JPS61231994A - 酸産生バクテリアの保存方法及びそれによつて製造される組成物 - Google Patents
酸産生バクテリアの保存方法及びそれによつて製造される組成物Info
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- JPS61231994A JPS61231994A JP61074394A JP7439486A JPS61231994A JP S61231994 A JPS61231994 A JP S61231994A JP 61074394 A JP61074394 A JP 61074394A JP 7439486 A JP7439486 A JP 7439486A JP S61231994 A JPS61231994 A JP S61231994A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、酸産生バクテリアの保存又は安定化の技術に
関する。更に詳しくは１本発明は、冷凍処理を行なわず
、氷点よりも高い温度で長時間の保存を容易にするバク
テリアの保存方法に関する。
関する。更に詳しくは１本発明は、冷凍処理を行なわず
、氷点よりも高い温度で長時間の保存を容易にするバク
テリアの保存方法に関する。
［発明の技術背景］
酸産生バクテリアは、ヨーグルト、チーズ等の製造のみ
ならず、発酵食肉製品及び貯蔵牧草の製造においても広
く使用されている。酪酸産生バクテリアは、これらの製
造工程において特に有用である。これらのバクテリアの
代表的な保存方法には、冷凍、凍結乾燥及び／又はマイ
クロカプセルへの封入がある。
ならず、発酵食肉製品及び貯蔵牧草の製造においても広
く使用されている。酪酸産生バクテリアは、これらの製
造工程において特に有用である。これらのバクテリアの
代表的な保存方法には、冷凍、凍結乾燥及び／又はマイ
クロカプセルへの封入がある。
冷凍は微生物の保存に広く用いられており、冷凍培地に
おいて最大の活性を維持する最適条件を決定するために
、幅広い研究が行なわれている。
おいて最大の活性を維持する最適条件を決定するために
、幅広い研究が行なわれている。
例えば、「フローズン・スターターズ・フロム・インタ
ーナル・ＰＨ・コントロールーグロウス・カルチャーズ
」テクニカルペーパー第６４２７号、オレゴン農業試験
場、ジャーナル拳オブ拳ディリー・サイエンス６７巻１
号（１９８４年）、サンネル及びサンダイア （” Ｆ
ｒｏｚｅｎ ５ｔａｒｔ−ｅｒｓ ｆｒｏｍ Ｉｎｔｅ
ｒｎａｌ ｐＨ−Ｃｏｎｔｒｏｌ−Ｇｒｏｗｎ Ｃｕ１
−ｔｕｒｅｓ”、 Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｐａｐｅｒ
Ｎｏ、 ６４２７、Ｏｒｅｇｏｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕ
ｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉａ＋ｅｎｔ ５ｔａｔｉｏｎ、Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄａｉｒｙ ５ｃｉｅｎｃｅ、
Ｖｏｌ、６７、Ｎ００１、（１９８４） 、 Ｔｈｕｎ
ｎｅｌ ａｎｄ ５ａｎｄｉｎｅ）があげられる。
ーナル・ＰＨ・コントロールーグロウス・カルチャーズ
」テクニカルペーパー第６４２７号、オレゴン農業試験
場、ジャーナル拳オブ拳ディリー・サイエンス６７巻１
号（１９８４年）、サンネル及びサンダイア （” Ｆ
ｒｏｚｅｎ ５ｔａｒｔ−ｅｒｓ ｆｒｏｍ Ｉｎｔｅ
ｒｎａｌ ｐＨ−Ｃｏｎｔｒｏｌ−Ｇｒｏｗｎ Ｃｕ１
−ｔｕｒｅｓ”、 Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｐａｐｅｒ
Ｎｏ、 ６４２７、Ｏｒｅｇｏｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕ
ｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉａ＋ｅｎｔ ５ｔａｔｉｏｎ、Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄａｉｒｙ ５ｃｉｅｎｃｅ、
Ｖｏｌ、６７、Ｎ００１、（１９８４） 、 Ｔｈｕｎ
ｎｅｌ ａｎｄ ５ａｎｄｉｎｅ）があげられる。
更に、凍結乾燥（Ｉｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）は酪
酸産生バクテリアを保存するために、２０年間にわたっ
て使用されている。例えば、Ｔ・モリチ、「ブリザベー
ション・オヴやラフティック・アシッドΦバクテリア・
バイ・フリーズドライイングＪ、ＪＡＲＱ、３号、１７
０〜１７６頁（１９７４年） （Ｍａｒｉｃｈｉ、
Ｔ 、、”Ｐｒｅｓｅｒｖａ−ｔｉｏｎ ｏｆ Ｌ
ａｃｔｉｃ Ａｃ１ｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｂｙ
Ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒ７ｉｎｇ” 、 Ｊ ＡＲＱ
、Ｎｏ、 ３、Ｐａｇｅｓ ｌ ７０−１７６ （
１９７４））があげられる、また、鉛末（Ｓｕｚｕｋｉ
）は、米国特許第４，２１７，４１９号（１９８０年）
において、グルコース及びアルギン酸ナトリウムを含む
ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）懸濁液
の凍結乾燥を開示している。
酸産生バクテリアを保存するために、２０年間にわたっ
て使用されている。例えば、Ｔ・モリチ、「ブリザベー
ション・オヴやラフティック・アシッドΦバクテリア・
バイ・フリーズドライイングＪ、ＪＡＲＱ、３号、１７
０〜１７６頁（１９７４年） （Ｍａｒｉｃｈｉ、
Ｔ 、、”Ｐｒｅｓｅｒｖａ−ｔｉｏｎ ｏｆ Ｌ
ａｃｔｉｃ Ａｃ１ｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｂｙ
Ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒ７ｉｎｇ” 、 Ｊ ＡＲＱ
、Ｎｏ、 ３、Ｐａｇｅｓ ｌ ７０−１７６ （
１９７４））があげられる、また、鉛末（Ｓｕｚｕｋｉ
）は、米国特許第４，２１７，４１９号（１９８０年）
において、グルコース及びアルギン酸ナトリウムを含む
ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）懸濁液
の凍結乾燥を開示している。
しかしながら、これらの方法には多くの問題点が伴う、
冷凍が行なわれる際には、若干の細胞が死滅する。同様
に、保存物質の再水利を行なうと、再水利工程により、
細胞が更に死滅する。したがって、冷凍及び／又は凍結
乾燥工程中の培養物の保護のために、担体が使用される
０代表的な担体として、グルコース、ラクトース又はシ
