CN110151795B - 一种丁酸梭菌活菌制剂及其生产工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及丁酸梭菌发酵工艺技术领域，具体指一种丁酸梭菌活菌制剂的生产工艺以及通过该工艺制成的丁酸梭菌活菌制剂。该工艺在培养阶段使用了含有复配保护剂的发酵培养基，能够有效降低干燥制粉环节对产品活菌量的损耗，同时明显改善活菌制剂的储存有效期和存活率，并且该复配保护剂的原料成本较低。该工艺在干燥制粉阶段向培养液中添加了作为流化剂，该流化剂在喷雾干燥过程中可显著提高料液的流动性，并在最终的活菌制剂成品中为菌体提供一定的保护。整套生产工艺相较于微胶囊化活菌制剂生产工艺更为简单且实施成本更低。

Description

一种丁酸梭菌活菌制剂及其生产工艺
技术领域
本发明涉及丁酸梭菌发酵工艺技术领域，具体指一种丁酸梭菌活菌制剂生产工艺以及通过该工艺制成的丁酸梭菌活菌制剂。
背景技术
丁酸梭菌属于梭状芽孢杆菌属，主要存在于奶酪、天然酸奶、人与动物的肠道与粪便以及某些树叶、土壤等自然环境中。丁酸梭菌是一种直的或弯曲的革兰氏阳性厌氧内生芽孢杆菌，对环境变化具有一定的抗性，这些特性都使得丁酸梭菌具备成为益生菌的潜力。另一方面，丁酸梭菌通过动物肠道时，对胃酸及胆汁酸盐的耐受性较好，因而保证了其有益性能的发挥。
将经过特殊工艺制成的丁酸梭菌活菌制剂添加进饲料中后能够通过动物消化道中生物竞争性排斥作用抑制有害菌生长，形成优势菌群或通过增强非特异性免疫功能来预防疾病，可达到调整体内微生态平衡的目的，进而促进动物生长及提高饲料转化率，降低粪便的臭味。在当前使用抗生素的弊端日益凸显的背景下，丁酸梭菌活菌制剂所具备的诸多优势使其在预防治疗肠道疾病中具有重要意义。
芽孢是产芽孢细菌在生长过程中形成的一种抗逆性休眠体，丁酸梭菌的芽孢较其营养体细胞更易保存且复活率高，是活菌制剂中丁酸梭菌的理想存在形式。丁酸梭菌活菌制剂产品呈干粉状，产品质量主要体现在储存有效期和存活率两个方面，目前主要通过在干燥制粉阶段引入微胶囊化工艺来提高产品在这两方面的性能，该工艺过程较为复杂且实施成本高，因此有必要通过改进生产工艺以实现在较低生产成本下对于丁酸梭菌活菌制剂产品的质量改善。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种能够在较低的生产成本下明显改善丁酸梭菌活菌制剂产品储存有效期和存活率的丁酸梭菌活菌制剂的生产工艺。
本发明的第二目的在于提供一种通过上述工艺制成的丁酸梭菌活菌制剂。
为实现上述第一目的，本发明提供一种丁酸梭菌活菌制剂的生产工艺，其特殊之处在于，包括下列步骤：
S1、对丁酸梭菌菌种进行活化处理；
S2、将经过活化处理的丁酸梭菌菌种转接到装有种子培养基的试剂瓶中并在37℃下培养16h至20h得到一级种子液，随后将一级种子液转接至装有发酵培养基的种子罐中并在37℃下再培养16h至20h得到二级种子液；
S3、将二级种子液经加热活化后接入装有发酵培养基的发酵罐中配制成培养液，培养液中二级种子液占5vt％(即培养液中二级种子液的体积分数为5％)，将培养液在37℃下培养28h至32h，培养过程中通过添加pH调节剂将培养液的pH值控制在6.5至6.6。
