DE69827684T2

DE69827684T2 - Neue Lactobazillus-Stämme zur Behandlung von Störungen des Gastrointestinaltraktes

Info

Publication number: DE69827684T2
Application number: DE69827684T
Authority: DE
Inventors: Gabriele Pedraglio
Original assignee: Proge Farm Srl
Current assignee: Proge Farm Srl
Priority date: 1997-02-27
Filing date: 1998-02-23
Publication date: 2005-04-07
Anticipated expiration: 2018-02-24
Also published as: EP0861905B1; IT1289984B1; DE69827684D1; ES2231908T3; EP0861905A3; EP0861905A2; ITMI970426A1

Description

1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Lactobacillus-Stämme, die nützlich sind für die Behandlung von Störungen des Gastrointestinalsystems, genauer gesagt neue Stämme von Lactobacillus Paracasei und Lactobacillus Salivarius, das Verfahren zu ihrer Herstellung, sie enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen, Diätergänzungsmittel und Nahrungsprodukte (z. B. Milch, Joghurt oder andere Molkereiprodukte).
Lactobazillen sind in der Natur weit verbreitet. Eine Anzahl von Spezies sind in Früchten, Gemüse und Molkereiprodukten (fermentierte Milch, Käse und Joghurt) vorhanden, während nur wenige Stämme im Gastrointestinal- und Urogenital-Trakt von Säugern und Insekten gefunden werden.
Die günstige Wirkung von Lactobazillen auf gastrointestinale Störungen ist seit der Vorzeit bekannt, und sie wurden während einer langen Zeit mit Milch und Molkereiprodukten aufgenommen.
2. Technologischer Hintergrund
In vielen Fällen können bekannte Lactobazillen, die durch die Diät oder in anderer Form verabreicht werden, die Magensäureumgebung nicht überwinden und/oder den Gallensäften nicht widerstehen, um am Leben zu bleiben und an der intestinalen Wirkungsstelle verfügbar zu sein und genügend Kolonien zu entwickeln, um in kurzer Zeit signifikante therapeutische Wirkungen zu erzielen.
Die so durchgeführte Behandlung von gastrointestinalen Störungen erfordert üblicherweise eine verlängerte Einnahmedauer und ist häufig in den ernstesten, persistenten Fällen wenig wirksam.
US 5,032,399 offenbart einen spezifischen Stamm Lactobacillus acidophilus, der aus der normalen Darmflora isoliert wurde, der als Lactobacillus GG bezeichnet wurde und anschließend als Lactobacillus casei subs. rhamnosus reklassifiziert wurde, von dem berichtet wird, dass er günstige Wirkungen bei der Behandlung von gastrointestinalen Störungen aufweist, gegen Säuren und Gallensäfte stabil ist und fähig ist, an den Zellen der Human-Darmmukosa zu haften, Milchsäure zu produzieren und wirksam in vitro zu wachsen.
Kürzlich hat der Anmelder unter dem Namen „Enterobacilli Proge Farm" ein Diätergänzungsmittel kommerzialisiert, das Lactobazillen enthält, welche aus Darmflora isoliert wurden, und das indiziert ist für die Behandlung von Störungen des Gastrointestinalsystems. Diese Diätergänzung, genauso wie andere kommerzielle Produkte, welche Lactobazillen enthalten, muss bei niedrigen Temperaturen gelagert werden, genauer gesagt im Kühlschrank (bei +4°C).
3. Zu lösendes Problem
Verschiedene aus der Darmumgebung isolierte Stämme von Lactobazillen verhalten sich als gute Koloniebilder sowohl in vitro als auch in vivo, wenn sie nach Selektion im Labormaßstab verwendet werden, indem sie ihre Aktivität in kurzer Zeit und mit zufriedenstellenden Ergebnissen zeigen.
Um jedoch für eine Kommerzialisierung in großem Maßstab sowie für die Verwendung durch die Verbraucher geeignet zu sein, müssen die Bakterienstämme technologischen Behandlungen unterzogen werden (wie Gefriertrocknen, Mischen mit Exzipienten, Aufteilung in verschiedene Dosiseinheiten und Formulierung zu pharmazeutischen Präparaten und Diätergänzungsmitteln), welche die Stämme häufig negativ beeinflussen, wobei oft ein Verlust der besonderen probiotischen Eigenschaften und der ursprünglichen Kolonisationsfähigkeit verursacht wird.
Ein weiteres technologisches Problem ist die schlechte Lagerungsstabilität der kommerziellen Lactobazillen-Stämme, welche üblicherweise eine Lagerung im Kühlschrank erfordern, und die jedenfalls ihre Aktivität in großem Ausmaß leicht verlieren.
4. Zusammenfassung
