CN112592860A - 不含动物来源氮源的婴儿双歧杆菌发酵培养基及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物培养基技术领域，提供一种不含动物来源氮源的婴儿双歧杆菌发酵培养基及其应用，培养基包括：非动物来源氮源、混合碳源、可溶性淀粉、氯化钠、L‑半胱氨酸盐、吐温‑80和维生素B1，其中，非动物来源氮源占培养基的含量为1.0‑3.0％；混合碳源占培养基的含量为0.5‑3.0％；可溶性淀粉占培养基的含量为0.1‑0.5％；氯化钠占培养基的含量为0.1‑1.0％；L‑半胱氨酸盐占培养基的含量为0.01‑1％；吐温‑80占培养基的含量为0.02‑1％；维生素B1占培养基的含量为0.01‑0.5％；培养基中pH为6.5‑8.5。本发明提供的培养基不含动物来源的氮源，可确保培养基不被复杂的污染物污染，确保在发酵生长婴儿双歧杆菌过程中安全性好、适用性高，发酵生长过程中工艺控制条件稳定，所得婴儿双歧杆菌产量高。

Description

不含动物来源氮源的婴儿双歧杆菌发酵培养基及其应用

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种不含动物来源氮源的婴儿双歧杆菌发酵培养基及其应用。

背景技术

双歧杆菌(Bifidobacterium)是人体最重要的生理性细菌，是胃肠道正常菌群中核心的优势菌群。长期和大量的研究表明，在人和豢养动物的整个生命过程中，双歧杆菌的多项生理调节功能对维持其健康状态具有至关重要的作用；换句话说，机体几乎所有的非健康状态，都直接或间接地与双歧杆菌数量和功能的平衡失调有关。正因如此，从20世纪70年代末开始，双歧杆菌制剂及其相关产品的开发及其产业化，成为健康产业链中重要的一环，在药品、保健品、食品、兽药和饲料等生产领域得到蓬勃发展，至今仍势头强劲。目前，双歧杆菌制剂及其相关产品的开发和生产主要通过发酵工程技术手段进行，主要有赖于双歧杆菌的大规模发酵培养，因此，不断开发出双歧杆菌高效、简便、廉价和安全的生产型培养基，以期提高培养效率，保证产品质量，降低生产成本，已成为双歧杆菌制剂及其相关产品的生产企业和研发机构着力追求的目标。

现有双歧杆菌的发酵培养基配方中几乎都含有动物来源氮源，包括但不限于酪蛋白胨、胰蛋白胨、胃蛋白胨、牛蛋白胨、水解乳蛋白、牛肉浸粉、牛肉浸膏、肝浸粉、消化血清粉等等，这类动物来源的氮源可能会残留在双歧杆菌的产品中，存在一定的安全隐患。例如专利CN201910299559.1公开了一种筛选适宜双歧杆菌增殖的氮源的培养基，利用培养基配方配置得到不同氮源的培养基，所述氮源包括：鱼骨蛋白胨、酵母提取物、酵母蛋白103、大豆蛋白胨、安琪蛋白胨、干酪素、酵母浸粉803、酵母浸粉528、水解植物蛋白、胰蛋白胨、胰酪蛋白胨、食品级水解植物蛋白、乳清蛋白粉、大豆蛋白粉、鱼蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸膏、牛肉浸膏、骨胶原蛋白胨、食品级干酪素、牛肉蛋白胨、牛骨蛋白胨。该培养基仍旧采用动物来源的氮源且氮源组分复杂，对婴儿双歧杆菌的安全性保证不足，具有一定的局限性。

因此，有必要提供一种新的发酵培养基以及工艺控制条件，以期解决现有技术中存在的不足。

发明内容

为解决现有技术的问题，本发明的目的在于提供一种不含动物来源氮源的婴儿双歧杆菌发酵培养基及其发酵生产方法，本发明提供的培养基不含动物来源的氮源，可确保培养基不被复杂的污染物污染，确保在发酵生长婴儿双歧杆菌过程中安全性好、适用性高，发酵生长过程中工艺控制条件稳定，所得婴儿双歧杆菌产量高。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明公开了一种不含动物来源氮源的婴儿双歧杆菌发酵培养基，所述培养基包括：非动物来源氮源、混合碳源、可溶性淀粉、氯化钠、L-半胱氨酸盐、吐温-80和维生素B1；

