JP4499564B2 - 抗高血圧特性を有するペプチドの製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、抗高血圧特性を有するペプチドを製造するために、約200kDaの細胞壁プロテイナーゼを含む乳酸菌を使用すること、及びそうした乳酸菌の取得方法に関する。
高血圧は、先進工業国において、心発作に関する最も主要な危険因子のうちの一つであると報告されている。高血圧は、アンジオテンシン変換酵素(ACE)を強く阻害する薬剤で治療されることが多い。疾患発達の初期段階で、高血圧を予防することは、薬剤による高血圧の治療の代わりとなりうる。現在では、多数の食物由来の生理活性化合物が、健康に有益であり、また健康を促進すると考えられている。
本発明により解決される課題は、抗高血圧特性を有するペプチドの作成に関して特に改良された特徴を有する乳酸菌(LAB)の取得方法を提供することである。
(i) 乳酸菌が、(prtH200と名づけられる)細胞壁プロテイナーゼをコードする遺伝子配列を含む乳酸菌であるかを調べ、(ここで該遺伝子配列は、以下の[センス配列(S);アンチセンス配列(A)]:
(ii) もし該乳酸菌が、ステップ(i)の判定基準を満たすなら、該乳酸菌を取得し;又は
(iii) もし乳酸菌が、ステップ(i)の判定基準を満たさないなら、別の乳酸菌についてステップ(i)を繰り返すステップ
を含む前記方法に関する。
但し、上記乳酸菌がラクトバチルス・ヘルベチカスCNRZ32株である場合を除く。
(i) 乳酸菌が、(prtH200と名付けられる)細胞壁プロテイナーゼをコードする遺伝子配列を含む乳酸菌であるかを調べ、ここで該遺伝子配列は、
prtH200が細胞壁プロテイナーゼ活性を示す酵素をコードするDNA配列であり、該DNA配列が、以下の:
(a) 配列番号1の1〜5550位で表されるDNA配列
(b) (a)において定義されるDNA配列の断片に少なくとも50%同一である少なくとも75塩基対(bp)の断片を含むDNA配列
(c) 細胞壁プロテイナーゼ活性を示すポリペプチドであって、配列番号2の1〜1849位で表されるポリペプチド配列の対応する断片に少なくとも30%同一である少なくとも200個のアミノ酸(aa)断片を含む、上記ポリペプチドをコードするDNA配列
(d) 配列番号1の1〜5550位で表されるDNA配列を含む二重鎖DNAプローブと低い厳密度でハイブリダイズするDNA配列;及び
(e) (a)、(b)、(c)、又は(d)において特定化されるDNA配列の断片であるDNA配列
からなる群から選ばれる;そして
(ii) 上記乳酸菌が、ステップ(i)の判定基準を満たすなら、次に該乳酸菌を取得し;又は
(iii) 上記乳酸菌が、ステップ(i)の判定基準を満たさないなら、次に他の乳酸菌でステップ(i)を繰り返すステップ
を含む、前記方法に関する。但し、上記乳酸菌が、ラクトバチルス・ヘルベチカスCNRZ32株である場合を除く。
prtaH200が、細胞壁プロテイナーゼ活性を示す酵素をコードするDNA配列であり、該DNA配列が、以下の:
(a) 配列番号1の1〜5550位で表されるDNA配列
(b) (a)において定義されるDNA配列の対応する断片に少なくとも50%同一である少なくとも75塩基対(bp)の断片を含むDNA配列
(c) 細胞壁プロテイナーゼ活性を示すポリペプチドであって、配列番号2の1〜1849位で表されるポリペプチド配列の対応する断片に少なくとも30%同一である少なくとも200個のアミノ酸(aa)断片を含む上記ポリペプチドをコードするDNA配列
(d) 配列番号1の1〜5550位で表されるDNA配列を含む二重鎖DNAプローブと低い厳密度でハイブリダイズするDNA配列;及び
(e) (a)、(b)、(c)、又は(d)において特定されるDNA配列の断片であるDNA配列
からなる群から選ばれる
と定義される。
(i) 本発明の第一及び第二態様に従った乳酸菌を取得する方法により、乳酸菌を取得し;
(ii) タンパク質を含む食材を、(i)で得られた乳酸菌で発酵して、上記ペプチドを含む発酵食材を取得するステップ
を含む方法に関する。
(i) 本発明の第一及び/又は第二態様に従った乳酸菌の取得方法により、乳酸菌取得し;
(ii) 動物乳タンパク質又は野菜タンパク質を含む食材を、(i)で得られた乳酸菌で発酵して、抗高血圧特性を有するペプチドを含む発酵食材を取得するステップ:
を含む方法に関する。
(i) ペプチドに抗高血圧特性を有するペプチドを製造する方法に従って、発酵食材を製造し、そして
