais como um ou mais de um RNA de cadeia simples (ssRNA), loxoribina, um análogo de guanosina em posições N7 e C8 ou um imidazoquinolina ou um derivado do mesmo. Em uma modalidade, o agonista dos TLR é imiquimod. Outros agonistas do TLR7 são descritos no documento WO 2002/085905. Em algumas modalidades, um agonista dos TLR é usado que é capaz de provocar uma resposta de sinalização através de TLR- 8. Adequadamente, o agonista dos TLR capaz de provocar uma resposta de sinalização através de TLR-8 é um RNA de cadeia simples (ssRNA), uma molécula de imidazoquinolina com atividade antiviral, por exemplo resiquimod (R848); resiquimod também é capaz de reconhecimento por TLR-7. Outros agonistas de TLR-8 que podem ser usados incluem aqueles descritos no documento WO 2004/071459.

[00493] Em outras modalidades, um adjuvante inclui um agonista dos TLR capaz de induzir a uma resposta de sinalização através de TLR-9. Por exemplo, o adjuvante pode incluir HSP90, DNA bacteriano ou viral e/ou DNA contendo nucleotídeos CpG não metilados (por exemplo, um oligonucleotídeo CpG). Por exemplo, oligonucleotídeos contendo CpG induzem a uma resposta predominantemente Th1. Tais oligonucleotídeos são bem conhecidos e são descritos, por exemplo, em WO 95/26204, WO 96/02555, WO 99/33488 e Pat. Nos. 5.278.302, 5.666.153, e. 6.008.200 e 5.856.462. Assim, os oligonucleotídeos usados como adjuvantes nas composições descritas incluem oligonucleotídeos contendo CpG, por exemplo, contendo dois ou mais motivos de dinucleotídeo CpG. Também estão incluídos oligonucleotídeos com ligações inter-nucleotídeo mistas.

[00494] Outros adjuvantes que podem ser usados em composições imunogênicas com os antígenos ou um ácido nucleico ou um vetor que codifica a viral, que expressam ou incluindo um antígeno, por exemplo, por si próprios ou em combinação com 3D-MPL ou outro adjuvante descrito aqui, são saponinas, tais como QS21. Em alguns exemplos, as saponinas são usadas como um adjuvante, por exemplo, para a administração sistémica de um antígeno PreF. Uso de saponinas (por exemplo, o uso de Quil A, derivada da casca da árvore da América do Sul Quillaja Saponaria Molina) como adjuvantes é familiar à pessoa especialista na técnica (vide, por exemplo, documentos US 5.057.540 e EP 0 362 279 B1, EP 0 109 942 B1; WO 96/11711; WO 96/33739). As saponinas hemolíticas QS21 e QS17 (frações purificadas por HPLC de Quil A) foram descritas como adjuvantes sistêmicos potentes e o método da sua produção é descrito na Pat. No. 5057540 e EP 0 362 279 B1.

[00495] O adjuvante pode também incluem sais minerais, tais como sais de alumínio ou cálcio, em particular hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio e fosfato de cálcio.

[00496] Uma outra classe de adjuvantes de polarização Th1 adequado para uso em composições incluem proteínas da membrana externa (OMP) com base em composições imunoestimuladores. OMP com base em composições imunoestimuladoras são particularmente adequadas como adjuvantes das mucosas, por exemplo, para a administração intranasal. Composições imunoestimuladoras com base em OMP são um gênero de preparações de (OMPs, incluindo alguns porinas) a partir de bactérias Gram-negativas, por exemplo, espécies Neisseria, que são úteis como um transportador ou em composições para imunógenos, tais como antígenos bacterianos ou virais (vide, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No 5.726.292; Patente dos Estados Unidos No 4.707.543). Além disso, proteossomos têm a capacidade de automontagem em vesículas ou vesículas similares a agregados de OMP de cerca de 20 nm a cerca de 800 nm e de incorporar de forma não covalente, de coordenadas, associado (por exemplo, eletrostática ou hidrofobicamente) ou de outro modo cooperar com antígenos proteicos ( AGS), particularmente antígenos que têm um grupo hidrofóbico. Proteossomos pode ser preparado, por exemplo, como descrito na técnica (vide, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No 5.726.292 ou a Patente dos Estados Unidos No 5.985.284;. 2003/0044425).

[00497] Proteossomos são compostos principalmente de proteínas extraídas quimicamente membrana externa (PMEs) de Neisseria meningitidis (principalmente porinas A e B, bem como OMP de classe 4), mantidos em solução de detergente (Lowell, G.H. Proteosomes for Improved Nasal, Oral, or Injectable Vaccines. Em: Levine MM, Woodrow GC, Kaper JB, Cobon GS, eds, New Generation Vaccines. New York: Marcel Dekker, Inc. 1997; 193-206). Proteossomos podem ser formulados com uma variedade de antígenos, tais como proteínas purificadas ou recombinantes derivados de fontes virais, incluindo os polipeptídeos descritos aqui PreF. A remoção gradual de detergente permite a formação de complexos de partículas hidrofóbicas de cerca de 100-200 nm de diâmetro (owell, G.H. Proteosomes for Improved Nasal, Oral, or Injectable Vaccines. Em: Levine MM, Woodrow GC, Kaper JB, Cobon GS, eds, New Generation Vaccines. New York: Marcel Dekker, Inc. 1997; 193-206).

[00498] Combinações de diferentes adjuvantes também podem ser usados em composições com os antígenos PreF descritos, vetores virais ou moléculas de ácido nucleico na composição. Por exemplo, como já foi notado, o QS21 pode ser formulado em conjunto com 3D- MPL. A proporção de QS2L3D-MPL será tipicamente na ordem de 1: 10 a 10: 1; tal como 1: 5 a 5: 1 e muitas vezes substancialmente 1: 1. Tipicamente, a proporção está na gama de 2,5: 1 a 1: 1 3D-MPL: QS21 (tais como AS01 (GlaxoSmithKline). Outra formulação de combinação inclui adjuvante 3D-MPL e um sal de alumínio, tal como o hidróxido de alumínio (tal como AS04 (GlaxoSmithKline). Quando formulados em combinação, esta combinação pode aumentar uma resposta imune Th1 específica de antígeno.

[00499] Em alguns casos, o adjuvante de formulação de um sal mineral, tal como cálcio ou de alumínio (alúmen) de sal, por exemplo, fosfato de cálcio, fosfato de alumínio ou hidróxido de alumínio. Em algumas modalidades, o adjuvante compreende uma emulsão de óleo e água, por exemplo, uma emulsão de óleo-em-água (tais como MF59 (Novartis) ou AS03 (GlaxoSmithKline). Um exemplo de uma emulsão de óleo-em-água compreende um óleo metabolizável, tal como esqualeno, um protocolo tal como um tocoferol, por exemplo, alfa-tocoferol e um tensoativo, tal como trioleato de sorbitano (Span 85) ou mono-oleato de polioxietileno sorbitano (Tween 80), em um veículo aquoso.

[00500] A composição farmacêutica contém, tipicamente, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antígeno PreF descrito, vetor virai ou molécula de ácido nucleico e podem ser preparados por técnicas convencionais. Preparo de composições imunogênicas, incluindo aquelas para administração a seres humanos, é geralmente descrita em Pharmaceutical Biotechnology, Vol.61 Vaccine Design - the subunit e adjuvant approach, editado por Powell e Newman, Plenum Press, 1995. New Trends and Developments in Vaccines, editado por Voller et al, University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978. A encapsulação dentro de lipossomas está descrita, por exemplo, por Fullerton, Patente dos Estados Unidos No 4.235.877. A conjugação de proteínas a macromoléculas é descrita, por exemplo, por Likhite, Patente dos Estados Unidos No 4.372.945 e por Armor et al., Patente dos Estados Unidos No 4.474.757. Tipicamente, a quantidade de antígeno em cada dose da composição imunogênica é selecionada como uma quantidade que induz uma resposta imune, sem efeitos colaterais adversos significativos.

[00501] A quantidade de antígeno de PreF descrito, vetor virai ou molécula de ácido nucleico pode variar, dependendo do antígeno específico usado, a via e o protocolo de administração e da população alvo, por exemplo. Tipicamente, cada dose humana compreenda 11000 μg de proteína, tal como de cerca de 1 μg a cerca de 100 μg, por exemplo, de cerca de 1 μg a cerca de 50 μg, tal como de cerca de 1 μg, cerca de 2 μg, cerca de 5 μg, cerca de 10 μg, 15 μg, cerca de 20 μg, cerca de 25 μg, cerca de 30 μg, a cerca de 40 μg ou cerca de 50 μg. A quantidade usada em uma composição imunogênica é selecionada com base na população em questão (por exemplo, para crianças ou idosos). Uma quantidade óptima para uma determinada composição pode ser determinada por estudos padrão envolvendo a observação de títulos de anticorpos e outras respostas em indivíduos. Deverá ser entendido que uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antígeno em uma composição imunogênica pode incluir uma quantidade que é ineficaz na indução de uma resposta imune pela administração de uma dose única, mas que é eficaz após a administração de múltiplas dosagens, por exemplo, em um protocolo de administração de reforço.

[00502] Em vários exemplos, as composições farmacêuticas para induzir a uma resposta imune contra RSV em humanos incluem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antígenos PreF descritos, vetores virais ou moléculas de ácido nucleico para administração a recém-nascidos (por exemplo, crianças entre o nascimento e 1 ano, tal como entre 0 e 6 meses, com a idade de dose inicial) ou pacientes idosos indivíduos (tal como um indivíduo superior a 65 anos de idade). Será apreciado que a escolha de adjuvante pode ser diferente nas diferentes aplicações e o adjuvante e a concentração óptima para cada situação podem ser determinadas empiricamente por aqueles versados na técnica.

[00503] Em determinadas modalidades, as composições farmacêuticas são as vacinas que reduzem ou previnem a infecção com RSV. Em algumas modalidades, as composições imunogênicas são vacinas que impedem ou reduzem a uma resposta patológica após a infecção com RSV. Opcionalmente, as composições farmacêuticas que contêm o antígeno descrito PreF, vetor virai ou molécula de ácido nucleico são formulados com pelo menos um antígeno adicional de um organismo patogênico com exceção do RSV. Por exemplo, o organismo patogênico pode ser um patógeno do trato respiratório (tais como um vírus ou bactéria que causa uma infecção respiratória). Em determinados casos, a composição farmacêutica contém um antígeno derivado de um vírus patogênico que não seja RSV, tal como um vírus que cause uma infecção do trato respiratório, tais como a gripe ou parainfluenza. Em outras modalidades, os antígenos adicionais são selecionados para facilitar a administração ou reduzir o número de inoculações necessárias para proteger um indivíduo contra uma pluralidade de organismos infecciosos. Por exemplo, o antígeno pode ser derivada de qualquer um ou mais de gripe, hepatite B, difteria, tétano, tosse convulsa, Haemophilus influenza, poliovírus, Streptococcus ou pneumococo, entre outros.

F. Métodos de Tratamento

[00504] Em várias modalidades, os antígenos descritos PreF ou um ácido nucleico ou um vetor que codifica a viral ou que expressam um antígeno incluindo PreF são usados para induzir a uma resposta imune para RSV em um indivíduo. Assim, em várias modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição imunogênica, incluindo um ou mais dos antígenos PreF descritos ou um ácido nucleico ou um vetor que codifica a viral, que expressam ou que inclui o antígeno, podem ser administrados a um indivíduo, de modo a gerar uma resposta imune para RSV.

[00505] De acordo com a presente descrição, uma quantidade profilaticamente ou terapeuticamente eficaz de uma composição imunogênica, incluindo um antígeno PreF ou um ácido nucleico ou um vetor que codifica a viral, que expressam ou que inclui o antígeno, é administrado a um indivíduo em necessidade de tal tratamento de uma tempo e sob condições suficientes para prevenir, inibir e/ou melhorar uma infecção por RSV em um indivíduo. A composição imunogênica é administrada em uma quantidade suficiente para desencadear uma resposta imune contra um antígeno de RSV, tal como a proteína F de RSV, no indivíduo.

[00506] Em algumas modalidades, a composição administrada ao indivíduo inclui (ou codifica) uma primeira proteína de F de RSV recombinante que é um subtipo de proteína A F de RSV estabilizado em uma conformação pré-fusão e uma proteína F segunda RSV recombinante que é um subtipo da proteína B F de RSV estabilizado em uma conformação pré-fusão. Em várias modalidades, a composição administrada ao indivíduo inclui uma mistura (tal como uma mistura a cerca de 1:1, 1:2, 2:1, 2:3, 3:2, 1:3, 3:1, 1:4, 4:1, 3:5, 5:3, 1:5, 5:1, 5:7, 7:5), de uma primeira proteína de F de RSV recombinante que é um subtipo de proteína A F de RSV estabilizado em uma conformação pré- fusão e uma segunda proteína F de RSV recombinante que é um subtipo da proteína F de RSV B estabilizado em uma conformação pré- fusão.

[00507] Em algumas modalidades a composição administrada ao indivíduo inclui uma primeira nanopartículas de proteínas, incluindo uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré- fusão por qualquer das substituições descritas aqui (tal como S155C, S290C e substituições S190F ou S155C, S290C, S190F e substituições V207L), em que a proteína F de RSV é estabilizado com base em um subtipo da proteína F de RSV, A e uma segunda nanopartícula de proteínas, incluindo uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão por qualquer das substituições descritas aqui (tal como substituições S155C, S290C e ou S155C S190F, S290C, S190F e substituições V207L), em que a proteína F de RSV é estabilizado com base em um subtipo da proteína F de RSV.

[00508] Em algumas modalidades a composição administrada ao indivíduo inclui uma primeira molécula de ácido nucleico (tal como um vetor de expressão) que codifica para uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão por qualquer das substituições descritas aqui (tal como S155C, S290C e substituições S190F ou S155C, S290C, S 190F e substituições V207L), em que a proteína F de RSV estabilizado é com base em um subtipo de proteína A F de RSV e uma segunda molécula de ácido nucleico (tal como um vetor de expressão) que inclui uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão por qualquer das substituições descritas aqui (tal como S155C, S290C e substituições ou S155C S190F, S290C, S190F e substituições V207L), em que a proteína F de RSV é estabilizada com base em um subtipo B proteína F de RSV.

[00509] Em algumas modalidades, uma composição incluindo nanopartículas ferritina incluindo a proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão por qualquer das substituições aqui (tal como S155C, S290C e substituições S190F ou S155C, S290C, S190F e substituições V207L) descritos é administrada a um indivíduo. Em algumas modalidades a composição administrada ao indivíduo inclui uma primeira nanopartículas ferritina incluindo uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré- fusão por qualquer das substituições descritas aqui (tal como S155C, S290C e substituições S190F ou S155C, S290C, S190F e substituições V207L), em que a proteína F de RSV estabilizado é com base em um subtipo de proteína A F de RSV e uma segunda nanopartícula ferritina incluindo uma proteína F de RSV recombinante estabilizada em uma conformação pré-fusão por qualquer das substituições descritas aqui (tal como S155C, S290C e substituições ou S155C S190F, S290C, S190F e substituições V207L), em que a proteína F de RSV é estabilizada com base em um subtipo da proteína F de RSV. B Os métodos de preparação de nanopartículas de ferritina incluindo um antígeno viral e a sua utilização para fins de imunização (por exemplo, para a imunização contra os antígenos da gripe) foram descritos na técnica (vide, por exemplo, Kanekiyo et al., Nature, 499: 102-106, 2013, aqui incorporada por referência na íntegra).

[00510] Em algumas modalidades, o indivíduo é selecionado para o tratamento que tem ou está em risco de desenvolver, uma infecção por RSV, por exemplo, devido a exposição ou a possibilidade de exposição ao RSV. Após a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz das composições terapêuticas descritas, o indivíduo pode ser monitorizado para a infecção por RSV, os sintomas associados com a infecção por RSV ou ambos. Porque quase todos os seres humanos são infectados com RSV com a idade de 3, toda a coorte de nascimento é incluída como uma população relevante para a imunização. Isso poderia ser feito, por exemplo, iniciar um regime de imunização a qualquer momento desde o nascimento até 6 meses de idade, a partir dos 6 meses de idade até 5 anos de idade, em mulheres grávidas (ou mulheres de idade criança de rolamento) para proteger seus bebês por transferência passiva de anticorpos, membros da família de recém- nascidos ou aqueles que ainda estão no útero e objetos a mais de 50 anos de idade.

[00511] Os indivíduos com maior risco de infecção por RSV com sintomas graves (por exemplo, exigindo hospitalização) incluem crianças com prematuridade, displasia broncopulmonar e cardiopatia congênita são mais suscetíveis à doença grave. Atopia ou uma história familiar de atopia também tem sido associada com a doença grave da infância. Durante a infância e na idade adulta, doença é mais suave, mas pode ser associada com a doença das vias aéreas inferiores e é geralmente complicada por sinusite. Aumentos de gravidade da doença em idosos institucionalizados (por exemplo, os seres humanos com mais de 65 anos de idade). A doença grave, também ocorre em pessoas com a doença da imunodeficiência combinada grave ou após transplante de medula óssea ou do pulmão. (vide, por exemplo, de Shay et al., JAMA, 282: 1440-6, 1999; Hall et al., N Engl J Med 2009; 360:. 588-598; Glezen et al., Am J Dis Child, 1986; 140 : 543-546; e Graham, Immunol Rev., 239: 149-166, 2011, cada um dos quais é aqui incorporado por referência). Assim, esses indivíduos podem ser selecionados para a administração dos antígenos PreF descritos ou um ácido nucleico ou um vetor que codifica a viral ou expressar um antígeno incluindo PreF.

[00512] Indivíduos típicos destinados para o tratamento com as composições e métodos da presente invenção incluem humanos, bem como primatas não humanos e outros animais, tais como gado. Para identificar indivíduos para profilaxia ou tratamento de acordo com os métodos da presente descrição, o rastreio métodos empregados para determinar fatores de risco associados com uma doença ou condição alvo ou suspeita ou para determinar o estado de uma doença ou condição existente em um indivíduo. Estes métodos de rastreio incluem, por exemplo, convencionais de processamento para determinar fatores de risco ambientais, familiares ou ocupacional e outras que podem ser associados com a doença ou condição alvo ou suspeita, bem como métodos de diagnóstico, tais como vários ELISA e outros métodos de imunoensaio, que estão disponíveis e bem conhecidos na técnica para detectar e/ou caracterizar a infecção por RSV. Estes e outros métodos de rotina permitem que o médico selecione a pacientes necessitados de terapia usando os métodos e as composições farmacêuticas da presente descrição. Uma composição imunogênica pode ser administrada como um programa de profilaxia ou tratamento independente ou como um acompanhamento, adjuvante ou coordenar regime de tratamento para outros tratamentos.

[00513] A composição imunogênica pode ser usada em protocolos de vacinação coordenar ou formulações combinatórias. Em determinadas modalidades, as composições imunogênicas e coordenar combinatórios empregam imunógenos protocolos de imunização ou formulações separadas, cada uma dirigida para induzir a uma resposta imune a um antígeno de RSV, tal como uma resposta imune à proteína F de RSV. Composições imunogênicas separadas que induzem a resposta imune ao antígeno de RSV pode ser combinado em uma composição imunogênica polivalente administrado a um indivíduo em uma única etapa de imunização ou podem ser administrados separadamente (em composições imunogênicas monovalentes) em um protocolo de imunização de coordenadas.

[00514] A administração das composições imunogênicas pode ser para qualquer finalidade terapêutica ou profiláctica. Quando fornecido profilaticamente, a composição imunogênica é fornecido antes de qualquer sintoma, por exemplo, antes da infecção. A administração profilática de composições imunogênicas serve para prevenir ou atenuar qualquer infecção subsequente. Quando fornecido terapeuticamente, a composição imunogênica é fornecido no ou após o aparecimento de um sintoma da doença ou infecção, por exemplo após o desenvolvimento de um sintoma de infecção por RSV ou após diagnóstico de infecção por RSV. A composição imunogênica pode assim ser proporcionada antes da exposição prevista para o RSV, de modo a atenuar a gravidade esperada, duração ou extensão de uma infecção e/ou sintomas de doenças associadas, após exposição ou suspeita de exposição ao vírus ou após o início real de uma infecção.

[00515] Administração induz uma resposta imune suficiente para tratar ou prevenir a infecção patogênica, por exemplo, para inibir a infecção e/ou reduzir os sinais e/ou sintomas da infecção. As quantidades eficazes para esta utilização dependerão da gravidade da doença, o estado geral de saúde do indivíduo e a robustez do sistema imunitário do indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz das composições imunogênicas descritos é a que proporciona alivio subjetivo, quer de um sintoma ou uma melhoria objetivamente identificável como observado pelo médico ou outro observador qualificado.

[00516] Para fins profiláticos e terapêuticos, a composição imunogênica pode ser administrada ao indivíduo em uma distribuição única de bolus, através da distribuição contínua (por exemplo, transdérmica contínua, mucosal ou intravenosa) ao longo de um período de tempo prolongado ou em um protocolo de administração repetida (por exemplo, por, um protocolo de administração repetida a cada hora, diariamente ou similar). A dosagem terapeuticamente eficaz da composição imunogênica pode ser fornecida como doses repetidas dentro de um regime de tratamento ou profilaxia prolongada que irão produzir resultados clinicamente significativos para aliviar um ou mais sintomas ou condições detectáveis associados com uma doença ou condição como aqui estabelecido alvo. A determinação das dosagens eficazes neste contexto é tipicamente com base em estudos de modelos animais seguiram-se por ensaios clínicos em humanos e é guiada por protocolos de administração que reduzem de forma significativa a ocorrência ou severidade dos sintomas da doença ou condições orientadas no assunto. Modelos adequados a este respeito incluem, por exemplo, murino, rato, suíno, felino, furão, primata não humano e outros assuntos de modelo animal aceite conhecidos na técnica. Alternativamente, as dosagens eficazes podem ser determinadas usando modelos in vitro (por exemplo, ensaios, imunológicas e histopatológicas). Usando tais modelos, apenas cálculos e ajustamentos normais são necessários para determinar uma concentração apropriada e a dose a administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição imunogênica (por exemplo, quantidades que são eficazes para desencadear uma resposta imune desejada ou aliviar um ou mais sintomas de uma doença alvo). Em modalidades alternativas, uma quantidade eficaz ou dose eficaz da composição imunogênica pode inibir ou aumentar simplesmente um ou mais selecionados atividades biológicas correlacionadas com uma doença ou condição, como aqui estabelecido, tanto para fins terapêuticos ou diagnóstico.

[00517] Em uma modalidade, um regime de imunização apropriado inclui, pelo menos, três inoculações separadas com uma ou mais composições imunogênicas, com uma segunda inoculação ser administradas mais do que cerca de dois, cerca de três a oito ou cerca de quatro, semanas após a primeira inoculação. Geralmente, a terceira inoculação é administrada vários meses após a segunda inoculação e em modalidades específicas, mais do que cerca de cinco meses após a primeira inoculação, mais do que cerca de seis meses a cerca de dois anos após a primeira inoculação ou cerca de oito meses a cerca de um ano após a primeira inoculação. Inoculações periódicas para além do terceiro também são desejáveis para melhorar o indivíduo "memória imunológica". A adequação dos parâmetros escolhidos de vacinação, por exemplo, formulação, da dose, do regime e assim por diante, pode ser determinado tomando ali quotas de soro a partir do indivíduo e ensaiando os títulos de anticorpos durante o curso do programa de imunização. Se tal monitorização indica que a vacinação é subótima, o indivíduo pode ser um reforço com uma dose adicional da composição imunogênica e os parâmetros de vacinação pode ser modificada de uma forma esperada para potenciar a resposta imune. É contemplado que possa haver diversas aumenta e que cada impulso pode incluir o mesmo ou um diferente antígeno PreF.

[00518] Para protocolos de reforço, o primeiro pode ser administrada como uma dose única ou doses múltiplas, por exemplo duas doses, três doses, quatro doses, cinco doses, seis ou mais doses podem ser administradas a um indivíduo ao longo de dias, semanas ou meses. O impulso pode ser administrado como uma dose única ou doses múltiplas, por exemplo, duas a seis doses ou mais pode ser administrado a um indivíduo ao longo de um dia, uma semana ou mês. Várias aumenta também pode ser dada, por exemplo, um a cinco ou mais. Diferentes dosagens podem ser usadas em uma série de inoculações sequenciais. Por exemplo, uma dose relativamente grande em uma inoculação primária e, em seguida, um impulso com doses relativamente menores. A resposta imune contra a superfície antigênico selecionado pode ser gerada por uma ou mais inoculações de um indivíduo com uma composição imunogênica descrita aqui.

[00519] Em algumas modalidades, a composição privilegiada administrada ao indivíduo inclui (ou codifica) uma proteína recombinante F de RSV que é um subtipo de proteína A F de RSV estabilizado em uma conformação pré-fusão e a composição de impulso administrado ao indivíduo inclui (ou codifica) uma recombinante a proteína F de RSV que é um subtipo da proteína F de RSV B estabilizado em uma conformação pré-fusão. Em algumas modalidades, a composição privilegiada administrada ao indivíduo inclui (ou codifica) uma proteína recombinante F de RSV que é um subtipo da proteína B F de RSV estabilizado em uma conformação pré-fusão e a composição de impulso administrado ao indivíduo inclui (ou codifica) uma recombinante a proteína F de RSV que é um subtipo da proteína F de RSV Um estabilizado em uma conformação pré-fusão.

[00520] Em algumas modalidades, os métodos incluem a administração de uma composição incluindo um subtipo recombinante proteína A F de RSV estabilizado em uma conformação pré-fusão e um subtipo recombinante proteína B F de RSV estabilizado em uma conformação pré-fusão uma vez ou mais do que um (por exemplo, em um de reforço Protocolo) como uma série de injeções.

[00521] Em algumas modalidades, os métodos incluem a administração de uma composição incluindo uma nanopartícula ferritina incluindo um subtipo recombinante proteína A F de RSV estabilizado em uma conformação pré-fusão e ferritina nanopartículas incluindo um subtipo recombinante proteína B F de RSV estabilizado em uma conformação pré-fusão, uma vez ou mais do que um (tal como em um protocolo de reforço) como uma série de injeções.

[00522] Em algumas modalidades, os métodos incluem a administração de uma composição incluindo um vetor que codifica um subtipo de proteínas recombinantes Um F de RSV estabilizado em uma conformação pré-fusão e vetor que codifica um subtipo de proteínas recombinantes B F de RSV estabilizado em uma conformação pré- fusão, uma vez ou mais do que um (tais como em um protocolo de reforço) como uma série de injeções. Em algumas modalidades, o método pode ainda incluir a administração de uma composição incluindo subtipo recombinante proteína A F de RSV estabilizado em uma conformação pré-fusão e subtipo recombinante proteína B F de RSV estabilizado em uma conformação pré-fusão e/ou uma composição incluindo uma nanopartícula ferritina incluindo um recombinante subtipo A proteína F de RSV estabilizado em uma conformação pré-fusão e nanopartículas ferritina incluindo um subtipo B recombinante da proteína F de RSV estabilizado em uma conformação pré-fusão.

[00523] Em algumas modalidades, os métodos incluem a administração de uma composição incluindo uma molécula de ácido nucleico que codifica um subtipo de proteínas recombinantes Um F de RSV estabilizado em uma conformação pré-fusão e a molécula de ácido nucleico que codifica um subtipo de proteínas recombinantes B F de RSV estabilizado em uma conformação pré-fusão uma vez ou mais do que ona (tal como em um protocolo de reforço) como uma série de injeções. Em algumas modalidades, o método pode ainda incluir a administração de uma composição incluindo subtipo recombinante proteína A F de RSV estabilizado em uma conformação pré-fusão e subtipo recombinante proteína B F de RSV estabilizado em uma conformação pré-fusão e/ou uma composição incluindo uma nanopartícula ferritina incluindo um recombinante subtipo A proteína F de RSV estabilizado em uma conformação pré-fusão e nanopartículas ferritina incluindo um subtipo B recombinante da proteína F de RSV estabilizado em uma conformação pré-fusão.

[00524] Em algumas modalidades, o primeiro e impulsionar composições administradas ao indivíduo incluem, cada um (ou codificar) uma primeira proteína de F de RSV recombinante que é um subtipo de proteína A F de RSV estabilizado em uma conformação pré- fusão e uma proteína F segunda RSV recombinante que é um subtipo B proteína F de RSV estabilizado em uma conformação pré-fusão. Em várias modalidades, o primeiro e impulsionar composições administradas ao indivíduo incluem, cada um (ou codificar) uma mistura (tal como uma mistura a cerca de 1:1, 1:2, 2:1, 2:3, 3:2, 1:3, 3:1, 1:4, 4:1, 3:5, 5:3, 1:5, 5:1, 5:7, 7:5) de uma proteína F primeira RSV recombinante que é um subtipo A de proteína F de RSV estabilizado em uma conformação pré-fusão e uma segunda proteína F de RSV recombinante que é um subtipo da proteína F de RSV B estabilizado em uma conformação pré-fusão.

[00525] Em algumas modalidades as composições de primeira linha e impulsionar administrado ao indivíduo incluem, cada proteína F de RSV recombinante que é um subtipo de proteína A F de RSV estabilizado em uma conformação pré-fusão por qualquer das substituições descritas aqui (tal como S 155C, S290C e S 190F substituições ou S 155C, S290C, S 190F e substituições V207L) e uma proteína F segunda RSV recombinante que é um subtipo da proteína B F de RSV estabilizado em uma conformação pré-fusão por qualquer das substituições descritas aqui (tal como S155C, S290C e substituições S190F ou substituições S155C, S290C, S190F e V207L).

[00526] Em algumas modalidades as composições de primeira linha e impulsionar administrado ao indivíduo cada incluem uma molécula de ácido nucleico que codifica para uma proteína F de RSV recombinante que é um subtipo de proteína A F de RSV estabilizado em uma conformação pré-fusão por qualquer das substituições descritas aqui (tal como S155C, S290C e substituições S190F ou S155C, S290C, S190F e substituições V207L) e uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína recombinante de F de RSV que é um subtipo da proteína B F de RSV estabilizado em uma conformação pré-fusão por qualquer das substituições descritas aqui (tal como S155C, S290C e S190F substituições ou S155C, S290C, S190F e substituições V207L).

[00527] Em algumas modalidades as composições de primeira linha e impulsionar administrado ao indivíduo cada incluem um primeiro nanopartículas de proteína (tal como uma nanopartícula ferritina) incluindo uma proteína F de RSV recombinante que é um subtipo de proteína A F de RSV estabilizado em uma conformação pré-fusão por qualquer das substituições descritas aqui (tal como S155C, S290C e substituições S190F ou S155C, S290C, S190F e substituições V207L) e uma segunda nanopartícula proteína (tal como uma nanopartícula ferritina) incluindo uma proteína F de RSV recombinante que é um subtipo da proteína B F de RSV estabilizado em uma conformação pré- fusão por qualquer das substituições descritas aqui (tal como S155C, S290C e substituições ou S155C S190F, S290C, S190F e substituições V207L).

[00528] Em algumas modalidades as composições de primeira linha e impulsionar administrado ao indivíduo incluem, cada um vetor incluindo ou que codifica para uma proteína F de RSV recombinante que é um subtipo de proteína A F de RSV estabilizado em uma conformação pré-fusão por qualquer das substituições descritas aqui (tal como S155C, S290C e substituições S190F ou S155C, S290C, S190F e substituições V207L) e um vetor incluindo ou que codificam uma proteína de RSV recombinante F que é um subtipo da proteína B F de RSV estabilizado em uma conformação pré-fusão por qualquer das substituições descritas aqui (tal como S155C, S290C e S190F substituições ou S155C, S290C, S190F e substituições V207L).

[00529] Em algumas modalidades a composição privilegiada administrado ao indivíduo inclui uma primeira molécula de ácido nucleico (tal como um vetor de expressão de DNA de plasmídeo) que codifica para uma proteína F de RSV recombinante que é um subtipo de proteína A F de RSV estabilizado em uma conformação pré-fusão por qualquer das substituições descritas aqui (tal como S155C, S290C e substituições S190F ou S155C, S290C, S190F e substituições V207L) e uma segunda molécula de ácido nucleico (tal como um vetor de expressão) que inclui uma proteína F de RSV recombinante que é um subtipo da proteína B F de RSV estabilizado em uma conformação pré- fusão por qualquer das substituições descritas aqui (tal como S155C, S290C e substituições S190F ou S155C, S290C, S190F e substituições V207L) e a composição de impulso administrado ao indivíduo inclui uma primeira nanopartículas de proteína (tal como uma nanopartícula ferritina) incluindo uma proteína F de RSV recombinante que é um subtipo de proteína A F de RSV estabilizado em uma conformação pré- fusão por qualquer das substituições descritas aqui (tal como S155C, S290C e substituições S190F ou S155C, S290C, S190F e substituições V207L ) e uma segunda nanopartícula proteína (tal como uma nanopartícula ferritina) incluindo uma proteína F de RSV recombinante que é um subtipo da proteína B F de RSV estabilizado em uma conformação pré-fusão por qualquer das substituições descritas aqui (tal como S155C, S290C e substituições S190F ou substituições de S155C, S290C, S190F e V207L).

[00530] Os protocolos de imunização, usando um plasmídeo de DNA nobre e ferritina impulso nanopartículas são conhecidos do vulgar perito na técnica (vide, por exemplo, Wei et al., Science, 329 (5995): 1060-4, 2010, o qual é aqui incorporado por referência aqui na íntegra).

[00531] A dosagem real da composição imunogênica irá variar de acordo com fatores tais como a indicação de doença e estado particular do indivíduo (por exemplo, do indivíduo a idade, tamanho, ginástica, extensão dos sintomas, fatores de susceptibilidade e assim por diante), tempo e via de administração, outros fármacos ou tratamentos a serem administrados ao mesmo tempo, bem como a farmacologia específica da composição imunogênica para desencadear a atividade desejada ou resposta biológica no assunto. Os regimes de dosagem podem ser ajustados para proporcionar uma resposta profilática ou terapêutica óptima. Como descrito acima na listagem renúncia a termos, uma quantidade eficaz é também aquela em que quaisquer efeitos secundários tóxicos ou prejudiciais do antígeno descritas e/ou outro agente biologicamente ativo é compensado em termos clínicos pelos efeitos terapeuticamente benéficos.

[00532] Uma gama não limitativa para uma quantidade terapeuticamente eficaz dos antígenos PreF descritos dentro dos métodos e composições imunogênicas da presente descrição é de cerca de 0,0001 mg/kg de peso corporal a cerca de 10 mg/kg de peso corporal, tal como de cerca de 0,01 mg/kg, sobre 0,02 mg/kg, cerca de 0,03 mg/kg, cerca de 0,04 mg/kg, cerca de 0,05 mg/kg, cerca de 0,06 mg/kg, cerca de 0,07 mg/kg, cerca de 0,08 mg/kg, cerca de 0,09 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg, cerca de 0,2 mg/kg, cerca de 0,3 mg/kg, cerca de 0,4 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 0,6 mg/kg, cerca de 0,7 mg/kg, cerca de 0,8 mg/kg, cerca de 0,9 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 1,5 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 2,5 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de 4 mg/kg, cerca de 5 mg/kg ou cerca de 10 mg/kg, por exemplo 0,01 mg/kg a cerca de 1 mg/kg de peso corporal, cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 5 mg/kg de peso corporal, cerca de 0,2 mg/kg a cerca de 2 mg/kg de peso corporal ou cerca de 1,0 mg/kg a cerca de 10 mg/kg de peso corporal.

[00533] Em algumas modalidades, a dosagem uma quantidade de um antígeno PreF descrita ou um ácido nucleico ou um vetor que codifica a viral, que expressam ou que inclui um antígeno inclui PreF para crianças, adultos, idosos, etc., tal como de cerca de 1-300 μg, por exemplo, uma dosagem de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou cerca de 300 μg de antígenos PreF ou um ácido nucleico ou um vetor que codifica a viral ou que expressam um antígeno incluindo PreF. A dosagem e o número de doses dependerá da configuração, por exemplo, em um adulto ou qualquer um preparado por infecção por RSV ou antes da imunização, uma única dose pode ser suficiente uma dose de reforço. Em lactentes, em alguns exemplos, pelo menos, duas doses seria dada, por exemplo, pelo menos três doses. Em algumas modalidades, um aumento anual é dada aos idosos (por exemplo, os seres humanos acima de 60 anos), uma vez por ano, por exemplo, junto com a vacina da gripe anual. Os métodos para a preparação de composições administráveis serão conhecidos ou evidentes para aqueles versados na técnica e são descritos em mais pormenor em publicações como Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pensilvânia, 1995.

[00534] A dosagem pode ser variada pelo médico assistente para manter uma concentração desejada em um sítio alvo (por exemplo, a circulação sistêmica). Concentrações mais elevadas ou mais baixas podem ser selecionadas com base no modo de distribuição, por exemplo, transepidérmica, retal, bucal, pulmonar ou a administração intranasal contra a administração intravenosa ou subcutânea. A dosagem também pode ser ajustada com base na taxa de liberação da formulação administrada, por exemplo, de um spray em pó contra intrapulmonar, oral, liberação sustentada contra formulações de distribuição transdérmica de partículas ou injetados e assim por diante. Para conseguir o mesmo nível de concentração no soro, por exemplo, as partículas de liberação retardada com uma taxa de libertação de 5 nanomolar (em condições padrão) seria administrada a cerca de duas vezes a dose de partículas com uma taxa de liberação de 10 nanomolar.

[00535] Após a administração de uma composição imunogênica do presente relatório descritivo, o sistema imunitário do indivíduo normalmente responde à composição imunogênica através da produção de anticorpos específicos para a conformação da proteína pré-fusão RS VF. Tal resposta significa que uma dose eficaz da composição imunogênica foi entregue.

[00536] Em várias modalidades, pode ser vantajoso administrar as composições imunogênicas descritos aqui com outros agentes, tais como proteínas, peptídeos, anticorpos e outros agentes antivirais, tais como agentes anti-RSV. Exemplos não limitativos de agentes anti-RSV incluem o palivizumabe anticorpo monoclonal (SYNAGIS®; MedImmune, Inc.) e a pequena molécula de fármaco antiviral de ribavirina (fabricado por muitas fontes, por exemplo, Warrick Pharmaceuticals, Inc.). Em determinadas modalidades, as composições imunogênicas são administradas concomitantemente com outros agentes anti-RSV. Em determinadas modalidades, as composições imunogênicas são administradas sequencialmente com outros agentes terapêuticos anti-RSV, tal como antes ou depois do outro agente. Um perito na técnica saberia que a administração sequencial pode significar imediatamente a seguir ou após um período adequado de tempo, tal como horas, dias, semanas, meses ou mesmo anos mais tarde.

[00537] Em modalidades adicionais, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica incluindo um ácido nucleico que codifica um antígeno PreF descrito é administrado a um indivíduo, de modo a gerar uma resposta imune. Em um exemplo específico, não limitativo, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ácido nucleico que codifica um antígeno descrito é administrado a um indivíduo para tratar ou prevenir ou inibir a infecção por RSV.

