DE60016959T2 - Lactobacillus helveticus, welches blutdrucksenkende di- und tripeptide herstellt - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft einen neuen Mikroorganismus und dessen Verwendung. Genauer gesagt wird ein neuer Lactobacillus helveticus-Stamm, dessen physiologische Eigenschaften, sowie dessen Verwendung zum Beispiel in der Lebensmittelindustrie und in der pharmazeutischen Industrie beschrieben.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Band 2, ed. Sneath et al., Williams & Wilkins, Baltimore, London, Los Angeles, Sydney, 1984, Teil 14, Seiten 1208 und folgende, beschreibt unter dem Titel "Regular, Nonsporing Gram-Positive Rods" die Charakteristika und Klassifikation von Mikroorganismen, die zu der Gattung Lactobacillus gehören, sowie die Eigenschaften der Spezies Lactobacillus helveticus. Im Allgemeinen wurden Lactobacillus helveticus-Stämme aus Milchprodukten isoliert, wie zum Beispiel aus fermentierten Milchprodukten und Käse, und herkömmlicherweise wurden sie als Starter-Mikroben bei der Herstellung von Käse, insbesondere bei den Käsearten Emmentaler und Gruyère, verwendet.
  • Die biologischen Wirkungen der Lactobacillus helveticus-Stämme sind ebenfalls im Stand der Technik beschrieben. Die internationale Patentanmeldung WO99/16862, Yamamoto et al. beschreibt zum Beispiel den Stamm Lactobacillus helveticus CM4, FERM BP-6060, welcher in der Lage ist, eine große Menge des Tripeptids Val-Pro-Pro und/oder Ile-Pro-Pro herzustellen, und welcher eine hohe extrazelluläre Proteaseaktivität aufweist. Die Veröffentlichung beschreibt zudem fermentierte Milchprodukte, die die obenstehend genannten Tripeptide und das Bakterium enthalten, sowie ein Verfahren zur Herstellung derselben durch die Fermentation von Produkten, die die Tripeptidsequenzen mit dem Bakterium enthalten.
  • Das US-Patent 5,449,661, Nakamura et al. beschreibt die Herstellung eines Peptids, das die Tripeptidsequenz Val-Pro-Pro enthält, sowie dessen Verwendung zur Verminderung einer Hypertension. Das Peptid wird durch die Fermentation von fettfreier Milch mit dem Stamm Lactobacillus helveticus JCM 1004 hergestellt, und das Peptid wird danach chromatographisch gereinigt und gefriergetrocknet.
  • Auch Yamamoto et al. beschrieben die Reinigung und Charakterisierung einer aus dem Mikroorganismus Lactobacillus helveticus CP790 stammenden Proteinase (J. Biochem., 1993, 114:740). Überdies berichteten Yamamoto et al. von einer Untersuchung, in der αs1- und β-Casein mit der Proteinase hydrolysiert wurden und die erhaltenen Peptide auf ihre Inhibitorwirkung von ACE (J Dairy Sci, 1994, 77:917) untersucht wurden. Die Gesamtzahl der untersuchten Peptide betrug 25 und ihre Molekulargröße und ihre Wirkung waren sehr unterschiedlich. Am effizientesten waren drei Peptide, die aus β-Casein erhalten wurden und 8, 18, bzw. 27 Aminosäuren enthielten. Die Untersuchung verglich zudem die ACE-Aktivität der mit dem Lactobacillus helveticus-Stamm CP790 und dessen Variante CP791 fermentierten Milch mit fehlerhafter Proteinaseaktivität, wobei ersterer bei spontan hypertensiven SHR Ratten wirksam war, bei einem gewöhnlichen Rattenstamm jedoch nicht wirksam war, wohingegen letzterer gar keine Wirksamkeit aufwies.
