DE69833691T2

DE69833691T2 - BAKTERIENSTAMM DER ART LACTOBACILLUS PARACASEI, UNTERART PARACASEI, DIESEN ENTHALTENDE Zusammensetzung ZUR VERWENDUNG IN NAHRUNGSMITTELN UND PRODUKT DIESEN ENTHALTEND

Info

Publication number: DE69833691T2
Application number: DE69833691T
Authority: DE
Inventors: Torkel Wadström; Per Aleljung; Ulla Svensson; Rangne Fonden
Original assignee: Arla Foods AB
Current assignee: Arla Foods AB
Priority date: 1997-12-08
Filing date: 1998-12-08
Publication date: 2006-08-31
Anticipated expiration: 2018-12-09
Also published as: NO326833B1; WO1999029833A1; PT1036160E; EP1036160A1; JP4247458B2; EP1036160B1; ATE318889T1; ES2255195T3; PL341010A1; CA2313245C; AU1896899A; CZ300143B6; SE9704577D0; NO20002919L; RU2205871C2; HU228050B1; CZ20001983A3; HUP0100428A2; CA2313245A1; SE9704577L

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Stamm von Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, eine Zusammensetzung davon zur Verwendung in Nahrungsmitteln sowie ein diesen Stamm enthaltendes Produkt.
Definition und Charakterisierung des Stammes
Der neue Stamm (der im Folgenden der Einfachheit halber mit LMG P-17806 bezeichnet wird) ist eine Variante der Art Lactobacillus paracasei subsp. paracasei. Er besitzt die Merkmale der Art mit einem GC-Gehalt von 44 %. LMG P-17806 ist aus Proben der gastrointestinalen Mikroflora von Menschen isoliert worden. LMG P-17806 ist ein grampositives, homofermentatives, stäbchenförmiges Bakterium. Es produziert L-Milchsäure (linksdrehendes Stereoisomer der Milchsäure) und wächst optimal bei 37°C. Der Stamm ist dadurch gekennzeichnet, dass er in vitro gegen Chlorwasserstoffsäure und Magensaft resistent ist, Gallensalze toleriert, ohne sie zu dekonjugieren, und dadurch, dass er eine große Fähigkeit besitzt, Cholesterol zu assimilieren. Der Stamm ist auch dadurch gekennzeichnet, dass er drei Plasmide mit einer Größe von 2,2, 4,36 bzw. 9,1 kb enthält. Andere Merkmale sind, dass der Stamm Ribose, Adonit, Galactose, Glucose, Fructose, Mannose, Sorbose, Mannit, Sorbit, N-Acetylglucosamin, Aesculin, Cellobiose, Maltose, Lactose, Saccharose, Trehalose, Inulin, Melezitose, D-Turanose und D-Tagatose fermentiert. Andererseits fermentiert er nicht Glycerol, Erythrit, D- und L-Arabinose, D- und L-Xylose, β-Methyl-D-xylosid, Rhamnose, Dulcit, Inosit, α-Methyl-D-mannosid, α-Methyl-D-glucosid, Amygdalin, Arbutin, Salicin, Melibiose, Raffinose, Stärke, Glycogen, Xylit, Gentiobiose, D-Lyxose, D- und L-Fucose, D- und L-Arabit und 2- und 5-Ketogluconat.
Der Stamm ist durch SDS-Gelelektrophorese charakterisiert worden, bei der er mit sechs anderen Stämmen von Lactobacillus paracasei subsp. paracasei verglichen worden ist. Bei diesem Vergleich ist gezeigt worden, dass er sich von allen anderen beschriebenen Stämmen unterscheidet und er gleichzeitig, verglichen mit anderen Lactobacillen, der bezeichneten Art anzugehören scheint. Er ist außerdem in einem sogenannten Riboprinter^® hinsichtlich der ribosomalen RNA charakterisiert worden. Mit diesem Verfahren ist gezeigt worden, dass der Stamm 76 % Ähnlichkeit mit dem Typstamm von Lactobacillus paracasei subsp. paracasei und 72 % Ähnlichkeit mit dem bei der gleichen Gelegenheit analysierten Typstamm von Lactobacillus casei aufweist.
Der Stamm ist bei der "Belgian Coordinated Collections of Microorganisms" – BCCM, LMG-Sammlung hinterlegt worden, wo ihm die Hinterlegungsnr. LMG P-17806 zugeteilt worden ist.
Die Vorteile des Stammes
Aufgrund einer einzigartigen Kombination positiver Eigenschaften hat LMG P-17806, verglichen mit bekannten Lactobacillus-Stämmen, entscheidende Vorteile bei der Verwendung als Probiotikum in Nahrungsmitteln und naturopathischen Arzneimitteln;

– der Stamm hat eine gute Resistenz gegen Magensaft und Gallensalze, aber im Gegensatz zu vielen anderen Stämmen dekonjugiert er die Gallensalze nicht;
– er besitzt eine große Fähigkeit, Cholesterol zu assimilieren;
– der Stamm bewältigt gut die Passage durch den Magen;
– der Stamm beeinflusst die Bedingungen im Dickdarmmodell, indem er die Produktion von L-Milchsäure in diesem erhöht;
– der Stamm ist nicht stärker proinflammatorisch als gewöhnliche Joghurtbakterien;
– der Stamm bewahrt Darmzellen vor dem Eindringen von pathogenen Mikroorganismen, wie Salmonella typhimurium;
– der Stamm hat eine antagonistische Wirkung gegen das Magengeschwür-Bakterium Helicobacter pylori;
– der Stamm bildet Bakteriozide, die gegen Clostridien wirken;
– der Stamm überlebt gut in Milch, ebenso wie in gefrorener und getrockneter Form;
– der Stamm hat, im Gegensatz zu den meisten anderen Lactobacillen, eine günstige Wirkung auf den Geschmack von fermentierten Milchprodukten (verleiht keinen schlechten Geschmack).

