FI95724B - Rehun homehtumisen esto - Google Patents

Description

, 95724

Rehun homehtumisen esto Tämä keksintö koskee antifungaalisia bakteerikantoja, erityisesti antifungaalisia Bacillus subtilis- ja 5 Serratia-bakteerikantoj a, eläinten rehuainekoostumusten, mukaanluettuina säilörehut ja heinä, säilömisessä käytettäviksi.

Eläinten rehuaineisiin kuuluu rehuja kuten viljan-jyvät, kokonaiset viljat, ruohot, palkokasvit, riisi, si-10 nimailanen, durra ja heinä. Rehu varastoidaan yleensä kuivattuna materiaalina tai sellaisen säilörehun muodossa, jota tuotetaan näistä materiaaleista käymismenetelmillä.

Tämä käyminen säilörehun tuottamiseksi suoritetaan yleensä hapettomassa ympäristössä ja happoa tuottavien bakteerien 15 läsnäollessa. Kuivattua materiaalia tai säilörehua otetaan tarpeen mukaan käyttöön rehuaineena.

Kun rehu aiotaan säilöä kuivattuna materiaalina, on tarpeellista, että materiaali kuivataan jonkin asteisesti ennen varastointia luontaisesti mukana olevien haitallis-20 ten mikrobien kolonisaation minimoimiseksi. Esimerkiksi pellolla heinässä on monimutkainen populaatio sieniä, hiivoja, aktinomykeettejä ja bakteereita, jotka voisivat ko-lonisoida varastoinnin aikana ja johtaa, äärimmäisissä tapauksissa, itsesyttymiseen. Homeen tai sienen kasvu voi 25 myös johtaa maistuvuus- ja terveysongelmiin sekä eläimillä että ihmisillä. Mikrobien kehittymisen nopeus vaihtelee kosteuspitoisuudesta riippuen, ja paalutetulle heinälle kosteuspitoisuutta 15 % pidetään yleensä ylärajana, jossa mikrobiaktiivisuus vähenee siedettävälle tasolle. Pohjois-30 Amerikassa normaali käytäntö tähän alhaiseen kosteuspitoisuuteen pääsemiseksi on antaa heinän jonkin aikaa lakastua eli kuivua pellolla ennen paalitusta.

Säilörehu on viljelykasvien, sellaisten kuin edellä on lueteltu, käymistuote, jonka saavat aikaan viljelykas-35 veissa korjuun aikaan luonnostaan mukana olevat maitohap- 2 95724 poa tuottavat bakteerit. Maitohappokäymistä voidaan parantaa lisäämällä valittuja maitohappoa tuottavia bakteereita. Tällaisiin bakteereihin kuuluvat suvun Lactobacillus, suvun Streptococcus, suvun Enterococcus, suvun Lac-5 tococcus ja suvun Pediococcus valitut maitohappoa tuottavat kannat.

Hyvän säilörehun saamiseksi on tärkeää päästä an-aerobioositilaan, ja siksi viljelykasvi yleensä varastoidaan ja sen annetaan fermentoitua suljetussa astiassa tai 10 siilossa. Anaerobioositila voi kuitenkin olla vaikea saavuttaa nopeasti, ja sen määrää se aste, jolla ilma pääsee tekemisiin siilossa säilöttävän materiaalin kanssa. Säilörehun altistus ilmalle, erityisesti ilman hapelle, johtaa säilörehun pilaantumiseen, ja pilaantumisaste riippuu 15 säilörehun aerobisesta stabiilisuudesta. Säilörehumateri-aali voi myös pilaantua sen jälkeen, kun se on otettu siilosta, ennen eläimille syöttämistä, riippuen tällä välillä kuluneesta ajasta. Näissä tapauksissa pilaantuminen johtuu pääasiassa siilossa säilötyn materiaalin hiiva- tai home-20 kontaminaatiosta.

Sienikasvua rehussa voidaan muuttaa tai estää lisäämällä kemiallisia fungisidejä, kuten ammoniakkia tai orgaanisia happoja tai niiden suoloja, ennen varastointia, tai erilaisilla fysikaalisilla keinoilla, joihin kuuluvat • 25 pitemmät kuivausajat pellolla, kuivurien käyttö, happipi toisuuden alentaminen ja/tai pH:n muutos.

Bacillus subtilis -lajin bakteerikannan on esitetty SU 751382:ssa, päivätty 30. heinäkuuta 1980, osoittavan fungisidistä aktiivisuutta rehussa erityisesti Stachybot-30 ris alternansia ja Dendrodochium toxicumia vastaan.

US-patentti 4 266 028, päivätty 5. toukokuuta 1981, esittää antifungaalisen antibiootin prodigiosiinin valmistuksen viljelemällä bakteeria Serratia marcescens R-2.

JP A 59/13175 kuvaa L. plantarum-, L. brevis-, ja 35 B. subtilis-bakteereja fermentaatioaktiivisina bakteerei- 3 95724 na. Homeongelmaa ei ei kuitenkaan liene kohdattu, koska raaka-aineena olivat kuivatut oljet, jolloin B. subtilis-bakteerin valinta homeen estoon tuntuu kaukaiselta. Serra-tia-bakteeria ei mainita.

5 FI A 883901:n tekninen kuvaus rajoittuu Bacillus

Rumilus-bakteerin käyttöön, jonka tiedetään olevan eri kuin B. subtilis.

Journal of Animal Science, voi. 50, nro 4, 1980, s. 729-736, Burghardi, S.R. et ai♦ kuvaa säilörehun fermen-10 taatiota erilaisilla laktobasilleilla ja streptokokeilla.