按W/V％计算，其中，所述非动物来源氮源占所述培养基的含量为1.0-3.0％；所述混合碳源占所述培养基的含量为0.5-3.0％；所述可溶性淀粉占所述培养基的含量为0.1-0.5％；所述氯化钠占所述培养基的含量为0.1-1.0％；所述L-半胱氨酸盐占所述培养基的含量为0.01-1％；所述吐温-80占所述培养基的含量为0.02-1％；所述维生素B1占所述培养基的含量为0.01-0.5％；所述培养基中pH为6.5-8.5。

进一步地，所述非动物来源氮源选自大豆蛋白胨、酵母浸粉、酵母浸膏、玉米浆、玉米浆干粉中的一种或者多种。

进一步地，所述非动物来源氮源优选为酵母浸粉。本发明采用非动物来源氮源本身具有丰富的可溶性蛋白、氨基酸、维生素、肽、多肽、核酸、无机盐、微量元素等，其营养结构很适合婴儿双歧杆菌的生长繁殖需要。

进一步地，所述混合碳源选自葡萄糖，蔗糖、麦芽糖、甘油、乳糖、半乳糖、低聚果糖、低聚半乳糖中的一种或者多种。

进一步地，所述混合碳源为：葡萄糖和低聚半乳糖的混合物，进一步优选地，二者的质量比为1:0.25～1。本申请通过改变培养基配方，例如增加维生素B1在培养基中的含量，在混合碳源中添加低聚半乳糖，实现非动物来源的氮源具有媲美动物来源氮源等同的效果。

进一步地，所述培养基按W/V％计算，其中，所述非动物来源氮源占所述培养基的含量为2.5％；所述混合碳源占所述培养基的含量为2.25％；所述可溶性淀粉占所述培养基的含量为0.25％；所述氯化钠占所述培养基的含量为0.25％；所述L-半胱氨酸盐占所述培养基的含量为0.05％；所述吐温-80占所述培养基的含量为0.1％；所述维生素B1占所述培养基的含量为0.02％；所述培养基中pH为7-8.0。

进一步地，所述培养基按W/V％计算，包括酵母粉2.5％，葡萄糖2.0％，低聚半乳糖0.25％，可溶性淀粉0.25％，氯化钠0.25％，L-半胱氨酸盐0.05％，吐温-80 0.1％，维生素B1 0.02％，pH7.5～8.0。

进一步地，所述婴儿双歧杆菌为婴儿双歧杆菌(B.infantis.CGMCC NO.0313-2)。

婴儿双歧杆菌(B.infantis.CGMCC NO.0313-2)通过健康婴儿的新鲜粪便中分离而得到。菌种的腮腺主要依据婴儿双歧杆菌菌体形态及菌落特征进行筛选。现将婴儿双歧杆菌进行平板分离，厌氧培养48-72小时，挑选圆形的、边缘整齐、凸起、表明光滑的、较大的菌落，菌落镜检菌体直或弯曲形，扩种一次，接发酵12小时厌氧培养后，离心收集菌泥，加保护剂制成菌悬液，装安瓿管。安瓿管装好后放-20℃预冻后，用真空冷冻干燥法冻干，装于多歧管上抽真空，保存在液氮中。婴儿双歧杆菌(B.infantis.CGMCC NO.0313-2)菌种特征鉴定如下表：

另一方面，本发明提供一种婴儿双歧杆菌的发酵生产方法，其通过将婴儿双歧杆菌种子液接种至本发明所述的不含动物来源氮源的婴儿双歧杆菌发酵培养基中培养，即可。本发明发酵生产方法，通过控制发酵培养的工艺条件，实现培养的婴儿双歧杆菌能达到10¹⁰cfu/ml的水平，以解决现有工艺无法实现的水平问题。