Der vorliegende Stamm von Lactobacillus paracasei subsp. paracasei kann als Lebensmittelzusatzstoff oder als naturopathisches Arzneimittel, sogenanntes "medical food", oder als Zusatzstoff für naturopathische Arzneimittel verwendet werden.
Derartige Arzneimittel können für Kinder zum Zweck der Milderung von atopischen Problemen; für ältere Personen zur Korrektur einer geänderten Mikroflora, die durch normale Altersveränderungen oder durch eine geänderte Chlorwasserstoffsäure-Sekretion verursacht wird; und für Personen allgemein verwendet werden, um die Intestinalflora zu normalisieren, wobei der Gehalt an Clostridium-Bakterien abnimmt, an Lactobacillen und Bifidobakterien zunimmt und hohe Gehalte an coliformen Bakterien abnehmen.
Durch diese Eigenschaften unterscheidet sich der Stamm LMG P-17806 von bisher bekannten Stämmen, was in den nachstehenden Beispielen gezeigt wird.
Herstellung des Stammes
Der Stamm wird auf die für Lactobacillen übliche Art hergestellt. Es wird ein für Lactobacillen geeignetes Substrat verwendet. Dieses Substrat sollte zum Beispiel mindestens eines der Kohlenhydrate, das der Stamm gemäß dem oben Genannten fermentieren kann, in Kombination mit Proteinen, Vitaminen, Mineralstoffen und anderen Nährstoffen, die normalerweise von Lactobacillen benötigt werden, enthalten. Beispiele für geeignete handelsübliche Substrate sind Hefeextrakt-Glucose-Bouillon, MRS (de Man-Rogosa-Sharp-Bouillon), Rogosa, mit einer geringen Menge eines Hefeextraktes angereicherte Milch, usw. Der Stamm wird mikroaerophil oder unter völliger Abwesenheit von Sauerstoff bevorzugt bei einer Temperatur zwischen +15°C und +42°C kultiviert. Wenn das Substrat mit 0,1 bis 1 % Inokulum versehen ist, ist eine Kulturdauer zwischen 10 und 40 Stunden angemessen. Der Stamm kann, wenn gewünscht, durch Zentrifugation oder Filtration konzentriert werden, wonach das Konzentrat gewaschen wird, um das Kulturmedium zu entfernen. Das Konzentrat kann dann auf die übliche Art eingefroren oder lyophilisiert werden. Auf diese Weise können Präparate mit zwischen 100 Millionen und 100,000 Millionen lebenden LMG P-17806-Bakterien pro g hergestellt werden. Ein Präparat kann dann als solches verwendet werden oder als Lebensmittelzusatzstoff verwendet werden, zum Beispiel für Milch oder ein anderes Produkt, das LMG P-17806 die Möglichkeit zum Überleben und, wenn gewünscht, zum Wachsen bietet.
Untersuchungen
A. Untersuchung zur Passage des Stammes durch den Gastrointestinaltrakt
LMG P-17806 wurde auf die oben beschriebene Art kultiviert und zusammen mit Joghurtkultur Milch zugesetzt. Ein fermentiertes Produkt wurde hergestellt, indem die Milch fünf Stunden bei +42°C inkubiert wurde. Es wurde ein genießbares Produkt erhalten, das ganze 100 Millionen lebende LMG P-17806 pro Gramm Produkt enthielt. Gesunden Personen wurde eine Woche lang täglich 3 × 200 g Produkt gegeben. Die Gesamteinnahme von LMG P-17806 betrug zwischen 40 Milliarden und 200 Milliarden.
Stuhlproben wurden vor der Einnahme, nach einer Woche Verzehr und eine Woche nach Beendigung der Einnahme untersucht. Wie aus den nachstehenden Tabellen 1 und 2 hervorgeht, wurde ein starker Anstieg der Zahl an Lactobacillen bei den Testpersonen erzielt. Zu jedem Zeitpunkt wurden zwei Isolate pro Testperson hinsichtlich der Art klassifiziert, d. h. 20 Isolate insgesamt. 18 der Isolate zur Verzehrszeit erwiesen sich als aus LMG P-17806 gemäß der phänotypischen Klassifizierung bestehend. Dieser Bakterienstamm wurde vor und nach der Einnahme von LMG P-17806 nicht in den Proben gefunden.
Die Gehalte der Stuhlproben während der Zufuhr waren durchschnittlich sehr hoch und schwankten nur leicht zwischen 63 Millionen und 320 Millionen pro Gramm, d. h. um einen Faktor von 5. Es war zu bemerken, dass die Gehalte weitgehend die gleichen waren, unabhängig davon, welche Gehalte vor Beginn des Experiments gemessen wurden. Nach Beendigung der Zufuhr kehrten die Gehalte zu dem Wert zurück, der für die betreffende Testperson als normal erscheint.
