JP2015514750A

JP2015514750A - 新規なロタウイルスワクチン組成物及び同組成物を調製する方法

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Publication number: JP2015514750A
Application number: JP2015506356A
Authority: JP
Inventors: クリシュナモハンヴァドレヴ; サイデヴァラジュールプラサッド
Original assignee: バハラバイオテックインターナショナルリミテッド
Priority date: 2012-04-23
Filing date: 2013-04-23
Publication date: 2015-05-21
Anticipated expiration: 2033-04-23
Also published as: EP2945650A1; WO2013160913A1; BR112014026407A2; EP2945650B1; RU2643929C2; US20150098967A1; BR112014026407B1; CN110227152A; RU2014146772A; US10568957B2; CN104507495A; JP6126684B2

Abstract

本発明は、ロタウイルス抗原、安定化剤及び緩衝液を含む、ロタウイルスワクチン組成物を提供する。本発明における緩衝液は、前記ロタウイルスワクチン組成物中に事前混合され、ワクチン投与前に制酸剤を別個に投与する必要がなく、胃の強酸性ｐＨを中和する。本発明の緩衝液を含むワクチン組成物は、経口投与のための、安定な液体ロタウイルスワクチン製剤である。

Description

本発明は、新規なロタウイルスワクチン組成物及び同組成物を調製する方法に関する。より詳細には、本発明は、ロタウイルス抗原、安定化剤及び新規な緩衝液を含む、新規なロタウイルスワクチン組成物に関する。緩衝液は、本発明のロタウイルスワクチン組成物中に事前混合される。本発明のワクチン組成物は、経口投与のための、安定な液体ロタウイルスワクチン製剤である。

ロタウイルスは、世界的に見て、重症の脱水性下痢の最も一般的な原因である。毎年、５０万人を超える５歳未満の小児が、ロタウイルス性下痢によって死亡している。これらのロタウイルス関連の死亡のうちの８０％超が、サハラ以南のアフリカ及び南アジアの発展途上国において発生している。その上、発展途上国及び先進国の両方において、下痢によるすべての入院のうちの２５〜５０％及び小児において、１年間に医療機関を受診する２３００万人の外来患者は、ロタウイルスが原因である。ほとんどすべての小児は、５歳までにロタウイルス感染を経験する。ロタウイルス性疾患の地球規模の膨大な負担のために、この病原体に対するワクチンの開発は、過去３０年間で優先事項となっている。市場で入手可能な２つの経口投与用ロタウイルス生ワクチンは、RotaTeq（登録商標）（Merck and Co., Inc.社, PA, USA及びSanofi Pasteur MSD SNC社, Lyon, France）及びRotarix（登録商標）（GSK Biologicals社, Rixensart, Belgium）である。２００９年４月及び１０月に、ＷＨＯの専門家による戦略的諮問委員会（ＳＡＧＥ，Strategic Advisory Group of Experts）は、アフリカ及びアジアにおける種々の集団からの追加の有効性データ並びにアメリカにおける承認後調査を再検討し、ワクチン接種の推奨を世界のすべての地域にまで拡大した。

ロタウイルスキャプシドは、同心円状の３つのタンパク質層で構成されている。外層はＶＰ７及びＶＰ４からなり、ウイルスの宿主細胞内への侵入中に失われる。ロタウイルス野生分離株は、トリプシン処理によって及びトリプシンを含む培地を補うことによって、ＶＰ４を２つのフラグメントＶＰ８^＊及びＶＰ５^＊に開裂させることで、組織培養における高力価増殖に適合させることが可能である。プロテアーゼ阻害剤は、インビトロ及びインビボにおいて、ロタウイルスの複製を減じることが知られている。トリプシンは、３層粒子（ＴＬＰ，triple-layer particle）と結び付くと不活性であり、アプロチニンなどのプロテアーゼ阻害剤に接近することができない。外層がカルシウム−キレート剤によって可溶化されると、ＶＰ５^＊、ＶＰ８^＊及びＶＰ７が放出され、結び付いたトリプシンが活性化され、ウイルスのキャプシドタンパク質及び他の外因性タンパク質の開裂が可能となる。トリプシン阻害剤を加えると、細胞中のウイルスｍＲＮＡ及びウイルスタンパク質の合成が著しく減少し、ウイルスが細胞に入る際に存在する場合、大きな阻害作用を有することが示されている。このことは、トリプシンのロタウイルス粒子への組み込みが、その感染性を増強し得ることを示している。

感染性は、トリプシン処理によって増強される。トリプシンは、ウイルスの非感染性画分が感染細胞中で脱外被することを可能にすることによって、この画分を感染性ウイルスに変換する。トリプシンは、ウシロタウイルスの８８，０００−ダルトンの構造ポリペプチドを開裂し、６７，０００−ダルトン及び２０，０００−ダルトンの開裂生成物を産生することが見出されている。ロタウイルスのトリプシン（ブタ由来）を用いた活性化は確立されており、感染後、培地中にトリプシンを加えることも、最適収率を得るために行われた。しかし、トリプシンの源がブタ（porcine）、すなわちブタ（pig）由来である。ブタ源を由来とするトリプシンは、所望されないブタサーコウイルス１及び２のような他の混入ウイルスを含有する恐れがあることが示されている。ブタトリプシンがロタウイルスの増殖に使用される場合に、ポリ塩化ビ−フェニル（ＰＣＢ，polychlorinated bi-phenyl）のような、微量の他の危険な汚染物質も見出され得る。したがって、動物由来のトリプシンを、ロタウイルス培養のバイオプロセスから、可能な範囲まで避けることが必須である。加えて、ブタ関連生成物は、特に世界のイスラム地域における、ある特定の信仰に対する障壁でもあるため、ブタ由来のものを絶対に含まないワクチンが、より有益であり有用である。ワクチン製剤中のＰＣＢ及び他の動物源の危険性を克服するために、バイオプロセスにおける新規なステップである組換えトリプシンの使用を導入すべく、プロセス開発研究に着手した。組換えトリプシンは、動物成分を含まない（ＡＣＦ，animal component free）、活性が非常に特異的である、混入キモトリプシンを含まない、動物由来の外来性薬剤を含まない且つ人が消費しても安全である。

Wyeth社は、１９９８〜９９年に、商業用ロタウイルスワクチンを市場に発売するという最初の特権を得た。Wyeth社のRotashieldの組成物には、アカゲザル胎仔二倍体細胞株中で増殖させた、アンホテリシンＢ培地中、ヒト−サル再集合体四価生ロタウイルス抗原、スクロース、グルタミン酸一ナトリウム、一リン酸カリウム、二リン酸カリウム、ウシ胎仔血清、硫酸ネオマイシンが含まれていた。しかし、ワクチン投与後の腸重積に関係する問題及び関連する副作用のために、Wyeth社は、その商業用ロタウイルスワクチン製剤を市場から回収した。現在のワクチンは、１つは一価ヒト血清型−Ｐ１Ａ［８］Ｇ１を含むもの（Rotarix）、また１つは５種類のヒト−ウシ再集合体−Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４及びＰ１Ａ［８］を含むもの（RotaTeq）などであり、臨床試験において一般的な有効性及び安全性を実証している。腸重積とロタウイルスワクチンとの関連性について、かなりの進歩を遂げてはいるが、答えの出ていない大きな問いは解決されるべきものとして、まだ残されたままである。入手可能なロタウイルスワクチンは、発展途上国において試験された場合、一般に有効性が不十分であることが、既に観察及び証明されており、このことは、これらの設定における未来の任意の経口ロタウイルス生ワクチンの潜在的な有効性に対する懸念につながっている（Bresee JS, Glass RI, Ivanoff B, Gentsch J. Current status and future priorities for rotavirus vaccine development, evaluation and implementation in developing countries. Vaccine 1999;17:2207-22）。高所得国では、ロタウイルスで死亡する小児はほとんどいないが、世界的には、毎年ロタウイルス感染症で死亡する大抵の小児は、低所得国の出身である。低所得国におけるロタウイルスワクチンの研究は、ワクチン接種計画にもかかわらず、高所得国とは異なり、中等度の有効性を示している。発展途上国におけるロタウイルスワクチンのそのような中等度の結果は、医療機関への受診（水分補給療法）の制限、不十分なインフラ、ワクチンの輸送にかかるより高額なコスト、ワクチンの投与方法における特徴、血清型カバー率の特異性及びより大きな栄養不良率を含む因子の組合せに起因するものであり得る。この地域における現在の調査は、低所得国におけるロタウイルスワクチンのさらなる研究を必要としており、ワクチンの成績を向上させるための新規なやり方を特定する。最も重要なことには、所望のこれらの低所得国における高価で長期の輸送及び貯蔵施設を克服するために、ロタウイルスワクチン製剤の安定性を高めることが必要である。ロタウイルス感染症に対するロタウイルスワクチンの分野で利用可能な先行特許は、ロタウイルスワクチン製剤の安定性に関する実験データを提供しているが、当技術分野の現状に基づく実用的な意味合いは、ワクチンの製造日から１年後の安定性の大きな障害を反映している。したがって、ロタウイルスに対する闘いが、まだその初期段階にあると考えられ得る、最も発展が遅れている国又は他の低所得国の全域で、世界的規模のワクチン接種計画を保証するために、ロタウイルスワクチン製剤について、少なくとも２４カ月間の貯蔵について示すための効果的な安定性試験が必要とされている。

