DE60010887T2

DE60010887T2 - Verwendung von Hefen, die kein Laktat assimilieren zur Verbesserung der aerobenStabilität von Silage

Info

Publication number: DE60010887T2
Application number: DE60010887T
Authority: DE
Inventors: Carol A. Hendrick; Nancy J. Platt; Barbara G. Ruser; Dean A. Hoganson
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Priority date: 1999-07-09
Filing date: 2000-07-07
Publication date: 2005-06-09
Anticipated expiration: 2020-07-08
Also published as: CA2378579A1; WO2001004291A1; DE60010887D1; EP1194541B1; US6489158B1; EP1194541A1; NZ516456A; AU5925000A; CA2378579C; ATE267252T1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ganz allgemein den Silageprozess, Mikroorganismen und Verwendung derselben bei der Behandlung von Tierfuttermittel und Silage zur Verstärkung der aeroben Stabilität, wodurch ein Verderben verhindert wird.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Der Silierungsprozess ist ein Verfahren einer feuchten Futterkonservierung und wird in der gesamten Welt verwendet. Silage liefert mehr als 200 Millionen Tonnen Trockenmaterial, das jährlich nur in Westeuropa und den Vereinigten Staaten gelagert wird. Das Konzept beinhaltet eine natürliche Fermentation, bei der Milchsäurebakterien wasserlösliche Kohlenhydrate unter anaeroben Bedingungen fermentieren, wobei organische Säuren gebildet werden. Dies bewirkt eine Abnahme im pH, der dann schädliche Mikroben hemmt, so dass das feuchte Futter konserviert wird. Das Verfahren kann durch vier verschiedene Phasen charakterisiert werden.
Nach Einschließen in der Lagerungseinheit ist die erste Phase aerob, wenn zwischen den Pflanzenteilchen noch Sauerstoff vorhanden ist, und der pH ist 6,0 bis 6,5. Diese Bedingungen sorgen für fortgesetzte Pflanzenrespiration, Proteaseaktivität und Aktivität von aeroben und fakultativ aeroben Mikroorganismen.
Die zweite Phase ist eine Fermentation bzw. Gärung, die mehrere Tage bis mehrere Wochen, nachdem die Silage anaerob wurde, andauert. Milchsäurebakterien entwickeln sich und werden die primäre mikrobielle Population, wodurch sich Milchsäure und andere organische Säuren entwickeln, die den pH auf 3,8 bis 5,0 senken.
Die dritte Phase ist stabil, wobei wenig Änderungen in den Merkmalen des Futtermittels auftreten, solange verhindert wird, dass Luft in die Lagerungseinheit eintritt.
Die Endphase ist die Entnahme, wenn die Silage endgültig entnommen wird und Luft ausgesetzt wird. Dies führt zu einer Reaktivierung von aeroben Mikroorganismen, in erster Linie von Hefe, Schimmelpilzen, Bazillen und Essigsäurebakterien, die ein Verderben verursachen können.
Die aerobe Instabilität ist das primäre Problem bei der Silageproduktion. Selbst bevor Lagerungseinheiten vor dem Verfüttern geöffnet werden, kann Silage durch Probleme bei der Handhabung Sauerstoff ausgesetzt werden (d.h. schlechte Packung oder schlechte Abdichtung). Unter diesen Typen aerober Bedingungen verursacht ein schnelles Wachstum von Hefen und Schimmel, dass die Silage sich erwärmt und verdirbt, wodurch ihr Nährwert verringert wird.
Aerobe Instabilität kann selbst bei einer beimpften Silage, die das durchgemacht hat, was traditionell als "gute" Fermentationsphase bezeichnet wird, nämlich einen raschen pH-Abfall und einen niedrigen End-pH, ein Problem sein. Die Hefe, die unter diesen Bedingungen zur Instabilität beiträgt, kann eine solche sein, die gegenüber sauren Bedingungen tolerant ist, und die, die während der Fermentation produzierten Milchsäurebakterien metabolisieren kann.
Behandlungstechniken, die eingesetzt werden können um dabei zu helfen, diesen Zustand zu verhindern, beinhalten ein sorgfältiges Packen der Silage, wie auch Sorgfalt während des Silierungsprozesses sowie Sorgfalt bei der Entfernung der Silage zur Fütterung um die Belüftung der restlichen Silage auf ein Minimum zu beschränken.
Die Behandlung bzw. Verarbeitung (Kompaktierung, Entnahmeraten) beeinträchtigt die Sauerstoffbewegung in die Silage stark. Während der Futterentnahme kann Luft 1 bis 2 m hinter die Silagefront eindringen, so dass das Einwirken von Sauerstoff verlängert wird. Fermentationssäure und pH hemmen die Geschwindigkeit des mikrobiellen Wachstums, allerdings werden die Verderbensgeschwindigkeiten bzw. die Raten des Verderbens auch durch die Mikrobenzahl und die Rate des aeroben Mikrobenwachstums an verfügbaren Substraten beeinträchtigt.