In den nachstehenden Tabellen 1 und 2 wurde durch Plattieren und unter Verwendung des Substrates Rogosa der Gehalt an Lactobacillus im Stuhl in Millionen pro Gramm bestimmt.
Tabelle 1 5 Testpersonen mit ursprünglich geringen Lactobacillusgehalten
Tabelle 2 5 Testpersonen mit hohen Lactobaciliusgehalten
Die Untersuchung zeigt, dass der Stamm bei der Passage durch den Gastrointestinaltrakt ein gutes Überleben aufweist.
B. Untersuchung zur Bildung von L-Milchsäure durch den Stamm in einem Dickdarmmodell
Das oben genannte fermentierte Produkt wurde in einen sogenannten SHIME-Reaktor gegeben, der ein in-vitro-Modell des Darms ist. Proben werden dem Teil des Reaktors entnommen, der den bedeutendsten Teilen des Dickdarms entspricht. Ähnliche Vergleichstests wurden mit einigen anderen Lactobacillus-Stämmen, u. a. einem nahe verwandten L. paracasei subsp. paracasei, durchgeführt. Wie aus der nachfolgenden Tabelle 3 hervorgeht, bewirkt LMG P-17806 einen starken Anstieg der Produktion von L-Milchsäure, welche das von LMG P-17806 gebildete Isomer der Milchsäure ist. Eine Milchsäureproduktion wird aus mehreren Gründen als günstig angesehen, u. a. in Anbetracht der antibakteriellen Wirkung von Milchsäure sowie der Tatsache, dass ein niedriger pH die Verfügbarkeit und Bildung von Stickstoffverbindungen reduzieren soll.
Tabelle 3 Produktion von L- und D-Milchsäure in einem SHIME-Reaktor nach der Zugabe verschiedener Milchsäurebakterien in mg pro Liter Reaktorinhalt

In der Tabelle bezieht sich "L" auf das linksdrehende Isomer der Milchsäure und "D" auf das rechtsdrehende Isomer.

Der Reaktor 4 entspricht dem oberen Teil des Dickdarms, der Reaktor 5 dem mittleren Teil und Reaktor 6 dem unteren Teil des Dickdarms. Die Untersuchung zeigt, dass der Stamm im Dickdarmmodell L-Milchsäure bildet.
C. Untersuchung darüber, wie der Stamm die Darmepithelzellen vor dem Eindringen von Salmonella typhimurium schützt
Darmepithelzellen vom Typ CaCo-2 wurden in vitro kultiviert. Diese wurden zu einer Mischung von Lactobacillen und Salmonella typhimurium im Verhältnis 100:1 mit der Zugabe von 1 Million Salmonella pro ml gegeben. Die Wirkung wurde nach einer Inkubation von 120 min bei 37°C untersucht. Die Menge an eindringenden Salmonella wurde bestimmt, indem die Platten mit den adhärierenden CaCo-2-Zellen dreimal gewaschen wurden. Die adhärierenden Zellen wurden eine Stunde mit dem Antibiotikum Gentamycin in einer Konzentration von 100 mg/l behandelt, um alle Bakterien zu töten, die nicht in Zellen eingedrungen waren. Dann wurden die Platten mit PBS gewaschen, um alles Gentamycin zu entfernen, und schließlich wurden die gefangenen Bakterien freigesetzt, indem die CaCo-2-Zellen unter Schütteln mit 0,1 % Triton-X behandelt wurden. Die Anzahl an Salmonella wurde dann mit der üblichen Plattier-Methode bestimmt. LMG P-17806 hatte eine deutliche Wirkung, da er die Anzahl an befallenen Zellen reduzierte. Dagegen scheint die nahe verwandte paracasei- Variante 506 das Eindringen von Salmonella-Bakterien eher zu stimulieren. LMG P-17806 zeigte auch hinsichtlich dieser Eigenschaft eine positive Wirkung. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 4 mitgeteilt.
Tabelle 4 Eindringen von Salmonella
Die Tabelle zeigt, dass der Stamm LMG P-17806 einen deutlichen Schutz vor dem Eindringen von Salmonella-Bakterien bietet.
D. Untersuchung des Schutzes vor Helicobacter pylori
In einem Mausmodell, in dem die Mäuse mit Helicobacter pylori infiziert wurden, wurde die Wirkung der Zufuhr eines fermentierten Milchprodukts einerseits mit einem LMG P-17806-Stamm und andererseits ohne diesen Stamm auf den gemessenen Gehalt an H. pylori im Stuhl untersucht.
Die Mäuse wurden zu drei Zeitpunkten im Abstand von einem Tag mit 100 Millionen des Stammes H. pylori 17874 in helikaler Form infiziert. Den Mäusen wurden dann Versuchsprodukte verabreicht, und der Gehalt an H. pylori im Stuhl wurde mittels heparinisierter Magnetkugeln und Enzym-Immunassay gemessen. Drei Produkte wurden untersucht. Es zeigte sich, dass alle fermentierten Milchprodukte den Anteil an H. pylori reduzierten, jedoch trat die Wirkung wesentlich schneller in den Fällen ein, in denen das Produkt LMG P-17806 enthielt, im Vergleich zu gewöhnlichem Joghurt beziehungsweise in Vergleich zu einem Stamm von L. fermentum KLD.