ロタウイルスは、ｐＨ２．０で１２分未満の半減期を有する、酸に不安定なウイルスである。ロタウイルスは、そのような酸性ｐＨで急速に不活化される。ロタウイルスワクチンは、幼児に経口経路によって投与されることを意図しており、ロタウイルスワクチン中の抗原は、胃酸によって不活化される可能性が最も高い。したがって、胃酸によるウイルスの不活化を防ぐために、制酸剤又は緩衝液を、経口ロタウイルスワクチン接種の前又はそれと組み合わせて投与する必要がある。

米国特許第６６１６９３１号を保有して、Merck社はロタウイルスワクチン界に参入した最初の企業である。米国特許第６６１６９３１号明細書は、液体ロタウイルスワクチン製剤を含むロタウイルスワクチン組成物であって、ロタウイルス株：（１×１０^５〜１０００×１０^５ｐｆｕ／ｍｌ）、スクロース、ラクトース［１％〜７０％ｗ／ｖ］、マンニトール、ソルビトール、デキストロース、フコース、トレハロース、ポリ−アスパラギン酸又はＮ−アセチルノイラミン酸、イノシトール−六リン酸（フィチン酸）及びシアル酸からなる群から選択される糖、一リン酸塩、ポリリン酸塩及びリン酸化糖からなる群から選択されるリン酸塩［０．０１Ｍ〜２Ｍ］並びにコハク酸塩（０．０５Ｍ）、クエン酸塩（０．０７Ｍ）、フマル酸塩、酒石酸塩（tartarate）、マレイン酸塩及び乳酸塩からなる群から選択されるカルボン酸塩［０．０５Ｍ〜２Ｍ］、組換えヒト血清アルブミン（０．５〜１．２５％）を含み、液体製剤及び凍結乾燥製剤にはポリソルベート（０．１〜２％）を含む組成物を特許請求している。凍結乾燥製剤の場合には、ポリソルベート及びポリソルベート８０（０．００〜０．１％）からなる群から選択される非イオン性界面活性剤が特許請求されている。０．０５Ｍ〜２Ｍ及び０．０１Ｍ〜２Ｍの範囲のクエン酸塩及びリン酸塩は、胃酸の酸性環境に対抗するための緩衝液として、ロタウイルス製剤中に使用されている。商品化されたMerck社のワクチン「Rotateq」は、５種類の生ロタウイルス株（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４及びＰ１）、スクロース、クエン酸ナトリウム、リン酸一ナトリウム一水和物、水酸化ナトリウム、ポリソルベート８０及びウシ胎仔血清を含む。この市販のロタウイルスワクチンは、組成物をその付与済み特許米国特許第６６１６９３１号に反映している。Rotateqワクチンは、血清型によって再集合体用量当たり最小で２．０〜２．８×１０^６感染単位（ＩＵ，infectious unit）及び凝集体用量当たり１１６×１０^６ＩＵ以下を含有する、５種類のヒト−ウシ再集合体生ロタウイルスの経口投与用２ｍｌ液剤の状態で入手可能となっている。

しかし、米国特許第６６１６９３１号明細書（国際公開第２００２／０１１５４０号パンフレット）はまた、ロタウイルスワクチンの凍結乾燥が、凍結乾燥中のウイルス力価の損失につながり得ることを引用している。これは、低収率につながる可能性があり、その上、凍結乾燥ワクチン製剤の効力は、必要とされるレベル未満に減弱され易く、結果として無効な免疫接種に帰着する。凍結乾燥製剤の事前再構成は、室温で効力を損失し易いことも認識されている。この特許に開示されている液体製剤用の緩衝液は、クエン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、重炭酸塩並びにフマル酸塩、酒石酸塩、乳酸塩及びマレイン酸塩などの他のカルボン酸塩の組合せを含む。さらに、リン酸塩の濃度は、ウイルスワクチン製剤の析出を防止するために、０．３５Ｍ未満に保つように教示されている。ウイルスワクチン製剤を安定化させるための重炭酸塩の使用も、製剤の安定性を損ねることが教示されているため、止めるように明示的に記載している。加えて、クエン酸塩、コハク酸塩及びリン酸塩のものを除く、種々の緩衝液成分の実施例は、特許明細書中に見当たらない。したがって、ロタウイルスワクチン及び緩衝液の液体製剤の安定性を高めるために、新規な緩衝液成分の存在が必要とされているようである。

Merck社に続き、Glaxo Smithkline社もロタウイルスワクチン製剤に関して出願し、後に米国特許第７２８５２８０号を取得した。米国特許第７２８５２８０号明細書は、経口投与用に、有機制酸剤であるクエン酸ナトリウム又は無機制酸剤である水酸化アルミニウム若しくは炭酸カルシウム及びキサンタンガムとともに製剤された弱毒生ロタウイルスワクチン組成物を特許請求している。ワクチン製剤は、制酸剤として存在する炭酸カルシウムとともに凍結乾燥され、投与前に水溶液を用いて再構成される。あるいは、この特許はまた、錠剤中にロタウイルス抗原、制酸剤及びキサンタンガムが既に存在する、幼児／小児の舌の上に直接置くための、凍結乾燥された形態での速溶性錠剤としてのワクチン製剤を特許請求している。したがって、米国特許第７２８５２８０号明細書で処方されている、GSK社により市販されている「Rotarix」に対応する生成物は、ワクチンとは別個に提供される希釈剤を加えることによって、投与前に再構成される必要がある凍結乾燥ワクチンである。「Rotarix powder and solvent for oral suspension」は、凍結乾燥粉末中に、Vero細胞上で生成された弱毒生ヒトロタウイルスＲＩＸ４４１４株を１０^６．０ＣＣＩＤ_５０以上、スクロース９ｍｇ及びソルビトール１３．５ｍｇ、デキストラン、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ，Dulbecco's Modified Eagle Medium）、アミノ酸を含有し、一方、再構成溶媒は、キサンタンガム、炭酸カルシウム及び滅菌水を含む。再構成後のワクチン用量は１ｍｌであり、２回に分けた用量は、初回用量と２回目用量との間に少なくとも４週間の時間間隔を空けて投与される必要がある。１ｍｌの投薬製剤が入手可能となっているが、実際的な観点から見て、完全に安定な単回液体製剤として入手可能となっていない。Rotarixというワクチン製剤は、凍結乾燥されたものであり、希釈剤を含有する別個の経口アプリケータ及び凍結乾燥された粉末の形態のワクチン抗原を含有するガラス製バイアル並びに別個の移し替えアダプタを同梱している。詳細な１０個に分かれたステップは、適切な再構成を保証する適切な順序で、順を追って行わなければならない。ワクチンと希釈剤とを混合することによる、ワクチンのこの再構成は、それ自体の不利な点を有する。このワクチンの投与は、粉末の形態のワクチン抗原を含有するガラス製バイアルに、移し替えアダプタを最初に接続した後、移し替えアダプタを経口アプリケータに接続し、ワクチン抗原と希釈剤とを適切に混合し、再構成された溶液の混濁を保証し、移し替えアダプタを取り外し、次いでワクチンを投与するという退屈なプロセスを行う。これらのすべてのステップは別々に、ワクチンを幼児／小児／患者に、投与する人／医療提供者の手際の良い作業スキルを必要とする。したがって、ロタウイルスワクチン製剤の適切な用量を含む単回液体製剤を有することが、依然として望まれている。

