DE3685673T2

DE3685673T2 - Verfahren zur aufbewahrung von saeure produzierenden bakterien und demgemaess hergestellte zusammensetzungen.

Info

Publication number: DE3685673T2
Application number: DE8686104037T
Authority: DE
Inventors: Jeffrey Truxton Barach; Bassie Jabron Kamara
Original assignee: Rhone Poulenc Inc
Current assignee: Bayer CropScience Inc USA
Priority date: 1985-04-04
Filing date: 1986-03-24
Publication date: 1993-01-21
Anticipated expiration: 2006-03-25
Also published as: ES8706336A1; EP0196593B1; DE3685673D1; ES553739A0; JPS61231994A; US4720460A; EP0196593A2; ATE77407T1; AU566174B2; EP0196593A3; AU5500486A; CA1277266C; BR8601513A

Description

Die Erfindung betrifft die Konservierung und Stabilisierung säureproduzierender Bakterien. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zum Konservieren von Bakterien, bei dem nicht nur ein Gefrieren vermieden wird, sondern das auch die Lagerung für längere Zeitperioden bei Temperaturen erleichtert, die oberhalb der Gefriertemperatur liegen.

Hintererund der Erfindung

Säureproduzierende Bakterien werden bei der Herstellung von fermentierten Fleischprodukten und Silofutter sowie bei der Herstellung von Joghurt, Käse und dergleichen intensiv eingesetzt. Milchsäureproduzierende Bakterien sind für derartige Herstellungsverfahren insbesondere von Nutzen. Zu den typischen Verfahren zum Lagern derartiger Bakterien gehören das Gefrieren, die Gefriergetrocknung und/oder die Mikroeinkapselung.
Für die Lagerung von Mikroorganismen wird die Gefrierung häufig eingesetzt. Zudem wurden intensive Forschungsanstrengungen unternommen, um die optimalen Bedingungen für die Aufrechterhaltung der maximalen Aktivität in gefrorenen Kulturen zu bestimmen. Diesbezüglich wird beispielsweise verwiesen auf "Frozen Starters from Internal pH-Control-Grown Cultures", Technical Paper No. 6427, Oregon Agricultural Experiment Station, Journal of Dairy Science, Band 67, Nr. 1 (1984), Thunnel und Sandine.
Außerdem wurde über 20 Jahre lang die Gefriertrocknung (Lyophilisierung) zur Konservierung bzw. Aufbewahrung von milchsäureproduzierenden Bakterien eingesetzt. Diesbezüglich wird beispielsweise verwiesen auf Morichi, T., "Preservation of Lactic Acid Bacteria by Freeze-drying", JARQ, Nr. 3, Seiten 170-176 (1974). Ferner beschreibt Suzuki im US-Patent Nr. 4 217 419 (1980) die Lyophilisierung einer Suspension von Lactobacillus, die Glucose und Natriumalginat enthält.
Bei diesen Verfahren treten jedoch viele Probleme auf. So werden beim Gefrieren einige der Zellen getötet. Wird dann der Entschluß gefaßt, das gelagerte Material wieder zu hydratisieren, dann werden durch den Rehydratisierungsprozeß in ähnlicher Weise zusätzliche Zellen getötet. Es werden daher Träger zur Anwendung gebracht, um die Kultur während des Gefrierens und/oder des Gefriertrocknungsprozesses zu schützen. Typische Träger sind fermentierbare Kohlenhydrate wie Glucose, Lactose oder Sucrose. Die Anwesenheit der fermentierbaren Kohlenhydrate veranlaßt den Mikroorganismus jedoch zur Produktion von Säure. Dies führt zu einer Schädigung und/oder zum Tod von einigen der Bakterienzellen aufgrund dein Reduktion des pH-Wertes auf einen Wert unterhalb desjenigen, der optimal ist.