ュークロースのような発酵性炭水化物がある。しかしな
がら、発酵性炭水化物が存在することによって、微生物
が酸を産生し、ＰＨが最適レベル以下へ減少するために
、結果として若干のバクテリア細胞が損傷及び／又は死
滅する。
冷凍が行なわれる際には、若干の細胞が死滅する。同様
に、保存物質の再水利を行なうと、再水利工程により、
細胞が更に死滅する。したがって、冷凍及び／又は凍結
乾燥工程中の培養物の保護のために、担体が使用される
０代表的な担体として、グルコース、ラクトース又はシ
ュークロースのような発酵性炭水化物がある。しかしな
がら、発酵性炭水化物が存在することによって、微生物
が酸を産生し、ＰＨが最適レベル以下へ減少するために
、結果として若干のバクテリア細胞が損傷及び／又は死
滅する。
カプセル容器材料の崩壊作用により、一定時間にわたり
カプセル製品の制御された放出を行うことを目的とした
カプセル封入技術及びカプセル化製品もまた微生物を保
存する方法として従来技術により十分に確立されている
。カプセルは外部の環境から微生物を保護することによ
り、微生物が機能し続けることを可能にしている０例え
ば、リム及ヒモスの「マイクロカブシュレージ望ンΦオ
ヴ・リビング・セルズφアンドｅディジユーズ」ジャー
ナルｅオプ中ファーマスーティカルΦサイエンス、７０
＠４号、３５１〜３５４頁（１９８１年４月） （Ｌ
ｉ１１ａｎｄ Ｍａｓｓ、′旧ｃｒａｅｎ−ｃａｐｓｕ
ｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｖｉｎｇ Ｃｅ１ｌｓ ａｎ
ｄ Ｔｒｓｓｕｅｓ”、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ５ｃｉｅｎｃｅｓ、 、 Ｖ
ａｌ。
カプセル製品の制御された放出を行うことを目的とした
カプセル封入技術及びカプセル化製品もまた微生物を保
存する方法として従来技術により十分に確立されている
。カプセルは外部の環境から微生物を保護することによ
り、微生物が機能し続けることを可能にしている０例え
ば、リム及ヒモスの「マイクロカブシュレージ望ンΦオ
ヴ・リビング・セルズφアンドｅディジユーズ」ジャー
ナルｅオプ中ファーマスーティカルΦサイエンス、７０
＠４号、３５１〜３５４頁（１９８１年４月） （Ｌ
ｉ１１ａｎｄ Ｍａｓｓ、′旧ｃｒａｅｎ−ｃａｐｓｕ
ｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｖｉｎｇ Ｃｅ１ｌｓ ａｎ
ｄ Ｔｒｓｓｕｅｓ”、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ５ｃｉｅｎｃｅｓ、 、 Ｖ
ａｌ。
７０、Ｎｏ、 ４、Ｐａｇｅｓ ３５１−３５４ （
Ａｐｒｉｌ、１９８１）ｌは、アルギン酸ナトリウム小
滴中に浮遊した細胞をゲル化するために塩化カルシウム
を用いた、生細胞のマイクロカプセル封入工程を開示し
ている。
Ａｐｒｉｌ、１９８１）ｌは、アルギン酸ナトリウム小
滴中に浮遊した細胞をゲル化するために塩化カルシウム
を用いた、生細胞のマイクロカプセル封入工程を開示し
ている。
より近年の研究は十分に確立されている冷凍、凍結乾燥
又はマイクロカプセル封入技術を用いずに、微生物の保
存を強化することに関連している。
又はマイクロカプセル封入技術を用いずに、微生物の保
存を強化することに関連している。
例えば、冷凍を行なわずに微生物を保存するために塩を
用いる方法が、カーノ及びイーベア （Ｋａｈｎ ａｎ
ｄ Ｅａｐｅｎ）の米国特許第４．３０８，２８７号に
示されている。この特許は、キニーネ塩類を用いること
によりヨーグルト（酸産生バクテリアを含有する）の保
存を強化するための方法を開示している。
用いる方法が、カーノ及びイーベア （Ｋａｈｎ ａｎ
ｄ Ｅａｐｅｎ）の米国特許第４．３０８，２８７号に
示されている。この特許は、キニーネ塩類を用いること
によりヨーグルト（酸産生バクテリアを含有する）の保
存を強化するための方法を開示している。
微生物保存のために塩を使用することを開示した別の文
献として、スミス、ベネディクト及びパルンポの「プロ
テクション・アゲインスト・ヒート・インジュリー書イ
ンースタフィロコッカス・オーレウス・バイ・ソルート
」、ジャーナル・オブ吻フード・プロテクション、４５
巻１号、５４〜５８頁（１９８２年１月） （Ｓｍｉｔ
ｈ、Ｂｅｎｅｄｉｃｔ、 ａｎｄ Ｐａｌｕｍｂｏ、”
Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ＡｇａｉｎｓｔＨｅａｔ Ｉ
ｎｊｕｒｙ ｉｎ Ｓｔａ ｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
＋ ａｕｒｅｕｓ ｂｙＳａｌｕｔｅ” 、 Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｔｅｃｔｉ
ｏｎ、Ｖａｌ。
献として、スミス、ベネディクト及びパルンポの「プロ
テクション・アゲインスト・ヒート・インジュリー書イ
ンースタフィロコッカス・オーレウス・バイ・ソルート
」、ジャーナル・オブ吻フード・プロテクション、４５
巻１号、５４〜５８頁（１９８２年１月） （Ｓｍｉｔ
ｈ、Ｂｅｎｅｄｉｃｔ、 ａｎｄ Ｐａｌｕｍｂｏ、”
Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ＡｇａｉｎｓｔＨｅａｔ Ｉ
ｎｊｕｒｙ ｉｎ Ｓｔａ ｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
＋ ａｕｒｅｕｓ ｂｙＳａｌｕｔｅ” 、 Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｔｅｃｔｉ
ｏｎ、Ｖａｌ。
４５、Ｎｏ、 ｌ 、 Ｐａｇｅｓ ５４−５８
、 （Ｊａｎｕａｒｙ 、１９８２）） がある、こ
の記事は、クエン酸ナトリウム、ＫＣｆＬ、ＮａＮＯ３
、Ｎａ２ ＳＯ４、Ｎａ２ ＨＰＯ，Ｉ 、ＮＨ４Ｃ１
、Ｃａ（１１２及びＬｉＣ１のような塩を使用すると熱
損傷に対する保護が行われ、それにより４９℃での９０
分の加熱時間により損傷されるＳ・オーレウス（影剋ユ
…）細胞数が減少するということを開示している。担体
としてラクトースを用いて、ストレプトコッカス・ラク
ティス拳Ｅ （ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＬＬｌｉＬ
！旦）及びＳ−クレモリス（Ｓ、 ｃｒｅｍｏｒｉｓ）
ノ懸濁液を４℃で保存することが、コーラエル、コバー
ガー及びウィーズの「ストーレッジ・オヴ・ラフティッ
ク自ストレプトコッキ、（Ｉ）、エフエフ）−オヴ・ペ
ーパー・オン・サバイバル・アンド・エンドジーニアス
・メタポリズム・イン・ホフフェート・バッファー」ウ
ェストφバージニア大学廃業試験場、報文第８５９号３
６５〜３６９頁（１９６６年１月） （（Ｃｏｗｅｌｌ
、 Ｋｏｂｕｒｇｅｒ、ａｎｄ Ｗｅｅｓｅ 、
”Ｓｔｒａｇｅ ｏｆ Ｌａｃｔｉｃ ５ｔｒｅ ｔ
ｏｃｏｃｃｉ。
