DE2813733C2

DE2813733C2 -

Info

Publication number: DE2813733C2
Application number: DE2813733A
Authority: DE
Inventors: Masahiko Higashi Yamato Tokio/Tokyo Jp Mutai; Mitsuo Kodaira Tokio/Tokyo Jp Mada; Kiyohiro Kunitachi Tokio/Tokyo Jp Shimada
Original assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Current assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Priority date: 1977-03-31
Filing date: 1978-03-30
Publication date: 1988-01-28
Also published as: JPS53121949A; GB1561169A; AU3197277A; CH638660A5; FR2385335B1; US4187321A; FR2385335A1; AU511674B2; PH13754A; JPS5721303B2; DE2813733A1

Description

Bifidobakterien kommen bekanntlich vorherrschend in der Darmflora von Brustkindern vor. Sie haben verschiedene physiologische Wirkungen, beispielsweise unterdrücken sie Fäulnisbakterien, sie hemmen die Bildung toxischer Amine, sie fördern die Verdauung des in der Muttermilch enthaltenen Caseins durch die Wirkung von Phosphoproteidphosphatase und sie hemmen das Wachstum pathogener Mikroorganismen in Verbindung mit der Verringerung des pH-Werts im Darm durch Erzeugung von Milchsäure, Essigsäure und Ameisensäure.

Flaschenkinder hingegen besitzen im Darm sehr wenige dieser Bifidobakterien. Das wird als ein Grund dafür angesehen, daß Flaschenkinder für Darmkrankheiten anfälliger sind als Brustkinder. Um die Darmflora eines Flaschenkindes der eines Brustkindes anzugleichen, ist deshalb als Ersatz für die Muttermilch eine Bifidobakterien enthaltende, pulverisierte Milch für Kinder versuchsweise hergestellt worden.

Dabei treten jedoch u. a. die nachstehend angegebenen Schwierigkeiten auf:

a) Bifidobakterien sind ursprünglich obligat (streng) anaerob, d. h. für ihr Wachstum sind strikt anaerobe Bedingungen erforderlich;
b) sie vermehren sich auf Medien aus reiner Kuhmilch nur sehr geringfügig, wenn diese keine wachstumsfördernden Substanzen, wie Hefeextrakt oder Maisquellflüssigkeit, enthält;
c) bei einem Zusatz von wachstumsfördernden Substanzen und Reduktionsmitteln zu den Medien aus Kuhmilch wachsen sie unter den gleichen aeroben Bedingungen, wie sie für die Züchtung von Lactobacillus gelten. Jedoch sind derartige Zusätze im allgemeinen teuer und beeinträchtigen den Geschmack der erhaltenen Kulturen.

Da die Züchtung von Bifidobakterien wegen der vorstehend angegebenen Gründe wesentlich schwieriger als die von Lactobacillus ist, konnte bisher eine großtechnische Herstellung von Nahrungsmitteln und Getränken mit einem Gehalt an diesen Bakterien nicht durchgeführt werden.

Es wurden daher Versuche mit dem Ziel angestellt, praktisch durchführbare Verfahren zur Züchtung von Bifidobakterien zu entwickeln, so daß Nahrungsmittel und Getränke mit einem Gehalt an diesen Bakterien zu niedrigen Preisen hergestellt werden können. Dabei wurden Bifidobacterium bifidum YIT-4002 (FERM BP-1038) und YIT-4005 (FERM BP-1039) und Bifidobacterium breve YIT-4006 (FERM BP-752) aufgefunden. Bei diesen Stämmen handelt es sich um Mutantenstämme (Dissozianten) von Bifidobacterium mit hochspezifischen Eigenschaften, die sich zur Herstellung von fermentierten Milchprodukten eignen.

Die vorgenannten Mutanten können sich unter aeroben Bedingungen in Medien auf der Basis von reiner Kuhmilch vermehren. Insbesondere ist der Stamm YIT-4005 so stark säureresistent, daß er auch bei Konservierung der Milchprodukte nicht ohne weiteres abstirbt.