[00538] Uma abordagem para a administração de ácidos nucleicos é a vacinação direta com DNA de plasmídeo, tal como com um plasmídeo de expressão de mamífero. Como descrito acima, a sequência de nucleotídeos que codifica um antígeno descrito pode ser colocado sob o controle de um promotor para aumentar a expressão da molécula. Outra abordagem seria usar RNA (tais como a distribuição de vacinas não virais de RNA auto-amplificação; vide, por exemplo, Geall et al., Proc Natl Acad Sci USA, 109: 14.604-9, 2012.

[00539] A imunização por construtos de ácido nucleico é bem conhecida na técnica e ensinada, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos No 5.643.578 (que descreve métodos de imunização de vertebrados através da introdução de DNA que codifica um antígeno para induzir a uma desejada mediada por células ou uma resposta humoral) e Patente dos Estados Unidos No 5.593.972 e Patente dos Estados Unidos No 5.817.637 (que descrevem a ligação operacional de uma sequência de ácido nucleico que codifica para um antígeno a sequências de regulação que permitem a expressão). A Patente dos Estados Unidos No 5.880.103 descreve vários métodos para a distribuição de ácidos nucleicos que codificam peptídeos imunogênicos ou outros antígenos a um organismo. Os métodos incluem distribuição lipossômica dos ácidos nucleicos (ou dos próprios peptídeos sintéticos) e construções de imunoestimulantes ou ISCOMS™, carregado negativamente estruturas tipo gaiola de 30-40 nm de tamanho formadas espontaneamente sobre o colesterol e mistura o Quil A™ (saponina). A imunidade protetora foi gerada em uma variedade de modelos experimentais de infecção, incluindo a toxoplasmose e tumores induzidos por vírus de Epstein-Barr, usando ISCOMS™ como o veículo de distribuição de antígenos (Mowat e Donachie, Immunol Today 12:. 383, 1991). As doses de antígeno tão baixo como 1 μg encapsulado em ISCOMS ™ foram encontrados para produzir Classe I mediada por respostas de CTL (Takahashi et al., Nature 344: 873, 1990).

[00540] Em outra abordagem para a utilização de ácidos nucleicos para a imunização, um antígeno descrito pode também ser expresso por hospedeiros virais atenuados ou vetores ou vetores bacterianos. O vírus recombinante da vacina, adenovírus, vírus adenoassociado (AAV), vírus do herpes, retrovírus, citomegalovírus ou outros vetores virais podem ser usados para expressar o peptídeo ou proteína, provocando desse modo uma resposta de CTL. Por exemplo, vetores de varíola e métodos úteis nos protocolos de imunização, estão descritos na Patente dos Estados Unidos No 4.722.848. BCG (Bacilo de Calmette-Guerin) fornece um outro vetor para a expressão dos peptídeos (vide Stover, Nature 351: 456-460, 1991).

[00541] Em uma modalidade, um ácido nucleico que codifica um antígeno PreF descrito é introduzido diretamente nas células. Por exemplo, o ácido nucleico pode ser carregado em microesferas de ouro através de métodos padrão e introduzido na pele por um dispositivo tal como é Bio-Rad Helios Gene Gun™. Os ácidos nucleicos pode ser "nu", que consiste em plasmídeos sob o controle de um promotor forte. Tipicamente, o DNA é injetada no músculo, embora também possa ser injetado diretamente em outros sítios, incluindo tecidos em proximidade com metástases. As dosagens para injeção são normalmente cerca de 0,5 μg a cerca de 50 kg mg/kg e são tipicamente cerca de 0,005 mg/kg a cerca de 5 mg/kg (vide, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No 5.589.466).

[00542] Além dos métodos terapêuticos previstos acima, qualquer um dos antígenos PreF descritos podem ser usados para produzir reagentes de imunodiagnóstico específicas de antígenos, por exemplo, para a vigi1ância serológica. Reagentes de imunodiagnóstico podem ser concebidos a partir de qualquer um dos antígenos descritos aqui. Por exemplo, no caso dos antígenos descritos, a presença de anticorpos de soro contra RSV é monitorizada usando os antígenos isolados descritos aqui, de modo a detectar uma infecção de RSV e/ou a presença de anticorpos que se ligam especificamente à conformação pré-fusão de RSV proteína F.

[00543] Geralmente, o método inclui o contato de uma amostra de um indivíduo, tais como, mas não limitado a um sangue, soro, plasma, urina ou esputo amostra do indivíduo com um ou mais do antígeno proteína F de RSV estabilizado em uma conformação pré-fusão descrito aqui e detectar a ligação de anticorpos na amostra para os imunógenos descritos. A ligação pode ser detectada através de quaisquer meios conhecidos para um perito na especialidade, incluindo a utilização de anticorpos secundários marcados que se ligam especificamente aos anticorpos a partir da amostra. Legendas incluem marcadores radioativos, marcadores enzimáticos e etiquetas fluorescentes.

[00544] Além disso, a detecção do anticorpo pré-fusão F de RSV de ligação também permite que a resposta do indivíduo, a imunização com o antígeno descrita a ser monitorizado. Em ainda outras modalidades, o título do anticorpo pré-fusão F de RSV anticorpos de ligação é determinada. A ligação pode ser detectada através de quaisquer meios conhecidos para um perito na especialidade, incluindo a utilização de anticorpos secundários marcados que se ligam especificamente aos anticorpos a partir da amostra. Legendas incluem marcadores radioativos, marcadores enzimáticos e etiquetas fluorescentes. Em outras modalidades, um imunógeno descrito é usado para isolar anticorpos presentes em uma amostra biológica ou indivíduo obtida de um indivíduo.

G. Kits

[00545] Os kits também são fornecidos. Por exemplo, kits para o tratamento ou prevenção de uma infecção por RSV em um indivíduo ou para detectar a presença de anticorpos específicos para a proteína F de RSV pré-fusão no soro de um indivíduo. Os kits incluem, tipicamente, um ou mais dos antígenos PreF ou um ácido nucleico ou um vetor que codifica a viral ou expressando incluindo o antígeno.

[00546] O kit pode incluir um recipiente e uma etiqueta ou folheto no ou associado com o recipiente. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente tipicamente contém uma composição incluindo um ou mais dos antígenos PreF descritos ou um ácido nucleico ou um vetor que codifica a viral ou expressando incluindo o antígeno, que é eficaz para o tratamento ou prevenção da infecção por RSV. Em várias modalidades, o recipiente pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco possuindo uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). A etiqueta ou folheto informativo indica que a composição é usada para tratar a condição em particular.

[00547] A etiqueta ou o folheto informativo ainda incluirá, tipicamente, instruções para uso de um antígeno PreF ou um ácido nucleico ou um vetor viral que codifica ou expressa o antígeno incluindo, por exemplo, um método de tratamento ou prevenção de uma infecção por RSV. O folheto inclui, tipicamente, instruções habitualmente incluídas nas embalagens comerciais de produtos terapêuticos que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, contraindicações e/ou advertências sobre o uso de tais produtos terapêuticos. Os materiais de instrução podem ser escritos, em formato eletrônico (tal como um disquete de computador ou CD) ou podem ser visuais (tais como arquivos de vídeo). Os kits podem também incluir componentes adicionais para facilitar a aplicação particular para a qual foi concebido o kit. Os kits podem incluir, adicionalmente, tampões e outros reagentes usados rotineiramente para a prática de um método em particular. Tais kits e conteúdos adequados são bem conhecidos daqueles versados na técnica.

H. Algumas modalidades

[00548] Modalidades adicionais estão descritos na seção H nas páginas 135-158 do Pedido Provisória dos Estados Unidos N° 61/863.909, depositado em 8 de Agosto de 2013, o qual é especificamente incorporada aqui por referência na íntegra.

[00549] Cláusula 1. Um imunógeno isolado, compreendendo uma proteína F de RSV recombinante ou um fragmento do mesmo que compreende pelo menos uma substituição de aminoácidos em comparação com uma proteína F de RSV nativa que estabiliza a proteína F de RSV recombinante em uma conformação pré-fusão que se liga especificamente a um anticorpo específico para F de RSV pré- fusão e em que o anticorpo não faz se ligam especificamente a uma proteína F de RSV em uma conformação pós-fusão.

[00550] Cláusula 2. O imunógeno se liga especificamente ao anticorpo, após incubação a 20°C em solução salina tamponada com fosfato em pH fisiológico durante pelo menos 24 horas, na ausência do anticorpo.

[00551] Cláusula 3. O imunógeno da cláusula 1 ou 2, em que a conformação pré-fusão da proteína F de RSV recombinante ou fragmento do mesmo compreende um sítio antigênico 0 que se liga especificamente ao anticorpo específico pré-fusão e em que o sítio antigênico compreende resíduos 62-69 0 e 196-209 de uma sequência nativa da proteína F de RSV estabelecida como uma das SEQ ID Nos: 1-184.

[00552] Cláusula 4. O imunógeno de qualquer uma das cláusulas 13, em que o imunógeno se liga especificamente a um D25, um AM22, um 5C4 ou um anticorpo específico pré-fusão MPE8.

[00553] Cláusula 5. O imunógeno de qualquer uma das cláusulas 14, em que a proteína F de RSV nativa é um subtipo humano A, subtipo B humana ou proteína F de RSV bovino.

[00554] Cláusula 6. O imunógeno de qualquer uma das cláusulas 15, em que a proteína F de RSV recombinante ou fragmento do mesmo compreende um polipeptídeo F1 e F2 um polipeptídeo e opcionalmente não compreende um polipeptídeo ou uma sua porção pep27.

[00555] Cláusula 7. O imunógeno da cláusula 6, em que os polipeptídeos F1 e F2 compreendem F de RSV posições 62- 69 e 196209, respectivamente e em que: o polipeptídeo F2 compreende ou consiste em 8-84 resíduos de F de RSV posições 26-109; e os polipeptídeos F1 compreende ou consiste em 14-393 resíduos de F de RSV posições 137-529, em que as posições F de RSV correspondem à sequência de aminoácidos de um polipeptídeo F0 de referência apresentada como SEQ ID NO: 124.

[00556] Cláusula 8. O imunógeno da cláusula 7, em que o resíduo do C-terminal do polipeptídeo F2 e o resíduo N-terminal do polipeptídeo F1, respectivamente, compreendem F de RSV as posições 97 e 137; 97 e 145; 97 e 150; 102 e 144; 102 e 145; 102 e 146; 102 e 147; 103 e 144; 103 e 145; 103 e 146; 103 e 147; 104 e 144; 104 e 145; 104 e 146; 104 e 147; 105 e 144; 105 e 145; 105 e 146; 105 e 147; ou 105 e 150.

[00557] Cláusula 9. O imunógeno da cláusula 7, em que os polipeptídeos F2 e F1 compreendem ou consistem em RSV F posições respectivamente: 26-109 e 137-513; 26-107 e 137-513; 26-107 e 145513; 26-105 e 137-513; 26-105 e 145-513; 26-103 e 145-513; 26-109 e 137-529; 26-107 e 137-529; 26-107 e 145-529; 26-105 e 137-529; 26105 e 145-529; 26-103 e 145-529; 46-103 e 147-310; 46-104 e 146-310; 50-96 e 149-306; 51-103 e 146-307; 51-103 e 139-307; 50-105 e 146306; ou 53-97 e 148 para um dos 305-320.

[00558] Cláusula 10. O imunógeno de qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a proteína F de RSV recombinante compreende ou consiste de um polipeptídeo de F2 e um polipeptídeo F1 compreendendo sequências de aminoácidos pelo menos 80% idênticas aos aminoácidos 26-103 e 145-310, respectivamente, de uma sequência nativa da proteína F de RSV apresentada como qualquer uma de SEQ ID Nos: 1-184.

[00559] Cláusula 11. O imunógeno de qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a proteína F de RSV recombinante compreende ou consiste de um polipeptídeo de F2 e um polipeptídeo F1 compreendendo sequências de aminoácidos pelo menos 80% idênticas aos aminoácidos 26-103 e 145-310, respectivamente, da SEQ ID NO: 124.

[00560] Cláusula 12. O imunógeno de qualquer uma das cláusulas precedentes, em que a proteína F de RSV recombinante compreende ou é constituído por um polipeptídeo de F2 e um polipeptídeo F1 compreendendo sequências de aminoácido, pelo menos 80% idênticas aos aminoácidos 26-103 e 145-513, respectivamente, de SEQ ID NO: 124.

[00561] Cláusula 13. O imunógeno de qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a proteína F de RSV recombinante compreende ou consiste de um polipeptídeo de F2 e um polipeptídeo F1 compreendendo sequências de aminoácidos pelo menos 80% idênticas aos aminoácidos 26-103 e 145-529, respectivamente, da SEQ ID NO: 124.

[00562] Cláusula 14. O imunógeno de qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a proteína F de RSV recombinante compreende ou consiste de um polipeptídeo de F2 e um polipeptídeo F1 compreendendo sequências de aminoácidos pelo menos 80% idênticas aos aminoácidos 26-103 e 145-551, respectivamente, da SEQ ID NO: 124.

[00563] Cláusula 15. O imunógeno de qualquer uma das cláusulas precedentes, em que a proteína F de RSV recombinante é uma proteína de cadeia simples F de RSV e a F2 e F1 polipeptídeos estão ligados por um ligante peptídeo heterólogo ou estão diretamente ligados.

[00564] Cláusula 16. O imunógeno da cláusula 15, em que a posição 105 do polipeptídeo F2 está ligado à posição 145 do polipeptídeo F1 através de um ligante Gly-Ser; ou na posição 103 do polipeptídeo F2 está diretamente ligado à posição 145 do polipeptídeo F1.

[00565] Cláusula 17. O imunógeno do artigo 16 ou a cláusula 16, em que o peptídeo heterólogo ligante compreende a sequência de aminoácidos apresentada como uma das SEQ ID NOs: 356-365 ou 1443-1453 ou é um ligante de G, S, GG, GS, SG, GGG ou GSG.

[00566] Cláusula 18. O imunógeno isolado de qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a proteína F RSV recombinante é estabilizada na conformação de proteína RSV F pré-fusão por: (a) uma primeira ligação de dissulfureto entre um par de cisteínas; (b) uma substituição de aminoácidos de preenchimento de cavidade; (c) a substituição de aminoácido mudança de embalagem; (d) um sítio de glicosilação ligada a N; (e) uma combinação de dois ou mais de (a) - (d); ou (f) uma combinação de (a) e (b).

[00567] Cláusula 19. O imunógeno isolado da cláusula 18, em que em que o par de cisteínas compreende uma primeira cisteína e uma segunda cisteína e em que: a primeira cisteína e a segunda cisteína estão em posições 137-216 do polipeptídeo F1; a primeira cisteína e a segunda cisteína estão em posições 461-513 do polipeptídeo F1; ou a primeira cisteína e a segunda cisteína estão em posições 137-216 e 461-513, respectivamente, do polipeptídeo F1; e em que as posições de aminoácidos corresponde à sequência de aminoácidos de um polipeptídeo F0 de referência apresentada como SEQ ID NO: 124.

[00568] Cláusula 20. O imunógeno da cláusula 18, em que a primeira cisteína é introduzida por substituição de aminoácidos em uma das posições 137-216 F de RSV e a segunda cisteína é introduzida por substituição de aminoácidos em uma das posições 271-460 F de RSV.

[00569] Cláusula 21. O imunógeno da cláusula 19 ou a cláusula 20, em que o par de cisteínas compreende uma primeira cisteína e uma segunda cisteína, compreendendo cada carbono e um carbono Cα e em que: (a) a primeira cisteína é introduzida por substituição de aminoácidos em uma das posições 137-216 F de RSV ou 461- 513 e a segunda cisteína é introduzida por substituição de aminoácidos em uma das posições 26-61 F de RSV, 77-97 ou 271-460; e (b) o carbono Cα da posição da primeira cisteína é de 2,08,0 angstroms do carbono Cα da posição da segunda cisteína e/ou o carbono C da posição da primeira cisteína é de 2.0-5.5 angstroms do carbono C da posição da segunda cisteína usando um rotômero ideal para cada carbono de C, na estrutura tridimensional definido pelas coordenadas estruturais fornecidos na Tabela 1.

[00570] Cláusula 22. O imunógeno da cláusula 19 ou a cláusula 20, em que o par de cisteínas compreende uma primeira cisteína e uma segunda cisteína, compreendendo cada carbono e um carbono Cα e em que: (a) a primeira cisteína e a segunda cisteína são introduzidas por substituição de aminoácidos em posições 137-216 F de RSV ou F de RSV as posições 461-513; ou a primeira cisteína é introduzida por substituição de aminoácidos em posições 137-216 F de RSV e a segunda cisteína é introduzida por substituição de aminoácidos em posições 461-513 F de RSV; e (b) o carbono Cα da posição da primeira cisteína é de 2,08,0 angstroms do carbono Cα da posição da segunda cisteína e/ou o carbono C da posição da primeira cisteína é de 2.0-5.5 angstroms do carbono C da posição da segunda cisteína usando um rotômero ideal para cada carbono de C, na estrutura tridimensional definido pelas coordenadas estruturais fornecidos na Tabela 1.

[00571] Cláusula 23. O imunógeno da cláusula 18, em que a ligação de dissulfureto compreende um intra-protômero ou uma ligação de dissulfureto interprotômero.

[00572] Cláusula 24. O imunógeno da cláusula 23, em que a ligação de dissulfureto não natural compreende: a ligação de dissulfureto intra-protômero entre RSV F posições 155 e 290; 151 e 288; 137 e 337; 397 e 487; 138 e 353; 341 e 352; 403 e 420; 319 e 413; 401 e 417; 381 e 388; 320 e 415; 319 e 415; 331 e 401; 320 e 335; 406 e 413; 381 e 391; 357 e 371; 403 e 417; 321 e 334; 338 e 394; 288 e 300; 60 e 194; 33 e 469; 54 e 154; 59 e 192; 46 e 311; 48 e 308; ou 30 e 410; a ligação de dissulfureto interprotômero entre RSV F posições 400 e 489; 144 e 406; 153 e 461; 149 e 458; 143 e 404; 346 e 454; 399 e 494; 146 e 407; 374 e 454; 369 e 455; 402 e 141; 74 e 218; 183 e 428 e a proteína F de RSV recombinante compreende uma inserção G entre as posições 183 e 182/183; 428 e a proteína F de RSV recombinante compreende uma inserção entre as posições C 427/428; 145 e 460 e a proteína F de RSV recombinante compreende uma inserção entre as posições de AA 146/147; 183 e 423 e a proteína F de RSV recombinante compreende uma inserção entre as posições AAA 182/183; ou 330 e 430 e a proteína F de RSV recombinante compreende uma inserção entre as posições CAA 329/330; a ligação de dissulfureto intra-protômero entre as posições 155 e 290 e em que a proteína F de RSV recombinante compreende ainda compreende uma ligação de dissulfureto não natural entre F de RSV as posições 74 e 218; 141 e 402; 146 e 460 e uma inserção entre as posições L 460/461; 345 e 454 e uma inserção entre as posições C 453/454; 374 e 454 e uma inserção entre as posições C 453/454; 239 e 279 e uma inserção entre as posições C 238/239; 330 e 493 e uma inserção entre as posições C 329/330; 183 e 428 e uma inserção entre as posições L 182/183; ou 183 e 428 e uma inserção entre as posições C 427/428.

[00573] Cláusula 25. O imunógeno da cláusula 23, em que a proteína F de RSV recombinante compreende: (c) ligação de dissulfureto intra-protômero e um ou mais dos seguintes conjuntos de substituições: S155C e S290C; G151C e I288C; F137C e T337C; T397C e E487C; L138C e P353C; W341C e F352C; S403C e T420C; S319C e I413C; D401C e Y417C; L381C e N388C; P320C e S415C; S319C e S415C; N331C e D401C; P320C e T335C; V406C e I413C; L381C e Y391C; T357C e N371C; S403C e Y417C; L321C e L334C; D338C e K394C; I288C e V300C; E60C e D194C; Y33C e V469C; T54C e V154C; I59C e V192C; S46C e T311C; L48C e V308C; E30C e L410C; ou a ligação de dissulfureto interprotômero e um ou mais dos seguintes conjuntos de substituições: T400C e D489C; V144C e V406C; A153C e K461C; A149C e Y458C; G143C e S404C; S346C e N454C; K399C e Q494C; S146C e I407C; T374C e N454C; T369C e T455C; ou V402C e L141C; A74C e E218C; S155C, S290C, L141C e V402C; S155C, S290C, A74C e E218C; E N183C N428C e uma inserção entre as posições L 182/183; N183C e N427G e uma inserção entre as posições C 427/428; S145C e 460C; e uma inserção entre as posições de AA 146/147; N183C e K423C e uma inserção AAA entre as posições 182/183; A329C e S430C e uma inserção CAA entre as posições 329/330; ou a ligação de dissulfureto intra-protômero entre F de RSV as posições 155 e 290 e a ligação adicional de dissulfureto não natural, S155C e S290C substituições e um ou mais dos seguintes conjuntos de substituições de aminoácidos: S146C e N460C e uma inserção de G entre posiciona 460/461; N345C e N454G e uma inserção entre as posições C 453/454; T374C e N454G e uma inserção entre as posições C 453/454; S238G e Q279C e uma inserção entre as posições C 238/239; e S493C e uma inserção entre as posições C 329/330; N183C e N428C; e uma inserção entre as posições L 182/183; ou N183C e N427G; e uma inserção entre as posições C 427/428.

[00574] Cláusula 26. O imunógeno da cláusula 23, em que a proteína F de RSV recombinante compreende

[00575] um polipeptídeo F1 compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como resíduos 137-513 de uma das SEQ ID NOs: 185, 189, 201, 202, 205, 207, 209, 213, 244, 245, 247, 257-262, 264-275, 277-282, 284, 296-299, 302, 303, 338-340; ou

[00576] um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo F1 compreendendo as sequências de aminoácidos definidas por resíduos 26-109 e 137-513, respectivamente, de uma das SEQ ID NOs: 190, 211, 212, 243, 246, 263, 276, 283, 285,

[00577] em que as posições de aminoácidos corresponde à sequência de aminoácidos de um polipeptídeo F0 de referência apresentada como SEQ ID NO: 124.

[00578] Cláusula 27. O imunógeno da cláusula 23, em que a ligação de dissulfureto não natural compreende uma ligação de dissulfureto intra-protômero entre RSV F posições 155 e 290.

[00579] Cláusula 28. O imunógeno da cláusula 23, em que a proteína F de RSV recombinante compreende S155C e S290C substituições.

[00580] Cláusula 29. O imunógeno da cláusula 23, em que a proteína F de RSV recombinante compreende ou consiste de uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos 80% de identidade com os resíduos 26-109 e 137-513, os resíduos 26-103 e 145-513 ou resíduos 26-105 e 145-513, de SEQ ID NOs: 185.

[00581] Cláusula 30. O imunógeno de qualquer uma das cláusulas 18-29, compreendendo a substituição do ácido amino-cavidade preenchimento compreendendo uma substituição F, G, W, Y, H ou M na posição 190, posição 207 ou posições 190 e 207.

[00582] Cláusula 31. O imunógeno de qualquer uma das cláusulas 18-29, que compreende a substituição de aminoácidos que compreende o preenchimento da cavidade de um 190F; 190L; 190W; 190Y; 190H; 190M; 190F e 207L; 190F e 207F; 190F e 207W; 190L e 207L; 190L e 207F; 190L e 207W; 190W e 207L; 190W e 207F; 190W e 207W; 190Y e 207L; 190Y e 207F; 190Y e 207W; 190H e 207L; 190H e 207F; 190H e 207W; 190M e 207L; 190M e 207F; 190M e 207W; 207L e 220L; 296F e 190F; 220L e 153W; 203w; 83W e 260W; 58W e 298L; ou 87F e 90L.

[00583] Cláusula 32. O imunógeno da cláusula 31, em que a proteína F de RSV recombinante compreende as posições 137-513 de uma das SEQ ID NOs: 191, 193, 248 ou 196-197 ou 371-376 ou posições 26-109 e 137- 513 de uma das SEQ ID NOs: 192, 195 ou 194.

[00584] Cláusula 33. O imunógeno da cláusula 30, em que a proteína F de RSV recombinante compreende ou consiste de uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos 80% de identidade com os resíduos 26-109 e 137-513, os resíduos 26-103 e 145-513 ou resíduos 26-105 e 145-513, da SEQ ID NO: 191.

[00585] Cláusula 34. O imunógeno da cláusula 18, em que a proteína F de RSV recombinante compreende uma ligação de dissulfureto não natural entre as substituições de cisteína na posição 155 e 290 e uma cavidade de preenchimento substituição F, G, W, Y, H ou M na posição 190, posição 207 ou posições 190 e 207.

[00586] Cláusula 35. O imunógeno da cláusula 18, em que a proteína F de RSV recombinante compreende S155C, S290C e substituições S190F ou S155C, S290C, S190F e V207L substituições.

[00587] Cláusula 36. O imunógeno da cláusula 18, em que a proteína F de RSV recombinante compreende ou consiste de uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos 80% de identidade com os resíduos 26-109 e 137-513, respectivamente ou 26-103 e 145-513, respeitosamente, 26-105 ou 145-513 e, respeitosamente, de uma das SEQ ID NOs: 185 (DS, subtipo A), 371 (DS-Cav1, subtipo A), 372 (DSCav1, subtipo B), 373 (DSCav1, bovino), 374 (DS S190F, subtipo A), 375 (DS, S190F, subtipo B) ou 376 (DS, S190F, bovina).

[00588] Cláusula 37. O imunógeno da cláusula 18, em que a proteína F de RSV recombinante é estabilizado na proteína F de RSV na conformação pré-fusão por uma substituição de aminoácido reacondicionamento, em que o polipeptídeo F1compreende as substituições de aminoácidos estabelecidas em um dos seguintes: 64L, 79V, 86W, 193V, 195F, 198F, 199f, 203F, 207L, 214L e; 64L, 79L, 86W, 193V, 195F, 198F, 199f, 203F e 214L; 64W, 79V, 86W, 193V, 195F, 198F, 199f, 203F, 207L, 214L e; 79V, 86F, 193V, 195F, 198F, 199f, 203F, 207L, 214L e; 64V, 79V, 86W, 193V, 195F, 198F, 199Y, 203F, 207L, 214L e; 64F, 79V, 86W, 193V, 195F, 198F, 199f, 203F, 207L, 214L e; 64L, 79V, 86W, 193V, 195F, 199f, 203F, 207L, 214L e; 561, 581, 1641, 1711, 179L, 181F, 1871, 291V, 2961 e 2981; 561, 581, 1641, 179L, 189F, 291V, 2961 e 2981; 56L, 581, 158W, 164L, 167V, 1711, 179L, 181F, 1871, 291V e 296L; 56L, 581, 158Y, 164L, 167V, 1871, 189F, 291V e 296L; 561, 58W, 1641, 167F, 1711, 179L, 181V, 1871, 291V e 2961; 561, 581, 64L, 79V, 86W, 1641, 179L, 189F, 193V, 195F, 198F, 199f, 203F, 207L, 214L, 291V, 2961 e 2981; 561, 581, 79V, 86F, 1641, 179L, 189F, 193V, 195F, 198F, 199f, 203F, 207L, 214L, 291V, 2961 e 2981; 561, 58W, 64L, 79V, 86W, 1641, 167F, 1711, 179L, 181V, 1871, 193V, 195F, 198F, 199f, 203F, 207L, 214L, 291V e 2961; 561, 58W, 79V, 86F, 1641, 167F, 1711, 179L, 181V, 1871, 193V, 195F, 198F, 199f, 203F, 207L, 214L, 291V e 2961; 486N, 487Q, 489N e 491 A; 486H, 487Q e 489H; 400V, 486L, 487L, 489L e; 400V, 4861, 487L e 4891; 400V, 4851, 486L, 487L, 489L, 494L, 498L e; 400V, 4851, 4861, 487L, 4891, 494L, 498L e; 3991, 400V, 4851, 486L, 487L, 489L, 494L, 497L, 498L e; 3991, 400V, 4851, 4861, 487L, 4891, 494L, 497L, 498L e; 375W, 391F e 394m; 375W, 391F e 394W; 375W, 391F, 394m, 486N, 487Q, 489N e 491 A; 375W, 391F, 394m, 486H, 487Q e 489H; 375W, 391F, 394W, 486N, 487Q, 489N, 491A e; 375W, 391F, 394W, 486H, 487Q e 489H; 375W, 391F, 394m, 400V, 486L, 487L, 489L, 494L e 498m; 375W, 391F, 394m, 400V, 4861, 487L, 4891, 494L e 498m; 375W, 391F, 394W, 400V, 486L, 487L, 489L, 494L e 498m; 375W, 391F, 394W, 400V, 4861, 487L, 4891, 494L e 498m; 137W e 339m; 137W e 140W; 137W, 140W e 488W; 486N, 487Q, 489N, 491A e 488W; 486H, 487Q, 489H e 488W; 400V, 486L, 487L, 489L e 488W; 400V, 4861, 487L, 4891 e 488W; 486N, 487Q, 489N, 491A, 137W e 140W; 486H, 487Q, 489H, 137W e 140W; 400V, 486L, 487L, 489L, 137W e 140W; 375W, 391F, 394m, 137W, 140W e; ou 375W, 391F, 394m, 137W, 140W e 339M; e em que as posições de aminoácidos corresponde à sequência de aminoácidos de um polipeptídeo F0 de referência apresentada como SEQ ID NO: 124.

[00589] Cláusula 38. O imunógeno da cláusula 37, em que a proteína F de RSV recombinante é estabilizada na proteína F de RSV pré-fusão conformação pela substituição de aminoácidos a reacondicionamento, em que o polipeptídeo compreende F1 as substituições de aminoácidos estabelecidas em um dos seguintes: I64L, I79V, Y86W, L193V, L195F, Y198F, I199F, L203F, V207L e I214L; I64L, I79L, Y86W, L193V, L195F, Y198F, I199F, L203F e I214L; I64W, I79V, Y86W, L193V, L195F, Y198F, I199F, L203F, V207L e I214L; I79V, Y86F, L193V, L195F, Y198F, I199F, L203F, V207L e I214L; I64V, I79V, Y86W, L193V, L195F, Y198F, I199Y, L203F, V207L e I214L; I64F, I79V, Y86W, L193V, L195F, Y198F, I199F, L203F, V207L e I214L; I64L, I79V, Y86W, L193V, L195F, I199F, L203F, V207L e I214L; V56I, T58I, V164I, L171I, V179L, L181F, V187I, I291V, V296I e A298I; V56I, T58I, V164I, V179L, T189F, 1291V, V296I e A298I; V56L, T58I, L158W, V164L, I167V, L171I, V179L, L181F, V187I, I291V e V296L; V56L, T58I, L158Y, V164L, I167V, V187I, T189F, I291V e V296L; V56I, T58W, V164I, I167F, L171I, V179L, L181V, V187I, I291V, V296I e; V56I, T58I, I64L, I79V, Y86W, V164I, V179L, T189F, L193V, L195F, Y198F, I199F, L203F, V207L, I214L, I291V, V296I e A298I; V56I, T58I, I79V, Y86F, V164I, V179L, T189F, L193V, L195F, Y198F, I199F, L203F, V207L, I214L, I291V, V296I e A298I; V56I, T58W, I64L, I79V, Y86W, V164I, I167F, L171I, V179L, L181V, V187I, L193V, L195F, Y198F, I199F, L203F, V207L, I214L, I291V, V296I e; V56I, T58W, I79V, Y86F, V164I, I167F, L171I, V179L, L181V, V187I, L193V, L195F, Y198F, I199F, L203F, V207L, I214L, I291V, V296I e; D486N, E487Q, D489N, S491A e; D486H, E487Q e D489H; T400V, D486L, E487L e D489L; T400V, D486I, E487L e D489I; T400V, S485I, D486L, E487L, D489L, Q494L e K498L; T400V, S485I, D486I, E487L, D489I, Q494L e K498L; K399I, T400V, S485I, D486L, E487L, D489L, Q494L, E497L e K498L; K399I, T400V, S485I, D486I, E487L, D489I, Q494L, E497L e K498L; L375W, Y391F e K394M; L375W, Y391F e K394W; L375W, Y391F, K394M, D486N, E487Q, D489N, S491A e; L375W, Y391F, K394M, D486H, E487Q e D489H; L375W, Y391F, K394W, D486N, E487Q, D489N, S491A e; L375W, Y391F, K394W, D486H, E487Q e D489H; L375W, Y391F, K394M, T400V, D486L, E487L, D489L, Q494L e K498M; L375W, Y391F, K394M, T400V, D486I, E487L, D489I, Q494L e K498M; L375W, Y391F, K394W, T400V, D486L, E487L, D489L, Q494L e K498M; L375W, Y391F, K394W, T400V, D486I, E487L, D489I, Q494L e K498M; F137W e R339M; F137W e F140W; F137W, F140W e F488W; D486N, E487Q, D489N, S491A e F488W; D486H, E487Q, D489H e F488W; T400V, D486L, E487L, D489L e F488W; T400V, D486I, E487L, D489I e F488W; D486N, E487Q, D489N, S491A, F137W e F140W; D486H, E487Q, D489H, F137W e F140W; T400V, D486L, E487L, D489L, F137W e F140W; L375W, Y391F, K394M, F137W e F140W; ou L375W, Y391F, K394M, F137W, F140W e R339M; e em que as posições de aminoácidos corresponde à sequência de aminoácidos de um polipeptídeo F0 de referência apresentada como SEQ ID NO: 124.

[00590] Cláusula 39. O imunógeno da cláusula 38, em que a proteína F de RSV recombinante é estabilizada na proteína F de RSV pré-fusão conformação por uma substituição de aminoácido reacondicionamento, em que o polipeptídeo compreende F1 posições 137-513 de uma das SEQ ID NO: 227-242, 249-256, 286-295, 326-337 ou.

[00591] Cláusula 40. O imunógeno de qualquer uma das cláusulas 18-39, em que a proteína F de RSV recombinante é estabilizada na proteína F de RSV pré-fusão conformação por um sítio de glicosilação N- ligada, em que o sítio de glicosilação ligado a N é a uma das posições de polipeptídeo F1 506, 175, 178, 276, 476, 185, 160, 503, 157 ou uma combinação de dois ou mais destes, em que as posições de aminoácidos corresponde à sequência de aminoácidos de uma referência F0 polipeptídeo apresentada como SEQ ID NO: 124.

[00592] Cláusula 41. O imunógeno da cláusula 40, em que a proteína F de RSV recombinante compreende um de (a) I506N e K508T; (b) A177S; (c) V178N; (d) V278T; (e) Y478T; (f) V185N e V187T; (g) L160N e G162S; (h) L503N e F505S; (i) V157N; (j) ou uma combinação de dois ou mais de (a) - (j); e em que as posições de aminoácidos correspondem à sequência de aminoácidos de um polipeptídeo F0 de referência apresentada como SEQ ID NO: 124.

[00593] Cláusula 42. O imunógeno da cláusula 41, em que a proteína F de RSV recombinante é estabilizada na proteína F de RSV pré-fusão conformação por um sítio de glicosilação ligada a N e em que o polipeptídeo compreende F1 posições 137-513 de uma das SEQ ID NOs: 198 -200, 203-204, 214-217.

[00594] Cláusula 43. O imunógeno de qualquer uma das cláusulas 18, em que a proteína F de RSV recombinante é estabilizada na proteína F de RSV pré-fusão conformação compreende as substituições de aminoácidos definidas como um dos seguintes: S238C e E92C; L193C e I59C; I59C e L297C; L297C e I292C; K176C e S190C; T189C e A177C; T58C e K191C; A424C e V450C; L171C e K191C; K176C e S190C; K77C e I217C; K427C e D448C; G151C e N302C; G151C e V300C; T189C e V56C; L171C e K191C; L230F; L158F; L230F e L158F; L203F; V187F; Y198F; Y198W; L204F; Y53F e L188F; V187F e L203F; Y198F e L203F; L141W; L142F; L142W; V144F; V144W; V90F; L83F; V185F e T54A; I395F; V90F, V185F e T54A; L83F e V90F; L83F, V185F e T54A; L230F, V90F e I395F; I395F, V185F e T54A; L203F, V90F, L230F, L158F, S509F, I395F, V185F e T54A; I221Y; F140W; F137W; S190L e V192L; V187F, S 190L e V192L; V187L, S190L e V192L; V185F, V187L, S190L e V192L; V154L, V157L, V185L e V187L; V154L, V185L e V187L; V187F; T58L A298L; T58L, V154L, V185L, V187L e A298L; Y458W; L158F e I167A; L158W e I167A; L158F; L158W; V56L, I167L e A298L; V56L, I167L e A298M; V56L e A167L; I167F; I167M; V154F; V56L, I167L, A298L e V154F; I199L, L203F; I199L, L203F, P205Q e I206T; I199L, L203F, P205E e I206K; I199L, L203F e V207F; I199L, L203F, P205Q, I206T e V207F; I199L, L203F, P205E, I206K e V207F; I199L, L203F e L83F; I199L, L203F, P205Q, I206T e L83F; I199L, L203F, P205E, I206K e L83F; I199L, L203F, S190L e V192L; I199L, L203F, P205Q, I206T, V187F e S190L, V192L; S55A, S190M, L203F, V207I, V296I e; Y53F, S55A, K176I, S190L, V207I, S259L, D263L e V296I; L158F, V207M e V296I; V56L, V207M e V296I; V56L, V207I, V296I e; V56I, V207M e V296I; V154L, V207M e V296I; Y198F, V207I, T219W e V296I; Y198F, V207I, T219I e V296I; Y198F, V207M, T219W e V296I; 198F, V207M, T219I e V296I; Y198F, V207M, T219L e V296I; S190Y; S190W; I206F, V207M, T219V e V296I; Y198F, V207M, T219L e K226M; Y198F, V207M, T219L e K226W; Y198F, V207M, T219L e K226L; L158F, L203F, V207I, V296I e; F488W; F488R; V207L; S190F; S190M; L503E, I506K e S509F; L503E, I506K, S509F e F505W; L503E, I506K, S509F, L230F e L158F; Q279C e S238C; Q501F; E82V, V207M, N227L e V296I; E82V, V207I, N227L e V296I; L158F, Y198F, V207M, S215G, N216P e T219L; L158F, Y198F, V207M, S213G, S215G e T219L; V56L, E82V, L203F, V207M, N227L, L230F e V296I; E82V, L158F, L203F, V207M, N227L, L230F e V296I; E82V, L203F, V207M, K226M, N227L, L230F e V296I; ou L203F, V207I, S180C, S186C e V296I;

[00595] em que as posições de aminoácidos correspondem à sequência de aminoácidos de um polipeptídeo F0 de referência apresentada como SEQ ID NO: 124.

