CN117567652B - 一种重组呼吸道合胞病毒颗粒抗原 - Google Patents

一种重组呼吸道合胞病毒颗粒抗原 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种重组呼吸道合胞病毒（RSV）颗粒抗原，涉及生物医药技术领域。本发明利用RSV F蛋白重组的头部结构域，成功构建表达了稳定的融合前F蛋白，通过颗粒化结构域的设计将融合前构象的F蛋白展示于纳米颗粒表面，本发明所获得的颗粒抗原及其制备的疫苗表达量高，稳定性好，免疫原性强。

Description

一种重组呼吸道合胞病毒颗粒抗原
技术领域
本申请属于生物医药技术领域，特别涉及一种重组呼吸道合胞病毒颗粒抗原及其制备方法和在制备预防RSV感染的疫苗中的应用。
背景技术
呼吸道病毒感染是全球最重要的公共卫生负担之一，每年导致全世界数百万人住院治疗。呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)是2岁以下儿童和65岁以上成人急性下呼吸道感染的主要原因。尽管RSV感染引起的呼吸道疾病危害严重，但目前尚无几种专门针对RSV的有效治疗方法和预防性疫苗。纵观全球进入临床阶段的RSV疫苗，研发的主要方向集中在减毒活疫苗、重组亚单位疫苗和病毒载体疫苗。RSV疫苗开发主要针对3种目标人群，包括婴幼儿、孕妇和老年人(≥60岁)。年龄小于6个月的婴儿，主要通过mAbs实现被动免疫保护，或由孕妇接种RSV疫苗后经胎盘转移抗体来获得被动保护；对于年龄大于6个月的婴幼儿则可以通过主动免疫RSV减毒活疫苗来获得保护；针对孕妇和老年人，RSV疫苗的开发以亚单位疫苗为主。
主流疫苗抗原的选择主要集中在F蛋白，尤其是融合前构象的F蛋白(PreF)。融合前构象的F蛋白相比融合后构象的F蛋白可以暴露更多具有中和活性的潜在表位，如仅在PreF中存在的表位Φ和表位V。针对表位Φ和表位V产生的抗体具有优秀的中和活性，与融合前构象的F蛋白结合后，可以阻断通过F蛋白构象变化介导的病毒膜融合。尽管已有大量关于RSV F蛋白融合前构象稳定性的研究，但其作为疫苗使用的安全性和有效性仍面临巨大的挑战。
因此，提供一种安全性高且具有增强的免疫原性和改善的稳定性的RSV抗原，以及包含其的疫苗成为本领域技术人员急需解决的技术问题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种重组呼吸道合胞病毒(RSV)颗粒抗原，包含可自组装成七聚体的颗粒化结构域和RSV F蛋白重组的头部结构域，其中所述重组的头部结构域从N端至C端包含直接相连或通过接头序列连接的RSV F蛋白的F1域截短片段和F2域截短片段。
所述重组的头部结构域包含只存在于融合前构象中的表位，所述表位包含以SEQID NO:1所示的野生型RSV F蛋白序列的残基62-69和196-209。
在一些实施方式中，所述颗粒化结构域位于所述重组的头部结构域的C端，与重组头部结构域的C端直接相连或通过接头序列相连。
在一些实施方式中，可选地，所述接头序列为GGGSSGS、GSGSG或G与S组成的4-10个氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述颗粒化结构域可自组装成七聚体，优选地，所述颗粒化结构域为IMX313。
“IMX313”通常被认为是分子佐剂，该技术基于鸡补体抑制剂C4b结合蛋白(C4bp)的寡聚结构域的嵌合版本，以获得Pfs25的均质自组装寡聚物。当在大肠杆菌中表达时，该C4 bp寡聚结构域已被证明自发形成可溶性七聚结构，这些结构域融合的蛋白抗原可改善抗体反应。
成熟F糖蛋白具有三个一般结构域：胞外结构域(ED)、跨膜结构域(TM)和胞质尾区(CT)。CT含有单一棕榈酰基化半胱氨酸残基。
人RSV的F糖蛋白首先从mRNA翻译为单一574个氨基酸的多肽前体(称为“F0”或“F0前体”)，其含有N-末端的信号肽序列(氨基酸1-25)。翻译后，在内质网中通过信号肽酶移除信号肽。F0前体的剩余部分(即，残基26-574)可通过细胞蛋白酶(尤其弗林蛋白酶)在两个多基础位点(a.a.109/110和136/137)进一步切割，移除名为pep27的27个氨基酸的间插序列(氨基酸110-136)且生成名为F1(C-末端部分，氨基酸137-574)和F2(N-末端部分，氨基酸26-109)的连接的片段。F1含有其N-末端的疏水融合肽和两个七肽重复区(HRA和HRB)。HRA靠近融合肽，且HRB靠近TM结构域。F1和F2片段通过两个天然二硫键连接在一起。无信号肽序列的未切割的F0蛋白或F1-F2异二聚体可形成RSV F原体。3个此类原体组装以形成最终RSV F蛋白复合物，其为3个原体的同三聚体。
在一些实施方式中，本发明所述F2域包含与SEQ ID NO:1的氨基酸26-105对应的RSV F蛋白多肽，所述F1域包含与SEQ ID NO:1的氨基酸137-516对应的RSV F蛋白多肽。