Es ist möglich, sowohl chemische als auch biologische Additive bei der Silageherstellung zu verwenden um adäquate Fermentationsmuster, speziell unter suboptimalen Bedingungen, zu begünstigen. Biologische Additive umfassen bakterielle Impfmaterialien und Enzyme. Bakterielle Impfmaterialien haben gegenüber chemischen Additiven Vorzüge, da sie sicher sind, einfach zu verwenden sind, für die Bauernhof-Maschinerie nicht korrosiv sind; sie verunreinigen die Umwelt nicht und werden als natürliche Produkte angesehen. Silage-Impfmaterialien, die in erster Linie homofermentative Milchsäurebakterien enthalten, wurden in vielen Teilen der Welt die dominanten Additive. Ihre Funktion besteht darin, die schnelle und effiziente Ausnutzung von wasserlöslichen Kohlenhydraten im Erntegut zu begünstigen, was zu einer intensiven Milchsäureproduktion und einer schnellen Verringerung im pH resultiert. Impfmaterialien reduzieren auch den aeroben Verderb und verbessern die Tierleistung.
Allerdings traten verschiedene Probleme mit Milchsäurebakterien-Impfmaterialien auf. Diese Probleme umfassen in erster Linie ein Versagen bei der Beherrschung der Fermentation und ein Versagen bei der Inhibierung einer nachteiligen mikrobiellen Aktivität. Weitere Probleme, die mit Milchsäurebakterien-Impfmaterialien in Verbindung stehen, umfassen eine Infektion durch Phagen, den Mangel, auf bestimmtem Erntegut nicht gut zu wachsen, Bakterien, die zum Zeitpunkt der Aufbringung nicht lebensfähig sind, und die epiphytische Natur der Milchsäurebakterien-Population. Da diese Typen an homofermentativen Milchsäurebakterien unerwünschte mikrobielle Aktivität nicht immer verhindern oder verringern, wurden einige neue Ansätze versucht.
Eine Übersicht über den Silageprozess und die Verwendung von Impfmaterialien ist in FMS Microbiology Rev. 19 (1996) 53–68, Weinberg, ZNG., und Muck, RE, "New trends and opportunities in the development and use of inoculants for silage" zu finden.
Das Konzept heterofermentativer Milchsäurebakterien in einem Impfmaterial hat in jüngerer Zeit Vorzug erhalten. Die Idee besteht darin, dass erhöhte Level an undissoziierten flüchtigen Fettsäuren, z.B. Acetat, andere Mikroben inhibieren kann, die eine aerobe Verschlechterung initiieren. Hetero-Gärungserreger haben die Fähigkeit, in Gegenwart von Sauerstoff Milchsäure in Essigsäure umzuwandeln, und das produzierte Acetat kann andere nachteilige Organismen inhibieren. Mit einem derartigen Mechanismus geht ein Drittel der Milchsäure-Trockensubstanz als Kohlendioxid verloren. Allerdings kann ein kleiner Verlust von 1% oder vielleicht bis zu 2% Trockensubstanz leicht viel größere Verluste durch aerobe Mikroorganismen ausgleichen. Bedenken bezüglich heterofermentativer Milchsäurebakterien umfassen Wirkungen auf die Tierleistung, wie auch die Identifizierung geeigneter Stämme, die für das Verfahren einsetzbar sind. Unterschiedliche Stämme selbst derselben Spezies haben keine identischen Eigenschaften und unterscheiden sich in ihren Fermentationsmerkmalen.
Die PCT-Publikation WO 97/29644 offenbart einen einzelnen Lactobacillus buchneri-Stamm (NCIMB 40788), von dem festgestellt wurde, dass er das Wachstum von Verderbnisorganismen bei der Silagelagerung inhibiert. Andere Anstrengungen um heterofermentative Organismen für Silage-Impfmaterialien zu identifizieren, umfassten (Wyss et al., 1991, "Einfluss von Luftstress und die Wirkung von spezifischen Zusätzen auf die aerobe Stabilität von Graswelksilagen", Wirtschaftseigene Futter, 37: 129–141), wobei ein Impfmaterial, das Lactat- und Propionat-produzierende Organismen umfasste, in einer Welkgrassilage verwendet wurde. Weinberg et al. (1995), "The effect of a propionic acid bacterial inoculant applied at ensiling, with oder without lactic acid bacteria on the aerobic stability of Pearl-Millet and maize silages", J. Appl. Bacteriol., 78: 430–436, beschreibt die Verwendung von Propionibacterium shermanii in Hirse-, Mais-, Sorghum- und Weizensilagen. Propionsäure wurde nur in einer Weizensilage produziert, in der die pH-Abnahme verzögert wurde und somit die aerobe Stabilität verbessert wurde. In allen anderen Silagen war die pH-Abnahme schnell und die Propionsäurebakterien konnten sich nicht vermehren.
Ein anderer Ansatz umfasste ausgewählte Stämme von Serratia rubidaea und Bacillus subtilis zusammen mit L. plantarum. Bei Verwendung in Ballengrassilagen verringerte sich die Anzahl an Schimmelpilzen deutlich. Eine gewisse Verbesserung wurde auch bei Ährenkorn hoher Feuchtigkeit beobachtet (Moran et al., (1993), "The development of a novel bacterial inoculant to reduce mold spoilage and improve the Silage fermentation in big bale silage. In: Silage Research 1993, Proceedings of the Tenth International Conference on Silage Research (O'Kiely, P., O'Connell, M. und Murphy, J., Herausg.) S. 85–86, Dublin City University, Irland). Eine ähnliche Zusammensetzung wie die für Ballengrassilage wurde für Weizensilage entwickelt, wobei Pediococcus-Stämme der Zusammensetzung beigefügt wurden. Pediococcus ist fähig, Pentosezucker, welche aus der Hemicellulosehydrolyse in Weizensilagen resultieren, zu fermentieren. In einem einzelnen Versuch mit Weizensilage wurde keine Verbesserung bei der aeroben Stabilität beobachtet.
