CN110878256A

CN110878256A - 一种富含发酵代谢产物高稳定性乳酸菌的制备方法及应用

Info

Publication number: CN110878256A
Application number: CN201811029156.7A
Authority: CN
Inventors: 赵小丽; 张杰峰
Original assignee: Beijing Agricultural Microbial Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Agricultural Microbial Technology Co Ltd
Priority date: 2018-09-05
Filing date: 2018-09-05
Publication date: 2020-03-13

Abstract

目前市场上存在的含有效活菌数的乳酸菌产品主要有两种剂型：粉状的产品基本上离心得到活性乳后采用低温冷冻干燥工艺制得，另外一种剂型颗粒型是离心得到活性乳后采用挤压制粒工艺制备。这两种工艺在生产过程中都是通过离心去除发酵上清液得到活性发酵乳，这样乳酸菌发酵培养过程产生的有机酸，生物酶等活性成分离心收集菌体时作为废弃物去除，这大大降低了产品的使用效果。本发明采用高温喷雾干燥和包被工艺相结合得到乳酸菌产品，该工艺既能保证较高的活菌得率，大大降低了生产成本，又保留了乳酸菌发酵过程中产生的代谢产物，大大提高了产品的价值。

Description

一种富含发酵代谢产物高稳定性乳酸菌的制备方法及应用

技术领域：本发明涉及畜牧业领域，具体涉及饲料行业益生菌的稳定包被技术

背景技术：

抗生素在禽畜养殖中一直发挥着重要的作用，但是其带来的负面效应也一直无法解决，比如耐药性扩散、药物残留和生态破坏等等。随着人们的食品安全意识的增强，抗生素越来越受到人们的质疑和抵触，现在很多国家已经禁止在禽畜养殖中使用抗生素。作为一种绿色的饲料添加剂，饲用乳酸菌类微生态制剂是一种很好的抗生素替代品。乳酸菌是动物体内的常驻有益菌，它能够拮抗病原微生物，调节动物消化道微生物区系平衡；活化免疫系统，增强免疫力；此外，乳酸菌还可以防止畜禽腹泻、提高畜禽增重，在肠道内发挥着重要的生理功能。随着国内外人们对乳酸菌的认识和研究不断深入，越来越多的乳酸菌制品在营养、保健及医疗方面得到推广应用。

但是，尽管乳酸菌有很大的用途和很高的价值，但由于大多数乳酸菌不产生芽孢，极易受到温度、氧气、水分及酸碱等外界环境因素的影响，通常菌活性保持比较困难。乳酸菌在进入动物的消化道后，又会受到胃酸、胆碱等恶劣的环境，以至于大部分乳酸菌活菌在未到达靶位点便已经死亡。为了提高乳酸菌的抗逆性，大多采用对菌体进行包被处理。现有乳酸菌的生产技术主要采用低温冷冻干燥技术、挤压造粒技术、高温喷雾干燥技术、超声波喷雾干燥技术。1)低温冷冻干燥技术及低温冷冻喷雾干燥技术，设备要求高，冻干能耗大，造成饲用乳酸菌的生产成本高，而且生产的产品在储存过程中更易受温度、湿度的影响严重影响其储存稳定性。2)挤压法是最传统最普通的方法，以海藻酸钠作为材料的固定化应用最多，但是缺点也是难以获得干燥乳酸菌微胶囊粉末产品。3)超声波喷雾干燥技术因生产工艺复杂，生产参数难以控制且对设备的要求较高，生产成本较高，很难大规模的实现产业化。4)现有喷雾干燥法一般采用高温喷雾干燥，用单一工序将菌体和保护剂、载体的悬浮液进行喷雾干燥，得到干燥的粉末状微胶囊产品。但是这个方法存在着乳酸菌分散不均匀及制备过程中乳酸菌因高温死亡率高的问题。

