CH638660A5 - Verfahren zur herstellung von bifidobakterien enthaltenden nahrungsmitteln und getraenken. - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Kultivierung von Bifidobakterien in Milchmedien oder halbsynthetischen Medien und zur Aufarbeitung der erhaltenen Kulturen zur Herstellung von Bifidobakterien enthaltenden Nahrungsmitteln und Getränken.

Es ist bekannt, dass Bifïdobakterium fast die gesamte Darmflora von Säuglingen ausmacht. Es liegen viele Berichte über Studien der physiologischen Bedeutung dieser Bakterien vor, die die Hemmwirkung auf Fäulnis durch Fäulnisbakterien, die Hemmwirkung auf die Produktion toxischer Amine, die Verdauungs wirkung auf menschliches Milchkasein durch die Wirkung auf Phosphorproteinphosphatase und die Hemmwirkung auf das Wachstum pathogener Keime durch einen verminderten pH-Wert des Darmes als Folge der Produktion organischer Säuren aus Lactose, wie beispielsweise Milchsäure, Essigsäure und Ameisensäure, klarstellen. Dieses wertvolle Bifïdobakterium ist jedoch im Darmtrakt von Flaschenkindern in sehr geringer Menge vorhanden, was als eine Ursache dafür angesehen wird, dass Flaschenkinder gegenüber mit Frauenmilch ernährten Säuglingen eine grössere Anfälligkeit gegenüber Darmerkrankungen aufweisen.

Um die Darmflora von Flaschenkindern derjenigen von mit Frauenmilch ernährten Säuglingen anzupassen, wurde ein Versuch unternommen, Bifidobakterien enthaltendes Milchpulver für Säuglinge herzustellen und ferner unter Verwendung verschiedener Arten von Bifïdobakterium Gärungsmilchprodukte herzustellen, von denen man sich eine gesundheitsfördernde Wirkung auf Kinder und auf Erwachsene versprach.

(a) Bifïdobakterium ist jedoch ursprünglich obligat anaerob und erfordert daher streng anaerobe Wachstumsbedingungen;

(b) es wächst auf reinen Kuhmilchmedien, die keinen Wachstumsbeschleuniger, wie Hefeextrakt oder Maisweichwasser, enthalten, ausserordentlich schlecht und

(c) wenn Wachstumsbeschleuniger und Reduktionsmittel den Kuhmilchmedien zugesetzt werden, wächst Bifïdobakterium unter den gleichen aeroben Bedingungen, wie sie zur Kultivierung von Lactobacillus nötig sind, solche s Zusatzstoffe sind jedoch im allgemeinen teuer und verderben den Geschmack der erhaltenen Kulturen.

Da die Kultivierung aus den obengenannten Gründen sehr viel schwieriger ist als diejenige von Lactobacillus, wurde die industrielle Produktion von Nahrungsmitteln und Ge-lo tränken, die diese Bakterien enthielten, bisher nicht durchgeführt. In Anbetracht der obengenannten Tatsache wurden viele Studien durchgeführt mit dem Ziel, ein Verfahren zur praktischen Kultivierung von Bifïdobakterium zu finden, das es gestattet, Nahrungsmittel und Getränke, die Bifido-15 bakterium enthalten, zu einem niedrigen Preis herzustellen. Überraschenderweise wurde festgestellt, dass Bifidobacterium bifidum, YIT-4002 (FERM-P Nr. 3371), YIT-4005 (FERM-P Nr. 3372) und Bifidobacterium breve, YIT-4006 (FERM-P Nr. 3906), die Varietäten (dissociants) von Bifido-20 bakterium mit hochspezifischen Eigenschaften sind, zur Herstellung von Gärungsmilchprodukten geeignet sind. Die genannten Varietäten (dissociants) können sich unter aeroben Bedingungen in reinen Kuhmilchmedien vermehren, und darüber hinaus ist YIT-4005 so stark säureresistent, dass sie 25 während der Konservierung nicht leicht abstirbt. Als Ergebnis weiterer Studien wurden die folgenden interessanten Daten ermittelt. Wenn die Varietäten (unter Varietät werden auch durch Mutation entstandene Varianten verstanden) mit für gewöhnlich obligat anaeroben Bifidobakterien kultiviert 30 werden, wachsen die obligaten Anaerobier in zufriedenstellender Weise in einem reinen Kuhmilchmedium unter aeroben Bedingungen (vgl. die weiter unten beschriebenen Versuche).