Der Silierungsprozess ist ein komplexer Prozess und beinhaltet Wechselwirkungen zahlreicher unterschiedlicher chemischer und mikrobiologischer Prozesse. Außerdem zeigen verschiedene Silagen und unterschiedliche Silierungsverfahren eine Vielzahl verschiedener Anforderungen. Wie zu erkennen ist, besteht auf dem Fachgebiet ein Bedarf an einer weiteren Ver besserung bei Zusammensetzungen und Verfahren zur Verbesserung der aeroben Stabilität von Silage.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens und einer Zusammensetzung, die als Impfmaterial verwendet werden kann um die aerobe Stabilität von Silage zu verbessern.
Eine weitere Aufgabe besteht in der Bereitstellung neuer Hefestämme, die in Zusammensetzungen zur Verbesserung der aeroben Stabilität verwendet werden können.
Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Erhöhung der Trockensubstanzwiedergewinnung aus Silage durch Verringerung des aeroben Verderbs.
Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Impfmaterials für ein Additiv zu Silage, das sicher und ungefährlich ist.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer natürlichen Additivzusammensetzung für Silage.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung von Qualitätssilagematerial, was durch Temperatur, pH, Trockenmaterialwiedergewinnung, Stickstoffprofil, Farbe und Mikroorganismenzahl bestimmt wird.
Andere Aufgaben der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der Erfindung deutlich.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Futtermaterialien, die gelagert werden sollen, mit besonderen Hefestämmen ("Killer"-Hefe) behandelt, die das Wachstum von Wildhefen, welche eine aerobe Verschlechterung bewirken, inhibieren. Diese Hefestämme verwerten auch Lactat nicht, wodurch die Futterqualität weiter konserviert wird und eine aerobe Verschlechterung inhibiert oder verzögert wird.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Behandlung von Futtermaterialien unter Verstärkung ihrer Konservierung bereit, das Verabreichung einer wirksamen Menge eines Killer-Hefestamms, seiner funktionellen Äquivalente oder der Futter-konservierenden oder cytotoxischen Zusammensetzungen, die damit produziert werden, an Futtermaterialien bereit. Gemäß der Erfindung wurden verschiedene Mikroorganismenstämme durch 18S rRNA-Sequenzierung derart identifiziert, dass sie zur Klasse Saccharomyces exiguus gehören, nämlich SE24, SE136 und SE151 sind, die bei der ATCC mit den Eingangsnummern 74441, 74442 bzw. 74443 hinterlegt wurden. Gemäß der Erfindung kann ein beliebiger dieser Stämme oder eine Kombination davon eingesetzt werden.
Wie weiter unten detaillierter erläutert wird, haben die erfindungsgemäßen Mikroorganismen einen einzigartigen Effekt, der sich von dem ihrer Nicht-Lactatassimilation unterscheidet und/oder darüber hinausgeht. Die Organismen produzieren antimikrobielle Faktoren, die wahrscheinlich proteinartig sind, die durch ihre Fähigkeit charakterisiert werden, das Wachstum von anderen Hefestämmen, die mit dem Verderb von Silage in Verbindung stehen, oder einer Vielzahl anderer Verderborganismen zu inhibieren.
Diese Substanzen können nach Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, isoliert und gereinigt werden. Die Substanzen als solche können direkt verwendet werden um Tierfutter oder Silage zu behandeln. Mit anderen Worten, es ist möglicherweise nicht notwendig, einen Mikroorganismus als solchen in Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung einzusetzen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist ein Diagramm, das das gesammelte Resultat von sechs Grasfutterversuchen zeigt. Nach den Resultaten verbesserten die Hefestämme der Erfindung allein oder in Kombination mit 1188 die aerobe Stabilität gegenüber 1188-, Kontroll- und anderen bakteriellen Impfmaterial-Behandlungen um 35 bis 60 h.
2 ist ein Diagramm, das die gesammelten Resultate von vier Versuchen mit beimpfter Ganzplanzen-Maissilage zeigt. Die Silage, die mit den Hefestämmen der Erfindung allein oder in Kombination mit 1188 behandelt worden war, hatte eine 20 bis 45 h höhere aerobe Stabilität als Kontrollbehandlungen mit 1188.