发明内容：

1、目前市场上存在的含有效活菌数的乳酸菌产品主要有两种剂型：粉状的产品基本上离心得到活性乳后采用低温冷冻干燥工艺制得，另外一种剂型颗粒型是离心得到活性乳后采用挤压制粒工艺制备。这两种工艺在生产过程中都是通过离心去除发酵上清液得到活性发酵乳，这样乳酸菌发酵培养过程产生的有机酸，生物酶等活性成分离心收集菌体时作为废弃物去除，这大大降低了产品的使用效果。况且前者干燥后的产品在常温下储存因受到零下40-70℃的破坏，存放过程中非常容易失活，储存时间短，而目前采用的超声波喷雾干燥或者低温冷冻干燥生产工序复杂，生产过程难以控制，且乳酸菌存活率较低，生产成本高。另外目前现有的喷雾干燥工艺虽然保留了发酵代谢产物，但是生产过程中乳酸菌的死亡率很高，大多不被采用。综上所述目前存在的益生菌包被工艺，虽然在改善产品储存稳定性方面有了一些效果，但还是不能满足产品应用方面的需求，而且没有根本解决饲料加工过程中不耐挤压，不耐高温的问题。

2、本发明就是针对以上问题采用新的产品制备方法，经过高温喷雾干燥工艺既保留了发酵过程中的发酵代谢产物，提高了饲料加工过程中乳酸菌对重金属、高温、高湿的抗逆性，大大提高了乳酸菌在颗粒料生产过程中高温挤压损失率大的问题。

3、富含发酵代谢产物高稳定性乳酸菌的制备

1)乳酸菌种的筛选：将分离得到的乳酸菌菌种在固体平板培养基上筛选钙圈大、产酸能力强、生长健壮的菌落进行摇瓶种子液培养，37℃培养20-30h，镜检无杂菌，转入发酵罐进行扩大培养。

2)富含发酵代谢产物的乳酸菌发酵液的制备培养：高密度发酵培养乳酸菌，并及时监控发酵培养过程中的pH，菌体形态，在pH3-5，菌体绝大部分呈单个存在，且菌体比较健壮时停止发酵培养。

3)高温喷雾干燥工艺即富含发酵代谢产物乳酸菌粉的制备：称取乳酸菌发酵液的保护剂：①甘油②海藻糖、壳聚糖、乳糖的一种或两种③谷氨酸钠④明胶、阿拉伯胶、黄原胶中的一种或两种，⑤沸石粉、玉米淀粉、糊精、二氧化硅中的一种或几种。以上保护剂依次加入到发酵液中并依次乳化10-30min得到乳酸菌乳化液，乳化后的产品进行喷雾干燥，干燥工艺参数：进风温度160-200℃，出风温度70-90℃，进料量3-5L/min。按照以上参数喷雾干燥制成粉状产品乳酸菌粉。

4)上述3)中的得到的乳酸菌粉进行包衣，包衣材料按照乳酸菌核心颗粒与包衣材料的质量比1-3:1称取包衣材料称量完毕后包衣材料用蒸馏水配置成50-60％的水溶液，乳化均匀后对乳酸菌粉在流化床内进行包衣，包衣参数进风温度50-45℃，出风温度25-28℃，物料温度保持在32-37℃，喷液频率5-12Hz，风机频率10-15Hz，使包被溶液均匀的喷涂在基丸上。包被后干燥20-30min的得到包衣半成品。

半成品进行第二层包衣，按照上述包衣后的半成品与包衣材料的质量比为0.5-1:1称取第二层包衣材料，称取完毕后配置成50-60％的水溶液，搅拌乳化均匀，待包衣，包衣参数进风温度50-45℃，出风温度25-28℃，物料温度保持在32-37℃，喷液频率10-15Hz。风机频率16-20Hz，是包被溶液均匀的喷涂在基丸上。包被后干燥20-40min得到包衣产品。

备注：包衣材料为羟丙甲基纤维素纤维素30-40％、甲基纤维素钠8-10％、海藻糖10-20％、海藻酸钠2-5％、脱脂奶粉5-15％、滑石粉10-20％、纤维素8-10％。