在一些实施方式中，所述F1域截短片段至少包含对应于野生型RSV F蛋白的第146-306位氨基酸残基，所述F2域截短片段至少包含对应于野生型RSV F蛋白的第51-104位氨基酸残基。
在一些实施方式中，所述F1域截短片段为对应于野生型RSV F蛋白的第146-306位氨基酸残基，所述F2域截短片段为对应于野生型RSV F蛋白的第51-104位氨基酸残基。
在一些实施方式中，可选地，所述接头序列为GGGSSGS、GSGSG、GGPG或G与S组成的4-10个氨基酸序列。
在一些实施方式中，优选地，所述接头序列为GGPG。
在一些实施方式中，所述重组的头部结构域进一步包含一种或多种氨基酸突变，所述氨基酸突变包括一个或多个氨基酸的添加、缺失或替换。
在一些实施方式中，所述氨基酸突变包括添加非天然二硫键突变和空腔填充突变。
在一些实施方式中，所述添加非天然二硫键突变包括通过成对的半胱氨酸取代形成人工的链内二硫键和/或链间二硫键。
链间二硫键(S-S)通常是指两个不同的有机分子中的硫原子之间的键。
链内二硫键(S-S)是指有机分子中两个相邻硫原子之间的键。
在本发明中，连接单个结构域中两个β-折叠的二硫键成为链内二硫键；连接两个不同结构域(例如，连接一个F1域和一个F2域)或连接两个相邻的相同结构域(例如，连接相邻的两个F蛋白单体的F1域)的二硫键称为链间二硫键。
在一些实施方式中，所述非天然二硫键突变选自V164C+K293C、G151C+I288C、H159C+I291C、S55C+L188C、S56C+V187C、S59C+V193C、K75C+E218C、T397C+E487C、S443C+S466C、T323C+I475C、I332C+P480C、S146C+N460C、I148C+Y286C、A149C+Y458C和S150C+Q302C中至少一组。
在一些实施方式中，所述非天然二硫键突变选自S55C+L188C、I148C+Y286C和H159C+I291C中至少一组。
在一些实施方式中，所述非天然二硫键突变是S55C+L188C、I148C+Y286C和H159C+I291C的组合。
在一些实施方式中，所述空腔填充突变包括V296F、N67F、L158F、V154L、V154I、V187F、S190V、V192M、L193H、S190F、V207L、K77E、V56I、E60F、E82Y、G139W、K168W、Q202Y、V207F、T219F、V220W、L230F和V495L。
在一些实施方式中，所述空腔填充突变选自N67F、L158F、V187F、S190V、V296F、V192M、V495L、S190F和E82Y中的至少一种。
在一些实施方式中，所述空腔填充突变选自N67F、S190V、V296F和V495L中至少一种。
在一些实施方式中，所述空腔填充突变选自N67F、S190V和V296F中的至少两种。
在一些实施方式中，优选地，所述空腔填充突变为N67F和S190V的组合。
在一些实施方式中，优选地，所述空腔填充突变为N67F、S190V和V296F的组合。
在本发明的颗粒抗原氨基酸序列中，特别是重组的头部结构域还包括相对于野生型RSV F蛋白序列的1个～4个天然存在的取代(P102A、I379V、M447V和E218A)。
在一些实施方式中，所述天然存在的取代选自P102A、I379V、M447V和E218A中至少一种。
在一些实施方式中，所述天然存在的取代为P102A。
在一些实施方式中，所述氨基酸突变进一步还可以加入静电突变，所述静电突变减少蛋白中在折叠结构中彼此靠近的残基之间的离子排斥或增加所述残基之间的离子吸引。
在一些实施方式中，所述静电突变包括K80E、E92D、G184N、V185N、K201Q、K209Q和S35F。
在一些实施方式中，优选地，所述静电突变为G184N。
本发明公开的颗粒抗原包含表达所需要的信号肽序列或者与纯化标签相连接的接头序列，这些信号肽序列或者与纯化标签相连接的接头序列可以在最终产物中除去。
在一些实施方式中，所述颗粒抗原包含表达所需要的信号肽为异源信号肽。
在一些实施方式中，所述异源信号肽是IgG信号肽，氨基酸序列为MGWSCIILFLVATATGVHS。
在一些实施方式中，所述颗粒抗原在载体构建时还引入了便于后续纯化的亲和标签，如strep tag(氨基酸序列：WSHPQFEK)、Monoclonal Flag-Tag(氨基酸序列：DYKDDDDK)和His tag(氨基酸序列：HHHHHHHH)，这些标签序列可以在最终产物中除去。
本发明所述的颗粒抗原将融合前构象的F蛋白多肽展示于七聚体纳米颗粒的表面。
本发明还提供所述颗粒抗原在制备预防RSV感染的疫苗中的应用。
本发明还提供一种预防RSV感染的疫苗，包含上述的颗粒抗原，并且所述疫苗针对RSV A亚型和/或B亚型中的至少一种感染提供保护。
本发明公开一种预防RSV感染的疫苗，进一步包含免疫佐剂，所述免疫佐剂包含铝佐剂、角鲨烯、生育酚、MPL、LPA、CpG、poly(I:C)以及QS-21中的至少一种。