3 ist die 18S rRNA-Sequenz der Hefestämme der Erfindung.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Erfindungsgemäß wurden Mikroorganismen isoliert und gereinigt, die die aerobe Stabilität von siliertem Futter verbessern. Es wurden spezifische "Killer-Hefen"-Stämme isoliert, die Lactat nicht assimilieren und die das Wachstum von anderen Hefestämmen, die mit dem Verderb von Silage in Verbindung stehen, inhibieren. Drei Stämme wurden identifiziert, SE24, SE136 und SE151; die 18S rRNA-Sequenzierung zeigt an, dass sie Saccharomyces exiguus sind. Diese Stämme wurden bei der ATCC mit den Eingangsnummern 74441, 74442 bzw. 74443 hinterlegt. Außerdem wurde die 18S rRNA-Region, die diesen Stämmen gemeinsam ist, sequenziert, was bei der Identifizierung anderer Stämme hilft, die wahrscheinlich ähnliche Aktivität aufweisen. Der Ausdruck "im Wesentlichen äquivalent", wie er hier verwendet wird, soll eine Nukleotidsequenz bezeichnen, die zu der Sequenz hier eine Komplementarität oder Homologie von etwa 80 bis 99,9% hat, wobei eine Komplementarität oder Homologie von mindestens 90% bevorzugt ist, wie sie durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, bestimmt wird; der Ausdruck soll auch solche Sequenzen beinhalten, die in 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,5M NaPO₄, pH 7,0, 1 mM EDTA bei 50°C und Waschen mit 1% SDS bei 42°C an die fragliche Sequenz hybridisieren wird.
Wenn nichts anderes angegeben ist, beziehen sich hierin angegebene Werte für die Sequenzidentität/Ähnlichkeit auf den Wert, der unter Verwendung der Programme der BLAST 2.0-Folge unter Anwendung von Fehlerparametern erhalten wird. Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389–3409 (1997). Software zur Durchführung von BLAST-Analysen ist allgemein verfügbar, z.B. durch the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlin.nih.gov/). Dieser Algorithmus involviert zuerst ein Identifizieren von "high scoring sequence pairs (HSPs)", indem kurze Wörter W in der Quary-Sequenz identifiziert werden, die mit dem positiv bewerteten Schwellenwert T übereinstimmen, wenn sie mit einem Wort derselben Länge in einer Datenbanksequenz angeordnet werden. T wird als der Nachbarwort-Schwellenwert bezeichnet (Altschul et al., oben). Diese anfänglichen Nachbarworttreffer wirken als Samen zur Initiierung von Suchen nach längeren HSPs, die diese enthalten. Die Worttreffer werden dann in beiden Richtungen entlang jeder Sequenz so weit ausgedehnt, wie der kumulative Anordnungsbereich erhöht werden kann. Kumulative Treffer bzw. Punktwerte werden für Nukleotidsequenzen errechnet, indem die Parameter M (positive Punktbewertung für ein Paar übereinstimmender Reste; immer > 0) und N (Strafpunkt für nicht übereinstimmende Reste; immer < 0) verwendet werden. Für Aminosäuresequenzen wird eine Punktbewertungsmatrix verwendet um die kumulative Bewertung zu errechnen. Die Ausdehnung der Worttreffer in jeder Richtung wird angehalten, wenn: die kumulative Anordnungsbewertung um die Menge X vom erreichten maximalen Wert abfällt; die kumulative Punktbewertung nach 0 oder darunter geht, und zwar infolge der Akkumulierung von Anordnungen mit einem oder mehreren Resten mit negativer Bewertung; oder das Ende der jeweiligen Sequenz erreicht ist. Die BLAST-Algorithmus-Parameter W, T und X bestimmen die Empfindlichkeit und die Geschwindigkeit der Anordnung. Das BLASTN-Programm (für Nukleotidsequenzen) verwendet als Fehler eine Wortlänge (W) von 3, eine Erwartung (E) von 10 und die BLOSUM62-Punktbewertungsmatrix (siehe Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915).
Weitere bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind Polynukleotide, die zu mehr als 79%, vorzugsweise mindestens 80%, bevorzugter mindestens 85%, mit einem Polynukleotid der Erfindung identisch sind. Unter diesen besonders bevorzugten Polynukleotiden sind die mit 90%, 95%, 98% oder mindestens 99% besonders bevorzugt.
In der vorliegenden Erfindung wird die Inhibierung von Organismen, die für einen Verderb verantwortlich sind, erreicht, indem die Silage mit Organismen der Spezies Saccharomyces exiguus, speziell mit den Stämmen SE24, SE136, SE151, oder mit Zusammensetzungen, die diese Stämme allein oder in Kombination mit eng verwandten Organismen enthalten, sowie durch Behandlung mit wirksamen Mutanten oder Äquivalenten von SE24, SE136, SE151 und Zusammensetzungen, die dieselben enthalten, erreicht.
Die Zusammensetzungen, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, können entweder in flüssiger oder trockener Form vorliegen und können zusätzliche Bakterienstämme enthalten. In festen Behandlungsformen kann die Zusammensetzung Saccharomyces exiguus zusammen mit einem Träger umfassen. Der Träger kann in seiner Natur eine wässrige oder nicht-wässrige Flüssigkeit oder ein Feststoff sein. In festen Formen kann die Zusammensetzung feste Träger oder physikalische Extender enthalten. Beispiele für solche festen Träger, festen Verdünnungsmittel oder physikalische Extender umfassen Maltodextrin, Stärke, Calci umcarbonat, Cellulose, Molke, vermahlene Maiskolben und Siliciumdioxid. Kurz ausgedrückt, der Träger kann ein organischer oder ein anorganischer physikalischer Extenender sein. Die feste Zusammensetzung kann direkt in Form eines leichten Pulververstäubens auf das Futter aufgetragen werden oder wenn sie in einem flüssigen Träger dispergiert ist, kann sie erfolgreich auf das Futter aufgesprüht werden.