S4、向培养液中添加流化剂并搅拌混合后经喷雾干燥制成丁酸梭菌活菌制剂成品。
其中，种子培养基包括10g/L的胰蛋白胨、22g/L的酵母浸粉、26g/L的葡萄糖、1g/L的无水硫酸铵、0.2g/L的硫酸镁、1g/L的碳酸氢钠、0.2g/L的硫酸锰、0.2g/L的氯化钙以及0.5g/L的半胱氨酸，种子培养基的pH值为6.8到7.0。
发酵培养基包括28g/L至33g/L的葡萄糖、15g/L至20g/L的玉米淀粉、25g/L至30g/L胰蛋白胨、20g/L至25g/L的酵母浸粉、3g/L至5g/L的轻质碳酸钙、3g/L至5g/L的氯化钠、3g/L至5g/L的磷酸氢二钾、2g/L至3g/L的磷酸二氢钾、0.08g/L至0.1g/L的硫酸锰、0.3g/L至0.4g/L的硫酸镁、0.1g/L至0.2g/L的消泡剂以及42.5g/L至62.5g/L的复配保护剂，发酵培养基的pH值为6.8至7.0，复配保护剂包括菊粉、麦芽糊精和甘油。
由上述方案可见，由于菊粉、麦芽糊精和甘油对于丁酸梭菌活菌制剂中的菌体都具备一定的保护作用，另外三者在作用机理上又存在一定区别，通过合理配比制成复配保护剂能够显著提高产品的储存有效期和存活率。复配保护剂需要长时间与丁酸梭菌接触才能充分作用于菌体并起到理想的保护效果，但一方面，丁酸梭菌在喷雾干燥过程中需要承受高温气流的剪切作用，干燥制粉环节会对产品的活菌量带来一定的损耗，因此在干燥制粉前就需要对菌体进行保护；另一方面，培养液中活菌数量和生理状态始终处在动态变化中，临时性添加复配保护剂对活菌制剂的储存有效期和存活率的效果的提升作用十分有限。
菊粉、麦芽糊精和甘油都可被丁酸梭菌作为碳源加以利用，因此这三者组成的复配保护剂可作为辅助性碳源添加到培养基中，通过控制发酵培养基中辅助性碳源与葡萄糖和玉米淀粉这两种主碳源的比例可保证丁酸梭菌在培养阶段的碳源供应并使三种辅助性碳源始终处在过量状态，从而能够作为复配保护剂与菌体充分作用，并最终成为活菌制剂成品的组成部分，有效降低干燥制粉环节对产品活菌量的损耗，同时明显改善活菌制剂的储存有效期和存活率。
复配保护剂作为发酵培养基的组成部分无需通过额外工序添加进培养液并与培养液混合，同时干燥制粉环节采用常规的喷雾干燥工艺，仅在干燥前添加了一定量的流化剂，因此整套生产工艺相较于微胶囊化工艺更为简单，另外菊粉、麦芽糊精和甘油作为普通工业品售价较低并且在培养基中的用量较小，因此对原料成本影响较小，整套生产工艺的实施成本低于引入微胶囊化后的生产成本。
进一步的方案是，复配保护剂包括12.5g/L至17.5g/L的菊粉、20g/L至25g/L的麦芽糊精以及10g/L至20g/L的甘油。
菊粉作为益菌因子能够明显促进丁酸梭菌的生长，提高芽孢率，并在干燥制粉环节对丁酸梭菌起到明显的保护作用。麦芽糊精作为保护剂虽无法透过细胞壁和细胞膜，但可在菌体表面形成有效的保护层。甘油能够穿过细胞壁和细胞膜，在干燥过程中可替代细胞膜内原有的水分子与磷脂和蛋白质形成氢键从而稳定细胞膜的完整性。符合上述配比的三种物质组成的复配保护剂在前述生产工艺中能够有效改善产品的储存有效期和存活率。
进一步的方案是，流化剂为玉米淀粉，步骤S4中流化剂的添加量为35g/L。