Tabelle 5 Gehalt von H. pylori im Stuhl, gemessen mittels heparinisierter Magnetkugeln und Enzym-Immunassay
Die Angaben in der Tabelle stellen die Extinktion bei 405 nm dar und sind relative Gehalte.
E. Untersuchung der Wirkung des Stammes LMG P-17806 auf die Immunabwehr
Das Immunabwehrsystem wird durch eine Reihe von Signalsubstanzen, sogenannten Cytokinen, kontrolliert. Einige davon können proinflammatorisch wirken. Die Wirkung von LMG P-17806 auf die Produktion der Cytokine TNF-alpha und IL-6 wurde mit der Wirkung der beiden in einer Joghurtkultur enthaltenen Arten L. delbruckei subsp. bulgaricus und Streptococcus thermophilus verglichen. Leukozyten wurden von menschlichem Blut abgetrennt und in einer Menge von 10 Millionen Leukozyten zu lebenden Bakterien oder zu mit Glutaraldehyd abgetöteten Bakterien gegeben. Als Kontrolle wurden Lipopolysaccharide (LPS) aus E. coli verwendet. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 6 mitgeteilt. Die Ergebnisse zeigen, dass LMG P-17806 in dem verwendeten Modell die gleichen inflammatorischen Eigenschaften hat wie eine gewöhnliche Joghurtkultur.
Tabelle 6 Die Wirkung des Stammes LMG P-17806 auf die Immunabwehr
F. Untersuchung der Resistenz des Stammes LMG P-17806 gegen Antibiotika
Probiotika können für die Verwendung in Zusammenhang mit Störungen des Gleichgewichts der Darmflora während der Behandlung mit Antibiotika von Nutzen sein. Gleichzeitig ist es wichtig, dass Probiotika nicht zur Verbreitung der Antibiotikaresistenz beitragen, und dies ist besonders bei der heutigen Verwendung von Probiotika und Antibiotika wichtig. Deshalb wurde die Resistenz des Stammes LMG P-17806 gegen verschiedene Antibiotika ermittelt. Die Empfindlichkeit des Stammes LMG P-17806 für verschiedene Antibiotika wurde bestimmt, indem der Gehalt ermittelt wurde, bei dem eine Abnahme der Vermehrung des Stammes um 50 %, gemessen als optische Dichte, erzielt wurde.
Es zeigte sich, dass der Stamm LMG P-17806 gegen Vancomycin resistent war und selbst bei 256 mg/l nicht inhibiert wurde. Der Stamm zeigte eine leichte Resistenz gegen Trimethoprim und Cefotaxim, wobei eine optische Dichte (OD) von 50 % bei 12 beziehungsweise 4 mg/l erhalten wurde. Der Stamm LMG P-17806 reagierte andererseits empfindlich auf Chloramphenicol, Erythromycin, Rifampicin und Tetracyclin, wo bereits Konzentrationen unter 1 mg/l zu einer Hemmung der Vermehrung um 50 % führten.
Die Wirkung von Antibiotika wurde auch in einer Reihenuntersuchung unter Verwendung sogenannter Sensi-Disc-Testblättchen von Oxoid untersucht. Nach diesen Ergebnissen war LMG P-17806 gegen Aztreonam, Ceftaximid, Cefoxitin, Colistinsulfat, Kanamycin, Polymyxin B, Streptomycin und Vancomycin resistent.
Nach diesen Ergebnissen kann also LMG P-17806 von besonderer Bedeutung für die Verwendung zur gleichen Zeit wie eine Therapie mit Antibiotika, wie zum Beispiel Vancomycin, Trimethoprim sowie einigen Cefloxacinen sein, die alle Antibiotika mit bekannten Nebenwirkungen auf die Darmflora und die Darmfunktion sind.
DIE VERWENDUNG DES STAMMES LMG P-17806
Beispiel 1 Herstellung von Bakterienkonzentrat
Ein gefrorenes Bakterienkonzentrat mit 10 Milliarden LMG P-17806 pro Gramm wurde auf die oben genannte Art hergestellt, indem die Lactobacillen in einem Molkesubstrat mit 1 g Hefeextrakt pro Liter bei einem konstantem pH von 5,5 14 Stunden bei 36°C kultiviert wurden. Die Bakterien wurden durch Zentrifugation mit kontinuierlichem Waschen des Zentrifugats abgetrennt. Das Zentrifugat wurde in flüssigem Stickstoff eingefroren und dann bis zum Gebrauch bei –80°C gelagert.