、 （Ｊａｎｕａｒｙ 、１９８２）） がある、こ
の記事は、クエン酸ナトリウム、ＫＣｆＬ、ＮａＮＯ３
、Ｎａ２ ＳＯ４、Ｎａ２ ＨＰＯ，Ｉ 、ＮＨ４Ｃ１
、Ｃａ（１１２及びＬｉＣ１のような塩を使用すると熱
損傷に対する保護が行われ、それにより４９℃での９０
分の加熱時間により損傷されるＳ・オーレウス（影剋ユ
…）細胞数が減少するということを開示している。担体
としてラクトースを用いて、ストレプトコッカス・ラク
ティス拳Ｅ （ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＬＬｌｉＬ
！旦）及びＳ−クレモリス（Ｓ、 ｃｒｅｍｏｒｉｓ）
ノ懸濁液を４℃で保存することが、コーラエル、コバー
ガー及びウィーズの「ストーレッジ・オヴ・ラフティッ
ク自ストレプトコッキ、（Ｉ）、エフエフ）−オヴ・ペ
ーパー・オン・サバイバル・アンド・エンドジーニアス
・メタポリズム・イン・ホフフェート・バッファー」ウ
ェストφバージニア大学廃業試験場、報文第８５９号３
６５〜３６９頁（１９６６年１月） （（Ｃｏｗｅｌｌ
、 Ｋｏｂｕｒｇｅｒ、ａｎｄ Ｗｅｅｓｅ 、
”Ｓｔｒａｇｅ ｏｆ Ｌａｃｔｉｃ ５ｔｒｅ ｔ
ｏｃｏｃｃｉ。
１、Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐＨｏｎ ５ｕｒｖｉ
ｖａｌ ａｎｄ ＥｎｄｏｇｓｎｅｏｕｓＭｓｔａ
ｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｐｈｏｓｐｈａｔｓ Ｂｕ
ｆｆｅｒ” 、ＷｅｓｔＶｉｒｇｉｎｉａ Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅ
ｒｉｍｅｎｔＳｔａｔｉｏｎ 、 Ｐａｐｅｒ
Ｎｏ、 ８５９ Ｐａｇｅｓ ３６５−３６９
、（Ｊａｎｕａｒテ、１９６６））に開示されている。
ｖａｌ ａｎｄ ＥｎｄｏｇｓｎｅｏｕｓＭｓｔａ
ｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｐｈｏｓｐｈａｔｓ Ｂｕ
ｆｆｅｒ” 、ＷｅｓｔＶｉｒｇｉｎｉａ Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅ
ｒｉｍｅｎｔＳｔａｔｉｏｎ 、 Ｐａｐｅｒ
Ｎｏ、 ８５９ Ｐａｇｅｓ ３６５−３６９
、（Ｊａｎｕａｒテ、１９６６））に開示されている。
しかしながら、この参考文献の３６６頁図２から分かる
ように、ラクトース含有懸濁液が最適のｐＨ８，５に緩
衝されている場合でも、活性又は生存率の減少は、およ
そ５日目で開始し、ｌＯ０日目でには多大になり始める
。したがって、コーラエル（Ｃｏｗｅｌｌ）らは、氷点
以上の温度における酸産生バクテリアの生存率をコンス
タントに保持する方法については示してはいない。むし
ろ、彼らは、ｐＨを８．５に緩衝することによって、４
℃におけるバクテリアのラクトース含有懸濁液を保存し
た場合の生存率の減少を低減させることを示している。
ように、ラクトース含有懸濁液が最適のｐＨ８，５に緩
衝されている場合でも、活性又は生存率の減少は、およ
そ５日目で開始し、ｌＯ０日目でには多大になり始める
。したがって、コーラエル（Ｃｏｗｅｌｌ）らは、氷点
以上の温度における酸産生バクテリアの生存率をコンス
タントに保持する方法については示してはいない。むし
ろ、彼らは、ｐＨを８．５に緩衝することによって、４
℃におけるバクテリアのラクトース含有懸濁液を保存し
た場合の生存率の減少を低減させることを示している。
［発明の概要］
すなわち、本発明は、バクテリアに対する特異基質であ
る担体の存在しない安定化量の水性緩衝化溶液中へバク
テリアを添加混合することを特徴とする酸産生バクテリ
アの保存方法を提供するものである。
る担体の存在しない安定化量の水性緩衝化溶液中へバク
テリアを添加混合することを特徴とする酸産生バクテリ
アの保存方法を提供するものである。
［本発明の有利性］
本発明の目的は、酸産生バクテリアを安定化又は保存す
る方法を提供することにある。保存は、氷点以下の温度
において行なってもよいが、本発明の目的は、氷点以上
の温度でバクテリアを保存することを意図する方法にあ
る。
る方法を提供することにある。保存は、氷点以下の温度
において行なってもよいが、本発明の目的は、氷点以上
の温度でバクテリアを保存することを意図する方法にあ
る。
先行技術で用いられている標準的な冷凍技術を使用しな
いというきわめて有利な状況のために、本方法によれば
、時間及び経費の両者が削減される。バクテリアを氷点
以上の温度で保存することにより、明らかに、解凍時間
が不要となる。また、先行技術において用いられている
代表的な冷凍物質である高価な液体窒素を使用する必要
がないので、大きな経費削減が達成される。さらに、冷
凍される際の若干のバクテリア細胞の死滅や、解凍が生
じる際の更なる細胞の死滅の原因である冷凍−解凍サイ
クルによるストレスも起こらない。加えて、培養物が既
に懸濁液中にあるので、それを使用するために、解凍し
た培養物を溶解する必要がない。最後に、本発明の技術
によって保存された培養物は、凍らせてもよいが、その
必要がないので、冷凍保存に伴うすべての問題が除去さ
れる。むしろ、培養物は氷点以上の温度、好ましくは約
４°Ｃで、又はより高い温度、例えば室温及びそれ以上
の温度で貯蔵することができる。氷点以上の温度では、
温度の上昇に伴なって、概して保存可能日数は減少する
が、バクテリアの生存力（率）は実質的に保持される。
いというきわめて有利な状況のために、本方法によれば
、時間及び経費の両者が削減される。バクテリアを氷点
以上の温度で保存することにより、明らかに、解凍時間
が不要となる。また、先行技術において用いられている
代表的な冷凍物質である高価な液体窒素を使用する必要
がないので、大きな経費削減が達成される。さらに、冷
凍される際の若干のバクテリア細胞の死滅や、解凍が生
じる際の更なる細胞の死滅の原因である冷凍−解凍サイ
クルによるストレスも起こらない。加えて、培養物が既
に懸濁液中にあるので、それを使用するために、解凍し
た培養物を溶解する必要がない。最後に、本発明の技術
によって保存された培養物は、凍らせてもよいが、その
必要がないので、冷凍保存に伴うすべての問題が除去さ
れる。むしろ、培養物は氷点以上の温度、好ましくは約
４°Ｃで、又はより高い温度、例えば室温及びそれ以上
の温度で貯蔵することができる。氷点以上の温度では、
温度の上昇に伴なって、概して保存可能日数は減少する
が、バクテリアの生存力（率）は実質的に保持される。
「実質的に生存力を保持する」ということは、０℃以上
の保存期間において細胞数の変化が、実験誤差の範囲内
である１０のべき数（ｆａｃｔｏｒ）の範囲内に押さえ
られていることを意味している。３７℃までの温度では
、生存力は実質的に少なくとも６日間保持される。望ま
しい具体例においては、バクテリアは、約４℃で保存し
た時には実質的に１０日、２０日又更には２ケ月以上と
いうより長い期間においても、生存率（力）が保持され