Es wurde nun erfindungsgemäß festgestellt, daß bei einer Züchtung der genannten Mutanten mit üblichen obligat anaeroben Bifidobakterien die letzteren in reinen Kuhmilchmedien unter aeroben Bedingungen gut wachsen.

Der Gegenstand der Erfindung ist in den Patentansprüchen definiert.

Erfindungsgemäß lassen sich Nahrungsmittel und Getränke mit einem Gehalt an mehreren Spezies von Bifidobakterien herstellen, indem man einfach Bifidobakterien, die obligat anaerob sind, unter aeroben Bedingungen, die denen für die sauerstoffresistenten Mutanten oder für Lactobacillus ähnlich sind, züchtet. Dieses Verfahren weist gegenüber anderen Verfahren, bei denen nur übliche Bifidobakterien oder deren sauerstoffresistente Mutanten verwendet werden, Vorteile auf, da es zu Produkten führt, die in bezug auf physiologische Aktivität und Geschmack eine günstige Eigenschaftenkombination aufweisen. Dabei werden je nach Art des Produktes und von dessen Verwendungszweck die günstigen Spezies von Bifidobakterien mit unterschiedlichen Eigenschaften in bezug auf physiologische Aktivität, Säurebildungsfähigkeit während der Züchtung und Geschmacksbeeinflussung des Produkts ausgewählt.

Im erfindungsgemäßen Verfahren können alle sauerstoffresistenten Mutanten von Bifidobacterium verwendet werden, die in Medien auf der Basis von reiner Milch unter aeroben Bedingungen wachsen können. Beispiele dafür sind die vorerwähnten Stämme YIT-4002, YIT-4005 und YIT-4006. Die wachstumsfördernde Aktivität gegenüber obligat anaeroben Stämmen unter aeroben Bedingungen ist eine gemeinsame Eigenschaft aller sauerstoffresistenten Mutanten und daher nicht auf die vorstehend genannten drei Spezies beschränkt.

In bezug auf die Zusammensetzung der beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nährmedien für die gemischte Züchtung von obligat anaeroben Stämmen und sauerstoffresistenten Mutanten gibt es keine speziellen Beschränkungen. Es sind auch keine speziellen Bestandteile erforderlich. Beispielsweise können beliebige Milcharten mit einer Feststoffkonzentration von 10 bis 20 Prozent verwendet werden, wie Milch, Magermilch oder aus Milchpulver hergestellte Milch. Es können auch halbsynthetische Medien ohne einen Gehalt an Milchfeststoffen verwendet werden. Da wachstumsfördernde Bestandteile, wie Hefeextrakt, Maisquellflüssigkeit und Pepton, sowie Reduktionsmittel, wie L-Ascorbinsäure und L-Cystein, nicht erforderlich sind, erhält man beim erfindungsgemäßen Verfahren eine fermentierte Milch, die lediglich Bifidobacterium ohne weitere Zusätze enthält. Jedoch kann das Wachstum der Bakterien durch Verwendung der vorgenannten Zusätze gefördert werden, wenn die Mengen dieser Zusätze innerhalb von Bereichen liegen, die vom geschmacklichen Standpunkt aus vertretbar sind, oder wenn aufgrund der Art der Produkte keine geschmacklichen Probleme auftreten.

Zunächst werden Präparate von obligat anaeroben Stämmen und sauerstoffresistenten Mutanten im Verhältnis von 1 : 1 bis 3 : 1 vermischt und in einer Menge von 1 bis 3 Gewichtsprozent auf die Medien überimpft. Es ist nicht erforderlich das Medium während der Züchtung unter anaeroben Bedingungen zu halten, so daß ähnliche Vorrichtungen, wie sie bei der routinemäßigen Züchtung von Lactobacillus eingesetzt werden, verwendet werden können.