後に、GSK社の米国特許第８１９２７４７号明細書は、弱毒生ロタウイルス抗原、スクロース、マンニトール、マルトース、デキストロース、ラクトース及びトレハロース（４０％〜７０％）から選択される糖（３５％〜７０％ｗ／ｗ）、カルボン酸塩として、アジピン酸ナトリウム（５０ｍＭ〜２Ｍ、限定的には１００ｍＭ〜１Ｍ、さらに限定的には４００〜７００ｍＭ及びカルシウムイオンを伴ったカルボン酸、アジピン酸を含む液体経口ロタウイルス製剤であって、組成物が少なくとも１２分の制酸力を有する製剤を特許請求している。この特許において、緩衝能を有することが証明されているカルボン酸塩には、数ある中で、クエン酸塩、酢酸塩、マロン酸塩、リンゴ酸塩、グルタミン酸塩、フマル酸塩、ラクトビオン酸塩、マレイン酸塩、グルコウロン酸塩（glucouronate）、ガラクトウロン酸塩（galactouronate）、ガラクタル酸塩及び酒石酸塩並びに相当する酸及び水酸化ナトリウム塩が含まれる。加えて、この特許に開示されている製剤は、ある特定の市販の制酸剤成分も同様に含み得、かかる制酸剤成分は、好ましくは、水酸化アルミニウム及び水酸化マグネシウムであり、言及されている他の水不溶性の制酸剤は、炭酸マグネシウム、炭酸アルミニウム、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムと炭酸マグネシウムとの混合物、アルミニウムマグネシウムヒドロカーボネート、水酸化アルミニウム−炭酸マグネシウム−ソルビトール−マンニトール、ヒドロキシ−アルミニウム−ナトリウム−炭酸塩、ジヒドロキシアルミニウムカリウム炭酸塩である。制酸剤のリストはこの特許の中で言及されているが、特定の制酸剤を含むワクチン製剤の安定性が立証されなければならない。さらに、他のワクチン抗原及び他の安定化剤／保存剤又は賦形剤を含むワクチン製剤に、ある成分として存在する間に、生ウイルスに及ぼす制酸作用も疑問である。ワクチン製剤と混合された市販の制酸剤は、ワクチン抗原を凝固させ、液体製剤の濃厚な塊を形成させてしまう可能性がある。その上、液体ワクチン製剤中に、制酸剤が懸濁液のように多く残存するため、ワクチン製剤中に含まれることは勧められない。GSK社の市販の次世代のRotarixワクチンの製品規格は、経口投与用１．５ｍｌ剤形中に、Vero細胞中で生成された弱毒生ヒトロタウイルスＲＩＸ４４１４株を１０^６．０ＣＣＩＤ_５０以上、スクロース１０７３ｍｇ、アジピン酸ジナトリウム、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）及び滅菌水を含有する液体ワクチン製剤「Rotarix oral suspension in pre-filled oral applicator」を提供する。

Bharat Biotech International Limited社は、インドにおいて付与済み特許２４２８６８号を所有しており、それぞれ１００ｍＭ〜１５０ｍＭ及び３１０ｍＭ〜４００ｍＭの範囲のクエン酸塩−リン酸塩緩衝液を、その他の独特の製剤成分とともに使用し、２°〜８℃で安定な、独自のロタウイルスワクチン製剤も開示している。この特許は、ワクチンの投与前に、対象へのクエン酸塩−重炭酸塩の別個の投与を含む。この特許によると、クエン酸塩−重炭酸塩は、製剤自体には含まれない。本発明はこの欠点を克服しており、本発明において、ワクチン製剤中にロタウイルス抗原と一緒に存在するクエン酸塩−重炭酸塩緩衝系の使用は、製剤のワクチン安定性に影響を及ぼすことなく緩衝能を保持することが証明されている。Bharat Biotech社の国際公開第２０１１／０７３６３号パンフレットは後に、ウイルスに感染した宿主細胞の繁殖中に、ヒト血清アルブミンを用いてプレコンディショニングし、それによってワクチン安定性のより良好な特性を与えるための、新規なバイオプロセスを特許請求し、開示している。

上述のように、ロタウイルスワクチン製剤において、胃の胃酸環境と闘うには特定の緩衝液成分が必要である。最初のGSK社の商業用ロタウイルスワクチン製剤は、制酸剤を含んでいたが、GSK社のロタウイルスワクチンの商業用最新型は、制酸剤から緩衝液に転換している。単純化した意味では、制酸剤は、胃の酸性環境のｐＨを中和することが知られているのに対して、緩衝液は、胃の強酸性環境において、ワクチン製剤自体のｐＨを保持すると言える。製剤中に緩衝液を混合することは常に有利であり、これは胃の胃酸からワクチン抗原を保護し、その上ワクチン安定性も維持することができる。

胃酸環境に対抗するための緩衝液成分又は制酸剤のリストが、先行技術に引用されており、最も好ましいものは、クエン酸塩リン酸塩緩衝液である。当技術分野の現状は、ワクチン製剤中にクエン酸塩リン酸塩緩衝液を使用することについての、いくつかの固有の問題を認識している。それらは、一般的な緩衝液及び細胞外液のある特定の模擬成分のうちで最も生理学的なものであるが、やはり多くの潜在的な不利点を有している。例として、リン酸塩は、制限酵素によるＤＮＡの開裂、ＤＮＡの連結反応及び細菌の形質転換を含む多くの酵素反応を阻害する。リン酸塩は、微生物が容易に混入するようになり、固定中に沈殿する傾向がある可能性がより高い。Merck社の米国特許第６６１６９３１号のパテントファミリーは、ワクチン製剤中のリン酸塩の析出を防止するために、リン酸塩を緩衝液として、０．３５Ｍという特定の制限を超えて使用することを止めるように記載している。GSK社の米国特許第’７９７号明細書は、ロタウイルスワクチン製剤は、リン酸塩を含まないことが好ましいと明示的に言及している。クエン酸ナトリウムは、GSK社によって、その米国特許第’２８０号明細書中で、無機制酸剤として使用されている。しかし、GSK社による、その後の米国特許第’７９７号明細書における、緩衝液としてのクエン酸塩の使用は完全に取り止められたようである。米国特許第’７９７号明細書は、カルボン酸塩を特許請求しており、これは、ジカルボン酸から誘導されることを明示的に意図している。クエン酸塩緩衝液は、クエン酸から誘導される。クエン酸は、３つのカルボキシル官能基を有する。クエン酸塩緩衝液は、クエン酸と好ましくはクエン酸ナトリウムとを混合し、所望のｐＨを得ることによって調製される。したがって、クエン酸塩緩衝液は、トリカルボン酸から調製される緩衝液である。