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von 35 Bifidobakterien enthaltenden Nahrungsmitteln und Getränken durch Kultivierung von obligat anaeroben Bifidobakterien in einem Milchmedium oder einem halbsynthetischen Medium und geeignete Aufarbeitung der erhaltenen Kultur ist durch eine gemischte Kultivierung von sauerstoffresisten-40 ten, durch Mutation entstandenen Varianten (Dissozianten) von Bifïdobakterium mit obligat anaeroben Bifidobakterien gekennzeichnet.

Nach dem erfmdungsgemässen Verfahren können Nahrungsmittel und Getränke, die mehr als eine Art Bifidobak-45 terium enthalten, durch einfache Kultivierung von Bifïdobakterium, das ein obligater Anaerobier ist, unter aeroben Bedingungen, die denjenigen für sauerstoffresistente Varietäten oder Lactobacilli ähnlich sind, erhalten werden. Dieses Verfahren ist vorteilhafter als die alleinige Verwendung ge-50 wohnlichen Bifidobakteriums oder seiner sauerstoffresistenten, durch Mutation entstandenen Varietäten, da es Produkte liefern kann, die alle zusammen ausgezeichnet hinsichtlich physiologischer Aktivität und Geschmack sind, indem nach Art des gewünschten Produkts und Verwendungszwecks 55 ausgewählte Bifidobakteriumspecies mit unterschiedlichen Eigenschaften hinsichtlich physiologischer Aktivität, Säureproduktionsfähigkeit während der Kultivierung und Ein-fluss auf den Geschmack des Produkts miteinander kombiniert werden.

60 Die im erfmdungsgemässen Verfahren verwendeten sauerstoffresistenten Varietäten von Bifïdobakterium umfassen sämtliche Varietäten von Bifïdobakterium, die in der Lage sind, in reinen Milchmedien unter aeroben Bedingungen zu wachsen, wie beispielsweise die oben erwähnten «s Stämme YIT-4002, YIT-4005 und YIT-4006. Die wachstumsfördernde Aktivität von obligat anaeroben Stämmen unter aeroben Bedingungen ist allen sauerstoffresistenten Varietäten gemeinsam und ist nicht auf die obigen drei Ar

3

638 660

ten beschränkt. Für die Zusammensetzung der für die gemischte Kultivierung von obligat anaeroben Varietäten und sauerstoffresistenten Varietäten verwendeten Medien gilt weder eine Einschränkung, noch sind bestimmte Ingredienzien erforderlich. Beispielsweise kann jede beliebige Milch mit einem Feststoffgehalt von 10 bis 20% (Vollmilch, Magermilch oder aus Pulvermilch wiedergewonnene Milch) verwendet werden. Halbsynthetische Medien, die keine Milchfeststoffe enthalten, können ebenfalls verwendet werden. Da keine wachstumsfördernden Mittel, wie beispielsweise Hefeextrakt, CSL oder Pepton, und Reduktionsmittel, wie L-Ascorbinsäure und L-Cystein, erforderlich sind, wird fermentierte Milch erhalten, die nur Bifïdobakterium allein enthält. Das Wachstum der Bakterien kann jedoch durch die Verwendung der obengenannten Zusatzstoffe innerhalb der Grenzen, in denen ihr Einfluss auf den Geschmack der Produkte tQlerierbar ist, oder wenn keine Probleme hinsichtlich des Charakters der Produkte auftreten, beschleunigt werden.

Für den Starter werden Präparationen von obligat anaeroben Varietäten und sauerstoffresistenten Varietäten im Verhältnis von 1:1 bis 3:1 gemischt, wobei sie für die Beimp-fung in einer Menge von 1-3 Gew.-% den Medien zugesetzt werden. Es ist nicht erforderlich, das Medium während der Kultivierung anaerob zu machen, wobei die Verwendung von Apparaten möglich ist, wie sie routinemässig für die Kultivierung von Lactobacilli verwendet werden.