Beispiel 2 Herstellung von fermentiertem Milchprodukt
Aus Milch wurde eine Produktmilch hergestellt, indem die Milch homogenisiert, fünf Minuten bei +95°C wärmebehandelt und auf +37°C temperiert wurde. Die Produktmilch wurde mit 0,01 % einer handelsüblichen, gefrorenen Joghurtkultur und 0,5 % des LMG P-17806-Konzentrates versetzt. Die Kulturen wurden sechs Stunden bei der angegebenen Temperatur wachsen gelassen. Die Milch war dann geronnen und der pH auf 4,55 gesunken. Die geronnene Form wurde zerbrochen, und das Produkt wurde auf +12°C abgekühlt, woraufhin es in gewöhnliche Plastikbecher, die normalerweise für Joghurt verwendet werden, abgepackt wurde und in einem Kühlraum mit einer Temperatur von +5°C einen Tag und eine Nacht nachgekühlt wurde. Der pH war dann auf 4,4 gesunken. Das Produkt wurde dann bis zu drei Wochen bei +8°C gelagert.
Der Gehalt an dem Stamm LMG P-17806 wurde kontrolliert, und wie aus den Ergebnissen in der nachstehenden Tabelle 7 hervorgeht, war während der Kultur eine begrenzte Vermehrung des Stammes LMG P-17806 zu verzeichnen und LMG P-17806 überlebte eine dreiwöchige Lagerung bei einem pH unter 4,4 sehr gut.
Tabelle 7 Lagerfähigkeit des Stammes LMG P-17806 in Milchprodukten
Die Gehalte sind in Millionen pro Gramm angegeben.
Das Produkt hatte ein normales Aussehen bei einer Molkeabtrennung von knapp 1 % nach einer vierzehntägigen Lagerung. Das Produkt schmeckte ausgezeichnet und hatte eine einheitliche Beschaffenheit und einen frischen, milden Geschmack. In einer von einem Forschungsinstitut durchgeführten unabhängigen Verbraucherumfrage erhielt das Testprodukt bessere Beurteilungen als normaler Joghurt. Das Produkt wurde in einer Verbraucherumfrage, bei der die Testpersonen nicht wussten, welches Produkt probiert wurde, mit einem entsprechenden Produkt ohne den Stamm LMG P-17806 verglichen. Das Produkt mit LMG P-17806 wurde von 74 % der Personen der Testgruppe bevorzugt und es erhielt eine durchschnittliche Wertung von 7,6 auf einer Skala von 9 Punkten, was bedeutend höher liegt als das Ergebnis für gewöhnlichen Joghurt. Die Beurteilung war etwas über 1 Punkt höher als für eine zuvor bekannte probiotische Kultur mit Lactobacillus acidophilus. Die Ergebnisse weichen auch von denen ab, die zuvor beim Vergleich von purem Joghurt mit gemischten Produkten aus Joghurt und den probiotischen Bakterien Lactobacillus acidophilus beziehungsweise Bifidobacterium longum erhalten wurden. Bei diesen Vergleichen konnten keine wesentlichen Unterschiede zwischen purem Joghurt und dem entsprechenden gemischten Produkt festgestellt werden.
Beispiel 3 Geeignete Zugabe des Stammes LMG P-17806
Es wurden auch Versuche durchgeführt, um den geeigneten Bereich für die Zugabe des Stammes LMG P-17806 zu ermitteln. Milch wurde wie vorstehend behandelt und dann Joghurtkultur zugegeben, wobei die Zugabe von Konzentrat des Stammes LMG P-17806 von 5 % bis 0,01 % variiert wurde. Bei einem so hohen Gehalt wie 5 % LMG P-17806-Zusatz wurde ein schlechter Geschmack erhalten, der vermutlich von Bestandteilen des Zusatzes selbst stammte. Die pH-Änderung war jedoch normal, und das Aussehen des Produkts war normal. Der Gehalt an LMG P-17806 in frischem Produkt betrug 504 Millionen pro Gramm und die Gehalte blieben während der Lagerung auf dieser Höhe. Bei der Zugabe von 0,01 % LMG P-17806-Konzentrat konnte das Produkt sensorisch nicht von gewöhnlichem Joghurt unterschieden werden und der Gehalt an LMG P-17806 betrug bereits nach einer Woche unter einer Million pro ml, was dem niedrigsten Gehalt entspricht, den ein Produkt enthalten muss, damit es gemäß den Richtlinien für eine internationale Gesetzgebung als ein spezifisches Probiotikum enthaltendes Produkt bezeichnet werden darf.
Beispiel 4 Herstellung von fermentiertem Spezialprodukt
Der Versuch wurde wie oben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass der Milch außerdem 0,4 g Hefeextrakt pro Liter zugegeben wurde. Die Veredelung erfolgte mit 0,01 % der gleichen Joghurtkultur wie oben, aber es wurden nur 0,1 % LMG P-17806-Konzentrat zugegeben. Es wurde eine Inkubation von 8 Stunden bei +34°C durchgeführt, wonach der Vorgang abgebrochen wurde und das Produkt wie im obigen Beispiel 3 gekühlt, abgepackt und gelagert wurde. Unter diesen Bedingungen vermehrte sich LMG P-17806 um das Zehnfache, und ähnlich wie oben überlebten die Bakterien die Lagerung gut. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle mitgeteilt.
Tabelle 8 Lagerfähigkeit des spezifischen Milchproduktes des Stammes LMG P-17806
Die Gehalte in der Tabelle sind in Millionen pro Gramm Produkt angegeben.
Das Produkt hatte ein normales Aussehen mit einer Molkeabtrennung von 1,5 % nach vierzehntägiger Lagerung. Das Produkt hatte einen guten, trockenen Geschmack und eine homogene Beschaffenheit.