Julkaisu ei koske homeenmuodostusta eikä kuvaa mitään lisättävää homeenestoainetta. Tiivistelmässä mainitaan kaupallinen eläviä bakteereja sisältävä säilöntäaine, joka sisältää B. subtilis-, L. acidophilus- ja Aspergillus ory-15 zae-organismeja sekoitettuna maitohappofermentaatioentsyy- mien kanssa. Järjestelmä eroaa kuitenkin oleellisesti esillä olevasta hakemuksesta, koska siinä lisätään tarkoituksella hometta A. oryzae. Järjestelmän kokeilu on antanut epäedullisia tuloksia.

20 Miltä tahansa säilörehussa tai kuivatussa rehussa käytettäväksi tarkoitetulta spesifiseltä biologiselta torjunta-aineelta vaadittaisiin, että se toimisi monimutkaisessa yhdistelmässä vaihtuvia olosuhteita ja kilpailisi luonnostaan mukana olevan mikrobiston kanssa.

’ 25 Yllättävästi olemme nyt löytäneet bakteerikantoja, joita voidaan käyttää torjumaan tehokkaasti sienten, ak-tinomykeettien ja bakteerien kasvua rehussa. Näitä bakteerikantoja sekoitetaan maitohappoa tuottaviin bakteerikantoihin säilörehun tuottamisessa ja säilömisessä käy-30 tettäksi. Erityisesti olemme löytäneet Bacillus subtilis -lajin ja Serratia-suvun bakteerikantoja, joilla nähdään sekä antifungaalisia että antibakteriaalisia ominaisuuksia, jotka mahdollistavat useiden homeiden ja bakteerien biologisen torjunnan rehussa.

4 95724

Siksi tämän keksinnön tarkoitus on valmistaa ja säilöä säilörehua paremmin käsittelemällä siiloon säilöttäväksi sopivaa materiaalia seoksella antifungaalista bakteerikantaa ja maitohappoa tuottavaa bakteerikantaa.

5 Edelleen tämän keksinnön tarkoituksena on tuoda käytettäväksi antifungaalisia bakteerikantoja, joita voidaan käyttää heinän tai muun kuivan rehun paalittamisen tai varastoimisen (säilömisen) sallimiseksi merkitsevästi korkeammassa kosteuspitoisuudessa kuin normaalisti.

10 Vielä edelleen tämän keksinnön tarkoituksena on tuoda käytettäväksi bakteerikantoja, jotka voidaan formuloida rehun käsittelyssä käytettäviksi koostumuksiksi.

Niinpä tämän keksinnön yhtenä puolena tuodaan käytettäväksi eläinten rehuainekoostumus, joka käsittää re-15 hun ja antifungaalisesti tehokkaan määrän antifungaalista bakteerikantaa valittuna joukosta, jonka muodostavat Bacillus subtilis FB260 ja Serratia-suvun antifungaalinen kanta.

Edullisesti antifungaalinen bakteerikanta on lajia, 20 joka valitaan joukosta, jonka muodostavat Serratia rubi-daea, Serratia plymuthica ja Serratia liquefaciens. Edullisemmin antifungaalinen kanta on lajia Serratia rubidaea, kuten Serratia rubidaea FB299.

Edullisesti eläinten rehuainekoostumuksen rehu on ' 25 heinä.

Keksinnön eräässä edullisessa ilmenemismuodossa eläinten rehuainekoostumus lisäksi käsittää maitohappoa tuottavan bakteerikannan suvusta, joka valitaan ryhmästä, jonka muodostavat Lactobacillus, Streptococcus, Entero-30 coccus, Lactococcus ja Pediococcus♦ Silloin, kun on haluttavaa, että eläinten rehuainekoostumus on säilörehu, maitohappoa tuottavaa bakteerikantaa on mukana maitohappoa tuottava tehokas määrä käymisen aikaansaamiseksi säilörehun tuottamiseksi. Edullisesti maitohappoa tuottava 35 kanta on sukua Lactobacillus. Edullisemmin maitohappoa 5 95724 tuottava kanta on lajia Lactobacillus plantarum. Vielä edullisemmin maitohappoa tuottava kanta on Lactobacillus plantarum MTD 1, jonka viljelmä on tallennettu laitokseen National Collections of Industrial and Marine Bacteria 5 (NCIMB) Skotlannin Aberdeenissa, hakunumero NCIMB 40027.

Tämän keksinnön toisena puolena tuodaan käytettäväksi säilörehukoostumus, joka käsittää säilörehun ja an-tifungaalisesti tehokkaan määrän antifungaalista bakteerikantaa valittuna joukosta, jonka muodostavat Bacillus 10 subtilis FB260 ja Serratia-suvun antifungaalinen kanta. Edullisesti antifungaalinen bakteerikanta on lajia, joka valitaan joukosta, jonka muodostavat Serratia rubidaea, Serratia plymuthica ja Serratia liquefaciens. Edullisemmin antifungaalinen bakteerikanta on lajia Serratia rubi-15 daea, kuten Serratia rubidaea FB299.

On ymmärrettävä, että säilörehukoostumus lisäksi käsittää bakteereja maitohappoa tuottavista kannoista, kuten edellä on määritelty, siinä tapauksessa että tällaisia bakteereita käytetään säilörehukoostumuksen valmista-20 misessa.

Tämän keksinnön vielä eräänä puolena tuodaan käytettäväksi bakteerikoostumus, jolla on käyttöä säilörehun valmistuksessa ja säilömisessä, mainitun koostumuksen käsittäessä bakteereita antifungaalisesta kannasta, joka 25 valitaan ryhmästä, jonka muodostavat Bacillus subtilis FB260 ja Serratia-suvun antifungaalinen kanta; ja bakteereita maitohappoa tuottavasta bakteerikannasta suvusta, joka valitaan ryhmästä, jonka muodostavat Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus ja Pediococcus.