Der Anmelder hat nun unerwartet ein Verfahren gefunden, welches in industriellem Maßstab die Selektion von Lactobazillen-Stämmen ermöglicht, die hervorragend verfügbar und resistent gegen technologische Behandlungen sind, wobei die Stämme brauchbar sind für therapeutische, prophylaktische und jedenfalls probiotische Behandlungen von Störungen des Gastrointestinalsystems in Menschen, wobei das Verfahren Inkubieren in einem Nährmedium einer zuvor gefriergetrockneten, dann rehydratisierten Mischung umfasst, enthaltend eine Vielzahl von Lactobazillen-Stämmen, und Selektion der ersten wachsenden Bakterien-Kolonien, die sich nicht später als in den ersten 12 Stunden, bevorzugt in 10 Stunden der Inkubation entwickeln, im Nährmedium bei einer Temperatur von etwa 30°C bis etwa 40°C, bevorzugt bei 37°C.
Der Inkubationsschritt der Mischung aus den gefriergetrockneten Stämmen wird typischerweise auf einer Platte in einem Nährmedium durchgeführt, das mit Agar versetzt wurde, bevorzugt auf einem agarisiertem MRS-Medium (de Man Rogosa Sharpe-Medium).
Die Bildung der Kolonien wird in geeigneter Weise unter einem optischen Mikroskop nachgewiesen, insbesondere durch Beobachten der Rückseite der Platte.
Die zu gefriertrocknende Lösung stammt aus der normalen intestinalen Bakterienflora eines gesunden menschlichen Subjekts und wird typischerweise aus biologischen Proben erhalten, die eine große Anzahl von Bakterienspezies enthalten (beispielsweise Darmschleimhaut, Fäces), die aus der humanen intestinalen Umgebung oder deren Inhalt durch üblichen Techniken isoliert wurden.
Vor der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden diese Proben üblicherweise geeigneten Vorbehandlungen entsprechend konventionellen Methoden unterworfen (beispielsweise physikalische Vorbehandlungen wie Homogenisieren und/oder Verdünnung in einem geeigneten Verdünner, beispielsweise Wasser).
Das vorliegende Verfahren umfasst darüber hinaus einen oder mehr Vorselektionsschritte durch Inkubation in einem bekannten für Lactobazillen selektiven Nährmedium, unter den für die Entwicklung von Lactobazillen bekannten Inkubationsbedingungen, aus denen an Lactobazillen stark angereichte Bakterienmischungen erhalten werden.
Der Vorselektionsschritt wird bevorzugt vor dem Gefriertrocknen durchgeführt, mit der bevorzugten, wie oben beschrieben, vorbehandelten biologischen Probe, um Bakterienmischungen zu erhalten, die anschließend dem Gefriertrocknen und den weiteren Selektionsschritten gemäß der vorliegenden Erfindung unterzogen werden, wobei dieser Schritt typischerweise in einem flüssigen Medium durchgeführt wird, beispielsweise einem flüssigen MRS-Medium, das gegebenenfalls mit weiteren Nährstoffen oder brauchbaren Substanzen versetzt ist, wie im folgenden angegeben.
Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind selektierte Lactobacillus-Stämme und die Bakterienkulturen, die Präparate oder Formulierungen, welche die vorliegenden Lactobazillen in Kombination mit einem pharmazeutisch oder jedenfalls physiologisch verträglichen Träger enthalten, wie therapeutische und/oder prophylaktische Zusammensetzung, Diätergänzungsmittel, medizinische Vorrichtungen, Nahrungsmittelprodukte.
5. Detaillierte Offenbarung
Das vorliegende Verfahren ermöglicht die Selektion von hoch lebensfähigen Lactobazillen, die geeignet sind für die Formulierung als pharmazeutische Präparate oder Diätzusätze in industriellem Maßstab, welche sich als sehr effizient und vorteilhaft bei der Behandlung verschiedener Erkrankungen des Gastrointestinalsystems erwiesen haben, Entsprechend einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stammen die Mischungen der Bakterienstämme, die dem vorliegenden Verfahren unterworfen werden, aus Proben von menschlichen Fäces, Entsprechend einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Mischungen, enthaltend eine große Anzahl von Lactobazillen, die zur menschlichen intestinalen Flora gehören, gefriergetrocknet, dehydratisiert, in einem Nährmedium inkubiert, wobei die selektierten Stämme, wie oben beschrieben, inkubiert werden, dann weiter einem oder mehreren der folgenden Selektionsschritte, bevorzugt allen, in beliebiger Reihenfolge unterzogen:

a) Inkubation in einem Nährmedium, das Galle in Konzentrationen von mindestens 0,1 Gew.-%/Volumen enthält, und Selektion der Stämme, die in dem genannten Medium wachsen,
b) Inkubation in einem sauren Nährmedium mit einem pH, der niedriger oder gleich 5,5 ist (bevorzugt niedriger als 3,5) und Selektion der Stämme, die in diesem Medium wachsen;
c) Inkubation in einem Nährmedium, enthaltend Zellen der Intestinalmukosa des zu behandelnden Subjektes, insbesondere Menschen, und Selektion der Bakterien, die an den Zellen in einer mittleren Rate haften können, entsprechend einer Adhäsion von mindestens 50 Bakterien pro Intestinalzelle in einer Inkubationszeit von bis zu 5 Minuten;
d) Inkubation der Stämme in einem Nährmedium und Selektion der Bakterien, die mindestens 3,5 mEq Milchsäure pro 10¹⁰ CFU (Kolonie-bildende Einheiten) bei 37°C in einer Zeit von 24 Stunden produzieren;
e) Inkubation der Stämme in einem Nährmedium und Selektion der Bakterienstämme, die bei 37°C mit einer Generationszeit von weniger als einer Stunde, bevorzugt von etwa 45 Minuten wachsen.

Die oben als a) bis e) bezeichneten Selektionsschritte werden typischerweise unter den Betriebsbedingungen durchgeführt, die in US 5,032,399 und im entsprechenden EP 199 535 beschrieben sind, mit dem Unterschied, dass die Mischungen von Mikroorganismen aus einer vorherigen Selektion, die aus der Isolierung von Mikroorganismen stammen, welche zur Differenzierung in einem mit zuvor gefriergetrockneten und rehydratisierten Stämmen inkubierten Nährmedium stammen, den Schritten a) bis d) unterworfen werden, Genauer gesagt umfasst das vorliegende Verfahren die folgenden Schritte:

1) Inkubation einer Mischung von Mikroorganismen, enthaltend eine Vielzahl von Lactobazillen in einem für Lactobazillen selektiven Medium, und Isolierung der so entwickelten Bakterienzellen;
2) Gefriertrocknen der aus dem vorhergehenden Schritt stammenden bakteriellen Zellen, bevorzugt in Gegenwart eines oder mehrerer Additive zum Gefriertrocknen;
3) Rehydratisierung der gefriergetrockneten Mischung aus dem vorherigen Schritt;
4) Inkubataion der resultierenden gefriergetrockneten und rehydratisierten Mischung in einem Nährmedium, bevorzugt in einem für Lactobazillen selektiven Medium, und Isolierung der entwickelten Zellen nicht später als in den ersten 12 Stunden, bevorzugt innerhalb von etwa 10 Stunden Inkubation bei 37°C in diesem Nährmedium.