进一步地，所述发酵生长方法，包括以下工序：

工序一，种子扩培：配制不含动物来源氮源的婴儿双歧杆菌发酵培养基，加热灭菌；将婴儿双歧杆菌工作种子复融后接种至培养基中，密封并培养，菌液pH降至4.5以下，即种子扩培完成；

工序二，发酵培养：配制不含动物来源氮源的婴儿双歧杆菌发酵培养基，加热灭菌结束后，用纯度≥99％的无菌高纯氮气将发酵罐内溶解氧进行置换，直至溶解氧低于5％；工序一扩培完成的菌液全部接种至发酵罐内，用纯度≥99％的无菌高纯氮气维持罐压压力，培养；

发酵过程取样检测发酵液OD、残糖、活菌数；

工序三，离心收菌：发酵培养完成后，发酵液离心，收集菌体。

进一步地，所述发酵生长方法，包括以下工序：

工序一，种子扩培：配制不含动物来源氮源的婴儿双歧杆菌发酵培养基500ml，调节pH至7.5-8.0，并进行115℃，15分钟灭菌待用；取婴儿双歧杆菌工作种子，常温复融3分钟，接种至优选培养基中，密封并置37.0±1.0℃摇床，120rpm进行培养，菌液pH降至4.5以下，即种子扩培完成；

工序二，发酵培养：配制不含动物来源氮源的婴儿双歧杆菌发酵培养基10L，条件pH至7.5-8.0，并于20L不锈钢自动灭菌发酵罐中进行115℃，15分钟灭菌；灭菌结束后，用纯度≥99％的无菌高纯氮气将发酵罐内溶解氧进行置换，并低于5％；将种子扩培完成的菌液500ml全部接种至发酵罐内，用纯度≥99％的无菌高纯氮气维持罐压0.03-0.05兆帕，转速50-100rpm，37.0±1.0℃培养；

发酵前8h，每4h取样检测发酵液OD、残糖；发酵8h后，每2h取样检测发酵液OD、残糖、活菌数；

当发酵液pH降至7.0及以下时，用无菌20-30％KOH溶液进行维持罐内pH至7.0±0.2；通过添加KOH实现维持发酵过程中良好的pH；

当发酵液的残糖降至1.0％及以下时，用无菌50-70％葡萄糖溶液进行补料，维持罐内残糖1.0±0.2％；通过补充葡萄糖实现对培养的营养成分的增加，保持发酵过程中持续进行；

工序三，离心收菌：发酵培养20-24h后，发酵液进行10000g，4℃，离心5-10分钟，收集菌体。

相对现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明通过使用不含动物来源氮源配制了培养基，可减少后续培养的婴儿双歧杆菌的污染，同时保证培养的婴儿双歧杆菌的安全性。

运用本发明所述培养基，不仅配方简单，而且培养婴儿双歧杆菌的过程简单，增菌效果稳定性好，重复性好，适宜婴儿双歧杆菌的工业化大规模培养。培养的发酵液仅经过离心即可收集菌体，没有复杂的废液和废渣产生污染环境，表明是一种经济效益和生态效益俱佳的培养基。相对传统培养基，活菌数大大得到提高，成本也对应减低。

现有技术也尝试用不含动物来源氮源作为双歧杆菌发酵培养基，但都无法达到与动物来源氮源等同的技术效果，不含动物来源氮源用于婴儿双歧杆菌发酵培养基更是难以实现。例如专利CN1584013A公开了一种复合培养基，包括菊芋汁、玉米浆、大豆蛋白胨、半胱氨酸盐，其双歧杆菌最高生长量为10⁹cfu/ml，未能达到10¹⁰cfu/ml的水平。另外专利CN101597585A也公开了一种以玉米浆干粉(蛋白含量40％)、葡萄糖、吐温-80等组分的发酵培养基，其双歧杆菌最大生长量为10⁹cfu/ml，同样未能达到10¹⁰cfu/ml的水平。