30 Edullisesti antifungaalinen bakteerikanta on lajia, joka valitaan joukosta, jonka muodostavat Serratia rubidaea, Serratia plymuthica ja Serratia liquefaciens; ja maitohappoa tuottava kanta on lajia Lactobacillus plantarum. Edullisemmin antifungaalinen kanta valitaan ryhmästä, jon-35 ka muodostavat Bacillus subtilis FB260 ja Serratia rubi- 6 95724 daea FB299. Edelleen edullisemmin maitohappoa tuottava kanta on Lactobacillus plantarum MTD 1, jonka viljelmä on tallennettu laitokseen National Collections of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB) Skotlannin Aberdeenissa, haku-5 numero NCIMB 40027.

Keksinnön mukaisen antifungaalisen bakteerikannan, jolla on käyttöä eläinten rehuainekoostumuksessa, säilö-rehukoostumuksessa ja bakteerikoostumuksessa, edullisiin ominaispiirteisiin, sen lisäksi, että sillä on antifun-10 gaalista aktiivisuutta (termi "antifungaalinen aktiivisuus" sisältää aktiivisuuden homeita tai hiivaa vastaan) kuuluvat: kyky kasvaa pH-arvoissa noin 4,0 - 8,0; kyky kasvaa lämpötiloissa noin 15 - 50 °C, edullisesti noin 25 - 50 °C; kyky käyttää hiilihydraatteja glukoosia, sak-15 karoosia, melibioosia, raffinoosia, sellobioosia ja ksy- loosia hiilen lähteenä; heikko proteaasin tuotto; sellu-laasien ja/tai hemisellulaasien (mukaanuettuna ksylanaa-sit) tuotto; aerobiset ja itiöitä muodostavat gram-posi-tiiviset bakteerisolut; fakultatiiviset ei itiöitä muodos-20 tavat gram-negatiiviset bakteerisolut; ja osmotoleranssi, joka näkyy kykynä kasvaa natriumkloridipitoisuuksissa noin 1 - 15 %.

Mitä tahansa suvun Lactobacillus, suvun Streptococcus , suvun Enterococcus, suvun Lactococcus tai suvun 25 Pediococcus maitohappoa tuottavaa kantaa, joka on sovelias säilörehun tekemiseen, voidaan käyttää edellä määritellyn mukaisissa eläinten rehuainekoostumuksessa ja säilörehu-koostumuksessa. Soveliaisiin bakteerikantoihin kuuluvat lajien Lactobacillus plantarum, Lactobacillus amylophi-30 lus, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus brevis, Lactococcus lactis. Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecium ja Enterococcus faecalis maitohappoa tuottavat kannat.

Eläinten rehuaine- ja säilörehu- ja bakteerikoostu-35 muksissa käytettyjen edellä määritellyn mukaisten baktee- 7 95724 rikantojen lisäksi mukana voi olla myös bakteereita muista maitohappoa tuottavista, säilörehussa käytettäviksi sopivista kannoista, jotka ovat suvun Lactobacillus tai suvun Streptococcus kantoja, jotka poikkeavat edellä mää-5 ritellyn mukaisisten koostumusten mainituista kannoista.

Tämän keksinnön vielä yhtenä puolena tuodaan käytettäväksi uusi Bacillus subtiliksen bakteerikanta FB260, jonka viljelmä on tallennettu Budapestin sopimuksen ehtojen mukaisesti laitokseen National Collections of Indust-10 rial and Marine Bacteria (NCIMB) Skotlannin Aberdeenissa, hakunumero NCIMB 40286 (23. toukokuuta 1990), ja uusi

Serratia rubidaean bakteerikanta FB299, jonka viljelmä on tallennettu Budapestin sopimuksen ehtojen mukaisesti laitokseen National Collections of Industrial and Marine 15 Bacteria (NCIMB) Skotlannin Aberdeenissa, hakunumero NCIMB 40285 (23. toukokuuta 1990).

Tämän keksinnön vielä yhtenä puolena tuodaan käytettäväksi antifungaalinen koostumus, jolla on käyttöä rehun, edullisesti heinän tai säilörehun, säilömisessä, tai 20 jolla on käyttöä edellä määritellyn mukaisten rehuaine-tai säilörehukoostumusten valmistuksessa, mainitun anti-fungaalisen koostumuksen käsittäessä tehokkaan määrän bakteereja valittuna ryhmästä Bacillus subtilis FB260 ja Serratia rubidaea FB299 sekä niille soveliaan kantajan.

25 Tämän keksinnön vielä yhtenä puolena tuodaan käy- « · tettäväksi menetelmä edellä kuvatun mukaisen eläinten re-huainekoostumuksen valmistamiseksi tai säilömiseksi, tunnettu siitä, että rehua käsitellään tehokkaalla määrällä sellaisen antifungaalisen bakteerikannan bakteerisoluja, 30 joka valitaan ryhmästä, johon kuuluvat edellä määritellyn mukainen Bacillus subtilis FB260 ja Serratia-suvun antifungaalinen kanta. Edullisesti antifungaalinen bakteerikanta on lajia, joka valitaan joukosta, jonka muodostavat Serratia rubidaea, Serratia plymuthica ja Serratia lique-35 faciens. Edullisemmin antifungaalinen kanta on edellä mää- 3 95724 ritellyn mukainen Serratia rubidaea FB299. Valinnaisesti menetelmä on edelleen tunnettu siitä, että mainittua rehua käsitellään tehokkaalla määrällä maitohappoa tuottavan -kannan bakteereita suvusta, joka valitaan ryhmästä, jonka 5 muodostavat Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus ja Pediococcus. Edullisesti maitohappoa tuottava kanta on lajia Lactobacillus plantarum, ja edullisemmin edellä määritellyn mukainen Lactobacillus plantarum MTD 1. Valinnaisesti menetelmä on myös tunnettu sii-10 tä, että rehua käsitellään tehokkaalla määrällä edellä määritellyn mukaista bakteerikoostumusta. Edullisesti rehu on heinä.