Beispiel 5 Herstellung von Gemüsesaft, der den Stamm LMG P-17806 enthält
Ein Gemüsesaft wurde hergestellt, indem Karottenkonzentrat und ein Orangensaftkonzentrat in gleichen Teilen gemischt wurden, so dass der pH der fertigen Mischung 3,9 betrug. Das gemischte Getränk wurde wärmebehandelt und mit 1 % beziehungsweise 0,1 % LMG P-17806-Konzentrat versetzt. Der Gehalt an LMG P-17806 betrug dann 100 beziehungsweise 10 Millionen pro ml. Die Getränke wurden vier Wochen bei +7°C gelagert. Der Geschmack des Produkts war nicht beeinträchtigt und es wurden keine Auswirkungen durch die Lagerung oder Zugabe von LMG P-17806 beobachtet. Jedoch schien die Zugabe von LMG P-17806 mit einem Gehalt von über 50 Millionen die Abnahme von Vitamin C zu reduzieren. In einem Produkt ohne LMG P-17806 fällt wie in dem Produkt mit 10 Millionen Bakterien pro ml der Vitamin C-Gehalt von 25 mg/100 g vor der Lagerung auf 18 mg/100 g nach vier Wochen. Bei der Zugabe von 100 Millionen LMG P-17806 pro ml fällt der Vitamin C-Gehalt nur auf 22 mg/100 g, d. h. eine über 50 % geringere Abnahme des Vitamin C-Gehalts. LMG P-17806 überlebte gut, und der LMG P-17806-Gehalt nach vier Wochen war nur ungefähr 40 % geringer als in frischem Produkt, unabhängig von der zugegebenen Menge.
In einem anderen Versuch wurde das gleiche Fruchtgetränk mit 5 % LMG P-17806 versetzt. Dies ergab einen schlechten Geschmack, der sich während der Lagerungszeit verschlimmerte.
Beispiel 6 Herstellung von Breipulver
Breipulver wird auf die übliche Art hergestellt. LMG P-17806-Konzentrat gemäß dem Vorstehenden wird nach Mischen mit Maisstärke lyophilisiert und nach Verpacken in einer sauerstoffundurchlässigen Verpackung bei einer Temperatur von –20°C gelagert. Das lyophilisierte Präparat enthielt 61 Milliarden LMG P-17806 pro Gramm. Das Breipulver wurde trocken mit 0,03 % LMG P-17806 gemischt und in Stickstoff Atmosphäre in einer sauerstoffundurchlässigen Verpackung verpackt. Das Pulver wurde zunächst drei Monate bei +12°C und dann weitere vier Monate bei Raumtemperatur gelagert. Der LMG P-17806-Gehalt geht aus der nachstehenden Tabelle 9 hervor. Das Breipulver bot dem LMG P-17806 gute Überlebensmöglichkeiten, und es ist deshalb möglich, zum Beispiel Babynahrungsprodukte mit einem hohen Gehalt an LMG P-17806 herzustellen.
Tabelle 9
Die Gehalte in der obigen Tabelle sind in Millionen pro Gramm Pulver angegeben.
Das Breipulver wurde in 9 Teilen Wasser von +50°C gelöst und der Gehalt an LMG P-17806 wurde bestimmt. Der Gehalt betrug 1 Million LMG P-17806 pro ml Getränk für den Fall, dass sechs Monate altes Pulver verwendet wurde. Der Brei konnte nicht von gewöhnlichem Produkt unterschieden werden. Nach Lagerung für eine Nacht bei Raumtemperatur schmeckte der Brei mit LMG P-17806 jedoch leicht sauer und hatte einen pH von 5,7.
In einem zweiten Versuch wurde die Wirkung der Zugabe von 1 % beziehungsweise 0,001 % eines lyophilisierten LMG P-17806-Präparates untersucht. Dessen Gehalte in dem Breipulver nach der Zugabe betrugen 570 beziehungsweise 0,8 Millionen pro Gramm.
Die Pulver wurden entsprechend gelagert und nach 5 Monaten Lagerung untersucht. Nach Lösen wie oben betrug der Gehalt in dem hergestellten Brei 800 Millionen beziehungsweise unter 10.000 pro ml bei dem geringen Zusatz. Bei dem hohen Zusatz wurde bereits nach vierstündiger Lagerung des Breies bei Körpertemperatur ein leicht saurer Geschmack festgestellt.
Beispiel 7 Herstellung von getrocknetem Pulver zur Verwendung als "medical food"
Ein lyophilisiertes LMG P-17806-Konzentrat wurde mit unterschiedlichen Mengen Maisstärke in den Verhältnissen 1:1, 1:9, 1:99 beziehungsweise 1:999 gemischt. Die gemischten Pulver wurden in kleinen Beuteln mit 1 bis 100 g pro Beutel aufbewahrt. Das Material der Beutel war für Sauerstoff und Wasserdampf undurchlässig. Die Beutel wurden im Gefrierschrank, Kühlschrank beziehungsweise bei Raumtemperatur gelagert. Der Inhalt wurde dann als Getränkezusatz verwendet, indem das Pulver vor dem Genuss des Getränks mit dem Getränk vermischt wurde. Das entsprechende Überleben wurde wie im obigen Beispiel 6 erhalten. Das Pulver mit dem Verhältnis 1:1 wurde außerdem in Gelatinekapseln mit 0,4 g pro Kapsel abgepackt. Die Anzahl an Bakterien pro Kapsel betrug 10 Milliarden. Die Kapseln wurden in Blisterverpackungen aus einem Material mit guten Barriereeigenschaften gegen Sauerstoff und Wasserdampf abgepackt. Die Kapseln wurden auf die gleiche Art wie oben gelagert, und es wurden entsprechend gute Überlebensergebnisse erzielt.