玉米淀粉充分分散于培养液中可提高喷雾干燥环节物料的流动性。玉米淀粉的吸湿性强且粒度较小，可包覆于菌体表面从而为干燥后的菌体提供保护，并且玉米淀粉还可作为丁酸梭菌的碳源，有助于提高产品应用阶段芽孢的复活率。另外上述添加量较为经济合理，能够保证玉米淀粉在喷雾干燥过程中显著提高料液的流动性，并在最终的活菌制剂成品中为菌体提供一定的保护。
进一步的方案是，步骤S4中搅拌混合过程在75r/min至100r/min的搅拌转速下进行，搅拌混合过程的持续时间为30min。
较高的搅拌转速以及较长的搅拌时间可使流化剂充分分散于培养液中，保证喷雾干燥环节料液的均匀性。
进一步的方案是，步骤S4中丁酸梭菌活菌制剂成品的含水量为7％至8％。
将成品的含水量控制在上述范围有助于复配保护剂和流化剂充分发挥对菌体的保护作用以延长产品的保存有效期。
进一步的方案是，步骤S4中喷雾干燥过程的进风温度为160℃，料液流速为100kg/h。
上述喷雾干燥工艺参数可保证活菌制剂成品的含水量达到所需的范围。
进一步的方案是，步骤S2中通过将二级种子液加热至80℃并恒温10min实现二级种子液的加热活化。
丁酸梭菌为内生芽孢杆菌，此类芽孢杆菌的优选通过加热法进行活化，加热活化不仅能激活芽孢使其尽快萌发，还有利于菌体同步培养及污染防治。
进一步的方案是，步骤S3中所述培养液的装填量为所述发酵罐总容积的70％。
进一步的方案是，pH调节剂为20wt％氨水。
为实现上述第二目的，本发明提供一种丁酸梭菌活菌制剂，其特殊之处在于，该丁酸梭菌活菌制剂通过前述生产工艺制成。
具体实施方式
实施例一
本实施例提供一种丁酸梭菌活菌制剂的生产工艺及通过该生产工艺制成的丁酸梭菌活菌制剂，该生产工艺包括以下步骤：
S1、从-80℃冷冻保存的甘油管中取丁酸梭菌液体菌种接入到种子培养基中，并在恒温培养箱37℃培养生长48h以实现丁酸梭菌的菌种活化处理。
S2、将经过活化处理的丁酸梭菌菌种按照5％的接种量转接到装有种子培养基的试剂瓶中并在37℃下培养16h至20h以达到对数生长期，从而得到一级种子液，随后将一级种子液按照5％的接种量转接至装有发酵培养基的种子罐中并在37℃下再培养16h至20h以达到对数生长期，从而得到二级种子液，一级种子液和二级种子液的培养终点均通过镜检来确定。
S3、将二级种子液加热至80℃并恒温10min以实现加热活化，取经过加热活化的350L二级种子液接入装有6650L发酵培养基的10000L规格发酵罐中得到7000L培养液，将培养液在37℃下培养28h至32h，培养过程中通过在线监控并自动添加作为pH调节剂的20wt％氨水的方式将培养液的pH值控制在6.5至6.6。培养时间超过12h后通过每4h对培养液进行一次镜检来判定发酵终点。
S4、按照35g/L的比例向培养液中添加玉米淀粉作为流化剂，以75r/min至100r/min的搅拌转速搅拌混合30min得到料液，料液以100kg/h的流速进入高速离心喷雾干燥器(型号为LPG-200，常州立马干燥工程有限公司)，在160℃的进风温度下进行喷雾干燥并得到含水量在7％至8％的丁酸梭菌活菌制剂成品。
其中，种子培养基为含有10g/L的胰蛋白胨，22g/L的酵母浸粉，26g/L的葡萄糖，1g/L的无水硫酸铵，0.2g/L的硫酸镁，1g/L的碳酸氢钠，0.2g/L的硫酸锰，0.2g/L的氯化钙以及0.5g/L的半胱氨酸的液体培养基，该培养基需用氨水溶液调节pH值至6.8至7.0并在121℃下灭菌30min。