在一些实施方式中，免疫佐剂为脂质体形式的佐剂，成分包括MPL、QS-21、DOPC和胆固醇。
本发明还提供制备所述颗粒抗原的方法，包括如下步骤：
S1、合成所述颗粒抗原对应的DNA序列，并克隆到质粒载体中；
S2、用重组质粒载体转染宿主细胞、并进行表达，所述宿主细胞为真核细胞；
S3、对培养产物进行纯化，得到所述颗粒抗原。
在一些实施方式中，本发明所述疫苗通常还包含药学可接受载体和/或赋形剂诸如缓冲剂。药学可接受载体和赋形剂是公知的，并且可以由本领域技术人员进行选择。任选地，药学可接受载体或赋形剂还含有至少一种稳定溶解度和/或稳定性的成分。增溶剂/稳定剂的例子包括去污剂，例如月桂树肌氨酸和/或吐温。另有一些增溶剂/稳定剂的例子包括精氨酸、蔗糖、海藻糖等。因此，本领域技术人员可以选择合适的赋形剂和载体以产生适合于通过选定的使用途径向受试者施用的配制剂。合适的赋形剂包括但不限于甘油、聚乙二醇、KCl、钙离子、镁离子、锰离子、锌离子和其他二价阳离子相关盐等。
通常在佐剂选择时应能够在接受疫苗施用的受试者或受试者群体中增强Th1偏向性免疫应答，且在受试者或受试者群体中是安全且有效的。
本发明还提供制备上述预防RSV感染的疫苗的方法，其包括：
S1、培养哺乳动物宿主细胞以表达所述颗粒抗原；
S2、纯化经步骤(1)表达的颗粒抗原；
S3、将纯化的颗粒抗原与免疫佐剂按比例充分混合。
在一些实施方式中，还包括基因合成、表达载体的构建、纯化蛋白的冻干等额外步骤。可以通过本领域公知的许多方法的任一种或几种来从重组细胞培养物回收和纯化所表达的融合多肽，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、过滤、超滤、离心、阴/阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水性相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。最后，可以在最终的纯化步骤中采用高效液相层析HPLC。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明通过对野生型RSV F蛋白进行针对性截短、重构、稳定化修饰和颗粒化等设计，获得了能够将保留对融合前构象蛋白质具有特异性表位的RSV F蛋白展示于七聚体纳米颗粒表面的颗粒抗原，在维持F蛋白稳定的融合前构象和蛋白装载量的同时确保了其可引起对呼吸道合胞病毒的有效中和抗体反应和结合抗体反应。
附图说明
以下附图仅旨在于对本发明做示意性说明和解释，并不限定本发明的范围。其中：
图1：本发明实施例10中F138和F140蛋白以4℃保存和经1次冻融后的SDS-PAGE电泳结果；
图2：本发明实施例10中F138蛋白以4℃保存和经1次冻融后的SEC-HPLC结果；
图3：本发明实施例10中F140蛋白以4℃保存和经1次冻融后的SEC-HPLC结果；
图4：本发明实施例11中小鼠免疫3周血清中的Pre-F特异性IgG含量；
图5：本发明实施例11中小鼠免疫5周血清中的Pre-F特异性IgG含量；
图6：本发明实施例11中小鼠免疫3周血清中的中和抗体滴度ND50；
图7：本发明实施例11中小鼠免疫5周血清中的中和抗体滴度ND50。
具体实施方式
下面将通过非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围，因为实施方案必然是多样的。本说明书中使用的用语仅是为了阐述特定的实施方案，而非作为限制，本发明的范围已界定在所附的权利要求中。
除非特别说明，本说明书中所使用的所有技术和科学用语均和本案所属技术领域的技术人员所普遍明了的意义相同。下面就本发明的优选方法和材料加以叙述，但是与本说明书中所述方法和材料类似或等效的任何方法和材料均可用以实施或测试本发明。下述实验方法如无特别说明，均为常规方法或产品说明书所描述的方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。
术语定义
在本申请中，术语“F0多肽”(F0)是指RSV F蛋白的前体多肽，其由信号多肽序列、F1多肽序列、pep27多肽序列和F2多肽序列组成。极少例外，已知RSV毒株的F0多肽由574个氨基酸组成。
在本申请中，术语“F1多肽”、“F1域”(F1)是指成熟RSV F蛋白的多肽链。天然F1包括RSV F0前体的近似残基137-574且由(从N-末端至C-末端)细胞外区域(近似残基137-524)、跨膜结构域(近似残基525-550)和细胞质结构域(近似残基551-574)组成。如本文所用，该术语涵盖天然F1多肽和来自天然序列的包括修饰(例如，氨基酸取代、插入或缺失)的F1多肽两者，所述修饰例如被设计以稳定F突变体或增强F突变体的免疫原性的修饰。
在本申请中，术语“F2多肽”、“F2域”(F2)是指成熟RSV F蛋白的多肽链。天然F2包括RSV F0前体的近似残基26-109。如本文所用，该术语涵盖天然F2多肽和来自天然序列的包括修饰(例如，氨基酸取代、插入或缺失)的F2多肽两者，所述修饰例如被设计以稳定F突变体或增强F突变体的免疫原性的修饰。在天然RSV F蛋白中，F2多肽通过两个二硫键连接至F1多肽以形成F2-F1异二聚体。