Bei einer Züchtungstemperatur von 37°C erhält man von den einzelnen Stämmen nach einer Züchtung von 18 bis 24 Stunden im allgemeinen die maximale Menge an lebensfähigen Mikroorganismen. Während des Wachstums werden organische Säuren, wie Milchsäure und Essigsäure, gebildet. Bei Fortsetzung der Züchtung beginnt die Bakterienzahl abzunehmen, während die Säurebildung weitergeht und nach 40 bis 50 Stunden die Sättigungsgrenze erreicht. Der Züchtungsvorgang wird entsprechend überwacht und je nach dem Verwendungszweck der Kultur zu einem entsprechenden Zeitpunkt abgebrochen.

Die erhaltene Kultur kann direkt zur Herstellung von Nahrungsmitteln mit einem Gehalt an Bifidobakterien verwendet werden. Es besteht aber auch die Möglichkeit, die Konzentration und den Geschmack der Kultur zu verändern, indem man beispielsweise Süßstoffe, Fruchtsäfte, Wasser und Geschmacksstoffe zusetzt. Ferner kann die Kultur auch zu Nahrungsmittelpräparaten mit einem Gehalt an Bifidobakterien in Pulver- oder Tablettenform getrocknet werden. In bezug auf die Art und Weise der Verarbeitung der Kultur und in bezug auf die Art der Endprodukte gibt es keine besonderen Beschränkungen, sofern die Lebensfähigkeit der Bifidobakterien gewährleistet ist. Unter dem Ausdruck "Nahrungsmittel und Getränke" sind alle Produkte zu verstehen, die auf- oder eingenommen werden. Dazu gehören beispielsweise auch Arzneimittelpräparate.

Der nachstehend aufgeführte Versuch und die Beispiele erläutern die Erfindung. Ferner sind die bakteriologischen Eigenschaften der drei erwähnten Spezies von sauerstoffresistenten Mutanten angegeben. Unter dem Ausdruck "Azidität" ist das Volumen (ml) einer 0,1 n Natriumhydroxidlösung, das zu Neutralisation von 10 ml Kulturlösung erforderlich ist, zu verstehen.

Versuch

In einen 300 ml-Kolben werden 150 ml 16prozentige, aus Milchpulver zubereitete Magermilch pipettiert. Nach Aufbringen eines Wattestopfens wird 15 Minuten bei 120°C sterilisiert. Sodann wird das Medium durch Rühren in fließendem Wasser auf 37°C abgekühlt, mit 2 Gewichtsprozent der in Tabelle I aufgeführten Bifidobacterium-Anzuchtkulturen beimpft und der statischen Züchtung bei 37°C unterworfen. Die zeitliche Abhängigkeit der Anzahl an lebensfähigen Bakterien und der Azidität werden gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt.

Unter dem Ausdruck "aerobe Bedingungen" sind insbesondere die vorstehend erwähnten Züchtungsbedingungen zu verstehen. Sie entsprechen den grundlegenden Züchtungsbedingungen, wie sie für bei der Milchverarbeitung verwendete Lactobacilli zur Herstellung von fermentierten Milch- und Käseprodukten und Getränken mit einem Gehalt an Milchsäurebakterien angewendet werden.

Die sauerstoffresistenten Mutanten von Bifidobacterium YIT-4002, YIT-4005 und YIT-4006 zeigen unter aeroben Bedingungen in Medien auf der Basis von Kuhmilch alle ein ausgezeichnetes Wachstum und ergeben nach 17-stündiger Züchtung 2,3 bis 5,0 × 10⁹/ml lebensfähiger Organismen. Im Gegensatz dazu ergeben andere Bifidobakterienstämme (übliche, obligat anaerobe Stämme) kaum einen Zuwachs an lebensfähigen Bakterien. Einige Stämme zeigen eine ausgeprägt langsame Aziditätszunahme und sterben rasch nach der Überimpfung ab.