发酵培养基为含有30g/L的葡萄糖、15g/L的玉米淀粉、15g/L的菊粉、20g/L的麦芽糊精、20g/L的甘油、25g/L胰蛋白胨、20g/L的酵母浸粉、3g/L的轻质碳酸钙、5g/L的氯化钠、3g/L的磷酸氢二钾、2g/L的磷酸二氢钾、0.1g/L的硫酸锰、0.4g/L的硫酸镁以及0.2g/L的GPE型消泡剂的液体培养基，其中的菊粉、麦芽糊精和甘油为复配保护剂，该培养基需用氨水溶液调节pH值至6.8至7.0并在121℃下灭菌30min。
实施例二
本实施例提供一种丁酸梭菌活菌制剂的生产工艺及通过该生产工艺制成的丁酸梭菌活菌制剂，该生产工艺与实施例一基本相同的，区别仅在于所使用的发酵培养基上。
本实施例使用的发酵培养基为含有28g/L的葡萄糖、18g/L的玉米淀粉、12.5g/L的菊粉、24g/L的麦芽糊精、15g/L的甘油、28g/L胰蛋白胨、22g/L的酵母浸粉、4g/L的轻质碳酸钙、4g/L的氯化钠、4g/L的磷酸氢二钾、3g/L的磷酸二氢钾、0.08g/L的硫酸锰、0.3g/L的硫酸镁以及0.1g/L的GPE型消泡剂的液体培养基，其中的菊粉、麦芽糊精和甘油为复配保护剂，该培养基需用氨水溶液调节pH值至6.8至7.0并在121℃下灭菌30min。
实施例三
本实施例提供一种丁酸梭菌活菌制剂的生产工艺及通过该生产工艺制成的丁酸梭菌活菌制剂，该生产工艺与实施例一基本相同的，区别仅在于所使用的发酵培养基上。
本实施例使用的发酵培养基为含有32g/L的葡萄糖、20g/L的玉米淀粉、17.5g/L的菊粉、25g/L的麦芽糊精、10g/L的甘油、30g/L胰蛋白胨、25g/L的酵母浸粉、5g/L的轻质碳酸钙、3g/L的氯化钠、5g/L的磷酸氢二钾、2.5g/L的磷酸二氢钾、0.09g/L的硫酸锰、0.35g/L的硫酸镁以及0.15g/L的GPE型消泡剂的液体培养基，其中的菊粉、麦芽糊精和甘油为复配保护剂，该培养基需用氨水溶液调节pH值至6.8至7.0并在121℃下灭菌30min。
实施例四
本实施例提供一种丁酸梭菌活菌制剂的生产工艺及通过该生产工艺制成的丁酸梭菌活菌制剂，该生产工艺与实施例一基本相同的，区别仅在于所使用的发酵培养基上。
本实施例使用的发酵培养基为含有33g/L的葡萄糖、16g/L的玉米淀粉、13g/L的菊粉、22g/L的麦芽糊精、18g/L的甘油、26g/L胰蛋白胨、24g/L的酵母浸粉、3g/L的轻质碳酸钙、4g/L的氯化钠、4g/L的磷酸氢二钾、2g/L的磷酸二氢钾、0.1g/L的硫酸锰、0.4g/L的硫酸镁以及0.1g/L的GPE型消泡剂的液体培养基，其中的菊粉、麦芽糊精和甘油为复配保护剂，该培养基需用氨水溶液调节pH值至6.8至7.0并在121℃下灭菌30min。
对比例
对比例采用与实施例一基本相同的生产工艺制备丁酸梭菌活菌制剂，区别仅在于使用的发酵培养基上，对比例使用的发酵培养基不含作为复配保护剂的菊粉、麦芽糊精和甘油这三种成分，其余成分及对应的含量均与实施例一中的发酵培养基相同。
丁酸梭菌活菌制剂计数实验