[00596] Cláusula 44. O imunógeno da cláusula 18, em que as proteínas recombinantes compreendem RSV F S155C e S290C substituições e compreende ainda um dos seguintes conjuntos de substituições: L513C, 514E e 515C; L513C, 514E, 515E e 516C; L512C, 513E e 514C; ou L512C, 513E, 514E e 515C; S155C, S290C e S190F substituições e compreende ainda um dos seguintes conjuntos de substituições: F488W, L513C, A514E e I515C; F488W, L513C, A514E, G515E e 516C; F488W, L512C, L513E e A514C; F488W, L512C, L513E, A514E e G515C; A424C, V450C, L171C, K191C, F488W, L513C, A514E e I515C; A424C, V450C, L171C, K191C, F488W, L513C, A514E, G515E e 516C; A424C, V450C, L171C, K191C, F488W, L512C, L513E e A514C; A424C, V450C, L171C, K191C, F488W, L512C, L513E, A514E e G515C; K77C, I217C, A424C, V450C, L171C, K191C, F488W, L513C, L514E e A515C; K77C, I217C, A424C, V450C, L171C, K191C, F488W, L513C, L514E e A515E; K77C, I217C, A424C, V450C, L171C, K191C, F488W, L512C, L513E e A514C; ou K77C, I217C, A424C, V450C, L171C, K191C, F488W, L512C, L513E, A514E e G515C;

[00597] substituições S155C, S290, S190F e V207L e compreende ainda um dos seguintes conjuntos de substituições: L503E e I506K; L503E, I506K e F505W; L503E, I506K, L230F e L158F; L503E, I506K, S509F, F505W, L230F e L158F; L160K, V178T, L258K, V384T, I431S e L467Q; F477K, L481Q, V482K, L503Q e I506K; L160K, V178T, L258K, V384T, I431S, L467Q, F477K, L481Q, V482K, L503Q e I506K; L512C e L513C; L512C, L513C, L160K, V178T, L258K, V384T, 1431 S e L467Q; L512C, L513C, F477K, L481Q, V482K, L503Q e I506K; L512C, L513C, L160K, V178T, L258K, V384T, S 1431, L467Q, F477K, L481Q, V482K, L503Q e I506K; F505W; F505W L160K, V178T, L258K, V384T, 1431 S e L467Q; F505W F477K, L481Q, V482K, L503Q e I506K; F505W L160K, V178T, L258K, V384T, I431S, L467Q, F477K, L481Q, V482K, L503Q e I506K; L512C, L513C e F505W; L512C, L513C F505W L160K, V178T, L258K, V384T, 143 IS e L467Q; L512C, L513C F505W F477K, L481Q, V482K, L503Q e I506K; L512C, L513C F505W L160K, V178T, L258K, V384T, 1,431 S, L467Q, F477K, L481Q, V482K, L503Q e I506K; I506K, S509F, L83F e V90F; I506K, S509F, L83F, V90F, L230F e L158F; I506K, S509F, F505W, L83F, V90F, L230F, V185F e T54A; L83F, V90F, L230F e I395F; I506K, S509F, F505W, L83F, V90F, L230F, L158F, I395F, V185F e T54A; L512C e L513C; ou 486DEF a CPC, em que as posições de aminoácidos corresponde à sequência de aminoácidos de um polipeptídeo F0 de referência apresentada como SEQ ID NO: 124.

[00598] Cláusula 45. O imunógeno da cláusula 18, em que a proteína recombinante SV F é estabilizada na pré-fusão proteína F de RSV e compreende polipeptídeos F2and F1 compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada como posições 26-109 e 137-513, respectivamente, de um dos SEQ ID NO: 338-433, 434-544, 672-682.

[00599] Cláusula 46. O imunógeno de qualquer uma das cláusulas 118, em que a proteína F de RSV recombinante compreende as substituições de aminoácidos definidas em uma das

[00600] linhas 1-16 da Tabela 5b (mais recente);

[00601] linhas 1-84 da Tabela 6b (preenchimento de cavidade mais recente);

[00602] linhas 1-54 da Tabela 8b (combinações mais recentes com DSCav-1); ou

[00603] linhas 1-13 da Tabela 8c ((preenchimento de cavidade mais recente + substituindo expostos resíduos hidrófobos); e

[00604] em que as posições de aminoácidos corresponde à sequência de aminoácidos de um polipeptídeo F0 de referência apresentada como SEQ ID NO: 124.

[00605] Cláusula 47. O imunógeno de qualquer uma das cláusulas 118, em que a proteína F de RSV recombinante é uma proteína de cadeia simples e compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOS: 698-828 ou 1474 -1478.

[00606] Cláusula 48. O imunógeno de qualquer uma das cláusulas 118, em que a proteína F de RSV recombinante é uma proteína de cadeia simples e compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOS: 698-828 ou 1474 -1478, opcionalmente sem os marcadores de proteínas ou sequências líder listados na correspondente SEQ ID NO.

[00607] Cláusula 49. O imunógeno de qualquer uma das cláusulas 118, em que a proteína F de RSV recombinante compreende um domínio de trimerização, que compreende adicionalmente um sítio de clivagem de protease entre o domínio Foldon e a proteína F de RSV recombinante.

[00608] Cláusula 50. O imunógeno de qualquer uma das cláusulas 118, em que a proteína F de RSV recombinante compreende as substituições de aminoácidos listados na Tabela de linha 23 correspondendo a uma das SEQ ID NOs: 829-1025.

[00609] Cláusula 51. O imunógeno de qualquer uma das cláusulas 118, em que a proteína F de RSV recombinante compreende as substituições de aminoácidos listados na Tabela de linha 23 correspondendo a uma das SEQ ID NOs: 969-1025.

[00610] Cláusula 52. O imunógeno de qualquer uma das cláusulas 118, em que o imunógeno compreende uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos: DSCav1-F137C e R339C; DSCav1- F137C e T337C; DSCav1- G139C e Q354C; F137C, R339C; F137C, T337C; G139C, Q354C; L260F; L260W; L260Y; L260R; L188F; L188W; L188Y; L188R; I57F; I57W; I57R; L252F; L252W; L252R; V192F; V192W; V192R; S150C e Y458C; A149C e N460C; S146C e N460C; A149C e Y458C; V220F; V220W; V220M; T219F; T219M; T219W; T219R; I221F; 1221 Y; I221W; Q224D e, L78K; V278F Q279F N277D e, S99K; Q361F; V402F; T400F; T400W; H486F; H486W; I217F; I217Y; I217W; F190V; K226L; T58I e A298M; F190V e K226L; F190V e T58I, A298M; K226L, T58I e A298M; T58I, A298M, F190V e K226L e opcionalmente compreende ainda S155C e S290C ou S155C, S290C e S190F V207L .

[00611] Cláusula 53. O imunógeno de qualquer uma das cláusulas 118, em que o imunógeno compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica à sequência de aminoácidos de uma das SEQ ID NOs: 829-1025, opcionalmente sem as marcadores de proteínas ou líder sequências listadas na ID SEQ NO correspondente.

[00612] Cláusula 54. O imunógeno de qualquer uma das cláusulas 53, em que a proteína F de RSV recombinante compreende um domínio de trimerização, que compreende adicionalmente um sítio de clivagem de protease entre o domínio Foldon e a proteína F de RSV recombinante.

[00613] Cláusula 55. O imunógeno de qualquer uma das cláusulas 118, em que a proteína F de RSV recombinante compreende as substituições de aminoácidos listados na Tabela de linha 24 correspondendo a uma da ID SEQ NOs: 901-968.

[00614] Cláusula 56. O imunógeno de qualquer uma das cláusulas 118, em que o imunógeno compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica à sequência de aminoácidos de uma das SEQ ID NOs: 901-968, opcionalmente sem as marcadores de proteínas ou líder sequências listadas na ID SEQ NO correspondente.

[00615] Cláusula 57. O imunógeno da cláusula 7, em que a proteína F de RSV recombinante ou fragmento do mesmo compreende ou consiste de uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idênticas às posições seguintes F1 e F2 de RSV como definido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-184:

[00616] (a) 56-97 e 189-211, respectivamente; (b) 58-97 e 192-242, respectivamente; (c) 59-97 e 194-240, respectivamente; (d) 60-75 e 193-218, respectivamente; (e) 60-94 e 192-229, respectivamente; (f) 6094 e 192-232, respectivamente; (g) 60-94 e 193-237, respectivamente; (h) 60-95 e 192-240, respectivamente; (i) 60-96 e 192-239, respectivamente; (j), 60-97 e 192-242, respectivamente; (k) 60-97 e 194-239, respectivamente; (l) 61-96 e 192-235, respectivamente; (m) 61-96 e 192-240, respectivamente; (n) 62-69 e 196-209, respectivamente; ou (o) uma permutação circular das posições F1 e F2 listados em qualquer um de (a) - (m), em que as posições de RSV F1 e F2 são unidas por um ligante heterólogo.

[00617] Cláusula 58. O imunógeno da cláusula 7, em que a proteína F de RSV recombinante ou fragmento do mesmo compreende ou consiste de uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idênticas às posições seguintes F1 e F2 de RSV como definido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-184:

[00618] (a) 46-103 e 147-310, respectivamente; (b) 46-104 e 146 310, respectivamente; (c) 50-96 e 149-306, respectivamente; (d) 51-103 e 146-307, respectivamente; (e) 51-103 e 139-307, respectivamente; (f) 50-105 e 146-306, respectivamente; (g) 53-97 e 148 para um dos 305320; (h) uma permutação circular das posições F1 e F2 listados em qualquer um de (a) - (g), em que as posições de RSV F1 e F2 são unidas por um ligante ou heterólogo estão diretamente ligados.

[00619] Cláusula 59. O imunógeno da cláusula 57 ou 58, em que a proteína F de RSV recombinante ou fragmento do mesmo compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das sítio mínima 0 imunógenos indicados na Tabela 20.

[00620] Cláusula 60. O imunógeno da cláusula 57 ou 58, em que a proteína F de RSV recombinante ou fragmento da mesma, compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica à sequência de aminoácidos de uma das SEQ ID NOs: 1027-1218.

[00621] Cláusula 61. O imunógeno da cláusula 57 ou 58, em que a proteína F de RSV recombinante ou fragmento da mesma, compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica à sequência de aminoácidos de uma das SEQ ID NOs: 1027-1218, opcionalmente, sem a proteína etiquetas ou sequências líder indicadas no correspondente SEQ ID NO.

[00622] Cláusula 62. O imunógeno qualquer das cláusulas 58-61, em que a proteína F de RSV recombinante compreende as substituições de cisteína na posição 155 e 290 e uma substituição F, G, W, Y, H ou M na posição 190, posição 207 ou posições 190 e 207.

[00623] Cláusula 63. O imunógeno qualquer das cláusulas 58-61, em que a proteína F de RSV recombinante compreende S155C e S290C substituições; S155C, S290C e substituições S190F ou S155C, S290C, S190F e V207L substituições.

[00624] Cláusula 64. O imunógeno de qualquer uma das cláusulas 58-61, em que a proteína F de RSV recombinante ou fragmento do mesmo compreende ou consiste da sequência de -ligante- F1 F2 ou F2 -ligante- F1 sequência de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1027- 1218.

[00625] Cláusula 65. O imunógeno de qualquer uma das cláusulas 57-64, em que o ligante heteróloga compreende ou consiste da sequência de aminoácidos apresentada como qualquer uma de SEQ ID NOs: 1443-1455 ou um G, S, GG, GS, SG, ligante GGG ou GSG.

[00626] Cláusula 66. O imunógeno de qualquer uma das cláusulas anteriores, que compreende um multímero da Proteína F de RSV recombinante ou fragmento da mesma.

[00627] Cláusula 67. O imunógeno de qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a proteína F de RSV recombinante está ligado a uma proteína de arcabouço.

[00628] Cláusula 68. O imunógeno de qualquer uma das cláusulas 156, em que o polipeptídeo compreende uma hélice FI α10 de RSV que compreende desde a posição 492 a um RSV de posições 510-529 e em que o polipeptídeo compreende FI pelo menos duas substituições de cisteína que formam um não natural ligação de dissulfureto interprotômero.

[00629] Cláusula 69. O imunógeno de 68, em que as posições 512524 do polipeptídeo F1 compreendem a sequência de aminoácidos apresentada como CCHNVNAGKSTTN (resíduos 512-524 de SEQ ID NO: 844) ou CCHNVNACCSTTN XY (resíduos de SEQ ID NO: 849) ; ou em que as posições 512-529 do polipeptídeo F1 compreender a sequência de aminoácidos apresentada como CCHNVNACCSTTNICCTT (resíduos 512-529 de SEQ ID NO: 853).

[00630] Cláusula 70. O imunógeno isolado de qualquer uma das cláusulas anteriores, em que o RSV recombinante F proteína compreende ainda uma ligação de dissulfureto adicional que compreende um par de cisteínas nas posições reticulados F1: (a) 486 e 487; (b) 512 e 513; (c) 519 e 520; (d) 526 e 527; (e) 486 e 487, em que o polipeptídeo compreende ainda um F1 P inserido entre as posições 486 e 487; (f) 330 e 493; em que o polipeptídeo compreende ainda um F1 C inserido entre as posições inserção de C entre as posições 329 e 330; ou (g) 330 e 493; em que o polipeptídeo compreende ainda um F1 C inserido entre as posições 329 e 330 e uma inserção de G entre as posições 492 e 493; em que as posições de aminoácidos corresponde à sequência de aminoácidos de um polipeptídeo F0 de referência apresentada como SEQ ID NO: 124.

[00631] Cláusula 71. O imunógeno de qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a proteína F de RSV recombinante ou fragmento do mesmo ou proteína de epitopo-arcabouço está ligado a um domínio de trimerização.

[00632] Cláusula 72. O imunógeno da cláusula 71, em que o C- terminal do polipeptídeo F1 da proteína F de RSV recombinante é ligado ao domínio de trimerização.

[00633] Cláusula 73. O imunógeno da cláusula 71 ou cláusula 72, em que o domínio de trimerização é um domínio Foldon.

[00634] Cláusula 74. O imunógeno qualquer das cláusulas 71-73, que compreende ainda um sítio de protease entre o clivam o polipeptídeo F1 e o domínio de trimerização.

[00635] Cláusula 75. O imunógeno da cláusula 74, compreendendo ainda um domínio transmembrana entre o sítio de clivam protease e o domínio de trimerização.

[00636] Cláusula 76. O imunógeno isolado da cláusula 75, em que a proteína F de RSV é estabilizada na proteína F conformação por pré- fusão: (a) a ligação de dissulfureto, em que o polipeptídeo e o polipeptídeo F2 F1 ligado ao domínio Foldon compreender a sequência de aminoácidos apresentada como posições 26-109 e 137-544, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID NOs: 185, 189, 190, 201, 202, 205, 207, 209, 211, 212, 213, 244, 245, 247, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 284, 302, 303, 243, 246, 276, 283, 285, 296, 297, 298 ou 299; (b) o preenchimento de cavidade substituição de aminoácidos, em que o polipeptídeo e o polipeptídeo F2 F1 ligado ao domínio Foldon compreender a sequência de aminoácidos apresentada como posições 26-109 e 137-544, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID NOs : 191, 193, 196, 197, 248, 192, 195 ou 194; (c) a substituição de aminoácido reacondicionamento, em que o polipeptídeo e o polipeptídeo F2 F1 ligado ao domínio Foldon compreender a sequência de aminoácidos apresentada como posições 26-109 e 137-544, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID NOs: 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336 ou 337; ou (d) o sítio de N-glicosilação ligada, em que o polipeptídeo e o polipeptídeo F2 F1 ligado ao domínio Foldon compreender a sequência de aminoácidos apresentada como posições 26-109 e 137544, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID NOs selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 198, 199, 200, 203, 204, 214, 215, 216 ou 217; (e) A ligação de dissulfureto e a substituição de preenchimento da cavidade, em que o polipeptídeo e o polipeptídeo F2 F1 ligado ao domínio Foldon compreender a sequência de aminoácidos apresentada como posições 26-109 e 137-544, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID NOs selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 371, 372, 373, 374, 375, 376; e em que as posições de aminoácidos corresponde à sequência de aminoácidos de um polipeptídeo F0 de referência apresentada como SEQ ID NO: 124.

[00637] Cláusula 77. O imunógeno isolado da cláusula 75, em que o polipeptídeo e o polipeptídeo F2 F1 ligado ao domínio Foldon compreender a sequência de aminoácidos apresentada como posições 26-109 e 137-548, respectivamente, de qualquer uma das SEQ ID NO: 552; 553; 554; 555; 556; 557; 558; 559; 560; 561; 562; 563; 564; 565; 566; 567; 568; 569; 570; 571; 572; 573; 574; 575; 576; 577; 578; 579; 580; 581; 582; 583; 584; 585; 586; 587; 588; 589; 590; 591; 592; 593; e 601; 683; 684; 685; 686; 687; 688; 689; 690; 691; 692; ou 693 em que as posições de aminoácidos correspondem à sequência de aminoácidos de um polipeptídeo F0 de referência apresentada como SEQ ID NO: 124.

[00638] Cláusula 78. O imunógeno de qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a proteína F de RSV recombinante ou fragmento do mesmo ou proteína de epitopo-arcabouço está ligada a uma subunidade de nanopartículas de proteína.

[00639] Cláusula 79. O imunógeno da cláusula 78, em que o C- terminal da proteína F de RSV recombinante ou fragmento do mesmo ou proteína de epitopo-arcabouço está ligada à subunidade nanopartículas de proteína.

[00640] Cláusula 80. O imunógeno da cláusula 78 ou cláusula 79, em que a subunidade de nanopartículas de proteína é uma ferritina, encapsulina, Enxofre Oxigenase redutase (SOR), lumazina sintase ou piruvato desidrogenase subunidade de nanopartículas.

[00641] Cláusula 81. O imunógeno da cláusula 78, em que: a subunidade ferritina nanopartículas compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de identidade de sequência com os resíduos 517-679 de SEQ ID NO: 350, e, opcionalmente, inclui um C31S, C31 ou C31V A substituição no polipeptídeo ferritina; (f) subunidade SOR compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de identidade de sequência com os resíduos 516-825 de SEQ ID NO: 344 ou SEQ ID NO: 345; a subunidade de lumazina sintase compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de identidade de sequência com os resíduos 517-670 de SEQ ID NO: 346 ou SEQ ID NO: 348 ou os resíduos 517-669 da SEQ ID NO: 347; ou a subunidade de piruvato desidrogenase sintase uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de identidade de sequência com os resíduos 516-757 de SEQ ID NO: 349.

[00642] Cláusula 82. O imunógeno da cláusula 78, que compreende uma proteína F de RSV de cadeia simples ligado a uma subunidade ferritina compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idênticas uma das SEQ ID NOS: 827-828 ou 1429-1442

[00643] Cláusula 83. O imunógeno da cláusula 78, em que a proteína F de RSV recombinante ou um fragmento do mesmo, está ligada a uma subunidade de nanopartículas e compreende a sequência de aminoácidos de qualquer um dos sítios imunogênicos ligados a uma nanopartículas de proteína como listado na Tabela 21.

[00644] Cláusula 84. O imunógeno da cláusula 78, em que a proteína F de RSV recombinante ou um fragmento do mesmo, está ligada a uma subunidade de nanopartículas, compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica à sequência de aminoácidos de uma das SEQ ID NOs: 1219-1428.

[00645] Cláusula 85. O imunógeno da cláusula 78, em que a proteína F de RSV recombinante ou fragmento do mesmo, está ligada a uma subunidade de nanopartículas e compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% idêntica à sequência de aminoácidos de uma das SEQ ID NOs: 1219- 1428, opcionalmente sem as marcadores de proteínas ou sequências líder indicadas no correspondente SEQ ID NO.

[00646] Cláusula 86. O imunógeno de qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a proteína F de RSV recombinante forma um trímero em solução salina tamponada com fosfato em pH fisiológico à temperatura ambiente.

[00647] Cláusula 87. O imunógeno qualquer das cláusulas anteriores, em que o imunógeno forma uma população homogênea de imunógenos quando incubados em solução aquosa, em que pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% e/ou, pelo menos, 95% de os imunógenos incubadas na solução se ligam especificamente ao anticorpo específico pré-fusão após: (a) incubação durante uma hora em NaCl a 350 mM, pH de 7,0, a 50°C; (b) incubação durante uma hora em NaCl a 350 mM a pH de 3,5, a 25°C; (c) incubação durante uma hora em NaCl a 350 mM pH de 10, a 25°C; (d) incubação durante uma hora em osmolaridade de 10 mM, pH de 7,0, a 25°C; (e) incubação durante uma hora em osmolaridade de 3000 mM, pH de 7,0, a 25°C; ou (f) dez ciclos de congelamento e descongelamento em NaCl a 350 mM, pH de 7,0; ou (g) uma combinação de dois ou mais de (a) - (f); em que o imunógeno é incubado na solução, na ausência do anticorpo específico pré-fusão.

[00648] Cláusula 88. O imunógeno qualquer das cláusulas anteriores, em que: (a) a proteína F de RSV recombinante ou um fragmento do mesmo, não inclui uma ligação de dissulfureto entre F de RSV as posições 481 e 489 ou entre F de RSV as posições 509 e 510; (b) a proteína F de RSV recombinante ou fragmento do mesmo não inclui um resíduo de cisteína na F de RSV as posições 481, 489, 509, 510 ou uma sua combinação; (c) uma combinação de (a) e (b).

[00649] Cláusula 89. O imunógeno isolado de qualquer uma das cláusulas 1-70, em que o C-terminal do polipeptídeo F1, é ligado a um domínio transmembrana.

[00650] Cláusula 90. O imunógeno isolado da cláusula 89, em que o domínio transmembrana é um domínio transmembrana RSV F.

[00651] Cláusula 91. O imunógeno isolado da cláusula 89 ou 90, em que o C-terminal do domínio transmembrana está ligado a um domínio citosólico F de RSV.

[00652] Cláusula 92. O imunógeno isolado de qualquer uma das cláusulas anteriores, em que o imunógeno não está estabilizado na conformação pré-fusão por reticulação não específica.

[00653] Cláusula 93. Uma partícula similar a vírus que compreende o imunógeno de qualquer uma das cláusulas 1-70.

[00654] Cláusula 94. Uma nanopartícula proteína compreendendo o imunógeno de qualquer uma das cláusulas 1-85.

[00655] Cláusula 95. Nanopartículas de proteína da cláusula 94, em que a proteína é uma nanopartícula de nanopartículas ferritina, uma nanopartícula encapsulina, um enxofre oxigenase redutase (SOR) de nanopartículas, uma nanopartícula de lumazina sintase ou uma nanopartícula piruvato desidrogenase.

[00656] Cláusula 96. O imunógeno, de qualquer uma das cláusulas 1-92, em que um fragmento Fab de anticorpo monoclonal D25 ou AM22 se liga especificamente ao imunógeno, a partícula similar a vírus ou a nanopartículas de proteína com uma meia-vida de 1 μM ou menos.

[00657] Cláusula 97. O imunógeno isolado de qualquer uma das cláusulas 1-85, em que o compreende um imunógeno D25 de epitopo que compreende uma estrutura tridimensional que, na ausência de anticorpo monoclonal D25 anticorpo pode ser estruturalmente sobreposta por cima da estrutura tridimensional de um epitopo compreendendo os resíduos D25 62-69 e 196-209 de SEQ ID NO: 370 em complexo com o anticorpo monoclonal D25, tal como definido pelas coordenadas atômicas indicadas no Tabela 1 com um desvio quadrático médio (RMSD) das suas coordenadas de menos de 2,0 A/resíduo, em que o RMSD é medida durante os átomos de polipeptídeo N, Ca, C, O, para, pelo menos, três aminoácidos consecutivos.

[00658] Cláusula 98. Uma molécula de ácido nucleico que codifica o imunógeno isolado de qualquer uma das cláusulas 1-92.

[00659] Cláusula 99. A molécula de ácido nucleico da cláusula 98, em que a molécula de ácido nucleico codifica uma proteína precursora do imunógeno.

[00660] Cláusula 100. A molécula de ácido nucleico da cláusula 99, em que a proteína precursora compreende, do N- para o C-terminal, um peptídeo de sinal, o polipeptídeo F2, o polipeptídeo Pep27 e o polipeptídeo F1.

[00661] Cláusula 101. A molécula de ácido nucleico da cláusula 100, em que o polipeptídeo compreende Pep27 a sequência de aminoácidos apresentada como posições 110-136 de qualquer SEQ ID Nos: 1-184 ou 370, em que as posições de aminoácidos correspondem ao aminoácido sequência de um polipeptídeo F0 de referência apresentada como SEQ ID NO: 124.

[00662] Cláusula 102. A molécula de ácido nucleico da cláusula 101, em que o peptídeo de sinal compreende a sequência de aminoácidos apresentada como posições 1-25 de qualquer SEQ ID Nos: 1-184 ou 370, em que as posições de aminoácidos correspondem ao aminoácido sequência de um polipeptídeo F0 de referência apresentada como SEQ ID NO: 124.

[00663] Cláusula 103. A molécula de ácido nucleico de qualquer uma das cláusulas 99-102, códons optimizados para a expressão em uma célula humana ou bovina.

[00664] Cláusula 104. A molécula de ácido nucleico de qualquer uma das cláusulas 99-103, operativamente ligada a um promotor.

[00665] Cláusula 105. Um vetor compreendendo a molécula de ácido nucleico da cláusula 104.

[00666] Cláusula 106. O vetor da cláusula 105, em que o vetor é um vetor viral.

[00667] Cláusula 107. O vetor viral da cláusula 106, em que o vetor viral é um vetor de vírus da parainfluenza bovino, um vetor de vírus de parainfluenza humana, um vetor de vírus da doença de Newcastle, um vetor de vírus Sendai, um vetor de vírus do sarampo, um vetor de RSV atenuada, um paramixovírus vetor, um vetor de adenovírus, um vetor de alfavírus, um vetor da Encefalite Equina Venezuelana, um vetor de vírus da floresta de Semliki, vírus Sindbis um vetor, um vetor de vírus adenoassociado, um vetor de poxvírus, um vetor de rabdovírus, um vetor de vírus da estomatite vesicular, um vetor de picornovírus ou um vetor de vírus do herpes.

[00668] Cláusula 108. O vetor da cláusula 106, em que o vetor é um vetor bacteriano.

[00669] Cláusula 109. O vetor bacteriano da cláusula de 108, em que o vetor é um vetor bacteriano, um vetor micobacteriano, um vetor de Salmonella, um vetor de Shigella, um vetor de Listeria monocytogenes ou um vetor de Lactobacillus.

[00670] Cláusula 110. A molécula de ácido nucleico ou vetor de qualquer uma das cláusulas 98-109, compreendendo a sequência de nucleotídeo apresentada como SEQ ID NO: 383, SEQ ID NO: 384, SEQ ID NO: 385 ou SEQ ID NO: 386.

[00671] Cláusula 111. Uma célula hospedeira isolada compreendendo o vetor de qualquer uma das cláusulas 105-110.

[00672] Cláusula 112. Uma composição imunogênica compreendendo uma quantidade eficaz do imunógeno, partícula similar a vírus, nanopartículas de proteína, molécula de ácido nucleico ou um vetor de qualquer uma das cláusulas 1-110; e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00673] Cláusula 113. A composição imunogênica da cláusula 112, que compreende ainda um adjuvante.

[00674] Cláusula 114. A composição imunogênica da cláusula 113, em que o adjuvante é alúmen, em uma composição de óleo em água, MF59, AS01, AS03, AS04, MPL, QS21, um oligonucleotídeo CpG, um agonista do TLR7, um agonista de TLR4 ou uma combinação de dois ou mais destes.

[00675] Cláusula 115. A composição imunogênica da cláusula 113, em que o adjuvante promove uma resposta imune Th1.

[00676] Cláusula 116. A composição imunogênica de qualquer dos artigos 112, que compreende ainda um anticorpo específico pré-fusão F de RSV que se liga especificamente ao imunógeno.

[00677] Cláusula 117. A composição imunogênica de qualquer uma das cláusulas 112, que compreende uma mistura de F de RSV ou de fragmentos de proteínas recombinantes do mesmo com base em proteína F de RSV de subtipo A e B.

[00678] Cláusula 118. A composição imunogênica da cláusula 117, caracterizado por: o subtipo humano Uma proteína F de RSV compreende S155C, S290C e substituições S190F e o subtipo humano de proteína F de RSV B compreende S155C, S290C e substituições S190F; ou o subtipo humano Uma proteína F de RSV compreende S155C, S290C, S190F e substituições V207L e o subtipo humano de proteína F de RSV B compreende S155C, S290C, S190F e substituições V207L.

[00679] Cláusula 119. Um método para gerar uma resposta imune para F de RSV em um indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da composição imunogênica de qualquer uma das cláusulas 112-118 para gerar a resposta imune.

[00680] Cláusula 120. O método da cláusula 119, em que a resposta imune compreende uma resposta imune Th1.

[00681] Cláusula 121. Um método para o tratamento ou prevenção de uma infecção por RSV em um indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição imunogênica de qualquer uma das cláusulas 112-120, assim, tratar ou prevenir a infecção por RSV no assunto.

[00682] Cláusula 122. O método de qualquer uma das cláusulas 119121, compreendendo uma administração de reforço da composição imunogênica.

[00683] Cláusula 123. O método da cláusula 122, em que a primeira e impulso compreender a administração de uma mistura de Proteínas F de RSV recombinantes ou os seus fragmentos ou moléculas de ácido nucleico ou nanopartículas de proteína com base em proteína F de RSV de subtipo A e B.

[00684] Cláusula 124. Um método para a detecção ou o isolamento de um anticorpo de ligação F de RSV em um indivíduo, que compreende:

[00685] o fornecimento de uma quantidade eficaz do imunógeno, partícula similar a vírus, nanopartículas de proteína, molécula de ácido nucleico ou um vetor de qualquer uma das cláusulas 1-110; contato de uma amostra biológica do indivíduo com a proteína F de RSV recombinante ou a nanopartícula da proteína, sob condições suficientes para formar um complexo imunológico entre a proteína F de RSV recombinante ou a nanopartícula proteína e o anticorpo de ligação F de RSV; e detecção do complexo imune, deste modo, detectando e isolando o anticorpo ou ligação F de RSV no indivíduo.

[00686] Cláusula 125. O método de qualquer uma das cláusulas 119124, em que o indivíduo está em risco de ou que tenha uma infecção por RSV.

[00687] Cláusula 126. O método da cláusula 125, em que a infecção por RSV humano é um RSV de subtipo A, subtipo B de RSV humano ou infecção por RSV bovino.

[00688] Cláusula 127. O método de qualquer uma das cláusulas 119126, em que o indivíduo é um indivíduo humano ou veterinário.

[00689] Cláusula 129. Um kit compreendendo o imunógeno, partícula similar a vírus, nanopartículas de proteína, molécula de ácido nucleico ou um vetor de qualquer uma das cláusulas 1-110; e instruções para utilizar o kit.

[00690] Conforme usado aqui, referência a:

[00691] " qualquer uma de SEQ ID Nos: 1-184" refere-se a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO:

[00692] "SEQ ID NO: 698-828" refere-se a qualquer uma de SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704, SEQ ID NO: 705, SEQ ID NO: 706, SEQ ID NO: 707, SEQ ID NO: 708, SEQ ID NO: 709, SEQ ID NO: 710, SEQ ID NO: 711, SEQ ID NO: 712, SEQ ID NO: 713, SEQ ID NO: 714, SEQ ID NO: 715, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO: 717, SEQ ID NO: 718, SEQ ID NO: 719, SEQ ID NO: 720, SEQ ID NO: 721, SEQ ID NO: 722, SEQ ID NO: 723, SEQ ID NO: 724, SEQ ID NO: 725, SEQ ID NO: 726, SEQ ID NO: 727, SEQ ID NO: 728, SEQ ID NO: 729, SEQ ID NO: 730, SEQ ID NO: 731, SEQ ID NO: 732, SEQ ID NO: 733, SEQ ID NO: 734, SEQ ID NO: 735, SEQ ID NO: 736, SEQ ID NO: 737, SEQ ID NO: 738, SEQ ID NO: 739, SEQ ID NO: 740, SEQ ID NO: 741, SEQ ID NO: 742, SEQ ID NO: 827 ou SEQ ID NO: 828;

[00693] "SEQ ID NOs: 1474-1478" refere-se a qualquer uma de SEQ ID NO: 1474, SEQ ID NO: 1475, SEQ ID NO: 1476, SEQ ID NO: 1477 ou SEQ ID NO: 1478;

[00694] "SEQ ID NOs: 829-1025" refere-se a qualquer uma de SEQ ID NO: 829, SEQ ID NO: 830, SEQ ID NO: 831, SEQ ID NO: 832, SEQ ID NO: 833, SEQ ID NO: 834, SEQ ID NO: 835, SEQ ID NO: 836, SEQ ID NO: 837, SEQ ID NO: 838, SEQ ID NO: 839, SEQ ID NO: 840, SEQ ID NO: 841, SEQ ID NO: 842, SEQ ID NO: 843, SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 845, SEQ ID NO: 846, SEQ ID NO: 847, SEQ ID NO: 848, SEQ ID NO: 849, SEQ ID NO: 850, SEQ ID NO: 851, SEQ ID NO: 852, SEQ ID NO: 853, SEQ ID NO: 854, SEQ ID NO: 855, SEQ ID NO: 856, SEQ ID NO: 857, SEQ ID NO: 858, SEQ ID NO: 859, SEQ ID NO: 860, SEQ ID NO: 861, SEQ ID NO: 862, SEQ ID NO: 863, SEQ ID NO: 864, SEQ ID NO: 865, SEQ ID NO: 866, SEQ ID NO: 867, SEQ ID NO: 868, SEQ ID NO: 869, SEQ ID NO: 870, SEQ ID NO: 871, SEQ ID NO: 872, SEQ ID NO: 873, SEQ ID NO: 874, SEQ ID NO: 875, SEQ ID NO: 876, SEQ ID NO: 877, SEQ ID NO: 878, SEQ ID NO: 879, SEQ ID NO: 880, SEQ ID NO: 881, SEQ ID NO: 882, SEQ ID NO: 883, SEQ ID NO: 884, SEQ ID NO: 885, SEQ ID NO: 886, SEQ ID NO: 887, SEQ ID NO: 888, SEQ ID NO: 889, SEQ ID NO: 890, SEQ ID NO: 891, SEQ ID NO: 892, SEQ ID NO: 893, SEQ ID NO: 894, SEQ ID NO: 895, SEQ ID NO: 896, SEQ ID NO: 897, SEQ ID NO: 898, SEQ ID NO: 899, SEQ ID NO: 900, SEQ ID NO: 901, SEQ ID NO: 902, SEQ ID NO: 903, SEQ ID NO: 904, SEQ ID NO: 905, SEQ ID NO: 906, SEQ ID NO: 907, SEQ ID NO: 908, SEQ ID NO: 909, SEQ ID NO: 910, SEQ ID NO: 911, SEQ ID NO: 912, SEQ ID NO: 913, SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 915, SEQ ID NO: 916, SEQ ID NO: 917, SEQ ID NO: 918, SEQ ID NO: 919, SEQ ID NO: 920, SEQ ID NO: 921, SEQ ID NO: 922, SEQ ID NO: 923, SEQ ID NO: 924, SEQ ID NO: 925, SEQ ID NO: 926, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 929, SEQ ID NO: 930, SEQ ID NO: 931, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 937, SEQ ID NO: 938, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 942, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945, SEQ ID NO: 946, SEQ ID NO: 947, SEQ ID NO: 948, SEQ ID NO: 949, SEQ ID NO: 950, SEQ ID NO: 951, SEQ ID NO: 952, SEQ ID NO: 953, SEQ ID NO: 954, SEQ ID NO: 955, SEQ ID NO: 956, SEQ ID NO: 957, SEQ ID NO: 958, SEQ ID NO: 959, SEQ ID NO: 960, SEQ ID NO: 961, SEQ ID NO: 962, SEQ ID NO: 963, SEQ ID NO: 964, SEQ ID NO: 965, SEQ ID NO: 966, SEQ ID NO: 967, SEQ ID NO: 968, SEQ ID NO: 969, SEQ ID NO: 970, SEQ ID NO: 971, SEQ ID NO: 972, SEQ ID NO: 973, SEQ ID NO: 974, SEQ ID NO: 975, SEQ ID NO: 976, SEQ ID NO: 977, SEQ ID NO: 978, SEQ ID NO: 979, SEQ ID NO: 980, SEQ ID NO: 981, SEQ ID NO: 982, SEQ ID NO: 983, SEQ ID NO: 984, SEQ ID NO: 985, SEQ ID NO: 986, SEQ ID NO: 987, SEQ ID NO: 988, SEQ ID NO: 989, SEQ ID NO: 990, SEQ ID NO: 991, SEQ ID NO: 992, SEQ ID NO: 993, SEQ ID NO: 994, SEQ ID NO: 995, SEQ ID NO: 996, SEQ ID NO: 997, SEQ ID NO: 998, SEQ ID NO: 999, SEQ ID NO: 1000, SEQ ID NO: 1001, SEQ ID NO: 1002, SEQ ID NO: 1003, SEQ ID NO: 1004, SEQ ID NO: 1005, SEQ ID NO: 1006, SEQ ID NO: 1007, SEQ ID NO: 1008, SEQ ID NO: 1009, SEQ ID NO: 1010, SEQ ID NO: 1011, SEQ ID NO: 1012, SEQ ID NO: 1013, SEQ ID NO: 1014, SEQ ID NO: 1015, SEQ ID NO: 1016, SEQ ID NO: 1017, SEQ ID NO: 1018, SEQ ID NO: 1019, SEQ ID NO: 1020, SEQ ID NO: 1021, SEQ ID NO: 1022, SEQ ID NO: 1023, SEQ ID NO: 1024 ou SEQ ID NO: 1025;

[00695] "SEQ ID NOs: 969-1025" refere-se a qualquer uma de SEQ ID NO: 969, SEQ ID NO: 970, SEQ ID NO: 971, SEQ ID NO: 972, SEQ ID NO: 973, SEQ ID NO: 974, SEQ ID NO: 975, SEQ ID NO: 976, SEQ ID NO: 977, SEQ ID NO: 978, SEQ ID NO: 979, SEQ ID NO: 980, SEQ ID NO: 981, SEQ ID NO: 982, SEQ ID NO: 983, SEQ ID NO: 984, SEQ ID NO: 985, SEQ ID NO: 986, SEQ ID NO: 987, SEQ ID NO: 988, SEQ ID NO: 989, SEQ ID NO: 990, SEQ ID NO: 991, SEQ ID NO: 992, SEQ ID NO: 993, SEQ ID NO: 994, SEQ ID NO: 995, SEQ ID NO: 996, SEQ ID NO: 997, SEQ ID NO: 998, SEQ ID NO: 999, SEQ ID NO: 1000, SEQ ID NO: 1001, SEQ ID NO: 1002, SEQ ID NO: 1003, SEQ ID NO: 1004, SEQ ID NO: 1005, SEQ ID NO: 1006, SEQ ID NO: 1007, SEQ ID NO: 1008, SEQ ID NO: 1009, SEQ ID NO: 1010, SEQ ID NO: 1011, SEQ ID NO: 1012, SEQ ID NO: 1013, SEQ ID NO: 1014, SEQ ID NO: 1015, SEQ ID NO: 1016, SEQ ID NO: 1017, SEQ ID NO: 1018, SEQ ID NO: 1019, SEQ ID NO: 1020, SEQ ID NO: 1021, SEQ ID NO: 1022, SEQ ID NO: 1023, SEQ ID NO: 1024 ou SEQ ID NO: 1025;