る。
の保存期間において細胞数の変化が、実験誤差の範囲内
である１０のべき数（ｆａｃｔｏｒ）の範囲内に押さえ
られていることを意味している。３７℃までの温度では
、生存力は実質的に少なくとも６日間保持される。望ま
しい具体例においては、バクテリアは、約４℃で保存し
た時には実質的に１０日、２０日又更には２ケ月以上と
いうより長い期間においても、生存率（力）が保持され
る。
［発明の詳細な説明］
本発明において、緩衝化された溶液中で安定化された微
生物は、酸を産生ずるバクテリアである。バクテリア細
胞は、適した増殖培地中で培養され、限外濾過及び／又
は遠心分離のような通常の技術によって収穫される。緩
衝化された溶液中にバクテリア細胞の培養菌を投入する
前に、培養液濃度は、どの細胞も正しく計測されるよう
に調整されなければならない。
生物は、酸を産生ずるバクテリアである。バクテリア細
胞は、適した増殖培地中で培養され、限外濾過及び／又
は遠心分離のような通常の技術によって収穫される。緩
衝化された溶液中にバクテリア細胞の培養菌を投入する
前に、培養液濃度は、どの細胞も正しく計測されるよう
に調整されなければならない。
緩衝化溶液又は懸濁液は、水と１種又はそれ以上の緩衝
剤とから調製される。酸産生バクテリア細胞は、この緩
衝媒体に添加混合される。あるいは、バクテリアをＨ２
Ｏに添加混合し、続いて緩衝剤を加えても良い、更に詳
しくは、バクテリアを含む緩衝化溶液又は懸濁液に、組
織を与えるために担体を使用しても良い、この担体は、
バクテリアの分散状態の保持を助け、バクテリアが、そ
の溶液を収容している容器の底へ沈殿する傾向を減少さ
せる。
剤とから調製される。酸産生バクテリア細胞は、この緩
衝媒体に添加混合される。あるいは、バクテリアをＨ２
Ｏに添加混合し、続いて緩衝剤を加えても良い、更に詳
しくは、バクテリアを含む緩衝化溶液又は懸濁液に、組
織を与えるために担体を使用しても良い、この担体は、
バクテリアの分散状態の保持を助け、バクテリアが、そ
の溶液を収容している容器の底へ沈殿する傾向を減少さ
せる。
担体を使用する場合、それは、安定化される特定の酸産
生バクテリアに対する特異基質であってはならない０本
発明で使用される担体が「基質でない」ということは、
担体が本質的に酸産生バクテリアによって発酵可能のも
のでなく、従って、実質的に酸の産生が起こらない、と
いうことを意味する。先行技術において担体として使用
されているある種の澱粉又は発酵性の糖は、酸産生バク
テリアに対する特異基質である。これらの澱粉又は発酵
性の糖の存在下で酸産生バクテリアが繁殖しても、バク
テリアによる基質の発酵が起こり、その結果酸が産生さ
れそれによりｐＨが減少し、バクテリア細胞の損傷を引
きおこす。
生バクテリアに対する特異基質であってはならない０本
発明で使用される担体が「基質でない」ということは、
担体が本質的に酸産生バクテリアによって発酵可能のも
のでなく、従って、実質的に酸の産生が起こらない、と
いうことを意味する。先行技術において担体として使用
されているある種の澱粉又は発酵性の糖は、酸産生バク
テリアに対する特異基質である。これらの澱粉又は発酵
性の糖の存在下で酸産生バクテリアが繁殖しても、バク
テリアによる基質の発酵が起こり、その結果酸が産生さ
れそれによりｐＨが減少し、バクテリア細胞の損傷を引
きおこす。
バクテリアは、０．１〜１０重量／容量パーセント、好
ましくは０．２〜２重量／容量パーセントの量の担体を
含む水性緩衝化溶液中で保存することが特に望ましい、
担体は、保存又は安定化されるバクテリアに対する特異
基質ではないものである。水性緩衝化溶液は単独で使用
しても良い。
ましくは０．２〜２重量／容量パーセントの量の担体を
含む水性緩衝化溶液中で保存することが特に望ましい、
担体は、保存又は安定化されるバクテリアに対する特異
基質ではないものである。水性緩衝化溶液は単独で使用
しても良い。
しかし、緩衝溶液のみに添加した方がバクテリアの安定
度が多少優れているにせよ、組織を与え、バクテリア細
胞を懸濁状態（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）に保持するため
に、緩衝液中に担体を含有させることが望ましい。ここ
で用いられているサスペンション（５ｕｓｐｅｎｓｉｏ
ｎ）という用語は、純粋な意味においての懸濁液及び／
又はある物による分散状態とみなされる物理的状態を包
含するものである。また、懸濁□ｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）
又は分散（ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ）という用語は、バク
テリアが容器の底に沈降する状態を包含するものである
。担体、緩衝剤、Ｈ２Ｏ及びバクテリアは、どの順序で
加えて混合してもよい。担体を用いる際は、カラジーナ
ン及びアルギン酸ナトリウムのような海藻誘導体などの
食用に適する物質から選ばれることが望ましい、その他
の望ましい担体は、ペクチン、グアール舎ガム（Ｇｕａ
ｒ ｇｕｍ） 、 ローカスト拳ビーンｅガム（Ｌｏｃ
ｕｓｔ ｂｅａｎ ｇｕｍ） 、キサンタンガム、ポリ
オール、非発酵性の糖又は食用に適するセルロースであ
る。これらの担体は、すべて米国食品薬剤局（ｔｈｅ
Ｕ、Ｓ、 Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉ
ｓｔｒａｔｉｏｎ）によって安全であると認定されたＧ
ＲＡＳである。
度が多少優れているにせよ、組織を与え、バクテリア細
胞を懸濁状態（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）に保持するため
に、緩衝液中に担体を含有させることが望ましい。ここ
で用いられているサスペンション（５ｕｓｐｅｎｓｉｏ
ｎ）という用語は、純粋な意味においての懸濁液及び／
又はある物による分散状態とみなされる物理的状態を包
含するものである。また、懸濁□ｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）
又は分散（ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ）という用語は、バク
テリアが容器の底に沈降する状態を包含するものである
。担体、緩衝剤、Ｈ２Ｏ及びバクテリアは、どの順序で
加えて混合してもよい。担体を用いる際は、カラジーナ
ン及びアルギン酸ナトリウムのような海藻誘導体などの
食用に適する物質から選ばれることが望ましい、その他
の望ましい担体は、ペクチン、グアール舎ガム（Ｇｕａ
ｒ ｇｕｍ） 、 ローカスト拳ビーンｅガム（Ｌｏｃ
ｕｓｔ ｂｅａｎ ｇｕｍ） 、キサンタンガム、ポリ
オール、非発酵性の糖又は食用に適するセルロースであ
る。これらの担体は、すべて米国食品薬剤局（ｔｈｅ
Ｕ、Ｓ、 Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉ
ｓｔｒａｔｉｏｎ）によって安全であると認定されたＧ
ＲＡＳである。
好ましい担体は、アルギン酸ナトリウム、セルロース誘
導体又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
導体又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
本発明においてｐ）Ｉは、種々ある緩衝剤のいずれかを
用いて中性付近に保たれる。望ましいＰＨの範囲は、約
６．０乃至約８．０である。より好ましくは、ｐＨ６，
４乃至７．６である。緩衝剤は、結果として大量の酸の
生成を起こすもの、すなわちバクテリアの特異基質でな
ければ、ｐＨを中性付近に保つどのようなものを使用し
ても良い。好ましい緩衝剤は、リン酸ジアンモニウム、
二塩基性リン酸ナトリウム又はそれらの混合物のような
、リン酸塩緩衝剤である。リン酸マグネシウム、リン酸
マグネシウムアンモニウム及び重炭酸ジアンモニウムも
また、緩衝剤として用いると有利なものである。水性緩
衝化溶液は、通例、緩衝剤を０．２〜５重量／容量パー
セント含む。
用いて中性付近に保たれる。望ましいＰＨの範囲は、約
６．０乃至約８．０である。より好ましくは、ｐＨ６，
４乃至７．６である。緩衝剤は、結果として大量の酸の
生成を起こすもの、すなわちバクテリアの特異基質でな
ければ、ｐＨを中性付近に保つどのようなものを使用し
ても良い。好ましい緩衝剤は、リン酸ジアンモニウム、
二塩基性リン酸ナトリウム又はそれらの混合物のような
、リン酸塩緩衝剤である。リン酸マグネシウム、リン酸
マグネシウムアンモニウム及び重炭酸ジアンモニウムも
また、緩衝剤として用いると有利なものである。水性緩
衝化溶液は、通例、緩衝剤を０．２〜５重量／容量パー
セント含む。
抗酸化剤、かび抑制剤及び／又は塩のような試薬もまた
、任意に包有して良い０通常、このような試薬の微生物
の保存生存率に対する影響は、はとんど無いか、全く無
い。これらの試薬は、緩衝溶液に対する添加剤の量とし
て０．１〜５重量／容量パーセント、好ましくは０．２
〜２重量／容量パーセント加える０通例、少量の安息香
酸ナトリウムが、かび（ｍｏｌｄ）すなわち菌類（ｆｕ
ｎｇｕｓ）を防止するために加えられる。また、少量の
有機塩、クエン酸ナトリウムを、細胞内の浸透圧を維持
するために加えても良い、もし、保存寿命が数日減少す
る場合、この欠点は通常、その試薬の有利性、すなわち
かび抑止力によって相殺される。
、任意に包有して良い０通常、このような試薬の微生物
の保存生存率に対する影響は、はとんど無いか、全く無
い。これらの試薬は、緩衝溶液に対する添加剤の量とし
て０．１〜５重量／容量パーセント、好ましくは０．２
〜２重量／容量パーセント加える０通例、少量の安息香
酸ナトリウムが、かび（ｍｏｌｄ）すなわち菌類（ｆｕ
ｎｇｕｓ）を防止するために加えられる。また、少量の
有機塩、クエン酸ナトリウムを、細胞内の浸透圧を維持
するために加えても良い、もし、保存寿命が数日減少す
る場合、この欠点は通常、その試薬の有利性、すなわち
かび抑止力によって相殺される。
本発明方法によって保存される微生物は、酸産生バクテ
リアである０通常、かかるバクテリアは、その発酵生成
物の少なくとも１種であり、通常は最も豊富である酪酸
によって、ラクトース又はグルコースのような単純炭水
化物を発酵させる能力を有する。このような酸産生バク
テリアとしては、ロイコノストック・クレモリス（Ｌｅ
ｕｃｏｎｏｓｔｏｃａｒｅａ＋ｏｒｉｓ） 、 スト
レブトコクス・ラクティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ Ｉａｃｔｉｓ） 、 Ｓ ＊クレモリス（Ｓ、 ｃ
ｒｅｍｏｒｉｓ）、Ｓ−ジアセチラクティス（Ｓ。
リアである０通常、かかるバクテリアは、その発酵生成
物の少なくとも１種であり、通常は最も豊富である酪酸
によって、ラクトース又はグルコースのような単純炭水
化物を発酵させる能力を有する。このような酸産生バク
テリアとしては、ロイコノストック・クレモリス（Ｌｅ
ｕｃｏｎｏｓｔｏｃａｒｅａ＋ｏｒｉｓ） 、 スト
レブトコクス・ラクティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ Ｉａｃｔｉｓ） 、 Ｓ ＊クレモリス（Ｓ、 ｃ
ｒｅｍｏｒｉｓ）、Ｓ−ジアセチラクティス（Ｓ。
ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）、Ｓ−サーモフィルス（
Ｓ。
Ｓ。
ｔｈｅｒｎ＋ｏｐｈｉｌｕｓ） 、ラクトバシラス・ブ
ルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａ
ｒｉｃｕｓ） 、 Ｌ ｅアシドフィルス（Ｌ、 ａｃ
ｉｄｏｐｈｉｌｕｓ） 、 Ｌ ＠ へルヘティクス（
Ｌ、 ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ） 、 Ｌ ＊ビフィズ
ス（Ｌ。
ルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａ
ｒｉｃｕｓ） 、 Ｌ ｅアシドフィルス（Ｌ、 ａｃ
ｉｄｏｐｈｉｌｕｓ） 、 Ｌ ＠ へルヘティクス（
Ｌ、 ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ） 、 Ｌ ＊ビフィズ
ス（Ｌ。
ｂｉｆｉｄｕｓ）、Ｌ−カゼイ（Ｌ、 ｃａｓｅｉ）
、 Ｌ ｅラクティス（Ｌ、 Ｉａｃｔｉｓ）、Ｌ−プ
ランタルム（Ｌ、 ｐｌａｎｔａｒｕｍ） 、 Ｌ ＠
デルブルエツキー（Ｌ、 ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）
、 Ｌ 拳サーモ７４）レス（Ｌ。
、 Ｌ ｅラクティス（Ｌ、 Ｉａｃｔｉｓ）、Ｌ−プ
ランタルム（Ｌ、 ｐｌａｎｔａｒｕｍ） 、 Ｌ ＠
デルブルエツキー（Ｌ、 ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）
、 Ｌ 拳サーモ７４）レス（Ｌ。
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｇ） 、 Ｌ ＊ ７．ルメ
ンティ−（Ｌ。
ンティ−（Ｌ。
ｆｅｒｍｅｎｔｉｉ）、及びペディオコッカス・セレビ
ジアｘ （Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）である。より好ましい乳酸菌は、ラクトバシラス
・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃ
ｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｌ＠ラクティス（Ｌ。Ｉａｃｔ
ｉｓ） 、 Ｌ ＊プランタルム（Ｌ。
ジアｘ （Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）である。より好ましい乳酸菌は、ラクトバシラス