  • Obwohl Milchsäurebakterien und auch die Spezies Lactobacillus helveticus weitgehend untersucht worden sind und sowohl für die Verwendung als herkömmlichen Starter als auch für die Verwendung als gesundheitsfördernde Substanz empfohlen wurden, besteht in diesem Bereich noch immer ein anhaltendes Bestreben neuere, effektive Mikroben zu finden, die sowohl als Starter als auch probiotische Stoffe in der Milchindustrie und in anderen Lebensmittelindustrien verwendbar sind, ebenso wie als natürliche Produkte und auch in der pharmazeutischen Industrie.
  • Beschreibung der Erfindung
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die zur Verfügung Stellung eines neuen Stammes von Lactobacillus helveticus mit ausgezeichneten proteolytischen und physiologischen Eigenschaften, der daher zur Verwendung als Starter und als gesundheitsfördernde Substanz gut geeignet ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird der Stamm den Konsumenten zur Verwendung als solcher oder bei der Herstellung von essbaren Lebensmitteln, funktionellen Produkten oder Pharmazeutika zur Verfügung gestellt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft daher Lactobacillus helveticus LBK-16 H, DSM 13137.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft zudem eine Bakterienpräparation, die den Lactobacillus helveticus-Stamm LBK-16 H, DSM 13137 umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung des Lactobacillus helveticus-Stammes LBK-16 H, DSM 13137 in der Lebensmittelindustrie oder der pharmazeutischen Industrie.
  • Ferner betrifft die vorliegende Erfindung essbare Produkte, wie zum Beispiel Nahrungsmittel und Pharmazeutika, die den obenstehend genannten Stamm enthalten.
  • Die Erfindung betrifft zudem den Lactobacillus helveticus-Stamm LBK-16 H, DSM 13137 für die Verwendung als therapeutische Substanz.
  • Die Erfindung betrifft ferner den Lactobacillus helveticus-Stamm LBK-16 H, DSM 13137 für die Verwendung bei der Behandlung von Hypertension.
  • Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung des Lactobacillus helveticus-Stammes LBK-16 H, DSM 13137 für die Herstellung von antihypertensiv wirkenden Produkten.
  • Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines antihypertensiv wirkenden Produktes, wobei das Verfahren den Lactobacillus helveticus-Stamm LBK-16 H, DSM 13137 verwendet.
  • Die Erfindung basiert auf einen neuen Lactobacillus helveticus-Stamm, LBK-16 H, der am 3. November 1999 bei der Hinterlegungsstelle Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) unter der Nummer DSM 13137 hinterlegt wurde, und der die folgenden Eigenschaften aufweist:
    Ein Lactobacillus helveticus-Stamm, der grampositiv ist und stäbchenförmige, lange Zellen aufweist. Die Wachstumstemperatur liegt im Bereich von etwa 35 bis 45°C, wobei die optimale Temperatur etwa 37 bis 42°C beträgt.
  • Lactobacillus helveticus LBK-16 H wächst gut in Milch bei einer Temperatur von 37 bis 42°C, wobei er 2,5 bis 2,9% Milchsäure (DL) produziert. Der optimale pH-Wert für das Wachstum liegt bei etwa 4,5 bis 7. Bei einer Kultivierung ohne eine Anpassung des pH-Wertes sinkt der pH-Wert in der Milch im Bereich von 3,3 bis 3,6.
  • Der Stamm wächst auch in für gewöhnlich für Lactobacilli verwendeten Medien gut, und kann auch Zitrat als eine Kohlenstoffquelle verwenden.
  • Lactobacillus helveticus LBK-16 H fermentiert Kohlenhydrate wie folgt:
    Kohlenhydrat L. helveticus LBK-16 H
    Glycerol –
    Erythritol –
    D-Arabinose –
    L-Arabinose –
    Ribose –
    D-Xylose –
    L-Xylose –
    Adonitol –
    β-Methylxylosid –
    Galactose +
    D-Glucose +
    D-Fructose + +
    D-Mannose +
    L-Sorbose –
    Rhamnose –
    Dulcitol –
    Inositol –
    Mannitol –
    Sorbitol –
    α-Methyl-D-mannosid –
    α-Methyl-D-glucosid –
    N-Acetyl-glucosamin +
    Esculin –
    Cellobiose –
    Maltose –
    Lactose +
    Saccharose –
    Trehalose –
    Inulin –
    Melezitose –
    D-Raffinose –
    Glycogen –
    Xylitol –
  • Der Lactobacillus helveticus LBK-16 H ist proteolytisch aktiv. Bestimmt durch das untenstehend in den Beispielen beschriebene OPA-Verfahren, das auf der Proteolyse von o- Phthaldialdehyd basiert, liegt die proteolytische Aktivität des Stammes im Bereich von 0,3 bis 0,6. Die proteolytische Aktivität kann sowohl zur Verwendung als ein Starter als auch für die Herstellung der biologisch aktiven Substanzen verwendet werden.