[00696] "SEQ ID NOs: 901-968" refere-se a qualquer uma de SEQ ID NO: 901, SEQ ID NO: 902, SEQ ID NO: 903, SEQ ID NO: 904, SEQ ID NO: 905, SEQ ID NO: 906, SEQ ID NO: 907, SEQ ID NO: 908, SEQ ID NO: 909, SEQ ID NO: 910, SEQ ID NO: 911, SEQ ID NO: 912, SEQ ID NO: 913, SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 915, SEQ ID NO: 916, SEQ ID NO: 917, SEQ ID NO: 918, SEQ ID NO: 919, SEQ ID NO: 920, SEQ ID NO: 921, SEQ ID NO: 922, SEQ ID NO: 923, SEQ ID NO: 924, SEQ ID NO: 925, SEQ ID NO: 926, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 929, SEQ ID NO: 930, SEQ ID NO: 931, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 937, SEQ ID NO: 938, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 942, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945, SEQ ID NO: 946, SEQ ID NO: 947, SEQ ID NO: 948, SEQ ID NO: 949, SEQ ID NO: 950, SEQ ID NO: 951, SEQ ID NO: 952, SEQ ID NO: 953, SEQ ID NO: 954, SEQ ID NO: 955, SEQ ID NO: 956, SEQ ID NO: 957, SEQ ID NO: 958, SEQ ID NO: 959, SEQ ID NO: 960, SEQ ID NO: 961, SEQ ID NO: 962, SEQ ID NO: 963, SEQ ID NO: 964, SEQ ID NO: 965, SEQ ID NO: 966, SEQ ID NO: 967 ou SEQ ID NO: 968;

[00697] "SEQ ID NOs: 1027-1218" refere-se a qualquer uma de SEQ ID NO: 1027, SEQ ID NO: 1028, SEQ ID NO: 1029, SEQ ID NO: 1030, SEQ ID NO: 1031, SEQ ID NO: 1032, SEQ ID NO: 1033, SEQ ID NO: 1034, SEQ ID NO: 1035, SEQ ID NO: 1036, SEQ ID NO: 1037, SEQ ID NO: 1038, SEQ ID NO: 1039, SEQ ID NO: 1040, SEQ ID NO: 1041, SEQ ID NO: 1042, SEQ ID NO: 1043, SEQ ID NO: 1044, SEQ ID NO: 1045, SEQ ID NO: 1046, SEQ ID NO: 1047, SEQ ID NO: 1048, SEQ ID NO: 1049, SEQ ID NO: 1050, SEQ ID NO: 1051, SEQ ID NO: 1052, SEQ ID NO: 1053, SEQ ID NO: 1054, SEQ ID NO: 1055, SEQ ID NO: 1056, SEQ ID NO: 1057, SEQ ID NO: 1058, SEQ ID NO: 1059, SEQ ID NO: 1060, SEQ ID NO: 1061, SEQ ID NO: 1062, SEQ ID NO: 1063, SEQ ID NO: 1064, SEQ ID NO: 1065, SEQ ID NO: 1066, SEQ ID NO: 1067, SEQ ID NO: 1068, SEQ ID NO: 1069, SEQ ID NO: 1070, SEQ ID NO: 1071, SEQ ID NO: 1072, SEQ ID NO: 1073, SEQ ID NO: 1074, SEQ ID NO: 1075, SEQ ID NO: 1076, SEQ ID NO: 1077, SEQ ID NO: 1078, SEQ ID NO: 1079, SEQ ID NO: 1080, SEQ ID NO: 1081, SEQ ID NO: 1082, SEQ ID NO: 1083, SEQ ID NO: 1084, SEQ ID NO: 1085, SEQ ID NO: 1086, SEQ ID NO: 1087, SEQ ID NO: 1088, SEQ ID NO: 1099, SEQ ID NO: 1100, SEQ ID NO: 1101, SEQ ID NO: 1102, SEQ ID NO: 1103, SEQ ID NO: 1104, SEQ ID NO: 1105, SEQ ID NO: 1106, SEQ ID NO: 1107, SEQ ID NO: 1108, SEQ ID NO: 1109, SEQ ID NO: 1110, SEQ ID NO: 1111, SEQ ID NO: 1112, SEQ ID NO: 1113, SEQ ID NO: 1114, SEQ ID NO: 1115, SEQ ID NO: 1116, SEQ ID NO: 1117, SEQ ID NO: 1118, SEQ ID NO: 1119, SEQ ID NO: 1120, SEQ ID NO: 1121, SEQ ID NO: 1122, SEQ ID NO: 1123, SEQ ID NO: 1124, SEQ ID NO: 1125, SEQ ID NO: 1126, SEQ ID NO: 1127, SEQ ID NO: 1128, SEQ ID NO: 1129, SEQ ID NO: 1130, SEQ ID NO: 1131, SEQ ID NO: 1132, SEQ ID NO: 1133, SEQ ID NO: 1134, SEQ ID NO: 1135, SEQ ID NO: 1136, SEQ ID NO: 1137, SEQ ID NO: 1138, SEQ ID NO: 1139, SEQ ID NO: 1140, SEQ ID NO: 1141, SEQ ID NO: 1142, SEQ ID NO: 1143, SEQ ID NO: 1144, SEQ ID NO: 1145, SEQ ID NO: 1146, SEQ ID NO: 1147, SEQ ID NO: 1148, SEQ ID NO: 1149, SEQ ID NO: 1150, SEQ ID NO: 1151, SEQ ID NO: 1152, SEQ ID NO: 1153, SEQ ID NO: 1154, SEQ ID NO: 1155, SEQ ID NO: 1156, SEQ ID NO: 1157, SEQ ID NO: 1158, SEQ ID NO: 1159, SEQ ID NO: 1160, SEQ ID NO: 1161, SEQ ID NO: 1162, SEQ ID NO: 1163, SEQ ID NO: 1164, SEQ ID NO: 1165, SEQ ID NO: 1166, SEQ ID NO: 1167, SEQ ID NO: 1168, SEQ ID NO: 1169, SEQ ID NO: 1170, SEQ ID NO: 1171, SEQ ID NO: 1172, SEQ ID NO: 1173, SEQ ID NO: 1174, SEQ ID NO: 1175, SEQ ID NO: 1176, SEQ ID NO: 1177, SEQ ID NO: 1178, SEQ ID NO: 1179, SEQ ID NO: 1180, SEQ ID NO: 1181, SEQ ID NO: 1182, SEQ ID NO: 1183, SEQ ID NO: 1184, SEQ ID NO: 1185, SEQ ID NO: 1186, SEQ ID NO: 1187, SEQ ID NO: 1188, SEQ ID NO: 1189, SEQ ID NO: 1190, SEQ ID NO: 1191, SEQ ID NO: 1192, SEQ ID NO: 1193, SEQ ID NO: 1194, SEQ ID NO: 1195, SEQ ID NO: 1196, SEQ ID NO: 1197, SEQ ID NO: 1198, SEQ ID NO: 1199, SEQ ID NO: 1200, SEQ ID NO: 1201, SEQ ID NO: 1202, SEQ ID NO: 1203, SEQ ID NO: 1204, SEQ ID NO: 1205, SEQ ID NO: 1206, SEQ ID NO: 1207, SEQ ID NO: 1208, SEQ ID NO: 1209, SEQ ID NO: 1210, SEQ ID NO: 1211, SEQ ID NO: 1212, SEQ ID NO: 1213, SEQ ID NO: 1214, SEQ ID NO: 1215, SEQ ID NO: 1216, SEQ ID NO: 1217 ou SEQ ID NO: 1218;

[00698] "SEQ ID NOs: 1429-1442" refere-se a qualquer uma de SEQ ID NO: 1429, SEQ ID NO: 1430, SEQ ID NO: 1431, SEQ ID NO: 1432, SEQ ID NO: 1433, SEQ ID NO: 1434, SEQ ID NO: 1435, SEQ ID NO: 1436, SEQ ID NO: 1437, SEQ ID NO: 1438, SEQ ID NO: 1439, SEQ ID NO: 1440, SEQ ID NO: 1441 ou SEQ ID NO: 1442;

[00699] "SEQ ID NOs: 1219-1428" refere-se a qualquer uma de SEQ ID NO: 1219, SEQ ID NO: 1220, SEQ ID NO: 1221, SEQ ID NO: 1222, SEQ ID NO: 1223, SEQ ID NO: 1224, SEQ ID NO: 1225, SEQ ID NO: 1226, SEQ ID NO: 1227, SEQ ID NO: 1228, SEQ ID NO: 1229, SEQ ID NO: 1230, SEQ ID NO: 1231, SEQ ID NO: 1232, SEQ ID NO: 1233, SEQ ID NO: 1234, SEQ ID NO: 1235, SEQ ID NO: 1236, SEQ ID NO: 1237, SEQ ID NO: 1238, SEQ ID NO: 1239, SEQ ID NO: 1240, SEQ ID NO: 1241, SEQ ID NO: 1242, SEQ ID NO: 1243, SEQ ID NO: 1244, SEQ ID NO: 1245, SEQ ID NO: 1246, SEQ ID NO: 1247, SEQ ID NO: 1248, SEQ ID NO: 1249, SEQ ID NO: 1250, SEQ ID NO: 1251, SEQ ID NO: 1252, SEQ ID NO: 1253, SEQ ID NO: 1254, SEQ ID NO: 1255, SEQ ID NO: 1256, SEQ ID NO: 1257, SEQ ID NO: 1258, SEQ ID NO: 1259, SEQ ID NO: 1260, SEQ ID NO: 1261, SEQ ID NO: 1262, SEQ ID NO: 1263, SEQ ID NO: 1264, SEQ ID NO: 1265, SEQ ID NO: 1266, SEQ ID NO: 1267, SEQ ID NO: 1268, SEQ ID NO: 1269, SEQ ID NO: 1270, SEQ ID NO: 1271, SEQ ID NO: 1272, SEQ ID NO: 1273, SEQ ID NO: 1274, SEQ ID NO: 1275, SEQ ID NO: 1276, SEQ ID NO: 1277, SEQ ID NO: 1278, SEQ ID NO: 1279, SEQ ID NO: 1280, SEQ ID NO: 1281, SEQ ID NO: 1282, SEQ ID NO: 1283, SEQ ID NO: 1284, SEQ ID NO: 1285, SEQ ID NO: 1286, SEQ ID NO: 1287, SEQ ID NO: 1288, SEQ ID NO: 1289, SEQ ID NO: 1290, SEQ ID NO: 1291, SEQ ID NO: 1292, SEQ ID NO: 1293, SEQ ID NO: 1294, SEQ ID NO: 1295, SEQ ID NO: 1296, SEQ ID NO: 1297, SEQ ID NO: 1298, SEQ ID NO: 1299, SEQ ID NO: 1300, SEQ ID NO: 1301, SEQ ID NO: 1302, SEQ ID NO: 1303, SEQ ID NO: 1304, SEQ ID NO: 1305, SEQ ID NO: 1306, SEQ ID NO: 1307, SEQ ID NO: 1308, SEQ ID NO: 1309, SEQ ID NO: 1310, SEQ ID NO: 1311, SEQ ID NO: 1312, SEQ ID NO: 1313, SEQ ID NO: 1314, SEQ ID NO: 1315, SEQ ID NO: 1316, SEQ ID NO: 1317, SEQ ID NO: 1318, SEQ ID NO: 1319, SEQ ID NO: 1320, SEQ ID NO: 1321, SEQ ID NO: 1322, SEQ ID NO: 1323, SEQ ID NO: 1324, SEQ ID NO: 1325, SEQ ID NO: 1326, SEQ ID NO: 1327, SEQ ID NO: 1328, SEQ ID NO: 1329, SEQ ID NO: 1330, SEQ ID NO: 1331, SEQ ID NO: 1332, SEQ ID NO: 1333, SEQ ID NO: 1334, SEQ ID NO: 1335, SEQ ID NO: 1336, SEQ ID NO: 1337, SEQ ID NO: 1338, SEQ ID NO: 1339, SEQ ID NO: 1340, SEQ ID NO: 1341, SEQ ID NO: 1342, SEQ ID NO: 1343, SEQ ID NO: 1344, SEQ ID NO: 1345, SEQ ID NO: 1346, SEQ ID NO: 1347, SEQ ID NO: 1348, SEQ ID NO: 1349, SEQ ID NO: 1350, SEQ ID NO: 1351, SEQ ID NO: 1352, SEQ ID NO: 1353, SEQ ID NO: 1354, SEQ ID NO: 1355, SEQ ID NO: 1356, SEQ ID NO: 1357, SEQ ID NO: 1358, SEQ ID NO: 1359, SEQ ID NO: 1360, SEQ ID NO: 1361, SEQ ID NO: 1362, SEQ ID NO: 1363, SEQ ID NO: 1364, SEQ ID NO: 1365, SEQ ID NO: 1366, SEQ ID NO: 1367, SEQ ID NO: 1368, SEQ ID NO: 1369, SEQ ID NO: 1370, SEQ ID NO: 1371, SEQ ID NO: 1372, SEQ ID NO: 1373, SEQ ID NO: 1374, SEQ ID NO: 1375, SEQ ID NO: 1376, SEQ ID NO: 1377, SEQ ID NO: 1378, SEQ ID NO: 1379, SEQ ID NO: 1380, SEQ ID NO: 1381, SEQ ID NO: 1382, SEQ ID NO: 1383, SEQ ID NO: 1384, SEQ ID NO: 1385, SEQ ID NO: 1386, SEQ ID NO: 1387, SEQ ID NO: 1388, SEQ ID NO: 1389, SEQ ID NO: 1390, SEQ ID NO: 1391, SEQ ID NO: 1392, SEQ ID NO: 1393, SEQ ID NO: 1394, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1396, SEQ ID NO: 1397, SEQ ID NO: 1398, SEQ ID NO: 1399, SEQ ID NO: 1400, SEQ ID NO: 1401, SEQ ID NO: 1402, SEQ ID NO: 1403, SEQ ID NO: 1404, SEQ ID NO: 1405, SEQ ID NO: 1406, SEQ ID NO: 1407, SEQ ID NO: 1408, SEQ ID NO: 1409, SEQ ID NO: 1410, SEQ ID NO: 1411, SEQ ID NO: 1412, SEQ ID NO: 1413, SEQ ID NO: 1414, SEQ ID NO: 1415, SEQ ID NO: 1416, SEQ ID NO: 1417, SEQ ID NO: 1418, SEQ ID NO: 1419, SEQ ID NO: 1420, SEQ ID NO: 1421, SEQ ID NO: 1422, SEQ ID NO: 1423, SEQ ID NO: 1424, SEQ ID NO: 1425, SEQ ID NO: 1426, SEQ ID NO: 1427 ou SEQ ID NO: 1428.

[00700] Em algumas modalidades, uma proteína recombinante descrito SV F pode incluir uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% (tal como pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou, pelo menos, 98% ou 100%) idêntico a qualquer uma das SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 232, SEQ 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Em várias modalidades o imunógeno se liga especificamente ao anticorpo ou inclui o sítio antigênico após incubação em PBS a pH 7,4 a 20°C durante 24 horas. Em algumas modalidades, o recombinante F de RSV polipeptídeo inclui uma das sequências a partir da sequência conjunto F e ainda inclui até 20 (por exemplo, até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19) substituições de aminoácidos (tal como substituições de aminoácidos conservativas, em que o recombinante F de RSV polipeptídeo se liga especificamente a um anticorpo específico pré-fusão F de RSV (tais como D25) e/ou inclui um sítio específico pré-fusão F de RSV antigênico (como sítio antigênico Ø). Os versados na técnica apreciarão que as sequências enumeradas acima pode compreender sequências líder, marcador de purificação, sítios de clivagem de protease para remover as marcadores de purificação de trimerização domínios, os domínios de subunidades de nanopartículas de proteína ou de outras sequências que não estão relacionados com a proteína F de RSV recombinante. Em várias modalidades, um imunógeno aqui proporcionado inclui uma proteína recombinante F de RSV de uma das sequências acima, mas não inclui as sequências líder, marcador de purificação, sítios de protease de clivagem para remover purificação domínios marcas trimerização, domínios de subunidades de nanopartículas de proteína ou outras sequências que não estão relacionados com a proteína F de RSV recombinante. Moléculas de ácidos nucleicos que codificam estas sequências proteicas são também fornece, assim como métodos de utilização das proteínas F de RSV recombinantes para gerar uma resposta imune para RSV em um indivíduo ou para prevenir ou tratar a infecção por RSV em um indivíduo.

III. EXEMPLOS

[00701] Os exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar características particulares de determinadas modalidades, mas o âmbito das reivindicações não deve estar limitado a estas características exemplificadas.

Exemplo 1

[00702] Estrutura do trímero F de Vírus Sincicial Respiratório pré- fusão ligado a um anticorpo humano

[00703] A conformação pré-fusão da glicoproteína de fusão (F) do vírus sincicial respiratório (RSV) é o alvo da maior parte dos anticorpos neutralizadores de RSV em soros humanos, mas sua metastabilidade tem dificultado a caracterização. Para superar este obstáculo, anticorpos que não se ligam à conformação pós-fusão de RSV F e são > 10 vezes mais potentes do que o anticorpo profilático palivizumabe (Synagis®), foram identificados. A estrutura de cocristal de um destes anticorpos, D25, em complexo com a glicoproteína F, revela bloqueio de D25 F em seu estado pré-fusão. Comparações das conformações pré-fusão e pós-fusão definem os rearranjos necessários para mediar a entrada de RSV. A estrutura da glicoproteína D25-F revela uma nova vulnerabilidade, um sítio antigênico 0, na parte de cima da glicoproteína F, o qual é específico e de caráter quaternário. A estrutura F do trímero pré-fusão de RSV, juntamente com a definição do sítio antigênico 0, deve permitir a concepção de antígenos para vacinas otimizados e orientar novas abordagens para a prevenção passiva de doenças induzidas pelo RSV.

[00704] O vírus sincicial respiratório (RSV) é onipresente, infectando quase todas as crianças de até 3 anos de idade (Glezen et al., Am. J. Dis. Child, 140, 543 (1986)). Nos Estados Unidos, a bronquiolite por RSV é a principal causa de hospitalização em lactentes e uma das principais causas da asma e alergia durante toda a infância (Shay et al., JAMA, 282, 1440 (1999); Hall et al., N. Engl J. Med., 360, 588 (2009)). Globalmente, RSV é responsável por 66,000-199,000 mortes a cada ano para crianças com menos de cinco anos de idade (Nair et al., Lancet, 375, 1545 (2010)) e responde por 7% das mortes entre crianças de 1 mês a 1 ano de idade - mais do que qualquer outro agente patogênico único, exceto a malária (Lozano et al., Lancet, 380, 2095 (2013)). A única intervenção de que dispõem é a administração passiva do anticorpo monoclonal licenciado palivizumabe (Synagis®), que reconhece a glicoproteína de fusão de RSV (F) (Johnson et al., J. Infect Dis, 176, 1215 (1997); Beeler e Coelingh van Wyke, J.Virol, 63, 2941 (1989)). e reduz a incidência de doença grave (O Grupo de Estudo, Pediatria, 102, 531 (1998) RSV IMpact-). A evidência clínica de que os anticorpos específicos para F de RSV podem proteger contra a doença provocou uma busca de melhores anticorpos (Collarini et al., J. Immunol, 183, 6338 (2009);. Wu et al., J. Mol Biol, 368, 652 (2007 );. Kwakkenbos et al, Nat Med, 16, 123 (2010)) e um esforço conjunto para desenvolver uma vacina eficaz (Graham, Immunol Rev., 239, 149 (2011))..

[00705] A glicoproteína F de RSV facilita a fusão das membranas virais e celulares (Walsh e Hruska, J. Virol, A1171 (1983)) é uma proteína de fusão de tipo I, com uma conformação pré-fusão metaestável que armazena energia dobrável, libertado durante um rearranjo estrutural a uma conformação pós-fusão altamente estável. Três sítios antigênicos (I, II e IV) foram encontrados para induzir atividade neutralizante (Arbiza et al., J. Gen. Virol, 73, 2225 (1992); Lopez et al., J. Virol, 72, 6922 (1998); Lopez et al., J. Virol, 64, 927 (1990)) e todos existir na forma de pós-fusão F conforme determinado por estudos estruturais e biofísicas (McLellan et al., J. Virol, 85, 7788 (2011); Swanson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108, 9619 (2011)). Absorção de soros humanos com pós-fusão F, no entanto, não consegue remover a maior parte da atividade neutralizadora F- específicos, o que sugere que a forma pré-fusão podem abrigar romance neutralizar sítios antigênicos (Magro et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109, 3089 (2012)). Apesar de extensa esforço, preparação homogênea de pré-fusão solúvel RSV F não foi obtida. Assim, a determinação da estrutura F e identificação de novos sítios antigênicos específicos do F tornaram-se prioridades pré-fusão convergentes para o desenvolvimento de novos anticorpos e vacinas profiláticas e terapêuticas. De acordo com estes objetivos, anticorpos específicos que poderia neutralizar o RSV, mas não se ligam a pós-fusão F foram identificados e a estrutura de F de RSV reconhecidos por estes anticorpos foi definido. Os resultados revelam a conformação pré-fusão de RSV F, o mecanismo de neutralização para uma categoria de anticorpos extremamente potentes e os detalhes em nível atômico para um sítio antigênico específico do pré-fusão que deve servir como um alvo de melhores terapias com bases em anticorpos e fornecer uma base para o desenvolvimento de antígenos de vacina eficazes.

[00706] Dois anticorpos humanos - D25 e AM22- foram determinados como sendo ~ 50 vezes mais potente do que o palivizumabe (Figura 1 A), para a neutralização de RSV F e que também não se ligam a uma forma solúvel de F de RSV estabilizado na conformação pós-fusão ( McLellan et al., J. Virol, 85, 7788 (2011)) (Figura IB). D25 e AM22 foram previamente descrito (Kwakkenbos et al., Nat Med, 16, 123 (2010); Pub. de Patente dos Estados Unidos 2010/0239593; Pub. de Patente dos Estados Unidos 2012/0070446). A falta de D25 e AM22 ligação à forma pós-fusão de F de RSV sugerido destes anticorpos pode reconhecer a conformação pré-fusão metaestável.

[00707] Esforços estruturais estavam focados em anticorpos humanos, AM22 e D25. Um formato de expressão placa de microtitulação de 96 cavidades (Pancera et al., PLoS One 2013; 8 (2): E55701, 2013, aqui incorporada por referência) foi usado para o rastreio de ligação destes anticorpos a um painel de variantes da glicoproteína F de RSV que eram capturada a partir de sobrenadantes de células em placas de Ni 2+ -NTA de ELISA. Se ligar a uma glicoproteína F construto anticorpo (F de RSV (+) DC), compreendendo os resíduos 1-513 F de RSV fundido com um domínio de trimerização fibritina C-terminal foi testado (Frank et al., J. Mol. Biol., 308, 1081 (2001)). No entanto, os complexos não foram formados por mistura de F de RSV purificada (+) Fd com D25 purificada ou anticorpo AM22. Determinou-se que a purificação da glicoproteína F solúvel desencadeada no estado pré- fusão metaestável (Chaiwatpongsakorn et al., J. Virol, 85, 3968 (2011).); para ultrapassar esta instabilidade, as células que expressam F de RSV (+) DC foram incubadas com fragmentos de ligação ao antígeno (FAB) ou imunoglobulinas (o último com um sítio de protease de clivagem de HRV3C na região de charneira (McLellan et al., Nature 480, 336, ( 2011)), a fim de armadilha F no estado pré-fusão. Alternativamente, as células que expressam F de RSV (+) Fd foram cotransfectadas com cassetes de DNA de expressão separados codificando cadeias de anticorpo pesadas e--light (Figura 5). a expressão óptima de um D25 -F complexo de glicoproteína foi obtido a partir da cotransfecção de DNA que codifica Fab D25 com DNA que codifica para F de RSV (+) Fd; rendimentos razoáveis complexos foram também observadas a partir da adição de Fab solúveis.

[00708] Cristalizações foram rastreadas para o Fab P25 e AM22, sozinho ou em complexo com F de RSV (+) Fd. Dados de difração de raios-X a 1,6 A resolução foram obtidos na forma de cristais hexagonais de Fab D25 por si só e a estrutura foi resolvida por substituição molecular e refinado para Rcryst R&~ de 24,5/25,7% (Tabela 9). Dados para 3,6 Uma resolução foram obtidos em cristais cúbicos de Fab D25 em complexo com RSV F(+)Fd e esta estrutura foi resolvida por substituição molecular usando a estrutura D25 não ligado e porções do previamente determinado pós-fusão RSV F estrutura (McLellan et al., J. Virol, 85, 7788 (2011); Swanson et al., Proc Natl Acad Sci USA, 108, 9619 (2011)) como modelos de pesquisa, juntamente com indícios de um derivado de ouro. A estrutura do complexo foi refinado para Rcryst/Rft~ de 21,3/26,7% (Figura 1C) (Tabela 9).

[00709] Um complexo de um Fab D25 ligado a uma molécula de glicoproteína F de RSV estava presente na unidade assimétrica da rede cúbica. Trina simetria estrutura posicionada dois outros complexos D25- RS VF para gerar uma extensa RSV F interface de trimérica de 2098 A2. Observou-se a densidade de elétrons contínua para os resíduos 26 a 513, exceto para os resíduos 98-136, que incluiu o fragmento de 27 aminoácidos removidos por clivagem proteolítica do precursor de F0 para formar a F2 e subunidades F1 (que corresponde a N- e C-terminais fragmentos, respectivamente) da glicoproteína F madura. Três sítios de glicosilação N-ligados foram detectados na densidade de elétrons a resíduos de asparagina 27, 70 e 500 (Figura 2A).

[00710] Em geral, a F de RSV estrutura ligada-D25 consiste em dois lóbulos embalados em ambas as extremidades de um tambor aberto antiparalelo 7 com uma única cadeia, dois cordões de que (β2 e β7) estendem-se entre os dois lóbulos, ligações de hidrogénio por mais 70 A e formando porções integrais de ambos os lóbulos e do tambor central. O lobo-membrana proximal, que contém a F2 N-terminal e C- terminal F1, consiste de uma camada β-sanduiche triplo e três hélices (A8, A9 e A10). A hélice α10 faz parte de uma hélice que parecia estender-se na membrana viral e para que o domínio de trimerização da fibrina foi anexado. O lóbulo-membrana distal, cerca de 90 A a partir da membrana virai, é constituído por sete hélices, embalados em torno de uma folha anti-paralelo de cadeia tripla e uma β-hairpina (β3 + β4). Extensas contatos inter-protômero pareceu estabilizar a estrutura trimérica, em particular o N-terminal hidrofóbica da subunidade F1 (também conhecido como o peptídeo de fusão), que foi embalado pela tripla β-sanduiche do lóbulo proximal à membrana de uma protômero vizinha. O peptídeo de fusão, contida no interior da cavidade de outra forma oca do trímero, está ligado às hélices A2 e A3 expostos à superfície através de uma abertura cilíndrica entre os protômeros que é cerca de 10 A em diâmetro; esta abertura pode ser usada como um caminho de saída para o peptídeo de fusão durante o disparo.

[00711] A estrutura do ligado-D25 F glicoproteína assemelhava-se à estrutura pré-fusão do vírus parainfluenza relacionada 5 (PIV5) glicoproteína F (Welch et al., Proc Natl Acad Sci USA, 109, 16672 (2012); Yin et al., Nature, 439, 38 (2006)) (Figura 6 e 7). A forma ligada a D25 de F de RSV apareceu para ser, assim, na conformação pré- fusão (Figura 2). Para definir os rearranjos estruturais entre forma pré e pós-fusão F, _D25-bound de F de RSV foi comparada com a sua conformação pós-fusão, que foi recentemente determinada (McLellan et al., J. Virol, 85, 7788 (2011); Swanson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108, 9619 (2011).

[00712] Conformações pré- e pós-fusão de F de RSV revelaram alterações dramáticas na forma geral, a partir de uma estrutura em forma de oval relativamente compacto com uma altura de 110 A para um cone alargado cerca de 50% mais longo (170 A) (Figura 2A). Apesar desta mudança notável na conformação, a maioria da glicoproteína F estrutura secundária e terciária foi preservada em ambos os estados pré e pós-fusão, com 215 resíduos que mostram menos do que 2 Ca Um desvio entre as duas estruturas (Figuras 2A, B). Duas regiões de golpear mudança conformacional ocorrer. No lobo-membrana distal, o peptídeo de fusão e cinco elementos de estrutura secundária (A2, α3, β3, β4 e α4) juntar-se com o A5-hélice para formar uma única hélice pós-fusão estendida (a5post) de mais de 100 um de comprimento, que é limitada na sua extremidade N-terminal por o peptídeo de fusão (para ajudar na clareza, os elementos de estrutura secundária da estrutura pós-fusão são rotulados com "pós" subscrito). Na membrana lobo - proximal, o único fio paralelo (β22) do β-triplo que nos títulos pré-fusão estrutura de hidrogênio para βi- desvenda, permitindo que o pré-fusão ALO-hélice para se juntar com o a5post-hélice. Juntos, os a5post e al0post hélices justapor F1 N- e C-terminais para formar a estrutura em espiral enrolada de proteínas de fusão característico do tipo I na sua conformação pós-fusão (Colman e Lawrence, Nat Rev. Mol Cell Biol., 4, 309. (2003)). No geral, as porções de hélice Alo mover mais de 170 A entre conformações pré e pós-fusão.

[00713] Em comparação com o tipo pré-fusão clivada pela protease, anteriormente relatado estruturas I de hemaglutinina da gripe (Wilson et al., Nature, 289, 366 (1981)), Ebola GP (Lee et al., Nature, 454, 177 (2008)) e PIV5 F (Welch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109, 16672 (2012)), a localização do peptídeo de fusão de RSV é mais similar ao de hemaglutinina (Figura 7), o que é surpreendente, dado que PIV5 e RSV são ambos paramixovírus. O peptídeo de fusão F de RSV é enterrado no centro da cavidade oca trímero e situa-se mais do que 40 A distância a partir do último resíduo visível F2. Isto sugere que um rearranjo estrutural substancial do peptídeo de fusão ocorre após o precursor de F0 é clivado pela protease furina-hospedeiro como para produzir F1 F2. Além disso, os rearranjos estruturais dramáticas ocorrer entre conformações pré e pós-fusão, tanto na membrana-proximal e distal à membrana lóbulos, fornecendo informações sobre a dificuldade de estabilizar a conformação pré-fusão de RSV F. Ao contrário PIV5 F e F metapneumovírus humano, que podem ser estabilizadas no estado pré-fusão unicamente adicionando-se um motivo GCN4-trimerização para a extremidade C-terminal (Yin et al., Nature, 439, 38 (2006);., Wen et al, Nat Struct Mol Biol, 19, 461 ( 2012)), o pré-fusão F de RSV conformação necessário estabilizar tanto do lóbulo proximal à membrana (conseguido anexando um domínio de trimerização fibritina (Frank et al., J. Mol. Biol, 308, 1081 (2001)) e o lobo da membrana distal (o que ocorre através da ligação do anticorpo D25).

[00714] O anticorpo D25 reconhece o ápice distal da membrana da glicoproteína F de RSV (Figura 1C). Ele se liga a um epitopo quaternário, com a cadeia D25-pesado interagindo com um protômero (envolvendo 638 A2 de enterrado área superficial interativo no RSV) e a ligação a ambos o mesmo protômero (373 A2) e uma protômero vizinho corrente D25-luz (A2 112) (Figura 3A). F de RSV contatos são feitos por 5 dos 6 ansas determinantes de complementaridade de D25, com a cadeia pesada 3 CDR (CDR H3) interagindo com a A4-hélice (resíduos 196-210 F1) e intermoleculares formar ligações de hidrogénio com os resíduos 63 F2, 65, 66 e 68 no circuito entre β2 Fita e hélice ai. Enquanto os elementos estruturais secundários do epitopo D25 permanecem praticamente inalterados, a sua orientação relativa muda substancialmente, com hélice A4--180 ° em relação à secção β2 em pré e pós-conformações de fusão (Figura 3B). Este rearranjo estrutural explica a falta de D25 de se ligar moléculas F pós-fusão e sugere D25 inibe a fusão da membrana por estabilização da conformação pré-fusão do complexo trimérico glicoproteína F. Embora as proteínas F de RSV subtipos A e B humanos são altamente relacionado em sequência (447/472 ou 94,7% dos aminoácidos que compreendem o madura F2/F1 ectodomínio são idênticos entre os subtipos conhecidos), seis posições naturalmente observadas de variação de RSV-sequência (resíduos 67 e 74 em F2 e resíduos 200, 201, 209 e 213 em F1) estão localizados na região ligada por D25 (Figura 3C). Da mesma forma, um dos 56 aminoácidos de F de RSV de bovino que não são idênticos para o ectodomínio de RSV humano maduro F subtipo A, 13 estão nesta mesma região (Figura 3C). Assim, o epitopo D25, no vértice da estrutura pré-fusão F de RSV, pode estar sob pressão imunitária e servir como um determinante de imunidade específica do subtipo (Chambers et al., J. Gen. Virol., 73, 1717 (1992)). Por exemplo, com base na análise da sequência, uma região do laço em glicoproteínas F foi levantada a hipótese de existir dentro da família Paramyxoviridae que pode estar sob pressão imune (Chambers et al., J. Gen. Virol., 73, 1717 (1992)). Foi demonstrado que a ligação de anticorpos monoclonais específicos de RSV subgrupo pode ser realizada por mutações dirigidas ao sítio entre os resíduos 200 e F1216 (Connor et al., J. Med. Virol, 63, 168 (2001)) e que uma peptídeo compreendendo os resíduos 205-225 F1 poderia induzir atividade neutralizante em coelhos, apesar de um epitopo específico não foi definida (Corvaisier et al., Arch. Virol, 142, 1073 (1997)).

[00715] Para compreender a relação entre o epitopo D25 relação ao epitopos reconhecidos por outros anticorpos neutralizantes de RSV, competição para a ligação às células infectadas com RSV D25 foi testada (Figura 4A). Notavelmente, AM22 competiu com D25 para RSV F vinculativo, sugerindo que eles reconheceram o mesmo sítio antigênico. Para definir melhor o sítio reconhecido por estes anticorpos, foi realizada EM coloração negativa no Fab-F de RSV complexos. Em imagens de Fab D25-F de RSV complexos assemelhava-se a estrutura cristalina de Fab D25-F de RSV e também imagens EM de Fab AM22- F de RSV (Figura 4B). Juntos, estes resultados sugerem que os anticorpos D25 e AM22 reconhecem o mesmo ou um sítio antigênico altamente relacionado, o qual foi denominado "sítio antigênico 0".

[00716] Para caracterizar os anticorpos que reconhecem sítio antigênico 0, as suas propriedades funcionais foram examinados. Em adição à sua potência e especificidade extraordinária (Figura 1 A), todos os três anticorpos de fusão fortemente inibida quando adicionado pós- fixação (Figura 4C) e todos os três foram incapazes de bloquear a ligação de células à superfície (Figura 4D), sugerindo que o receptor de F de RSV se liga a uma região no F não bloqueado por estes três anticorpos. O domínio de ligação ao receptor na proteína F pneumovírus humana relacionada é um motivo RGD (Cseke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106, 1566 (2009)) que corresponde a F de RSV resíduos 361363, que residir na ponta de uma linha de assinante do tambor central, no lado do pré-fusão trímero F de RSV não bloqueado por ligação-D25. Embora estes anticorpos não impedir a fixação, as regiões de ambos F1 e F2 que compreende o sítio antigênico 0 são conhecidos por contribuir para a ligação à heparina (Feldman et al., J. Virol, 74, 6442 (2000); Crim et al., J. Virol, 81, 261 (2007)) e é possível que esta região pode contribuir para a fixação não específica com metades de sulfato de heparina na glicosaminoglicanas em concerto com a glicoproteína G e outras regiões de F. Por último, AM22 e anticorpos D25 neutralizado de forma similar em ambos Fab e contextos de imunoglobulina (Figura 8), indicando que a avidez de não jogar um papel dominante como faz para alguns anticorpos da gripe com vírus (Ekiert et al., Nature, 489, 526 (2012)). Em geral, a ligação e especificidade de neutralização fenótipos partilhados de D25 e AM22 e sugerem que estas propriedades pode ser característica de anticorpos que reconhecem o sítio antigênico 0. Em contraste, nenhum dos anticorpos que reconhecem outros sítios antigênicos associados F de RSV com atividade neutralizante ( sítios I, II e IV) partilham propriedades similares de neutralizar potência e pré- fusão F especificidade (Figura 9A-9B).

[00717] Apesar sítio antigênico 0 sendo parcialmente blindado do reconhecimento imunológico por múltiplos mecanismos, incluindo mascaramento conformacional (ele só está presente no estado pré- fusão metaestável), montagem quaternário (o sítio é compartilhado por protômeros RSV), variação antigênica (é um dos mais variável porções de F de RSV) e blindagem de glicana (o glicana ligado em televisão ligado a Asn70 está no topo do pré-fusão F trímero), todos os três anticorpos pré-fusão específicos parecem ter como alvo um epitopo similar. A localização do sítio antigênico 0 no ápice do trímero pré-fusão F deve ser facilmente acessível, mesmo na superfície do vírion aglomerado, o que pode explicar a observação de que a atividade de mais de neutralização em soros humanos induzida por infecção natural de RSV é dirigido contra a forma pré-fusão de RSV F (Magro et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109, 3089 (2012), embora outros sítios antigênicos pré-fusão específicos não pode ser excluída. A potência elevada de anticorpos contra o sítio antigênico 0 sugere que poderia ser desenvolvido para profilaxia passiva de doença induzida por RSV em recém-nascidos. Além disso, com base em vacina específica, pré-fusão anticorpo estimulação pode ser assistido por estabilização da forma pré- fusão de RSV F, talvez facilitada pela ligação entre porções móveis e imóveis da estrutura F através da concepção com base na estrutura de variantes de RSV F com ligações de dissulfureto. Note que a pré-fusão estabilizada contém todos os epitopos neutralizantes previamente caracterizados, bem como sítio antigênico 0. Definição da estrutura D25-F de RSV, portanto, fornece a base para várias novas abordagens para prevenir a doença induzida por RSV.