总菌量计数：取实施例一至四中培养至发酵终点的培养液等体积混合得到混合液，吸取该混合液10ml注入装有90ml无菌生理盐水及玻璃珠的三角瓶中充分震荡10分钟得到一级菌悬液，随后再按1:10的稀释比例对一级菌悬液进行多级稀释，取三个适宜的连续稀释度菌悬液进行平板涂布，每个平板涂布0.1mL菌悬液，每个稀释度涂布3块平板。以对比例中培养至发酵终点的培养液做比较对照，同时以无菌生理盐水做空白对照。涂布好的平板置于厌氧培养箱中37℃下恒温培养24h后进行菌落计数。
芽孢量计数：吸取上述混合液10ml注入装有90ml无菌生理盐水及玻璃珠的三角瓶中充分震荡10分钟后80℃下水浴处理10min作为一级芽孢悬液，随后再按1:10的稀释比例对一级芽孢悬液进行多级稀释，取三个适宜的连续稀释度的芽孢悬液进行平板涂布，每个平板涂布0.1mL芽孢悬液，每个稀释度涂布3块平板。以对比例中培养至发酵终点的培养液做比较对照，同时以无菌生理盐水做空白对照。涂布好的平板置于厌氧培养箱中37℃下恒温培养24h后进行菌落计数。
上述总菌量计数实验和芽孢量计数实验均使用TPY固体培养基作为计数培养基，该培养基的制备方法为：以1L蒸馏水溶解10g的胰蛋白胨，5g的大豆蛋白胨，3g的酵母粉，10g的
Figure BDA0002059246450000081
蛋白胨，10g的葡萄糖，0.3g的L-半胱氨酸盐酸盐，2.5g的磷酸二氢钾，3g的氯化钠，0.3g的硫代乙醇酸钠和20g的琼脂后在116℃下高压灭菌20min。
表1：实施例与对比例的计数及芽孢率比较结果
实施例 对比例
总菌数(cfu/ml) 11.8×10<sup>8</sup> 4.6×10<sup>8</sup>
芽孢数(cfu/ml) 11.4×10<sup>8</sup> 2.5×10<sup>8</sup>
丁酸梭菌芽孢率(％) 96.6 54.3
注：丁酸梭菌芽孢率(％)＝(芽孢数/总菌数)×100％，实施例和对比例中总菌数和芽孢数均已排除相应的空白对照的影响。
从表1可以看出，使用菊粉，麦芽糊精和甘油组成的复配保护剂能够显著提高培养液中丁酸梭菌的总菌数、芽孢数及芽孢率，引入复配保护剂的培养液达到发酵终点后丁酸梭菌的总菌数高达每毫升11.8×108，芽孢率达到96.6％。相应地，培养液中较高的总菌数以及芽孢率也会体现到对应的丁酸梭菌活菌制剂产品中，这将有助于改善产品的储存性能。
丁酸梭菌活菌制剂储存稳定性检测实验
取实施例一至四制得的丁酸梭菌活菌制剂成品等重量混合得到混合粉，另取对比例制得的丁酸梭菌活菌制剂成品作为对比粉。依据前述培养至发酵终点的四个实施例培养液的混合液与对比例培养液的芽孢量计数结果的比值将混合粉和对比粉的芽孢数都以添加玉米淀粉的方式稀释至11×108/g至13×108/g。以稀释后的混合粉作为实验组样品，以稀释后的对比粉作为对照组样品，实验组样品和对照组样品都在密封、避光和室温条件下储存12个月。
分别在储存期达到0月、1月、3月、6月、9月、12月时参照前述芽孢量计数的方法对实验组样品和对照组样品进行计数，每次计数实验组和对照组都设置3个平行样品。
表2：实验组与对照组的储存稳定性比较结果
Figure BDA0002059246450000091
由表2可以看出，实验组样品在室温条件下储存12个月后丁酸梭菌芽孢的平均存活率仍保持在90％以上，而对照组样品在相同储存条件下的平均存活率仅达到20％，说明由菊粉，麦芽糊精和甘油组成的复配保护剂能够显著提高丁酸梭菌活菌制剂成品的储存性能，与之对应的活菌制剂产品在储存有效期和成活率方面相较于普通产品具备明显的优势。