Kultivierung bei 37 °C ergibt üblicherweise in 18-24 Stunden die höchstmögliche Keimzahl (viable count) für jede Varietät. Organische Säuren, wie beispielsweise Milchsäure und Essigsäure, werden während des Wachstums gebildet. Wenn die Kultivierung weiter fortgesetzt wird, beginnt die Bakterienanzahl abzunehmen, die Säurebildung dauert jedoch fort, wobei in 40-50 Stunden Sättigung erreicht wird. Die Kultivierung wird überwacht und je nach dem Verwendungszweck zu einem geeigneten Zeitpunkt unterbrochen.

Die erhaltene Kultur kann so, wie sie ist, für Nahrungsmittel, die Bifïdobakterium enthalten, verwendet werden, oder die Konzentration und der Geschmack der Kultur kann durch Zugabe von Süssungsmitteln, Fruchtsaft, Wasser, Geschmacksstoffen usw. abgeändert werden. Ausserdem kann die Kultur getrocknet werden, um Nahrungsmittel oder Pulverpräparate oder Tabletten zu erhalten, die Bifïdobakterium enthalten. Die Verarbeitung der Kultur bzw. der Typ des Endprodukts unterliegt keinen Einschränkungen, solange das Bifïdobakterium nicht abgetötet wird. Die in dieser Beschreibung genannten «Nahrungsmittel und Getränke» umfassen alles, was als Nahrungsmittel eingenommen wird, von Nahrungsmitteln und Getränken für den Geschmack bis zu Präparaten für vorbeugende medizinische Behandlung.

Die Erfindung wird im folgenden durch einen Versuch und durch Beispiele näher erläutert, und es wird eine vollständige Aufzählung der repräsentativen bakteriologischen Eigenschaften der drei obenerwähnten Varietäten von sauer-5 stoffresistenten Varietäten gegeben. Der «Säuregrad» (acidi-ty) ist das Volumen in Milliliter 0,1 n Natronlauge, die zur Neutralisation von 10 ml der Kulturlösung erforderlich sind.

io Versuch

In einen 300-ml-Kolben wurden 150 ml 16%ige rückverdünnte Magermilch pipettiert, und der Kolben wurde mit einem Wattepfropfen verschlossen; dann wurde der Kolben 15 Minuten lang bei 120 °C sterilisiert. Nachdem das Medium 15 durch Rühren in fliessendem Wasser auf 37 °C abgekühlt war, wurden 2 Gew.-% jedes der Starter von Bifïdobakterium, wie in Tabelle 1 angegeben, zugegeben, und bei 37 °C bei statischer Kultur bebrütet. Währenddessen wurden die zeitlichen Veränderungen der Keimzahlen und des Säure-20 grades gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben. (Die für das erfindungsgemässe Verfahren angegebenen aeroben Bedingungen zeigen die obenerwähnten Kulturbedingungen an. Die Kulturbedingungen waren die gleichen wie die Basiskulturbedingungen für die sogenannten Milch-25 lactobacilli, die für die Herstellung fermentierter Milch,

Käse und Getränke, die Milchsäurebakterien enthalten, angewendet werden.)

YIT-4002, YIT-4005 und YIT-4006, sauerstoffresistente Varietäten von Bifïdobakterium, wachsen alle ausgezeichnet 30 unter aeroben Bedingungen in Kuhmilchmedien, wobei sie eine Keimzahl von 2,3 bis 5,0 x 109 pro ml nach 17 Stunden Kultur ergeben. Im Gegensatz dazu zeigten die anderen Varietäten von Bifïdobakterium (alle waren die standardisierten, obligat aeroben Varietäten) kaum eine Erhöhung der 35 Keimzahl; einige zeigten bemerkenswert langsamen Anstieg des Säuregrades und starben kurz nach der Beimpfung ab.