Materiais e métodos

[00718] Vírus e células. Reservas virais foram preparadas e mantidas como anteriormente descrito (Graham et al., J. Med. Virol, 26, 153 (1988)) expressando RSV-Proteína Fluorescente Verde (GFP) de RSV-GFP foi construído como anteriormente relatado (Hallak et al., Virology. 271, 264 (2000)). O título dos stocks RSV-GFP usados para fluxo com base em citometria de neutralização e de fusão ensaios foi 2,5 x 107 pfu/ml. O título do estoque RSV A2 usado para o ensaio de fixação foi de 1,02 x 105 cfu/ml. Células HEp-2 foram mantidas em meio essencial mínimo de Eagle contendo 10% de soro fetal de bovino (10% de EMEM) e foram suplementados com glutamina, penicilina e estreptomicina.

[00719] Criação de plasmídeos de expressão de anticorpo. O DNA que codifica anticorpos regiões variáveis pesada e leve foram códons optimizados para a expressão humana e sintetizados. AM22 e D25 regiões variáveis pesada e leve foram subclonados em plasmídeos de expressão contendo pVRC8400 em grelha domínios constantes humanos (para a cadeia pesada de IgG1 e para a cadeia leve kapa). Variantes do AM22 D25 e os plasmídeos de expressão da cadeia pesada foram feitas através da inserção de um sítio de protease quer HRV3C (GLEVLFQGP; SEQ ID NO: 355) ou um códon terminal na região de charneira.

[00720] Expressão e purificação de anticorpos e fragmentos Fab. Os anticorpos foram expressos por transfecção transitória de plasmídeos das cadeias pesada e leve em células HEK293F em suspensão a 37°C durante 4-5 dias. Os sobrenadantes de células foram passados sobre Proteína A agarose e os anticorpos ligados foram lavados com PBS e eluída com tampão de eluição de IgG em 1 volume/Loth de 1 M de Tris-HCl a pH 8,0. AM22 e Fab D25s foram criadas por digestão de IgG com Lys-C. A digestão foi inibida pela adição de comprimidos de coquetel inibidor da protease completos e as misturas de Fab e Fc foi passado para trás sobre Proteína A agarose para remover fragmentos Fc. O Fab que fluiu através da coluna foi ainda purificado por cromatografia de exclusão de tamanho.

[00721] Ensaios de neutralização de RSV. Neutralização mediada por anticorpos foi medida por um ensaio de neutralização de citometria de fluxo (Chen et al., J. Immunol. Methods, 362, 180 (2010). Resumidamente, as células HEp-2 foram infectadas com RSV-GFP e a infecção foi monitorizada como uma função de expressão da GFP em 18 horas após a infecção por citometria de fluxo. Os dados foram analisados por regressão encaixe e curva não linear (GraphPad Prism, GraphPad Software Inc., San Diego CA).

[00722] Ensaio de ligação de RSV F pós-fusão. Proteína F de RSV purificada, solúvel na conformação pós-fusão foi preparada conforme descrito em (McLellan et al., J. Virol, 85, 7788 (2011). Uma cinética de ELISA foi usado para testar a ligação dos anticorpos monoclonais para pós-fusão F de RSV como descrito anteriormente (McLellan et al., J. Mol. Biol, 409, 853 (2011). Resumidamente placas, de 96 cavidades Ni 2+ -NTA-revestidas (ThermoFisher Scientific) foram revestidas com 100 μl pós-fusão F de RSV (1 μg/ml) durante uma hora à temperatura ambiente 100 μl de anticorpo diluído. F0i adicionado a cada cavidade e incubados durante uma hora à temperatura ambiente. Os anticorpos ligados foram detectados por incubação das placas com 100 μl de cabra anti-camundongo de anticorpo conjugado com HRP de IgG (laboratórios de pesquisa Jackson imunorreatividade, West Grove, PA) ou HRP- conjugado anti-IgG humana (Santa Cruz Biolotechnology, Inc, Santa Cruz, CA) durante 1 hora em temperatura ambiente. Em seguida, 100 μl de Super AquaBlue ELISA (eBioscience, San Diego, CA) foi adicionado aos cada cavidade e as placas foram lidas imediatamente, usando um leitor de microplacas Dynex Technologies a 405 nm (Chantilly, VA). Entre passos, as placas foram lavadas com PBS-T.

[00723] Coleta de dados de cristalização e raios X para Fab D25 não ligado. Condições de cristalização foram pesquisadas usando uma cristalização robô cartesiano abelha e cristais iniciais foram cultivadas pelo método de difusão de vapor em sessão gotas a 20°C por mistura de 0,2 μl de Fab D25 com 0,2 μl de solução reservatório (22% (peso/v) de PEG 4000, 0,1 M de acetato de sódio pH 4,6). Os cristais foram reproduzidos manualmente na suspensão gotas através da combinação de proteínas e uma solução reservatório em uma razão de 2: 1. Os cristais foram rapidamente congelados em azoto líquido em 27,5% (peso/v) de PEG 4000, 0,1 M de acetato de sódio a pH 4,5 e 15% (v/v) de 2R, 3R-butanodiol. Dados de difração de raios-X a 1,6 A foram coletadas no comprimento de onda de 1,00 A na SER-CAT ID-22 (Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory).

[00724] Determinação da estrutura e refino de Fab D25 não ligado. Dados de difração de raios-X foram integrados e escalados com o pacote HKL2000 (Otwinowski e menores, em Methods Enzymol. (Academic Press, vol. 276, pp. 307-326, 1997)) e uma solução de substituição molecular, usando os domínios de Ig de APO ID: 3GBM (Ekiert et al., Science, 324, 246 (2009)) e 3IDX (Chen et al., Science, 326, 1123 (2009)) como modelos de pesquisa foi obtido usando PHASER (McCoy et al., J. Appl Crystallogr., 40, 658 (2007)). Construto do modelo manual foi realizada usando COOT (Emsley et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 66, 486 (2010)) e refino de sítios individuais, parâmetros TLS e B-fatores individuais foi realizada em Phenix (Adams et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 66, 213 (2010)). A densidade de elétrons para os domínios variáveis D25 foi excelente, mas a densidade elétrica para os domínios constantes era pobre, possivelmente um resultado de flexibilidade do ângulo do cotovelo. Estatísticas de recolha de dados e refino final estão apresentados na Tabela 8.

[00725] Expressão e purificação de RSV(+)Fd em complexo com Fab D25. O F de RSV (+) Fd construto de proteína foi derivada a partir da cepa A2 (adesão P03420) com três substituições que ocorrem naturalmente (P102A, 1379 V e M447V) para aumentar a expressão. Um gene com códons optimizados mamífero que codifica F de RSV resíduos 1-513 com uma T4 fibritina trimerização motivo C-terminal (Frank et al., J. Mol. Biol, 308, 1081 (2001)), sítio de trombina, 6X marcador His e StreptagII foi sintetizado e subclonado em um vetor de expressão de mamífero derivado do pLEXm (Aricescu et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 62, 1243 (2006)). Os plasmídeos que expressam F de RSV (+) Fd, a cadeia leve D25 e a cadeia pesada D25 (com ou sem um códon terminal na região de charneira) foram simultaneamente transfectadas em células HEK293 (Reeves et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 13419 (2002)) em suspensão. Como alternativa, apenas o F de RSV (+) Fd plasmídeo pode ser transfectado, com Fab D25 purificado adicionado a "células a GnTT '3 horas após a transfecção. Após 4-5 dias, o sobrenadante celular foi coletado, centrifugado, filtrado e concentrado. O complexo foi inicialmente purificado por meio de resina de Ni 2+ -NTA (Qiagen, Valência, CA) usando um tampão de eluição constituído por 20 mM de Tris-HCl a pH 7,5, NaCl 200 mM e imidazol a 250 mM pH 8,0. O complexo foi então concentrado e purificado adicionalmente sobre resina StrepTactin de acordo com as instruções do fabricante (Novagen, Darmstadt, Alemanha). Após uma incubação de um dia para o outro com a protease de trombina (Novagen) para remover os marcadores His e Strep, um excesso de Fab D25 foi adicionado ao complexo, que foi depois purificado sobre uma coluna de Superose6 filtração em gel (GE Healthcare) com um tampão de corrida de 2 mM Tris-HCl pH 7,5, NaCl a 350 mM e 0,02% de NaN3. O complexo eluída foi diluído com um volume igual de água e concentrada até ~ 5 mg/ml. Procedimentos similares foram usados para expressar e purificar complexos Fab AM22.

[00726] Coleta de dados de cristalização e raios X de RSV F(+)Fd em complexo com Fab D25. Cristais iniciais foram cultivadas pelo método de difusão de vapor em sessão gotas a 20°C por mistura de 0,1 μl de F de RSV (+) Fd obrigado a Fab D25 com 0,1 μl de solução reservatório (40% (peso/v) de PEG 400, 5% (peso/v) de PEG 3350, 0,1 M e acetato de sódio pH 5,5) (Majeed et al., Structure, 11, 1061 (2003)). Os cristais foram reproduzidos manualmente na suspensão gotas e o cristal a 3,6 A foi cultivado usando uma solução de reserva contendo 30% (peso/v) de PEG 400, 3,75% (peso/v) de PEG 3350, 0,1 M de HEPES pH 7,5 e 1% (v/v) de 1, 2-butanodiol. O cristal foi transferida diretamente a partir da gota e dados de difração de raios-X foram coletados remotamente em um comprimento de onda de 1,00 A no SER- CAT ID-22.

[00727] Determinação da estrutura e refino de RSV F(+)Fd em complexo com Fab D25. Dados de difração de raios-X foram integrados e escalados com o pacote HKL2000 (Otwinowski e menores, em Methods Enzymol. (Academic Press, vol. 276, páginas 307-326, 1997)) e uma solução de substituição molecular foi obtido por PHASER ( McCoy et al., J. Appl. Crystallogr., 40, 658 (2007)), usando a estrutura D25 não ligado e resíduos de Fab 29-42, 49-60, 78-98, 219-306, 313322, 333-343 e 376-459 do VRS pós-fusão F estrutura (PDB ID: 3RRR, McLellan et al., J. Virol, 85, 7788 (2011)) como modelos de pesquisa. Seis sítios de um derivado NaAuCl mapeado para conhecidas cadeias laterais reativas (F resíduos Met97/Hisl59, Met264/Met274, His317 e Met396; resíduos de cadeia pesada D25 Met19/His82 e His59). Manual de construto do modelo foi realizado usando COOT (Emsley et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 66, 486 (2010)), com elementos de estrutura secundária a ser construído primeiro. Refino dos sítios individuais, parâmetros TLS e B-fatores individuais foi realizada em Phenix (Adams et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 66, 213 (2010)), usando a estrutura Fab D25 não ligado e as porções de RSV pós-fusão F estrutura como modelos de referência durante o refino. Todos os resíduos de F de RSV na proteína madura foram construídos com exceção dos resíduos no C-terminal F2 para Met97. Estatísticas de coleta de dados final e refino são apresentados na Tabela 9.

[00728] Ensaio de ligação competitiva de RSV F. Ligação de anticorpos de competição foi realizado em RSV infectadas células HEp- 2. Células HEp-2 foram infectadas com 3 MOI (multiplicidade de infecção) de RSV durante 18-20 horas. Após a infecção, as células foram separadas usando uma solução de dissociação de células (Cellstripper, Mediatech Inc., Herndon, VA) e lavado com PBS. As células foram semeadas a 5 xlO4/cavidade em placas de 96 cavidades de fundo em U em PBS. Os anticorpos monoclonais AM22, D25, 101F e foram diluídos a partir de uma concentração de 100 μg/ml e adicionou- se células HEp-2. Após 30 minutos de 100 μl de Alexa 488 D25 conjugado foi adicionada a uma concentração de 1 μg/ml e incubados a 4°C durante uma hora. As células foram lavadas uma vez com PBS e depois fixadas com paraformaldeído a 0,5%. A ligação de D25-Alexa 488 em células foi medida por citometria de fluxo (instrumento LSR II, Becton Dickinson, San José, CA). Os dados foram analisados usando o software FlowJo, versão 8.5 (Tree Star, San Carlos, CA).

[00729] Análise de microscopia eletrônica de coloração negativa. As amostras foram adsorvido em redes revestidas de carbono recém-descarregada fulgor, enxaguadas brevemente com água e corados com formato de uranila a 0,75%. As imagens foram gravadas em um microscópio FEI T20 com uma câmera CCD Águia. A análise de imagem 2D e cálculo da média foi realizada com bsoft (Heymann e Belnap, J. Struct. Biol, 157, 3 (2007) e REMA (Ludtke et al., J. Struct. Biol, 128, 82 (1999)).

[00730] Ensaio de inibição da fusão de vírus RSV-célula. A capacidade dos anticorpos para inibir a fusão do vírus de RSV-a-célula foi medida como descrito anteriormente (McLellan et al., J. Virol, 84, 12236 (2010)). Resumidamente, as células HEp-2 foram semeadas em placas de 96 cavidades, cultivadas durante 24 horas a 37°C e em seguida arrefecida a 4°C durante uma hora antes do ensaio. RSV-GFP foi adicionado a células pré-refrigerada a 4°C, e, em seguida, as células foram lavadas em PBS frio para remover o vírus não ligado. Anticorpos diluído em série foram adicionados a células refrigerados e incubadas durante 1 hora a 4°C, antes de transferir para 37°C durante 18 horas. Após a incubação, as células foram tripsinizadas, fixo em 0,5% de paraformaldeído e analisadas por citometria de fluxo para determinar a frequência de células expressando GFP.

[00731] Ensaio de inibição de RSV. A capacidade dos anticorpos para inibir a ligação de RSV para células foi medida como descrito anteriormente (McLellan et al., J. Virol, 84, 12236 (2010)). Resumidamente, as células HEp-2 foram dispersas em meios, lavou-se com PBS frio, semeadas em placas de 96 cavidades de fundo em V e arrefeceu-se durante 1 hora a 4°C antes da utilização. Anticorpos e heparina, um inibidor conhecido de fixação de RSV, foram distribuídos em diluições em série, em seguida, misturado com o vírus da cepa RSV A2 por uma hora a 37°C. Meio de células gelada foi removido após a centrifugação e o vírus ou as misturas de vírus e os reagentes foram adicionados às células refrigerados e incubadas durante 1 hora a 4°C. Após a incubação, as células foram lavadas em PBS frio para remover vírus não ligado e fixadas com paraformaldeído a 0,5%. Os vírus em células ligadas foram detectados com conjugado de cabra FITC-anticorpo anti-RSV. As células foram lavadas em PBS frio e avaliadas por citometria de fluxo. Intensidades de fluorescência mediana de vírus ligados foram analisados com software FlowJo, versão 8.5 (Árvore Star, San Carlos, CA). Tabela 9. Coleta de dados cristalográficos e estatísticas de refino

Exemplo 2 Estabilização de proteínas F de RSV

[00732] Este exemplo ilustra a criação de F de RSV exemplificativas proteínas estabilizadas em uma conformação pré-fusão. A estrutura cristalina da proteína F de RSV, em complexo com Fab D25 (isto é, em uma conformação pré-fusão) em comparação com a estrutura do pós- fusão proteína F de RSV (descrito, por exemplo, em McLellan et al., J. Virol., 85, 7788, 2011, com coordenadas depositado como N° de Acesso PDB 3RRR) mostra os rearranjos estruturais dramáticas entre conformações pré e pós-fusão, tanto na membrana-proximal e distal à membrana lóbulos, proporcionando orientação para a estabilização da conformação pré-fusão de RSV F. com base -se em uma comparação da pré e pós-F de RSV estruturas de fusão, existem duas regiões que são submetidos a grandes alterações conformacionais, localizado no terminal N e C-terminais da subunidade F1. Por exemplo, como ilustrado na Figura 2, as posições 137-216 e 461-513 do polipeptídeo F1 sofrer rearranjo estrutural entre as conformações Pré e Pós-proteína F, enquanto que as posições 271-460 do polipeptídeo F1 mantêm-se relativamente inalterada. Este exemplo ilustra várias estratégias de estabilização da proteína F de RSV na sua conformação pré-fusão.

[00733] Para estabilizar a região N-terminal de F1, que é um componente do sítio antigênico 0 e está envolvido na ligação ao anticorpo D25, várias estratégias têm sido concebidos, incluindo a introdução de ligações de dissulfureto intra-protômero, ligações de dissulfureto inter-protômero, preenchimento da cavidade substituições de aminoácidos, substituições de reacondicionamento, a introdução de sítios de glicosilação ligados a N e as suas combinações.

Ligações de dissulfureto intraprotômero

[00734] Introdução de dois resíduos de cisteína que estão a uma distância suficientemente próxima para formar uma ligação de dissulfureto intra-protômero na pré-fusão, mas não pós-fusão, conformação pode bloquear a proteína na conformação F pré-fusão. Uma ligação de dissulfureto intramolecular pode ser formado dentro de um único protômero F2 F1 dentro do trímero e assim não seria reticular os três protômeros juntos. Especificamente, uma ponte dissulfureto formada entre uma região que muda de conformação e uma região que não muda de conformação em estruturas pré e pós-fusão deve bloquear a proteína na conformação pré-fusão. Um exemplo é o do mutante S155C/S290C, onde Serl55 está localizado em uma região que muda de conformação, enquanto que Ser290 é em uma região que não muda de conformação. Além disso, a formação de uma ligação de dissulfureto entre duas regiões que tanto a mudança de conformação, tais como dois resíduos localizados dentro F1 posiciona 137-216 ou dois resíduos localizados dentro F1 posições 461-513 ou um resíduo dentro F1 posições 137-216 e a segunda F1 posiciona dentro de 461-513, também pode ser suficiente para bloquear a proteína na conformação pré-fusão.

[00735] Usando os métodos descritos acima, vários pares de resíduos da proteína F de RSV foram determinados para estar em estreita proximidade suficiente na conformação pré-fusão, mas não a conformação pós-fusão, para formar uma ligação de dissulfureto intraprotômero se cisteínas foram introduz no resíduo correspondente as posições de pares. Estes pares de resíduos, bem como as substituições de aminoácidos que corresponde a SEQ ID NO: 1 necessários para introduzir os resíduos de cisteína nestas posições, são indicados na Tabela 10. Tabela 10 também apresenta um SEQ ID NO contendo as substituições indicadas e que corresponde a uma precursoras F0 constructo incluindo um peptídeo de sinal, F2 polipeptídeo (26-109) posições, polipeptídeo pep27 (posições 110-136), F1 polipeptídeo (posições 137-513), um domínio de trimerização (um domínio Foldon) e um sítio de clivagem da trombina (LVPRGS (posições 547-552 da SEQ ID NO: 185)) e marcadores de purificação (marcador His (HHHHHH (posições 553-558 da SEQ ID NO: 185)) e Strep Tag II (SAWSHPQFEK (posições 559-568 da SEQ ID NO: 185))). Tabela 10. Exemplos de pares de cisteína de ligação cruzada para estabilização de dissulfureto intra e inter-protômero

Ligações de dissulfureto intermoleculares

[00736] Introdução de dois resíduos de cisteína que estão a uma distância suficientemente próxima para formar uma ligação de dissulfureto inter-protômero na pré-fusão, mas não pós-fusão, conformação pode bloquear a proteína na conformação F pré-fusão. Uma ligação de dissulfureto inter-protômero seria formado entre protômeros adjacentes dentro do trímero e assim seria reticular os três protômeros juntos. Especificamente, uma ponte dissulfureto formada entre uma região que muda de conformação e uma região que não muda de conformação em estruturas pré e pós-fusão deve bloquear a proteína na conformação pré-fusão. Um exemplo é o do mutante A153C/K461C, onde Alal53 está localizado em uma região que muda de conformação, enquanto que Lys461 fica em uma região que não muda de conformação. Além disso, a formação de uma ligação de dissulfureto entre duas regiões que tanto a mudança de conformação, tais como dois resíduos localizados dentro F1 posiciona 137-216 ou dois resíduos localizados dentro F1 posições 461-513 ou um resíduo dentro F1 posições 137-216 e a segunda F1 posiciona dentro de 461-513, também pode ser suficiente para bloquear a proteína na conformação pré-fusão.

[00737] Usando os métodos descritos acima, vários pares de resíduos da proteína F de RSV foram determinados para estar em estreita proximidade suficiente na conformação pré-fusão, mas não a conformação pós-fusão, para formar uma ligação de dissulfureto inter- protômero se cisteínas foram introduzidos no correspondendo as posições de pares de resíduos. Estes pares de resíduos, bem como as correspondentes substituições de aminoácidos necessários para introduzir os resíduos de cisteína nestas posições, são indicados na Tabela 11. Tabela 11 também apresenta um SEQ ID NO contendo as substituições indicadas e que corresponde a um precursor F0, também incluindo um construto peptídeo sinal, F2 polipeptídicas (posições 26- 109), de polipeptídeos pep27 (posições 110-136), F1 polipeptídicas (posições 137-513), um domínio de trimerização (um domínio Foldon) e um sítio de clivagem de trombina (LVPRGS (posições 547-552 de SEQ ID NO: 185)) e marcadores de purificação (marcador His (HHHHHH (posições 553-558 da SEQ ID NO: 185)) e Strep Tag II (SAWSHPQFEK (posições 559-568 da SEQ ID NO: 185))). Tabela 11. Exemplos de pares de cisteína de ligação cruzada para estabilização de ligação de dissulfureto interprotômero

[00738] Adicionalmente, múltiplas mutações estabilizadores descritos aqui podem ser combinados para gerar um antígeno PreF contendo mais do que uma mutação de estabilização. Exemplos de tais construtos que contêm um primeiro e segundo par de resíduos que formam uma intra- ou uma ligação de dissulfureto inter-protômero são fornecidos na Tabela 12. A Tabela 12 também apresenta um SEQ ID NO contendo as substituições indicadas e que corresponde a um precursor construto também FO incluindo um peptídeo de sinal, F2 polipeptídeo (26-109) posições, polipeptídeo pep27 (posições 110-136), F1 polipeptídeo (posições 137-513), um domínio de trimerização (um domínio Foldon) e um sítio de clivagem da trombina (LVPRGS (posições 547 -552 de SEQ ID NO: 185)) e a purificação Tag (marcador His (HHHHHH (posições 553-558 da SEQ ID NO: 185)) e Strep Tag II (SAWSHPQFEK (posições 559-568 da SEQ ID NO: 185) )). Tabela 12. Exemplos de pares de cisteína de ligação cruzada para combinações de estabilização de dissulfureto intra e inter-protômero

[00739] Além disso, os aminoácidos podem ser inseridos (ou suprimido) a partir da sequência de proteína M para ajustar o alinhamento dos resíduos na estrutura da proteína F, de tal modo que pares de resíduos particulares estão a uma distância suficientemente próxima para formar uma ligação de dissulfureto intra ou inter-protômero na pré-fusão, mas não pós-fusão, conformação, o que, como discutido acima, irá estabilizar a proteína M no pré-fusão conformação. Exemplos de tais modificações são apresentados na Tabela 13. Tabela 13 também apresenta um SEQ ID NO contendo as substituições indicadas e correspondente a um precursor de F0 construto também incluindo um peptídeo de sinal, F2 polipeptídeo (26-109) posições, polipeptídeo pep27 (posições 110 -136), F1 polipeptídicas (posições 137-513), um domínio de trimerização (um domínio Foldon) e um sítio de clivagem da trombina (LVPRGS (posições 547-552 da SEQ ID NO: 185)) e marcadores de purificação (marcador His (HHHHHH (posições 553-558 da SEQ ID NO: 185)) e Strep Tag II (SAWSHPQFEK (posições 559-568 da SEQ ID NO: 185))). Tabela 13. Uso de inserções de aminoácidos para orientar proteínas F para aceitar ligações de dissulfureto inter- ou intraprotômero ou combinações das mesmas

Substituições para Preenchimento de Cavidade

[00740] A comparação da estrutura de cristal da proteína F de RSV, em complexo com Fab D25 (isto é, em uma conformação pré-fusão) em comparação com a estrutura do pós-fusão proteína F de RSV (descrito, por exemplo, em McLellan et al., J. Virol, 85, 7788, 2011; coordenadas estruturais da proteína F de RSV na sua conformação pós-fusão são depositadas no Protein Data Bank (PDB) como N° de Acesso PDB 3RRR) identifica várias cavidades ou bolsas internas na conformação pré-fusão que deve entrar em colapso para o F para a transição para a conformação pós-fusão. Estas cavidades estão listados na Tabela 14. Assim, o preenchimento destes cavidades internas estabiliza F no estado pré-fusão, através da prevenção de transição para a conformação pós-fusão. Cavidades são preenchidas por substituindo aminoácidos com cadeias laterais grandes para aqueles com pequenas cadeias laterais. As cavidades podem ser intra-cavidades ou cavidades protômero inter-protômero. Um exemplo de uma modificação da cavidade de preenchimento F de RSV para estabilizar a proteína de RSV na sua conformação pré-fusão é o S190F/V207L mutante.

[00741] Usando esta estratégia, várias modificações de preenchimento de cavidade foram identificados para estabilizar a proteína F de RSV na sua conformação pré-fusão. Estas modificações, são indicados na Tabela 14. Tabela 14 também listas A SEQ ID NO contendo as substituições indicadas e correspondente a um precursor de F0 constructo incluindo um peptídeo de sinal, F2 polipeptídeo (26109) posições, polipeptídeo pep27 (posições 110-136 ), FI polipeptídicas (posições 137-513), um domínio de trimerização (um domínio Foldon) e um sítio de clivagem da trombina (LVPRGS (posições 547-552 da SEQ ID NO: 185)) e marcadores de purificação (marcador His (HHHHHH (posições 553-558 de SEQ ID NO: 185)) e Strep Tag II (SAWSHPQFEK (posições 559-568 da SEQ ID NO: 185))). Tabela 14. Substituições de aminoácidos exemplificativas para preenchimento de cavidade

[00742] As cavidades indicadas são ditas por um pequeno resíduo de encosto da cavidade que pode ter uma mutação para um resíduo maior para encher a cavidade. Deve entender-se que outros resíduos (para além daquele a cavidade tem o nome de) pode também ter uma mutação para preencher a mesma cavidade.

Substituições de Reacondicionamento

[00743] Além disso, a conformação pré-fusão da proteína F de RSV pode ser estabilizada, aumentando as interações dos resíduos vizinhos, tais como através do aumento ou formação de interações hidrofóbicas- ligação de hidrogénio. Além disso, a conformação pré-fusão da proteína F de RSV pode ser estabilizada por redução de interações desfavoráveis ou repulsivas de resíduos que levam à conformação pré-fusão vizinha. Isto pode ser realizado através da eliminação de aglomerados de resíduos carregados de forma similar. Exemplos de tais modificações estão indicados na Tabela 15. Tabela 15 também apresenta um SEQ ID NO contendo as substituições indicadas e correspondente a um precursor de F0 constructo incluindo um peptídeo de sinal, F2 polipeptídeo (26-109) posições, polipeptídicas pep27 (posições 110- 136), F1 polipeptídeo (posições 137-513), um domínio de trimerização (um domínio Foldon) e um sítio de clivagem da trombina (LVPRGS (posições 547-552 da SEQ ID NO: 185)) e marcadores de purificação (marcador His (HHHHHH ( posições 553-558 da SEQ ID NO: 185)) e Strep Tag II (SAWSHPQFEK (posições 559-568 da SEQ ID NO: 185))). Tabela 15. Substituições de aminoácidos de reacondicionamento

Mutações de glicosilação

[00744] Além disso, a introdução de sítios de glicosilação ligados a N que seriam acessíveis-solvente na pré-fusão F de RSV, mas conformação solvente-inacessível no pós-fusão F de RSV podem estabilizar a conformação F de RSV no estado pré-fusão, impedindo adopção do estado pós-fusão. Para criar um sítio de glicosilação ligada a N, a sequência Asn-X-Ser/Thr (onde X é qualquer aminoácido exceto Pro) podem ser introduzidos. Isto pode ser conseguido por substituição de um aminoácido Ser/Thr dois resíduos do C-terminal de um resíduo nativo Asn ou por substituição de um aminoácido Asn dois resíduos N- terminal a um resíduo nativo Ser/Thr ou por substituição de ambos um resíduo Asn e Ser/Thr separados por um aminoácido não prolina.

[00745] Usando esta estratégia, foram identificados vários sítios para sítios de glicosilação ligados a N que seriam acessíveis-solvente na pré- fusão F de RSV, mas conformação solvente-inacessível no pós-fusão F de RSV conformação. Estas modificações estão indicados na Tabela 16. Tabela 16 também lista a SEQ ID NO contendo as substituições indicadas e correspondente a um precursor de F0 constructo incluindo um peptídeo de sinal, F2 polipeptídeo (26-109) posições, polipeptídeo pep27 (posições 110-136), FI polipeptídicas (posições 137-513), um domínio de trimerização (um domínio Foldon) e um sítio de clivagem da trombina (LVPRGS (posições 547-552 da SEQ ID NO: 185)) e marcadores de purificação (marcador His (HHHHHH (posições 553 -558 de SEQ ID NO: 185)) e Strep Tag II (SAWSHPQFEK (posições 559-568 da SEQ ID NO: 185))). Tabela 16. Exemplos de glicosilação N-ligada

Exemplo 3 Estabilização da membrana do lobo proximal de antígenos PreF

[00746] Como discutido acima, a estrutura de cristal da proteína F de RSV, em complexo com Fab D25 (isto é, em uma conformação pré- fusão) em comparação com a estrutura do pós-fusão proteína F de RSV ((descrito, por exemplo, em McLellan et al., J. Virol., 85, 7788, 2011, com coordenadas depositados como APO Adesão No. 3RRR)) mostra rearranjos estruturais dramáticas entre conformações pré e pós-fusão no lobo-membrana distal. Com base em uma comparação entre o pré e pós-F de RSV estruturas de fusão, existem duas regiões que são submetidos a grandes alterações conformacionais, localizado no terminal N e C-terminais da subunidade F1. Por exemplo, como ilustrado na Figura 2, as posições 137-216 e 461-513 do polipeptídeo F1 sofrer rearranjo estrutural entre as conformações Pré e Pós-proteína F, enquanto que as posições 271-460 do polipeptídeo F1 mantêm-se relativamente inalterada. Este exemplo ilustra várias estratégias de estabilizar a região C-terminal de F1, o que inclui a membrana do lobo proximal da proteína F de RSV. Várias estratégias têm sido identificadas, incluindo a introdução de um domínio de trimerização (como discutido acima), a introdução de pares de cisteína que podem formar uma ligação de dissulfureto que estabiliza a região C-terminal de FI e introdução de um domínio transmembrana (por exemplo, para aplicações incluindo uma membrana antígeno PreF).

Ligações de Dissulfureto

[00747] Uma estratégia para a estabilização da membrana do lobo proximal da proteína F é a introdução de uma ou mais substituições de cisteína que introduzem uma ligação de dissulfureto que estabiliza a que porção C-terminal de fios (por exemplo, para uma aplicação, incluindo um antígeno solúvel PreF). Tal estratégia pode ser combinada com qualquer uma das modificações de estabilização aqui proporcionados, por exemplo, aqueles descritos no Exemplo 2, tal como uma proteína F1 com uma substituição de cisteína S155C/S290C. Uma estratégia inclui a introdução de dois resíduos de cisteína que estão a uma distância suficientemente próxima para formar uma ligação de dissulfureto inter-protômero que liga a região C-terminal da proteína na conformação F1 pré-fusão. Uma ligação de dissulfureto inter-protômero seria formado entre protômeros adjacentes dentro do trímero e assim seria reticular os três protômeros juntos. Usando os métodos descritos acima, vários pares de resíduos da proteína F de RSV foram determinados para estar em estreita proximidade suficiente na conformação pré-fusão, para formar uma ligação de dissulfureto inter-cisteínas foram protômero se introduz com as posições de pares de resíduos correspondentes.

[00748] Exemplos de substituições de cisteína que podem ser introduzidos para gerar uma ligação de dissulfureto que estabiliza a membrana do lobo proximal incluem substituições de cisteína em pares de resíduos: (a) 486 e 487 (b) 486 e 487; com uma inserção entre as posições P 486/487 (c) 512 e 513 (d) 493; inserção de C entre 329/330 (e) 493; inserção de C entre 329/330 e inserção de C entre 492/493

[00749] Além disso, o comprimento do polipeptídeo F1 pode ser variada, dependendo da posição do par da cisteína C-terminal. Por exemplo, o polipeptídeo F1 pode incluir posições 137-481, que eliminam a hélice Alo do polipeptídeo F1.

[00750] Exemplos de construtos que contêm modificações, incluindo cisteínas nas estes pares de resíduos, bem como a descrição adicional estão listados na Tabela 17. Tabela 17 também apresenta um SEQ ID NO contendo as substituições indicadas e correspondente a um precursor de F0 construto também incluindo um peptídeo de sinal, F2 polipeptídeo (26-109 posiciona), polipeptídicas pep27 (posições 110- 136), Polipeptídeo F1 (com as posições variáveis).

[00751] Tabela 17. Ligações de dissulfureto para estabilizar a membrana do lobo proximal da proteína F

Domínios de Transmembrana

[00752] Outra estratégia para a estabilização da membrana do lobo proximal da proteína F é para incluir um domínio transmembrana na proteína F1, por exemplo, para uma aplicação, incluindo uma membrana ancorada antígeno PreF. Por exemplo, a presença das sequências transmembrana é útil para a expressão como uma proteína transmembrana para a preparação de vesículas de membrana. O domínio transmembrana podem ser ligados a uma proteína F1 contendo qualquer uma das mutações aqui proporcionados estabilizadores, por exemplo, aqueles descritos no Exemplo 2, tal como uma proteína F1 com uma substituição de cisteína S155C/S290C. Além disso, o domínio transmembrana pode ser ainda ligada a uma cauda citosólica RSV F1. Exemplos de construtos de precursor F0, incluindo um peptídeo de sinal, F2 polipeptídeo (26-109) posições, polipeptídeo pep27 (posições 110-136), F1 polipeptídeo (posições 137-513), um domínio transmembrana de RSV são fornecidas como SEQ ID NOs: 323 ( sem um domínio citosólico) e 324 (com um domínio citosólico).

Exemplo 4 Antígenos PreF com uma única cadeia

[00753] Este exemplo ilustra Proteínas F de RSV recombinantes que não possuem os sítios de clivagem de furina nativas, de tal modo que a proteína protômero F é formado como uma única cadeia de polipeptídeo, em vez de um heterodímero F2/F1.

[00754] A Tabela 18 lista vários antígenos PreF cadeia simples que incluem a eliminação de F posições 98-149, o que remove os dois sítios de clivagem da furina, o polipeptídeo pep27 e o peptídeo de fusão. As restantes porções das F1 e F2 polipeptídeos são unidas por um ligante. Além disso, várias estratégias podem ser empregues para estabilizar os construtos com uma única cadeia em uma conformação pré-fusão, incluindo o uso das estratégias descritas nos Exemplos 2 e 3, acima. A Tabela 18 também apresenta um SEQ ID NO contendo as substituições indicadas e correspondente a um precursor de F0 construto também incluindo um peptídeo de sinal, F2 polipeptídeo (26-109) posições, polipeptídeo pep27 (posições 110-136), polipeptídeo F1 (com as posições variáveis ). Tabela 18. Antígenos PreF com uma única cadeia Tabela 18. –continuaç

Exemplo 5 Proteína F de RSV estabilizada com uma ligação de dissulfureto e um domínio de trimerização

[00755] Este exemplo ilustra a produção de uma proteína F de RSV estabilizado com uma ligação de dissulfureto e um domínio de trimerização. Conforme ilustrado na Figura 10, os resíduos serina nas posições 155 e 290 (indicadas por setas e realce vermelho nos diagramas da fita) são adjacentes uns aos outros na conformação pré-fusão F de RSV, mas não na conformação pós fusão da proteína F de RSV. Além disso, as cadeias laterais destes resíduos são orientadas uma para a outra. No entanto, as cadeias laterais dos resíduos adjacentes para serina 155, 154 e valina lisina 156, são orientadas para fora a partir da cadeia lateral de serina 290. Em vista destes resultados, uma proteína F de RSV recombinante foi construído com S155C e S290C substituições. Espera- se que os resíduos de cisteína nesta 155/290 construto iria formar uma ligação de dissulfureto que iria bloquear a proteína F de RSV recombinante na conformação pré-fusão, mas que a incorporação de cisteínas nas posições 154 ou 156 (em vez de posição 155) não seria suficiente para produzir uma ligação de dissulfureto de estabilização.

[00756] Uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de RSV nativa F0 sofreu mutação usando técnicas convencionais de biologia molecular para codificar a proteína F de RSV denominado RSVF(+)FdTHS S155C, S290C e apresentada como SEQ ID NO: 185: MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDA KVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFEGFLLGV GSAIASGVAVÇKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNI ETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMÇI IKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSN RVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSN GCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSD EI±SA1GGYIPEAPR1K;OAYVRKIX;EWVL1JSTFLGGLVPR(ÍSHHHHHHSAWSHPOFEK (SEQ ID NO: 185).

[00757] RSVF(+)FdTHS S155C, S290C inclui um peptídeo de sinal (resíduos 1-25), F2 (resíduos 26-109 de polipeptídeos), Pep27 polipeptídicas (resíduos (110-136), F1 polipeptídeo (resíduos 137-513), o domínio Foldon ( os resíduos 514-544) e um sítio de clivagem da trombina (LVPRGS (posições 547-552 da SEQ ID NO: 185)) e marcadores de purificação (marcador His (HHHHHH (posições 553-558 da SEQ ID NO: 185)) e Strep Tag II (SAWSHPQFEK (posições 559-568 da SEQ ID NO: 185)).) construtos de controle também foram gerados com V154C K156C ou substituições, em vez da substituição S155C.

[00758] Quando expresso em células, RSVF(+)FdTHS S155C, S290C foi processado e expresso como uma proteína F de RSV estável e solúvel; no entanto, os construtos de controle com 154/290 ou 156/290 substituições não conseguiu expressar (provavelmente porque não se dobrar em uma conformação solúvel) (vide Figura 10).

[00759] O RSVF(+)FdTHS S 155C, S290C construto foi purificada e testada quanto à ligação de anticorpos à anticorpos específicos pré- fusão AM22 e D25, bem como 131-2a anticorpo (que se liga sítio I antigênico, presente no pré e pós-RSV fusão F conformações), motavizumabe e palivizumabee (que se ligam sítio antigênico II, presentes no pré e pós-F de RSV conformações de fusão) e anticorpo 101F (que se liga sítio antigênico IV, presente no pré e pós-fusão F de RSV conformações). Como mostrado na Figura 11 (gráfico da esquerda), todos estes anticorpos especificamente ligados ao RSVF purificado (+) FdTHS S155C, S290C constructo, indicando que RSVF(+)FdTHS S155C, S290C mantém uma conformação pré-fusão. Os resultados indicam ainda que este construto mantém sítios antigênicos I, II e IV, comum a ambas as pré e pós-fusão conformações de RSV F.

[00760] Para demonstrar que RSVF purificado (+) FdTHS S155C, é S290C em uma conformação trimérico, esta construto foi passado através de uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho. Como mostrado na Figura 11 (gráficos à direita) de uma preparação de RSVF purificado (+) FdTHS S 155C, S290C eluiu em um único pico correspondente ao peso molecular da proteína F trimérico. Em contraste, uma preparação de um construto de controle sem as substituições S155C e S290C, que não se espera que ser estabilizado na conformação pré-fusão, eluiu em vários picos, indicando a presença de rosetas de proteína e agregados F disparado, o que indica que esta construto de controle não é estável em uma conformação pré-fusão homogênea.