背景技術の開示からも、ロタウイルスワクチンが胃の中の強酸性環境に耐えるには、制酸剤又は緩衝液が必要であることは明らかである。溶液中に懸濁されたロタウイルス抗原は、効力を損失させてはならず、ワクチンの有効性を最適化するために、好都合なやり方で、その他の賦形剤と相互作用すべきであるため、緩衝液は重要である。溶液のｐＨの劇的な増減は、ワクチン中のタンパク質／生ロタウイルス抗原の変性を引き起こし得るため、緩衝液はワクチンの有効性及び安定性を決める非常に重要なものである。ワクチン製剤とともに使用される緩衝液は、安価であり、調製が容易であるばかりでなく、酸化に耐えて安定であるという基準を満たす必要がある。毒性ではない緩衝液を選んで調製することも重要である。適した緩衝系は、ワクチン抗原の力価のみならず、ワクチンを投与すべき患者の内部の強酸性環境と闘うための潜在的な成分としての機能を減弱するべきではない。緩衝液は、ロタウイルスワクチンには不可欠な部分であり、これは胃の強酸性ｐＨ中でワクチン製剤のｐＨを保持するのに必要であったためであり、またワクチン力価がその免疫原性レベル未満に損なわれないことを保証されるためにも必要であった。緩衝液は、胃の酸性環境に対抗することを意図している、ロタウイルスワクチン製剤の別の成分であり、ワクチン製剤の長期使用のための安定性を確立する必要がある。他のカルボン酸塩の緩衝液としての使用の見込みは、先行技術の中で言及された可能性があるが、今なお、これらの緩衝液と抗原及びロタウイルスワクチン製剤を安定化させる他の賦形剤との絶対的な特定の組合せを確立することが必要とされている。１本の単回バイアル中の適切な緩衝液と抗原との特定の組合せは、沈殿のいかなる形成も示すべきではなく、長期安定性を示さなければならない。多くの可能な緩衝液成分の網羅的なリストが、Merck社及びGSK社の先行技術中の言及に見出されるにもかかわらず、その最先端技術は、いかなる実験データによっても裏付けされておらず、生物学的組成物は、単なる仮定及び見込みに過ぎず、受け入れられない。ただクエン酸塩、リン酸塩及びある程度のコハク酸塩のみが、ワクチン中で最も幅広く許容される緩衝液として、先行技術中に実験的に示されている。

緩衝液は、組合せ系で作用することが知られている。各組合せ緩衝系は、それ自体、独自の物理化学的性質及び緩衝能を有することに特定の意味を持つ。特定の溶液における特定の緩衝液組合せ系の選択は、組成物の種類によって決まる。本発明は、弱毒生ウイルス及び１又は２以上の糖などの広範囲の他の製剤成分並びに他の可能な安定化成分の存在下で、部分的に加水分解されたタンパク質を含むロタウイルスワクチン組成物を扱っている。成分は多種多様なやり方で互いに相互作用するため、特定の製剤の種類に適合し、それによってその機能活性を保持するような特定の緩衝液−組合せ系の選択が認められなければならない。ただ先行技術に引用されているだけの可能な緩衝液に反して、先行技術に引用されていない新規な組合せ緩衝系及びロタウイルスワクチン製剤を安定化させる際のそれらの役割が、本発明において詳細に提示されており、カギとなる特徴は、最低２年の安定性である。

したがって、追加的に安全で、しかも効果的であり、ロタウイルスワクチンの最大限の有効性を同時に保証し、世界中へのロタウイルスワクチンのより良好な輸送を遂行するために、比較的より長い時間安定でもあるロタウイルスワクチン製剤のための、新規な緩衝液組合せ系を有する新規なワクチン組成物が発明される。本発明は、ウイルス力価について妥協することなく、人体によって容易に摂取及び吸収できると同時に、しかも非常に安定であるロタウイルスワクチン調製物のための、先行技術には全く存在しない、新規な緩衝液組合せ系の使用を提案する。本発明の本明細書に記載されているような理想的なワクチン及び緩衝液の製剤（１又は２以上）を含むロタウイルスワクチン製剤に関連する既存の限界を克服することは、ロタウイルス感染症に対する世界的規模のワクチン接種において大いに有利である。

凍結乾燥ワクチン製剤は、安定性を拡大するが、より高額な製造コストがかかる。凍結乾燥ワクチンの場合に関与するロジスティックスも、世界の遠隔地で利用可能なロタウイルスワクチンを作製する機会を減少させる。凍結乾燥バイアルのための高度な輸送施設が、ロジスティックス及びワクチンの増大する費用の問題に加えられる。したがって、本発明の発明者らは、新規な代替の緩衝液を含む、１ｍｌ製剤〜２．５ｍｌ用量製剤という低い用量範囲の液体ロタウイルスワクチン製剤を実験的に示している。最長少なくとも２年までの長期間。このことは、ロタウイルスワクチン製剤に関して利用可能な当技術分野の現状を超えて、かなりの前進である。冷蔵温度で最長２年まで安定なロタウイルスワクチン製剤は、はるかに低コストでワクチンの輸送のし易さを促進すると同時に、必要とされる免疫原性を高めるために、製剤中のウイルス力価を維持することも、容易に可能となる。

米国特許第６６１６９３１号明細書国際公開第２００２／０１１５４０号パンフレット米国特許第７２８５２８０号明細書米国特許第８１９２７４７号明細書インド特許２４２８６８号明細書国際公開第２０１１／０７３６３号パンフレット米国特許第’７９７号明細書

Bresee JS, Glass RI, Ivanoff B, Gentsch J. Current status and future priorities for rotavirus vaccine development, evaluation and implementation in developing countries. Vaccine 1999;17:2207-22

本発明の第１の目的は、ヒトにおけるロタウイルス感染症の予防及び治療のためのワクチン製剤の開発である。

本発明の別の目的は、ワクチン組成物中のロタウイルス抗原に安定性をもたらすのに適した代替の新規な緩衝液を含む、ロタウイルスワクチン組成物を提供することである。本発明のさらに別の目的は、ワクチンの投与中に強酸性の胃のｐＨでロタウイルスワクチン組成物のｐＨを保持する新規な代替の緩衝液を含む、ロタウイルスワクチン組成物を提供することである。

本発明の別の目的は、経口投与用の安定化剤及び緩衝液を含み、制酸剤の事前投与を必要としない、安定なロタウイルスワクチン組成物を提供することである。

本発明のさらなる目的は、最長少なくとも２年までの間、ワクチンの効力を損失することなく、ロタウイルス抗原の長期安定性を可能にする、安定なロタウイルスワクチン組成物を提供することである。

さらに、本発明の別の目的は、動物源由来の混入が全く無いばかりでなく、他の動物由来のものを絶対に含まない新規なロタウイルスワクチン組成物の調製のための、組換えトリプシンの存在下におけるロタウイルスの適合方法を提供することである。

製剤の緩衝能を試験した種々の製剤のBaby Rossete Riceアッセイ結果を示すグラフである。クエン酸塩リン酸塩緩衝液を用いた２〜８℃でのロタウイルスワクチン製剤の安定性を示すグラフである。クエン酸塩リン酸塩緩衝液を用いた２５℃でのロタウイルスワクチン製剤の安定性を示すグラフである。クエン酸塩リン酸塩緩衝液を用いた３７℃でのロタウイルスワクチン製剤の安定性を示すグラフである。クエン酸塩重炭酸塩緩衝液を使用した２°〜８℃でのロタウイルスワクチン製剤の安定性試験を示すグラフである。クエン酸塩重炭酸塩緩衝液を使用した２５℃でのロタウイルスワクチン製剤の安定性試験を示すグラフである。炭酸塩重炭酸塩緩衝液を使用した２〜８℃でのロタウイルスワクチン製剤の安定性試験を示すグラフである。炭酸塩重炭酸塩緩衝液を使用した２５℃でのロタウイルスワクチン製剤の安定性試験を示すグラフである。炭酸水酸化マグネシウム緩衝液を使用した２〜８℃及び２５℃でのロタウイルスワクチン製剤の安定性試験を示すグラフである。混合緩衝液を使用した２〜８℃でのロタウイルスワクチン製剤の安定性試験を示すグラフである。アンモニウムベースの混合緩衝液を用いた２５℃でのロタウイルスワクチン製剤の安定性を示すグラフである。アンモニウムベースの混合緩衝液を用いた３７℃でのロタウイルスワクチン製剤の安定性を示すグラフである。種々の緩衝液がＯＲＶ製剤に及ぼすｌｏｇ力価対時間に関する影響を示すグラフである。種々の緩衝液がＯＲＶ製剤に及ぼすｌｏｇ損失力価対時間に関する影響を示すグラフである。