Typische erfindungsgemäße Zusammensetzungen, die zur Behandlung von Silage einsetzbar sind, enthalten 10² bis 10¹² lebensfähige Organismen/g, vorzugsweise 10⁷ bis 10¹⁰ lebensfähige Organismen/g, und bevorzugter 10⁹ bis 10¹⁰ lebensfähige Organismen/g, in löslichen Formulierungen. Für körnige Formulierungen sind 10⁴ bis 10¹⁰ bevorzugt, und am meisten bevorzugt sind 10⁷ bis 10⁸.
Der Behandlungsbereich für eine Silage ist typischerweise 10⁷ bis 10¹⁷ lebensfähige Organismen/Tonne, vorzugsweise 10⁹ bis 10¹⁵ lebensfähige Organismen/Tonne, und bevorzugter 10¹⁰ bis 10¹² lebensfähige Organismen/Tonne.
Der Fachmann auf diesem Gebiet wird andere geeignete Träger und Dosierungsformen kennen oder wird fähig sein, solche unter Verwendung von Routineexperimenten zu ermitteln. Die Stämme können so einzeln oder in Kombination eingesetzt werden um eine Silagequalität-konservierende Menge an Mikroorganismen zu bestimmen, oder um den toxischen Effekt zu bestimmen, der bei Fermentation der Stämme erzeugt wird. Außerdem kann die Verabreichung verschiedener Zusammensetzungen unter Verwendung von Standardtechniken, die dem Fachmann geläufig sind, erfolgen.
Der Ausdruck "Stamm", wie er hier verwendet wird, soll so interpretiert werden, dass er eine Mutante oder ein Derivat der Stämme SE24, SE136, SE151, hinterlegt bei der ATCC mit den Eingangsnummern 74441, 74442, 74443, die/das die funktionelle Aktivität zur Verbesserung der aeroben Stabilität von Futter aufrecht erhält, umfasst, wie es durch die hierin offenbarten Verfahren und Beispiele beschrieben und definiert ist, wobei eine typische Erhöhung der Stabilität etwa 13 bis 51 Stunden länger als eine Kontrolle oder eine Zunahme bei der aeroben Stabilität von etwa 1 bis etwa 10% weniger aerober Verlust bedeutet.
Die erfindungsgemäßen Mikroorganismen wurden aus Grassilage gereinigt und isoliert. Nach ausgiebigem Experimentieren wurden sie nach Testen von Hunderten von Isolaten entdeckt.
Nach Reinigung und Isolierung der spezifischen Stämme wurden taxonomische Studien und eine rRNA-Sequenzierung durchgeführt um die Stämme zu identifizieren. Sie wurden als Saccharomyces exiguus identifiziert, und ihnen wurden die Prototyp-Nummern SE24, SE136 und SE151 gegeben. Gemäß der Erfindung werden diese Stämme, Zusammensetzungen, die diese Stämme umfassen, oder die cytotoxischen Faktoren, die durch diese Stämme produziert werden, zur Behandlung von Futtermaterialien eingesetzt.
Materialien, die zur Silierung oder Lagerung nach den erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, sind beliebige, die für einen aeroben Verderb anfällig sind. Das Material wird üblicherweise mindestens 25 Gew.-% Trockensubstanz enthalten. Solche Materialien umfassen Roggen oder herkömmliches Gras, Mais, einschließlich Mais mit hohem Feuchtigkeitsgehalt, Ganzpflanzenmais, Luzerne, Weizen, Legumen, Sorghum, Sonnenblumen, Gerste oder andere ganze Erntegetreide. Die Silage kann in Ballen (eine Form, die für einen aeroben Verderb besonders anfällig ist), Sauerstoff limitierenden Beuteln, Bunkern, Hochsilos, Sauerstoff-beschränkenden Silos, Beuteln, Haufen oder in jeder anderen Lagerungsform, die für einen aeroben Verderb anfällig sein kann, erfolgen. Alternativ kann die Erfindung mit einem beliebigen anfälligen Tierfutter, ob fest oder flüssig, z.B. für Schweine, Geflügel oder Wiederkäuer, verwendet werden.
Die Aktivität, die mit der vorliegenden Erfindung verbunden ist, kann in anderen Hefestämmen von S. exiguus, und möglicherweise auch in anderen Gattungen, gefunden werden. Auf der Basis der hierin gegebenen Informationen kann dies durch Routineexperimente entwickelt werden.
BEISPIELE
Beispiel 1
Buxtehude-Versuche mit Grassilage
Ein Experiment wurde durchgeführt um Grasfutter mit Hefe, welche "Killer"-Aktivität hat, wie auch mit Bakterien, die Anti-Hefe-Aktivität aufweisen, in Labor-Assays zu inokulieren um so zu bestimmen, ob die aerobe Stabilität der Silage verbessert wird.
