DE2907721C2

DE2907721C2 - Verfahren zur Herstellung einer stabilen Kultur eines Mikroorganismus der Gattung Lactobacillus

Info

Publication number: DE2907721C2
Application number: DE2907721A
Authority: DE
Inventors: Martin Bryce Blonay Smiley
Original assignee: Societe des Produits Nestle SA
Current assignee: Societe des Produits Nestle SA
Priority date: 1978-03-16
Filing date: 1979-02-28
Publication date: 1982-09-30
Also published as: OA06218A; AU517372B2; IL56745A0; US4399220A; ES477271A1; DK148797C; IT7948292A0; CH640568A5; AU4478279A; NL186329C; DE2907721A1; GB1560208A; JPS6239995B2; NL7902079A; IN150440B; FR2419976B1; FR2419976A1; IT1163972B; NL186329B; JPS54163885A

Description

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Die vorliegende. Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer stabilen Kultur eines Mikroorganismus der Gattung Lactobacillus, der _M mindestens ein extrachromosomales genetisches Element besitzt, welches einerseits seine Fähigkeit zur Bildung von Milchsäure aus Lactose stimuliert und andererseits seine Fähigkeit zur Metabolisierung von N-Acetyl-D-glucosamin kontrolliert. _M

Ein wichtiges Problem bei der industriellen Herstellung von Milchprodukten, wie z. B. Käse und Joghurt, liegt in der Instabilität der Stämme der höheren Mikroorganismen, die bei der Herstellung dieser Produkte verwendet weiden, insbesondere der Mikroorganismen, die Milchsäure aus Lactose bilden, wie z. B. die Spezies der Gattung Lactobacillus. Es ist in der Tat bekannt, daß die Fähigkeit der erwähnten Mikroorganismen (»Milchmikroorganismen«) zur Bildung von Milchsäure aus Lactose — welche hier aus als »Aktivität« oder »Milchsäurebildungsvermögen« bezeichnet wird — mit der Zeit abnehmen kann.

Einige Spezialisten haben den Mechanismus der Bildung von Milchsäure unter Berücksichtigung der Genetik studiert. Deshalb weiß man jetzt, daß ein Plasmid für die Fermentation von Lactose durch Streptococcus lactis verantwortlich ist und daß Plasmide beim Lactosemetabolismus gewisser Lactobacilli eine Rolle spielen können.

Die Plasmide sind extrachromosomale genetische so Elemente in Form eines ringförmigen Moleküls von Desoxyribonucleinsäure (DNA), dessen Gewicht einigen Promillen oder einigen Prozenten des Gewichts eines Chromosoms des Mikroorganismus entspricht

Außer für den Fall, daß ein Plasmid vollständig für die Fermentation von Lactose durch einen Mikroorganismus verantwortlich ist — in welchem Fall es ausreicht, den Mikroorganismus zur Bewahrung seiner Aktivität in Milch zu kultivieren — kann der gegenwärtige Wissensstand kaum in der Industrie angewendet μ werden, wenn es um die Stabilität der Aktivität von Milchmikroorganismen geht

Darüber hinaus weiß man, daß verschiedene Stämme der gleichen Spezies von Mikroorganismen hinsichtlich ihres Milchsäurebildungsvermögens stark unterschiedlieh sein können. Dies gilt insbesondere für den Mikroorganismus Lactobacillus helveticus von der Unterspezies jugurti. Dieser Mikroorganismus wird bei der Herstellung von Giqjyere, Emmentaler und Parmesan verwendet Es wan·: also alles andere als nur eine akademische Übung, iyenn man die Gründe dieser Unterschiede erklären;; und bei jedem Stamm eine maximale Aktivität garantieren könnte.

Durch die vorliegend!; Erfindung wird dieses Problem nunmehr gelöst Die Lösung besteht darin, daß man bei dem eingangs genannten Verfahren den Mikroorganismus in einem Nährmedium kultiviert, dessen assimilierbare Hauptkohlenstoffquelle aus N-Acetyl-D-glucosamin besieht

Mit dem Ausdruck »assimilierbare Hauptkohlenstoffquelle« i'Si. hier die bestimmende Quelle gemeint ohne welche der Mikroorganismus sich nicht entwickeln kann, weis aber nicht die Anwesenheit anderer »Nebenqtielien« ausschließt die dem Medium mit einer Quelle für Spurenelemente und Vitamine, wie z. B. einem Hefeextrakt zugegeben werden.