In das auf die vorstehend beschriebene Weise hergestellte Medium werden 2 Gewichtsprozent einer Anzuchtkultur, die durch Vermischen von gleichen Volumina der einzelnen in Tabelle II aufgeführten Spezies von Bifidobacterium und einem der vorerwähnten Mutantenstämme erhalten worden sind, überimpft. Die Züchtung wird unter statischen Bedingungen bei 37°C durchgeführt. Während dieser Zeit werden die zahlenmäßige Entwicklung der lebensfähigen Bakterien und die Azidität gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt. Bei Züchtung eines Gemisches aus Bifidobacterium und den vorerwähnten Mutanten nehmen die zahlenmäßige Entwicklung und die Azidität von Bifidobacterium in ähnlicher Weise zu, wie dies für die vorerwähnten Mutantenstämme der Fall ist. Dies gilt auch in einem Medium aus reiner Milch unter aeroben Bedingungen. Es ist jedoch festzustellen, daß je nach Spezies gewisse Unterschiede auftreten.

Tabelle I

Tabelle II

Beispiel 1

Ein Milchmedium mit 16 Prozent Gesamtfett wird mit jeweils 1 Prozent Bifidobacterium longum (I) und Bifidobacterium bifidum (YIT-4002) (II) beimpft. Die Züchtung wird 30 Stunden unter aeroben Bedingungen bei 37°C durchgeführt. Die Gesamtzahl der lebensfähigen Bakterien der erhaltenen Kultur beträgt 2,5 × 10⁹/ml (6,5 × 10⁸/ml für I und 2,0 × 10⁹/ml für II). Die Azidität beträgt 24,5. Die Kultur wird in einem Homogenisator behandelt. Sodann werden 110 Teile dieser Kultur mit 3 Teilen Saccharose, 3 Teilen Sorbit, 3 Teilen Karottensaft und 80 Teilen Wasser zu einem fermentierten Milchprodukt mit einem Gehalt an den beiden vorerwähnten Spezies vermischt.

Beispiel 2

Ein 10prozentiges Magermilchmedium wird mit jeweils 1 Prozent Bifidobacterium bifidum (III) und Bifidobacterium breve (YIT- 4006) (IV) beimpft. Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen 20 Stunden bei 37°C durchgeführt. Die Gesamtzahl der lebensfähigen Bakterien der erhaltenen Kultur beträgt 2,5 × 10⁹/ml (1,4 × 10⁹/ml für III und 1,9 × 10⁹/ml für IV). Die Kultur wird als solche eingefroren und bei einem Druck von unter 266 Pa etwa 6 Stunden unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält ein Trockenpulver eines fermentierten Milchproduktes mit einem Gehalt an den beiden vorerwähnten Spezies.

Beispiel 3

Ein halbsynthetisches Medium der nachstehend angegebenen Zusammensetzung wird mit jeweils 1 Prozent Bifidobacterium longum (V), Bifidobacterium bifidum (YIT-4005) (VI) und Lactobacillus acidophilus (VII) beimpft. Die Züchtung wird 20 Stunden bei 37°C unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Die Gesamtzahl der lebensfähigen Bakterien beträgt 3,6 × 10⁹/ml (4,0 × 10⁸/ml für V, 1,0 × 10⁹/ml für VI und 1,7 × 10⁹/ml für VII). Die Kultur wird zur Abtrennung und Gewinnung der Zellen in eine Gefrierzentrifuge eingeführt. Sodann werden die Zellen in 30 ml eines Mediums mit einem Gehalt an 10 Prozent Magermilch, 1,0 Prozent Natriumglutamat und 1 Prozent Vitamin C dispergiert und gefriergetrocknet. Man erhält ein getrocknetes Produkt mit einem Gehalt der drei vorerwähnten Spezies. Dieses trockene Material wird mit dem 20-fachen seines Volumens an Trockenstärke versetzt und mit einer Tablettiermaschine zu Tabletten verarbeitet.