Tämän keksinnön vielä yhtenä puolena tuodaan käytettäväksi menetelmä edellä määritellyn mukaisen säilöre-15 hukoostumuksen valmistamiseksi tai säilömiseksi, tunnettu siitä, että soveliasta rehua käsitellään tehokkaalla määrällä sellaisen antifungaalisen bakteerikannan bakteerisoluja, joka valitaan ryhmästä, jonka muodostavat edellä määritellyn mukainen Bacillus subtilis FB260 ja Serra-20 tia-suvun antifungaalinen kanta; ja tehokkaalla määrällä maitohappoa tuottavan bakteerikannan bakteerisoluja suvusta, joka valitaan ryhmästä, jonka muodostavat Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus ja Pediococcus . Edullisesti antifungaalinen bakteerikanta on 25 lajia, joka valitaan joukosta, jonka muodostavat Serratia rubidaea, Serratia plymuthica ja Serratia liquefaciens; ja maitohappoa tuottava kanta on lajia Lactobacillus plantarum. Edullisemmin antifungaalinen kanta valitaan ryhmästä, jonka muodostavat Bacillus subtilis FB260 ja 30 Serratia rubidaea FB299. Vielä edullisemmin maitohappoa tuottava kanta on edellä määritellyn mukainen Lactobacillus plantarum MTD 1. Valinnaisesti menetelmä on tunnettu siitä, että rehua käsitellään tehokkaalla määrällä edellä määritellyn mukaista bakteerikoostumusta.

β 95724 Tämän keksinnön mukaisissa koostumuksissa, silloin kun se on tarkoituksenmukaista, antifungaalisen kannan ja maitohappoa tuottavan kannan bakteerisoluja on soveliaasti mukana suhteelliset osuudet välillä 1:9 - 9:1. Edulli-5 sesti niitä on mukana olennaisesti yhtäsuuret osuudet.

Tämän keksinnön mukaisia antifungaalisia bakteerikantoja voidaan valmistaa mikä tahansa tarvittava määrä fermentoimalla näyte mainittua kantaa soveliaissa olosuhteissa asianmukaisessa elatusaineessa. Tällaiset olosuh-10 teet ja elatusaineet ovat sinänsä tunnettuja. Elatusai-neet sisältävät yleensä esimerkiksi typen lähteen (esim. kalajauho tai tryptoni) ja hiilihydraattilähteen kuten tärkkelyksen tai glukoosin. Soveliaisiin olosuhteisiin kuuluvat lämpötila välillä noin 20 - 40 'C ja likimain 15 neutraali pH. Fermentointi voidaan vaivatta suorittaa eri-nä, tyypillisesti 1-2 päivää kestävinä, tai käyttäen jatkuvaa viljelmää. Bakteerikannan elävä biomassa voidaan saada fermentointinesteestä konsentroimalla, esimerkiksi sentrifugoimalla tai mikro- tai ultrasuodatuksella, mitä 20 seuraa minkä tahansa haluttujen ja asiaan kuuluvien for-mulointiaineiden lisäys. Formulointiaineisiin, jotka voivat olla hyödyllisiä, kuuluvat esimerkiksi pinta-aktiivi-set aineet, esim. kostutusaineet, kiinteät laimennusai-neet, dispersointiaineet ja UV-stabiloijat. Niin halutta-25 essa kiinteät formulaatiot voidaan valmistaa tunnetuilla menetelmillä.

Tämän keksinnön mukaisen menetelmän käytännössä bakteerikoostumusta voidaan käyttää nesteenä tai hienojakoisena kiinteänä aineena. Kun sitä käytetään nesteenä, 30 kantaja on vesi, kun taas, kun sitä käytetään kiinteänä aineena, kantaja on kiinteä materiaali. Yleensä kiinteinä aineina käytettävät koostumukset toimitetaan käyttäjille täydellisinä formulaatioina mukaanlukien kantajat. Kuitenkin, kun koostumusta käytetään nesteenä, käyttäjälle 35 yleensä toimitetaan asianmukaiset bakteerisolut suspen-soitaviksi asianmukaiseen määrään vettä ennen käyttöä.

95724 10

Kun keksinnön mukaista koostumusta käytetään kiinteänä aineena, mitä tahansa soveliasta materiaalia voidaan käyttää kantajana mainitussa koostumuksessa. Esimerkkejä soveliaista kantajista ovat viljat, kuten jauhetut mais-5 sintähkät, jauhettu kaura ja vehnä sekä muut materiaalit, kuten savi, liitu, magnesiitti, kalkkikivi ja talkki.

Kantajien ja bakteerien lisäksi säilörehun valmistamisessa käytettäviksi tarkoitetut koostumukset yleensä sisältävät lisämateriaaleja, joita on lisätty eri syistä.

10 Mikä tahansa lisätty muu materiaali voi sisältyä vielä yhtenä komponenttina keksinnön mukaiseen bakteerikoostu-mukseen. Lisämateriaaleihin kuuluvat ravinteet (jotka voivat olla sokereita, kuten sakkaroosia, laktoosia jne.); kasvutekijät, jotka ovat välttämättömiä joidenkin baktee-15 rien kasvulle (mukaanluettuina hiivauute, maissinliotus-neste, vitamiinit ja aminohapot); materiaalit, joita on lisätty bakteerien elinkyvyn suojaamiseksi; antioksidan-tit; hapenottoa auttavat materiaalit; ja öljyt ja muut materiaalit pölyämistaipumusten vähentämiseksi lisäaineil-20 ta tai viljelyskasveihin tarttumisen parantamiseksi.