  • Der Lactobacillus helveticus LBK-16 H verträgt niedere pH-Werte sehr gut. Dies stellt sowohl aus dem Gesichtspunkt der Haltbarkeit als auch der physiologischen Aktivität eine wichtige Eigenschaft dar. Wie in den Beispielen beschrieben verträgt der Stamm einen pH-Wert von 4 und sogar von 3 über vier Stunden hinweg sehr gut und seine Haltbarkeit ist insbesondere in Milchprodukten ausgezeichnet: bis zu 4 Stunden bei einem derart niedrigen pH-Wert wie dem pH-Wert von 2. Ausgehend von den Ergebnissen kann ebenfalls angenommen werden, dass der Stamm den Verdauungstrakt nach dem Magen überlebt und im Dickdarm lebensfähig bleibt.
  • Der Lactobacillus helveticus LBK-16 H weist ebenfalls eine ausgezeichnete Gallentoleranz auf, er toleriert Gallenkonzentrationen von bis zu 0,5%. Dieses Ergebnis deutet ebenfalls darauf hin, dass der Stamm den Verdauungstrakt durch den Magen überlebt, ebenso wie den Dünndarm, und im Dickdarm lebensfähig bleibt.
  • Es wurde zudem nachgewiesen, dass der Lactobacillus helveticus LBK-16 H die Fähigkeit zur Herstellung von Stickoxid besitzt. Die Herstellung von Stickoxid wurde als die Bildung von Stickoxid untersucht, die durch Aktivierung von Stickoxidsynthetase zur Verfügung gestellt wurde. In der Makrophagen-Zell-Linie J774 stellte der Stamm 0,4μm NO her, und in der humanen Enterozyten-Zell-Linie T84 stellte er etwa 2 bis 6μm NO her. Diese Eigenschaft ist sehr wichtig: Die Aktivierung der Produktion von NO in einer angemessenen Menge ist vorteilhaft, zum Beispiel bei der Reaktion auf Entzündungen und bei der Regulierung des Blutdrucks.
  • Es wurde zudem herausgefunden, dass Lactobacillus helveticus LBK-16 H die Fähigkeit besitzt, bioaktive Peptide herzustellen. In den Beispielen der finnischen Patentanmeldung 992360 wurde beschrieben, wie ein gut konservierbares Produkt, das die antihypertensiven Peptide enthält, durch ein zweistufiges Verfahren hergestellt wird, wobei die obenstehend genannten biologisch aktiven Peptide in der ersten Stufe durch Fermentierung von beispielsweise verschiedenen Milchprodukten mit Lactobacillus helveticus LBK-16 H alleine oder mit einer Kombination des Stammes und anderen Milchsäurebakterienstämmen hergestellt werden. Gemäß der Beispiele der Veröffentlichung stellte der Lactobacillus helveticus LBK-16 H die bekannten antihypertensiv-wirkenden Tripeptide VPP (Val-Pro-Pro) und IPP (Ile-Pro-Pro) 13 bis 15mg/l, bzw. 6 bis 8mg/l her. Die Veröffentlichung gibt an, dass eine Mischung aus verschiedenen Peptiden bei der Fermentationsreaktion gebildet wird. Ist die Fermentationsdauer ausreichend, werden relative kleine Di- und Tripeptide erhalten.