定義：
ＦＦＵ／ｍｌ：所与量の液／産物における生ウイルスの濃度の測定。これは、単層の培養細胞上に既知量のウイルス液を広げて、ウイルスに感染させ、次いで培養物中の、感染したと見られるエリアの数を数えることによって測定される。

目標力価：単回ヒト用量のロタウイルスワクチンはそれぞれ、ワクチンの免疫原性を高めるために、ワクチンの貯蔵期間終了まで１０^５．５ｆｆｕ／用量以上を含有すべきであり、これが目標力価と称される。

必要とされるウイルスバルクが、バルク力価及び製剤の目標力価に基づいて、容量ベースで加えられる。典型的なロタウイルスバルク力価は、およそ１０^７．５／用量であるが、製剤力価は、およそ１０^６．０又は１０^５．５／用量を目標とされる。ただし、所与の組成物について、ワクチン力価が安定性に及ぼす影響を調べるために、いくつかのバッチはおよそ１０^４．０力価でも製剤される。すべての成分は、最終的に重量／容量パーセントという用語で表される。

典型的な目標力価は、ワクチンの調製時でおよそ１０^６．０であり、目的は、２°〜８℃での２年の貯蔵後に、０．５ｌｏｇ力価損失（およそ＋／−０．３０の力価推定の誤差のためのマージンを含む）を考慮した後、最小１０^５．０の力価を有するワクチン製剤を得ることである。２〜８℃での０日力価と比較して、０．３を超える力価損失を示すいかなる組成物も、不安定性の徴候を示すとみなされる。言うまでもなく、力価損失は、２５℃及び３７℃では、貯蔵時間の関数としてかなり高いが、これらの結果は、スクリーニング目的のためのみに使用される。ワクチンは幼児によって容易に吸収され得るという事実を考慮すると、種々の製剤に例示されている全用量は、０．５ｍｌ〜２．０ｍｌの範囲であり、これを製剤は有する。賦形剤（糖）は、生物学的調製において一般的に行われているように、所望の新規な緩衝溶液（１又は２以上）中に溶解させ、一方、安定化剤［（ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ，Human Serum Albumin）／ラクトアルブミン加水分解物（ＬＡＨ，Lactalbumin Hydrolysate）］は、水溶液として（注射用水中に）作製され、すべての溶液は滅菌ろ過される。これらの溶液は、両方とも重量／容量ベースで調製される。ワクチン＋緩衝液は、全容量として２．５ｍｌが知られているが、酸中和試験に基づいて、より少ない容量の緩衝液も試験されている。これはまた、商業用ロタウイルスワクチンに関する、パブリックドメインで利用可能な情報を用いて確証された。

必要とされる場合に、本発明の詳細な実施形態が、本明細書において、実施例を用いて開示される。しかし、開示される実施形態は、種々の形で具体化され得る、本発明の単なる例に過ぎないことは理解されるべきである。したがって、本明細書において開示されている特定の構造及び機能の詳細は、限定として解釈されるべきではなく、実質的には、適切に詳細ないかなる構造においても、単に、特許請求の範囲ための基礎として及び本発明をさまざまに用いる当業者に教示するための代表的な基礎としてに過ぎない。さらに、本明細書において使用されている用語及びフレーズは、限定されるためのものではなく、むしろ本発明の理解可能な説明を提供するためのものである。

組換えトリプシンの存在下におけるロタウイルスの適合方法。
Vero細胞を対象とし、Ｔ型フラスコ及びＣＦ１（セルファクトリー１）を使用して小規模研究を行い、さらに、ＣＦ４０までスケールアップして、ロタウイルスの比較感染性及び収率を研究した。感染後、回収率に関して、１ｍｌ当たりのウイルス液回収量（ＶＨ，viral harvest）を、４８時間後毎に観察した。Ｔ型フラスコ及び細胞スタックを使用して、３セットの実験を行い、３つの実験の平均を考慮した。結果を以下の表に示す。

よって、組換えトリプシンがブタトリプシンよりも比較的良好な収率を与えたことは、実験から明らかであり、この理由として、ブタトリプシンが、不純物としてキモトリプシンを含有するのみならず、ＰＣＶ１及び２並びにＰＣＢにも関連するいかなる潜在的な危険も含まないためである。

種々の新規な緩衝液及び緩衝液を含むワクチン製剤の緩衝能。
特定の緩衝液の緩衝能を測定することによって、理想的な緩衝液を選択することができる。緩衝能は、強酸性環境において、所与の製剤が持つ中性条件にｐＨを維持する、緩衝液の量として測定される。通常は、緩衝されたｐＨがｐＫａに近いほど、それだけ緩衝能が大きい。３４ｍＥｑの塩酸を使用して、種々の緩衝液の緩衝能を試験した。緩衝能の結果は、ワクチン製剤中にそのような緩衝液を含むために、塩基として作用した。３４ｍＥｑの塩酸及び先行技術において保証されている、十分に確立されたBaby Rosette Riceアッセイを使用して、緩衝液及びワクチン製剤の緩衝能の試験を行った。

［実施例２．１］
種々の緩衝液の緩衝能：
ロタウイルスワクチン製剤中に含まれる可能性のある以下の新規な緩衝液を、それらの緩衝能について調べた。

結論：炭酸水酸化マグネシウム、炭酸塩−重炭酸塩緩衝液及びクエン酸塩−重炭酸塩緩衝液組合せ系は、強力な緩衝液であり、濃塩酸（ＨＣｌ，Hydrochloric acid）２０ｍｌを加えた後でさえも、ｐＨは、元のｐＨからおよそ６．５〜７．０まで下がった。乳酸塩重炭酸塩緩衝液並びに０．０５Ｍクエン酸塩及び０．１Ｍ重炭酸塩緩衝液は、中程度であり、２０ｍｌのＨＣｌを加えた後、ｐＨは５．５〜６．０まで達した。上述の緩衝液（１又は２以上）はすべて、５ｍｌのＨＣｌを中和することができ、この場合、ｐＨは、９．０〜およそ７．０の範囲である。胃液の量がおよそ３．０ｍｌ〜５．０ｍｌであるため、これらの緩衝液はすべて、胃の中でワクチンｐＨを保持するための緩衝液として使用することができる。これらの緩衝液が製剤のために使用される場合、緩衝液とともに他の賦形剤が存在するため、１ｍｌのワクチンは５ｍｌの酸を中和することができるが、ｐＨは７．０の代わりにおよそ６．０である。ｐＨ６．０は、ウイルス抗原の安定性を損なわず、よってこれらの緩衝液は、経口ワクチン製剤に加えることができる。

上述の新規な緩衝液に加えて、酢酸アンモニウムベースの混合緩衝液の緩衝能について調べた。酢酸アンモニウムベースの混合緩衝液組合せ系は、ロタウイルスワクチン製剤に関するいかなる先行技術文献にも引用されていない。そのようなアンモニウムベースの混合緩衝液の緩衝能は、評価されている。アンモニウム塩（０．５Ｍの酢酸アンモニウム＋重炭酸アンモニウム＋オルトリン酸ジアンモニウム）を有する混合緩衝液を調べ、その緩衝能を確認した。０．５ｍｌの濃塩酸に、混合緩衝液を０．５ｍｌ〜２ｍｌまで加え、ｐＨを調べた。

０．５ｍｌの緩衝液に濃塩酸を加えた後でさえ、緩衝液は７．２５のｐＨを保持することができ、このことは、これらのアンモニウム緩衝液が、濃塩酸を加えた直後のｐＨ変化に耐えることができる強力な緩衝液であることを示しており、また緩衝液を漸次０．５ｍｌ〜２．０ｍｌまで加えると、ｐＨは７．７〜８．０の範囲に増加することが、上記の表から明らかである。