Beispiel 8 Herstellung und Verwendung von Bakterienmischungen
LMG P-17806 kann mit anderen Lactobacillen gemischt werden, ohne diese zu hemmen. LMG P-17806 scheint keine Substanzen zu bilden, die andere Lactobacillen oder Lactococci hemmen, wenn LMG P-17806 mit Joghurtkulturen, Sauermilchkulturen mit Lactococci oder anderen Lactobacillus-Arten, wie L. acidophilus, L. fermentum oder L. rhamnosus, cokultiviert wird. Versuche mit Mischungen lyophilisierter Präparate, die alle diese Bakterien enthielten, haben unveränderte Lagerungseigenschaften gezeigt, unabhängig davon, ob das Mischen mit Maisstärke oder mit Breipulver erfolgte. Nach Auflösen des Breipulvers und einer Lagerung von 12 Stunden bei Körpertemperatur und 12 Stunden bei Raumtemperatur konnte weder eine negative Auswirkung von LMG P-17806 auf den Gesamtgehalt an Lactobacillen noch auf den Gehalt eines der Bakterien festgestellt werden.
In einem Versuch zur Herstellung von probiotischer Sauermilch wurden 0,5 % Sauermilchkultur und jeweils 0,6 % lyophilisiertes Konzentrat von L. acidophilus NCFB 1748, L. fermentum KLD und LMG P-17806 zu normal behandelter Produktmilch gegeben. Es wurden jedoch nur 0,1 % KLD zugegeben, da höhere Zugaben zu schlechtem Geschmack und zu einem schlechten Koagulat führten. Die Milch wurde 19 Stunden bei Raumtemperatur gelagert. Ihr pH betrug dann 4,50. Die Milch wurde auf +10°C abgekühlt, abgepackt und bei +6°C bis zu 14 Tagen gelagert. Die Ergebnisse gehen aus der nachfolgenden Tabelle hervor.
Tabelle 10
Die Gehalte sind in Millionen pro ml der verschiedenen Bakterien angegeben.
80 gesunden Testpersonen wurden in Verbindung mit einer Konferenzreise nach Istanbul in der Türkei die Produkte zu essen gegeben. Die Gruppe wurde zweigeteilt, wobei die eine Gruppe Sauermilch entsprechend der obigen aß, die nur LMG P-17806 enthielt, während die andere die probiotische Sauermilch mit drei verschiedenen probiotischen Stämmen aß. Die Testpersonen waren 8 Tage am Konferenzort. Sie begannen, die Produkte zwei Tage vor der Abreise an den Konferenzort zu essen und aßen sie bis vier Tage nach ihrer Rückkehr. Die Produkte wurden als 3 Zwischenmahlzeiten gleichmäßig über den Tag verteilt mit 150 g/Mahlzeit gegessen. Alle Testpersonen mit Ausnahme von 2 Personen aus der Sauermilchgruppe gaben an, das Produkt gemäß dem Plan gegessen zu haben. Sie wurden in einer Befragung aufgefordert, Magen-Darm-Beschwerden in Form von Bauchschmerzen, Spannungen, Durchfall oder Verstopfung nach einer dreistufigen Skala anzugeben. Abgesehen von Durchfall bestand ein Unterschied darin, dass 5 % der Testpersonen, die nur LMG P-17806 gegessen hatten, angegeben haben, dass sie mindestens zwei Tage lang starken oder sehr starken Durchfall hatten, wogegen die Häufigkeit hierfür in der Gruppe, welche die probiotische Sauermilch aß, nur 22 % betrug.
Es scheint somit, als könnte eine Mischung aus mehreren verschiedenen Lactobacillen noch wirksamer sein als nur ein einziger Bakterienstamm. Dies kann auf die Tatsache zurückzuführen sein, dass die verabreichten Lactobacillen unterschiedliche Eigenschaften besaßen.

Claims

Lactobacillus-Stamm, bei dem es sich um ein gram-positives, homofermentatives, stäbchenförmiges Bakterium handelt, das L-Milchsäure produzieren kann, als Probiotikum in Nahrungsmitteln und naturopathischen Arzneimitteln nützlich ist und das in vitro gegen Chlorwasserstoffsäure und Magensäfte resistent ist und Gallensalze toleriert, ohne sie zu dekonjugieren, während eine starke Assimilation derselben stattfindet, eine große Fähigkeit besitzt, Cholesterol zu assimilieren, und das ein gutes Überleben bei der Passage durch den Magen und den Gastrointestinaltrakt aufweist und bei dem es sich um einen Stamm handelt, der optimal bei etwa 37°C wächst, dadurch gekennzeichnet, dass der Stamm Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, LMG P-17806 ist und dass er drei Plasmide mit einer Größe von 2,2, 4,36 bzw. 9,1 kb enthält.