  • Auf der Basis der obenstehend beschriebenen Eigenschaften kann der Lactobacillus helveticus LBK-16 H als probiotischer Organismus angesehen werden.
  • Der Lactobacillus helveticus LBK-16 H ist zum Beispiel als herkömmliches Starter-Bakterium in der Milchindustrie verwendbar, zum Beispiel bei der Herstellung von fermentierten Milchprodukten und Käsen. Die Verwendung bei der Herstellung von Käse, insbesondere von Emmentaler Käse, wird als bevorzugte Ausführungsform angesehen.
  • Der Lactobacillus helveticus LBK-16 H kann zudem sehr gut bei der Herstellung von bioaktive Peptide umfassenden Spezialprodukten, wie zum Beispiel fermentierten Milchprodukten, insbesondere Sauermilch und Joghurt, verwendet werden.
  • Der Lactobacillus helveticus LBK-16 H kann ferner als eine funktionelle Substanz als solche bei der Herstellung von essbaren Substanzen, oder als ein Bestandteil in, oder Zusatz zu, essbaren Substanzen verwendet werden.
  • Der Lactobacillus helveticus LBK-16 H wird unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren durch Kultivierung des Bakteriums hergestellt, zum Beispiel in MRS-Nährlösung, in Milch, wie zum Beispiel Rohmilch, Milch, die aus Milchpulver wiederhergestellt wurde, oder mit Ultraschall behandelter Milch, oder in einem Medium wie zum Beispiel Rogosa oder MRS, die für gewöhnlich für Lactobacilli verwendet werden. Für den Fachmann ist die Auswahl der geeigneten Kultivierungsbedingungen und anderer Parameter, wie zum Beispiel Temperatur, pH-Wert und Luftzufuhr offensichtlich. Die Temperatur kann beispielsweise im Bereich von 30 bis 45°C liegen. Eine Anpassung des pH-Wertes kann notwendig werden.
  • Der Lactobacillus helveticus LBK-16 H kann alleine kultiviert werden, um eine Reinkultur zu bilden. Der Stamm kann auch als Mischkultur kultiviert werden, zum Beispiel zusammen mit anderen dem Fachmann bekannten Startermikroben. Falls gewünscht, ist es ebenfalls möglich, eine Mischkultur zur Verfügung zu stellen, indem Mikroben verschiedener Art separat kultiviert werden und dann die verschiedenen Mikroben in den gewünschten Verhältnissen vereinigt werden. Die Mikrobenkombinationen werden so ausgewählt, dass sie der Erzielung der bestmöglichen Eigenschaften des Endproduktes dienen und die Gefahr einer Kontamination eliminiert wird.
  • Nach der Kultivierung wird die Zellsuspension zurückgewonnen und als solche verwendet oder auf die gewünschte Weise behandelt, zum Beispiel durch Konzentration, Trocknung, oder Gefriertrocknung.
  • Natürlich kann der Lactobacillus helveticus LBK-16 H ebenfalls als eine Reinkultur oder Mischkultur verwendet werden, alleine, oder zum Beispiel mit herkömmlich verwendeten und im Handel erhältlichen Startern oder probiotischen Stoffen.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Bakterienpräparation, die gefriergetrocknet wurde und die den Stamm Lactobacillus helveticus LBK-16 H, DSM 13137 enthält, in einem geeigneten Adjuvans als bevorzugte Präparation angesehen.
  • Die erfindungsgemäße Bakterienpräparation kann das obenstehende Bakterium als solches umfassen, oder in Verbindung mit anderen Zusammensetzungs-Bestandteilen, wie zum Beispiel anderen Mikroorganismen.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung kann der Stamm auch bei der Herstellung von essbaren Produkten, insbesondere (funktionellen) Lebensmitteln, natürlichen Produkten oder Pharmazeutika verwendet werden.
  • Die erfindungsgemäßen essbaren Produkte werden unter Verwendung des Läctobacillus helveticus LBK-16 H, DSM 13137 oder eines bakteriellen Produktes, das den Lactobacillus helveticus LBK-16 H enthält, hergestellt, sowie unter Verwendung von herkömmlichen Bestandteilen der (End-) Produkte.