・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃ
ｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｌ＠ラクティス（Ｌ。Ｉａｃｔ
ｉｓ） 、 Ｌ ＊プランタルム（Ｌ。
ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、又はロイコノストック番クレモ
リス（Ｌａｕｃｏｎｏｓｔａｃ ｃｒｅｍｏｒｉｓ）で
ある、以下の実施例においては、酪酸産生バクテリア、
Ｌ・プランタルム（Ｌ、 ｐｌａｎｔａｒｕｍ）を用い
る。
リス（Ｌａｕｃｏｎｏｓｔａｃ ｃｒｅｍｏｒｉｓ）で
ある、以下の実施例においては、酪酸産生バクテリア、
Ｌ・プランタルム（Ｌ、 ｐｌａｎｔａｒｕｍ）を用い
る。
［具体例〕
本発明の以下の実施例は、単に本発明を具体的に説明す
る目的で示すものである。それにより。
る目的で示すものである。それにより。
特許請求の範囲を制限する意図は無い。これらの実施例
で用いられたラクトバシラス會プランタルム（Ｌａｃｔ
ｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕ＋＋＋）株は、
メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カル
チ＋−８：ＩＬ／クシ、１７ （Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔ
ｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託
され、ＡＴＣＣ＃３９５４２として登録されているもの
である。この株は以下の様に培養し、濃縮した。
で用いられたラクトバシラス會プランタルム（Ｌａｃｔ
ｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕ＋＋＋）株は、
メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カル
チ＋−８：ＩＬ／クシ、１７ （Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔ
ｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託
され、ＡＴＣＣ＃３９５４２として登録されているもの
である。この株は以下の様に培養し、濃縮した。
Ｌ−プランタルム（Ｌ、 ＰＩａｎｔａｒｕ＋ｗ）の生
細胞を、デクストロース、イースト抽出物及び無機塩で
強化した加水分解ミルクをベースとした増殖培地中で培
養した。培養中のｐＨを約６．５に保持するために、Ｎ
Ｈ，ＯＨを加えた。培養は３７℃で１６〜２４時間行な
った。その後、培養菌をデスラッジャーを用いた遠心分
離により収穫し、細胞のスラリーを回収した。デスラッ
ジャーは、排流中の母液、未使用の増殖媒体及び代謝副
生成物を除去する、連続が過が可能な積層板を備えた回
転ドラムである。次に、細胞スラリーを、それぞれ中性
又は中性に近いＰＨをもつ洗浄溶液である生理食塩水又
はペプトン水で洗浄した。かかる洗浄溶液は当業界にお
いて周知であり、収穫されたバクテリア細胞の培養菌の
洗浄に使用されるものである。これらは、培地中に存在
している可能性のある残留物の除去を促進する。濾過を
続け、細胞数が以ドの各実施例において望ましい数にな
るまで、新たに収穫された培養菌を−ａ１ｉ！シた。生
存力の尺度として用いた細胞数は、ＣＦＵ／、Ｊ（１ミ
リリツトル中のコロニー形成単位）で示され、それは、
以下の様に測定した。
細胞を、デクストロース、イースト抽出物及び無機塩で
強化した加水分解ミルクをベースとした増殖培地中で培
養した。培養中のｐＨを約６．５に保持するために、Ｎ
Ｈ，ＯＨを加えた。培養は３７℃で１６〜２４時間行な
った。その後、培養菌をデスラッジャーを用いた遠心分
離により収穫し、細胞のスラリーを回収した。デスラッ
ジャーは、排流中の母液、未使用の増殖媒体及び代謝副
生成物を除去する、連続が過が可能な積層板を備えた回
転ドラムである。次に、細胞スラリーを、それぞれ中性
又は中性に近いＰＨをもつ洗浄溶液である生理食塩水又
はペプトン水で洗浄した。かかる洗浄溶液は当業界にお
いて周知であり、収穫されたバクテリア細胞の培養菌の
洗浄に使用されるものである。これらは、培地中に存在
している可能性のある残留物の除去を促進する。濾過を
続け、細胞数が以ドの各実施例において望ましい数にな
るまで、新たに収穫された培養菌を−ａ１ｉ！シた。生
存力の尺度として用いた細胞数は、ＣＦＵ／、Ｊ（１ミ
リリツトル中のコロニー形成単位）で示され、それは、
以下の様に測定した。
殺菌したピペットを用い、１．０ミリリツトルの試料を
、それぞれ２℃〜５℃に冷却され殺菌した蒸留ペプトン
水（０，１重量／容量パーセント）１０ミリリツトルを
入れたチューブの中に移した。適度の混合を行なうため
に、試料を低速で回転させ、殺菌した０、１重量／容量
パーセントのペプトン水を用いて希釈溶液をいくつか調
製した。希釈溶液を、各１対のＡＰＴ（ディフコ社の全
目的用トウウィーン媒体（ＡＩｌ ＰｕｒｐｏｓｅＴｗ
ｅｅｎ ｍｅｄｉｕｍ ｆｒｏｍ Ｄｉｆｃｏ））寒天
プレート上に配置した。プレートを３７℃で４８時間、
嫌気的に培養し、ＣＦＵ／−をケベック（Ｑｕｅｂｅｃ
）自動コロニーカウンターを用いて測定した。寒天プレ
ート上のそれぞれ個々のコロニーは、試料からのひとつ
の有機体の存在を示している。すなわちバクテリアコロ
ニーの数は、試料中に存在する有機体の総数を示す。
、それぞれ２℃〜５℃に冷却され殺菌した蒸留ペプトン
水（０，１重量／容量パーセント）１０ミリリツトルを
入れたチューブの中に移した。適度の混合を行なうため
に、試料を低速で回転させ、殺菌した０、１重量／容量
パーセントのペプトン水を用いて希釈溶液をいくつか調
製した。希釈溶液を、各１対のＡＰＴ（ディフコ社の全
目的用トウウィーン媒体（ＡＩｌ ＰｕｒｐｏｓｅＴｗ
ｅｅｎ ｍｅｄｉｕｍ ｆｒｏｍ Ｄｉｆｃｏ））寒天
プレート上に配置した。プレートを３７℃で４８時間、
嫌気的に培養し、ＣＦＵ／−をケベック（Ｑｕｅｂｅｃ
）自動コロニーカウンターを用いて測定した。寒天プレ
ート上のそれぞれ個々のコロニーは、試料からのひとつ
の有機体の存在を示している。すなわちバクテリアコロ
ニーの数は、試料中に存在する有機体の総数を示す。
見立主−ユ
水１００ｃｃ中に（Ｎ Ｈ４） ＨＰ Ｏ４を２．８ｇ
混合することにより緩衝液を調製した。これにアルギン
酸ナトリウム０．７ｇを加え、ｐＨ７を有する溶液を調
製した。次に、望ましい細胞濃度を有するラクトバシラ
ス・プランタルムの新たに収穫し濃縮した培養菌１５ｃ
ｃを、少量の上記調製溶液中に撹拌しながら懸濁させた
。更に、調製溶液を全量が５０ｃｃになるまで加え、ｐ
）１７ 、６を有するバクテリア懸濁液を調製した。細
胞数を上記記載方法で測定した安定度のデータを下記の
人工に報告する。
混合することにより緩衝液を調製した。これにアルギン