Säilörehun valmistamiseen käytettävään koostumukseen sisältyvien kantajan ja bakteerien suhteelliset osuudet riippuvat kulloinkin käytettävästä bakteerikannasta ja sen aktiivisuudesta ja elinkyvystä. Erityisen sovelias 25 kiinteänä käytettävä bakteerikoostumus sisältää kiinteää kantajaa, kuten jauhettuja maissintähkiä (maissiryynejä).

Kun bakteerisolujen on tarkoitus muodostaa osa käytettävästä nestemäisestä lisäaineesta, käyttäjä suspensoi ne riittävään määrään vettä. Elävien solujen pitoisuutta, 30 määriteltynä pesäkkeitä muodostavien yksiköiden (CFU) lu-kumääränä, voidaan käyttää ohjeena määriteltäessä käyttömääriä. Ohjeellisesti bakteerisoluja voidaan käyttää nestemäisenä suspensiona tai kiinteänä lisäaineena pitoisuuksina välillä noin 1 x 105 - 1 x 10® CFU käsiteltävää rehu-35 grammaa kohti, riippuen rehun lajista ja kunnosta. Edulli- 11 95724 sesti pitoisuus on välillä noin 1 x 105 - 5 x 106 CFU rehu-grammaa kohti.

Keksinnön mukaisten eläinten rehuaine-, säilörehuja bakteerikoostumusten valmistuksessa bakteerit yleensä 5 kuivataan soveliain keinoin, esim. kylmäkuivataan tai su-mutuskuivataan, tai elävä viljelmä suspensoidaan veteen, ja sitten ne sekoitetaan muiden komponenttien kanssa tavanomaisilla sekoitusmenetelmillä.

Tämän keksinnön mukaiset eläinten rehuaine- ja säi-10 lörehukoostumukset yleensä valmistetaan käyttämällä, esimerkiksi sumuttamalla, asianmukaisen bakteerikannan bakteerisoluja tai edellä määritellyn mukaista bakteerikoos-tumusta runsaasti kosteutta sisältävään viljasäilörehuun, joka on luonnostaan saastunut tai altis saastumiselle eri 15 mikrobeilla.

Elävä biomassa (bakteerisolut) etenee elinkierrossaan tuottaen pilaantumisen torjuntaan tarvittavat anti-fungaaliset ja antibakteriaaliset aktiivisuudet.

Tämän keksinnön mukaisia uusia bakteerikantoja ja 20 bakteerikoostumusta voidaan käyttää laajan valikoiman rehuja valmistuksessa ja säilönnässä, mukaanluettuina säilörehu ja heinä, jotka ovat alttiita homeilla saastumiselle.

Myös aktiivisuutta koliformeja ja hiivoja vastaan havaitaan joissakin yhteyksissä, erityisesti Bacillus subtilis 25 FB260:n tapauksessa. Muihin etuihin kuuluu värin säilymi nen ja lämpenemisen kontrolli keksinnön mukaisten eläinten rehuaine- tai säilörehukoostumusten valmistuksessa ja/tai säilömisessä. Tämä on erityisen tärkeää säilötyn heinän tapauksessa, jonka luokka määräytyy värin perusteella.

30 Spesifisiä esimerkkejä keksinnöllä suojattavasta kaupalli sesti tärkeästä rehusta ovat palkokasvit, mukaanluettuina sinimailanen, maissi, runsaasti kosteutta sisältävät viljan jyvät, maissisäilörehu, viljasäilörehu, ruohosäilörehu, vihannessäilörehut sekä heinä ruohokasveista ja palkokas-35 veistä.

12 95724

Olemme keksineet, että Serratia rubidaea FB299 tuottaa maitohappoa, ja sellaisissa tapauksissa, tarvittaessa, muiden maitohappoa tuottavien bakteerien läsnäolo voidaan minimoida.

5 Tämän keksinnön etuna on lisäksi tuoda käytettävik si sellaisia bakteerikantoja sekä rehuaine-, säilörehu- ja bakteerikoostumuksia, jotka ovat hyväksyttäviä asiaa koskevan rehuainelainsäädännön puitteissa, ilman ei-toivottu ja vaikutuksia karjalle ja ilman niistä tulevia sivu-10 tuotteita, eivätkä tuota jäämiä mainituista sivutuotteista.

Vielä eräs etu on tuoda käytettäviksi tämän keksinnön mukaisia bakteerikantoja ja mainittuja koostumuksia, jotka ovat käsittelijälle turvallisempia käyttää ei-15 vätkä aiheuta korroosiota tai vaurioita koneille.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä lisää, mutta keksinnön suoja-ala ei rajoitu niissä esitettyihin ilmenemi smuotoihin.

Esimerkki 1 20 Seuraava esimerkki valaisee Serratia rubidaea-kan- nan FB299 ja Bacillus subtilis-kannan FB260 eristämistä.