Auch ist es im Stand der Technik bekannt, Einkapselungstechniken und eingekapselte Produkte für die kontrollierte Freigabe des Produktes als Funktion der Zerstörung des eingekapselten Materials während einer Zeitspanne als Verfahren zur Konservierung von Mikroorganismen einzusetzen. Durch Schützen der Mikroorganismen vor den Einflüssen der Umgehebung versetzt die Kapsel die Mikroorganismen in die Lage, weiterhin lebensfähig zu bleiben. So beschreiben beispielsweise Lim und Moss, "Microencapsulation of Living Cells and Tissues", Journal of Pharmaceutical Sciences, Band 70, Nr. 4, Seiten 351 bis 354 (April 1981) ein Mikroverkapselungsverfahren für lebende Zel len unter Verwendung von Kalziumchlorid zum Gelieren von in Natriumalginattröpfchen suspendierten Zellen.
Jüngere Studien befassen sich mit der Verstärkung der Konservierung von Mikroorganismen, ohne dabei die gut bekannten Gefrier-, Gefriertrocknungs- oder Mikroverkapselungstechniken zur Anwendung zu bringen.
So beschreibt beispielsweise das US-Patent Nr. 4 308 287 (Kahn und Eapen) die Verwendung eines Salzes zur Konservierung von Mikroorganismen ohne Gefrierung. In diesem Patent ist ein Verfahren zur Verstärkung der Konservierung von Joghurt (enthält säureproduzierende Bakterien) durch Verwendung von Chininsalzen beschrieben.
Die Verwendung eines Salzes zur Konservierung wird in der Literatur auch von Smith, Benedict und Palumbo beschrieben, man vergleiche "Protection Against Heath Injury in Staphylococcus aureus by Solute", Journal of Food Protection, Band 45, Nr. 1, Seiten 54 bis 58 (Januar 1982). In diesem Artikel ist die Verwendung von Salzen, wie beispielsweise Natriumcitrat, KCl, NaNO&sub3;, Na&sub2;SO&sub4;, Na&sub2;HPO&sub4;, NH&sub4;Cl, CaCl&sub2; und LiCl, zum Schutz vor Hitzeschäden beschrieben, wobei auch die Zahl der geschädigten S.Aureus-Zellen während eines 90 minütigen Erhitzungszeitraumes bei 49ºC gleichzeitig abnimmt.
Die Lagerung bei 4º C von Suspensionen von Streptococcus lactis E und S. cremoris unter Verwendung von Lactose als Träger ist beschrieben in Cowell, Koburger und Weese, "Storage of Lactic Streptococci. I. Effect of pH on Survival and Endogeneous Metabolism in Phosphate Buffer", West Virginia University Agricultural Experiment Station, Paper No. 859, Seiten 365 bis 369 (Januar 1966). Wie jedoch aus der Fig. 2 auf Seite 366 dieser Literaturstelle entnommen werden kann, beginnt eine Abnahme der Aktivität oder Lebensfähigkeit nach etwa 5 Tagen und wird nach 10 Tagen stark ausgeprägt, selbst wenn die lactosehaltige Suspension beim optimalen pH-Wert von 8,5 gepuffert ist. Somit offenbaren auch Cowell et al nicht, wie eine konstante Lebensfähigkeit zur Lagerung von säureproduzierenden Bakterien bei einer Temperatur oberhalb des Gefrierpunktes aufrechterhalten werden kann. Sie zeigen vielmehr, daß eine Pufferung bei einem pH-Wert von 8,5 zu einer Reduktion hinsichtlich des Verlustes der Lebensfähigkeit bei der Lagerung von lactosehaltigen Suspensionen von Bakterien bei 4º C führt.

Zusammenfassung der Erfindung

Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Konservierung säureproduzierender Bakterien bereitgestellt, bei dem die Bakterien in eine stabilisierende Menge einer gepufferten wässrigen Lösung gegeben werden, die frei von einem Träger ist, bei dem es sich um ein spezifisches Substrat für die Bakterien handelt.