酸ナトリウム０．７ｇを加え、ｐＨ７を有する溶液を調
製した。次に、望ましい細胞濃度を有するラクトバシラ
ス・プランタルムの新たに収穫し濃縮した培養菌１５ｃ
ｃを、少量の上記調製溶液中に撹拌しながら懸濁させた
。更に、調製溶液を全量が５０ｃｃになるまで加え、ｐ
）１７ 、６を有するバクテリア懸濁液を調製した。細
胞数を上記記載方法で測定した安定度のデータを下記の
人工に報告する。
衣」
実施例１の懸濁液を４℃及び２２℃で保存した。
５４８．７ ＋、５Ｘ１０１１０無
表１の結果から、４℃の保存においては生存率は実質的
に保持されていることが認められる。
に保持されていることが認められる。
５４日経過後も、１０のべき数の範囲内で細胞数が実質
的に一定であり、生存率の減少が無いことが観察された
。パーセントレベルの減少も無かった。温度２２℃で６
日経過後は、数パーセントの生存率の減少が観察された
が、細胞数は１０”のレベルのままであり、１０のべき
数の減少はなかった。細胞数が１０！ｏから１０９のレ
ベルに減少するｌＯのべき数においての生存率の減少は
１５日目までは起こらなかった。
的に一定であり、生存率の減少が無いことが観察された
。パーセントレベルの減少も無かった。温度２２℃で６
日経過後は、数パーセントの生存率の減少が観察された
が、細胞数は１０”のレベルのままであり、１０のべき
数の減少はなかった。細胞数が１０！ｏから１０９のレ
ベルに減少するｌＯのべき数においての生存率の減少は
１５日目までは起こらなかった。
支立遺−」
新たに収穫し、洗浄し、濃縮したラクトパシラス・プラ
ンタルム２５ｃｃを、５．０重量／容量パーセントのリ
ン酸ジアンモニウム１ｍ液７５ｃｃと混合して全量を１
００ｃｃとし、異なる温度において保存した。細胞数を
上記記載の方法と同様に測定した。結果を下記の表■に
報告する。
ンタルム２５ｃｃを、５．０重量／容量パーセントのリ
ン酸ジアンモニウム１ｍ液７５ｃｃと混合して全量を１
００ｃｃとし、異なる温度において保存した。細胞数を
上記記載の方法と同様に測定した。結果を下記の表■に
報告する。
人工
実施例２の懸濁液を４℃、２２℃、３２℃及び３７°Ｃ
で保存した。
で保存した。
保１」１支」」
２６ ７．２ ＋、ｅｘ＋ｏＩ０ １２
ｇ２Ｇ ６．５ り、０Ｘ１０７９９有 表ＩＩから、ＰＥＧ又はアルギン酸ナトリウムのような
担体を含まない緩衝液を用いることにより、良好な安定
性が達成されるということが認められる。保存温度４℃
で４７日、及び保存温度２２℃で２６日におよびパーセ
ントレベルのｇ少も、ｌＯのべき数の減少もなく、生存
率は実質的に保持された。１０のべき数の減少は、３２
℃におし１ては、１８日までは起こらず、３７℃におい
ては１１日目までは起こらな力）った。
ｇ２Ｇ ６．５ り、０Ｘ１０７９９有 表ＩＩから、ＰＥＧ又はアルギン酸ナトリウムのような
担体を含まない緩衝液を用いることにより、良好な安定
性が達成されるということが認められる。保存温度４℃
で４７日、及び保存温度２２℃で２６日におよびパーセ
ントレベルのｇ少も、ｌＯのべき数の減少もなく、生存
率は実質的に保持された。１０のべき数の減少は、３２
℃におし１ては、１８日までは起こらず、３７℃におい
ては１１日目までは起こらな力）った。
見立１
水１００ｃｃに（ＮＨ４） ２ ＨＰ Ｏａを５ｇ混合
して、緩衝液を調製した。これにＰＥＧ３０００を１ｇ
、安息香酸ナトリウム１ｇ及びクエン酸ナトリウム０．
１７ｇを加えた。次に、新たに収穫した未洗浄の、濃縮
したラクトパシラス・ブランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）２５ｃｃヲ、このリ
ン酸ジアンモニウム、ポリエチレングリコール３０００
（３０００は平均分子量である）、安息香酸ナトリウ
ム及びクエン酸ナトリウムの溶液と混合し、異なる温度
で保存した。細胞数を上記記載の方法と同様に測定し、
本実施例の結果を下記の表ｍに要約した。
して、緩衝液を調製した。これにＰＥＧ３０００を１ｇ
、安息香酸ナトリウム１ｇ及びクエン酸ナトリウム０．
１７ｇを加えた。次に、新たに収穫した未洗浄の、濃縮
したラクトパシラス・ブランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）２５ｃｃヲ、このリ
ン酸ジアンモニウム、ポリエチレングリコール３０００
（３０００は平均分子量である）、安息香酸ナトリウ
ム及びクエン酸ナトリウムの溶液と混合し、異なる温度
で保存した。細胞数を上記記載の方法と同様に測定し、
本実施例の結果を下記の表ｍに要約した。
墓；
実施例３の懸濁液を３２℃及び３７℃で保存した。
１９ Ｅｆ、８３．８Ｘ１０’ １３７有１９ Ｇ、５
５．８Ｘ１０８ ！３５３表ｍのデータから、３２℃に
おいては、生存率は１０日１までは実質的に保持され、
１９日１までは１０のべき数の減少は無かったことが認
められる。より高い３７℃の温度においては、細胞数の
１０のべき数の減少は、６日目経過時点から始まった。
５．８Ｘ１０８ ！３５３表ｍのデータから、３２℃に
おいては、生存率は１０日１までは実質的に保持され、
１９日１までは１０のべき数の減少は無かったことが認
められる。より高い３７℃の温度においては、細胞数の
１０のべき数の減少は、６日目経過時点から始まった。
丈１己Ｌｕ
かびを防ぐために、１重量／容量パーセントの安息香酸
ナトリウムを、アルギン酸ナトリウム及びリン酸ジアン
モニウムの溶液に加えたほかは、実施例１の工程と同様
に実験を行なった０次に、この調製溶液をラクトバシラ
ス・ブランタルムの懸濁に使用した。かび抑止剤を含ま
ない培養菌懸濁液の結果を記録した表工と、生存率にお
いて木質的に変化は無かった。
ナトリウムを、アルギン酸ナトリウム及びリン酸ジアン
モニウムの溶液に加えたほかは、実施例１の工程と同様
に実験を行なった０次に、この調製溶液をラクトバシラ
ス・ブランタルムの懸濁に使用した。かび抑止剤を含ま
ない培養菌懸濁液の結果を記録した表工と、生存率にお
いて木質的に変化は無かった。
要約すると、実施例１は担体としてアルギン酸ナトリウ
ムを含む緩衝液を用いた具体例を示している０表ｎは、
担体を含まない緩衝液を用いた具体例を示している。し
かしながら、組織を与えるための担体を加えないと、バ
クテリアは懸濁液中に沈殿していく傾向があり、この生
成物を１例えば牧畜への経口投与のような投与を行なう
ことは困難である０表ｍは担体としてＰＥＧを含む緩衝
化溶液を、任意の安定度強化剤、安息香酸ナトリウム及
びクエン酸ナトリウムと共に用いた具体例を示す。
ムを含む緩衝液を用いた具体例を示している０表ｎは、
担体を含まない緩衝液を用いた具体例を示している。し
かしながら、組織を与えるための担体を加えないと、バ
クテリアは懸濁液中に沈殿していく傾向があり、この生
成物を１例えば牧畜への経口投与のような投与を行なう
ことは困難である０表ｍは担体としてＰＥＧを含む緩衝
化溶液を、任意の安定度強化剤、安息香酸ナトリウム及
びクエン酸ナトリウムと共に用いた具体例を示す。