Zusammensetzung des Mediums
Vorbehandelte Maisquellflüssigkeit*)70 g Glucose20 g KH₂PO₄ 1 g K₂HPO₄ 2 g Wasser927 ml pH-Wert 7,0

*)Nach Lösen von 10 Prozent Citronensäure in Maisquellflüssigkeit wird der pH-Wert mit Natriumhydroxid auf 8,0 eingestellt. Durch 10-minütige Zentrifugation bei 10 000 U/min wird der Niederschlag entfernt.

Bakteriologische Eigenschaften der sauerstoffresistenten Mutanten von Bifidobacterium (1) Taxonomische Eigenschaften

Es handelt sich um einen gram-positiven Bacillus, der keine Sporen bildet und innerhalb der Zelle Granula aufweist, die sich mit Methylenblau anfärben lassen. Unter dem Mikroskop lassen sich kurze keulenförmige Bacillen erkennen, die häufig gabelförmig geteilt sind. Die Kolonien sind zylindrisch, konvex oder linsenförmig. Bei Züchtung in 12prozentiger Magermilch wird hauptsächlich Essigsäure und Milchsäure gebildet.

Die nachstehenden Versuche führen zu folgenden Ergebnissen:

Katalasenegativ Milchkoagulierungpositiv Gelatineverflüssigungnegativ Schwefelwasserstoffbildungnegativ Indolbildungnegativ Nitratreduktionnegativ Kohlendioxidbildungnegativ

(2) Zuckervergärung

(a) YIT-4002 und YIT-4005
Glucose, Fructose, Lactose und Galactose werden vergärt. Arabinose, Xylose, Salicin, Mannose, Mannit, Melezitose, Cellobiose, Sorbit, Inulin, Trehalose, Rhamnose, Maltose, Ribose und Sorbose werden nicht vergärt.
(b) YIT-4006
Glucose, Fructose, Lactose, Galactose, Salicin, Melezitose, Cellobiose, Maltose, Ribose und Mannose werden vergärt. Arabinose, Xylose, Mannit, Sorbit, Inulin, Trehalose, Rhamnose und Sorbose werden nicht vergärt.

(3) Wachstumsbedingungen

(a) YIT-4002 und YIT-4005
25 bis 45°C, pH-Wert 5 bis 7 (optimale Bedingungen: 36 bis 38°C, pH-Wert 6 bis 7).
(b) YIT-4006
25 bis 42°C, pH-Wert 5 bis 9 (optimale Bedingungen: 36 bis 38°C, pH-Wert 6 bis 7).

Aufgrund der vorstehenden Eigenschaften werden nach Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Auflage, 1974, (a) YIT-4002 und YIT-4005 als Bifidobacterium bifidum und (b) YIT-4006 als Bifidobacterium breve klassifiziert. Da die genannten Stämme aber neue, bei bekannten Bifidobakterien nicht vorhandene Eigenschaften aufweisen, werden sie als neue Mutanten angesehen.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Nahrungsmitteln und Getränken mit einem Gehalt an Bifidobakterien, wobei mehrere Arten von Bifidobakterien im Gemisch vorliegen, unter Züchtung von obligat anaeroben Bifidobakterien in Milch oder einem halbsynthetischen Medium und entsprechender Verarbeitung der erhaltenen Kultur, dadurch gekennzeichnet, daß man eine gemischte Züchtung von sauerstoffresistenten Mutantenstämmen von Bifidobakterium mit den obligat anaeroben Bifidobakterien durchführt, wobei sauerstoffresistente und obligat anaerobe Bifidobakterien im Verhältnis 1 : 1 bis 1 : 3 vorliegen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als sauerstoffresistenten Mutantenstamm Bifidobacterium bifidum YIT-4002 (FERM BP-1038) verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als sauerstoffresistenten Mutantenstamm Bifidobacterium bifidum YIT-4005 (FERM BP-1039) verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als sauerstoffresistenten Mutantenstamm Bifidobacterium breve YIT-4006 (FERM BP-752) verwendet.