在本申请中，术语“天然”或“野生型”蛋白、序列或多肽是指未通过选择性突变人工修饰的天然存在的蛋白、序列或多肽。
在本申请中，术语“pep27多肽”或“pep27”是指在RSV F蛋白成熟期间从F0前体切除的27个氨基酸的多肽。pep27的序列侧接两个弗林蛋白酶切割位点，所述弗林蛋白酶切割位点在F蛋白成熟期间通过细胞蛋白酶切割以生成F1和F2多肽。
在本申请中，术语“DS-Cav1”是指RSV F蛋白的具有McLellan等人，Science,342(6158),592-598,2013中所述的氨基酸序列的形式。
在本申请中，术语“D25”是指CN200880023301.9中所述的抗体，其具有重链CDR1：NYIIN，重链CDR2：GIIPVLGTVHYAPKFQG，重链CDR3：ETALVVSTTYLPHYFDN和轻链CDR1：QASQDIVNYLN，轻链CDR2：VASNLET，轻链CDR3：QQYDNLP的氨基酸序列。
在本申请中，术语“101F”是指US11261356中所述的抗体，其具有重链CDR1：TSGMGVS，重链CDR2：HIYWDDDKRYNPSLKS，重链CDR3：LYGFTYGFAY和轻链CDR1：RASQSVDYNGISYMH，轻链CDR2：AASNPES，轻链CDR3：QQIIEDPWT的氨基酸序列。
在本申请中，术语“Mota”或“motavizumab”是指WO2007002543A2中所述的抗体，其具有重链CDR1：TSGMSVG，重链CDR2：DIWWDDKKDYNPSLKS，重链CDR3：SMITNWYFDV和轻链CDR1：SASSRVGYMH，轻链CDR2：DTSKLAS，轻链CDR3：FQGSGYPFT的氨基酸序列。
在本申请中，术语“AM14”是参照WO2008147196A2中所述的抗体，其VH区(V-D-J区段)具有氨基酸序列EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSHYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGENTYYADSVKGRFSISRDNSKNTVSLQMNSLRPEDTALYYCARDRIVDDYYYYGMDVWGQGATVTVSS，VL区(V-J区段)具有氨基酸序列DIQMTQSPSSLSAVGDRVTITCQASQDIKKYLNWYHQKPGKVPELLMHDASNLETGVPSRFSGTDFTLTISSLQPEDIGTYYCQQYDNLPPLTFGGGTKVEIKRTV。
实施例1.质粒构建与基因合成
按照如下表1设计颗粒蛋白及对照组的氨基酸序列，氨基酸序列按照宿主CHO细胞进行密码子优化确定核酸序列进行基因合成。
表1.构建体氨基酸序列设计
名称 氨基酸序列SEQ ID NO:
WT 1
IMX313 2
F head-IMX313 3
DS-Cav1 4
实施例2.质粒转化、制备及酶切鉴定
将合成的目的基因插入真核质粒pCHO3.1载体，用于转染和表达。将构建的各重组质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，将转入含有目的基因的质粒的甘油菌转接到150mL LB液体培养基(Amp终浓度为100μg/ml)中，在37℃、2000rpm下摇床培养过夜，用无内毒素质粒大提试剂盒进行质粒提取，对提取物测定质粒浓度、并进行酶切鉴定，具体的反应体系如表2所示。
表2.酶切反应体系
质粒扩增后测定浓度，结果如表3所示，可见各质粒均能获得较高的扩增浓度。
表3.质粒浓度测定结果
用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，在相应大小的位置可见清晰的条带。对所有质粒的进行测序，经鉴定，所有质粒目的基因序列完全正确。载有目的基因的重组质粒载体已被成功转入宿主细胞中，并已成功获得扩增。
实施例3.蛋白表达
通过瞬时转染的方法将得到的质粒导入CHO细胞中，经过培养后收集蛋白上清液。
将ExpiCHO-S细胞(Thermo)在补充有6mM L-谷氨酰胺(sigma/G5146)的EmCD CHO-S203(Eminence/L20301)培养基中培养，提前一天按0.25E5 cells/孔密度铺96孔板(补加10％ FBS)，37℃、8％CO2的培养箱中静置培养。转染当天将铺有细胞的96孔板更换新鲜的含L-谷氨酰胺的EmCD CHO-S203培养基。用含L-谷氨酰胺的EmCD CHO-S203培养基配制转染孵育体系(体积为转染体积的50％)，其中DNA用量1μg/ml，转染试剂PEI(Polysciences/24765-1)与DNA的比为3，将PEI与DNA混合静置孵育5min后加入铺有细胞的96孔板中，将培养物于37℃、8％CO2的培养箱中静置培养。转染24h后降温至32℃培养，按5％体积比添加Advanced Feed1(sigma/24368-1L)补料。转染后第7天停止培养收取上清。