Vorteile der Erfindung

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Stabilisierung oder Konservierung von säureproduzierenden Bakterien bereitzustellen. Die Konservierung kann bei Temperaturen unterhalb des Gefrierpunktes erfolgen. Es ist jedoch Aufgabe der vorliegenden Erfindung, daß das Verfahren die Lagerung der Bakterien bei Temperaturen oberhalb des Gefrierpunktes möglich macht.
Aufgrund der äußerst vorteilhaften Tatsache, daß die Standardtechniken des Gefrierens gemäß dem Stand der Technik vermieden werden, können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sowohl Zeit als auch Geld gespart werden. Es versteht sich von selbst, daß keine Auftauzeit benotigt wird, wenn die Bakterien bei Temperaturen aufbewahrt werden, die oberhalb des Gefrierpunktes liegen. Ferner können große Kosteneinsparungen dadurch erzielt werden, daß es nicht nötig ist, teuren flüssigen Stickstoff zur Anwendung zu bringen, denn letzterer ist das typische Gefrieragens, das gemäß dem Stand der Technik Anwendung findet. Außerdem gehen von dem Gefrier-Auftauzyklus keine Belastungen aus, durch die der Tod von einigen der Bakterienzellen beim Gefrieren und der Tod von weiteren Zellen beim Auftauen verursacht werden. Da die Kulturen bereits suspendiert sind, wird außerdem die Notwendigkeit vermieden, eine aufgetaute Kultur zu lösen, um sie einsetzen zu können. Zum Schluß sei noch angeführt, daß alle diejenigen Probleme, die bei der Lagerung im gefrorenen Zustand auftreten, vermieden werden können, da die Kulturen, die gemäß der erfindungsgemäßen Technik konserviert werden, nicht eingefroren werden müssen, obgleich sie jedoch gefroren werden können. Die Kulturen können vielmehr bei Temperaturen oberhalb des Gefrierpunktes, vorzugsweise bei in etwa 4º C, oder sogar bei höheren Temperaturen, wie beispielsweise Raumtemperatur oder darüber, gelagert werden. Bei den Temperaturen oberhalb des Gefrierpunktes werden die Bakterien im wesentlichen ihre Lebensfähigkeit behalten, wobei die Gesamtzahl der möglichen Lagertage im allgemeinen abnimmt, wenn die Temperatur zunimmt. Mit dem Ausdruck, daß "die Lebensfähigkeit im wesentlichen beibehalten wird", soll zum Ausdruck gebracht werden, daß während der Lagerzeit oberhalb 0º C jede Änderung der Zahl der Zellen innerhalb eines Faktors von 10 und somit innerhalb des experimentellen Fehlers liegt. Bei Temperaturen bis zu 37º C wird die Lebensfähigkeit für mindestens 6 Tage im wesentlichen beibehalten. Bei einer vorteilhaften Ausführungsform behalten die Bakterien im wesentlichen ihre Lebensfähigkeit, wenn sie bei etwa 4º C während eines Zeitraumes von 10 Tagen, 20 Tagen oder sogar längere Zeitperioden von 2 Monaten oder mehr gelagert werden.