[00761] Para confirmar ainda que a RSVF(+)FdTHS S155C, S290C construto é estabilizada em uma conformação pré-fusão, estudos de microscopia electrónica foi realizada (Figura 12) e demonstram que a forma RSVF(+)FdTHS S155C, S290C população homogênea de estruturas com uma forma similar ao do pré-fusão conformação de F de RSV e significativamente diferente daquela da proteína F pós-fusão (imagem direita, de Martin et al., J. Gen. Virol., 2006).

[00762] Estudos de cristalografia foram realizados para demonstrar que RSVF purificado (+) FdTHS S155C, S290C é homogênea em solução. A formação de cristais na solução aquosa é um teste rigoroso para a homogeneidade de uma proteína em solução. Figura 15 mostra imagens dos cristais formados por RSVF purificado (+) FdTHS S155C, S290C em tampão aquoso contendo 0,2 M de sulfato de lítio, 1,64 M de tartrato de Na/K e CHES a 0,1 M, pH 9,5. A formação de RSVF(+)FdTHS S155C, cristais S290C em tampão aquoso demonstra que esta proteína é substancialmente homogênea na solução.

Exemplo 6 Indução de uma resposta imune de neutralização usando um antígeno PreF

[00763] Este exemplo ilustra a utilização de um antígeno para induzir a uma PreF neutralizante de RSV resposta imune em um indivíduo.

[00764] Camundongos CB6F1/J sem patógenos de oito semanas de idade (Jackson Labs) foram divididos em 5 grupos de 10 cada e imunizados com os seguintes regimes: 1) viver RSV A2 (RSV) em 5x106 pfu por via intranasal; 2) precipitado de alúmen de RSV inativado com formalina (FI-RSV) por via intramuscular (IM); 3) estabilizado pré-fusão RSV F (RSVF(+)FdTHS S155C, S290C; pré-fusão F) 20 ug em PolyLC 50 mg IM; 4) pós-fusão F de RSV trímero ((pós-fusão RSV) 20 μg em 50 ug PolyLC IM.

[00765] O Grupo 1 (RSV vivo) foi infectada uma vez no tempo 0 e todos os outros grupos foram imunizados nas semanas 0 e 3. O soro foi obtido na semana 5, duas semanas após a segunda injeção intramuscular ou cinco semanas após a infecção por RSV. Atividade de neutralização foi determinada pelo método seguinte: Os soros foram distribuídos como diluições de quatro vezes a partir de 1: 10 a 1: 40960, misturado com um volume igual de recombinante mKate-RSV que expressam F genes prototípicos a partir de qualquer cepa A2 (subtipo A) ou 18537 (subtipo B) e a proteína fluorescente Katushka e incubados a 37°C durante uma hora. Em seguida, 50 μl de cada diluição de soro de mistura/vírus foram adicionados a células HEp-2 As células que tinham sido semeadas a uma densidade de 30 μl em MEM (meio essencial mínimo) em cada cavidade de 384 cavidades placas de fundo óptico do preto e incubadas por 20-22 horas antes da análise espectrofotométrica em Ex. de 588 nm e Em. de 635 nm (SpectraMax Paradigm, Molecular Devices, Sunnyvale, CA 94089). A IC50 para cada amostra foi calculada pela curva de regressão de montagem e não linear usando GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego CA). Os valores de P foram determinados pelo teste t de Student. O método acima para medir a neutralização de RSV foi realizada substancialmente como descrito anteriormente (vide, por exemplo, Chen et al., J. Immunol Methods, 362: 180-184, 2010, aqui incorporado por referência), exceto que foi a leitura por um leitor de placas fluorescente, em vez de citometria de fluxo.

[00766] Usando este ensaio, as respostas de anticorpos acima geralmente -100 EC50 poderia ser considerado como protetor. Como mostrado nas Figuras 13 e 14, os camundongos administrados uma proteína F de RSV estabilizado em uma conformação pré-fusão (F de RSV (RSVF(+)FdTHS S155C, S290C) produziu uma resposta imune neutralizante para RSV A ~ 15 vezes maior do que a produzida por camundongos administrado um F de RSV 14 proteína em uma conformação pós-fusão e uma resposta a RSV B ~ 5 vezes maior do que a produzida por camundongos administrados uma proteína F de RSV em uma conformação pós-fusão. A Figura 13 mostra os resultados após 5 semanas após a imunização-inicial e a Figura mostra os resultados após 7 semanas após a imunização. A média provocou valores de IC50 são também mostradas na Figura 13 e 14. A diferença na neutralização de RSV entre A e B subgrupos não é surpreendente que o RSVF(+)FdTHS S155C, S290C construto é derivado uma proteína F de RSV a partir de um subgrupo A. Espera-se que a imunização com um construto correspondente derivada de uma cepa de RSV B iria gerar soros neutralizantes mais específico para o RSV B (vide F1g. 41).

[00767] Além disso, demonstrou-se que o pré-fusão F estabilizado pode ser formulado em alúmen, bem como PolyLC e retêm a imunogenicidade conferida por respostas de anticorpos ao sítio antigênico 0. Os camundongos BALB/c foram imunizados com 20 μg da versão/S290C S155C de DS pré-fusão estabilizado F derivado de subtipo A e formulado com (gel de hidróxido de alumínio a 10 mg/ml, Brenntag, Frederikssund, Dinamarca) ou alúmen PolyLC. Os camundongos foram inoculados com 0 a 3 semanas e no ponto de tempo de 5 semanas (2 semanas após a segunda injeção), o soro foi obtido por ensaios de neutralização (vide Figura 42). Os resultados mostram que a imunização com uma proteína F de RSV estabilizado em uma conformação pré-fusão produz uma resposta imune protetora contra RSV.

Exemplo 7 Tratamento de indivíduos com os antígenos descritos

[00768] Este exemplo descreve métodos que podem ser usados para tratar um indivíduo que tem ou está em risco de ter uma infecção de RSV através da administração de um ou mais dos antígenos descritos PreF ou um ácido nucleico ou um vetor que codifica a viral, que expressam ou que inclui um antígeno PreF. Em exemplos particulares, o método inclui o rastreio de um indivíduo possuindo, pensado para ter ou em risco de ter (por exemplo, devido a imunidade comprometida, estado fisiológico ou exposição a RSV) uma infecção por RSV. Indivíduos de um estado de infecção desconhecido pode ser examinado para determinar se eles têm uma infecção, por exemplo, usando os testes serológicos, exame físico, ligado ensaio imunoenzimático (ELISA), de rastreio radiológico ou outra técnica de diagnóstico conhecidos daqueles versados na técnica. Em alguns exemplos, um indivíduo é selecionada, que tem uma infecção por RSV ou está em risco de adquirir uma infecção por RSV. Os indivíduos foram encontrados para (ou conhecidos) ter uma infecção de RSV e, assim, tratável por administração dos antígenos descritos PreF ou um ácido nucleico ou um vetor que codifica a viral, que expressam ou incluindo um antígeno PreF são selecionados para receber os antígenos PreF ou uma nucleico ácido ou um vetor que codifica a viral ou expressar um antígeno incluindo PreF. Os indivíduos também podem ser selecionados que estão em risco de desenvolver uma infecção por RSV por exemplo, os idosos, os imunocomprometidos e os muito jovens, tais como crianças.

[00769] Assuntos selecionados para tratamento pode ser administrada uma quantidade terapêutica de antígenos PreF descritos. Uma composição imunogênica, incluindo o antígeno PreF pode ser administrado em doses de 0,1 mg kg de peso corporal a cerca de 1 mg/kg de peso corporal por dose, tal como 0,1 mg kg de peso corporal a cerca de 1 ug/kg de peso corporal, 0,1 ug/kg de peso corporal para cerca de 10 ug/kg de peso corporal por dose, de 1 mg kg de peso corporal - 100 ug/kg de peso corporal por dose, 100 ug/kg de peso corporal - 500 ug/kg de peso corporal por dose ou 500 ug/kg de peso corporal - 1000 ug/kg de peso corporal por da dose ou mesmo maior. Em algumas modalidades, cerca de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou cerca de 100 ug do antígeno PreF está incluído na composição imunogênica que é administrado ao indivíduo em uma dose única. A composição imunogênica pode ser administrada em várias doses, por exemplo continuamente, diariamente, semanalmente ou mensalmente. O modo de administração pode ser qualquer usado na técnica, tal como a administração nasal. A quantidade de agente administrado ao indivíduo pode ser determinada por um médico e podem depender do indivíduo particular tratado. Quantidades específicas exemplificativas são fornecidos aqui (a descrição mas não está limitado a estas doses).

Exemplo 8 Proteína F de RSV estabilizada com uma ligação de dissulfureto, substituições de preenchimento de cavidade e um domínio de trimerização

[00770] Este exemplo ilustra a produção de uma proteína F de RSV estabilizada com uma ligação de dissulfureto e um domínio de trimerização.

[00771] A Figura 16 mostra a estrutura de uma proteína F de RSV recombinante estabilizadas por engenharia mutações ligação de dissulfureto S155C e S290C (denominado "DS"), as mutações- preenchimento de cavidade S190F e V207L (denominado "Cav1") e um domínio de trimerização heterólogo anexado ao C -terminus do polipeptídeo F1 da proteína F. A estrutura tridimensional representado é a estrutura F de RSV ligadas a D25 e é mostrado com dois dos protômeros indicadas como uma superfície de cor-de-rosa molecular e castanho e o terceiro protômero exibido como fitas. Os resíduos N- e C- terminais de F1 que se movem mais do que 5 A entre os pré e pós-fusão conformações são mostrados. Inserções mostram a ligação de dissulfureto entre os resíduos de engenharia S 155C e S290C, assim como as mutações da cavidade de preenchimento de espaço e S190F V207L. Um modelo do fago T4 fibritina domínio de trimerização é mostrado na base do trímero pré-fusão.

[00772] Uma proteína F de RSV, incluindo a 155C S, S290C, S 190F e V207L (Cav1) substituições em RSV de subtipo humano A e o domínio Foldon heterólogo C-terminal apensa, foi expressa e purificada usando os métodos descritos no Exemplo 1 e 5 e está denominadas RSV_A F(+)FdTHS DSCav1.

[00773] A caracterização antigênica de RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 são mostrados na F1gura 17. As taxas de associação e dissociação de D25 solúvel, AM22, 5C4, 101F, Motavizumabe e palivizumabe Fab com imobilizada RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 foram medidos usando um OctetRED 384 ™ instrumento (ForteBio, Melno Park, CA). As constantes de dissociação de equilíbrio para cada um dos anticorpos são fornecidos.

[00774] A pureza de RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 é ilustrada por meio de cromatografia de exclusão por tamanho (Figura 18). A proteína purificada, após clivagem da trombina para remover os marcadores, foi passado através de uma coluna de exclusão de tamanho Superose 6 16/70. O volume de eluição é consistente com um trímero glicosilada.

[00775] As características antigênicas e físicas, incluindo o rendimento a partir de plasmídeos expressos transitoriamente, antigenicidade contra vários sítios antigênicos e a retenção de ligação de D25 (fornecida como uma quantidade fraccionada) após 1 hora de incubação a várias temperaturas (NaCl a 350 mM, pH 7,0, a 50°C, 70°C ou 90°C), pH (NaCl a 350 mM pH 3,5 ou pH 10, a 25°C) e osmolalidade (10 mm ou 3000 mm osmolaridade, pH 7,0, a 25°C) ou de 10 ciclos de congelação-descongelação (em NaCl a 350 mM pH 7,0), de RSV_A F(+)FdTHS variantes estabilizadas por DS, Cav1 DSCav1 ou mutações são mostradas na Figura 19. A variante retém DSCav1 sítio antigênico 0 reconhecimento, com uma melhor estabilidade física, tal como avaliado por uma maior retenção de D25-reatividade após a exposição a condições extremas de temperatura, pH, osmolalidade e congelamento-descongelamento, então ou DS ou variantes Cav1.

[00776] Para investigar as propriedades estruturais do mutante DSCav1, a estrutura de RS V_A F(+)FdTHS DSCav1 foi determinada usando cristalografia de raios-X tridimensional. Figura 20 mostra uma representação em fita do 3.1 Uma estrutura de cristal de RSV_A F(+)FdTHS DSCav1. Cores mais quentes e fitas mais espessas correspondem ao aumento B-fatores. Apesar mutações estabilizantes, sítio antigênico 0, no ápice trímero, retém uma flexibilidade significativa. Figura 21 mostra a comparação da estrutura de RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 para a estrutura ligada de RSV-D25 F. A F1g. 22 destaques as mutações estabilizadoras em RSV_A F(+)estrutura FdTHS DSCav1. Densidade de elétrons observado correspondente à ligação de dissulfureto entre os resíduos cisteína 155 e 290 (à esquerda), bem como o resíduo Phe190-preenchimento de cavidade (à direita), indica que estas modificações estão presentes no cristal.

[00777] Para determinar a imunogenicidade da RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 construir, camundongos e primatas não humanos foram inoculados com esta construto e os soros obtidos a partir dos animais inoculadas foram testadas para a neutralização de RSV (Figuras 23 e 24). Os camundongos foram imunizados e a atividade de neutralização dos soros resultante foi testada, como descrito no Exemplo 6, acima. Resumidamente, camundongos CB6 dez por grupo foram imunizados com 10 ug de proteína F de RSV indicado misturada com 50 ug de poli I: C adjuvante. As imunizações ocorreram com 0 a 3 semanas e os soros de semana 5 e na semana 7 foram testados para a neutralização de RSV subtipo A (RSV_A) e B (RSV_B). Os valores médios são indicados por linhas vermelhas horizontais. Animais Macaca mulatta de origem indiana pesando 8.76-14.68 kg por via intramuscular foram injetados com imunógenos na semana 0 e na semana 4. O sangue foi coletado a cada duas semanas por até 6 semanas. Quatro macacos rhesus RSV- ingénuos por grupo foram imunizados por via intramuscular com 50 ng de proteína F de RSV indicado misturado com 500 ug de poli I: C adjuvante. As imunizações ocorreram às 0 e 4 semanas e soros de seis semanas foram testadas quanto à neutralização de RSV subtipo A (à esquerda) e B (direita). Os valores médios são indicados por linhas vermelhas horizontais. Tomados em conjunto, estes resultados mostram que o RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 constructo gerada com êxito uma resposta neutralizante em camundongos e primatas não humanos.

Exemplo 9 Concepção com base em estrutura de uma vacina de glicoproteína de fusão para vírus sincicial respiratório

[00778] Sumário. O vírus sincicial respiratório (RSV) é a principal causa de hospitalização para crianças menores de cinco anos de idade. Para obter respostas humorais de proteção contra RSV, os esforços se concentraram no sítio antigênico 0, um sítio específico para o estado pré-fusão da fusão (F) glicoproteína, como este sítio é o principal alvo dos anticorpos neutralizadores de RSV altamente potentes provocada pela infecção natural. Estrutura de design para a engenharia versões estabilizadas de F que preservaram sítio antigênico 0 a extremos de pH e temperatura usado. Seis estruturas cristalinas-F estabilizados fornecidos detalhes em nível atômico para resíduos de cisteína introduzidos e encheu cavidades hidrofóbicas e revelou sutilmente diferente "pré-fusão" F conformações. A imunização com variantes de sítio 0 estabilizados de F de RSV induzida em ambos os camundongos e a atividade não humano específico para o RSV neutralizante 3-15 vezes maior do que os induzidos por F de RSV no seu estado pós-fusão. Projeto atômico-nível para apresentar um supersítio de vulnerabilidade viral pode, assim, ter um efeito transformador sobre o desenvolvimento de vacinas.

[00779] Introdução. O vírus sincicial respiratório (RSV) é estimado para ser responsável por 6,7% das mortes em crianças de idade e faz com que o excesso de mortalidade em idosos em níveis comparáveis aos que causada por infecção com o vírus da influenza. Embora a infecção por RSV não induzir imunidade protetora totalmente, os anticorpos contra a glicoproteína de fusão de RSV (F) pode prevenir a doença grave em humanos, como demonstrado pela profilaxia passiva com o anticorpo F-dirigida, o palivizumabe (Synagis®).

[00780] O sucesso comprovado do palivizumabe tem estimulado os esforços de vacinas destinadas a induzir anticorpos RSV protetora F- dirigidas. Estes esforços têm sido complicado pela diversidade estrutural de RSV F, uma proteína do tipo I de fusão que assume, pelo menos, duas conformações: um estado pré-fusão e um estado pós- fusão estável. Ambos os estados partilham epitopos alvo de anticorpos neutralizantes, incluindo palivizumabe, F de RSV e pós-fusão está a ser desenvolvido como um candidato a vacina. Conforme descrito aqui, o alvo dominante de anticorpos neutralizadores de RSV eliciados por infecção natural foi encontrado para residir principalmente na conformação pré-fusão F de RSV e anticorpos, tais como AM22 e D25 (vide, por exemplo, US 12/600,950 e US 12/898.325) - substancialmente mais potente do que o palivizumabe - alvo sítio antigênico 0, um sítio específico para metaestável pré-fusão F, que está localizado no vértice da membrana distal do trímero de proteína F de RSV pré-fusão.

[00781] Para melhorar a estimulação destes anticorpos potentes, as variantes solúveis de engenharia de F de RSV foram concebidos para expor de forma estável sítio antigênico 0. Estas variantes foram caracterizados tanto antigenicamente e cristalograficamente e testados quanto à imunogenicidade em camundongos e primatas não humanos. Os resultados fornecem uma visão sobre a interação entre design, antigenicidade, estrutura e imunogenicidade e mostrar como base- estrutura de engenharia para preservar e apresentar um alvo antigênico apropriado pode ter um efeito transformador sobre a estimulação das respostas humorais de proteção.

[00782] A estratégia de vacina com base na estrutura descrita aqui inclui uma estratégia de quatro passos: (1) identificar um supersítio de vulnerabilidade viral alvo de anticorpos com atividade neutralizante potente, (2) para determinar a estrutura do supersítio em complexo com um anticorpo representativo, ( 3) para manipular a apresentação do supersítio estável na ausência de reconhecer anticorpo e (4) para induzir respostas de título elevado de proteção através de imunização com antígenos modificados que apresentam o supersítio (Figura 26).

Manipulação de Antígenos F de RSV

[00783] Em virtude de seu reconhecimento por anticorpos neutralizadores de RSV extraordinariamente potentes, sítio antigênico 0 foi escolhido como o alvo supersítio; a sua estrutura em complexo com o anticorpo descrito no presente documento D25 (Figura 26B). Para manipular variantes de F de RSV que estavelmente apresentados sítio 0, a estrutura de F de RSV ligado por D25 foi analisada. Mecanisticamente, há um número de maneiras de estabilizar uma conformação da proteína. Mecanismos para estabilizar sítio 0 sem comprometer o seu reconhecimento foram testados estes em combinação com um domínio fibritina trimerização T4-fago ("Foldon") (Efimov et al., J Mol Biol 242, 470 (1994); Boudko et al., European Journal /FEBS 269, 833 (2002)) anexado ao C-terminal do ectodomínio de F de RSV (McLellan et al., J. Virol. 85, 7788 (2011)).

[00784] Apresentando pares de cisteína previstos para formar uma ligação de dissulfureto na conformação alvo, mas amplamente separados em conformações alternativas, é uma abordagem para estabilizar uma estrutura. As p-carbonos de resíduos de serina 155 e 290 são 4,4 A para além da estrutura F de RSV-D25 ligada (vide Exemplo 1) e 124,2 Um além na estrutura pós-fusão (McLellan et al., J. Virol. 85, 7788 (descritos acima e ver figuras 27 e 32) A S155C-S290C mutante duplo, denominado "DS", formado estáveis RSV F trímeros, expressa em 1,4 mg L, manteve sítio antigênico 0 e foi homogênea como avaliado por coloração negativa EM (descrito acima; vide também a FIG 31, FIG 33..) Outras modificações de cisteína, tais como aquelas entre as regiões de F de RSV que são compatíveis tanto com o pré e pós-fusão estados (por exemplo, S403C e T420C), não antigênico estabilizar o sítio 0 (Figura 31) um determinado número de potenciais modificações de cisteína inter-subunidades duplos também foi testado; nenhuma das substituições de cisteína duplos testados inter- subunidades, no entanto, expressa mais do que 0,1 mg L.

[00785] Substituições hidrofóbicas de preenchimento de cavidades fornecem outro meio para estabilizar a conformação de seleção. O RSV F-estrutura ligada D25 foi analisado para cavidades hidrofóbicas únicas para a conformação ligada à D25 de RSV F que confinava regiões que diferiam em pré e pós-fusão F estados. F0i identificado um conjunto de tais cavidades na "cabeça" da membrana distal da estrutura pré-fusão, próximo ao sítio de ligação de D25 e modelado alterações hidrofóbicos para preencher essas cavidades. S190F e alterações V207L adotado conformações de cadeia lateral prevalentes com confrontos mínimos, enquanto K87F, V90L, V220L e alterações V296F mostrou menos compatibilidade estérica, preencher essas cavidades com pares de alterações foi avaliada. Um par S190F-V207L, o qual foi denominado "Cav1" (Figura 27), formada estáveis F de RSV trímeros, expressa em 2,2 mg/L e manteve sítio antigênico 0 (31 Figura). Enquanto isso, K87F- V90L, S190F-V296F e V207L-V220L variantes apresentaram um aumento de retenção de reconhecimento D25, mas menos do que 0,1 mg/1 de rendimentos F de RSV trímero (Figura 31).

[00786] Outras cavidades para o centro da pré-fusão RSV F estavam perto do peptídeo de fusão, o eixo trímero e um remendo ácida que compreende os resíduos Asp486, Glu487 e Asp489. Uma série de alterações do preenchimento de cavidades foram modelados incluindo F137W, F140W e F488W e analisadas estas alterações em combinação com D486H, E487Q e D489H (Figura 31). Dos seis combinações testadas, apenas dois (F488W e D486H-E487Q-F488W-D489H) expressaram níveis de purificada trímero RSV F acima de 0.1 mg/1 e manteve reconhecimento D25. A variante D486H-E487Q-F488W- D489H, designada "tric", formado estáveis F de RSV trímeros, expressa em 0,8 mg/1 e mantidas sítio antigênico 0 (Figura 31, F1g. 27).

[00787] O impacto de desestabilizar a conformação pós-fusão na preservação do sítio antigênico 0, também foi testada. V178N, previsto para introduzir um N-ligada glicana compatível com a pré-fusão mas não a conformação pós-fusão de F, não pareceu estabilizar sítio antigênico 0, nem V185E ou I506K, o que colocaria um ácido glutâmico ou uma lisina para o interior do pacote de seis pós-fusão hélice (Figura 31). Estas mutações resultado provável em alguns conformação intermediário de RSV F que é "disparado", mas é incapaz de adotar a conformação pós-fusão. Ao todo, mais de 100 variantes F de RSV foram construídas, expressas em formato de transfecção de 96 cavidades (Pancera et al., PLoS ONE 8, e55701 (2013)) e testadas por ELISA quanto à ligação a D25 e motavizumabe. Quinze construtos eram compatíveis com a ligação de D25, seis dos quais retido o reconhecimento D25 durante pelo menos 7 dias a 4°C e três destes pode ser purificado até homogeneidade trímeros que retiveram sítio antigênico 0 (Figura 31). Em geral, observou-se uma forte correlação entre a retenção de ligação para pelo menos 7 dias D25 a 4°C em sobrenadantes de 96 cavidades e rendimento de trímeros purificados a partir da expressão em larga escala e purificação (Figura 34).

Otimização Combinatória de Estabilidade do Sítio 0

[00788] DS, Cav1 e Tric variantes apresentadas uma variedade de propriedades físicas e antigênicas. A variante DS foi o menos estável a pH e temperatura extremos, mas de forma mais permanente estabilizado no estado trimérica, enquanto interconversão constante do trímero para agregar foi observado para Cav1 e Tric. Para avaliar se uma variante mais ideal de F de RSV pode ser obtido através da combinação de DS, Cav1 e tric, todas as combinações foram feitas.

[00789] Combinações geralmente melhor retenção de D25 reatividade a extremos físicos. Assim, por exemplo, todas as combinações mostraram uma estabilidade melhorada a incubação a 50°C ou pH 10,0. No entanto, a baixa tolerância ao congelamento- descongelamento exibido por também foi observada em ambos Cav1- TRIC e DS-Cav1-TRIC. Em geral, a combinação DS-Cav1 apareceu óptima em termos de rendimento de trímero e estabilidade física a condições extremas de temperatura, pH, osmolalidade e congelamento- descongelamento (Figura 31, F1g 35) e mostrou-se homogêneo, como avaliado por EM coloração negativa (Figura 33).

Análise cristalográfica

[00790] Variantes para fornecer feedback em nível atômico, estruturas cristalinas de sítio 0 estabilizadas de RSV F foram determinados (Figura 28). O DS, Cav1, DS-Cav1 e DS-Cav1-Tric variantes todos cristalizado em similares em tartrato a 1,5 M, pH de 9,5 condições e estes cristais cúbicos raios-X para resoluções de 3.1 A, 3.1 A, 3,8 A e 2,8 A resoluções, respectivamente (Figura 40). Soluções de substituição molecular foram obtidos usando a estrutura ligada F de RSV-D25 como um modelo de pesquisa e estes revelaram um único protômero F de RSV na unidade assimétrica, com o eixo F triméricos alinhados ao longo da tríplice cristalográfica. Cristais tetragonais de Cav1 e cristais cúbicos de DS-Cav1 também foram obtidos a partir de 1,7 M de sulfato de amónio pH 5,5 condições e estas difrações foram para resoluções de 2,4 A e 3,0 A, respectivamente (Figura 40). Substituição molecular revelou a treliça tetragonal para ter um trímero F de RSV completa na unidade assimétrica e ser altamente relacionada com os reticulados cúbicos tartarato. Em geral estas estruturas revelaram a engenharia F de RSV variantes ser substancialmente na conformação ligada-D25 (F de RSV Os variantes modificadas tinham C -root significa desvios quadrados a partir da conformação ligada entre 0,68-1,5 D25-A e a partir da conformação pós-fusão de aproximadamente 30 UMA).

[00791] Embora a estrutura da variante DS (Figura 28, mais à esquerda da coluna) foi estável como um trímero solúvel, com os resíduos de cisteína substituídos em 155 e 290, de fato, formando uma ligação de dissulfureto que em larga medida impedido de disparo para o estado pós-fusão, grande parte da membrana-distal porção do trímero F de RSV, incluindo sítio antigênico 0, era desordenados (resíduos 63- 72 e 169-216) ou em uma conformação diferente. Assim, por exemplo, os resíduos 160-168 na estrutura DS estender a oc2-hélice em vez de formar uma curva e iniciar a OC3-hélice como no F-estrutura ligada D25 (Figura 28B, mais à esquerda do painel). Uma explicação não limitativo para as diferenças entre a estrutura e o DS F de RSV-D25 estrutura ligada é que o DS é cristalizado em uma conformação que não se liga D25. Em geral, a variante DS retida muitas das características do estado pré-fusão F de RSV, incluindo o peptídeo de fusão no interior da cavidade trimérico.

[00792] Em comparação com o DS, a estrutura Cav1 (Figura 28, 2a e 3a colunas) foi mais ordenada no ápice da membrana distal, com o oc3-hélice, β3/β4 hairpina e a a-hélice claramente definidas. Os resíduos 137-202, que contêm a substituição S190F, tinha um COC- RMSD de 0,6 A quando comparado com o F-D25 estrutura ligada. O grau mais elevado de ordem estrutural foi provavelmente devido à mutação S190F que uma cavidade cheia observado no F-D25 estrutura ligada e aumento dos contatos de van der Waal com resíduos Ile57, Lysl76, Vall92, Glu256, Ser259 e Leu260. A outra mutação no preenchimento de cavidade Cav1, V207L, foi deslocado por 5.5A em comparação com o F-D25 estrutura ligada, com a porção C-terminal da hélice OC4-vincada perto Pro205 e adota conformações diferentes nas duas condições de cristalização (Figura 28B, painéis 2° e 3° da esquerda).

[00793] Uma característica surpreendente da estrutura Cav1 na rede cristalina tetragonal é o C-terminal de F2, que é desordenado no F-D25 estrutura ligada, mas no Cav1, túneis na cavidade ao lado do trimérico peptídeo de fusão. Curiosamente, o C-terminal termina com Ala107 e não Arg109, como esperado, após clivagem do sítio de furina (Arg106- Alal07-Arg108-Arg109). Na estrutura Cav1, a carga positiva da Arg106 é compensado por um íon de sulfato ordenadas (Figura 28C). Biologicamente, a posição F2 interior do C-terminal pode desempenhar um papel no despoletar da pré-fusão F conformação.

[00794] Comparação das estruturas DS-Cav1 das duas formas cristalinas tetragonais (Figura 28, 2a e 3a colunas da direita) para aqueles de Cav1 revelou apenas pequenas diferenças (RMSD de 0,86 A para os resíduos entre Cav1 e DS-Cav1 crescido em amónio condições de sulfato; RMSD de 0,47 A para 447 resíduos na rede cúbica). As maiores diferenças ocorreram no ápice RSV F, incluindo o sítio antigênica 0 e especificamente nos resíduos 64-73 e 203-216. Notavelmente, a mobilidade atômica (S-fator) foi mais elevada na região do vértice para todas as variantes de sítio de 0-estabilizados, talvez indicativos de sítio intrínseca 0 flexibilidade. Curiosamente, no entanto, o sítio 0 apresenta uma baixa mobilidade atômica quando ligado por D25, revelando a capacidade de D25 para estabilizar RSV F conformações tanto em termos globais e sítios.

[00795] A estrutura de combinação tripla DS-Cav1-TriC (Figura 28, coluna da direita) também foi altamente similar aos outros Cav1 molecular contendo estruturas variantes F de RSV. Uma diferença na densidade de elétrons, no entanto, correspondeu a uma extensão de densidade fraca na região proximal à membrana, o que corresponde às dimensões do domínio T4-fibritin trimerização (Stetefeld et al., Structure 11, 339 (2003)), que não é visível em outras estruturas cristalizados F de RSV que continham neste domínio, incluindo a estrutura ligada-D25. Pequenas diferenças estruturais em embalagem provável permitir o ordenamento parcial deste domínio (e também pode contribuir para o aumento da sua limite de difração dos cristais DS-Cav1-TRIC em relação às outras variantes cúbicos), mais do que as diferenças na interação entre o DS- Cav1-Tric estabilizado RSV F e este domínio de trimerização.

[00796] Em termos das alterações de resíduos de 486-489, a substituição F488W crítica embalado diretamente contra as substituições de F488W protômeros vizinhos do trímero F de RSV. A cadeia lateral de indol de Trp488 apontado na direção do vértice trímero e também formado interações anel de empilhamento com a cadeia lateral de 140Phe do peptídeo de fusão (Figura 28C, painel da direita). Esta interação peptídeo de fusão, que não é observado em qualquer uma das estruturas Phe488 contendo, provavelmente inibe a extração do peptídeo de fusão da cavidade pré-fusão trímero, proporcionando uma lógica estrutural para a capacidade de a alteração F488W para estabilizar o estado pré-fusão de RSV F (Figura 31).

Imunogenicidade de sítio antigênico 0 de proteína F de RSV estabilizada

[00797] Para avaliar o efeito do sítio estabilização na estimulação de respostas humorais RSV-protetora, os camundongos CB6 foram imunizadas com várias formas de F de RSV, injetando cada murganho com 10 μg de RSV F combinado com 50 μg de poli I: C adjuvante nas semanas 0 e 3 e medida a capacidade de 5 semanas os soros para prevenir a infecção por RSV de células HEp-2. DS, Cav1 e Tric cada provocou títulos elevados de atividade (média geométrica de 50% concentrações eficazes (EC50s) de 1.826-2422) neutralização. Este nível foi ~ 3 vezes maior do que o provocado por pós-fusão F (504 EC 50) e ~ 20 vezes maior do que o limiar de proteção. Por comparação, DS-Cav1 eliciada atividade neutralizante de 3937 de EC50, a cerca de 7 vezes mais elevada do que pós-fusão F e 40-vezes maior do que o limiar de proteção (Figura 29 A). (Quando o palivizumabe (Synagis®) é doseado para uma concentração de 15 mg/kg, os níveis séricos em calha são -40 μg/ml, o que proporciona proteção em bebés de doença grave. No ensaio de neutralização, 40 μg ml de palivizumabe em soro produz um EC50 de 100. Este título é também associado com a proteção completa contra a infecção do trato respiratório inferior em camundongos e camundongos do algodão desafiados com o RSV.)

[00798] Para quantificar a estimulação de anticorpos entre diferentes sítios na pré-fusão RSV F, foram usados formulários sítio antigênico 0- ocluído de RSV F. Camundongos CB6 imunizados com 20 μg de RSV F ligado por anticorpos sítio antigênico 0 dirigidos (compreendendo -10 μg de F de RSV e -10 μg do fragmento de ligação ao antígeno de anticorpos) desenvolvidos semana 5 média geométrica de títulos de neutralização de 911 e 1274 EC50 para AM22 e D25 complexos, respectivamente, aproximadamente o dobro da pós-fusão em 10 μg ml e comparável à dos provocados por pós-fusão a 20 μg ml (Figura 29 A). Estes resultados sugerem que os títulos muito elevados produzidos por imunização com F de RSV variantes estabilizado no estado pré-fusão - especialmente DS-Cav1 - deveram-se a anticorpos dirigidos contra o sítio antigênico 0.

[00799] Para examinar a generalidade do sítio, macacos rhesus foram imunizados com DS-Cav1, DS e formas pós-fusão de RSV F, injetando cada macaque com 50 μg RSV F misturada com 500 g de poli I: C adjuvante nas semanas 0 e 4 e de medição a capacidade dos soros de 6 semanas para inibir a infecção por RSV. Proteínas formuladas retidos esperado perfis antigênicos tal como medido pela ligação de D25 (Figura 38). DS e DS-Cav1 eliciada médias geométricas dos títulos de 1222 e 2578 de EC50, respectivamente, cerca de 5 e 10 vezes mais elevada do que pós-fusão F (287 EC 50) (Figura 29B), assim uma conservação da imunogenicidade relativa para as diferentes formas de F de RSV imunógeno entre camundongos e primatas e a capacidade de DS-Cav1 para gerar títulos elevados de RSV-protetora em um sistema imune dos primatas.

Otimização de respostas de proteção às proteínas F de RSV

[00800] A matriz de informações (Figura 26C) gerada pela interação entre design, propriedades físicas e antigênicas, a estrutura em nível atômico e imunogenicidade fornece uma base para uma maior optimização (Nabel, Science 326, 53 (2009)). Por exemplo, para obter insights sobre a relação entre várias propriedades antigênicas e físicos de engenharia RSV Fs e estimulação de respostas protetoras RSV, pode-se correlacionar propriedades (Figura 31) com imunogenicidade (Figura 29). Tais correlações indicam que o aumento sítio 0 estabilidade a extremos físicos (mas não de rendimento trímero nem afinidade D25) deve aumentar títulos protetores desencadeados após a imunização (Figura 30A), proporcionando assim uma visão de design para uma maior optimização. Da mesma forma, as correlações entre diferentes estados conformacionais ou regiões de RSV F (Figura 28) e imunogenicidade (Figura 29) fornecer o projeto insight sobre a conformação de RSV F que fornece as respostas mais proteção. Neste caso, os resultados indicam que aumentando o mimetismo estrutural do sítio antigênico 0 na sua conformação ligada a D25 deve conduzir à melhoria dos títulos de proteção (Figura 30B).

[00801] Além de proporcionar orientações para a melhoria, a matriz de informação também pode fornecer uma estimativa para o grau que tal melhoria pode ocorrer. Isto é, uma vez que uma correlação foi estabelecida dizer entre a estabilidade física ou mímica estrutural e respostas protetoras, pode-se maximizar a estabilidade física (por exemplo, a 100 retenção de% de ligação de D25) ou mímica estrutural (por exemplo, para exigir o mimetismo da conformação ligada-D25) para obter uma ideia da melhoria máxima da resposta protetora induzida em relação a este parâmetro específico. Esses resultados (Figura 30A, B) sugerem que mimetismo estrutural adicional provavelmente não teria muito efeito sobre a imunogenicidade, mas a estabilização física adicional de sítio antigênico 0 pode melhorar substancialmente a qualidade antigênica dos títulos protetores. Parâmetros independentes, tais como adjuvante, a multimerização ou regimes de imunização são susceptíveis de permitir a melhoria da resposta induzida e esses parâmetros podem ser analisadas de forma independente e optimizado (flexibilidade de um sítio antigênico pode aumentar a sua imunogenicidade por permitir que o sítio para se conformar a uma maior diversidade de anticorpos. Observamos, neste contexto, que os fatores atômico-de mobilidade do sítio antigênico 0 estavam entre os mais altos do ectodomínio de RSV F).

[00802] Experimentalmente parâmetros de mistura também pode fornecer insight. Por exemplo, para determinar o foco de soro de RSV- F provocou, a imunogenicidade pode ser interrogado antigenicamente (Figura 30C). Para medir a antigenicidade dos soros induzidos por diferentes formas de F de RSV, as diferentes formas de F de RSV foram acoplados a um biossensor ponta octeto e medida a reatividade de soros eliciada, bem como soros de "pré-absorvida", em que as diferentes formas de RSV Fs tinha sido adicionado (Figura 30C). Com DS-Cav1 no sensor, as respostas biossensores para pós-fusão F-, DS- e macacos DS-Cav1 imunizados mostraram aumento das respostas (FIG 30C, painel esquerdo.); com pós-fusão F sobre o sensor, as respostas de biossensor para os mesmos soros mostrou diminuir as respostas (FIG 30C, painel da direita.); e com soros que tinham sido pré-absorvido com pós-fusão F e com SD-Cav1 sobre o sensor, as respostas de pós-fusão F-, DS- e macacos tendências com títulos estimulados de proteção DS-Cav1-imunizado (Figura 30C painel da esquerda). Em geral, os títulos de EC50 eliciada não tendência com respostas antigênicas medidos contra quer pré-fusão ou formas pós- fusão de F de RSV, mas se correlacionou com o nível de respostas específicas do pré-fusão, seja medida como a diferença ou como uma proporção (p =0,005) entre pré-fusão e pós-fusão respostas RSV F- dirigidos (Figura 30D) (para o formulário "pré-fusão" de RSV F, o DS- Cav1 estabilizado variante do RSV F foi usado). Estes resultados sugerem que a qualidade da resposta imune é substancialmente melhor para o RSV F imunógenos na pré-fusão versus a conformação pós- fusão, uma descoberta que pode referir-se a potência de neutralização superiores observadas para detecção de anticorpos específicos do pré- fusão que alvejam sítio antigênico 0 (que deve sofrer deconvolução para possível resposta induzida, por utilização de sondas estruturalmente definidas, como mostrado com D25 e motavizumabe- Bond F de RSV na Figura 39).