本发明的发酵生产方法过程中，种子扩培和发酵培养均采用同一发酵培养基，真正实现在婴儿双歧杆菌培养过程中不存在动物来源氮源的过程，在实现婴儿双歧杆菌培养的安全性前提下，提高产量。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

培养基实施例1

一种不含动物来源氮源的婴儿双歧杆菌发酵培养基，所述培养基按W/V％计算，包括酵母粉2.5％，葡萄糖2.0％，低聚半乳糖0.25％，可溶性淀粉0.25％，氯化钠0.25％，L-半胱氨酸盐0.05％，吐温-80 0.1％，维生素B1 0.02％，pH7.5～8.0。将上述组分依次混合均一，即得。

培养基实施例2

一种不含动物来源氮源的婴儿双歧杆菌发酵培养基，按W/V％计算，其中，所述非动物来源氮源占所述培养基的含量为1.0％；所述混合碳源占所述培养基的含量为3.0％；所述可溶性淀粉占所述培养基的含量为0.1％；所述氯化钠占所述培养基的含量为1.0％；所述L-半胱氨酸盐占所述培养基的含量为0.01％；所述吐温-80占所述培养基的含量为1％；所述维生素B1占所述培养基的含量为0.01％；所述培养基中pH为8.5；

所述非动物来源氮源选自大豆蛋白胨、酵母浸粉的混合物，二者比例为1：1；所述混合碳源为：葡萄糖和低聚半乳糖的混合物，二者的质量比为1:1。

培养基实施例3

一种不含动物来源氮源的婴儿双歧杆菌发酵培养基，按W/V％计算，其中，所述非动物来源氮源占所述培养基的含量为3.0％；所述混合碳源占所述培养基的含量为0.5％；所述可溶性淀粉占所述培养基的含量为0.5％；所述氯化钠占所述培养基的含量为0.1％；所述L-半胱氨酸盐占所述培养基的含量为1％；所述吐温-80占所述培养基的含量为0.02％；所述维生素B1占所述培养基的含量为0.5％；所述培养基中pH为6.5；

所述非动物来源氮源选自酵母浸膏、玉米浆的混合物，二者比例为1:1；所述混合碳源选自葡萄糖，蔗糖的混合物，二者的质量比为1:1。

培养基实施例4

一种不含动物来源氮源的婴儿双歧杆菌发酵培养基，按W/V％计算，其中，所述非动物来源氮源占所述培养基的含量为5％；所述混合碳源占所述培养基的含量为2％；所述可溶性淀粉占所述培养基的含量为0.3％；所述氯化钠占所述培养基的含量为0.5％；所述L-半胱氨酸盐占所述培养基的含量为0.5％；所述吐温-80占所述培养基的含量为0.5％；所述维生素B1占所述培养基的含量为0.1％；所述培养基中pH为7；

所述非动物来源氮源为酵母浸粉；所述混合碳源为：葡萄糖和低聚半乳糖的混合物，二者的质量比为1:0.5。

实施例1

种子扩培：从工作种子库中取1支工作种子，接种于500ml优选培养基中，密封并置37.0±1.0℃摇床，120rpm进行培养24h，检测得pH＝4.28，镜检无污染，此为种子扩培液。

发酵培养：将培养完成的500ml种子扩培液接种至已灭菌的10L优选培养基中，用纯度≥99％的无菌高纯氮气维持罐压0.03-0.05兆帕，转速50-100rpm，37.0±1.0℃培养。发酵前8h，每4h取样检测发酵液OD、残糖；发酵8h后，每2h取样检测发酵液OD、残糖、活菌数。当发酵液pH降至7.0及以下时，用无菌20-30％KOH溶液进行维持罐内pH至7.0±0.2。当发酵液的残糖降至1.0及以下时，用无菌50-70％葡萄糖溶液进行补料，维持罐内残糖1.0±0.2％。发酵20h后，结束培养，取无菌样测定活菌数为1.2×10¹⁰cfu/ml。