Auführliche Beschreibung der Erfindung

Bei den Mikroorganismen, die gemäß der vorliegenden Erfindung in einer gepufferten Lösung stabilisiert werden, handelt es sich um Bakterien, die eine Säure produzieren. Die Bakterienzellen werden in einem geeigneten Wachstumsmedium kultiviert und dann gemäß Standardtechniken geerntet, wie beispielsweise durch Ultrafitration und/oder durch Zentrifugieren. Bevor die Kultur der Bakterienzellen in die gepufferte Lösung gegeben wird, sollte die Konzentration der Kultur auf die jeweils gewünschte Zahl der Zellen eingestellt werden.
Eine gepufferte Lösung oder Suspension wird ausgehend von Wasser und einem oder mehreren Pufferagens bzw. Pufferagentien hergestellt. Zellen von säureproduzierenden Bakterien werden mit diesem gepufferten Medium vermischt. Die Bakterien können in alternativer Weise in H&sub2;O gegeben werden. Es schließt sich dann die Zugabe eines Pufferagens an. Insbesondere kann ein Träger eingesetzt werden, um der Bakterien enthaltenen gepufferten Lösung oder Suspension eine Textur zu verleihen. Der Träger hilft dabei, die Bakterien dispergiert zu halten. Die Tendenz der Bakterien, sich auf dem Boden des Behälters, der die Lösung enthält, abzusetzen, wird dadurch verringert.
Wird ein Träger eingesetzt, dann darf es sich nicht um ein spezifisches Substrat für das zu stabilisierende, bestimmte säureproduzierende Bakterium handeln. Mit dem Ausdruck, daß der erfindungsgemäß eingesetzte Träger "kein Substrat ist", soll zum Ausdruck gebracht werden, daß der Träger im wesentlichen durch das säureproduzierende Bakterium nicht fermentierbar ist. Es findet daher im wesentlichen keine Säureproduktion statt. Bestimmte Stärken oder fermentierbare Zucker, die gemäß dem Stand der Technik als Träger eingesetzt werden, stellen spezifische Substrate für säureproduzierende Bakterien dar. Obwohl säureproduzierende Bakterien in Anwesenheit dieser Stärken oder fermentierbaren Zucker gedeihen, tritt eine Fermentation des Substrats durch die Bakterien ein, wodurch bewirkt wird, daß Säure produziert wird. Dadurch wird jedoch der pH-Wert reduziert und eine Schädigung der Bakterienzellen verursacht.
Es ist insbesondere zweckmäßig die Bakterien in einer gepufferten wässrigen Lösung zu konservieren, die einen Träger in einer Menge von 0,1 bis 10 % Gewicht/Volumen, vorzugsweise 0,2 bis 2 %, enthält. Bei dem Träger handelt es sich um kein spezifisches Substrat für die Bakterien, die konserviert oder stabilisiert werden. Gepufferte wässrige Lösungen können alleine eingesetzt werden. Es ist jedoch zweckmäßig, einen Träger in die gepufferte Lösung einzuverleiben, um eine Textur bereitzustellen und die Bakterienzellen in Suspension zu halten, obgleich die Stabilität der Bakterien, die lediglich mit einer gepufferten Lösung versetzt werden, geringfügig besser sein könnte. Der im Rahmen de vorliegenden Unterlagen verwendete Ausdruck "Suspension" bezeichnet wahre Suspensionen und/oder einen physikalischen Zustand der von einigen als Dispersion angesehen werden könnte. Der Ausdruck "Suspension" oder " Dispersion" umfaßt auch solche Situationen, in denen sich die Bakterien auf dem Boden des Containers abgesetzt haben. Der Träger, das Pufferagens, H&sub2;O und das Bakterium bzw. die Bakterien, können beliebiger Reihenfolge zusammengegeben