Im Verlauf einer grundlegenden vergleichenden Studie der Eigenschaften von zwei Stämmen ein und dergleichen -Spezies von Lactobacillus, nämlich Lactobacillus helveticus der Unterspezies jugurti, von denen einer ein wesentlich höheres Milchsäurebildungsvermögen als der andere aufwies, wurde in der Tat festgestellt daß diese: Kapazität der Anwesenheit eines Plasmids mit 13,17 Kilobasen (kb) zuzuschreiben ist Dieses Plasmid war beiim Stamm mit einem schwachen Vermögen abwesend. Es wurde gefunden, daß dieses Plasmid nicht die Fähigkeit des Stamms zur Bildung von Milchsäure aus Lactose kontrolliert, sondern diese Fähigkeit stimuliert d. h. also, daß es einen Faktor kontrolliert, der die Bildung von Milchsäure stimuliert, wobei diese Bildung, ^stimuliert oder nicht stark oder schwach, durch Gene kontrolliert wird, die im Chromosom vorhanden sind Darfiber hinaus wurde festgestellt daß das gleiche Plasmid vollständig die Fähigkeit des Mikroorganismus zur Metiibolisierung von N-Acetyl-D-glucosamin kontrolliert So wurden also die Gründe aufgedeckt warum die beiden Stämme der gleichen Spezies nicht das gleiche Milchsäurebildungsvermögen besitzen, und wurde auch ein Mittel gefunden, das in der Industrie vortrefflich verwendet werden kann, Stämme dieser Mikroorganismen zu kultivieren und sie bei einer starken Aktivität zu stabilisieren.

In der Tat ist es möglich, daß Plasmide bei der Zellteilung verlorengehen. Einerseits ist die Verdoppelung der Chromosomen nicht notwendigerweise mit der Verdoppelung der Plasmide verbunden und andererseits sind die bei der Verdoppelung entstehenden Plasmide nicht unbedingt in gleichen Teilen in den aus der Zellteilung hervorgehenden Zellen verteilt Wenn jedoch die Zellen auf einem Medium kultiviert werden, dessen Hauptkohlenstoffquelle nur aufgrund eines Plasmids ausgebeutet werden kann, dann sind die Zellen ohne Plaitmide nicht lebensfähig, weshalb sie auf Kosten von Zellen mit Plasmiden verschwinden.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird also ein Mikroorganismus der Gattung Lactobacillus verwendet, der mindestens ein extrachromosomales genetisches Element, d. h. also ein Plasmid, besitzt, welches einesteils seine Fähigkeit zur Bildung von Milchsäure aus Lactose stimuliert und andererseits sein Vermögen zur Metabolisierung von N-Acetyl-D-glucosamin kontrolliert. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Mikroorganismus um Lactobacillus helveticus der Unterspezies jugurti S 36-2, der vom Landwirtschaftlichen Mikrobiologischen Institut der Universität Bologna 111 Italien erhältlich ist.

Der Mikroorganismus kann dadurch gehalten oder konserviert werden, daß man ihn einige Monate in ein wäßriges Medium mit einem Trockenfeststoffgehalt von 5—10Gew.-% bringt, das eine entsprechende assimilierbare Stickstoffquelle, Salze, Spurenelemente und Vitamine sowie N-Acetyl-D-glucosamin als assimilierbare Hauptkohlenstoffquelle enthält, wobei dieses Medium vor der Überführung sterilisiert worden ist, beispielsweise durch Erhitzen in einem Autoklaven während 30 min auf 115° C. Das beimpfte Medium kann ₎₀ bei einer Temperatur inkubiert werden, die für das Wachstum des Mikroorganismus günstig ist, beispielsweise 40 bis 42° C, bis seine optische Dichte dem logarithmischen p. ejc-Halbwachstum entspricht. Er kann zwischen den Oberführungen auf eine Temperatur gehalten werden, die ausreichend tief liegt, daß sich der Mikroorganismus nicht vermehrt, beispielsweise 5—10⁰C Wenn es erwünscht ist, eine Menge an Mikroorganismus zu erzeugen, die zur industriellen Herstellung von beispielsweise Käse oder Joghurt nötig ist, dann Tcann man von den obigen Kulturen ausgehen, sie in Milch kultivieren und sie so oft wie nötig, beispielsweise 3 bis 4mal, überführen, und zwar bei einer für ihr Wachstum günstigen Temperatur. Die Überführungen können in einem Verhältnis von 0,5 bis zu 2s einigen Volumenprozenten, zweckmäßig 1 Volumenprozent, zu übertragender Kultur zum Volumen der zu beimpfenden Milch erfolgen.