4、实施案例

实施案例1富含发酵代谢产物稳定化乳酸菌的制备方法(粪肠球菌)

步骤1)乳酸菌发酵液的制备，具体操作

1-1)乳酸菌种子液的制备：将保存的乳酸菌菌种划线接种到平板培养基上，37℃培养15-20h，挑选钙圈大，生长健壮的菌落接种到摇瓶液体培养基中，120-200r/min,37℃培养15-18h，即为乳酸菌一级种子液。再将摇瓶种子液转接到液体培养基中，培养10-18h得到乳酸菌二级种子液。

1-2)乳酸菌发酵生产，将上述种子液转接到发酵罐中培养，培养条件：36-37℃、30-50r/min,罐压0.05Mpa，培养15-24h。

上述种子培养基配方：蛋白胨0.3％，酵母提取物0.8％，葡萄糖6％，NaCl 0.7％，pH6.5-7.0.

发酵培养培养基配方：白砂糖3.5％，酵母浸粉0.1％，蛋白胨1.0％，NaCl 0.5％,钾盐0.05％，碳酸钙1％。消泡剂适量，pH6.5-7.0。

步骤2)富含发酵代谢产物高稳定性乳酸菌的具体制备步骤

2-1)高温喷雾干燥工艺：称取或配制乳酸菌发酵液的保护剂：①甘油②海藻糖、壳聚糖、乳糖的一种或两种③谷氨酸钠④明胶、阿拉伯胶、黄原胶中的一种或两种，⑤沸石粉、玉米淀粉、糊精、二氧化硅中的一种或几种。以上保护剂依次加入到发酵液中并依次乳化10-30min得到乳酸菌乳化液，乳化后的产品进行喷雾干燥，干燥工艺参数：进风温度180℃，出风温度80℃，进料量3-5L/min。按照以上参数喷雾干燥制成粉状产品乳酸菌粉。

2-2)上述步骤中得到的乳酸菌粉进行包衣，包衣材料按照乳酸菌核心颗粒与包衣材料的质量比2:1称取包衣材料称量完毕后包衣材料用蒸馏水配置成50％的水溶液，乳化均匀后对乳酸菌粉在流化床内进行包衣，包衣参数进风温度45℃，出风温度27℃，物料温度保持在35℃，喷液频率5-12Hz，风机频率12Hz，使包被溶液均匀的喷涂在基丸上。包被后干燥30min的得到包衣半成品。

半成品进行第二层包衣，按照上述包衣后的半成品与包衣材料的质量比为1:1称取第二层包衣材料，称取完毕后配置成56％的水溶液，搅拌乳化均匀，待包衣，包衣参数进风温度50℃，出风温度28℃，物料温度保持在37℃，喷液频率15Hz。风机频率18-20Hz，使包被溶液均匀的喷涂在基丸上。包被后干燥20min得到包衣产品。

包衣材料为羟丙甲基纤维素纤维素30％、甲基纤维素钠10％、海藻糖16％、海藻酸钠4％、脱脂奶粉7％、滑石粉20％、纤维素13％。

实施案例2富含发酵产物高稳定性乳酸储存稳定性跟踪检测

表1高稳定性乳酸菌的储存稳定性

储存时间	30d	90d	180d
				得率	95％	89％	78％

实施案例3富含发酵产物高稳定性乳酸菌耐热性试验，在集团配合料生产过程中按照有效活菌数添加到制粒生产过程中，制粒结束冷却后取样检测有效活菌数，计算活菌得率，评价其耐热性：

表2乳酸菌饲料添加耐高温试验结果

由上表可以看出该产品在全价料生产过程中的耐高温性得到很大改善，解决了一直存在的乳酸菌不耐高温制粒的难题。

实施案例4富含发酵产物高稳定性乳酸菌功效评价(动物饲喂试验)