werden. Wird ein Träger zur Anwendung gebracht, dann ist er zweckmäßigerweise ausgewählt unter einem genießbaren Material, wie Seetangderivaten, bei spielsweise Karrageen und Natriumalginat. Weitere zweckmäßige Träger sind Pektin, Guargummi, Johannisbrotgummi, Xanthangummi, ein Polyol, ein nicht fermentierbarer Zucker oder eine genießbare Zellulose. Diese Träger sind alle sogenannte "Gras"-Träger iind werden von der US Food and Drug Administration als sicher angesehen. Bevorzugte Träger sind Natriumalginate, Cellulosederivate und Polyethylenglycol (PEG).
Der pH-Wert wird erfindungsgemäß mit einem oder mehreren Pufferagentien in der Nähe des Neutralpunktes gehalten. Der bevorzugte pH-Bereich reicht voii in etwa 6,0 bis in etwa 8,0. Vorzugsweise liegt der pH-Wert zwischen 6,4 und 7,6. Es kann jedes Pufferagens zur Anwendung gebracht werden, das den pH- Wert in der Nähe des Neutralpunktes hält, solange es keine Produktion einer wesentlichen Menge einer Säure verursacht. Mit anderen Worten, jedes Agens kann zur Anwendung gebracht werden, bei dem es sich um kein spezifisches Substrat für die Bakterien handelt. Die bevorzugten Pufferagentien sind Phosphatpuffer, wie Diammoniumphosphat, Dinatriumhydrogenphosphat oder Mischungen davon. Magnesiumphosphat, Magnesiumammonium phosphat und Diammoniumbicarbonat können ebenfalls als vorteilhafte Pufferagentien eingesetzt werden. Die gepufferte wässrige Lösung enthält typischerweise 0,2 bis 5 % Gewicht /Volumen des Pufferagens.
Gewünschtenfalls können auch Agentien, wie Antioxidantien, Schimmelinhibitoren und/oder Salze, vorhanden sein. Derartige Agentien beeinflussen die Lebensfähigkeit bei der Lagerung der Mikroorganismen nicht oder nur geringfügig. Diese Agentien können in einer Menge von 0,1 bis 5 % Gewicht/Volumen, vorzugsweise 0,2 bis 2 % G/V des zusätzlichen Agens zur gepufferten Lösung hinzugegeben werden. In typischer Weise wird eine geringe Menge Natriumbenzoat hinzugegeben, um das Auftreten von Schimmel oder Pilzen zu verhindern. Es kann auch eine geringe Menge des organischen Salzes, Natriumcitrat, hinzugegeben werden, um dabei behilflich zu sein, den osmotischen Druck innerhalb der Zelle aufrechtzuerhalten. Sollte die Lagerzeit um einige Tage reduziert werden, wird dies gewöhnlich durch den Vorteil des Agens, d.h. die Verhinderung von Schimmel, ausgeglichen.
Bei den Mikroorganismen, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren aufbewahrt bzw. konserviert werden, handelt es sich um säureproduzierende Bakterien. Derartige Bakterien besitzen im allgemeinen die Fähigkeit, einfache Kohlenhydrate zu fermentieren, beispielsweise Lactose oder Glucose, wobei Milchsäure zumindest ein und im allgemeinen das häufigste Fermentationsprodukt darstellt. Zu derartigen säureproduzierenden Bakterien gehören Leuconostoc cremoris, Streptococcus lactis, S. cremoris, S. diacetylactis, S. thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, L. acidophilus, L. helveticus , L. bifidus, L. casei, L. lactis , L. plantarum, L. delbrueckii , L. thermophilus , L. fermenti und Pediococcus cerevisiae. Bevorzugte Lactobazilli sind Lactobacillus acidophilus, L . lactis, L . planta um oder Leuconostoc cremoris. Das milchsäureproduzierende Bakterium, L. plantarum, wird in den folgenden Beispielen eingesetzt.