离心收菌：发酵液进行10000g，4℃，离心5分钟，收集菌体108g，菌体活菌数为1.1×10¹²cfu/g。

实施例2

种子扩培：从工作种子库中取1支工作种子，接种于500ml优选培养基中，密封并置37.0±1.0℃摇床，120rpm进行培养24h，检测得pH＝4.30，镜检无污染，此为种子扩培液。

发酵培养：将培养完成的500ml种子扩培液接种至已灭菌的10L优选培养基中，用纯度≥99％的无菌高纯氮气维持罐压0.03-0.05兆帕，转速50-100rpm，37.0±1.0℃培养。发酵前8h，每4h取样检测发酵液OD、残糖；发酵8h后，每2h取样检测发酵液OD、残糖、活菌数。当发酵液pH降至7.0及以下时，用无菌20-30％KOH溶液进行维持罐内pH至7.0±0.2。当发酵液的残糖降至1.0及以下时，用无菌50-70％葡萄糖溶液进行补料，维持罐内残糖1.0±0.2％。发酵22h后，结束培养，取无菌样测定活菌数为1.8×10¹⁰cfu/ml。

离心收菌：发酵液进行10000g，4℃，离心5分钟，收集菌体115g，菌体活菌数为1.5×10¹²cfu/g。

实施例3

种子扩培：从工作种子库中取1支工作种子，接种于500ml优选培养基中，密封并置37.0±1.0℃摇床，120rpm进行培养24h，检测得pH＝4.20，镜检无污染，此为种子扩培液。

发酵培养：将培养完成的500ml种子扩培液接种至已灭菌的10L优选培养基中，用纯度≥99％的无菌高纯氮气维持罐压0.03-0.05兆帕，转速50-100rpm，37.0±1.0℃培养。发酵前8h，每4h取样检测发酵液OD、残糖；发酵8h后，每2h取样检测发酵液OD、残糖、活菌数。当发酵液pH降至7.0及以下时，用无菌20-30％KOH溶液进行维持罐内pH至7.0±0.2。当发酵液的残糖降至1.0及以下时，用无菌50-70％葡萄糖溶液进行补料，维持罐内残糖1.0±0.2％。发酵24h后，结束培养，取无菌样测定活菌数为2.2×10¹⁰cfu/ml。

离心收菌：发酵液进行10000g，4℃，离心5分钟，收集菌体125g，菌体活菌数为1.7×10¹²cfu/g。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种不含动物来源氮源的婴儿双歧杆菌发酵培养基，其特征在于，所述培养基包括：非动物来源氮源、混合碳源、可溶性淀粉、氯化钠、L-半胱氨酸盐、吐温-80和维生素B1；

按W/V％计算，其中，所述非动物来源氮源占所述培养基的含量为1.0-3.0％；所述混合碳源占所述培养基的含量为0.5-3.0％；所述可溶性淀粉占所述培养基的含量为0.1-0.5％；所述氯化钠占所述培养基的含量为0.1-1.0％；所述L-半胱氨酸盐占所述培养基的含量为0.01-1％；所述吐温-80占所述培养基的含量为0.02-1％；所述维生素B1占所述培养基的含量为0.01-0.5％；所述培养基中pH为6.5-8.5。

2.根据权利要求1所述不含动物来源氮源的婴儿双歧杆菌发酵培养基，其特征在于，所述非动物来源氮源选自大豆蛋白胨、酵母浸粉、酵母浸膏、玉米浆、玉米浆干粉中的一种或者多种。

3.根据权利要求1所述不含动物来源氮源的婴儿双歧杆菌发酵培养基，其特征在于，所述混合碳源选自葡萄糖，蔗糖、麦芽糖、甘油、乳糖、半乳糖、低聚果糖、低聚半乳糖中的一种或者多种。