［実施例２．２］
種々のワクチン及び新規な緩衝液製剤の緩衝能：
我々は、安定な新規なワクチン及び緩衝液組成物を開発しようと努力して、種々の緩衝液を広範囲の濃度で用いて、多数の製剤を調製してきた。そのような組成物を開発している間に、いくつかの指針となる因子をまとめた。
・選ばれた緩衝液の酸中和能又は緩衝能。
・所定の酸系に必要な緩衝液の容量が２．０ｍｌ未満であること。
・緩衝液＋ウイルスワクチン組合せ物の安定性。

そのような研究にとって、２°〜８℃で安定であることが見出されている緩衝液を含まない純粋な液体ワクチン組成物は、ベース組成物としての役目を果たしている。再び要点を繰り返すと、０．５ｌｏｇ未満の力価損失を示す組成物又はそれらの最終力価が１０^５．５０を超える組成物は、安定な組成物とみなされる。

２．２．１．３４ｍＥｑＨＣｌを使用して、クエン酸塩重炭酸塩、炭酸塩重炭酸塩及びクエン酸塩リン酸塩緩衝液を含む種々のワクチン製剤の緩衝能も試験し、下記の表に提供した。

２．２．２．Baby Rossette Riceアッセイ：ロタウイルスワクチンは経口投与されるため、ｐＨがおよそ１．８〜２．０である胃の酸性度に曝されるようになり、それによってロタウイルス抗原は不活化されてしまう。ウイルス潜在能力のこの不活化を防ぐために、製剤中に使用される緩衝液は、中性のｐＨレベルで製剤を保持する。ロタウイルスの不活化は、ｐＨ２．０又は３．０で起こるが、ｐＨ４．０では、起こらない又はわずかな不活化が起こる。所与の製剤の緩衝能は、製剤のｐＨを４．０超で維持するために測定される時間と定義され、バリデートされた方法であり、先行技術の中で言及されているBaby Rossette Riceアッセイによって評価される。

ＢＲＲアッセイの手順：５０ｍｌのビーカー中、注射用水を製剤に加えて最終容量を１０ｍｌにした。ビーカーを水浴に入れ、温度を３７℃に維持した。溶液の最初のｐＨを測定し、記録した。その後、０．１Ｎ塩酸４．０ｍｌを、最終容量１０ｍｌの製剤を含有するビーカーに加えた。同時に、蠕動ポンプを使用して０．１ＮＨＣｌを０．５ｍｌ／分で加えるためのポンプのスイッチをオンにした。ｐＨ４．０以上に保持されるまで、時間の経過とともにｐＨ値を毎分記録した。時計及びポンプを停止させる（Ref:Geigy scientific Tables,Volume 1,1981 addition, Page 126）。新規な緩衝液−組合せ系を使用した数種のロタウイルスワクチン製剤を、緩衝能について調べた（製剤のそれぞれの成分の詳細は、適用可能な場合には言及されている）。緩衝能の結果を、以下の表に言及する。

クエン酸塩重炭酸塩緩衝液は、０．０３Ｍクエン酸三ナトリウム及び０．３Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液である。

製剤例ＢＶ−８は、スクロース４０．０％ｗ／ｖ、トレハロース０．５％ｗ／ｖ、ラクトース５．０％ｗ／ｖ、ラクトアルブミン加水分解物０．５％ｗ／ｖ、ｒＨＳＡ０．０８％ｗ／ｖ、０．５Ｍオルト−リン酸水素ジアンモニウム、酢酸アンモニウム及び重炭酸アンモニウムの混合緩衝液並びにロタウイルス抗原１１６Ｅを含有し、１ｍｌの用量とする。

製剤例ＢＶ−９は、スクロース３０．０％ｗ／ｖ、トレハロース２％ｗ／ｖ、ラクトース５．０％ｗ／ｖ、ラクトアルブミン加水分解物１％ｗ／ｖ、ｒＨＳＡ０．０８％ｗ／ｖ、０．５Ｍオルト−リン酸水素ジアンモニウム、酢酸アンモニウム及び重炭酸アンモニウムの混合緩衝液並びにロタウイルス抗原１１６Ｅを含有し、１．５ｍｌの用量とする。

ＣＰＢは、０．３５Ｍクエン酸三ナトリウム及び０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液である。

製剤例ＢＶ−１０は、スクロース４０％ｗ／ｖ、トレハロース−０．５％ｗ／ｖ、ラクトアルブミン加水分解物−０．５％ｗ／ｖ、ｒＨＳＡ−０．３５％ｗ／ｖ、０．０５Ｍリン酸カリウム及び０．３５Ｍクエン酸三ナトリウム緩衝液並びにロタウイルス抗原１１６Ｅを含有し、最大２．０ｍｌまでの用量とする。

製剤例ＢＶ−１１は、スクロース−４０％ｗ／ｖ、トレハロース−０．５％ｗ／ｖ、ラクトアルブミン加水分解物０．５％ｗ／ｖ、ｒＨＳＡ−０．３５％ｗ／ｖ、１．１Ｍリン酸カリウム緩衝液を含有し、最大２ｍｌまでの用量とする。

結論：
２．５ｍｌのクエン酸塩重炭酸塩は、個別にも測定した。これは、約１２分間ｐＨ４以上を維持するという以前の慣例に従って、ワクチンの投与前に、幼児に別個に投与されるためである。ＢＢＩＬの製剤例ＢＶ−８及びＢＶ−９は、アンモニウムベースの混合緩衝液バッチであり、中和することができ、約１５分間ｐＨ４．０を超えて維持される。

ある特定の製剤例ＢＶ−１０は、クエン酸塩濃度を０．３５Ｍに上げ、リン酸塩を０．０５Ｍに下げて調製された緩衝液組合せ系を含み、用量として２．０ｍｌを使用して、緩衝能について調べた。緩衝能を観察し、１２分であることが分かった。この製剤も、酸を十分に中和することができ、良好な緩衝能を示す。よって、この緩衝液において、０．３５Ｍのクエン酸塩を考慮に入れた。

新規な緩衝液を使用したロタウイルスワクチン製剤の安定性
新規な緩衝液の中で、他のものに比べてより良好な安定性を示す最も有利な緩衝液のいくつかは、炭酸塩−重炭酸塩緩衝系、炭酸水酸化マグネシウム緩衝液、クエン酸塩−重炭酸塩緩衝系及びアンモニウム塩と混合された緩衝液を含む。これらの新規な緩衝液を使用したワクチンの最終的な安定性並びに最終的なロタウイルスワクチン製剤及び同製剤を製造する方法を実施した。

実験は、最終的なロタウイルスワクチン製剤のさらなる安定性のために、亜鉛イオンの組み込みを含む。亜鉛イオンは、当技術分野において知られているやり方で、組成物との相互作用によって、ワクチンの安定性を高めることが観察されている。（Inge Erk et.al Journal of Virology, Vol. 77, No. 6 Mar. 2003, p. 3595-3601）は、ロタウイルスのＶＰ６トリマーの主要なキャプシドタンパク質が、所与のｐＨ及び温度において、亜鉛イオンの存在下で、ウイルスの柔軟性を達成する際に、重大な役割を果たすことを実証している。ロタウイルスワクチンの新規な製剤は、したがって、最終的な製剤中のロタウイルス抗原に、より良好な安定性を付与するために、亜鉛イオンも含む。