Die entsprechend dem vorliegenden Verfahren isolierten Kulturen von Lactobazillen können manchmal durch Spuren von Bakterienstämmen kontaminiert sein, die zu anderen Spezies aus der mikrointestinalen Flora stammen, ohne dass vom Umfang der vorliegenden Erfindung abgewichen wird.
Das für Lactobazillen selektive Medium ist beispielsweise eine MRS-Kulturflüssigkeit (de Man Rogosa Sharpe-Flüssigkeit, Oxoid), kommerziell angeboten von DIFCO und beschrieben in J. Applied Bacteriol. (1960), 23, 130, welches die in der oben angegebenen US 5,032,399 und EP-B199 535 berichtete Zusammensetzung aufweist, oder ein anderes selektives Medium, das für diesen Zweck bekannt ist, gegebenenfalls versetzt mit weiteren Nährstoffen oder weiteren Substanzen. Beispielsweise kann ein mit Gallensäuresalzen versetztes MRS-Medium (beispielsweise in einer 0,5 Gew.-%/Volumen-Konzentration, bezogen auf die gesamte Flüssigkeit) verwendet werden.
Die Inkubation in einem für Lactobazillen selektiven Medium nach Schritt 1) wird typischerweise in einem flüssigen Medium durchgeführt.
Die Inkubation der gefriergetrockneten, rehydratisierten Bakterienstämme, wie in Schritt 4), wird typischerweise auf agarisierten Platten, bevorzugt in einem selektiven Medium für Lactobazillen, durchgeführt, obwohl es alternativ in einem unterschiedlichen Nährmedium durchgeführt werden kann, das üblicherweise für ihre Entwicklung bekannt ist.
Die oben genannten Inkubationsschritte der Lactobazillen werden typischerweise bei einer Temperatur von 30°C bis 40°C, bevorzugt bei 37°C, bevorzugter in mild anaerober Atmosphäre durchgeführt.
Das Gefriertrocknen wird bevorzugt in Gegenwart von Additiven durchgeführt, die als Gefriertrocknungs-Schutzmittel bekannt sind, beispielsweise entrahmtes Milchpulver (in Mengen von beispielsweise etwa 10 bis 12 Gew.-%, bezogen auf die zu gefriertrocknenden Lactobazillen), Saccharose, Glycerin, oder jedenfalls durch Durchführen entsprechender alternativer, üblicher Gefriertrocknungstechniken, Das vorliegende Verfahren ermöglicht die Selektion von Lactobazillen, wie der im Institut Pasteur hinterlegten Stämme, wie im folgenden angegeben, mit hoher Resistenz gegen technologische Behandlungen, insbesondere hoher Lebensdauer und hoher Lagerungsstabilität, bei Temperaturen von etwa +15°C/+20°C, und darüber hinaus einer oder mehrerer der folgenden vorteilhaften überraschenden Charakteristika: Fähigkeit zur Bildung von Milchsäure in im wesentlichen stereomerenreiner L-(+)-Form, oder jedenfalls in einer Menge, die wesentlich höher ist als die des Isomeren D(–), Resistenz gegen verschiedene Antibiotika, insbesondere Unempfindlichkeit gegen Tetracycline, jedoch Empfindlichkeit gegen andere Antibiotika, insbesondere Rifampicin und Erythromycin.
Entsprechend einer weiteren vorteilhaften Eigenschaft sind die entsprechend den vorliegenden Verfahren erhaltenen Lactobazillen nicht dazu fähig, ihre Resistenz gegen Tetracycline auf weitere Mikroorganismen zu übertragen, einschließlich der pathogenen.
Insbesondere haben die erfindungsgemäßen Lactobazillen die folgenden Merkmale:

– Stabilität gegen Säuren;
– Stabilität gegen Gallensäfte;
– Fähigkeit zur Adhäsion an Zellen der Intestinalmukosa;
– Fähigkeit zum effizienten Wachstum in vitro.

Die Fähigkeit zur alleinigen Bildung, oder jedenfalls in hohem Überschuss, von L-(+)-Milchsäure, d. h. des L(+)-Isomeren, welches vom Körper nicht metabolisiert wird und während einer langen Zeit im Intestinallumen verbleiben kann, wo es seine Wirkung ausübt, ist extrem vorteilhaft dahingegen, dass die von Lactobazillen produzierte Milchsäure mindestens teilweise für die günstigen Wirkungen der Kolonisierung des Gastrointestinaltrakts durch Lactobazillen verantwortlich ist, indem Pathogenen vermutlich durch eine Absenkung des pH der intestinalen Umgebung entgegengewirkt wird.
Die Empfindlichkeit gegen einige Typen von Antibiotika, die für die erfindungsgemäßen Lactobazillen nachgewiesen wurde, ist ein wichtiger vorteilhafter Faktor. Es ist in der Tat bekannt, dass Kreuzresistenz-Phänomene gegen Antibiotika durch Migration von plasmidischem Material von einem Mikroorganismus zu einem anderen auftreten können. Daher ist die Gabe von Lactobazillen, die gegen alle Antibiotika resistent sind, für den Körper potentiell gefährlich dahingehend, dass pathogene Stämme, die gegen alle Antibiotika resistent sind, selektiert werden könnten.
Es ist daher wichtig, dass die Milchsäurebakterien, die für die Behandlung von Erkrankungen des Gastrointestinalsystems gegeben werden, zumindest gegen einige Antibiotika empfindlich sind, um geeignete therapeutische Waffen verfügbar zu haben, falls die oben erwähnte Kreuzresistenz auftreten sollte.
Im Gegensatz zu den durch das vorliegende Verfahren isolierten Lactobazillen zeigte sich, dass verschiedene bekannte Lactobazillus-Stämme, darunter das im US 5,032,399 offenbarte Milchsäure-Bakterium GG, unempfindlich gegen alle Antibiotika und daher unter diesem Gesichtspunkt unvorteilhaft sind.
Die Selektion entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren kann periodisch durchgeführt werden, um Stämme mit unterschiedlichen Lysotypien zu isolieren und zu verwenden, die jedoch probiotische Eigenschaften beibehalten wie:

– Fähigkeit zur Erreichung der Wirkungsstelle in unzerstörtem Zustand;
– Fähigkeit zur Besiedlung des gastrointestinalen Bereichs;
– Produktion von L-(+)-Milchsäure.