实施例4.含中和抗体表位Siteφ和SiteⅡ部分的筛选
使用PBS稀释包被抗体D25或包被抗体motavizumab(简称mota)，至5ng/μL，每孔加入200μL，4℃过夜孵育。PBST洗1次。用250μL 2％ BSA/PBS封闭ELISA检测板，室温封闭1小时，用PBST清洗1次。每孔加入200μL蛋白上清液，室温孵育1h。用PBST清洗3次。用0.2％BSA/PBS中稀释HRP标记抗体到适应稀释度(D25-1:8000，mota-1:16000)，每孔加入200μL，室温孵育1小时。用PBST清洗4次。
加入100μL底物溶液(TMB双组份溶液A:B＝1:1混合)，室温反应15-20min，添加100μL终止液，并读数OD值。
结果如下表所示，能够结合特异性单抗D25和mota的是具有PreF特异性表位Siteφ和SiteⅡ的F head部分，而颗粒结构域IMX313不具有特异性结合D25或mota的能力。
表4.目标蛋白与D25和Mota的结合情况
实施例5.颗粒结构域的评价
取蛋白表达上清，在50℃和70℃条件下分别孵育1小时，再采用双抗体夹心ELISA法，以101F作为包被抗体，D25、motavizumab(后续简称Mota)作为标记抗体检测配对，检测考察不同极端温度条件下颗粒结构域IMX313对蛋白活性、PreF构象占比及稳定性的影响，其中，蛋白活性以表位特异性中和抗体检测活性浓度表示，PreF构象占比以D25与Mota的活性浓度比值表示，构象热稳定性以50℃-1h或70℃-1h与低温时的D25活性浓度比值表示。
表5. 70℃时蛋白活性及PreF构象占比情况
表6.构象稳定性情况
结果发现50℃条件下，蛋白活性变化不明显，且PreF蛋白构象稳定性高。在更加极端的70℃温度条件下，颗粒抗原F head-IMX313和DS-Cav1对照蛋白的蛋白活性和Pre-F构象稳定性均受到较大的影响，因此高温不利于Pre-F构象的稳定。但对于未经任何稳定化修饰的颗粒抗原F head-IMX313来说，其在50℃和70℃条件下的稳定性降幅比DS-Cav1对照蛋白小，而且即使是在如此极端条件下，颗粒抗原F head-IMX313活性仍远高于DS-Cav1对照蛋白。因此，不同于本身具有多种稳定化修饰的DS-Cav1对照蛋白(具有双半胱氨酸突变S155C和S290C、空腔填充突变S190F和V207L以及foldon三聚化结构域)，本发明重构的Fhead和颗粒结构域IMX313均对维持蛋白活性、Pre-F构象及其稳定性做出重要贡献。
实施例6.F蛋白单独突变方案筛选
本发明的各突变体是基于SEQ ID NO:1中所述的野生型(简称WT)RSV F蛋白氨基酸序列来设计和制备的。本实施例说明各种F蛋白单突变体的设计，所述F蛋白单突变体包括foldon结构域和引入的氨基酸突变，例如添加非天然二硫键突变、空腔填充突变、静电突变。这些F蛋白单突变体包含IgG信号肽(MGWSCIILFLVATATGVHS)、两个单独多肽链。多肽链之一，F2多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸26-106，除了如所述的引入的突变。另一多肽链包含连接至foldon结构域N-端的F1多肽(残基136-513)，除了如所述的引入的突变，它们通用引入的修饰还包括del_P27替换为ARGSGSG、R106Q和F137S。另外还包含纯化标签His-Tag(HHHHHHHH)、亲和标签Monoclonal Flag-Tag(DYKDDDDK)和接头序列(例如GSGSG)。SEQ IDNO:1的信号肽(残基1-25)和pep27(残基110-136)在表达过程期间从F0前体切割。
按下表设计各个RSV F蛋白单独突变体及对照组蛋白的氨基酸酸序列，氨基酸序列按照宿主CHO细胞进行密码子优化确定核酸序列并进行基因合成。
表7.仅含添加非天然二硫键的突变体
表8.仅含空腔填充突变的突变体
质粒名称 突变
pCHO3.1-F57 V296F
pCHO3.1-F58 N67F
pCHO3.1-F59 D486H+E487Q+F488W+D489H
pCHO3.1-F76 L158F
pCHO3.1-F77 V154L
pCHO3.1-F78 V154I
pCHO3.1-F79 V187F
pCHO3.1-F80 S190V
pCHO3.1-F81 V192M
pCHO3.1-F82 L193H
pCHO3.1-F83 I492F
pCHO3.1-F84 V495L
pCHO3.1-F85 S190F
pCHO3.1-F86 V207L
pCHO3.1-F90 K77E
pCHO3.1-F105 V56I
pCHO3.1-F106 E60F
pCHO3.1-F107 E82Y
pCHO3.1-F108 G139W