Verfahren
Es wurden Versuche in Buxthehude, Deutschland, nach Standardverfahren durchgeführt, welche in europäischen Silage-Forschungsstudien angewendet wurden (siehe Beispiel 3). Gras wurde gehäckselt und mit 32 bis 44,6% Trockensubstanz siliert. PVC-Silos 4" × 14" wurden mit einer Verdichtungsrate von etwa 100 kg Trockensubstanz/m³ und zwei 48 h-Luftinfusionszeiten 4 und 6 Wochen nach Silierung verwendet. Es gab sechs Stellen und zwei Silos pro Behandlung pro Öffnungstag. Die Gesamt-Hefezahlen wurden bestimmt, indem auf Saboraud-Dextroseagar plattiert wurde, und Lactat-assimilierende Hefe wurde durch Plattieren auf Hefe-Stickstoff-Basen-Agar + 1% Natriumlactat bestimmt. Flüchtige Fettsäuren (VFAs) und Ethanol wurden durch HPLC mit Silageextrakten bestimmt.
Beimpfung
1188 war ein handelsübliches Produkt in löslicher Form. Eine gefriergetrocknete Kultur einzelner Bakterienstämme wurde von einem Pionierpflanzen-Vertragshersteller hergestellt. Hefen wurden als frisch gewachsene Kultur verwendet: Jede Hefe war über Nacht in MYPD-Brühe bei 28°C wachsen gelassen und wurde durch Zentrifugation konzentriert und in 10 ml Wasser resuspendiert. Die End-Zellkonkonzentrationen wurden durch Fluoreszenzmikroskopie bestimmt. Auf diese Weise hergestellte Hefesuspensionen waren unter Kühlung bis zu 1 Woche stabil. Die gefriergetrockneten Bakterienbehandlungen wurden vor Anwendung in sterilem Wasser solubilisiert. Alle Behandlungen wurden mit einer 30 cm³-Spritze, die mit einer Nadel Nr. 16 ausgestattet war, mit einer Rate von 1 ml/lb Futter zu einem Endbeimpfungslevel von 1,0 e5 kbE/g aufgebracht. Tabelle 1 fasst die verwendeten Behandlungen zusammen.
Tabelle 1. Beschreibung von Behandlungen
Resultate
Tabelle 2 und 1 zeigen das Gesamtresultat von sechs Versuchen. Allein und in Kombination mit 1188 verbesserten die drei Hefeisolate die aerobe Stabilität im Vergleich zu Behandlungen mit 1188, Kontrolle und anderen bakteriellen Impfmaterialien. Bei Behandlungen nur mit Hefe waren die pH-Level höher, die Lactat/Acetat-Verhältnisse waren verringert und die Ethanollevel waren erhöht, wenn man diese Parameter mit Behandlungen vergleicht, die das Impfmaterial 1188 enthalten. Bei Kombination der Hefe SE24 und SE136 mit 1188 waren die Fermentationsparameter besser als mit Hefe alleine, und die aerobe Stabilität war im Vergleich zu Behandlungen, Kontrolle und 1188 allein, verbessert.
Beispiel 2
Buxtehude-Mais-Ganzpflanzen-Silage-Versuche
Es wurde ein Experiment durchgeführt um Mais-Ganzpflanzenfutter mit Hefe, die "Killer"-Aktivität hat, wie auch mit Bakterien, die Anti-Hefe-Aktivität aufweisen, in Labor-Assays zu beimpfen und so festzustellen, ob die aerobe Stabilität der Silage verbessert ist.
Verfahren Versuche wurden durch die Standardverfahren durchgeführt, welche in europäischen Silage-Forschungsstudien eingesetzt werden (siehe Beispiel 3). Ganze Maispflanzen (Hybrid "Noveta") wurden gehäckselt und mit 28,3 bis 39,5% Trockensubstanz siliert. Es wurden PVC-Silos 4" × 14" mit 50% Verdichtungsrate (etwa 100 kg Trockensubstanz/m³) und zwei 48 h-Zeiträumen mit Luftinfusion 4 und 6 Wochen nach der Silierung verwendet. Es gab vier Stellen und zwei Silos pro Behandlung pro Öffnungstag. Bakterielle und Hefe-Impfmaterialien wurden wie in Beispiel 1 hergestellt. Tabelle 3 fasst die verwendeten Behandlungen zusammen.
Tabelle 3. Beschreibung von Behandlungen
Resultate
Tabelle 4 und 2 zeigen das zusammengefasste Resultat von vier Versuchen. Der niedrige pH (kleiner als 4,3) zeigt, dass in allen Behandlungen eine gute Fermentation erfolgt ist. Die aerobe Stabilität der mit "Anti-Hefe-Bakterien" behandelten Silagen war ähnlich der der unbehandelten Kontrollsilage. Silage, die mit dem handelsüblichen Produkt 1188 behandelt worden war, war in dieser Studie weniger stabil als Kontrollsilage. Eine Mais-Ganzpflanzen-Silage, die allein mit Hefe oder in Kombination mit 1188 behandelt worden war, hatte eine 20 bis 45 h höhere aerobe Stabilität als 1188- oder Kontrollbehandlungen.
Tabelle 4. Resultate des Buxtehude-Mais-Ganzpflanzen-Versuchs: Behandlungs-LS-Mittel, Tag 65 (Over Cuts)
Beispiel 3
US-Gras-Silage-Versuch
Der Zweck dieses Versuchs war es, nach verschiedenen Behandlungen zu suchen, die die aerobe Stabilität von Gras beeinträchtigen könnten. Hefe mit "Killer"-Aktivität wurden zusammen mit einzelnen Bakterienstämmen aus dem handelsüblichen Produkt 1188 getestet. Verfahren Die Versuche wurden in Delevan, Wisconsin, und Elkhorn, Wisconsin, durchgeführt. Weidegras wurde geschnitten und zu 33 bis 34% Trockensubstanz welken gelassen, gehäckselt und in Silos mit Modellgröße siliert. Bakterielle und Hefe-Impfmaterialien wurden hergestellt, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Die Behandlungen sind in Tabelle 5 zusammengefasst.