Die Möglichkeit der Selektion von Stämmen mit unterschiedlichen Lysotypien ermöglicht die Gewährleistung der Produktivität und Wirksamkeit des Fermentationsverfahrens und/oder einer sicheren Kolonisierung im Darm sogar in Gegenwart von Phagen, die Lactobazillen sowohl in der Fermentationsumgebung als auch im Intestinallumen phagocytieren und zerstören können, und so die Produktion von Lactobazillen oder die sie verwendenden therapeutischen oder diätetischen Behandlungen hinfällig machen.
Darüberhinaus sind die erfindungsgemäßen Lactobazillus-Stämme in unerwarteter Weise mit einer höheren Stabilität versehen, verglichen mit denjenigen, die durch die bekannten Verfahren erhalten werden, da sie während langer Zeit bei Temperaturen von oberhalb 4°C gelagert werden können, insbesondere bei +15°C/+20°C. Beispielsweise beträgt nach etwa 18 bis 24 Monaten bei ungefähr 22°C die Abnahme der lebensfähigen Zellen nur eine logarithmische Einheit.
Dank dieser Eigenschaft zeigen die erfindungsgemäßen Präparate Mengen von lebenden Lactobazillen von nur etwa ein Logarithmus weniger Zellen pro Einheitsdosis, verglichen mit der Anzahl lebender Zellen zum Zeitpunkt Null, sogar nach Monaten von der Kommerzialisierung an, im Gegensatz zu dem, was für verschiedene kommerzielle Zusammensetzungen des Stands der Technik beobachtet wird, die eine hohe Abnahme der lebenden Zellen zeigen, verglichen mit denjenigen, die zum Zeitpunkt der Verpackung angegeben werden, und die daher unter therapeutischem Gesichtspunkt häufig schlecht wirksam sind.
In der Tat ergibt die Behandlung mit erfindungsgemäßen Lactobazillen günstige Ergebnisse wie die fast vollständige Remission von Diarrhö, sogar wenn sie schwer und hartnäckig ist, aufgrund von beispielsweise Antitumor-Radiotherapie, in kurzer Zeit, d. h. etwa 1 bis 2 Tagen, was deutlich weniger ist als die Zeit, die mit dem Lactobazillen-Stamm des Stands der Technik erforderlich ist. Die Schnelligkeit der Wirkung kann zumindest teilweise der hohen Lagerstabilität zugeschrieben werden, die die erfindungsgemäßen Lactobazillen zeigen.
Genauer ermöglichte das erfindungsgemäße Verfahren die Selektion von neuen Lactobazillus-Stämmen, die zu den Spezies Paracasei und Salivarius gehören, insbesondere 3 Stämmen, die unter dem Budapester Vertrag bei der „Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" (CNCM) des Institut Pasteur (25, Rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15) unter den folgenden Zugangsnummern hinterlegt wurden:

– Milchsäurebakterium PF1S, hinterlegt am 3. April 1996 unter der Zugangsnummer CNCM I-1687, mit der taxonomischen Bezeichnung Lactobacillus Paracasei;
– Milchsäurebakterium PF2P, hinterlegt am 3. April 1996 unter der Zugangsnummer CNCM I-1688, mit der taxonomischen Bezeichnung Lactobacillus Paracasei;
– Milchsäurebakterium PF1S1, hinterlegt am 6. Dezember 1 996 unter der Zugangsnummer CNCM I-1794, mit der taxonomischen Bezeichnung Lactobacillus Salivarius.