In das nach der gleichen Methode wie oben hergestellte Medium wurden 2 Gew.-% der durch Vermischen gleicher Volumina jeder Varietät von Bifïdobakterium, wie in Tabel-40 le 2 angegeben, und einem der obenerwähnten Varietäten erhaltenen Startermischung gegeben und unter statischen Kulturbedingungen bei 37 °C beimpft; die lebensfähige Keimzahl und der Säuregrad wurden in Abhängigkeit von der Zeit gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben. 45 Wenn die Mischung von Bifïdobakterium und den oben erwähnten Varietäten kultiviert wurde, war die Keimzahl und der Säuregrad ähnlich wie bei obenerwähnten Varietäten, selbst in einem reinen Milchmedium unter aeroben Bedingungen, obwohl je nach der Art einige Unterschiede vor-50 handen waren.

Tabelle I

Kultivierung (h)

0

17

24

41

Messgrössen

Säure

Keimzahl

Säure

Keimzahl

Säure

Keimzahl

Säure

Keimzahl

Varietäten grad

(ml"')

grad

(ml-1)

grad

(ml-1)

grad

(ml"1)

YIT-4002

3,5

4,2 x I07

14,4

4,9 x IO9

21,2

4,8 x IO9

27,2

7,3 x IO8

YIT-4006

3,4

7,0 x IO7

10,0

2,3 x IO9

13,5

8,9 x IO8

17,0

5,6 x IO8

YIT-4005

3,5

4,5 x IO7

13,9

5,0 x IO9

19,6

4,6 x IO9

25,1

3,1 x IO9

B. longum

3,6

5,7 x IO7

5,2

6,2 x IO7

5,4

5,4 x IO7

6,3

1,0 x IO7

B. breve

3,6

4,0 x IO7

6,7

5,1 x IO7

7,8

3,6 x IO7

9,2

1,1 x IO7

B. adoles

3,4

3,4 x IO7

4,4

1,8 x IO7

4,6

1,2 x IO7

5,1

6,4 x 10®

B. infantis

3,5

6,0 x IO7

4,5

4,6 x IO6

4,8

1,2 x IO6

5,3

1,0 x IO5

B. bifidum

3,4

4,0 x IO7

5,9

6,0 x IO7

6,6

3,9 x IO7

7,5

2,4 x IO7

638660

4

Tabelle 2

Kultivierung (h)

0

17

24

41

Messgrössen Varietäten \

Säuregrad

Keimzahl (ml"1)

Säuregrad

Keimzahl (ml"1)

Säuregrad

Keimzahl (ml"1)

Säuregrad

Keimzahl (ml-1)

B. longum YIT-4002 Gesamt

3,5

2.5 x 107 2,2 x 107

4.6 x 107

13,9

7,7 x 108 4,7 x 109 5,5 x 109

22,8

9,2 x 108 5,8 x 109 6,8 x 109

28,6

1,8 x 108 4,2 x 108 6,5 x 108

B. breve

YIT-4002

Gesamt

3,6

7,7 x 107 2,0 x 107 9,6 x 107

18,5

6,5 x 109 2,0 x 109 8,5 x 109

24,5

4,8 x 109

1.4 x 109

6.5 x 109

29,5

3,4 x 107 3,8 x 106 3,7 x 107

B. adoles YIT-4005 Gesamt

3,4

1,7 x 107 2,7 x 107 4,2 x 107

13,4

4,0 x 108 5,6 x 109 6,5 x 109

21,0

8,9 x 108 4,9 x 109 5,9 x 109

28,4

5,6 x 108 3,5 x 109 4,2 x 109

B. infantis YIT-4005 Gesamt

3,5

3,8 x 107 2,8 x 107 6,2 x 107

11,8

8,5 x 108 3,7 x 109 4,5 x 109

22,3

1,2 x 109 6,0 x 109 7,0 x 109

28,9

6,5 x 108 3,8 x 109 4,5 x 109

B. bifidum

YIT-4005

Gesamt

3,4

2.5 x 107 3,0 x 107

5.6 x 107

17,9

4,6 x 109 3,0 x 109 6,8 x 109

25,6

5,2 x 109 3,5 x 109 7,8 x 109

31,6

4,0 x 108 1,3 x 109 1,5 x 109

B. longum YIT-4006 Gesamt

3,4

4,4 x 107 4,2 x 107 6,0 x 107

12,8

5,9 x 108 2,5 x 109 2,7 x 109

23,0

8,0 x 108 1,6 x 109 1,8 x 109

28,0

2,1 x 108 4,0 x 108 4,3 x 108

Hinterlegungsdaten:

Bifidobacterium bifidum YIT-4002 Déposition Nr. FERM-P 3371 Déposition Date: December 30,1975

Bifidobacterium bifidum YIT-4005 Déposition Nr. FERM-P 3372 Déposition Date: December 30,1975

Bifidobacterium breve YIT-4006 Déposition Nr. FERM-P3906 Déposition Date: January 28,1977

Adresse der Hinterlegungsstelle:

Fermentation Research Institute,

Agency of Industriai Science and Technology,

Ministry of International Trade and Industry 1-3, Higashi 1-chome, Yatabe-cho,

Tsukuba-gun, Ibaragi-ken, Japan

Beispiel 1

Ein 16%iges Vollmilchmedium wurde mit je 1% Starter von Bifidobacterium longum (I) und Bifidobacterium bifidum (YIT-4002) (II) beimpft und 30 Stunden lang unter aeroben Bedingungen bei 37 °C bebrütet. Die Keimzahl der erhaltenen Kultur betrug insgesamt 2,5 x 109/ml (6,5 x 108/ml für I und 2,0 x 109/ml für II), und der Säuregrad betrug 24,5. Die Kultur wurde mit einem Homogenisator homogenisiert, und 110 Teile der Kultur wurden mit 3 Teilen Saccharose, 3 Teilen Sorbitol, 3 Teilen Möhrensaft und 80 Teilen Wasser verdünnt, so dass ein fermentiertes Milchprodukt erhalten wurde, das die beiden obenerwähnten Varietäten enthielt.

Beispiel 2

Ein 10%iges Magermilchmedium wurde mit je 1% Starter von Bifidobacterium bifidum (III) und Bifidobacterium breve (YIT-4006) (IV) beimpft und 20 Stunden lang unter aeroben Bedingungen bei 37 °C bebrütet. Die Keimzahl der erhaltenen Kultur betrug insgesamt 2,5 x 109/ml (1,4 x 109/ ml für III und 1,9 x 109/ml für IV). Die Kultur wurde so, wie sie war, eingefroren und 6 Stunden lang bei einem Druck

30 von weniger als 266 Pa (2 mmHg) getrocknet, wodurch ein Milchpulver eines fermentierten Milchproduktes erhalten wurde, das die beiden obenerwähnten Varietäten enthielt.

Beispiel 3

35 Ein halbsynthetisches Medium der unten angegebenen Zusammensetzung wurde mit je 1 % der Starter von Bifidobacterium longum (V), Bifidobacterium bifidum (YIT-4005) (VI) und Lactobacillus acidophilus (VII) beimpft und 20 Stunden lang unter aeroben Bedingungen bei 37 °C bebrütet. 40 Die Keimzahl der erhaltenen Kultur betrug insgesamt

3.6 x 109/ml (4,0 x 108/ml für V, 1,0 x 109/ml für VI und

1.7 x 109/ml für VII). Die Kultur wurde zur Abtrennung und Gewinnung der Zellkulturen in eine Gefrierzentrifuge eingefüllt. Die Zellen wurden in 30 ml eines Mediums dispergiert,

45 das 10% Magermilch, 1,0% Natriumglutamat und 1% Vitamin C enthielt, und dann gefriergetrocknet, um ein Trok-kenmaterial zu erhalten, das die drei obengenannten Varietäten enthielt. Das erhaltene Trockenmaterial wurde mit dem 20fachen Volumen getrockneter Stärke vermischt und so auf einer Tablettenmaschine zu Tabletten gepresst.

Zusammensetzung des Mediums Behandeltes CSL* 70 g

Glucose 20 g

55 KH2P04 1 g

K2HP04 2g

Wasser 927 ml

(pH 7,0)

*) Nachdem Citronensäure zu 10% in CSL aufgelöst war, wurde der 60 pH-Wert mit Natriumhydroxyd auf 8,0 eingestellt. Das Zentrifu-gieren erfolgte 10 Minuten lang bei 10 000 U./min, um den Niederschlag zu beseitigen.