Claims (9)

1.一种丁酸梭菌活菌制剂的生产工艺，其特征在于，包括下列步骤：
S1、对丁酸梭菌菌种进行活化处理；
S2、将经过活化处理的丁酸梭菌菌种转接到装有种子培养基的试剂瓶中并在37℃下培养16h至20h得到一级种子液，随后将所述一级种子液转接至装有发酵培养基的种子罐中并在37℃下再培养16h至20h得到二级种子液；
S3、将所述二级种子液经加热活化后接入装有发酵培养基的发酵罐中配制成培养液，所述培养液中所述二级种子液占5vt％，将所述培养液在37℃下培养28h至32h，培养过程中通过添加pH调节剂将所述培养液的pH值控制在6.5至6.6；
S4、向所述培养液中添加流化剂并搅拌混合后经喷雾干燥制成丁酸梭菌活菌制剂成品；
其中，所述种子培养基包括10g/L的胰蛋白胨、22g/L的酵母浸粉、26g/L的葡萄糖、1g/L的无水硫酸铵、0.2g/L的硫酸镁、1g/L的碳酸氢钠、0.2g/L的硫酸锰、0.2g/L的氯化钙以及0.5g/L的半胱氨酸，所述种子培养基的pH值为6.8到7.0；
所述发酵培养基包括28g/L至33g/L的葡萄糖、15g/L至20g/L的玉米淀粉、25g/L至30g/L胰蛋白胨、20g/L至25g/L的酵母浸粉、3g/L至5g/L的轻质碳酸钙、3g/L至5g/L的氯化钠、3g/L至5g/L的磷酸氢二钾、2g/L至3g/L的磷酸二氢钾、0.08g/L至0.1g/L的硫酸锰、0.3g/L至0.4g/L的硫酸镁、0.1g/L至0.2g/L的消泡剂以及42.5g/L至62.5g/L的复配保护剂，所述发酵培养基的pH值为6.8至7.0，所述复配保护剂包括菊粉、麦芽糊精和甘油；
所述流化剂为玉米淀粉，步骤S4中所述流化剂的添加量为35g/L。
2.如权利要求1所述的丁酸梭菌活菌制剂的生产工艺，其特征在于：
所述复配保护剂包括12.5g/L至17.5g/L的菊粉、20g/L至25g/L的麦芽糊精以及10g/L至20g/L的甘油。
3.如权利要求1或2所述的丁酸梭菌活菌制剂的生产工艺，其特征在于：
步骤S4中所述搅拌混合过程在75r/min至100r/min的搅拌转速下进行，所述搅拌混合过程的持续时间为30min。
4.如权利要求1或2所述的丁酸梭菌活菌制剂的生产工艺，其特征在于：
步骤S4中所述丁酸梭菌活菌制剂成品的含水量为7％至8％。
5.如权利要求1或2所述的丁酸梭菌活菌制剂的生产工艺，其特征在于：
步骤S4中所述喷雾干燥过程的进风温度为160℃，料液流速为100kg/h。
6.如权利要求1或2所述的丁酸梭菌活菌制剂的生产工艺，其特征在于：
步骤S3中通过将所述二级种子液加热至80℃并恒温10min实现所述二级种子液的加热活化。
7.如权利要求1或2所述的丁酸梭菌活菌制剂的生产工艺，其特征在于：
步骤S3中所述培养液的装填量为所述发酵罐总容积的70％。
8.如权利要求1或2所述的丁酸梭菌活菌制剂的生产工艺，其特征在于：
所述pH调节剂为20wt％氨水。
9.一种丁酸梭菌活菌制剂，其特征在于：
该丁酸梭菌活菌制剂通过权利要求1至8中任意一项所述的生产工艺制成。
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