4.根据权利要求1所述不含动物来源氮源的婴儿双歧杆菌发酵培养基，其特征在于所述混合碳源为：葡萄糖和低聚半乳糖的混合物。

5.根据权利要求1所述不含动物来源氮源的婴儿双歧杆菌发酵培养基，其特征在于，所述培养基按W/V％计算，其中，所述非动物来源氮源占所述培养基的含量为2.5％；所述混合碳源占所述培养基的含量为2.25％；所述可溶性淀粉占所述培养基的含量为0.25％；所述氯化钠占所述培养基的含量为0.25％；所述L-半胱氨酸盐占所述培养基的含量为0.05％；所述吐温-80占所述培养基的含量为0.1％；所述维生素B1占所述培养基的含量为0.02％；所述培养基中pH为7-8.0。

6.根据权利要求1所述不含动物来源氮源的婴儿双歧杆菌发酵培养基，其特征在于，所述培养基按W/V％计算，包括酵母粉2.5％，葡萄糖2.0％，低聚半乳糖0.25％，可溶性淀粉0.25％，氯化钠0.25％，L-半胱氨酸盐0.05％，吐温-80 0.1％，维生素B1 0.02％，pH7.5～8.0。

7.根据权利要求1所述不含动物来源氮源的婴儿双歧杆菌发酵培养基，其特征在于，所述婴儿双歧杆菌为婴儿双歧杆菌(B.infantis.CGMCC NO.0313-2)。

8.一种婴儿双歧杆菌的发酵生产方法，其特征在于，通过将婴儿双歧杆菌种子液接种至权利要求1～7任一项所述的不含动物来源氮源的婴儿双歧杆菌发酵培养基中培养，即可。

9.根据权利要求8所述婴儿双歧杆菌的发酵生产方法，其特征在于，包括以下工序：

工序一，种子扩培：配制不含动物来源氮源的婴儿双歧杆菌发酵培养基，加热灭菌；将婴儿双歧杆菌工作种子复融后接种至培养基中，密封并培养，菌液pH降至4.5以下，即种子扩培完成；

工序二，发酵培养：配制不含动物来源氮源的婴儿双歧杆菌发酵培养基，加热灭菌结束后，用纯度≥99％的无菌高纯氮气将发酵罐内溶解氧进行置换，直至溶解氧低于5％；工序一扩培完成的菌液全部接种至发酵罐内，用纯度≥99％的无菌高纯氮气维持罐压压力，培养；

发酵过程取样检测发酵液OD、残糖、活菌数；

工序三，离心收菌：发酵培养完成后，发酵液离心，收集菌体。

10.根据权利要求9所述婴儿双歧杆菌的发酵生产方法，其特征在于，包括以下工序：

工序一，种子扩培：配制不含动物来源氮源的婴儿双歧杆菌发酵培养基500ml，调节pH至7.5-8.0，并进行115℃，15分钟灭菌待用；取婴儿双歧杆菌工作种子，常温复融3分钟，接种至优选培养基中，密封并置37.0±1.0℃摇床，120rpm进行培养，菌液pH降至4.5以下，即种子扩培完成；

工序二，发酵培养：配制不含动物来源氮源的婴儿双歧杆菌发酵培养基10L，条件pH至7.5-8.0，并于20L不锈钢自动灭菌发酵罐中进行115℃，15分钟灭菌；灭菌结束后，用纯度≥99％的无菌高纯氮气将发酵罐内溶解氧进行置换，并低于5％；将种子扩培完成的菌液500ml全部接种至发酵罐内，用纯度≥99％的无菌高纯氮气维持罐压0.03-0.05兆帕，转速50-100rpm，37.0±1.0℃培养；

发酵前8h，每4h取样检测发酵液OD、残糖；发酵8h后，每2h取样检测发酵液OD、残糖、活菌数；

当发酵液pH降至7.0及以下时，用无菌20-30％KOH溶液进行维持罐内pH至7.0±0.2；

当发酵液的残糖降至1.0％及以下时，用无菌50-70％葡萄糖溶液进行补料，维持罐内残糖1.0±0.2％；

工序三，离心收菌：发酵培养20-24h后，发酵液进行10000g，4℃，离心5-10分钟，收集菌体。