  • Das Bakterium kann einem Lebensmittel oder einem anderen Produkt während dessen Herstellungsprozesses hinzugefügt werden. Alternativ kann es einem fertigen Produkt hinzugefügt werden. Es ist auch möglich, das Bakterium in Verbindung mit der Herstellung des Produktes so zu verwenden, dass keine Bakterienzellen sondern nur während des Wachstums des Bakteriums erzeugte Produkte, wie zum Beispiel Aromastoffe oder aromatische Substanzen oder Substanzen mit einer biologischen Aktivität in dem Endprodukt verbleiben.
  • In der vorliegenden Erfindung wird der Begriff Lebensmittel in weitem Sinne verwendet und deckt alle essbaren Produkte ab, die in fester, gelierter oder liquider Form vorliegen können und er deckt sowohl Fertiggerichte als auch Produkte ab, denen das Produkt der Erfindung im Zusammenhang mit dem Verzehr, als ein Zusatzstoff oder als ein konstituierender Bestandteil des Produktes hinzugefügt wird. Die Lebensmittel können zum Beispiel Produkte der Milchindustrie, der fleischverarbeitenden Industrie, der lebensmittelverarbeitenden Industrie, der Getränkeindustrie, der Backwarenindustrie und der Konditorindustrie sein. Typische Produkte umfassen Milchprodukte, wie zum Beispiel fettfreie Milch, Milch mit verschiedenen Fettgehalten als solche oder in Form des entsprechenden Milchpulvers, und fermentierte Milchprodukte wie zum Beispiel Sauermilch, Buttermilch, Quark, Joghurt, geronnene Milch, unreifer Käse und gereifter Käse, Füllungen von Snacks, usw. Getränke wie zum Beispiel Molkegetränke, Fruchtsaftgetränke und Biere stellen eine weitere wichtige Gruppe dar.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung umfassen die Produkte der pharmazeutischen Industrie außer den verschiedenen pharmazeutischen Präparationen ebenfalls gesundheitsfördernde natürliche Produkte und ähnliches. Typische Formen von Präparationen sind beispielsweise Kapseln, Pillen und Lösungen.
  • Gemäß der Erfindung wird der Lactobacillus helveticus LBK-16 H, DSM 13137 in einer ausreichenden Menge verwendet, um die erwünschte Wirkung zur Verfügung zu stellen. Die verwendbare Menge kann daher innerhalb einer weiten Spanne variieren, je nach Anwendung und Wirkung.
  • Im Folgenden wird die Erfindung durch die Beispiele ausführlicher beschrieben. Diese Beispiele dienen jedoch lediglich der Erläuterung der Erfindung und sollen ihren Schutzumfang in keinster Weise einschränken.
  • Beispiel 1
  • Kultivierung des Lactobacillus helveticus-Stammes LBK-16 H
  • Der Lactobacillus helveticus-Stamm LBK-16 H wurde kultiviert, indem eine Stammkultur zweimal in MRS- oder Milchnährlösung mit 1% Inokulum bei einer Temperatur von 37°C 20 bis 24 Stunden lang okuliert wurde. Die eigentliche (produktionelle) Kultivierung wurde ebenfalls in einer MRSbasierten oder Milch-basierten Nährlösung bei einer Kultivierungstemperatur von 35°C bis 42°C durchgeführt, indem der Stamm 20 bis 48 Stunden wuchs (mit oder ohne Anpassung des pH-Wertes).
  • Die Zellen können von der Kultivierung als solche rückgewonnen werden oder sie können unter Verwendung bekannter Techniken konzentriert werden und als Zellkonzentrat verwendet werden, oder sie können auch nach der Konzentration zu einem pulverartigen Produkt gefriergetrocknet werden.