Die drei Lactobazillen-Stämme Paracasei und Salivarius, die oben durch ihre Zugangsnummern identifiziert wurden, bilden ausschließlich L(+)-Milchsäure, sind empfindlich gegen Erythromycin und Rifampicin und unempfindlich gegen Tetracycline, sind stabil gegen Säuren und widerstehen pH 3,5 während 30 Minuten bei 40°C.
Insbesondere die L. Paracasei-Stämme, insbesondere das Milchsäurebakterium PF2P CNCM I-1688, sind unempfindlich gegen Aztreonam, Cefotixina, Vancomycin und Tetracyclin und empfindlich gegen Erythromycin, Rifampicin und Cefotaxim, und sie fermentieren Ribose; und Salivarius-Stämme wie der PF1S1 CNCM I-1794-Stamm sind unempfindlich gegen Cefotaxim und Tetracyclin und empfindlich gegen Erythromycin und Rifampicin.
Die erfindungsgemäßen Lactobazillen können als solche gegeben werden, oder sie können mit einem pharmazeutisch oder jedenfalls physiologisch verträglichen Träger versetzt werden, um verschiedene Typen von Präparaten oder Formulierungen zu erhalten wie pharmazeutische Zusammensetzungen, Diätergänzungen oder Nahrungsmittelprodukte, insbesondere Milchprodukte (wie Milch, Joghurt), die ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind.
Die vorliegenden Präparate oder Formulierungen enthalten mindestens ein Milchsäurebakterium gemäß der vorliegenden Erfindung, bevorzugt Mischungen von mindestens einem Milchsäurebakterium der Spezies Paracasei oder Salivarius, insbesondere in wirksamen Mengen für die gewünschte therapeutische, prophylaktische oder probiotische Behandlung und können beispielsweise entsprechend üblichen Techniken hergestellt werden.
Der Träger kann Exzipienten, Additive, Verdünner oder weitere nützliche Substanzen enthalten, vorausgesetzt, sie sind pharmakologisch oder physiologisch verträglich.
Für die Behandlung von Störungen des Gastrointestinalsystems gemäß der Erfindung werden Lactobazillen typischerweise oral gegeben, bevorzugt als Paracasei- und Salivarius-Gemische.
Die tägliche wirksame Menge für Menschen umfasst allgemein 10⁷ bis etwa 2 × 10⁹ Lactobazillen pro Tag für einen Erwachsenen (mit einem Gewicht von durchschnittlich 50 bis 70 kg), oder 10⁶ bis 10⁸ Lactobazillen für Kinder, Typische Präparate für die Behandlung von Störungen des Gastrointestinalsystems gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten beispielsweise 10⁶ bis 3 × 10⁹ UFC Lactobazillen als Einheitsdosis.
Bevorzugt enthalten die erfindungsgemäßen Präparate Lactobazillen in gefriergetrockneter Form.
Zu diesem Zweck werden wässrige Mischungen, enthaltend Lactobazillen und bevorzugt mindestens ein Gefriertrocknungsadditiv, typischerweise unter den oben für das Verfahren zur Selektion von Lactobazillen gemäß der Erfindung angegebenen Bedingungen oder nach bekannten Verfahren gefriergetrocknet.
Bevorzugt werden für die Zwecke der Erfindung Lactobazillen, typischerweise in gefriergetrockneter Form, mit Exzipienten oder Additiven kombiniert, die ausgewählt werden aus:
Vitaminen (wie Vitaminen der Gruppe B, beispielsweise Vitamin B1 und B2, Vitamin C und Gemische davon), Kohlenwasserstoffen (z. B. Süßstoffe wie Saccharose und Maltodextrine) und Siliziumdioxid, bevorzugt im Gemisch, beispielsweise Mischungen von Vitaminen B1, B2, C, Saccharose, Maltodextrinen und Siliziumdioxid.
Vitamine sind in Mengen anwesend, die von der typischen Dosis für das Vitamin abhängen, beispielsweise etwa 0,1 bis 5 mg Vitamin B1 oder B2 für 10⁹ Lactobazillen und etwa 5 bis 20 mg Vitamin C für 10⁹ Lactobazillen; Kohlenwasserstoffe sind beispielsweise in Mengen von 500 bis 1000 mg für 10⁹ Lactobazillen anwesend (beispielsweise etwa 500 bis 800 mg Saccharose für 10⁹ Lactobazillen, bevorzugt kombiniert mit etwa 100 bis 300 mg Maltodextrinen für 10⁹ Lactobazillen); Siliziumdioxid ist in Mengen von beispielsweise etwa 0,5 bis 5,0 mg für 10⁹ Lactobazillen vorhanden.
Bevorzugt wird im Endprodukt das die Lactobazillen enthaltene gefriergetrocknete Produkt in Sachets in Papier/Aluminium/Polyethylenfolie verpackt.
Die erfindungsgemäßen Lactobazillen sind wertvoll für die Behandlung von verschiedenen Störungen des Gastrointestinaltrakts, beispielsweise solchen, die auf Veränderungen des Gleichgewichts der Intestinalflora zurückzuführen sind, insbesondere Diarrhö und Konstipation, beispielsweise spezifische und aspezifische Diarrhö (insbesondere Diarrhö im Anschluss an die Verwendung von Antibiotika), chronische Darmentzündungen, Kolitis, Flatulenz, Sodbrennen, Gastroenteritis, aphthöse Stomatitis, peristaltische Störungen, weitere Zustände von beeinträchtigten Gastrointestinalfunktionen und/oder Dysmikrobismus im Anschluss an Operationen, Nieren- oder Lebererkrankungen, Radiotherapie, unausgewogene Ernährung, emotionalen Stress, Alterung oder Störungen des Immunsystems.
Die erfindungsgemäßen Lactobazillen sind darüber hinaus wirksam bei der Behandlung von Reizdarm. Dies ist ein besonders unerwartetes Ergebnis dahingehend, dass, obwohl bekannt ist, dass Lactobazillen hauptsächlich im distalen Darm kolonisieren, es nicht bekannt ist, dass sie das Kolon in großen Mengen besiedeln können.
Einige exemplarische Ausführungsformen der Erfindung werden im folgenden angegeben.
BEISPIEL
Zusammensetzung für die orale Anwendung in gefriergetrockneter Form, enthaltend in Sachets aus Papier/Aluminium/Polyethylenfolie, jeweils enthaltend:

– Lactobacillus Paracasei PF2P, in Mengen von mindestens 10⁹ UFC;
– Lactobacillus Salivarius PF1S1, in Mengen von mindestens 10⁹ UFC;

– Lactobacillus Paracasei PF1S, in Mengen von mindestens 10⁹ UFC;
– Lactobacillus Salivarius PF1S1, in Mengen von mindestens 10⁹ UFC;

Die folgenden Tabellen zeigen die Fermentationsprofile der drei beim Institut Pasteur hinterlegten Lactobazillen-Stämme, erholten mit Hilfe des API 50CHL-Systems.
Tabelle 1
Der Stamm L. Paracasei PF1S-CNCM I-1687 fermentiert die folgenden Kohlenwasserstoffe:
L-Arabinose, Ribose, Galactose, D-Glukose, D-Fruktose, D-Mannose, L-Sorbose, Rhamnose, Dulcitol, Inositol, Mannitol, Sorbitol, α-Methyl-D-Mannosid, α-Methyl-D-Glukosid, N-Acetylglukosamin, Amygdalin, Arbutin, Esculin, Salicin, Cellobiose, Maltose, Lactose, Melibiose, Saccharose, Trhealose, Inulin, Melicitose, β-Gentiobiose, D-Turanose, D-Tagatose.
Tabelle 2
L. Paracasei PF2P-CNCM I-1688 fermentiert die folgenden Kohlenwasserstoffe:
L-Arabinose, Ribose, Galactose, D-Glukose, D-Fruktose, D-Mannose, L-Sorbose, Rhamnose, Dulcitol, Inositol, Mannitol, Sorbitol, α-Methyl-D-Mannosid, α-Methyl-D-Glukosid, N-Acetylglukosamin, Amygdalin, Arbutin, Esculin, Salicin, Cellobiose, Maltose, Lactose, Melibiose, Saccharose, Threalose, Inulin, Melicitose, α-Gentiobiose, D-Turanose, D-Tagatose,
Tabelle 3
L. Salivarius-Stamm PF1S1-CNCM I-1794 fermentiert die folgenden Kohlenwasserstoffe:
Galactose, D-Glukose, D-Fruktose, D-Mannose, Mannitol, Sorbitol, N-Acetylglukosamin, Maltose, Lactose, Melibiose, Saccharose, Trehalose, D-Raffinose, Xylitol, D-Arabitol,