Tabelle 5 Beschreibung der Behandlungen
Packung
Für jede Behandlung wurden zwei experimentelle Standard-PVC-Silos mit 4" × 14" mit etwa 230 kg TM/m³ gepackt. Das Futter wurde mit einer hydraulischen Presse zu einer Standarddichte gepresst. Die Silos waren an jedem Ende mit Fernco-Schnellkappen versehen; die obere hatte ein Bunsenventil um Gas entweichen zu lassen. Nach dem Füllen der Silos wurden sie in einem Raum mit kontrollierter Umgebung (etwa 72°F) gehalten, bis sie geöffnet wurden.
Analysen
Während jedes Versuchs wurden vier vorsilierte, nicht beimpfte Futterproben zur pH-Analyse und zur mikrobiellen Analyse entnommen. TM wurde bestimmt, indem etwa 150 g Futter für 72 Stunden in einem 55°C-Ofen getrocknet wurden. Der pH wurde nach Aufschließen von 11 g Futter mit 99 ml sterilem, entionisiertem Wasser in einem "Stomacher" bestimmt. Eine VFA-Analyse erfolgte durch HPLC mit den filtrierten Wasserextrakten der Silage.
Am Tag 92 wurden die Silos geöffnet, dann entleert und gemischt. Proben wurden für eine pH-, TM-Analyse und eine Analyse auf aerobe Stabilität entnommen. Die aerobe Stabilitiät wurde bestimmt, indem 2,5 lb Silage in einen mit Kunststoff ausgekleideten Polystyrolkühler gegeben wurden und eine Temperatursonde in die Mitte der Silagemasse gebracht wurde. Die Kühler wurden in einem temperaturregulierten Raum gehalten. Umgebungstemperatur und Silagetemperatur wurden alle drei Stunden für eine Woche gemessen und mit einem Datenerfassungsgerät aufgezeichnet. Der ROT-Wert für die Silage war als die Zeit in Stunden definiert, die benötigt wird, bis sich die Silagetemperatur auf 1,7°C über Umgebungstemperatur erhöht. Cumm_DD ist die Integration der Fläche zwischen der Kurve der tatsächlichen Temperatur und einer Linie, die bei Umgebungstemperatur gezogen wurde.
Resultate Tabelle 6 zeigt die gesammelten Resultate von zwei Versuchen. SE24 verbesserte die aerobe Stabilität (höherer ROT-Wert, niedrigerer Cumm_DD-Wert) in Grassilage, und zwar allein und in Kombination mit zwei L. plantarum-Stämmen. In geringerem Ausmaß wurde die aerobe Stabilität auch verbessert, wenn SE24 mit einem E. faecium-Stamm vermischt wurde. In Behandlungen, die die Hefestämme enthalten, waren im Vergleich zu einer 1188-behandelten Silage am Tag 92 die pH-Werte höher und die Lactat/Acetat-Verhältnisse niedriger. Wenn allerdings SE24 mit einem, L. plantarum-Stamm vermischt wurde, waren die pH-Werte für Grassilage annehmbar niedrig (4,5 oder weniger) und die aerobe Stabilität war gegenüber einer Behandlung mit 1188, der Kontrolle und L. plantarum allein verbessert.
Tabelle 6.
Resultate einer US-Gras-Silage-Studie, Tag 92. LS-Mittel von zwei Orten, zwei Silos pro Ort.
Beispiel 4
Protokoll zur Bestimmung der aeroben Stabilitäts
BESTIMMUNG EINES AEROBEN VERSCHLECHTERUNGSSYSTEMS VÖLKENRODE
H. Honig
Das System basiert auf der linearen Korrelation, die zwischen einer Temperaturerhöhung und der Intensität der CO₂-Produktion besteht, welche wiederum über die Respirationsformel in TM-(Glucose)-Verluste transformiert werden kann. Die später angegebenen Umwandlungsfaktoren beziehen sich auf die hierin verwendete Testeinstellung. Eine höhere Isolierung und größere Futtermengen werden bei den gleichen Verlusten einen höheren Temperaturanstieg ergeben.
Behälter
1 l-Aluminiumdosen, 100 mm Durchmesser, 150 mm hoch, überzogen mit einer Kunststofffolie, im Dosenboden und der Überzugsfolie ein Loch mit einem Durchmesser von 10 mm, 60 mm Styroporschaumisolierung an den Seiten, 30 mm oben und am Boden.
Gasfluss
Ein Gasflusswert wird durch die Differenz im spezifischen Gewicht von CO₂, das während des Verfahrens gebildet wird, und der umgebenden Luft sichergestellt. Der Lochdurchmesser ist für den notwendigen Gasaustausch ausreichend, wie es durch Vergleichsmessungen mit dem "Sapromat-System" gezeigt wird (der O₂-Mangel wird bei Bedarf automatisch kompensiert). Der Dosenüberzug sollte aus Kunststoff sein um ein übermäßiges Trocknen der Oberflächenschichten des Materials zu vermeiden.