Die Erfindung wird anhand des folgenden Beispiels weiter erläutert Die Prozentangaben sind in Gewicht ausgedrückt

Beispiel

Einerseits kultiviert man gesondert zwei Stämme von Lactobacillus helveticus Unterspezies jjgurti mit der No. S 13-8 bzw. S 36-2, die vom Landwirtschaftlichen Mikrobiologischen Institut der Universität Bologna in Italien erhalten worden sind, in einer Suspension von 10% Magermilchpulver und 0,1% Hefeextrakt in Wasser, wobei die Suspension in einem Autoklaven während 30 min bei 115°C sterilisiert worden ist Nach einer Inkubation von 8 st bei 42" C hat der Stamm S 13-8 1,5% und der Stamm S 36-2 2,4% Milchsäure in der Suspension gebildet.

Andererseits züchtet man den Stamm S 36-2 auf einem MRS-Medium (J. C. de Man, M. Rogosa und M. F. Sharpe, J. Appl. Bact.23, 130-135 (I960)) für Lactobazilli. Man überführt Proben dieser Kultur in frisches MRS-Medium, dem 7 μg/ml Acriflavin zugesetzt worden sind. Man inkubiert 24 st Man beimpft erneut ein ίο MRS-Medium, das durch Zusatz von 14% Agar verfestigt worden ist, und inkubiert unter einer Atmosphäre von Wasserstoff und CO₂. Hierauf isoliert man individuelle Kolonien.

Dann kultiviert man in einem modifizierten MRS-Medium der folgenden Zusammensetzung:

10g

N-Acetyl-D-glucosamin
Polypepton 10 g

Hefeextrakt 5 g Polyoxyäthylensorbitanmonooleat 1 ml

K₂HPO₁ 2 g

CH₃COONa · 3 H₂O 5 g Diammoniumcitrat 2 g

MgSO« -7 H₂O 0,2 g

MnSO₄ · 4 H₂O 0,05 g

destilliertes Wasser 1 I

einzeln eine gewisse Anzahl von Proben des Stamms S 36-2, der nicht der Behandlung mit Acriflavin unterworfen worden ist, und die obigen Kolonien, die der Behandlung mit Acriflavin unterworfen worden sind. Es wird festgestellt, daß etwa 60% dieser Kolonien nicht in der Lage sind, auf dem obigen Medium zu wachsen, in welchem N-Acetyl-D-glucosarnin die assimilierbare Hauptkohlenstoffquelle ist Dagegen ist nur 1% der Bezugsproben hierzu unfähig. In einer wäßrigen Suspension nvt 10% Magermilchpulver und 0,1% Hefeextrakt wird sichergestellt, daß die Kolonien die nicht zur Metabolisierung von N-Acetyl-D-glucosamin fähig sind, in 8 st Milchsäuremengen zwischen 1,3 und 1,6% erzeugen können, d.h. also genauso viel wie der Stamm S 13-8. Im Gegensatz hierzu sind praktisch alle Bezugsproben dazu fähig, auf dem modifizierten MRS-Medium zu wachsen, wobei sie auf dem Medium aus Magermilchpulver und Hefeextrakt in 8 st 2,3—2,6% Milchsäure erzeugen. Diese Eigenschaft bleibt intakt, wenn man diese Proben auf dem modifizierten MRS-Medium kultiviert oder hält

Durch geeignete Techniken der ,Hydrolyse, der Trennung durch Zentrifugierung unter einem Dichtegradienten von CsCI-Ethidiumbromid und der Elektronenmikroskopie wird sichergestellt daß ein Plasmid von 13,17 kp, das im Stamm S 36-2 anwesend ist, im Stamm S 13-8 abwesend ist und im mit Acriflavin behandelten Stamm S 36-2 neutralisiert ist, einesteils für die Erhöhung der Bildung der Milchsäurebildung von ungefähr 1,5 auf ungefähr 2,4% — wie oben bestimmt — und andererseits für die Metabolisierung von N-Acetyl-D-glucosamin verantwortlich ist.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung einer stabilen Kultur eines Mikroorganismus der Gattung Lactobacillus, der mindestens ein extrachromosomales genetisches Element besitzt, welches einerseits seine Fähigkeit zur Bildung von Milchsäure aus Lactose stimuliert und andererseits seine Fähigkeit zur Metabolisierung von N-Acetyl-D-glucosamin kontrolliert, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mi- kroorganismus in einem Nährmedium kultiviert, dessen assimilierbare Hauptkohlenstoffquelle aus N-Acetyl-D-glucosamin besteht

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Lactobacil-Ius helveticus der Unterspezies jugurti No. S 36-2 vom Landwirtschaftlichen Mikrobiologischen Institut der Universität Bologna in Italien kultiviert.