[00803] Sem estar limitado pela teoria, que contêm os sítios antigênicos múltiplos epitopos alvo de anticorpos que derivam de múltiplos genes da linha germinal pode ser alvos de vacina ideal uma vez que estes "supersítios" têm uma alta probabilidade de induzir múltiplas linhagens de anticorpos neutralizantes. 0 sítio antigênico no RSV F é um exemplo de um supersítio antigênico que é também um sítio de vulnerabilidade viral. Muitas das lições aprendidas com os esforços com RSV descritos aqui, tais como a importância de examinar a resposta imunológica natural do ser humano e de selecionar o sítio de destino adequado, é provável que sejam de aplicação geral. No geral, concentrando-se estrutura de design com base em supersítios de vulnerabilidade, vacinologia estrutural pode estar à beira de alcançar uma mudança de paradigma de alteração no desenvolvimento de vacinas contra patógenos virais.

Materiais e métodos

[00804] Vírus e as células. Reservas virais foram preparadas e mantidas como anteriormente descrito (Graham et al., J. Med. Virol. 26, 153 (1988)). Expressando RSV-Proteína Fluorescente Verde (GFP) de RSV-GFP foi construída e fornecida conforme relatado anteriormente (Hallak et al., Virology 271, 264 (2000)). O título dos stocks RSV-GFP usados para fluxo com base em em citometria de neutralização e de fusão ensaios foi de 2,5x107 pfu/ml. A titulação do estoque RSV A2 usado para o ensaio de fixação foi de 1,02 x 10s cfu/ml. Células HEp-2 foram mantidas em meio essencial mínimo de Eagle contendo soro fetal de bovino a 10% (10% de EMEM) e foram suplementados com glutamina, penicilina e estreptomicina.

[00805] Expressão e purificação de anticorpos e fragmentos Fab. Os anticorpos foram expressos por transfecção transitória de plasmídeos das cadeias pesada e leve em células HEK293F em suspensão a 37°C durante 4-5 dias (vide acima e também McLellan et al., Nat Struct Biol Mol 17, 248 (2010).; McLellan et al., J Virol. 84, 12236 (2010)). Os sobrenadantes de células foram passados sobre Proteína A agarose e os anticorpos ligados foram lavados com PBS e eluída com tampão de eluição de IgG em 1 volume/Loth de 1 M de Tris-HCl a pH 8,0. Os Fabs foram criadas por digestão de IgG com a Lis-C ou protease HRV3C (McLellan et al., Nature 480, 336 (2011)) e as misturas de Fab e Fc foi passado para trás sobre Proteína A agarose para remover fragmentos Fc. Os Fabs que fluiu através da coluna foi ainda purificado por cromatografia de exclusão de tamanho.

[00806] Rastreio de estabilizado de construtos de RSV F pré- fusão. Pré-fusão F de RSV variantes foram derivadas a partir de F de RSV (+) Fd construto (veja-se Exemplo 1), que consiste em F de RSV resíduos 1-513 com uma T4 fibritina trimerização motivo C-terminal (McLellan et al., Nature 480, 336 ( 2011)), sítio de trombina, 6x marcador His e StreptagII. Uma abordagem a expressão do gene transitório microplaca de 96 cavidades-formatado foi usada para se conseguir a expressão de elevado rendimento de várias proteínas de RSV F como descrito anteriormente (Pancera et al., PLoS ONE 8, e55701 (2013)). Resumidamente, 24 horas antes da transfecção as células HEK 293T foram semeadas em cada cavidade de uma microplaca de 96 cavidades a uma densidade de 2.5xl05 células/ml em meio de expressão (DMEM de alto teor de glucose suplementado com 10% de ultra-baixo de IgG de soro fetal bovino e 1x -non-aminoácidos essenciais) e incubados a 37°C, 5% CO2for 20 h. O plasmídeo de DNA e TrueFect-Max (BioSystems, MD) foram misturados e adicionados às células em crescimento e a placa de 96 cavidades foi incubado a 37°C, 5% de CO2. Um dia após a transfecção, o meio enriquecido (DMEM de alto teor de glicose mais 25% de ultrabaixo de IgG do soro de bovino fetal, aminoácidos não essenciais 2x, glutamina 1x) foi adicionada a cada cavidade e voltou a incubadora para cultura contínua. No quinto dia após a transfecção, a proteína F de RSV expressa no sobrenadante foi coletado e testado por ELISA quanto à ligação a anticorpos D25 e Motavizumabe usando microplacas de Ni 2+ -NTA. Após incubação os sobrenadantes colhidos a 4°C durante uma semana, os ELIS Como foram repetidos.

[00807] Expressão em larga escala e purificação de construtos de RSV F. Pós-fusão solúvel F de RSV foi expresso e purificado conforme descrito anteriormente (McLellan, J Virol 85, 7788 (2011)). Pré-fusão variantes foram expressos por transfecção transitória em células293F usando TrueFect-Max (Reino Biosystems, MD). Os sobrenadantes da cultura foram coletados 5 dias após a transfecção e centrifugados a 10000 g para remover os detritos celulares. Os sobrenadantes das culturas foram esterilizadas por filtração antes da troca de tampão e concentrada usando filtração de fluxo tangencial (Van Reis, J. Sci 159, 133 (1999)). Glicoproteínas F de RSV foram purificados por cromatografia de níquel e estreptactina afinidade imobilizado e as frações relevantes que contêm as variantes F de RSV foram reunidas, concentradas e submetidas a cromatografia de exclusão de tamanho (vide Exemplo 1). Marcadores de afinidade foram removidos por digestão com trombina seguido de cromatografia de exclusão de tamanho. Glicoproteínas usados nas imunizações de primatas não humanos foram testados para endotoxinas, usando o ensaio e, se necessário, as proteínas foram passadas através de uma coluna EndoTrap Red (BioVendor) para remover endotoxinas antes da imunização. Nível de endotoxina foi <5 UE/kg de peso corporal/h, medida pelo kit de teste Limulus Amebocyte Lysate (LAL) (Lonza, Basileia, Suíça).

[00808] Caracterização antigênica de RSV F estabilizada. Um instrumento ForteBio Octet Red384 foi usado para medir cinética de ligação de RSV F a anticorpos que alvejam sítio antigênico 0 (D25, AM22), sítio I (131-2a), sítio II (pavlizumabe, motavizumabe) e sítio IV (101F). Todos os ensaios foram realizados com agitação regulada para 1000 rpm, em solução salina tamponada com fosfato (PBS) suplementado com 1% de albumina de soro bovino (BSA), a fim de minimizar as interações não específicas. O volume final para todas as soluções foi μl 100/cavidade. Os ensaios foram realizados a 30°C em placas de 96 cavidades pretas sólidos (Geiger Bio-ona). StrepMAR- Immo (35 μg/mL) em tampão PBS foi usado para carregar sondas antiFc de camundongo durante 300 s, o que foram então usados para capturar as proteínas relevantes variantes F de RSV que continham um C-terminal do Strep-T & G. Os níveis de captura típicas para cada passo de carregamento foram entre 0,7 e 1 nM e a variabilidade dentro de uma linha de oito pontas não excedeu 0,1 nm para cada uma dessas etapas. Chips Biosensor foram então equilibrados durante 300 s em PBS + BSA a 1% antes de se medir associação com fragmentos de antígeno de ligação (FAB) em solução (0,002 μM para μM 1) para 300 s; Os Fabs foram, em seguida, deixou-se dissociar para 400 S-1200 s, dependendo da taxa de dissociação observada. Cavidades de dissociação foram usados apenas uma vez para evitar contaminação. Paralelamente a correção de desvio da linha de base subtrair sistemática foi realizada subtraindo as medições registadas por um sensor colocado incubadas em PBS + BSA a 1%. Para remover as respostas de ligação não específica, uma molécula de gpl20 de HIV-1 com um marcador Strep do C-terminal foi carregada na sondas anti-Fc de camundongo e incubado com Fabs de RSV e as respostas não específicas foram subtraídos dos dados de resposta variante F de RSV. A análise dos dados e ajuste de curva foram realizadas usando software de octeto, versão 7.0. Os dados experimentais foram ajustados com as equações de ligação que descreve uma mistura 1: 1 de interação. Análise global do conjuntos de dados completos, assumindo ligação reversível (dissociação total) foram realizadas usando não linear de mínimos quadrados montagem permitindo que um único conjunto de parâmetros de ligação a ser obtidos simultaneamente para todas as concentrações usadas em cada experiência.

[00809] Estabilidade física de variantes de RSV F. Para avaliar a estabilidade física de proteínas F de RSV concebidos sob várias condições de stress, as proteínas foram tratadas com uma variedade de tensões farmaceuticamente relevantes, tais como um pH extremo, alta temperatura, baixa e alta osmolaridade, bem como ciclos de congelação/descongelação repetidas. A estabilidade física das proteínas F de RSV tratados foi avaliada pelo seu grau de conservação do sítio antigênico 0 após o tratamento, um parâmetro crítico avaliado pela ligação do anticorpo D25 0 sítio específico.

[00810] No tratamento de pH, a proteína F de RSV foi diluído para uma concentração inicial de 50 mg/ml, ajustado para pH 3,5 e pH 10 com tampões apropriados e incubados à temperatura ambiente durante 60 minutos antes de voltar a neutralizados a pH 7,5 e ajustada para 40 μg/ml. No tratamento de temperatura, proteína de RSV em 40 μg/ml foi incubado a 50°C, 70°C e 90°C durante 60 minutos em PCR com tampas aquecido para impedir a evaporação. No tratamento da pressão osmótica, 100 μl de soluções de proteína F de RSV (40 μg) originalmente contendo NaCl a 350 mM ou foram diluídas com tampão de 2,5 mM de Tris (pH 7,5) para uma osmolalidade de 10 mM de NaCl ou ajustado com MgCl2 a 4,5 M para uma final concentração de 3,0 M. As soluções de proteína foram incubadas durante 60 minutos à temperatura ambiente e, em seguida trazida de volta a NaCl a 350 mM por adição de NaCl a 5M ou diluição com tampão Tris a 2,5 mM, respectivamente, antes de ser concentrado até 100 μl. O tratamento de congelamento/descongelamento foi realizado 10 vezes repetido de congelação por azoto líquido e descongelação a 37°C. A ligação do anticorpo D25 para as proteínas F de RSV tratados foram medidos com um instrumento Octeto com os protocolos descritos acima. Os graus de estabilidade física são apresentados como a razão entre o nível de ligação de D25 estado estável antes e após o tratamento do estresse.

[00811] Coleta de dados de cristalização e raios X de proteínas F de RSV estabilizadas pré-fusão. Cristais de F de RSV DS, Cav1, DSCav1 e DSCav1TriC foram cultivadas pelo método de difusão de vapor em gotas de suspensão a 20°C por mistura de 1 μl de F de RSV com uma solução reservatório de μl (1,4 MK/tartarato de Na, pH de 0,1 CHES 9,5, 0,2 M LiSO4). Os cristais foram diretamente congelada em azoto líquido. Cristais de F de RSV e Cav1 DSCav1 também foram cultivadas pelo método de difusão de vapor em gotas de suspensão a 20°C por mistura de 1 μl de F de RSV com 0,5 μl de solução reservatório (1,7 M sulfato de amónio, 0,1 M de citrato de pH 5,5). Os cristais foram transferidos para uma solução de sulfato de amónio 3,2 M, citrato a 0,1 M pH 5,5 e rapidamente congelados em azoto líquido. Todos os dados de difração de raios-X foram coletados a um comprimento de onda de 1,00 A no SER-CAT Beamline ID-22.

[00812] Determinação da estrutura, refino e análise de RSV F pré-fusão estabilizada. Dados de difração de raios-X foram integrados e escalado com o pacote HKL2000 (Otwinowski, em Methods in Enzymol. (Academic Press, 1997), vol. 276, páginas 307-326)) e soluções de substituição moleculares foram obtidos por PHASER (McCoy et al., Software Phaser. J. Appl. Crystallogr. 40, 658 (2007)) usando o F de RSV-estrutura ligada D25 ( PDB ID: 4JHW, (vide exemplo 1)) como modelo de busca. Construto de modelos manual foi realizada usando COOT (Emsley et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66, 486 (2010)) e o refinamento foi realizada em Phenix (Adams et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66, 213 (2010)). Estatísticas de coleta de dados e de refinamento finais são apresentados na Figura 40. Sobreposições de RSV F estruturas foram realizadas usando resíduos 225-455 que mostraram altos níveis de similaridade estrutural. Cálculos pelo RMSD de sítios antigênicos foram com base em em resíduos 6171 e 194-219, que estavam dentro de 10 A do anticorpo D25 no F-D25 estrutura complexa de RSV.

[00813] Análise de microscopia eletrônica de coloração negativa. As amostras foram adsorvido às redes de película de carbono recém-descarregada fulgor, lavados duas vezes com tampão e corados com recém-feitos formato de uranila a 0,75%. As imagens foram gravadas em um microscópio FEI T20 com uma câmara de 2K x 2K de Eagle CCD a um tamanho de pixel de 1,5 A. A análise de imagem 2D e cálculo da média foi realizada com bsoft (Heymann, J. Struct. Biol. 157, 3 (2007)) e REMA (Ludtke et al., J. Struct. Biol. 128, 82 (1999)).

[00814] Imunizações com NHP. Todos os experimentos com animais foram revisadas e aprovadas pelo cuidado e uso Comitê do Centro de Pesquisa de Vacinas, NIAID, NIH Animal e todos os animais foram alojados e tratados de acordo com o sítio, estadual, federal e as políticas do instituto em uma Associação Americana para Credenciamento of Laboratory Animal Care (AAALAC) facilidade NIH. Animais Macaca mulatta de origem indiana pesando 8.76-14.68 kg por via intramuscular foram injetados com imunógenos na semana 0 e na semana 4. O sangue foi coletado a cada duas semanas por até 6 semanas.

[00815] Ensaios de neutralização de RSV. Os soros foram distribuídas diluições de quatro vezes a partir de 1: 10 a 1: 40960, misturado com um volume igual de recombinante mKate-RSV que expressam F genes prototípicos de cepa A2 e a proteína fluorescente Katushka e incubados a 37°C durante uma hora. Em seguida, 50 μl de cada diluição de soro de mistura/vírus foram adicionados a células HEp- 2 As células que tinham sido semeadas a uma densidade de 30 μl de MEM a 1,5x104 (meio essencial mínimo) em cada cavidade de 384 cavidades placas de fundo óptico do preto e incubadas por 20-22 horas antes da análise espectrofotométrica em Ex. de 588 nm e Em. de 635 nm (SpectraMax Paradigm, Molecular Devices, Sunnyvale, CA 94089). A IC50 para cada amostra foi calculada pela curva de regressão de montagem e não linear usando GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego CA). Os valores de P foram determinados pelo teste t de Student.

[00816] Análise de Antigenicidade no Soro. Um instrumento forteBio Octet Red384 foi usado para medir a reatividade de soros com as proteínas F de RSV variantes de F, com agitação, a temperatura, placas de 96 cavidades e os volumes de tampão idênticas às usadas para medições cinéticas. RSV F DSCav1 e pós-fusão F foram imobilizadas em amina sondas de acoplamento através da ativação da sonda em uma mistura de ativação EDC/NHS para 300 s em 10 mM de acetato de pH 5. A reatividade sonda foi extinta usando etanolamina 10 mM pH 8,5. Os níveis de captura típicas foram entre 0,7 e 1 nM e a variabilidade dentro de uma linha de oito pontas não excedeu 0,1 nm para cada uma dessas etapas. Chips Biosensor foram, então, equilibrados durante 300 s em PBS + BSA a 1% antes das medições de ligação. Os soros foram diluídos para uma diluição de 1/50 e 1/100 em PBS + BSA a 1% e a ligação foi avaliada por 300s. Depleção de soro foi realizada usando 1 μg de proteínas DSCavI pós-fusão ou F por um μT de soros de animais. Paralelamente a correção soros subtrair a ligação não específica foi realizada subtraindo os níveis de ligação de uma sonda descarregado incubadas com os soros. Antigenicidade sítio específica foi avaliada por incubação das sondas carregadas com variantes F de RSV com 1 ou 2 μM D25 Fab do sítio de 0 a avaliação e motavizumabe para avaliação do sítio II ou ambos os anticorpos para avaliar a não reatividade sítio 0/11 restante.

Exemplo 10 Proteínas F de RSV com uma única cadeia estabilizadas em uma conformação pré-fusão

[00817] Este exemplo ilustra Proteínas F de RSV recombinantes adicionais que faltam os sítios de clivagem de furina nativas, de tal modo que a proteína protômero F é formado como uma única cadeia de polipeptídeo, em vez de um heterodímero F2/F1. Diagramas esquemáticos que ilustram o desenho de uma única cadeia estabilizado pré-fusão-Proteínas F de RSV adicionais são fornecidos nas Figuras 43 e 44.

[00818] As Figuras 43-45 ilustram a concepção de uma série de construtos com uma única cadeia, com uma única cadeia, incluindo F de RSV sem construir. 9 (SCF no 9; BZGJ9 DSCav1; SEQ ID NO:. 669). Variáveis para os construtos com uma única cadeia incluem o tamanho do ligante, a Fl e F2 pontos finais e o mecanismo usado para induzir a trimerização da construto com uma única cadeia. Além disso, várias estratégias podem ser empregues para estabilizar os construtos com uma única cadeia em uma conformação pré-fusão, incluindo o uso das estratégias descritos aqui. Os construtos com uma única cadeia indicados foram expressas em células e caracterizado por cromatografia de exclusão por tamanho (Figura 46) e a ligação a anticorpos específicos para F de RSV (Figura 47).

[00819] Para caracterizar ainda mais o RSV F construir nenhuma. 9 (SCF não 9; BZGJ9 DSCav1; SEQ ID NO.: 669), a estrutura desta proteína tridimensional foi resolvida por cristalografia de raios-X (vide as figuras 48-51.). Cristais cúbicos foram cultivadas pelo método de difusão de vapor em uma solução de reserva de 1,19 M L12SO4, 3,33% de PEG 400, 0,12 M MgSC1A NaOAc 0,1 M pH 5,5. Os cristais cresceram a - 120 μπi antes de serem congelados rapidamente em uma solução reservatório contendo 2 M de sulfato de lítio. Os dados de difração foram coletados a uma resolução de 3.2 A, com uma intensidade sobre o erro de 2,84. A estrutura cristalina ilustrada a localização do ligante GS no construto # 9 (Figuras 49 e 50), foi usado para prever a localização de outros tamanhos de ligante (Figura 51) e como a base do desenho com uma única cadeia adicional constrói BZGJ9-1 através 9-10 (vide F1g. 55). Com uma única cadeia construto de genes com códons optimizados com um motivo de trimerização de T4 fibritina C-terminal, o sítio da trombina, 6X marcador His e StreptagII foi sintetizado e subclonado em um vetor de expressão de mamífero derivado do pLEXm. Os plasmídeos que expressam F de RSV (+) Fd, foram transfectados para células HEK293 GnTI -/- células em suspensão. Após 4-5 dias, o sobrenadante celular ser coletado, centrifugado, filtrado e concentrado. A proteína foi inicialmente purificado por meio de resina de Ni 2+ -NTA (Qiagen, Valência, CA) usando um tampão de eluição constituído por 20 mM de Tris-HCl a pH 7,5, NaCl 200 mM e imidazol a 250 mM, pH 8,0. O complexo foi então concentrado e purificado adicionalmente sobre resina StrepTactin de acordo com as instruções do fabricante (Novagen, Darmstadt, Alemanha). Após uma incubação de um dia para o outro com a protease de trombina (Novagen) para remover os marcadores His e Strep, um excesso de Fab D25 foi adicionado ao complexo, o qual foi então purificado sobre uma coluna de filtração em gel Superdex-200 (GE Healthcare) com um tampão de corrida de 2 mM Tris-HCl, pH de 7,5, NaCl a 350 mM e NaN3 a 0,02% ou soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) pH 7,4. Produtos de um único gene de uma única cadeia de ferritina foram expressas e purificadas de uma maneira similar.

[00820] Vários construtos com uma única cadeia foram selecionados para testes de imunogenicidade em modelos animais (Figura 53). BZGJ9 DS-Cav1, BZGJ9, BZGJ11 DS-Cav1 (monómero), BZGJ10 (de monómeros e frações de trímeros), BZGJ8 (monómero), BZGJ4 DS- Cav1 e BZGJ11 DS-Cav1-lumazina sintase (oligômero 60mer) foram todos testados quanto à imunogenicidade in grupos de 10 camundongos CB6F1/J por injeção de 10 μg de proteína na presença de 50 μg de poli I: C a semana 0 e semana 3. Os soros de semana 5 foi testada para imunogenicidade. Os grupos de controle de F de RSV de subtipo A-DS e Cav1 proteína Pós-fusão também foram testados e imunizado de um modo similar.

[00821] Para avaliar a neutralização contra RSV subtipo A e subtipo B, os soros de animais imunizados foram distribuídas diluições de quatro vezes a partir de 1: 10 a 1: 40960, misturado com um volume igual de recombinante mKate-RSV que expressam F genes prototípicos de subtipo A (cepa A2) ou subtipo B (cepa 18537) e a proteína fluorescente Katushka e incubados a 37°C durante 1 h. Em seguida, 50 μl de cada diluição de soro de mistura/vírus foram adicionados a células HEp-2 As células que tinham sido semeadas a uma densidade de 1,5x104 em 30 μl em MEM (meio essencial mínimo) em cada cavidade de 384 cavidades placas de fundo óptico do preto e incubados durante 20-22 h antes da análise espectrofotométrica a 588 nm de excitação e 635 nm de emissão (SpectraMax Paradigma, Molecular Devices, CA). A IC50 para cada amostra foi calculada pela curva de regressão de montagem e não linear usando GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., CA). Os valores P foram determinados pelo teste t de Student.

[00822] Os resultados de neutralização mostram que todos os construtos com uma única cadeia são os imunogênicos testados.

[00823] Os construtos com uma única cadeia estavam ligados a ferritina para produzir nanopartículas de ferritina incluindo os antígenos SCF (Figura 56). Em resumo, o C-terminal do polipeptídeo F1 incluído na proteína scF foi ligado a ferritina e a proteína recombinante foi expressa em células para produzir nanopartículas de SCF-ferritina. Um exemplo é a proteína "BZGJ9-DS-Cav1-Ligante longo-Ferritina" (SEQ ID NO: 1429), que inclui um F de RSV proteína com uma única cadeia recombinante incluindo um ligante GS entre F de RSV as posições 105 e 145 e uma subunidade ferritina ligada à posição 513 da proteína F de RSV por um ligante peptídeo heterólogo gerado por ligação do C- terminal do polipeptídeo F1 em scF No. 9 para uma subunidade ferritina. As nanopartículas SCF-ferritina foram expressas, purificadas e caracterizado por temperatura, pH, osmolaridade e estabilidade (Figura 57). Adicionalmente, as nanopartículas de ferritina foram administrados a animais para demonstrar que são imunogênicos (Figura 58). Os três construtos foram testadas F de RSV DSCav1 (SEQ ID NO: 371), BZGJ9-DS-Cav1-Ligante longo-Ferritina (SEQ ID NO: 1429) e FCE n° 9 (também denominado BZGJ9 DS-Cav1, SEQ ID NO: 669). Estas são a mesma imunogenicidade/neutralização como descrito acima.

[00824] Várias sequências com uma única cadeia são fornecidas nas SEQ ID NOs listadas na Tabela 19, bem como uma indicação da abordagem de design. Tabela 19. Exemplos de proteínas F de RSV com uma única cadeia

[00825] O rendimento de proteína foi calculado para várias das proteínas F recombinantes e é mostrado a seguir na Tabela 27.

[00826] Tabela 27. Rendimento de expressão de proteína F de RSV recombinante

Exemplo 11 Estrutura de uma proteína F de RSV a partir da cepa 18537 B com as mutações DSCavI

[00827] Este exemplo ilustra a similaridade da proteína de RSV com os estabilizadores substituições DSCav1 através subtipos RSV. As substituições DSCav1 foram introduzidos na proteína F de RSV a partir da cepa B18537. E a estrutura tridimensional da proteína recombinante resultante, incluindo um domínio C-terminal Foldon, foi resolvido através de métodos similares aos descritos acima. Como mostrado nas Figuras 59-62, as substituições DSCav1 poderia ser introduzido com sucesso em uma glicoproteína F de RSV de subtipo B para estabilizar o sítio antigênico □ para gerar um mutante DSCav1 no fundo subtipo B que se liga especificamente a pré-fusão anticorpos específicos. Tabela 25, abaixo, fornece um resumo dos dados cristalográf icos para DSCav1 de F de RSV de subtipo B. Tabela 25. Dados cristalográficos relativos a DSCav1, subtipo B

Exemplo 12 Concepção e produção de proteínas F de RSV F recombinantes sem um domínio de trimerização

[00828] Este exemplo ilustra a concepção e produção de proteínas recombinantes F de RSV que são estabilizadas em uma conformação pré-fusão mas que não incluem um domínio de trimerização do C- terminal para manter a estabilidade da membrana do lobo proximal da proteína F de RSV.

[00829] Resumidamente, no lugar do domínio de trimerização do C- terminal, um anel de ligações de dissulfureto é introduzido no C-terminal do polipeptídeo F1 através da substituição de resíduos de cisteína para os aminoácidos da hélice α10. Os três hélices α10 do ectodomínio F de RSV para um enrolamento de bobina que estabilizou a porção proximal da membrana da proteína. Quando expresso em células, pontes dissulfureto inter-protômero formar entre as cisteínas introduzidas na hélice α10, assim, "travando" as três hélices α10 em estreita proximidade e impedindo o movimento do domínio proximal da membrana do pré ao pós-fusão conformação. A hélice α10 da proteína F de RSV inclui os resíduos 492 para o domínio transmembrana (resíduos 529).

[00830] Neste exemplo, a proteína F de RSV recombinante com o anel de cisteína de estabilização é inicialmente expressa como uma proteína recombinante que inclui um domínio de trimerização. O domínio de trimerização pode ser proteoliticamente removido seguinte expressão inicial. A clivagem pode ser realizada antes, depois ou durante a purificação da proteína F de RSV. Atualmente, purificação a proteína F de RSV usando tendem Ni 2+ IMAC e etapas de imobilização com Estreptactina, através do His6 e StrepII tag no C-terminal, seguido por digestão com trombina à temperatura ambiente durante 12 horas, em seguida, separação da Foldon da proteína F de RSV por cromatografia de exclusão de tamanho. Seria também possível purificar a proteína F de RSV clivado por permuta iônica.

[00831] As Figuras 63-68 mostram resultados de filtração em gel e coloração com azul de Commassie reduzida e não reduzida análise PAGE de várias das proteínas recombinantes F sem domínio de trimerização como projetado listados abaixo. Tabela 22 proporciona características antigênicas e físicas das construtos indicadas, que incluem as substituições DSCav1 e substituições de cisteína na hélice α10 nas posições 525 e 526 (CCTail4xFd), 512 e 513 (CCTail5xFd), 519 e 520 (CCTail6xFd) e 512 e 512 (CCLongxFd). A SEQ ID NO correspondente para cada construto é mostrado na Figura 66. Tabela 22. Características antigênicas e físicas das variantes manipuladas de glicoproteína F de RSV

[00832] Várias sequências de proteínas SV F sem os domínios de trimerização ou com um domínio de trimerização clivável são fornecidos na SEQ ID NOs listadas na Tabela 23, bem como uma indicação da abordagem de design. O nome, anel de cisteína α10, presença ou ausência de C-terminal ou Foldon clivável Foldon, sequência de base (por exemplo, "DSCAV1" indica que o construto inclui as substituições DSCav1), o conceito de criação e que corresponde a SEQ ID NO são indicados. Na Tabela 23, as seguintes siglas são usadas: DSCAV1: S155C, S290C, S190F, substituições V207L; Op - espiral otimizada; OPCC - espiral otimizada com persulfuretos; Interc - dissulfureto interprotômero na hélice C-terminal; Multi-interc - múltipla estabilização interprotômero dissulfureto; ECC: maior estabilidade bobina-espiral; FP- CC: Fusão peptídeo Cys ponte; 190p: 190 bolso aminoácido alternativo; Fd (Foldon não clivável), xfd (Foldon clivável), N (sem Foldon); CFM: preenchimento de cavidade mutação; ICFM: cavidade Interface de preenchimento mutações As proteínas recombinantes F de RSV sem ou com um domínio de trimerização clivável listados na Tabela 23 foram expressos em células em condições em que as proteínas são secretadas a partir das células nos meios de comunicação celular como descrito acima no Exemplo 9. Cada construto contém uma sequência de comando que provoca a proteína para entrar no sistema secretor e ser segregado. O meio foi então centrifugado e o sobrenadante usado para o teste de antigenicidade para a ligação ao sítio 0 D25 específica do anticorpo e o anticorpo específico do sítio II Motavizumabe ("Mota", as Figuras 69A-69E). As condições testadas incluem D25 e Mota obrigatório no dia 0 (condições 1 e 2), D25 e vinculativo Mota no dia 0, após incubação a 70°C durante uma hora (condições 3 e 4) e D25 e Mota de ligação após uma semana em 4°C (condições 5 e 6). O controle é a DSCav1 construir com um domínio Foldon. Dados de antigenicidade específicas para cada construto é fornecida nas Figuras 69A-69E (as condições testadas são anotadas nas linhas de cabeçalho). Tabela 23. Proteínas F de RSV recombinante que não possuem um domínio de trimerização ou que têm um domínio de trimerização clivável protease

[00833] O rendimento de proteína foi calculado para várias das proteínas F recombinantes e é mostrado abaixo na Tabela 26.

[00834] Tabela 26. Rendimento de expressão de proteína F de RSV recombinante

[00835] Exemplo 13

[00836] Mutações adicionais para estabilizar a parte distal da membrana do ectodomínio de F de RSV

[00837] Este exemplo ilustra as mutações adicionais que foram realizadas em proteína F de RSV para estabilizar a proteína em sua conformação pré-fusão.

[00838] Várias sequências de proteína F de RSV sem os domínios de trimerização foram concebidos e são fornecidas em SEQ ID NOs listados na Tabela 24, bem como uma indicação da abordagem de design. O nome, mutação relativamente à SEQ ID NO: 1026, presença ou ausência de domínio C-terminal de Foldon, sequência de fundo (por exemplo, "WT" indica o tipo selvagem de RSV F), o conceito de criação e que corresponde a SEQ ID NO são indicados.

[00839] As proteínas F de RSV recombinante com um domínio C- terminal de trimerização listados na Tabela 24 foram expressos em células em condições em que as proteínas são secretadas a partir das células no meio celular. Cada construto contém uma sequência de comando que faz com que a proteína entre no sistema de secreção e segregada conforme descrito acima no Exemplo 9. O meio foi então centrifugado e o sobrenadante usado para o teste de antigenicidade para a ligação ao sítio 0 D25 anticorpo específico e o sítio II anticorpo específico Motavizumabe ("Mota", Figura 69A-69E). As condições testadas incluem D25 e Mota obrigatório no dia 0 (condições 1 e 2), D25 e vinculativo Mota no dia 0, após incubação a 70°C durante uma hora (condições 3 e 4) e D25 e Mota de ligação após uma semana em 4°C (condições 5 e 6). O controle é a DSCav1 construir com um domínio Foldon. Dados de antigenicidade específicas para cada construto é fornecida nas Figuras 69A-69E (as condições testadas são anotadas nas linhas de cabeçalho). Tabela 24. Nova estabilização com domínio Foldon

Exemplo 14 Imunógenos com sítio 0 mínimo

[00840] O epitopo de sítio 0 F de RSV está localizado no vértice da ponta de trímero e inclui a região reconhecida pelos anticorpos neutralizantes três D25, AM22 e 5C4. Mais especificamente, como delineado pela estrutura cristalina do complexo/D25 F de RSV, este epitopo compreende a superfície exterior da hélice (resíduos 196-210 OC4) e o loop adjacente (resíduos 63-68) e entre β2 cel. Este exemplo ilustra a criação e caracterização de antígenos que se apresentam sítio sozinho 0 com resíduos adjacentes mínimos e que podem ser usados para induzir a uma resposta imune sítio 0 e pode ser mais rentável para a produção do que o comprimento de pré-fusão completa estabilizado F de RSV trímero.

Conceitos gerais para a concepção de imunógenos de RSV F com um sítio 0 mínimo

[00841] Os imunógenos com sítio 0 mínimo foram concebidos usando quatro conceitos de design principais: permutação circular, permutação circular com arcabouço, imunógenos com domínio III e multimerização.

[00842] Permutações circulares envolvem alteração de ligações dentro de uma estrutura nativa da proteína, mantendo a orientação espacial das partes componentes. O sítio O mínimo componentes epitopo OC4 e o loop β2-α1 são cada parte de dois segmentos de loop separadas dentro F1 de RSV. Para criar estáveis do sítio 0 dobras, os dois segmentos de laço foram ligados (C-terminal para N-terminal) com ligantes de aminoácidos flexíveis curtas nas duas ordens diferentes possíveis, criando assim duas pregas separadas, cada uma das quais preservar o sítio 0 epitopo (Figura 70A).

[00843] Para criar permutações circulares com arcabouço, os ligantes curtos flexíveis de permutado circularmente 0 sítio proteínas foram substituídas por pequenos segmentos rígidos de outras proteínas que potencialmente proporcionar uma maior estabilidade do que os ligantes de aminoácidos simples (Figura 70B).

[00844] O Domínio III (resíduos 50-306) é maior de um domínio de aproximadamente 250 aminoácidos da proteína F de RSV que contém o sítio de 0 epitopo (vide Figura 70D). Os resíduos do domínio III circundante sítio 0 fornece ainda mais a estabilidade estrutural ao sítio 0 ao não adicionar significativas epitopos de superfície distrair adicionais para o imunógeno. Domínio III contém um sítio natural de clivagem de furina entre os resíduos 136 e 137 que expõe o peptídeo de fusão. Domínio III pode ser ainda mais estabilizada por substituição do sítio de clivagem com um ligante de aminoácidos ou através da realização de uma permutação circular para conectar-se a N- original e C-terminais ou domínio III e criar uma nova N- e C-terminais no sítio de clivagem. Ambos os métodos foram usados para estabilizar uma variedade de domínio III imunógenos.

[00845] Por último, imunógenos com sítio O foram multimerizados para aumentar a imunogenicidade (Figuras 70D e 70E). Trimerização foi usado para simular o trímero nativa observada no pré-fusão F de RSV pico viral e oligômeros maiores, conforme definido e 24mers 60mers foram usados para reforçar especificamente a imunogenicidade. A foi realizada através da introdução de ligações de dissulfureto entre as construtos ou por ligação covalente de construtos em conjunto como dímeros ou trímeros usando ligantes de aminoácidos ou por ligação de construtos de domínios de multimerização usando ligantes aminoácidos. Alguns construtos utilizavam uma combinação destas estratégias. Os menores domínios de multimerização usados foram trímeros (por exemplo GCN4) e o maior tinha 60mers (por exemplo lumazina sintase). Nós também utilizamos pentâmeros, 12mers e 24mers.

[00846] Além dos principais conceitos de design esboçados acima, os imunógenos foram estabilizados usando vários outros métodos, incluindo a adição de ligações de dissulfureto, mutações preenchimento de cavidade, a redução da hidrofobicidade da superfície, a adição de resíduos de superfície carregada e adição de glicanas N-ligados e truncagem de regiões potencialmente flexíveis. Uma listagem de vários sítios mínima 0 imunógenos é fornecida nas Tabelas 20 (imunógenos com sítio O não em partículas) e 21 (imunógenos com sítio O sobre uma nanopartícula de proteína), bem como uma indicação da abordagem de design. O nome, conceito, são indicados os resíduos de RS VF proteína, arcabouço ou outra proteína adicionado e a correspondente SEQ ID NO. Nas Tabelas 20 e 21, as seguintes siglas são usadas: SO: sítio 0 mínimo; CP: permutação circular; DS: Dissulfureto; CAV: preenchimento da cavidade; Custo: Adicionando resíduos carregados; SC: cadeia simples; TD3: domínio em tandem domínio III; D3: domínio III; RH: Reduzir Hidrofobicidade; Fd: Fd T4 domínio trimerização; CCMPTD: frango domínio cartilagem matriz trimerização proteína; MTQ-CC: MTQ espiral enrolada trimerização motivo; CXVIII: Colágeno XVIII domínio trimerização; 2M0E: Miz-1 dedo de zinco 6 (2M0E) cadafalso; ATCase: carbamoiltransferase aspartato (ATCase) domínio de trimerização (1GQ3); GCN4: domínio de trimerização GCN4; Fer: Ferritina; Dps: Dps de Microbacterium Arborescens; LS: lumazina sintase de A. aeolicus; THR: trombina; EH: hidrofóbicos expostos; HCP1: hcp1 de P. aeruginosa (lyl2).

[00847] Imunógenos com sítio 0 mínimos foram expressos em células usando um sistema que resulta na secreção do sítio mínima 0 imunógenos para o meio de cultura de tecidos como descrito acima no Exemplo 9. O meio foi então centrifugado e o sobrenadante usado para o teste de antigenicidade para a ligação ao sítio 0 D25 anticorpos específicos, AN22 e 5C4 por ELISA (Figura 72A-72F). As condições testadas incluem ligação de D25 após 0 e 1 semana a 4°C (condições 1 e 2), ligando D25 após 1 h. a 60°C (condição 3), 70°C (Condição 4), 80°C (Condição 5), 90°C (Condição 6) ou 100°C (Condição 7), a ligação AM22 depois de duas semanas a 4°C (Condição 8), a ligação 5C4 na semana 4°C (Condição 9). A média de D25, AM22, D25 e ligação após 1 hora a 70°C é também mostrado (condição 10). Um resumo dos dados de antigenicidade é proporcionado na Figura 71, que mostra o número de imunógenos com sítio O que caem dentro de cada categoria de concepção e que produziu um resultado de ELISA de pelo menos 1,5. Dados de antigenicidade específicas para cada construto é fornecida nas Figuras 72A-72F (as condições testadas são anotadas nas linhas de cabeçalho). Os resultados indicam que as mínimas imunógenos com sítio O especificamente se ligam a anticorpos específicos pré-fusão; e, assim, são úteis para induzir a uma resposta imune em um indivíduo a sítio antigênico 0. Além disso, os resultados indicam que o sítio mínima 0 construtos podem ser usadas como sondas para isolar e detectar anticorpos específicos F de RSV a partir de uma amostra pré-fusão.