Heinänäyte saatiin St. Valerienista Kanadan Quebecista, ja säilörehunäyte saatiin "Ferme Brioniman"ilta myös Quebecistä. FB299:n ja FB260:n eristys suoritettiin siir-25 tämällä vastaavasti 0,1 g heinää tai säilörehunäyte (1 g viljaa) 10 ml:an 0,05 % peptonia ja suorittamalla sarja-laimennukset 104 - 107 asti, riippuen siitä, miten samealta näyte näytti. 0,1 ml laimennusta, joka oli halutun laimennuksen yläpuolella, maljattiin maljallelevitysmenetel-30 mää käyttäen ravinto-, hiiva-mallas-, Sabouraud-dekstroo-si- ja L-S -erotteluelatusaineelle. Maljoja tarkasteltiin viiden päivän huoneenlämmössä inkubaation jälkeen. Pesäkkeet selektoitiin ja puhdistettiin sillä elatusaineella, jolta ne eristettiin, ja niitä inkuboitiin huoneenlämmössä 35 siihen asti, että ne kasvoivat. Valituista pesäkkeistä li 13 95724 tehtiin sivelyvalmisteet, gram-värjättiin ja tarkasteltiin mikroskoopilla (1000X suurennuksella öljyimmersio-objek-tiivia käyttäen) lisäkarakterisointia varten. Bakteeri-isolaatit siirrettiin ravintoagarvinopinnoille, ja niitä 5 säilytettiin + 4 °C:ssa ennen käyttöä.

Taulukossa 1 luetellaan kantojen Bacillus subtilis FB260 ja Serratia rubidaea FB299 morfologiset ja mikrobiologiset erityispiirteet.

f < 14 95724

Taulukko 1

Morfologia ja mikrobiologinen karakterisointi FB260: 5 Aerobinen ja itiöitä muodostava bakteeri, gram-po- sitiivisia yksittäisiä soluja, pesäkemorfologia Bacillus-lajille tyypillinen kasvua havaitaan pH-arvoissa välillä 4,5 - 8,0 kasvua havaitaan lämpötiloissa välillä 25 - 50 °C 10 kasvua havaitaan lopullisissa NaCl-pitoisuuksissa välillä 1 - 15 % kanta voi käyttää hiilenlähteenä glukoosia, sakkaroosia, melibioosia, raffinoosia, sellobioosia ja ksyloo-sia 15 kanta on heikko proteaasientuottaja, mutta vahva amylaasien ja ksylanaasien tuottaja kanta on osoittanut antifungaalista tehoa useita homeita vastaan, erityisesti lajeja Penicillium sp., Absi-dia sp., Aspergillus niger ja Aspergillus flavus vastaan.

20 FB299:

Fakultatiivinen ja itiöitä muodostamaton bakteeri, gram-negatiivisia yksittäisiä soluja

kasvua havaitaan pH-arvoissa välillä 4,0 - 8,0 25 kasvua havaitaan lämpötiloissa välillä 25 - 50 °C

kasvua havaitaan lopullisissa NaCl-pitoisuuksissa välillä 1 - 10 % kanta voi käyttää hiilenlähteenä glukoosia, sakkaroosia, melibioosia, raffinoosia, sellobioosia ja ksyloo-30 siä kanta on osoittanut antifungaalista tehoa useita homeita vastaan, erityisesti lajeja Penicillium sp., Absi-dia sp., Aspergillus niger ja Aspergillus flavus vastaan.

Il 15 95724

Esimerkki 2 Tämä esimerkki valaisee bakteerikantojen FB260 ja FB299 käyttöä sinimailasheinän säilömisessä.

500 g sinimailasheinää punnittiin muoviämpäriin 5 vaa'alla. Kukin näyte pantiin eri kasaan muovikalvolle. Käsittelyä kohti oli 8 rinnakkaisnäytettä, joten 8 kasaa järjestettiin kerrallaan. Jokainen kasa sumutettiin 10 ml:11a kulloistakin käsittelykantaa käyttäen SpotGUN-Lur-mark -sumutuspistooleita. Heinää käänneltiin joka kasassa 10 ja edelleen ruiskutettiin toiset 10 ml joka näytteelle.

Tämä tehtiin sinimailasen peittämiseksi paremmin. Sitten näytteet säkitettiin yksittäin nailonverkkopusseihin pakkaamalla sinimailanen tiukasti "paaliksi", sulkemalla pussit langalla ja merkitsemällä ne. Tämä menettely seurasi 15 kutakin käsittelyä 1-3, tuloksena 24 "paalia" heinää kummallakin kosteustasolla 40 % ja 28 %. Paalit pinottiin kahteen pinoon kosteuspitoisuuden mukaan lattialle olosuhteiltaan säädeltävässä huoneessa, joka oli asetettu 26 eC:seen ja 70 % suhteelliseen kosteuteen. Kahden viikon 20 kuluttua yksi paali kummastakin kosteustasosta avattiin, ja sen kosteuspitoisuus tarkastettiin käyttäen mikroaaltouunia ja vaakaa. Koe lopetettiin ja homeilla pilaantuminen arvioitiin. Tilastollista testausta varten näkyvien homeiden arvioinnissa käytetty +/- -luokitussysteemi muu-25 tettiin erillisiksi arvoiksi seuraavan systeemin mukai sesti. Miinukselle (-) annettiin arvo 0 %. Plussalle (+) annettiin arvo 33 %. Kaksoisplussalle (++) annettiin arvo 66 %, ja lopuksi kolmoisplussalle (+++) annettiin arvo 99 %. Nämä prosenttiluvut perustuivat maksimimäärään home-30 kasvua, joka näytteessä saattoi esiintyä, ennen kuin se luokiteltiin seuraavaan ylempään luokkaan. Tulokset luetellaan taulukossa 2, ja ne osoittavat, että 28 %:n kosteuden heinässä sekä FB299 että FB260 torjuivat hyvin homeita. 40 %:n kosteuden heinässä FB299 osoitti erityisen 35 hyvää homeiden torjuntaa.