上記の実施例１及び２で分かるように、ラクトバシラス
・プランタルムを４℃において保存した場合はそれぞれ
５４日及び４７日の長期にわたって保存した場合におい
ても、生存率の減少は起こらない。更に表■から分かる
ように、安息香酸ナトリウム又はクエン酸ナトリウムの
ような１種以上の任意の試薬を用いても、生存率の減少
にほとんど影響を与えない。
・プランタルムを４℃において保存した場合はそれぞれ
５４日及び４７日の長期にわたって保存した場合におい
ても、生存率の減少は起こらない。更に表■から分かる
ように、安息香酸ナトリウム又はクエン酸ナトリウムの
ような１種以上の任意の試薬を用いても、生存率の減少
にほとんど影響を与えない。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、バクテリアに対する特異基質である担体を含まない
、安定化量の水性緩衝化溶液中にバクテリアを添加混合
し、それにより、バクテリアの懸濁液を提供することを
特徴とする酸産生バクテリアの保存方法。 ２、得られるバクテリア懸濁液が約６．０乃至約８．０
のｐＨを示す特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、該バクテリアが新たに収穫された培養物から誘導さ
れた酪酸産生バクテリアである特許請求の範囲第２項記
載の方法。 ４、バクテリアを水性緩衝化溶液中に添加混合する前に
、新たに収穫された培養物を洗浄溶液で洗浄する特許請
求の範囲第３項記載の方法。 ５、該水性緩衝化溶液が更に、バクテリアによる被発酵
性を実質的に示さない担体を含む特許請求の範囲第４項
記載の方法。 ６、特許請求の範囲第５項記載の方法であって、該担体
が、緩衝化溶液の全容量に対して０．１乃至１０重量／
容量パーセントの量存在する特許請求の範囲第５項記載
の方法。 ７、該担体が、アルギン酸ナトリウム、カラジーナン、
アルギン酸カリウム、キサンタンガム、グアール・ガム
（Ｇｕａｒ ｇｕｍ）、ローカスト・ビーン・ガム（Ｌ
ｏｃｕｓｔ ｂｅａｎ ｇｕｍ）、ペクチン、ポリエチ
レングリコール又はセルロース誘導体である特許請求の
範囲第６項記載の方法。 ８、該緩衝化溶液中の緩衝剤が、リン酸ジアンモニウム
、二塩基性リン酸ナトリウム、重炭酸ジアンモニウム又
はそれらの混合物である特許請求の範囲第７項記載の方
法。 ９、該溶液中のバクテリアが、０℃乃至３２℃の温度で
保存した場合に少なくとも１１日間の生存力を実質的に
保存する特許請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４
項、第５項、第６項、第７項又は第８項記載の方法。 １０、抗酸化剤、かび抑制剤及び塩類から成る群より選
ばれた添加剤を更に包含する特許請求の範囲第８項記載
の方法。 １１、かび抑制剤が、緩衝化溶液基準で０．１乃至５重
量／容量パーセントの安息香酸ナトリウムであり、塩が
、０．１乃至５重量／容量パーセントのクエン酸ナトリ
ウムである特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２、特許請求の範囲第３項、第４項又は第５項記載の
方法によって調製されたバクテリア懸濁液であって、該
バクテリアの生存力が、該懸濁液を約４℃の温度で４７
日間保存した場合に実質的に保持される懸濁液。 １３、生存酸産生バクテリアの懸濁液及び、バクテリア
に対する特異基質である担体を含まない水性緩衝化溶液
からなることを特徴とする組成物。 １４、該懸濁液が、リン酸ジアンモニウム、二塩基性リ
ン酸ナトリウム、重炭酸ジアンモニウム及びそれらの混
合物から成る群より選ばれた緩衝剤を用いることにより
、約６．０乃至約８．０のｐＨを有し、該バクテリアが
、ロイコノストック・クレモリス（￥Ｌｅｕｃｏｎｏｓ
ｔｏｃ￥ ￥ｃｒｅｍｏｒｉｓ￥）、ストレプトコッカ
ス・ラクティス（￥Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ￥ ￥
ｌａｃｔｉｓ￥）、Ｓ・クレモリス（￥Ｌ．￥ ￥ｃｒ
ｅｍｏｒｉｓ￥）、Ｓ・ジアセチラクティス（￥Ｓ．￥
￥ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ￥）、Ｓ・サーモフィ
ルス（￥Ｓ．￥ ￥ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ￥）、ラ
クトバシラス・ブルガリクス（￥Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌ
ｌｕｓ￥ ￥ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ￥）、Ｌ・アシドフ
ィルス（￥Ｌ．￥ ￥ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ￥）、Ｌ
・ヘルベティクス（￥Ｌ．￥ ￥ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ
￥）、Ｌ・ビフィズス（￥Ｌ．￥ ￥ｂｉｆｉｄｕｓ￥
）、Ｌ・カゼイ（￥Ｌ．￥ ￥ｃａｓｅｉ￥）、Ｌ・ラ
クティス（￥Ｌ．￥ ￥ｌａｃｔｉｓ￥）、Ｌ・プラン
タラム（￥Ｌ．￥ ￥ｐｌａｎｔａｒｕｍ￥）、Ｌ・デ
ルブルエッキー（￥Ｌ．￥ ￥ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ
￥）、Ｌ・サーモフィルス（￥Ｌ．￥ ￥ｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ￥）、Ｌ・フェルメンティー（￥Ｌ．￥
￥ｆｅｒｍｅｎｔｉｉ￥）及びペディオコッカス・セレ
ビジアエ（￥Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ￥ ￥ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ￥）から成る群より選ばれたものである特許
請求の範囲第１３項記載の組成物。 １５、特許請求の範囲第１４項記載の組成物であって、
該懸濁液が、アルギン酸ナトリウム、カラジーナン、ア
ルギン酸カリウム、キサンタンガム、グアール・ガム（
Ｇｕａｒ ｇｕｍ）、ローカスト・ビーン・ガム（Ｌｏ
ｃｕｓｔ ｂｅａｎ ｇｕｍ）、ペクチン、ポリエチレ
ングリコール又はセルロース誘導体から成る群より選ば
れた担体を包含する組成物。
Applications Claiming Priority (2)
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| US06/719,895 US4720460A (en) | 1985-04-04 | 1985-04-04 | Process for preserving acid producing bacteria and compositions produced thereby |
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