pCHO3.1-F109 K168W
pCHO3.1-F110 Q202Y
pCHO3.1-F111 V207F
pCHO3.1-F112 T219F
pCHO3.1-F113 V220W
pCHO3.1-F114 L230F
pCHO3.1-F115 S409Y
pCHO3.1-F116 I475W
表9.仅含静电突变的突变体
/>
参照实施例2的方法进行质粒转化、制备及酶切鉴定，质粒扩增后测定浓度，各质粒均能获得较高的扩增浓度。对所有质粒的进行测序，经鉴定，所得质粒目的基因序列完全正确。载有目的基因的重组质粒载体已被成功转入宿主细胞中，并已成功获得扩增。
再参照实施例3的方法通过瞬时转染的方法将得到的质粒导入CHO细胞中，经过培养后收集蛋白上清液。
使用PBS稀释包被抗体D25或包被抗体motavizumab(简称mota)，至5ng/μL，96孔板每孔加入200μL，4℃过夜孵育。PBST洗1次。用250μL 2％BSA/PBS封闭ELISA检测板，室温封闭1小时，用PBST清洗1次。每孔加入200μL蛋白上清液，室温孵育1h。用PBST清洗3次。用0.2％ BSA/PBS中稀释HRP标记抗体到适应稀释度(D25-1:8000，mota-1:16000)，每孔加入200μL，室温孵育1小时。用PBST清洗4次。加入100μL底物溶液(TMB双组份溶液A:B＝1:1混合)，室温反应15-20min，添加100μL终止液，并读数OD值，并根据回归分析方程计算样品浓度。计算蛋白在4℃条件下放置7天后的PreF构象占比，以D25与Mota的活性浓度比值表示。
表10.F蛋白单突变体4℃放置7天的PreF构象占比
/>
蛋白上清液在4℃放置7天后，与DS-Cav1对照组相比，仅含添加非天然二硫键突变的F蛋白单突变体F24、F27、F30、F31、F32、F35、F38、F40、F41、F46、F53和F123，以及仅含空腔填充突变的F蛋白单突变体F58、F76、F79、F80、F81、F84、F85和F107仍具有较高的PreF构象占比。因此，在F蛋白单突变体的设计中，空腔填充突变N67F、L158F、V187F、S190V、V192M、V495L、S190F和E82Y，以及添加的非天然二硫键突变V164C+K293C、V151C+I288C、S55C+L188C、S56C+V187C、S59C+V193C、T397C+E487C、S443C+S466C、T323C+I475C、I332C+P480C、S146C+N460C、A149C+Y458C和S150C+Q302C，这些突变设计对PreF构象的稳定化做出了重要贡献。而仅含静电突变的F蛋白单突变体F91～F104并不能仅依靠此种突变方式在4℃的长时间贮存中达到良好的稳定PreF构象的效果。
实施例7.组合突变颗粒抗原设计
在筛选中，发明人意外地发现，虽然一些组合突变颗粒抗原引入的均为经单独突变筛选出的有利于在4℃长期贮存中维持Pre-F构象稳定的突变，但它们在60℃高温条件下维持蛋白活性或Pre-F构象热稳定性方面却表现不佳。因此，在设计组合突变颗粒抗原时并不完全摒弃在单独突变筛选时欠佳的方案。优选示例性的，按照下表进一步设计在RSV Fhead中具有优选的组合突变的颗粒抗原及对照组颗粒蛋白，组合突变颗粒抗原N端信号肽为IgG信号肽，其氨基酸序列为MGWSCIILFLVATATGVHS，而后连接引入组合突变的RSV Fhead，其中，RSV F head的结构从N端至C端依次为F1域截短片段(残基146-306)，接头序列和F2域截短片段(残基51-104)，组合突变颗粒抗原C端为颗粒化结构域IMX313。另外，组合突变颗粒抗原设计时还加入了便于纯化的亲和标签。氨基酸序列按照宿主CHO细胞进行密码子优化确定核酸序列进行基因合成，经质粒转化、制备和酶切鉴定正确后通过CHO表达系统表达目的蛋白。
表11.组合突变颗粒抗原设计
实施例8.组合突变颗粒抗原上清中蛋白活性、构象占比及构象热稳定性评价
组合突变颗粒蛋白表达三天后，10000rpm离心收集表达的细胞上清，另取表达上清，在60℃和70℃条件下分别孵育1小时，再采用双抗体夹心ELISA法，以101F作为包被抗体，D25、motavizumab(后续简称Mota)或AM14作为标记抗体检测配对，检测表达的各组合突变颗粒蛋白的蛋白活性，在不同温度下孵育后不同结构的占比及Siteφ表位的构象热稳定性。其中，蛋白活性以表位特异性中和抗体检测活性浓度表示，不同结构占比以0d的D25或AM14与Mota的活性浓度比值表示，构象热稳定性以60℃-1h/0d、70℃-1h/0d的D25活性浓度比值表示，结果如下表所示。
表12.不同温度孵育后上清中的蛋白活性
注：“/”表示未检测到反应性或未测定
表13.结构占比与构象热稳定性