16 95724

Taulukko 2 I. 28 %:n kosteustaso

Homeiden läsnäolo* kussakin paalissa 12345678 5 Käsittely 1. Kontrolli + +++ ++ + + + ++ ++ +++ +++ 2. FB260 + + + ++ ++ + + + 3. FB299 +++ ++ ++ + + ++ + 10 Käsittely

Kontrolli FB299 FB260 Näkyvien homeiden keskiprosentti 78 49 41 15 II. 40 %:n kosteustaso

Homeiden läsnäolo* kussakin paalissa 12345678 Käsittely 1. Kontrolli +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ 20 2. FB260 +++ + +++ + +++ +++ ++ +++ 3. FB299 ++ + + ++ +++ +++ Käsittely

Kontrolli FB260 FB299 , 25 Näkyvien homeiden keskiprosentti 99 78 49 •ff Näkyvien homeiden selitys: -: Ei homekasvua 30 +: Hiukan homekasvua ++: Melko paljon homekasvua +++: Suuria määriä homekasvua 17 95724

Esimerkki 3

Seuraava esimerkki esittää vertailun FB260:n tai FB299:n käytöstä yksin tai yhdessä Lactobacillus planta-rumin (Ecosyl, tavaramerkki) kanssa siilossa säilötyille 5 runsaasti kosteutta sisältäville maissin jyville.

2 kg runsaasti kosteutta sisältäviä maissin jyviä punnittiin joka näytteeseen ja pantiin happea läpäisemättömiin polyetyleenipusseihin. 100 ml kulloistakin käsittelyainetta kaadettiin näytepussiin, joka sitten suljet-10 tiin umpeen ja käännettiin nopeasti ylösalaisin 10 kertaa täydellisen peittämisen varmistamiseksi. Lopullinen käytettyjen elävien solujen kokonaispitoisuus vaihteli 1 x 105 - 1 x 107 CFU/g maissia (käytettäessä yhdistelmänä "Ecosylin" kanssa FB260:tä ja FB299:ä oli enemmistö). Ko-15 keeseen kuului kolme rinnakkaista jokaisesta neljästä näy-teajasta, tuloksena 12 pussia käsittelyä kohti. Yhdeksän kahdestatoista kuhunkin käsittelyyn kuuluvasta näytteestä pantiin erillisiin 75 litran galvanoituihin teräsroskasäi-liöihin ja peitettiin 20 kg hiekkasäkillä siilon paineen 20 jäljittelemiseksi. Lopuksi kannet suljettiin yhdeksässä "siilossa". Jäljellä olevat kolme näytettä käsittelyä kohti edustivat hetkeä 0, ja ne pantiin jääkaappiin kaiken aktiivisuuden pysäyttämiseksi ennen kuin näytteet voitiin analysoida visuaalisesti ja niiden supernatantit kerätä 25 talteen seuraavana päivänä. Seitsemän päivän jälkeen huoneenlämmössä, jäljellä olevat rinnakkaiset kustakin käsittelystä pantiin olosuhteiltaan säädeltävään huoneeseen 25,2 °C:seen ja 70 %:n suhteelliseen kosteuteen jäljellä oleviksi 8 päiväksi. Jokaisen näytteenottoajän kohdalla 30 asiaankuuluvista näytteistä arvioitiin visuaalisesti homeilla pilaantuminen, ja ne pestiin vedellä haihtuvien happojen, vesiliukoisten hiilihydraattien jne. keräämiseksi talteen analyyttisiä tarkoituksia varten.

18 95724 Käsittelyt suoritettiin seuraavasti: Käsittely 1 : Kontrolli Käsittely 2 : FB260 Käsittely 3 : FB299 5 Käsittely 4 : Lactobacillus plantarum Käsittely 5 : Lactobacillus plantarum + FB260 Käsittely 6 : Lactobacillus plantarum + FB299

Tulokset on lueteltu taulukossa 3, ja niistä näkyy, että edellä kuvatuissa olosuhteissa käsittelyssä nro 5 10 nähtiin vähemmän kontaminaatiota homeilla kuin kontrollissa, kun säilörehu testattiin 15 päivän jälkeen. Aerobisen stabiilisuuden suhteen käsittelyissä nro 3 ja nro 6 nähtiin sekä hyvä homeiden torjunta että pienempi lämpötilan nousu viiden päivän ilma-altistuksen jälkeen. Mitä 15 tulee pH-arvoon, hyviä arvoja (<4,2) havaittiin molemmilla käsittelyillä nro 5 ja nro 6 kontrolliin verrattuna. Kumpikin FB260:stä ja FB299:stä toimii hyvin yhdessä Lactobacillus plantarumin kanssa, tuloksena parempi säilörehu kuin Lactobacillus plantarum-kannalla yksinään.

20

Taulukko 3 Käsittely Näkyvät pH* Aerobinen homeet* stabiilisuus** 1 77 % 4,35 77 % (29,7eC) 25 2 55 % 4,35 66 % (29,3°C) 3 55 % 4,32 33 % (23,7°C) 4 55 % 4,21 55 % (26,7°C) 5 22 % 4,16 66 % (26,7°C) 6 44 % 4,14 44 % (25,0°C) 30 - *: Testit suoritettiin 15 päivän vanhalle säilörehulle **: Testit suoritettiin sen jälkeen, kun siilossa säilöttyä materiaalia oli altistettu ilmalle 5 päivää huoneenlämmössä. Prosenttiarvot ovat pilaantumista homeella, kun 35 taas arvot suluissa ovat keskimääräisiä lämpötiloja.