Spezifische Beispiele

Die nachstehenden Beispiele der vorliegenden Erfindung dienen lediglich zu Erläuterungszwecken und stellen keine Einschränkung der Ansprüche dar. Der in diesen Beispielen eingesetzte Stamm Lactobacillus plantarum ist in der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, unter der Registriernummer ATCC 39542 hinterlegt. Der Stamm wurde wie folgt bezogen und konzentriert:
Lebensfähige Zeilen von L. plantarum wurden in einem Wachstumsmedium auf Basis hydrolisierter Milch kultiviert, das mit Dextrose, Hefeextrakt und Mineralsalzen verstärkt war. NH&sub4;OH wurde hinzugegeben, um den pH-Wert während der Kultivierung bei in etwa 6,5 zu halten. Es wurde 16 bis 24 h bei 37 ºC inkubiert. Dann wurde die Kultur durch Zentrifugieren unter Verwendung eines Schlammseparators geerntet, wobei ein Zellbrei gesammelt wurde. Ein Schlammseparator ist eine Drehtrommel mit übereinander angeordneten Platten, so daß eine kontinuierliche Filtration ermöglicht wird, wobei Mutterflüssigkeit, nicht verwendetes Wachstumsmedium und metabolische Nebenprodukte im Ablaufstrom entfernt werden. Der Zellbrei wurde dann mit einer physiologischen Kochsalzlösung oder Peptonwasser, die jeweils eine Waschlösung mit einem neutralen oder fast neutralen pH- Wert darstellen, gespült. Derartige Waschlösungen sind im Stand der Technik zu Verwendung beim Spülen einer geernteten Kultur von Bakterienzellen gut bekannt. Sie unterstützen die Entfernung von Restmaterial, das vom Kulturmedium stammen kann. Die Filtrierung wurde fortgesetzt, um die frisch geerntete Kultur von Zellen auf diejenige Zahl von Zellen zu konzentrieren, die für die nachstehenden Beispiele gewünscht wurde. Die Zahl der Zellen, die als Maß für die Lebensfähigkeit diente, wurde in CFU/ml (colony forming units per mililiter; koloniebildende Einheiten pro Milliliter) gemessen und wie folgt bestimmt:
Unter Verwendung steriler Pipetten wurden Proben von jeweils 1,0 ml in Röhrchen überführt, von denen jedes 10 ml kaltes, (2 ºC bis 5 ºC) steriles destilliertes Peptonwasser (0,1 %) G/V enthielt. Die Proben wurden mit einem Vortex-Rührer mit niedriger Geschwindigkeit gerührt, um eine geeignete Mischung zu erhalten. Es wurden verschiedene Verdünnungen in dem sterilen 0,1 % G/V Peptonwasser durchgeführt Verdünnungen wurden in zweifacher Ausführung auf APT Agarplatten gegeben (APT = All Purpose Tween medium from Difco (Tween-medium für alle wecke von Difco)). Die Platten wurden 48 h bei 37 ºC anerob inkubiert. Die CFU pro ml wurde unter Verwendung eines automatischen Quebec Koloniezählers bestimmt. Jede distingte Kolonie auf der Agarplatten zeigt die Anwesenheit, eines einzelnen Organismus von den Proben an. Eine Zählung der Bakterienkolonien zeigt somit, die Gesamtzahl der in der Probe vorhandenen Organismen an.

Beispiel I

Ein Puffer wurde hergestellt, indem 2,8 g (NH&sub4;)&sub2;HPO&sub4; in 100 ml Wasser gegeben wurden. Dazu wurde 0,7 g Natriumalginat hinzugefügt. Es wurde eine Vorratslösung mit einem pH-Wert von 7,0 erhalten. Anschließend wurden 15 ml einer konzentrierten frisch geernteten Kultur von Lactobacillus plantarum mit einer gewünschten Zellkonzentration in einer geringen Menge der so hergestellten Vorratslösung unter Rühren suspendiert. Es wurde weitere Vorratslösung bis zu einem Gesamtvolumen von 50 ml hinzugegeben, wobei die erhaltene bakterielle Suspension einen pH-Wert von 7,6 besaß. Die Zahl der Zellen wurde in der oben beschriebenen Weise bestimmt. Die Stabilitätsdaten sind in der nachstehenden Tabelle I wiedergegeben. Tabelle I Die Suspension des Beispiels I wurde bei 4 ºC und 22 ºC gelagert. Lagerung bei 4 ºC Tage Zahl der Zellen (CFU/ml) % Verlust Faktor von 10 Verlust Tabelle 1 (Fortsetzung) Lagerung bei einer Temperatur von 22 ºC Tage Zahl der Zellen (CFU/ml) % Verlust Faktor von 10 Verlust
Aus den Daten der Tabelle I kann entnommen werden, daß die Lebensfähigkeit während einer Lagerung bei 4º im wesentlichen beibehalten wurde. Nach 54 Tagen wurde kein Verlust der Lebensfähigkeit beobachtet, da die Zahl der Zellen im wesentlichen konstant war, d.h. innerhalb eines Faktors von 10. Es wurde nicht einmal ein prozentualer Verlust festgestellt. Nach 6 Tagen bei einer Temperatur von 22 ºC konnte ein gewisser prozentual er Verlust der Lebensfähigkeit beobachtet werden. Es wurde jedoch kein Verlust in der Größenordnung eines Faktors von 10 beobachtet, da die Zahl der Zellen immer noch 10¹&sup0; betrug. Ein Verlust der Lebensfähigkeit um einen Faktor von 10, d.h. eine Reduktion der Zahl der Zeilen von 10¹&sup0; auf 10&sup9; trat erst nach 15 Tagen auf.