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在蛋白活性方面，组合突变颗粒蛋白组和DS-Cav1-N对照组颗粒蛋白都能够正常表达，且F137、F138、F139和F140在不同温度条件下的蛋白活性均远高于DS-Cav1-N对照组，受高温影响较小。在不同结构占比方面，与DS-Cav1-N对照组相比，F140的D25/Mota比值(0d)与其相当，而F137、F138和F139的D25/Mota比值(0d)均高于对照组，说明本发明提供的颗粒抗原在颗粒聚体表面上展示的F蛋白呈融合前构象。且各组合突变颗粒蛋白的AM14/Mota比值均较低，进一步印证了本发明成功构建了颗粒抗原而非三聚体蛋白抗原。
在热稳定性方面，经60℃处理后的所有组合突变颗粒蛋白的Pre-F构象稳定性良好，基本未受到实质性影响。经70℃极端高温处理后，所有蛋白稳定性均明显下降，尤其是DS-Cav1-N对照组几乎丢失全部Pre-F构象，而本发明的组合突变颗粒蛋白仍能保持至少约50％的Pre-F构象，因此本发明的颗粒抗原在极端温度的条件下具有更优的热稳定性，尤其是F138和F140在各方面表现俱佳。
实施例9.温度对蛋白性质的影响
大量制备的F138、F139和F140蛋白使用镍柱亲和层析和分子筛层析两步纯化方法纯化后，将蛋白浓度稀释至检测浓度4ng/ml，再使用Pre-F融合前构象特异性单抗D25鉴定纯化的蛋白构象的稳定性，构象热稳定性以60℃-1h/4℃的D25活性浓度比值表示、4℃条件下的贮存稳定性以4℃-7d/4℃的D25活性浓度比值表示，结果如下表所示。
表14.蛋白纯化得率
表15.蛋白构象热稳定性及贮存稳定性表征
表16.蛋白构象热稳定性及贮存稳定性表征续表
本发明的公开的颗粒抗原蛋白表达量及纯化得率高，在稳定性方面，相较于处理前，无论60℃孵育1h或4℃贮存7天，所有组合突变颗粒蛋白的融合前构象F蛋白稳定性几乎没有显著变化，更为稳定。本发明的组合突变颗粒蛋白的热稳定性良好，且可以保证在4℃条件下贮藏至少7天。另外，为获得更稳定的贮藏条件，发明人还以颗粒蛋白F138和F140为待测样品尝试了-80℃冻存的贮藏方式。
实施例10.冻融对蛋白性质的影响
取出-80℃冻存的蛋白样品，并将其放置在冰上或4℃低温环境中，缓慢地加入适量的蛋白质溶解缓冲液，同时轻轻搅拌样品，继续在低温下搅拌样品直至蛋白质完全溶解。为探究冻融1次是否会改变蛋白性质，分别从蛋白降解情况、粒径变化、构象变化和蛋白分子量多方面进行表征。
10.1SDS-PAGE：
以4℃保存和经1次冻融的F138和F140蛋白为待测样品，进行SDS-PAGE电泳，结果如图1和图2所示，冻融1次后蛋白条带和4℃保存蛋白一致，4℃保存的蛋白降解条带略多，-80℃冻存较好。
10.2DLS粒径检测：
经DLS(Dynamic Light Scattering，动态光散射)检测，F138蛋白冻融后粒径变化较显著，由13.4nm减小至12nm，F140蛋白冻融前后粒径变化均无显著性差异，颗粒粒径为13±0.3nm左右，符合预期。
10.3ELISA构象变化：
采用双抗体夹心ELISA法，以101F作为包被抗体，D25作为标记抗体检测配对，检测4℃保存和经1次冻融的F138和F140蛋白活性浓度。结果如下表，冻融1次后和4℃保存蛋白D25构象浓度检测比在1附近，因此，冻融1次对蛋白构象没有影响。
表17.冻融前后构象变化
10.4SEC-HPLC：
采用SEC-HPLC方法对4℃保存和经1次冻融的F138和F140蛋白分别进行分子量的确定，结果如图3和图4所示，蛋白冻融前后出峰位置一致，冻融1次对蛋白大小和纯度几乎无影响。
综上，颗粒蛋白F138和F140均适宜-80℃冻存的贮藏方式。
实施例11.免疫评价
选择6-8周龄的雌性BALB/C小鼠进行免疫，随机分组，每组6只，在0天、21天通过肌肉注射对小鼠进行疫苗双点免疫，左、右腿各50μL，免疫原包括候选抗原F138和F140；PBS为阴性对照组。抗原剂量为12μg/只小鼠，AS01佐剂剂量为每只小鼠1/20HD(1HD AS01佐剂为0.5ml，含50μg MPL、50μg QS-21、1mg DOPC、0.25mg胆固醇、4.835mg氯化钠、0.15mg无水磷酸氢二钠、0.54mg磷酸二氢钾和注射用水)。分别在第20天和第35天收集血清，采集的血清储存于-20℃，后续进行中和抗体和结合抗体检测。
11.1结合抗体检测：
(1)待检血清样本使用样本稀释液稀释；
(2)阴性对照血清使用样品稀释液1:200倍稀释；
(3)加样：将系列稀释的待测血清样本、阴性对照血清以100μl/孔加至pre-F酶标板中，待测血清样本加1孔，对照溶液加2孔；IgG-UNLB标曲酶标板条以100μl/孔加入样品稀释液；
(4)温育：酶标板置于37℃温育30分钟，于自动洗板机用洗涤液洗板5次；
(5)加酶：将酶标二抗(HRP Goat Anti-Mouse IgG(H+L)，ABclonal)以100μl/孔加至酶标板内，置于37℃温育30分钟，于自动洗板机用洗涤液洗板5次；
(6)显色：显色A液与显色B液(飞净生物)等体积混匀，100μl/孔加至酶标板内，于室温避光孵育15分钟；
(7)终止：以50μl/孔加入终止液终止反应；