  • Beispiel 2
  • Proteolytische Aktivität des Lactobacillus helveticus-Stammes LBK16 H
  • Die proteolytische Aktivität des Lactobacillus helveticus-Stammes LBK-16 H wurde aus der Milch unter Verwendung des OPA-Verfahrens bestimmt (Church, F. C., Swaisgood, H. E., Porter, D. H., Catigna, G. L., 1983, Spectrophotometric assay using o-Phthaldialdehyde for determination of proteolysis in milk and isolated milk proteins, J Dairy Sci 66 : 1219–1227).
  • Zur Durchführung des Verfahrens wurden die Bakterienzellen in einer MRS-Nährlösung in einem 10 ml Röhrchen kultiviert, danach wurde die Suspension mit 0,9% NaCl gewaschen und zu 10 ml suspendiert. Die Bakterienzellen wurden als 1% Inokulum in 10 ml 22-Grad Milch inokuliert. Eine entsprechende Milchprobe ohne Bakterieninokulum wurde als Kontrolle verwendet.
  • 2,5 ml der Probe, 0,5 ml Wasser und 0,5 ml 0,75 N Trichloressigsäure (TCA) wurden in einer Vortex-Vorrichtung gut gemischt, 10 Minuten ruhen gelassen und durch ein Whatman-Filterpapier #2 gefiltert. Eine 150 μl Probe wurde dem TCA-Filtrat entnommen und mit 3ml des OPA-Reagenz in einer wegwerfbaren Küvette vermischt. Die Mischung wurde 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, und danach wurde sie mit einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 340nm vermessen. Der Kontrollwert wurde von dem Zählerwert abgezogen, wobei die proteolytische Aktivität des Lactobacillus helveticus LBK-16 H 0,3 bis 0,6 erreichte.
  • OPA Reagens:
    25 ml 100 mmol Natriummetaborat
    2,5 ml 20% (w/w) SDS
    40 mg OPA (o-Phthaldialdehyd) aufgelöst in 1 ml Methanol
    100 μl β-Mercaptoethanol
  • Die Substanzen werden kombiniert und in Wasser aufgelöst, so dass das Endvolumen 50 ml beträgt. Das Reagens wird einen Tag im Dunkeln gelagert.
  • Beispiel 3
  • pH-Toleranz des Lactobacillus helveticus LBK-16 H
  • LBK-16 H wurde 17 bis 18 Stunden zweimal vor dem Test in einer MRS-Nährlösung kultiviert. Danach wurde der Stamm für den Test entweder in einer MRS-Nährlösung oder in einer Milchnährlösung kultiviert. Beim pH-Wert-Test, wurde der pH-Wert der Testnährlösung (MRS) auf den pH-Wert 6,5, den pH-Wert 4 und den pH-Wert 2 (mit Milchsäure) eingestellt. Diese Nährlösungen wurden mit MRS- oder Milchnährlösungskultivierungen derart inokuliert, dass die Eingangskonzentration 107 cfu/ml betrug, und 3 und 4 Stunden bei 37°C kultiviert. Danach wurde die Konzentration des LBK-16 H-Stammes aus den Kultivierungen (durch das Bestimmungsverfahren von Lactobacilli auf MRS-Agar) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
  • Tabelle 1 pH-Toleranz des LBK-16 H-Stammes
    Figure 00150001
  • Somit toleriert der Stamm den pH-Wert von 4 und sogar von 3 über vier Stunden hinweg sehr gut. Die Haltbarkeit des Stammes bei einem derart niedrigen Niveau wie dem pH-Wert von 2 für 4 Stunden ist, wenn er in einem Milchprodukt augenommen ist, besser, als bei einem wässrigen Produkt.
  • Beispiel 4
  • Gallen-Toleranz des Lactobacillus helveticus-Stammes LBK-16 H
  • Der Stamm LBK-16 H wurde wie in Beispiel 3 kultiviert. Der Test wurde in MRS-Nährlösungen durchgeführt, zu denen Gallensäure, Rindergalle; Sigma B-3883 in einer Menge von 0,3% und 0,5% hinzugefügt wurden. Den Gallen-enthaltenden-Nährlösungen wurde 1% einer frischen Kultur der MRS- oder milchbasierten Kultivierungen hinzugefügt, wobei die Eingangskonzentration 2 – 5 × 106 cfu/ml betrug. Der Stamm wurde in der Nährlösung 3 Stunden lang kultiviert, und danach wurde die Zellkonzentration auf dem MRS-Agar bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
  • Tabelle 2 Gallentoleranz von LBK-16 H
    Figure 00170001
  • Wie aus der Tabelle ersichtlich, toleriert LBK-16 H Gallenkonzentrationen von bis zu 0,5%.