Claims (13)

95724

1. Eläinten rehuainekoostumus, tunnettu siitä, että siinä on rehua ja antifungaalisesti tehokas 5 annos antifungaalista bakteerikantaa valittuna ryhmästä, jonka muodostavat Bacillus subtilis FB260, jonka viljelmä on tallennettu laitokseen National Collections of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB) Skotlannin Aberdeenissa hakunumerolla NCIMB 40286, ja antifungaalinen Serratia- 10 suvun kanta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen eläinten rehuainekoostumus, tunnettu siitä, että mainittu antifungaalinen bakteerikanta on Serratia rubidaea FB299, jonka viljelmä on tallennettu laitokseen National Collections of

15 Industrial and Marine Bacteria (NCIMB) Skotlannin Aberdeenissa hakunumerolla NCIMB 40285.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai patenttivaatimuksen 2 mukainen eläinten rehuainekoostumus, tunnettu siitä, että mainittu rehu on heinä.

4. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-3 mukai nen eläinten rehuainekoostumus, edelleen tunnettu siitä, että siinä on maitohappoa tuottavaa bakteerikantaa suvusta, joka valitaan ryhmästä, jonka muodostavat Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus ja Pe-, 25 diococcus, maitohappoa tuottava tehokas määrä käymisen ai kaansaamiseksi säilörehun tuottamiseksi.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen eläinten rehuainekoostumus, tunnettu siitä, että mainittu maitohappoa tuottava bakteerikanta on Lactobacillus plantarum

30 MTD 1, jonka viljelmä on tallennettu laitokseen National Collections of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB) Skotlannin Aberdeenissa hakunumerolla NCIMB 40027.

6. Säilörehukoostumus, tunnettu siitä, että siinä on säilörehua ja antifungaalisesti tehokas annos 35 antifungaalista bakteerikantaa valittuna ryhmästä, jonka 95724 muodostavat Bacillus subtilis FB260, jonka viljelmä on tallennettu laitokseen National Collections of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB) Skotlannin Aberdeenissa haku-numerolla NCIMB 40286, ja antifungaalinen Serratia-suvun 5 kanta.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen säilörehukoostu-mus, tunnettu siitä, että mainittu antifungaalinen bakteerikanta on Serratia rubidaea FB299, jonka viljelmä on tallennettu laitokseen National Collections of

8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen säilörehukoostu-mus, edelleen tunnettu siitä, että siinä on maitohappoa tuottavan bakteerikannan bakteereita suvusta, 15 joka valitaan ryhmästä, jonka muodostavat Lactobaci1lus, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus ja Pediococcus.

9. Bakteerikoostumus, jolla on käyttöä säilörehun valmistuksessa ja säilömisessä, tunnettu siitä, että siinä on sellaisen antifungaalisen kannan bakteerei- 20 ta, joka valitaan ryhmästä, jonka muodostavat Bacillus subtilis FB260, jonka viljelmä on tallennettu laitokseen National Collections of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB) Skotlannin Aberdeenissa, hakunumero NCIMB 40286, ja antifungaalinen Serratia-suvun kanta; ja maitohappoa 25 tuottavan bakteerikannnan bakteereita suvusta, joka valitaan ryhmästä, jonka muodostavat Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus ja Pediococcus.

10. Biologisesti puhdas viljelmä bakteerikantaa valittuna ryhmästä, jonka muodostavat Bacillus subtilis

30 FB260 (NCIMB 40286) ja Serratia rubidaea FB299 (NCIMB 40285), joiden viljelmät on tallennettu laitokseen National Collections of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB) Skotlannin Aberdeenissa.

10 Industrial and Marine Bacteria (NCIMB) Skotlannin Aberdeenissa hakunumerolla NCIMB 40285.

11. Antifungaalinen koostumus, jolla on käyttöä re- 35 hun säilömisessä tai jolla on käyttöä patenttivaatimukses- I) 95724 sa 1 tai patenttivaatimuksessa 4 määritellyn mukaisen re-huainekoostumuksen tai patenttivaatimuksessa 6 tai patenttivaatimuksessa 8 määritellyn mukaisen säilörehukoostumuk-sen valmistuksessa, tunnettu siitä, että siinä on 5 tehokas määrä bakteereita valittuna ryhmästä, johon kuuluvat Bacillus subtilis FB260 ja Serratia rubidaea FB299, molemmat patenttivaatimuksessa 10 määritellyn mukaisesti, ja niille sovelias kantaja.

12. Menetelmä patenttivaatimuksessa 1 määritellyn 10 mukaisen eläinten rehuainekoostumuksen valmistamiseksi tai säilömiseksi, tunnettu siitä, että rehua käsitellään tehokkaalla määrällä sellaisen antifungaalisen bakteerikannan bakteerisoluja, joka valitaan ryhmästä, jonka muodostavat Bacillus subtilis FB260, jonka viljelmä 15 on tallennettu laitokseen National Collections of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB) Skotlannin Aberdeenissa, hakunumero NCIMB 40286, ja antifungaalinen Serratia-suvun kanta.

13. Menetelmä patenttivaatimuksessa 8 määritellyn 20 mukaisen säilörehukoostumuksen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että soveliasta rehua käsitellään tehokkaalla määrällä sellaisen antifungaalisen bakteerikannan bakteerisoluja, joka valitaan ryhmästä, jonka muodostavat Bacillus subtilis FB260, jonka viljelmä on tallennettu 25 laitokseen National Collections of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB) Skotlannin Aberdeenissa, hakunumero NCIMB 40286, ja antifungaalinen Serratia-suvun kanta; ja tehokkaalla määrällä maitohappoa tuottavan bakteerikannan bakteerisoluja suvusta, joka valitaan ryhmästä, jonka muodos-30 tavat Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus, Lacto-coccus ja Pediococcus. 95724