(8)读板：用酶标仪在波长450nm处测定吸光度(参比波长为620nm)，结果如下表及图4、图5所示。
表18.(3周血清)Pre-F特异性IgG含量
表19.(5周血清)Pre-F特异性IgG含量
结果显示，在用免疫原F138和F140配合佐剂对小鼠基础免疫后，3周血清中均检测出显著的Pre-F IgG抗体，并且在加强免疫后，小鼠5周血清中检测到的Pre-F IgG GMC(几何平均浓度)均有不同程度的大幅提升，分别为3周时的29倍和50倍。虽然结合抗体还没有建立起与保护的免疫相关性，但高浓度的血清抗体与感染后严重下呼吸道疾病风险的显著降低有关。
11.2中和抗体检测：
中和抗体是可以特异性识别病毒表面的抗原中和位点，阻止病毒入侵细胞繁殖，保护机体免受其害，具有真正抗病毒作用的评价免疫效果的指标。委托中科国邦利用RSVA2毒株通过荧光斑点减少中和试验(FRNT法)进行中和抗体检测。具体步骤为：
(1)样品准备：室温解冻-20℃储存的血清，56℃热灭活30min，30min后取出并冷却至室温，然后将每组的6份血清充分混合获得各组混合血清样品。
(2)样品加样及稀释：40倍初始稀释，后续4倍稀释，作6个稀释度。取96孔板，第2列做为细胞对照(CC)，第3列做为病毒对照(VC)。于B4-B11孔中加入已稀释20倍的样品，使用多道移液器对B4-B11孔中液体轻柔的反复混匀，然后进行4倍比稀释，直至G4-G11孔中。另取阴性参考品进行加样及稀释。
(3)病毒稀释：在冰盒上将病毒稀释至800～1200FFU/孔，加入除细胞对照外的各孔。
(4)将上述96孔板置于37℃、5％CO2培养箱中孵育1h。
(5)将HEp-2细胞消化计数，使用完全培养基调整至2.0×105个/mL，100μL/孔加入到96孔板中。
(6)置于37℃、5％CO2培养箱中培养，24-28小时后用细胞成像多功能微孔板检测系统进行GFP荧光斑点计数，并记录结果。
(7)50％中和抗体抑制率(ND50)的计算：将仪器读取的荧光斑点数值输入数据分析模板，使用Reed-Muench法计算样品50％中和抗体抑制率(ND50)。结果如下表及图6、图7所示。
表20.中和抗体滴度
结果显示，在用候选抗原F138和F140配合佐剂对小鼠进行基础免疫后，小鼠3周血清中均能检测出针对RSV A2毒株的中和性抗体。并且，在随后的加强免疫中，相较于基础免疫3周后的结果，从经候选抗原加强免疫后的小鼠血清中的中和抗体滴度来看，候选抗原F138和F140均诱导产生了更高水平的中和抗体，检测到的中和抗体滴度分别为3周时的41.5倍和55.4倍，表现出显著的疫苗保护性。
由上述实验可以看出，本发明提供的抗原稳定性高，抗原及疫苗组合物可诱导产生针对RSV病毒的高滴度的中和抗体，这也提示在病毒入侵时疫苗将提供较好的保护性效果，对RSV候选疫苗的研发具有重要意义。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1. 一种重组呼吸道合胞病毒颗粒抗原，包含RSV F蛋白重组的头部结构域和可自组装成七聚体的颗粒化结构域IMX313，其中所述重组的头部结构域从N端至C端包含直接相连或通过接头序列连接的RSV F蛋白的F1域截短片段和F2域截短片段，且所述重组的头部结构域相较于野生型RSV F蛋白的头部结构域的突变由以下组成：
（A）非天然二硫键突变：S55C+L188C和I148C+Y286C的组合或者S55C+L188C、I148C+Y286C和H159C+I291C的组合，空腔填充突变：N67F+S190V以及天然取代P102A；或
（B）非天然二硫键突变：S55C+L188C和I148C+Y286C的组合或者S55C+L188C、I148C+Y286C和H159C+I291C的组合，空腔填充突变：N67F+S190V+V296F，静电突变G184N以及天然取代P102A，
其中所述F1域截短片段和F2域截短片段分别对应于野生型RSV F蛋白的第146-306位和第51-104位氨基酸残基，所述野生型RSV F蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2.如权利要求1所述的颗粒抗原，其中所述重组的头部结构域的C端与所述颗粒化结构域的N端直接相连或通过接头序列相连。
3. 如权利要求2所述的颗粒抗原，其中所述颗粒抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：5、6、7、8中任一项所示。
4.如权利要求1-3中任一项所述的颗粒抗原，其中所述颗粒抗原将融合前构象的F蛋白多肽展示于七聚体纳米颗粒的表面。
5.权利要求1-3中任一项所述的颗粒抗原在制备预防RSV感染的疫苗中的应用。
6. 一种预防RSV感染的疫苗，包含权利要求1-3中任一项的颗粒抗原；所述疫苗针对RSV A亚型和/或B亚型中的至少一种感染提供保护。
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