(ii) 適切な方法で該食材をパッキングして、機能性食品を得るステップ
を含む。
本発明の詳細な実施態様を記述する前に、本発明の主要な態様に関わる特徴的な用語の定義を与える。
PrtH200細胞壁プロテイナーゼ
細胞壁プロテイナーゼの活性は、好ましくは乳酸菌の中に存在する間に確認される。適切な戦略は、分析される細胞壁プロテイナーゼをコードする遺伝子に致死変異を有する乳酸菌を構築することである。この構築された細菌のタンパク質分解活性(適切なアッセイについては以下を参照のこと)を、対応する野生型細菌の活性と比較した。対応する野生型と比較したとき、致死変異を有する乳酸菌のタンパク質分解活性の計測できる低減により、分析される細胞壁プロテイナーゼをコードする遺伝子が、活性のある乳酸細胞壁プロテイナーゼをコードする遺伝子であるということが実験的に確認されるだろう。
同一性:配列番号2のprtH200のアミノ酸配列の対応する断片に対して50%の同一性を有する1600個のアミノ酸断片
同一性:配列番号2のprtH200のアミノ酸配列の対応する断片に対して49%の同一性を有する1632個のアミノ酸断片
同一性:配列番号2のprtH200のアミノ酸配列の対応する断片に対して32%の同一性を有する1682個のアミノ酸断片
同一性:配列番号2のprtH200のアミノ酸配列の対応する断片に対して63%の同一性を有する415個のアミノ酸断片
生物体:ストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)
同一性:配列番号2のprtH200のアミノ酸配列の対応する断片に対して30%の同一性を有する781個のアミノ酸断片
同一性:配列番号2のprtH200のアミノ酸配列の対応する断片に対して61%の同一性を有する264個のアミノ酸断片
同一性:配列番号1のprtH200DNA配列の対応する断片に対して、84%の同一性を有する102bpの断片
同一性:配列番号1のprtH200DNA配列の対応する断片に対して、86%の同一性を有する81bpの断片。
同一性:配列番号1のprtH200DNA配列の対応する断片に対して、86%の同一性を有する81bpの断片。
同一性:配列番号1のprtH200DNA配列の対応する断片に対して、86%の同一性を有する81bpの断片。
同一性:配列番号1のprtH200DNA配列の対応する断片に対して、83%の同一性を有する102bpの断片。
本明細書中で記載されるprtH200遺伝子配列は、乳酸菌(LAB)の「フィンガープリント」として検出されうる。
好ましくは、prtH200遺伝子配列とは別に、LABはまた、本明細書中でorfF3と名付けられるオープン・リーディング・フレームを含む遺伝子を含む。この遺伝子は、さらなるフィンガープリントとして検出されうる。
orfF3はオープン・リーディング・フレームをコードするDNA配列であって、該DNA配列は以下:
(a)配列番号3の1〜2679位で表されるDNA配列
(b) (a)において定義されるDNA配列の対応する断片に少なくとも40%同一である少なくとも75塩基対(bp)の断片を含むDNA配列
(c)配列番号4の1〜893位で表されるポリペプチド配列の対応する断片に少なくとも30%同一である、少なくとも200個のアミノ酸断片を含むポリペプチドをコードするDNA配列
(d)配列番号3の1〜2679位で表されるDNA配列を含む二本鎖DNAプローブと低い厳密度でハイブリダイズするDNA配列
(e) (a)、(b)、(c)、又は(d)において特定化されるDNA配列の断片であるDNA配列
を含む群から選ばれる。
好ましくは、prtH200遺伝子配列とは別に、LABはまた、本明細書中でorfF4と名付けられるオープン・リーディング・フレームを含む遺伝子を含む。
orf4は、オープン・リーディング・フレームをコードするDNA配列であり、該DNA配列は、以下の:
(a)配列番号5の1〜4881位で表されるDNA配列
(b)(a)において定義されるDNA配列の対応する断片に対して少なくとも40%同一である、少なくとも75塩基対(bp)の断片を含むDNA配列
(c)配列番号6の1〜1627位で表されるポリペプチド配列の対応する断片に少なくとも30%同一である少なくとも200個のアミノ酸(aa)の断片を含むポリペプチドをコードするDNA配列
(d)配列番号5の1〜4881位で表されるDNA配列を含む二重鎖DNAプローブと、低い厳密度でハイブリダイズするDNA配列