  • Beispiel 5
  • Herstellung von Stickoxid durch Lactobacillus helveticus LBK-16 H
  • Die Herstellung von Stickoxid durch Lactobacillus helveticus LBK-16 H wurde unter der Verwendung des von Korhonen et al. beschriebenen Verfahrens untersucht (Induction of nitric oxide synthesis by probiotic Lactobacillus GG in J774 macrophages und T84 colon epitheal cells, Korhonen, R., Korpela, R., Saxelin, M., Mäki, M., Kankaanranta, H. und Moilanen, E., eingereicht). Das Verfahren basiert auf der Induktion einer induzierbaren Stickoxidsynthetase (iNOS) und der resultierenden Produktion von Stickoxid (NO). Zwei verschiedene Zellinien wurden bei dem Test verwendet: J774 murine Makrophagenzellinie und T 84 humane Enterozytenzellinie. Die Induktion wurde mit den Lactobacillus helveticus LBK-16 H-Zellen in der J774 Zellinie durchgeführt, wobei γ-Interferon gegenwärtig war, da die Bakterienzellinien NO nicht alleine herstellten. Das Verhältnis der Zellen der Zellinie und des Bakterienstammes betrug 1:10.
  • Die Expression des Enzyms iNOS wurde anhand der Western Blot-Technik bestimmt, wobei Lipopolysaccharide (LPS) und lipoteicoische Säure (lipoteicoic acid; LA) als Referenzen verwendet wurden.
  • Die Herstellung von Stickoxid (NO) wurde als die Menge des Stickoxid-Metaboliten Nitrit in dem Wachstumsmedium nach 24 Stunden Inkubation bestimmt. Die Nitritmenge wurde durch eine Griess-Reaktion gemessen (Green et al., 1988, Analytical Biochemistry, Band 126, Seiten 131 bis 138).
  • Der Lactobacillus helveticus LBK-16 H war in der Lage, 0,4μM Stickoxid in der murinen Makrophagenzellinie und 5 bis 6μM Stickoxid in humanen Epithelzellinie herzustellen. Zu Vergleichszwecken kann erwähnt werden, dass Lactobacillus rhamnosus LC 705, DSM 7061 nur 0,7μM Stickoxid in den T84 Zellen herstellte.
  • Beispiel 6
  • Herstellung von bioaktiven Peptiden durch den Lactobacillus helveticus LBK-16 H
  • Zur Bildung eines Inokulums wurde der Lactobacillus helveticus-Stamm LBK-16 H bei 37°C 24 Stunden lang in MRS-Nährlösung kultiviert und in wiederhergestellte Milch (10%) inokuliert. Nach zwei Kultivierungsrunden wurde das Inokulum (15%) in ein Gärmedium inokuliert, das aus 9 bis 10% fettfreier Milch aus Milchpulver bestand und das 10 Minuten lang bei 110°C sterilisiert wurde. Die Fermentation wurde bei 37°C 22 bis 24 Stunden lang durchgeführt, wobei die ganze Zeit ein kräftiges Mischen stattfand.
  • Zur Durchführung eines Vergleichstests wurde die Fermentation wiederholt, wobei (a) eine Mischung aus verschiedenen Stämmen, d.h. L. helveticus LB161, L. helveticus LBK-16 H und L. helveticus LB230, (b) eine Mischung der Stämme L. helveticus LBK-16 H und L. rhamnosus LC705, DSM 7061, und (c) eine Mischung der Stämme L. helveticus LBK-16 H und Streptococcus thermophilus T101, DSM 4022 verwendet wurden.