ヒトロタウイルス株１１６Ｅは、自然に弱毒化されたものである（ヒト−ウシ再集合体）。ロタウイルス抗原を含む最終的な製剤の安定性試験を、種々の温度範囲で実施した。種々のワクチン製剤を、２°〜８℃及び２５℃の温度に供した。ワクチン力価の観察は、ＦＦＵ／用量（フォーカス形成単位）の観点で行い、プロトコルに基づいて、規定の時間間隔で行った。ワクチン力価の０．３ｌｏｇ損失の範囲内の最大の下落は、２〜８℃において、新規な緩衝系を使用した安定なロタウイルスワクチン製剤として維持されているとみなした。先に説明されているように、ワクチンのウイルス力価は、製剤の安定性を評価するための、貯蔵時間の関数として測定される。それぞれの場合について、以下の例に記載されているように、２〜８℃において、貯蔵から２４カ月後、ワクチン製剤は、安定であると分かることが観察された（最小値又は損失がないものは、誤差バーとみなす）。しかし、室温において、ワクチン力価の最大１．５ｌｏｇ損失が、６カ月の期間に観察された。ワクチン力価のそのような損失から、２５℃におけるワクチンの安定性は、６カ月間であると結論付けられる。

［実施例３．１］
クエン酸塩−リン酸塩緩衝液組合せを使用したロタウイルス製剤の安定性。
製剤例ＢＶ−１０は、スクロース４０％ｗ／ｖ、トレハロース−０．５％ｗ／ｖ、ラクトアルブミン加水分解物−０．５％ｗ／ｖ、ｒＨＳＡ−０．３５％ｗ／ｖ、０．０５Ｍリン酸カリウム及び０．３５Ｍクエン酸三ナトリウム緩衝液並びにロタウイルス抗原１１６Ｅを含有し、最大２．０ｍｌまでの用量とする。

ＢＶ−１０及びＢＶ−１１の安定性データを、以下に提供する。

［実施例３．２］
０．０３Ｍクエン酸塩及び０．３Ｍ重炭酸塩緩衝液（ＣＢ緩衝液）を使用したワクチン製剤。
０．０３２Ｍのクエン酸塩及び０．３Ｍの重炭酸塩を得るために、クエン酸三ナトリウム、（分子量２９４．１ｇｍ）の脱水物を９．６ｇｍの量に、無水重炭酸ナトリウム（分子量。８４．０１ｇｍ）を２５．６ｇｍの量にしたものを、滅菌ガラス瓶中、５００ｍｌに順次加えた。成分を完全に溶解し、注射用水（ＷＦＩ，water for injection）を用いて、容量を１リットルにした。ｐＨを調べ、８．２〜８．４のレベルに維持した。次いで、緩衝液容器を２Ｌステンレス製（ＳＳ，Stainless Steel）の圧力容器中に移し、フィルターに接続した。バイオセーフティーキャビネット下で、圧縮空気を使用することによって、溶液を０．２μフィルターに通してろ過した。緩衝液を別の滅菌瓶中に回収し、瓶にラベルを貼り、後に使用するために２〜８℃で貯蔵した。

製剤の作製は、この（０．０３２Ｍ）クエン酸塩（０．３Ｍ）重炭酸塩緩衝液組合せ系を使用し、１０^６ｆｆｕ／用量のロタウイルス抗原１１６Ｅ及び他の安定化剤並びに各製剤（表において、Bharat Biotech International Limited社によって適切に割り当てられた独自の製剤番号によって識別される）に相当する、下記のような成分を以下の表に言及されるような用量で含めて調製し、ワクチン製剤の２°〜８℃及び２５℃での安定性を、種々の時間間隔でおよそ２年まで試験した。これらを添付のグラフに示す（図５及び６）。

［実施例３．３］
炭酸塩重炭酸塩緩衝液（１又は２以上）（０．２Ｍ及び０．１Ｍ）を使用したワクチン製剤（ＣＡＢ緩衝液）。
ワクチン調製物に使用するための、人体によって摂取及び吸収される他の十分に適した緩衝系のうちの１つは、炭酸塩−重炭酸塩緩衝系である。この理由として、この緩衝系は、細胞外液緩衝の約８０％に関与しており、炭酸（Ｈ_２ＣＯ_３）及び重炭酸塩（ＨＣＯ_３ ⁻）の組合せの形で血漿中に存在し、ｐＨ７．３５〜７．４５を維持しているためである。この系は、酵素作用を阻害しない、有用なアルカリ性ｐＨ範囲、簡単さ及び妥当で良好な安定性という必要条件を満たすため、有機的環境における使用に、非常に利益となる。この組合せ緩衝系は、特にモル濃度が０．１５Ｍ未満の重炭酸塩については、先行技術において報告されていない。

［実施例５．１］
０．２Ｍ炭酸塩重炭酸塩緩衝液：
０．２Ｍの炭酸塩及び０．２Ｍの重炭酸塩を得るために、無水炭酸ナトリウム（分子量１０５．９９ｇｍ）を１．６９ｇｍの量に、無水重炭酸ナトリウム（分子量。８４．０１ｇｍ）を１５．４ｇｍの量にしたものを、滅菌ガラス瓶中、５００ｍｌに順次加えた。成分を完全に溶解し、ＷＦＩ（注射用水）を用いて、容量を１リットルにした。ｐＨを調べ、９．２〜９．５のレベルに維持した。次いで、緩衝液容器を２Ｌステンレス製の圧力容器中に移し、フィルターに接続した。バイオセーフティーキャビネット下で、圧縮空気を使用することによって、溶液を０．２μフィルターに通してろ過した。緩衝液を別の滅菌瓶中に回収し、瓶にラベルを貼り、後に使用するために２〜８℃で貯蔵した。

［実施例５．２］
０．１Ｍ炭酸塩重炭酸塩緩衝液
０．１Ｍの炭酸塩及び０．１Ｍの重炭酸塩を得るために、無水炭酸ナトリウム（ＭＷ．１０５．９９）を０．５３ｇｍの量に、無水重炭酸ナトリウム（ＭＷ．８４．０１）を７．９８ｇｍの量にしたものを、滅菌ガラス瓶中、５００ｍｌに順次加えた。成分を完全に溶解し、ＷＦＩ（注射用水）を用いて、容量を１リットルにした。ｐＨを調べ、９．２〜９．５のレベルに維持した。次いで、緩衝液容器を２Ｌステンレス製の圧力容器中に移し、フィルターに接続した。バイオセーフティーキャビネット下で、圧縮空気を使用することによって、溶液を０．２μフィルターに通してろ過した。緩衝液を別の滅菌瓶中に回収し、瓶にラベルを貼り、後に使用するために２〜８℃で貯蔵した

製剤の作製は、この０．２Ｍ炭酸塩−重炭酸塩緩衝液組合せ系及び０．１Ｍ炭酸塩−重炭酸塩緩衝液組合せ系を使用し、１０^６ｆｆｕ／用量のロタウイルス抗原１１６Ｅ及び他の安定化剤及び各製剤（表３（ｇ）において言及されているような独自の製剤番号によって識別される）に相当する、下記のような成分を以下の表に言及されるような用量で含めて調製し、ワクチン製剤の２°〜８℃及び２５℃での安定性を、種々の時間間隔でおよそ２年まで試験した。これらを添付のグラフに示す（図７及び８）。

２５℃での安定性

［実施例３．４］
０．１Ｍ炭酸水酸化マグネシウム緩衝液（ＭＨＣ緩衝液）を使用したワクチン製剤
０．１Ｍ炭酸水酸化マグネシウムを得るために、炭酸水酸化マグネシウム二水和物（分子量３１４．９８ｇｍ）を、滅菌ガラス瓶中、注射用水５００ｍｌに順次加えた。この塩は水不溶性であるため、成分を十分に振盪して均質にした。注射用水を用いて、懸濁液を１リットルの容量にした。完全に溶解し、ＷＦＩ（注射用水）を用いて、容量を１リットルにした。ｐＨを調べ、１０〜１０．５のレベルに維持した。溶液を、高圧蒸気滅菌法によって、１２１℃で３０分間滅菌した。緩衝液を別の滅菌瓶中に回収し、瓶にラベルを貼り、後に使用するために２〜８℃で貯蔵した。

この０．１Ｍ炭酸水酸化マグネシウム緩衝液組合せ系を使用する製剤を、１０^６ｆｆｕ／用量のロタウイルス抗原１１６Ｅ及び他の安定化剤及び各製剤（表３（ｊ）において言及されているような独自の製剤番号によって識別される）に相当する、下記のような成分を以下の表に言及されるような用量で含めて調製し、ワクチン製剤の２°〜８℃及び２５℃での安定性を、種々の時間間隔でおよそ２年まで試験した。これを添付のグラフに示す（図９）。