为验证富含发酵代谢产物高稳定性乳酸菌对保育猪生产性能，特选取136头9.0kg左右的保育猪，随机分成试验组和对照组，每个处理组有4个重复，每个重复组17头。经过40天的饲喂，计算日增重和料肉比。如表所示：试验数据采用SPSS17.0中的单因素方差分析。

表3保育猪的生产指标

	初重(Kg)	末重(Kg)	日增重(g)	料肉比
					试验组	9.0±0.4a	23.8±1.9a	369±42a	1.589±0.036a
对照组	8.8±0.6a	21.9±0.6a	326±35a	1.756±0.041b

注：同列肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)。

试验结果表明：肠力健可以显著提高保育猪的生产性能，平均日增重提高了34g，增幅达到10.4％，料肉比降低0.165(P<0.01)。

Claims

1.乳酸菌种的筛选：将分离得到的乳酸菌菌种在固体平板培养基上筛选钙圈大、产酸能力强、生长健壮的菌落进行摇瓶种子液培养，37℃培养20-30h，镜检无杂菌，转入发酵罐进行扩大培养。

2.富含发酵代谢产物高稳定性乳酸菌的制备方法及应用，所指乳酸菌包括：粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus Faecom)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)。

3.富含发酵代谢产物的乳酸菌发酵液的制备培养：高密度发酵培养乳酸菌，并及时监控发酵培养过程中的pH，菌体形态，在pH3-5，菌体绝大部分呈单个存在，且菌体比较健壮时停止发酵培养。

4.摇瓶种子培养基：蛋白胨0.3％，酵母提取物0.8％，葡萄糖6％，NaCl 0.7％，pH 6.5-7.0。

5.发酵培养基：白砂糖2-3.5％，酵母浸粉0.1-0.5％，蛋白胨0.2-1.0％，NaCl 0.5-1.2％,钾盐0.05-0.1％，碳酸钙0.3-1％。消泡剂适量，pH6.5-7.0。

6.高温喷雾干燥工艺即富含发酵代谢产物乳酸菌粉的制备：称取乳酸菌发酵液的保护剂：①甘油②海藻糖、壳聚糖、乳糖的一种或两种③谷氨酸钠④明胶、阿拉伯胶、黄原胶中的一种或两种，⑤沸石粉、玉米淀粉、糊精、二氧化硅中的一种或几种。以上保护剂依次加入到发酵液中并依次乳化10-30min得到乳酸菌乳化液，乳化后的产品进行喷雾干燥，干燥工艺参数：进风温度160-200℃，出风温度70-90℃，进料量3-5L/min。按照以上参数喷雾干燥制成粉状产品乳酸菌粉。

7.乳酸菌粉进行包衣，包衣材料按照乳酸菌核心颗粒与包衣材料的质量比1-3:1称取包衣材料称量完毕后包衣材料用蒸馏水配置成50-60％的水溶液，乳化均匀后对乳酸菌粉在流化床内进行包衣，包衣参数进风温度50-45℃，出风温度25-28℃，物料温度保持在32-37℃，喷液频率5-12Hz，风机频率10-15Hz，使包被溶液均匀的喷涂在基丸上。包被后干燥20-30min的得到包衣半成品。

8.半成品进行第二层包衣，按照上述包衣后的半成品与包衣材料的质量比为0.5-1:1称取第二层包衣材料，称取完毕后配置成50-60％的水溶液，搅拌乳化均匀，待包衣，包衣参数进风温度50-45℃，出风温度25-28℃，物料温度保持在32-37℃，喷液频率10-15Hz。风机频率16-20Hz，是包被溶液均匀的喷涂在基丸上。包被后干燥20-40min得到包衣产品。

9.包衣材料为羟丙甲基纤维素纤维素30-40％、甲基纤维素钠8-10％、海藻糖10-20％、海藻酸钠2-5％、脱脂奶粉5-15％、滑石粉10-20％、纤维素8-10％。