Bakteriologische Eigenschaften der sauerstoffresistenten 65 Varietäten von Bifïdobakterium

(1) Taxologische Eigenschaften

Sie sind grampositiv, asporogene (nicht sporenbiidende) Bazillen mit Granula, die eine Affinität für Methylenblau

5

638 660

haben, in den Zellen. Unter dem Mikroskop sind sie kurze, keulenförmige Stäbchen, die häufig gegabelt sind. Die Kolonien sind zylindrisch, konvex oder linsenförmig. Wenn sie in 12%iger verminderter Magermilch kultiviert werden, produzieren sie hauptsächlich Essigsäure und Milchsäure.

Katalase (—), Milchkoagulierbarkeit (+), Gelatineverflüssigung (—), Schwefelwasserstoffbildung (—), Indol-produktion (—), Salpetersäurereduktion (—) und Kohlen-dioxydproduktion (—).

(2) Zuckervergärung

(a) YIT-4002, YIT-4005

Positiv für Glucose, Fructose, Lactose und Galactose.

Negativ für Arabinose, Xylose, Salicin, Mannose, Mannitol, Melezitose, Cellobiose, Sorbit, Inulin, Tre-halose, Rhamnose, Maltose, Ribose und Sorbose.

(b) YIT-4006

Positiv für Glucose, Fructose, Lactose, Galactose,

Salicin, Melezitose, Cellobiose, Maltose, Ribose und Mannose.

Negativ für Arabinose, Xylose, Mannit, Sorbit, Inulin, Trehalose, Rhamnose und Sorbose.

s

(3) Wachstumsbedingungen (a) YIT-4002, YIT-4005 25 bis 45 °C, pH-Wert 5 bis 7 (optimale Bedingungen 36-38 °C, pH 6-7).

io (b) YIT-4006

25 bis 42 °C, pH-Wert 5 bis 9 (optimale Bedingungen 36-38 °C, pH 6-7).

Auf den obigen Eigenschaften beruhend wurden (a) YIT-4002 und YIT-4005 und (b) YIT-4006 auf der Grundlage is von Bargey's Manual (1974) als (a) Bifidobacterium bifidum und (b) Bifidobacterium breve identifiziert. Da sie jedoch die obenerwähnten Eigenschaften aufweisen, die bei bekannten Arten von Bifïdobakterium nicht bekannt sind, schlössen wir, dass sie Varietäten von Bifïdobakterium sind.

s

Claims (6)

1. 638660

   2

   PATENTANSPRÜCHE

   1. Verfahren zur Herstellung einer Bifidobakterienkultur durch Züchtung obligat anaerober Bifidobakterien in einem Milchmedium oder einem halbsynthetischen Medium, dadurch gekennzeichnet, dass eine gemischte Kultivierung von sauerstoffresistenten Varietäten von Bifïdobakterium mit den obligat anaeroben Bifidobakterien durchgeführt wird.
2. 2. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die sauerstoffresistente Varietät von Bifïdobakterium Bifidobacterium bifidum YIT-4002 (Hinter-legungs-Nr. FERM-P 3371) ist.
3. 3. Verfahren gemäss Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass die sauerstoffresistente Varietät von Bifïdobakterium Bifidobacterium bifidum YIT-4005 (Hinter-legungs-Nr. FERM-P 3372) ist.
4. 4. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die sauerstoffresistente Varietät von Bifïdobakterium Bifidobacterium breve YIT-4006 (Hinterlegungs-Nr. FERM-P 3906) ist.
5. 5. Anwendung des Verfahrens nach Patentanspruch 1 zur Herstellung von Bifidobakterien enthaltenden Nahrungsmitteln und Getränken, gekennzeichnet durch die'di-rekte Verwendung der erhaltenen Bakterienkultur zu Speisezwecken.
6. 6. Anwendung nach Patentanspruch 5, gekennzeichnet durch den Zusatz der erhaltenen Bakterienkultur während der Herstellung von Nahrungsmitteln.