２〜８℃及び２５℃での安定性

［実施例３．５］
アンモニウム塩と混合された緩衝液（混合緩衝液）０．５Ｍを使用したワクチン製剤
アンモニウム塩との混合緩衝液０．５Ｍを得るために、オルトリン酸水素ジアンモニウム（ＭｏｌＷｔ．１３２．０６ｇｍ）を６６．０３ｇｍの量に、酢酸アンモニウム（ＭｏｌＷｔ．７７．０８ｇｍ）を３８．５４ｇｍの量に、及び重炭酸アンモニウム（ＭｏｌＷｔ．７９．０２ｇｍ）を３９．５１の量にしたものを、滅菌ガラス瓶中、注射用水５００ｍｌに加えた。成分を完全に溶解し、ＷＦＩ（注射用水）を用いて、容量を１リットルにした。ｐＨを調べ、７．６〜７．８のレベルに維持した。次いで、緩衝液容器を２Ｌステンレス製の圧力容器中に移し、フィルターに接続した。バイオセーフティーキャビネット下で、圧縮空気を使用することによって、溶液を０．２μフィルターに通してろ過した。緩衝液を別の滅菌瓶中に回収し、瓶にラベルを貼り、後に使用するために２〜８℃で貯蔵した。

この０．５Ｍの混合緩衝液組合せ系を使用する製剤を、１０^６ｆｆｕ／用量のロタウイルス抗原１１６Ｅ及び他の安定化剤及び各製剤（表３（ｌ）において言及されているような独自の製剤番号によって識別される）に相当する、下記のような成分を以下の表に言及されるような用量で含めて調製し、ワクチン製剤の２°〜８℃での安定性を、種々の時間で１年の期間試験した。これらを添付のグラフに示す（図１０〜１３）。

２〜８℃での安定性

安定性期間後の、製剤前及び製剤後の緩衝液及びワクチン製剤のｐＨ値
種々の製剤に使用された緩衝液のｐＨ及び緩衝液が最終的なワクチン製剤中に存在する間に相当するｐＨ値を調べることも重要である。これは、最終的なワクチン製剤の所与のｐＨ範囲を、ワクチンの貯蔵期間中及び貯蔵期間後に調べることである。そのようなデータを以下に提示する。重炭酸塩ベースの系は、ｐＨ８を超えており、これは、生理学的緩衝液のｐＨを超えている。しかし、ワクチンは、安定性期間後、２〜８℃において２年を超えても安定である。

さらに、製剤成分を固定して、種々の緩衝液を変更しながら実験を行い、ワクチン製剤の安定性を長期間にわたって試験した。相当する図番号１３及び１４は、種々の新規な緩衝液並びにスクロース４０％ｗ／ｖ、トレハロース０．５％ｗ／ｖ、ＬＡＨ１％ｗ／ｖ、ｒＨＳＡ０．３５％ｗ／ｖ及びロタウイルス抗原１１６Ｅを含む固定された製剤成分を使用したワクチンの比較安定性を示す。

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Claims

ｉ．ロタウイルス抗原；
ii．組合せ緩衝系；
iii．糖の組合せ；
iv．組換えヒト血清アルブミン；
ｖ．部分的に加水分解されたタンパク質であるラクトアルブミン加水分解物
を含む液体ワクチン製剤。
組合せ緩衝系が、クエン酸塩−重炭酸塩緩衝系である、請求項１に記載のワクチン製剤。
クエン酸塩の濃度が、０．０１Ｍ〜０．０５Ｍの範囲で存在する、請求項２に記載のワクチン製剤。
重炭酸塩の濃度が、０．０１Ｍ〜２Ｍの範囲の濃度で存在する、請求項２に記載のワクチン製剤。
クエン酸塩の濃度が０．０３Ｍである、請求項３に記載のワクチン製剤。
重炭酸塩の濃度が、０．３Ｍの濃度で存在する、請求項４に記載のワクチン製剤。
組合せ緩衝系が、炭酸塩−重炭酸塩緩衝系である、請求項１に記載のワクチン製剤。
炭酸塩−重炭酸塩が、０．０１Ｍ〜０．５Ｍの範囲で存在する、請求項７に記載のワクチン製剤。
炭酸塩−重炭酸塩が、０．１Ｍの濃度で存在する、請求項８に記載のワクチン製剤。
炭酸塩−重炭酸塩が、０．２Ｍの濃度で存在する、請求項８に記載のワクチン製剤。
組合せ緩衝系が、炭酸水酸化マグネシウム緩衝系である、請求項１に記載のワクチン製剤。
炭酸水酸化マグネシウム組合せ緩衝系が、０．０１Ｍ〜０．５Ｍの範囲の濃度で存在する、請求項１１に記載のワクチン製剤。
炭酸水酸化マグネシウムが、０．１Ｍの濃度で存在する、請求項１２に記載のワクチン製剤。
組合せ緩衝系が、酢酸アンモニウム；重炭酸アンモニウム及びオルト−リン酸ジアンモニウムを含む混合緩衝系である、請求項１に記載のワクチン製剤。
混合緩衝液が、０．０１Ｍ〜２Ｍの範囲の濃度で存在する、請求項１４に記載のワクチン製剤。
混合緩衝液が、０．５Ｍの濃度で存在する、請求項１５に記載のワクチン製剤。
組合せ緩衝系が、クエン酸塩−リン酸塩緩衝系であって、前記クエン酸塩の濃度が０．３５Ｍである、請求項１に記載のワクチン製剤。
糖の組合せが、スクロース、ラクトース及びトレハロースを含む、請求項１に記載のワクチン製剤。
糖の組合せが、スクロース及びトレハロースである、請求項１に記載のワクチン製剤。
糖の組合せが、スクロース及びラクトースである、請求項１に記載のワクチン製剤。
糖の組合せが、２０％〜７５％ｗ／ｖの範囲の濃度で存在するスクロースを含む、請求項１に記載のワクチン製剤。
糖の組合せが、最大１０％ｗ／ｖまでの範囲の濃度で存在するラクトースを含む、請求項１又は１９に記載のワクチン製剤。
糖の組合せが、最大１％ｗ／ｖまでの範囲の濃度で存在するトレハロースを含む、請求項１又は１８に記載のワクチン製剤。
ヒト血清アルブミンが、最大０．４％ｗ／ｖまでの範囲の濃度で存在する、請求項１に記載のワクチン製剤。
ラクトアルブミン加水分解物が、最大１０％ｗ／ｖまでの範囲の濃度で存在する、請求項１に記載のワクチン製剤。
ラクトアルブミン加水分解物が、最大５％ｗ／ｖまでの範囲の濃度で存在する、請求項２４に記載のワクチン製剤。
塩化亜鉛を、３ｍＭの濃度でさらに含む、請求項１に記載のワクチン製剤。
用量が０．５ｍｌ〜１．５ｍｌであって、それがロタウイルス感染症に対して長期の免疫原性をもたらすことができ、胃の環境の酸性度を中和するのに十分である、請求項１に記載のワクチン製剤。
用量が１ｍｌであり、胃の環境の酸性度を中和することができ、それによってロタウイルスに起因する感染症に対する必要量の長期の防御免疫反応を惹起することができる、請求項１又は２７に記載のワクチン製剤。
ロタウイルス抗原が、１０^４．５〜１０^５．５ｆｆｕ／用量の範囲の濃度で存在する、請求項１に記載のワクチン製剤。
製剤のｐＨが、７〜８．５である、請求項１に記載のワクチン製剤。
２°〜８℃で少なくとも２年間及び２５℃で６カ月間安定である、請求項１に記載のワクチン製剤。
ロタウイルス抗原が、組換えトリプシンの存在下で適合され、より高いウイルス回収率をもたらすことができる、請求項１に記載のワクチン製剤。