[00848] Com base nos dados de antigenicidade, 14 das construtos iniciais foram selecionados como representativos para a avaliação em modelos animais para a produção de uma resposta imune e para a caracterização física e estrutural adicional. A métrica para escolher o 14 incluído construtos selecionados usando a média de ELISA para D25 (semana 1), AM22 (semana 2) e D25 Após 1 hora a 70 graus. Para evitar várias construtos muito similares a serem escolhidos para cada categoria, cada uma das categorias foram subdivididos em categorias (SEQ ID NO em parênteses):

Categoria 1: Monômeros:

[00849] permutação circular de sítio O: TZ-13 (354567-108) Média: 3,18 (SEQ ID NO: 1040)

[00850] permutação circular de sítio O com arcabouço: JG_2KN0 (354567-417) Média: 3,00 (SEQ ID NO: 1053)

[00851] domínio III: E-CP_RBD51-307_14mutDS-Cav1_THS (354567-273) Média: 3,17 (SEQ ID NO: 1156)

[00852] dímero de domínio III: GSJnh4-TWIN (354567-693) Média: 3,06 (SEQ ID NO: 1194)

[00853] Categoria 2: Trímeros:

[00854] permutações circulares de sítio O: TZ-19 (354567-126) Média: 3,08 (SEQ ID NO: 1106)

[00855] domínio III (dois são unidos): RSVF(+)THS_s_to_hp2_foldon (354567-210) Média: 3,08 (SEQ ID NO: 1170) e MS_08 (354567-447) Média: 3,08 (SEQ ID NO: 1188)

[00856] dímero de domínio III: GSJnh4Fd-TWIN (354567-705) Média: 3,01 (SEQ ID NO: 1212)

[00857] Categoria 3: monômeros multivalentes:

[00858] permutação circular de sítio O sobre Ferritina: 2m0e-resurfl- Ferritina (354567-621) Média: 2,81 (SEQ ID NO: 1276)

[00859] domínio III on Ferritina: GSJnh2F (354567-471) Média: 3,10 (SEQ ID NO: 1220)

[00860] monômero sobre um oligômero que não Ferritina: LSl-E- CP_RBD51-307_11mutDS-Cav1_THS (354567-315) Média: 2,72 (SEQ ID NO: 1281)

[00861] Adicional: MP11 (354567-642) Média: 3,05 (SEQ ID NO: 1263)

[00862] Categoria 4: Trímeros polivalentes:

[00863] domínio III sobre nanopartículas (2): GSJnh2Fd-F (354567 483) Média: 2,57 (SEQ ID NO: 1266)

[00864] GSJnh4Fd-F (354567-489) Média: 2,02 (SEQ ID NO: 1268) Tabela 20. Imunógenos com sítio Æ mínimo (não sobre uma nanopartícula de proteína) Tabela 21. Imunógenos com sítio mínimo sobre uma nanopartícula de proteína

[00865] Exemplo 15

[00866] Imunogenicidade de proteína F pré-fusão estabilizada

[00867] Uma série de ensaios (além daqueles fornecidos acima) foram realizados para ilustrar a imunogenicidade das proteínas F de RSV recombinantes fornecidas aqui as quais são estabilizadas em uma conformação pré-fusão. Os resultados mostram que as proteínas F de RSV recombinantes fornecidas estabilizadas em uma conformação pré- fusão podem ser usadas para induzir a uma resposta imune em vários modelos animais e, ainda, que a indução da resposta imune protege contra um futuro desafio viral.

[00868] Salvo indicação em contrário, nas Figuras 73-84 e neste exemplo, referência é feita às seguintes proteínas F de RSV recombinantes:

[00869] DS (Subtipo A) = RSV A2 F(+)FdTHS S155C, S290C (SEQ ID NO: 185)

[00870] DS (Subtipo B) = RSV B18537 F(+)FdTHS S155C, S290C (SEQ ID NO: 1479)

[00871] DS-Cav1 (Subtipo A) = RSV A2 F(+)FdTHS S155C, S290C, S190F, V207L (SEQ ID NO: 371)

[00872] DS-Cav1 (Subtipo B) = RSV B18537 F(+)FdTHS S155C, S290C, S190F, V207L (SEQ ID NO: 372)

[00873] Pós-fusão F (Subtipo A) = RS V A2 F(+) dFPTHS

[00874] A Figura 73 ilustra que, usando Ribi como adjuvante, em uma versão com uma única cadeia de DS-Cav1 apresentada no contexto de uma nanopartícula de ferritina administrada IM, provoca uma resposta de anticorpos neutralizantes pequena, mas detectável, após 2 semanas em macacos rhesus após uma única dose. Com base nestas respostas pequenas mas detectáveis após uma dose, espera-se que após o reforço com uma segunda dose de uma resposta significativa de anticorpo neutralizante irá ser induzida. Isto seria consistente com a imunogenicidade de 2 meg de DS clivados estabilizado pré-fusão F trímero apresentada em uma nanopartícula ferritina formulado com Ribi após 2 doses em camundongos, discutido abaixo.

[00875] Conforme ilustrado na Figura 74, os camundongos (CB6F1/J) uma resposta imune para a versão de DS pré-fusão estabilizado é induzida em camundongos imunizados com 20 meg de DS F em 50 meg de ICLC poli nas semanas 0 e 3. atividade neutralizante foi mantida a um nível elevado em DS camundongos imunizados por mais de 12 semanas.

[00876] Conforme ilustrado na Figura 75, a imunização com DS (subtipo A) = RSV A2 F(+)FdTHS S155C, S290C (SEQ ID NO: 185) pode prevenir a infecção por RSV em um modelo animal. Os camundongos foram imunizados IM com o DS versão da proteína estabilizada F (SEQ ID NO: 185) na semana 0 e semana 3. Os camundongos foram desafiados por via intranasal com 10E7 pfu de RSV A2 do vírus homólogo em 19 semanas, quatro semanas após a última vacinação. No dia 5 pulmões e nariz foram removidos para medir a carga viral no tecido. Os resultados mostram que os camundongos imunizados com a versão de DS pré-fusão F teve nenhum vírus detectável no pulmão ou ao nariz.

[00877] Além disso, os camundongos administrados com DS (subtipo A) = RSV A2 F(+)FdTHS S155C, S290C (SEQ ID NO: 185) não foram submetidos a uma resposta de citocinas de tipo 2 para o imunógeno (Figura 76). O teor de citocina foi medida nos sobrenadantes dos pulmões e nariz no dia 5, após a imunização inicial com controle (PBS), RSV de tipo selvagem (RSV), formalina RSV inativado (FIRSV), DS (SEQ ID NO: 185; "pré-fusão F) ou um construto de pós fusão estabilizado F (pós-fusão F). Os camundongos submetidos a infecção primária tinha níveis significativos de IFN-gama e a MIP-1 alfa como esperado. FI-RSV camundongos imunizados apresentavam níveis significativos de citocinas tipo 2 (IL-4, IL-5 e IL-13) e citocinas associadas aos danos epiteliais (IL-6) típico das respostas associadas com doença avançada de vacina. Os murganhos imunizados com a pré-fusão F (DS) teve um nível modesto de IFN-gama e IL-10 associada a uma resposta eficaz e regulamentada e nenhuma doença ou perda de peso.

[00878] A atividade de neutralização de soro a partir de modelos de primatas não humanos imunizados com a proteína F de RSV recombinante DSCav1 (SEQ ID NO: 371) foi analisada ao longo de uma vacinação de três doses (Figura 77). Macacos rhesus, 4 por grupo, foram imunizados duas vezes, a 0 e 4 semanas com 50 mg primário com qualquer DS-Cav1 pré-fusão F (SEQ ID NO: 371) ou F pós-fusão com base na sequência do subtipo A e formulado com ICLC poli. Na semana 26, os dois grupos foram reforçados com 50 mg de IM DS-Cav1 pré-fusão F formulado com ICLC poli. Após 2 doses de DS-Cav1, atividade neutralizante significativa é induzida e mantida acima do limiar de proteção por mais de 5 meses. Pós-fusão F era imunogênica e induziu atividade neutralizante detectável após 2 doses, mas foi apenas transitoriamente acima do limiar de proteção. Impulsionar o grupo F pós- fusão com uma terceira dose de DS-Cav1 estabilizado pré-fusão F resultou em um aumento na atividade superior à alcançada após a 2a dose neutralizante. Após a atividade neutralizante dose de 3 contra o subtipo homólogo A foi mantida de forma estável por mais de 10 semanas como destaque nas áreas em caixas vermelhas.

[00879] Para demonstrar que a construto DSCav1 pode ser formulada com alúmen, purificado DSCav1 (SEQ ID NO: 371) foi misturada com gel de hidróxido de alúmen ou gel de fosfato de Alume em várias proporções. Camundongos BALB/c foram imunizados IM com 10 mg da versão DS-Cav1 de estabilizar pré-fusão F formulada com (gel de hidróxido de alumínio ou gel de fosfato de alumínio) em alúmen 0 e 3 semanas. A proteína: alúmen em peso: proporções em peso variavam entre 1: 1 e 1: 10. Todas as formulações eram imunogênicos (figura 78.). Além disso, a utilização do alúmen como um adjuvante para imunização DSCav1 foi demonstrada em um modelo de primata não humano (Figura 79). Macacos rhesus foram imunizados nas semanas 0, 4, 26 e com a proteína purificada DS (SEQ ID NO: 185). Os semana 0 e 4 injeções eram compostas da versão DS de estabilizado RSV pré-fusão F (50 mg) formulada em ICLC poli. A semana 26 foi de 50 mg pulso do DS pré-fusão estabilizado F formulado em gel de fosfato de alumínio. Portanto, é um adjuvante de alúmen eficaz para o pré-fusão F estabilizado em PHN.

[00880] Para mostrar que outro protocolo de imunização é eficaz para induzir a uma resposta imune eficaz com DSCav1, os camundongos foram imunizados com um vetor com base em gene que expressa DSCav1 e a resposta imune resultante para F de RSV foi avaliada (Figura 80). Camundongos CB6F1/J foram imunizados com um vetor recombinante de adenovírus serotipo 5 expressando a versão de tipo selvagem de F a 0 e 3 semanas ou foram imunizados nas semanas 0 com rAd5 expressar a versão DS-Cav1 de PreF ancorada membrana (não segregada) e potenciado com 10 mg de DS-Cav1 formulada em alume na semana 3. rAd5-PreF camundongos preparados potenciado com DS-Cav1 em alume produzido tanto por anticorpos neutralizantes como camundongos que receberam duas doses de proteína única, indicando que pré-fusão F entregue por uma base gene- vetor é primo imunogênica e pode, por um impulso da proteína posterior.

[00881] Além disso, a proteína DSCav1 foi eficaz para estimular uma resposta imune para o tipo selvagem (WT) F de RSV (Figura 81). Os primatas não humanos ativados com vetores de adenovírus recombinantes que expressam WT versões de F de RSV (subtipo A) de mais de 2 anos antes do impulso, foram impulsionadas com uma dose única de 50 mg de DS-Cav1 subtipo A ou subtipo B formulada em alume. Duas semanas após o reforço atividade neutralizante foi significativamente aumentada em ambos os subtipo A e as proteínas B- DS Cav1 (Figuras 81-82).

[00882] Para demonstrar a eficácia de subtipo dos DS (S155C, S290C) versão de estabilizado F, camundongos CB6F1/J foram imunizados IM com 10 mg de DS formulada em Ribi na semana 0 e na semana 3 (Figura 83). Anticorpo neutralizante foi induzido tanto por A (SEQ ID NO: 185) quanto por B (SEQ ID NO: 1479) contra ambas as proteínas virais de subtipo A e subtipo B. O grupo que recebeu tanto A e B recebeu um total de 20 mg de proteína.

[00883] A Figura 84 ilustra que alteração de glicosilação da proteína F de RSV reduz sua imunogenicidade. Camundongos BALB/c foram imunizados com 10 meg da versão DS da F pré-fusão estabilizada formulada em poli IC nas semanas 0 e 3. Os construtos F foram tratados com glicosidases ou versões mutantes foram feitas para eliminar sítios de glicosilação em N27 e N70. A proteína F não pode ser produzida se a glicosilação N500 sofre mutação, sugerindo que a glicosilação neste sítio é necessária para expressão. A atividade de neutralização foi detectada na semana 5 (barras sólidas) e semana 7 (barras tracejadas) em camundongos imunizados por qualquer uma das variantes de glicosilação de F. No entanto, alteração da glicosilação pareceu reduzir a imunogenicidade em relação à versão DS original pré-fusão estabilizada F. * *** = P <0,0001.

[00884] Será evidente que os detalhes precisos dos métodos ou composições descritas podem ser variados ou modificados sem se afastar do espírito das modalidades descritas. São reivindicadas todas de tais modificações e variações que caem dentro do âmbito e espírito das reivindicações anexas.

Claims (37)

1. Imunógeno isolado, caracterizado pelo fato de que compreende: uma proteína F de RSV recombinante ou um fragmento da mesma que compreende pelo menos uma substituição de aminoácidos comparado com uma proteína F de RSV nativa que estabiliza a proteína F de RSV recombinante em uma conformação pré-fusão que se liga especificamente a um anticorpo pré-fusão de F RSV específico, em que: a pelo menos uma substituição de aminoácidos introduz uma ligação dissulfeto não natural entre um par de cisteínas para estabilizar a proteína RSV F recombinante na conformação da prefusão; o imunógeno se liga especificamente ao anticorpo após incubação a 20°C em solução salina tamponada com fosfato em um pH fisiológico durante pelo menos 24 horas na ausência do anticorpo e em que o anticorpo não se liga a uma proteína F de RSV em uma conformação pós-fusão; e a conformação pré-fusão da proteína F de RSV recombinante ou fragmento da mesma compreende um sítio antigênico 0 que se liga especificamente ao anticorpo específico pré-fusão e em que o sítio antigênico 0 compreende os resíduos 62-69 e 196-209 da sequência nativa da proteína F de RSV apresentada como uma de SEQ ID NOs: 1-184.

2. Imunógeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o imunógeno se liga especificamente a um anticorpo específico pré-fusão D25 ou AM22; e/ou em que a proteína F de RSV nativa é uma proteína A, B de RSV ou F de RSV bovino; e/ou em que a proteína F de RSV recombinante ou fragmento da mesma compreende um polipeptídeo F1 e um polipeptídeo F2 e não compreende um polipeptídeo pep27; e/ou o resíduo C-terminal do polipeptídeo F2 e o resíduo N- terminal do polipeptídeo F1, respectivamente, compreendem as posições 97 e 137; 97 e 145; 97 e 150; 102 e 144; 102 e 145; 102 e 146; 102 e 147; 103 e 144; 103 e 145; 103 e 146; 103 e 147; 104 e 144; 104 e 145; 104 e 146; 104 e 147; 105 e 144; 105 e 145; 105 e 146; 105 e 147; ou 105 e 150 de proteína F de RSV; e/ou em que os polipeptídeos F1 e F2 compreendem ou consistem, respectivamente, nas posições: 26-109 e 137-513; 26-107 e 137-513; 26-107 e 145-513; 26-105 e 137-513; 26-105 e 145-513; 26103 e 145-513; 26-109 e 137-529; 26-107 e 137-529; 26-107 e 145-529; 26-105 e 137-529; 26-105 e 145-529; 26-103 e 145-529; 46-103 e 147310; 46-104 e 146-310; 50-96 e 149-306; 51-103 e 146-307; 51-103 e 139-307; 50-105 e 146-306; ou 53-97 e 148 a um de 305-320 de proteína F de RSV.

3. Imunógeno, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que os polipeptídeos F1 e F2 apresentam sequências correspondentes de uma sequência nativa de proteína F de RSV apresentada como qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-184; e/ou em que a proteína F de RSV recombinante compreende ou consiste em um polipeptídeo F2 e um polipeptídeo F1 compreendendo sequências de aminoácidos: aminoácidos 26-103 e 145-310, respectivamente, da SEQ ID NO: 124; aminoácidos 26-103 e 145-513, respectivamente, da SEQ ID NO: 124; aminoácidos 26-103 e 145-529, respectivamente, da SEQ ID NO: 124; ou aminoácidos 26-103 e 145-551, respectivamente, da SEQ ID NO: 124; e/ou a proteína F de RSV recombinante é uma proteína F de RSV com uma única cadeia e os polipeptídeos F1 e F2 estão ligados por um ligante peptídico heterólogo ou estão diretamente ligados; e/ou a posição 105 do polipeptídeo F2 está ligada à posição 145 do polipeptídeo F1 através de um ligante de Gly-Ser; e/ou a posição 103 do polipeptídeo F2 está diretamente ligada à posição 145 do polipeptídeo F1; e/ou o ligante peptídico heterólogo compreende a sequência de aminoácidos apresentada como uma de SEQ ID NOs: 356-365 ou 1443-1453, ou é um ligante G, S, GG, GS, SG, GGG ou GSG.

4. Imunógeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a proteína F de RSV recombinante é ainda estabilizada na conformação pré-fusão de proteína F de RSV por: (a) uma substituição de aminoácidos de preenchimento de cavidade; (b) uma substituição de aminoácido de reacondicionamento; (c) um sítio de glicosilação N-ligada; ou (d) uma combinação de dois ou mais de (a) - (c).

5. Imunógeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o par de cisteínas compreende uma primeira cisteína e uma segunda cisteína e a primeira cisteína é introduzida por uma substituição de aminoácidos em uma das posições 137-216 da proteína F de RSV e a segunda cisteína é introduzida por uma substituição de aminoácidos em uma das posições 271-460 da proteína F de RSV; e/ou (i) o par de cisteínas compreende uma primeira cisteína e uma segunda cisteína, cada uma compreendendo um carbono Cα e um carbono Cβ, e em que: (a) a primeira cisteína é introduzida por meio de substituição de aminoácidos em uma das posições 137-216 ou 461-513 da proteína F de RSV e a segunda cisteína é introduzida por meio de substituição de aminoácidos em uma das posições 26-61, 77-97 ou 271-460 da proteína F de RSV; e (b) o carbono Cα da posição da primeira cisteína é de 2,08,0 angstroms a partir do carbono Cα da posição da segunda cisteína e/ou o carbono Cβ da posição da primeira cisteína é de 2,0-5,5 angstroms a partir do carbono Cβ da posição da segunda cisteína usando um rotômero ideal para cada carbono Cβ, na estrutura tridimensional definida pelas coordenadas estruturais fornecidas na Tabela 1; ou (ii) o par de cisteínas compreende uma primeira cisteína e uma segunda cisteína, cada uma compreendendo um carbono Cα e um carbono Cβ, e em que: (a) a primeira cisteína e a segunda cisteína são introduzidas por meio de substituição de aminoácidos nas posições 137-216 de proteína F de RSV ou posições 461-513 de proteína F de RSV; ou a primeira cisteína é introduzida por meio de substituição de aminoácidos nas posições 137-216 de proteína F de RSV e a segunda cisteína é introduzida por meio de substituição de aminoácidos nas posições 461-513 de proteína F de RSV; e (b) o carbono Cα da posição da primeira cisteína é de 2,08,0 angstroms a partir do carbono Cα da posição da segunda cisteína e/ou o carbono Cβ da posição da primeira cisteína é de 2,0-5,5 angstroms a partir do carbono Cβ da posição da segunda cisteína usando um rotômero ideal para cada carbono Cβ, na estrutura tridimensional definida pelas coordenadas estruturais fornecidas na Tabela 1.

6. Imunógeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a ligação de dissulfureto não natural compreende uma ligação de dissulfureto interprotômero entre as substituições S155C e S290C.

7. Imunógeno, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a proteína F de RSV recombinante compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos compreendendo os resíduos 26-109 e 137-513, os resíduos 26-103 e 145-513 ou os resíduos 26-105 e 145-513 de SEQ ID NOs: 185.

8. Imunógeno, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a ligação de dissulfureto não natural compreende: uma ligação de dissulfureto inter-protômero entre as substituições A149C e Y458C; uma ligação de dissulfureto inter-protômero entre as substituições N183C e N428C, e a proteína F do RSV compreendendo ainda uma inserção G entre as posições 182/183; ou uma ligação de dissulfureto inter-protômero entre as substituições de T369C e N455C; e/ou compreendendo uma substituição de aminoácido de preenchimento de cavidade que compreende uma substituição F, L, W, Y, H ou M na posição 190, posição 207 ou posições 190 e 207; e/ou em que a substituição de aminoácido de preenchimento de cavidade que compreende: 190F; 190L; 190W; 190Y; 190H; 190M; 190F e 207L; 190F e 207F; 190F e 207W; 190L e 207L; 190L e 207F; 190L e 207W; 190W e 207L; 190W e 207F; 190W e 207W; 190Y e 207L; 190Y e 207F; 190Y e 207W; 190H e 207L; 190H e 207F; 190H e 207W; 190M e 207L; ou 190M e 207F; 190M e 207W.

9. Imunógeno, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a proteína F de RSV recombinante compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos compreendendo os resíduos 26-109 e 137-513, os resíduos 26-103 e 145-513 ou os resíduos 26-105 e 145-513 de SEQ ID NO: 191.

10. Imunógeno, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a proteína F de RSV recombinante compreende uma ponte de dissulfureto não natural entre as substituições de cisteína nas posições 155 e 290 e uma substituição de preenchimento de cavidade F, L, W, Y, H ou M na posição 190, posição 207 ou posições 190 e 207.

11. Imunógeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína F de RSV recombinante compreende substituições S155C, S290C e S190F, ou substituições S155C, S290C, S190F e V207L; e/ou em que a proteína F de RSV recombinante ainda compreende: uma ligação de dissulfureto inter-protômero entre as substituições A149C e Y458C; uma ligação de dissulfureto inter-protômero entre as substituições N183C e N428C, e a proteína F do RSV compreendendo ainda uma inserção G entre as posições 182/183; ou uma ligação de dissulfureto inter-protômero entre as substituições de T369C e N455C.

12. Imunógeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína F de RSV recombinante compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos compreendendo os resíduos 26-109 e 137-513, respectivamente, ou 26-103 e 145-513, respectivamente, ou 26-105 e 145-513, respectivamente, de uma de SEQ ID NOs: 185 (DS, subtipo A), 1479 (DS, subtipo B), 371 (DS-Cav1, subtipo A), 372 (DSCav1, subtipo B), 373 (DSCav1, bovina), 374 (DS S190F, subtipo A), 375 (DS, S190F, subtipo B) ou 376 (DS, S190F, bovina); e/ou em que a proteína F de RSV recombinante compreende uma sequência de aminoácidos: resíduos 26-476 de SEQ ID NO: 669 (BZGJ9 DS-Cav1) resíduos 26-472 de SEQ ID NO: 706 (BZGJ9-9 DS-Cav1) resíduos 26-474 de SEQ ID NO: 707 (BZGJ9-10 DS-Cav1); e/ou em que o polipeptídeo F1 compreende uma hélice α10 de RSV que compreende a partir da posição 492 de RSV a uma das posições 510-529 e em que o polipeptídeo F1 compreende pelo menos duas substituições de cisteína que formam uma ligação de dissulfureto não natural interprotômero; e/ou em que as posições 512-524 do polipeptídeo F1 compreendem a sequência de aminoácidos apresentada como CCHNVNAGKSTTN (resíduos 512-524 de SEQ ID NO: 844), ou CCHNVNACCSTTN 512-524Y (resíduos de SEQ ID NO: 849); ou em que as posições 512-529 do polipeptídeo F1 compreendem a sequência de aminoácidos apresentada como CCHNVNACCSTTNICCTT (resíduos 512-529 da SEQ ID NO: 853).

13. Imunógeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína F de RSV recombinante compreende os resíduos 26-109 e 137-513, respectivamente, ou 26-103 e 145-513, respectivamente, ou 26-105 e 145-513, respectivamente, da SEQ ID NO : 371 (DS-Cav1, subtipo A), 372 (DSCav1, subtipo B) ou 373 (DSCav1, bovino).

14. Imunógeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína F de RSV recombinante ou fragmento da mesma compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos nas posições a seguir em F1 e F2 de RSV conforme apresentado em qualquer uma de SEQ ID Nos: 1-184: (a) 46-103 e 147-310, respectivamente; (b) 46-104 e 146-310, respectivamente; (c) 50-96 e 149-306, respectivamente; (d) 51-103 e 146-307, respectivamente; (e) 51-103 e 139-307, respectivamente; (f) 50-105 e 146-306, respectivamente; (g) 53-97 e 148 para um dos 305-320; ou (h) uma permutação circular das posições de F1 e F2 listadas em qualquer uma de (a) - (g), em que as posições de F1 e F2 de RSV são unidas por um ligante heterólogo ou estão diretamente ligadas; e/ou em que o ligante heterólogo compreende ou consiste na sequência de aminoácidos apresentada como qualquer uma das SEQ ID NO: 1443-1455, ou um ligante G, S, GG, GS, SG, GGG ou GSG; e/ou em que a proteína F de RSV recombinante compreende substituições de cisteína nas posições 155 e 290, e uma substituição F, L, W, Y, H ou M na posição 190, posição 207 ou posições 190 e 207; e/ou em que a proteína F de RSV recombinante compreende substituições S155C e S290C; substituições S155C, S290C e S190F ou substituições S155C, S290C, S190F e V207L; ou a proteína F de RSV recombinante ou seu fragmento compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos de uma dentre: resíduos 1-128 da SEQ ID NO: 1040 (TZ-13); resíduos 1-126 da SEQ ID NO: 1053 (JG_2KN0); resíduos 1-187 da SEQ ID NO: 1106 (TZ-19); resíduos 27-247 da SEQ ID NO: 1156 (E-CP_RBD51- 307_14mutDS-Cav1_THS); resíduos 26-282 da SEQ ID NO: 1170 (RSVF(+)THS_s_to_hp2_foldon9); resíduos 21-283 da SEQ ID NO: 1188 (MS_08); resíduos 27-553 da SEQ ID NO: 1194 (GSJnh4-TWIN); ou resíduos 26-580 da SEQ ID NO: 1212 (GSJnh4Fd-TWIN).

15. Imunógeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a proteína F de RSV recombinante está ligada a uma proteína dearcabouço.

16. Imunógeno, caracterizado pelo fato de que compreende uma proteína de epitopo-arcabouço que compreende uma proteína de arcabouço heteróloga ligada covalentemente a um polipeptídeo compreendendo um epitopo pré-fusão de proteína F de RSV, em que um anticorpo específico pré-fusão de proteína F de RSV se liga especificamente à proteína de epitopo-arcabouço, preferivelmente, em que o epitopo pré-fusão de proteína F de RSV compreende ou consiste nas posições 62-69 e 196-209 de proteína F de RSV ligadas por um ligante peptídico heterólogo ou uma permutação circular da mesma, em que as posições correspondem à sequência de aminoácidos de um polipeptídeo F0 de referência apresentado como SEQ ID NO: 124; e/ou a proteína de arcabouço heteróloga é uma de uma proteína de arcabouço 2KNO, 2A90, 2W59, 3U2E, 2VJ1, 1CHD, 1PQZ ou 2MOE; e/ou em que a proteína de epitopo-arcabouço compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos da proteína F de RSV e sequência de proteína de arcabouço apresentada de acordo com qualquer uma de SEQ ID NOs: 1053.

17. Imunógeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que compreende um multímero de proteína F de RSV recombinante ou um fragmento da mesma; e/ou em que a proteína F de RSV recombinante ou fragmento da mesma ou proteína de epitopo-arcabouço está ligada a um domínio de trimerização; e/ou o C-terminal do polipeptídeo F1 da proteína F de RSV recombinante está ligado ao domínio de trimerização; e/ou o domínio de trimerização é um domínio Foldon; e/ou a proteína F de RSV recombinante ligada ao domínio de trimerização compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos apresentando os resíduos 26-109 e 137-544 ou 26-103 e 145-544 de uma de SEQ ID NOS: 185 (DS, subtipo A), 1479 (DS, subtipo B), 371 (DS-Cav1, subtipo A), 372 (DSCav1, subtipo B), 373 (DSCav1, bovina), 374 (DS S190F, subtipo A), 375 (DS, S190F, subtipo B), ou 376 (DS, S190F, bovina).

18. Imunógeno, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a proteína F de RSV recombinante ligada ao domínio de trimerização compreende os resíduos 26-109 e 137-544 ou 26-103 e 145-544 da SEQ ID NO: 371 (DS-Cav1, subtipo A) ou SEQ ID NO: 372 (DS-Cav1, subtipo B).

19. Imunógeno, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a proteína F de RSV recombinante ligada ao domínio de trimerização compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos compreendendo os resíduos: os resíduos 26-476 da SEQ ID NO: 669 (BZGJ9-DSCav1) os resíduos 26-472 da SEQ ID NO: 706 (BZGJ9-9 DSCav1) os resíduos 26-474 da SEQ ID NO: 707 (BZGJ9-10 DSCav1).

20. Imunógeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que um resíduo C-terminal de um polipeptídeo F1 da proteína F de RSV recombinante está ligado a um domínio de trimerização de foldon; o imunógeno compreende um trímero da proteína F de RVS recombinante; e a proteína F de RSV recombinante é solúvel em solução aquosa.

21. Imunógeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que um resíduo C-terminal de um polipeptídeo F1 da proteína F de RSV recombinante está ligado a um domínio transmembranar; e o imunógeno compreende um trímero da proteína F de RSV recombinante.

22. Imunógeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que a proteína F de RSV recombinante ou fragmento da mesma ou proteína de epitopo- arcabouço está ligada a uma subunidade de nanopartículas da proteína, preferivelmente, o C-términal da proteína F de RSV recombinante ou fragmento da mesma ou proteína de epitopo- arcabouço está ligada à subunidade de nanopartículas da proteína; e/ou a subunidade de nanopartículas de proteína é uma subunidade de nanopartículas de ferritina, encapsulina, oxigenase redutase de enxofre (SOR), lumazina sintase ou piruvato desidrogenase; e/ou a subunidade de nanopartículas de ferritina compreende uma sequência de aminoácidos apresentando os resíduos 517-679 de SEQ ID NO: 350 e opcionalmente inclui uma substituição C31S, C31A ou C31V no polipeptídeo de ferritina; a subunidade de SOR compreende uma sequência de aminoácidos apresentando os resíduos 516-825 de SEQ ID NO: 344 ou SEQ ID NO: 345; a subunidade de lumazina sintase compreende uma sequência de aminoácidos tapresentando os resíduos 517-670 de SEQ ID NO: 346 ou SEQ ID NO: 348, ou os resíduos 517-669 de SEQ ID NO: 347; ou a subunidade de piruvato desidrogenase sintase compreende uma sequência de aminoácidos apresentando os resíduos 516-757 de SEQ ID NO: 349; e/ou a proteína F de RSV recombinante ligada à ferritina compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos dos resíduos 26-105 e 137-679 de qualquer uma de SEQ ID NOs: 377-382 (partículas de ferritina de A, B, -DSCav1 bovino e DS S190F), em que a proteína F de RSV recombinante ligada à ferritina forma uma nanopartícula de ferritina que se liga especificamente ao anticorpo pré- fusão específico; e/ou a proteína F de RSV recombinante ligada à ferritina compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos dos resíduos 28-664 da SEQ ID NO: 1429 (DS-Cav1 BZGJ9 ferritina Longlink); resíduos 28-663 da SEQ ID NO: 1430 (DS-Cav1 BZGJ9-9 ferritina Longlink); ou resíduos 28-665 de SEQ ID NO: 1431 (DS-Cav1 BZGJ9- 10 ferritina Longlink) ; e/ou a proteína F de RSV recombinante ligada à subunidade de nanopartícula da proteína compreende uma sequência de aminoácidos dos: resíduos 56-500 da SEQ ID NO: 1220 (GSJnh2F); resíduos 48-429 da SEQ ID NO: 1263 (MP11); resíduos 56-536 da SEQ ID NO: 1266 (GSJnh2Fd-F); resíduos 56-526 da SEQ ID NO: 1268 (GSJnh4Fd-F); resíduos 53-256 da SEQ ID NO: 1275 (m0e-resurf1- Ferritina); ou resíduos 52-437 da SEQ ID NO: 1281 (LS1-E-CP_RBD51- 307_11mutDS-Cav1_THS).

23. Imunógeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que a proteína F de RSV recombinante forma um trímero em solução salina tamponada com fosfato em pH fisiológico; e/ou o imunógeno forma uma população homogênea de imunógenos quando incubados em solução aquosa, em que pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% e/ou pelo menos 95% dos imunógenos incubados na solução se ligam especificamente ao anticorpo específico pré-fusão após: (a) incubação durante uma hora em NaCl a 350 mM, pH de 7,0, a 50°C; (b) incubação durante uma hora em NaCl a 350 mM, pH de 3,5, a 25°C; (c) incubação durante uma hora em NaCl a 350 mM, pH de 10, a 25°C; (d) incubação durante uma hora em osmolaridade de 10 mM, pH de 7,0, a 25°C; (e) incubação durante uma hora em osmolaridade de 3000 mM, pH de 7,0, a 25°C; ou (f) dez ciclos de congelamento e descongelamento em NaCl a 350 mM, pH de 7,0; ou (g) uma combinação de dois ou mais de (a) - (f); em que o imunógeno é incubado na solução na ausência do anticorpo específico pré-fusão; e/ou a proteína F de RSV recombinante ou fragmento da mesma não inclui uma ligação de dissulfureto entre as posições 481 e 489 da proteína F de RSV ou entre as posições 509 e 510 da proteína F de RSV; um resíduo de cisteína nas posições 481, 489, 509, 510 da proteína F de RSV ou uma combinação das mesmas; ou uma ligação de dissulfureto entre as posições 481 e 489 do F de RSV, ou entre as posições 509 e 510 do F de RSV e um resíduo de cisteína nas posições 481, 489, 509, 510 do F de RSV ou uma combinação destes.

24. Partícula similar a vírus, caracterizada pelo fato de que compreende um imunógeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23.

25. Nanopartícula de proteína, caracterizada pelo fato de que compreende um imunógeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23.

26. Nanopartícula de proteína, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que a nanopartícula de proteína é uma nanopartícula de ferritina, uma nanopartícula de encapsulina, uma nanopartícula de oxigenase redutase de enxofre (SOR), uma nanopartícula de lumazina sintase ou uma nanopartícula de piruvato deidrogenase.

27. Imunógeno, partícula similar a vírus, ou nanopartícula de proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado(a) pelo fato de que um Fab de anticorpo monoclonal D25 ou AM22 se liga especificamente ao imunógeno, partícula similar a vírus ou nanopartícula de proteína com uma Kd de 1 μM ou menos.

28. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica o imunógeno ou nanopartícula de proteína como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 27.

29. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico codifica uma proteína precursora do imunógeno ou nanopartícula de proteína; e/ou a proteína precursora compreende, do N- para o C-terminal, um peptídeo sinalizador, um polipeptídeo F2, um polipeptídeo Pep27 e um polipeptídeo F1; e/ou a molécula de ácido nucleico tem códons otimizados para expressão em uma célula humana ou bovina; e/ou a molécula de ácido nucleico está operacionalmente ligada a um promotor.

30. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 28 ou 29, preferivelmente em que: o vetor é um vetor viral; e/ou o vetor viral é um vetor do vírus da parainfluenza bovina, um vetor do vírus da parainfluenza humana, um vetor de vírus da doença de Newcastle, um vetor do vírus Sendai, um vetor do vírus do sarampo, um vetor de RSV atenuado, um vetor de paramixovírus, um vetor de adenovírus, um vetor de alfavírus, um vetor de encefalite equina Venezuelana, um vetor do vírus Forest Semliki, um vetor do vírus Sindbis, um vetor do vírus adenoassociado, um vetor de poxvírus, um vetor de rabdovírus, um vetor do vírus da estomatite vesicular, um vetor de picornovírus ou um vetor do vírus do herpes.

31. Molécula de ácido nucleico ou vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 30, caracterizada(o) pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos apresentada como SEQ ID NO: 383, SEQ ID NO: 384, SEQ ID NO: 385 ou SEQ ID NO: 386.

32. Célula hospedeira isolada bacteriana ou de levedura, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor como definido na reivindicação 30 ou 31.

33. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz do imunógeno, partícula similar a vírus, nanopartículas de proteína, molécula de ácido nucleico ou vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 32; e um veículo farmaceuticamente aceitável, preferivelmente, em que a composição imunogênica ainda compreende um adjuvante; e/ou o adjuvante é alúmen, uma composição de água-em-óleo, MF59, AS01, AS03, AS04, MPL, QS21, um oligonucleotídeo CpG, um agonista de TLR7, um agonista de TLR4, um agonista de TLR3 ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos; e/ou o adjuvante promove uma resposta imune a Th1; e/ou pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% e/ou pelo menos 98% dos imunógenos, partículas similares a vírus ou nanopartículas de proteína na composição se ligam especificamente a anticorpos específicos pré-fusão após incubação em solução salina tamponada com fosfato em pH fisiológico e 4°C durante pelo menos 24 horas

34. Imunógeno, partícula similar a vírus, ou nanopartícula de proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que é para uso em um método para detecção ou isolamento de um anticorpo que se liga à proteína F de RSV em um indivíduo, compreendendo: o fornecimento de uma quantidade eficaz do imunógeno, partícula similar a vírus ou nanopartícula de proteína; o contato de uma amostra biológica do indivíduo com a proteína F de RSV recombinante ou nanopartícula de proteína sob condições suficientes para formar um complexo imunológico entre a proteína F de RSV recombinante ou a nanopartícula de proteína e o anticorpo que se liga à proteína F de RSV; e a detecção do complexo imune, deste modo, detectando ou isolando o anticorpo que se liga à proteína F de RSV no indivíduo.

35. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende o imunógeno, a partícula similar a vírus, a nanopartícula de proteína, a molécula de ácido nucleico, o vetor, a célula hospedeira ou a composição imunogênica como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 34; e instruções para uso do kit.

36. Imunógeno, partícula similar a vírus, nanopartícula da proteína, molécula de ácido nucleico, vetor ou composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 34, caracterizado pelo fato de que é para uso em um método para inibir ou prevenir a infecção por RSV em um indivíduo, preferivelmente, em que o indivíduo está em risco ou tem uma infecção por RSV; e/ou a infecção por RSV é um subtipo A de RSV humano, subtipo B de RSV humano ou infecção de RSV bovino; e/ou o indivíduo é um ser humano ou um animal; e/ou o indivíduo tem menos de um ano de idade, mais de 65 anos de idade, ou está grávida; e/ou o indivíduo é uma fêmea em idade fértil, uma criança em idade escolar, de 2 a 5 anos de idade, de 6 a 12 meses de idade, ou menos do que seis meses de idade; mais preferencialmente, para induzir uma resposta imune à proteína F de RSV em um indivíduo; mais preferencialmente, em que a resposta imune compreende uma resposta imune a Th1; e/ou o indivíduo está em risco ou tem uma infecção por RSV; e/ou a infecção por RSV é um subtipo A de RSV humano, subtipo B de RSV humano ou infecção de RSV bovino; e/ou o indivíduo é um ser humano ou um animal; e/ou o indivíduo tem menos de um ano de idade, mais de 65 anos de idade, ou está grávida; e/ou o indivíduo é uma fêmea em idade fértil, uma criança em idade escolar, de 2 a 5 anos de idade, de 6 a 12 meses de idade, ou menos do que seis meses.

37. Uso do imunógeno, da partícula similar a vírus, da nanopartícula de proteína, da molécula de ácido nucleico, do vetor, ou da composição imunogênica como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição ou medicamento para inibir ou prevenir a infecção por RSV em um indivíduo.