Stamm nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er 44 % GC enthält.
Stamm nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass er aus Proben der gastrointestinalen Mikroflora von Menschen isoliert worden ist.
Stamm nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Stamm Ribose, Adonit, Galactose, Glucose, Fructose, Mannose, Sorbose, Mannit, Sorbit, N-Acetylglucosamin, Aesculin, Cellobiose, Maltose, Lactose, Saccharose, Trehalose, Inulin, Melezitose, D-Turanose und D-Tagatose fermentiert.
Stamm nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass er als Konzentrat in Form von gefrorenem oder lyophilisiertem Pulver bereitgestellt wird.
Zusammensetzung eines Stamms nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche zur Verwendung in Nahrungsmitteln und/oder als naturopathische Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, dass der Stamm Lactobacillus paracasei subsp. paracasei zu einem Milchprodukt, einem fermentierten Milchprodukt, einem Frucht- oder Gemüsegetränk, wie Gemüsesaft, Zitrusfruchtsaft oder einem Saft einer anderen Frucht oder eines anderen Gemüses, mit einem Gehalt von zwischen 0,001 % und 5 % gegeben wird.
Zusammensetzung eines Stamms nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche zur Verwendung in Nahrungsmitteln und/oder als naturopathische Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, dass der Stamm Lactobacillus paracasei subsp. paracasei zu einem Milchprodukt, einem fermentierten Milchprodukt, einem Frucht- oder Gemüsegetränk, wie Gemüsesaft, Citrusfruchtsaft oder einem Saft einer anderen Frucht oder eines anderen Gemüses, mit einem Gehalt von zwischen 0,01 % und 1 % gegeben wird.
Zusammensetzung eines Stamms nach irgendeinem der Ansprüche 1–4 zur Verwendung als Probiotikum in Nahrungsmitteln und/oder naturopathischen Arzneimitteln, dadurch gekennzeichnet, dass der Stamm Lactobacillus paracasei subsp. paracasei gemäß der Erfindung mit Jogurt-Kulturen und Sauermilch-Kulturen mit Lactococci oder anderen Lactobacillus-Arten, wie L. acidophilus, L. fermentum oder L. rhamnosus, cokultiviert wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Stamm Lactobacillus paracasei subsp. paracasei gemäß der Erfindung mit einem Gehalt zwischen 1 Million und 10.000 Millionen Lebendbakterien pro Gramm Zusammensetzungsprodukt vorliegt.
Produkt, das den Stamm Lactobacillus paracasei subsp. paracasei nach irgendeinem der Ansprüche 1–4 enthält, dadurch gekennzeichnet, dass das Produkt besteht aus einem Milchprodukt, einem fermentierten Milchprodukt, einem Gemüse- oder Fruchtgetränk oder Breipulver, die alle den Stamm Lactobacillus paracasei subsp. paracasei mit einem Gehalt von 5 × 10⁵ – 5 × 10⁹, gewöhnlich 1 × 10⁵ – 10⁹ Lebendbakterien, entsprechend 0,0005–0,5 % des Produkts, enthalten; oder einem konzentrierten naturopathischen Arzneimittel, in dem der Stamm Lactobacillus paracasei subsp. paracasei mit einem Gehalt von 1.000–100.000 Millionen lebende Bakterien, entsprechend 0,001–100 % des Produkts, vorliegt.
Produkt nach Anspruch 10, das den angegebenen Gehalt an Bakterien enthält, dadurch gekennzeichnet, dass im Fall von Nahrungsmittelprodukten es weiter einen geringen Anteil, z. B. 0,001–0,1 %, an Hefeextrakt oder anderen Substanzen enthält, die zur Vermehrung oder dem Überleben von Lactobacillus paracasei subsp. paracasei in dem Produkt beitragen, und dass es im Fall von naturopathischen Arzneimitteln Substanzen enthält, die für das Überleben der Bakterien von Bedeutung sind, und/oder Reste des Kultursubstrats enthält.
Produkt nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Stamm Lactobacillus paracasei subsp. paracasei als Konzentrat in gefrorenem oder lyophilisiertem Zustand zum Einmischen in direkter Verbindung mit dem Anlass des Verzehrs in ein Milchprodukt, ein fermentiertes Milchprodukt, ein Gemüse- oder Fruchtgetränk, ein Breipulver oder in ein konzentriertes naturopathisches Arzneimittel bereitgestellt wird.
Produkt, das einen Stamm von Lactobacillus paracasei subsp. paracasei nach irgendeinem der Ansprüche 1–5 enthält, dadurch gekennzeichnet, dass es für Kinder für den Zweck der Milderung von atopischen Problemen; für ältere Personen zur Korrektur einer geänderten Mikroflora, die durch normale Altersveränderungen oder durch eine geänderte Chlorwasserstoffsäure-Sekretion verursacht wird; und für Personen allgemein verwendet wird, um die Intestinalflora zu normalisieren, wobei in diesem Fall der Gehalt an Clostridia-Bakterien abnimmt, an Bifidobakterien zunimmt und hohe Gehalte an coliformen Bakterien abnehmen.