Claims

Verfahren zur Auswahl von Lactobacillus-Stämmen, die nützlich in der Behandlung von Störungen des Gastrointestinaltraktes beim Menschen sind, das umfasst: Das Inkubieren in einem Nährmedium einer Mischung, die eine Mehrzahl von Lactobacillus-Stämmen enthält, die in einer normalen humanen Instestinalbakterienflora vorkommen, die vorher gefriergetrocknet und anschließend rehydratisiert wurden, gefolgt durch die Auswahl von Kolonien, die sich nicht später als in den ersten zwölf Stunden der Inkubation in dem genannten Nährmedium bei einer Temperatur von 30°C bis 40°C entwickeln.
Verfahren nach Anspruch 1, das die folgenden Schritte umfasst: 1) Inkubation einer Mischung von Mikroorganismen, die eine Mehrzahl von Lactobazillen enthalten, in einem Selektivmedium für Lactobazillen und Isolieren der so entwickelten Bakterienzellen; 2) Gefriertrocknen der Bakterienzellen aus dem vorhergehenden Schritt in Gegenwart von einem oder mehreren Gefriertrocknungsadditiven; 3) Rehydratisierung der gefriergetrockneten Mischung aus dem vorherigen Schritt; 4) Inkubation der resultierenden gefriergetrockneten und rehydratisierten Mischung in einem Medium für selektive Lactobazillen oder in einem anderen Nährmedium und Isolieren der Zellen, die sich nicht später als in den ersten zwölf Stunden der Inkubierung bei 37°C in dem genannten Nährmedium entwickeln.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das Isolieren der Zellen, die sich nach der Inkubation der oben erwähnten gefriergetrockneten und rehydratisierten Mischung entwickelt haben, innerhalb der ersten zehn Stunden der Inkubation bei 37°C durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Inkubation in einer MRS-Kulturbrühe durchgeführt wird.
Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 4, worin die Inkubation der obigen gefriergetrockneten und rehydratisierten Mischung auf Platten in einem Nährmedium, das mit Agar versetzt ist, durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das Gefriertrocknen in Gegenwart von Gefriertrocknungsadditiven durchgeführt wird, die ausgewählt werden aus Magermilchpulver, Saccharose und Glycerin.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Inkubation der oben erwähnten gefriergetrockneten und rehydratisierten Stämme gefolgt wird von einem oder mehreren der folgenden Auswahlschritte, die in beliebiger Reihenfolge durchgeführt werden: a) Inkubation in einem Nährmedium, das Galle enthält in Konzentrationen von mindestens 0,1% Gewicht/Volumen und Auswahl der Stämme, die sich in dem genannten Medium vermehren; b) Inkubation in einem sauren Nährmedium, das einen pH von gleich oder weniger als 5,5 aufweist und Auswahl der Stämme, die sich in dem genannten Medium vermehren; c) Inkubation in einem Nährmedium, das Zellen der Intestinalschleimhaut des zu behandelnden Subjektes enthält und Auswahl der Bakterien, die fähig sind, an die Zellen mit einer Durchschnittsrate zu haften, die der Haftung von mindestens 50 Bakterien für jede Intestinalzelle entspricht, während einer Inkubationsdauer, die kleiner oder gleich 5 Minuten ist; d) Inkubation der Stämme in einem Nährmedium und Auswahl der Bakterien, die mindestens 3,5 mEq Milchsäure pro 10¹⁰ UFC (Kolonie-formende Einheiten) bei 37°C in einer Zeit von 24 Stunden erzeugen; e) Inkubation von Stämmen in einem Nährmedium und Auswahl der Bakterienstämme, die sich bei 37°C innerhalb einer Bildungsdauer von weniger als einer Stunde vermehren.
Kultur ausgewählt aus den folgenden Kulturen, die bei der CNCM-Sammlung des Instituts Pasteur hinterlegt sind: – Lactobacillus Paracasei, CNCM I-1687; – Lactobacillus Paracasei, CNCM I-1688; – Lactobacillus Salivarius, CNCM I-1794.
Präparat zur Behandlung von Störungen des Gastrointestinalsystems beim Menschen, das eine wirksame Menge von mindestens einem Milchsäurebakterienstamm, wie in Anspruch 8 definiert, in Kombination mit pharmazeutisch oder physiologisch verträglichen Trägern enthält.
Präparat nach Anspruch 9, ausgewählt aus pharmazeutischen Zusammensetzungen, Nahrungsergänzungsmitteln und Lebensmittelprodukten.
Präparat nach Anspruch 1 0 für die orale Anwendung.
Präparat nach Anspruch 9, worin der genannte Milchsäurebakterienstamm in gefriergetrockneter Form vorliegt.
Präparat nach Anspruch 9, ausgewählt aus pharmazeutischen Zusammensetzungen und Nahrungsergänzungsmitteln, worin die Lactobazillen kombiniert sind mit Exzipienten oder Additiven, die ausgewählt sind aus Vitaminen, Kohlenwasserstoffen und Siliciumdioxid.
Präparat nach Anspruch 9, das Vitamin B1 und B2, Vitamin C und Mischungen davon, Saccharose, Maltodextrine und Siliciumdioxid enthält.
Verwendung einer Kultur, die einen Milchsäurebakteriumstamm, wie in Anspruch 8 definiert, enthält, für die Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von Störungen des Gastrointestinalsystems beim Menschen.
Verwendung nach Anspruch 15, worin die genannten Störungen ausgewählt werden aus der Gruppe, die besteht aus spezifischen und nicht spezifischen Diarrhöen, Verstopfungen, Colitis, Blähungen, Sodbrennen, Gastroenteritis, aphthöse Stomatitis und Reizdarm.