Beispiel II

25 ml von konzentriertem, frisch geerntetem, gewaschenem Lacotbacillus plantarum wurden mit 75 ml einer Lösung von 5,0 % Gewicht/Volumen Diammonumphosphatpuffer vermischt. Das er haltene Gesamtvolumen von 100 ml wurde bei verschiedenen Temperaturen gelagert. Die Zahl der Zellen wurde auf die gleiche Weise wie oben beschrieben, bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle II zusammengefaßt. Tabelle II Die Suspension des Beispiels 2 wurde bei Temperaturen von 4 ºC, 22 ºC, 32 ºC und 37 ºC gelagert. Lagerung bei einer Temperatur von 4 ºC Tage Zahl der Zellen (CFU/ml) % Verlust Faktor von 10 Verlust
Aus der Tabelle II kann entnommen werden, daß eine gute Stabilität bei Verwendung eines Puffers erhalten werden kann, wobei kein Träger wie PEG oder Natriumalginat vorhanden ist. Die Lebensfähigkeit wurde im wesentlichen beibehalten, da bei, einer Lagertemperatur von 4 º für immerhin 47 Tage und bei einer Lagertemperatur von 22 ºC für immerhin 26 Tage weder ein Prozentverlust noch ein Verlust um einen Faktor von 10 beobachtet werde. Bei, 32 ºC trat, ein Verlust, um einen Faktor von 10 erst nach 18 Tagen und bei 37 ºC erst nach 11 Tagen auf.

Beispiel III

Ein Puffer wurde hergestellt, indem 5 g (NH&sub4;)&sub2;HPO&sub4; mit 100 ml Wasser vermischt wurden. Dazu wurde 1 g PEG 3000, 1 g Natriumbenzoat und 0,17 g Natriumcitrat gegeben. Dann wurden 25 ml konzentriertes, frisch geerntetes ungewaschenes Lactobacillus plantarum mit dieser Lösung von Diammoniumphosphat, Polyethylenglycol 3000 (3000 ist das durchschnittliche Molekulargewicht), Natriumbenzoat und Natriumcitrat vermischt und bei verschiedenen Temperaturen gelagert. Die Zahl der Zellen wurde, wie oben beschrieben, bestimmt. Die Ergebnisse dieses Beispiels sind in der nachstehenden Tabelle III zusammengefaßt. Tabelle III Die Suspension des Beispiels III wurde bei 32 ºC und 37 ºC gelagert. Lagerung bei, einer Temperatur von 32 ºC Tage Zahl der Zellen (CFU/ml) % Verlust Faktor von 10 Verlust Lagerung bei einer Temperatur von 37 ºC Tage Zahl der Zellen (CFU/ml) % Verlust Faktor von 10 Verlust
Aus den Daten in der Tabelle III kann entnommen werden, daß die Lebensfähigkeit bei 32 ºC länger als 10 Tage im wesentlichen beibehalten wurde, wobei ein Verlust um den Faktor von 10 erst nach 19 Tagen beobachtet wurde. Bei einer höheren Temperatur, nämlich bei einer Temperatur von 37 ºC trat ein Verlust um einen Faktor von 10 hinsichtlich der Zahl der Zellen nach 6 Tagen auf.