Temperaturmessung
Thermofühler, verbunden mit einem automatischen Drucker mit 100 Kanälen. Eine Messung erfolgte in 6-Stunden-Intervallen und wurde täglich gemittelt.
Basistemperatur
Die Behälter werden in einem Raum gelagert, der auf 20°C reguliert ist. Wenn das Material zu Beginn kälter ist, sollte ihm Zeit gegeben werden, sich auf 20°C einzustellen, bevor eine Isolierung angebracht wird.
Füllmenge
100 g TM ist die Basis-Füllmenge. Ein Temperaturanstieg zeigt im Bereich von 60 bis 100 g TM eine lineare Korrelation zur Füllmenge; die Daten können bei geringen Abweichungen korrigiert werden. Wenn Material mit hoher Massendichte das 1 l-Volumen nicht füllt, werden Styroporscheiben mit einem Loch von 12 mm in der Mitte als Ersatz verwendet.
Verlustberechnung
Der TM-Gehalt ist neben der Füllmenge der zweite Faktor, der bei der Umwandlung von einer Temperaturerhöhung in TM-Verluste zu berücksichtigen ist. Basis der folgenden Tabelle sind ausgedehnte Vergleiche des Temperaturanstiegs bei der beschriebenen Einstellung und gleichzeitige CO₂-Bestimmungen.
TM-Verlust, % pro Tag bei 1°C Temperaturanstieg a) Faktor FTM100 (bei 100 g TM-Füllgewicht)
b) Faktor FTM (bei variablem Füllgewicht (60....130 g))
Verlustkurve
Die täglich bestimmten Verluste werden gesammelt und gegen die Lagerungszeit aufgetragen. Eine normale Lagerungszeit in Völkenrode ist 9 Tage.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Zusammensetzung zur Verwendung als Silage-Impfmaterial, umfassend: einen Hefestamm, ausgewählt aus SE24, SE136 und SE151, wobei die Hefestämme die ATCC-Zugriffsnummern 74441, 74442 bzw. 74443 haben, und deren Derivaten oder Mutanten.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, die außerdem ein Trägermaterial umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung ungefähr 10² bis ungefähr 10¹² lebensfähige Organismen pro Gramm, ungefähr 10⁷ bis ungefähr 10¹⁰ lebensfähige Organismen pro Gramm, oder ungefähr 10⁹ bis ungefähr 10¹⁰ lebensfähige Organismen pro Gramm enthält.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei das Trägermaterial ein flüssiges Suspensions-Trägermaterial ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei das Trägermaterial ein festes Suspensions-Trägermaterial ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei das Trägermaterial ein wasserlösliches festes Trägermaterial ist, ausgewählt aus Kalziumcarbonat, Stärke und Cellulose.
Verfahren zur Behandlung von Tierfuttermitteln oder Silage, die für das Wachstum von Fäulnisorganismen auf ihnen empfänglich sind, welches die Zugabe eines wie in Anspruch 1 definierten Hefestammes zu dem Futtermittel umfasst.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Silage ausgewählt ist aus Gras-, Mais-, Luzernen-, Weizen-, Legumenosen-, Sorghum-, Sonnenblumen-, und Gerstensilage.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Hefestamm beim Einsilieren zugegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 7, welches es umfasst, die Silage für mindestens 30 Tage aufrechtzuerhalten.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei sich die Silage in einem Ballen, einem sauerstoffbegrenzenden Sack, einem Bunker, einem Fassdauben-Silo, einem sauerstoffbegrenzenden Silo, einem Sack, einem Haufen oder mehreren davon befindet.
Zusammensetzung, die durch das Verfahren nach Anspruch 7 erhältlich ist.
Tierfuttermittel, zu welchem ein Hefestamm gegeben wurde, wie er in Anspruch 1 definiert ist.
Silage, zu welcher ein Hefestamm gegeben wurde, wie er in Anspruch 1 definiert ist.
Gereinigter und isolierter Stamm: (a) Saccharomyces exiguus-Stamm SE24, mit der ATCC-Zugriffsnummer 74441; oder (b) Saccharomyces exiguus-Stamm SE136, mit der ATCC-Zugriffsnummer 74442; oder (c) Saccharomyces exiguus-Stamm SE151, mit der ATCC-Zugriffsnummer 74443.
Isolierte DNA-Sequenz, welche verwendet werden kann, um Stämme von Saccharomyces exiguus zu identifizieren, welche kein Laktat assimilieren und welche das Wachstum von anderen Hefestämmen, die mit der Fäulnis von Silage in Verbindung stehen, inhibieren, wobei die Sequenz durch eine rRNA-Sequenz gekennzeichnet ist, welche die Sequenz SEQ ID NO: 1 ist.
Isolierter Hefestamm, der eine rRNA-Sequenz von SEQ ID NO: 1 aufweist, oder eine Sequenz, die fähig ist, damit zu hybridisieren, wobei der Stamm sich außerdem durch seine Fähigkeit, das Wachstum von Hefestämmen, welche mit aerober Fäulnis in Verbindung stehen, zu inhibieren, auszeichnet, wobei der Stamm außerdem ein solcher ist, welcher nicht Laktat assimiliert.