  • Das verwendete Wachstumsmedium war 9% Milch, die bei 100°C 15 Minuten lang sterilisiert wurde. Die Stämme L. helveticus und L. rhamnosus LC705 wurden zur Bildung von Inokula bei 37°C 24 Stunden lang in MRS-Nährlösung kultiviert, aus der ein 1% Inokulum dann in Milch transferiert wurde. Str. thermophilus T101 wurde 18 Stunden lang bei 37°C in LM17 Nährlösung kultiviert, aus der ein Inokulum in Milch transferiert wurde.
  • Die erste Kultivierung wurde durchgeführt, indem alle Stämme einzeln in Milch kultiviert wurden, Inkubation 24 Stunden lang bei 37°C. Für die zweite Kultivierung wurde 1% der Stämme in jeder Mischung in Milch pipettiert, wonach eine Cokultivierung 24 Stunden lang bei 37°C durchgeführt wurde. Für die dritte Kultivierung wurden 5 bis 10% der zuvor erhaltenen Cokultivierung in Milch pipettiert und bei 37°C 24 Stunden lang inkubiert.
  • Die durch den Stamm L. helveticus LBK-16H und die verschiedenen Mikrobenmischungen produzierten Mengen an VPP und IPP sind in Tabelle 3 dargestellt. Der erfindungsgemäße L. helveticus LBK-16H ist in der Lage, große Mengen an bioaktiven Peptiden herzustellen. Die anderen Mikroben der verschiedenen Mischungen stellten keine bioaktiven Peptide her, aber sie beeinflussten die Aktivität des LBK-16 H auch nicht nachteilig. Zwischen den Mischungen oder dem puren LBK-16H Stamm wurden keine Unterschiede beobachtet.
  • Tabelle 3 IPP- und VPP-Mengen, die durch den Stamm LBK-16 H und verschiedene Mikrobenmischungen erzeugt wurden
    Figure 00200001

Claims (14)

  1. Lactobacillus helveticus LBK-16 H, DSM 13137.
  2. Bakterienpräparat enthaltend den Lactobacillus helveticus-Stamm LBK-16 H, DSM 13137.
  3. Bakterienpräparat gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin andere Mikroorganismen enthält.
  4. Bakterienpräparat gemäß Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß es in Form eines lyophilisierten Pulvers oder einer Kapsel vorliegt.
  5. Verwendung des Lactobacillus helveticus-Stammes LBK-16 H, DSM 13137 in der Nahrungsmittelindustrie.
  6. Verwendung gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein Produkt der Milchindustrie oder der Getränkeindustrie hergestellt wird.
  7. Eßbares Produkt, dadurch gekennzeichnet, daß es das Bakterium, gemäß Anspruch 1 oder das Bakterienpräparat gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, enthält.
  8. Eßbares Produkt gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Milchprodukt ist.
  9. Eßbares Produkt gemäß Anspruch 7, dadurch gekennnzeichnet, daß es ein Getränk ist, vorzugsweise ein Molkegetränk, Fruchtgetränk oder Bier.
  10. Der Lactobacillus helveticus-Stamm LBK-16 H, DSM 13137 zur Verwendung als therapeutische Substanz.
  11. Der Lactobacillus helveticus-Stamm LBK-16 H, DSM 13137 zur Verwendung bei der Behandlung von Bluthochdruck.
  12. Der Lactobacillus helveticus-Stamm LBK-16 H, DSM 13137 zur Verwendung bei der Herstellung von antihypertensiven Produkten.
  13. Der Lactobacillus helveticus-Stamm LBK-16 H, DSM 13137 zur Verwendung bei der Herstellung von antihypertensiven Produkten gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das antihypertensive Produkt antihypertensive Di- und Tripeptide enthält.
  14. Der Lactobacillus helveticus-Stamm LBK-16 H, DSM 13137 zur Verwendung bei der Herstellung von antihypertensiven Produkten gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das antihypertensive Produkt eine hohe Konzentration an Tripeptiden aufweist, insbesondere Ile-Pro-Pro und/oder Val-Pro-Pro.
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