Beispiel IV

Das in Beispiel I beschriebene Verfahren wurde wiederholt, wobei jedoch zur Verhinderung von Schimmel Natriumbenzoat in einer Menge von 1 % Gewicht/Volumen zu der Lösung von Natriumalginat und Diammoniumphosphat hinzugegeben wurde. Dann wurde die so hergestellte Lösung zum Suspendieren des Lactobacillus plantarum verwendet,. Es wurde im wesentlichen keine Veränderung der Lebensfähigkeit im Vergleich mit den zu den in der Tabelle I zusammengefaßten Daten festgestellt, in welcher Daten aufgeführt sind, die Kultursuspensionen betreffen, die keinen Schimmelinhibitor enthielten.
Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß das Beispiel I die Ausführungsform unter Verwendung einer Pufferlösung beschreibt, die Natriumalginat als Träger enthält. Tabelle II erläutert die Verwendung einer Pufferlösung ohne einen Träger. Ist jedoch kein Träger vorhanden, um eine gewisse Textur zu vermitteln, dann neigen die Bakterien dazu, aus der Suspension auszufallen. Es wäre somit schwierig, dieses Produkt zu verabreichen, beispielsweise in oraler Form an Ackertiere. Tabelle III erläutert die Verwendung einer gepufferten Lösung, die PEG als Träger zusammen mit den gewünschtenfalls vorhandenen, die Stabilität stärkenden Agentien, beispielsweise Natriumbenzoat und Natriumcitrat, enthält
Wie aus den obigen Beispielen in I und II entnommen werden kann, tritt kein Verlust hinsichtlich der Lebensfähigkeit auf, wenn das Lactobacillus plantarum bei 4 ºC, gelagert wird, selbst dann, wenn die Lagerung über einen Zeitraum von 54 bzw. 47 Tagen erfolgt. Außerdem hat die Verwendung von einem oder mehreren gewünschtenfalls eingesetzten Agentien, d.h. Natriumbenzoat oder Natriumcitrat, nur einen geringen Effekt auf den Verlust an Lebensfähigkeit, wie dies aus dem Beispiel 3 ersichtlich ist.

Claims

1. Verfahren zur Konservierung säureproduzierender Bakterien, worin die säureproduzierenden Bakterien in einer stabilisierenden Menge einer gepufferten wässrigen Lösung suspendiert werden, die ein Pufferagens und Polyethylenglycol als einen zellstabilisierenden Träger in einer Menge von 0,1 bis 10 % Gewicht/Volumen enthält, wobei diese Lösung frei von einem spezifischen fermentierbaren Substrat für die Bakterien sind, wodurch eine Bakteriensuspension mit einer gesteigerten Lebensfähigkeit erhalten wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die erhaltene Bakteriensuspension einen pH-Wert zwischen in etwa 6,0 und in etwa 8,0 besitzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Bakterien Milchsäure produzierende Bakterien sind, die aus einer frisch geernteten Kultur stammen.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin diese frisch geerntete Kultur mit einer Waschlösung gespült wird, bevor die Bakterien in die gepufferte wässrige Lösung gegeben werden.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Pufferagens in der gepufferten Lösung Diammoniumphosphat, Dinatriumhydrogenphosphat, Diammoniumbicarbonat oder eine Mischung davon ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin ein weiteres Agens zum Einsatz gebracht wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antioxidantien, Schimmelinhibitoren und Salzen.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin der Schimmelinhibitor aus 0,1 bis 5 % Gewicht/Volumen Natriumbenzoat und das Salz 0,1 bis 5 % Gewicht/Volumen Natriumcitrat sind, bezogen auf die gepufferte Lösung.

8. Zusammensetzung, die eine Suspension von lebensfähigen säureproduzierenden Bakterien und eine gepufferte wässrige Lösung aufweist, die ein Pufferagens und Polyethylenglycol als zellstabilisierenden Träger in einer Menge von 0,1 bis 10 % Gewicht/Volumen enthält, wobei diese Lösung frei von einem spezifisch fermentierbaren Substrat für die Bakterien ist,

9. Zusammensetzung nach Anspruch 8, in der diese Suspensionen einen pH-Wert von in etwa 6,0 bis in etwa 8,0 besitzt, wobei dieser pH-Wert mit einem Pufferagens eingestellt wird, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Diammoniumphosphat, Dinatriumhydrogenphosphat, Diammoniumbicarbonat und Mischungen davon und wobei diese Bakterien ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Leuconostoc cremoris, Streptococcus lactis, S. cremoris, S. diacetylactis, S. thermophilus, Lactobacillus bulgaricus , L. acidophilus, L. helveticus , L. bifidus, L. casei , L. lactis, L. plantarum, L. delbrueckii L. thermophilus, L. fermenti und Pediococcus cerevisiae.