(e)(a)、(b)、(c)、又は(d)において特定化されるDNA配列の断片であるDNA配列
を含む群から選ばれる。
好ましくは、prtH200遺伝子配列とは別に、LABは、本明細書中でorfF1と名付けられるオープン・リーディング・フレームを含む遺伝子を含む。
orfF1は、オープン・リーディング・フレームをコードするDNA配列であり、該DNA配列は、以下の:
(a)配列番号19の1〜5358位で表されるDNA配列:
(b) (a)において定義されるDNA配列の対応する断片に対して少なくとも40%同一である少なくとも75塩基対(bp)の断片を含むDNA配列
(c)配列番号20の1〜1785位で表されるポリペプチド配列の対応する断片に少なくとも30%同一である少なくとも200個のアミノ酸(aa)の断片を含むポリペプチドをコードするDNA配列
(d)配列番号19の1〜5358位で表されるDNA配列を含む二重鎖DNAプローブと、低い厳密度でハイブリダイズするDNA配列;及び
(e) (a)、(b)、(c)、又は(d)で特定化されたDNA配列の断片である、DNA配列
を含む群から選ばれる。
本明細書中で記載されるLABの特徴を記述する別の適切な方法は、いわゆるパルスフィールド・ゲル・電気泳動(PFGE)フィンガープリント技術を使用する方法である。
バンド番号1:283kbp
バンド番号2:259kbp
バンド番号3:219kbp
バンド番号4:138kbp
バンド番号5:127kbp
バンド番号6:119kbp
バンド番号7:106kbp
バンド番号8:88kbp
バンド番号9:71kbp
バンド番号10:59kbp
バンド番号11:54kbp
バンド番号12:46kbp
である。
ラクトバチルス・ヘルベチカスDSM14998の283kbpのバンドに対応するバンド
ラクトバチルス・ヘルベチカスDSM14998の219kbpのバンドに対応するバンド
ラクトバチルス・ヘルベチカスDSM14998の46kbpのバンドに対応するバンド
上記されるように、本明細書中に記載される遺伝子配列の存在は、好ましくは本明細書中の教示に従って設計されたPCRプライマーを使用するPCR増幅により確認される。当業者が、適切に設計されたPCRプライマーを持つ場合、適切な特意的PCR増幅プロトコルを行う一般的な知識を使用して乳酸菌の遺伝子の有無を確認することは、当業者にとってたやすいことである。
上記で説明されるように、PrtH200遺伝子に関する適切なPCRプライマーは:
上記DNA配列の相同性/同一性は、二つの配列間の同一性の程度として測定され、第二配列からの第一配列の偏差を指し示す。
ヌクレオチド・ホモロジー分析に類似して、本文脈において、好ましいコンピューターホモロジー検索プログラムは、本特許出願の出願日において、NCBIのインターネットサイトにおいて特定される「標準タンパク質-タンパク質BLAST[blastp]」検索であって、Composition-based statisticsをYes、FilterをLow complexity、Expectを10、Word Sizeを3、MatrixをBLOSUM 62、Gap CostsをExistance 11 Extension1に設定する検索である。
上で記載されるハイブリッド形成は、二重鎖DNAプローブにハイブリダイズする類似のDNA配列を含むように企図される。ヌクレオチドプローブと、相同DNA又はRNAは配列とのあいだの低い、中間の、又は高い厳密度でのハイブリッド形成を測定するための適切な実験条件は、以下の手順を含む。DNA断片又はRNAを含むフィルターを、5×SSC(塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、Sambrook et al., 1989)で10分間予浸して、5×SSC、5×デンハルト溶液(Sambrook et al.,1989)、0.5%SDS及び100mu g/mlの変性され超音波処理されたサケ精子DNA(Sambrook et al.,1989)の溶液中でプレハイブリダイゼーションを行ない、続いて、10ng/mlのランダム-プライム化(Feinberg,A. P. and Vogelstein,B. (1983) Anal. Biochem. 132: 6-13)P-dCTP-標識プローブ(比活性>1×10cpm/mu g)で45℃12時間ハイブリッド形成させた。フィルターを次に、2×SSC、0.5%SDS中で、少なくとも55℃(低厳密度)、より好ましくは少なくとも60℃(中厳密度)、より好ましくは少なくとも65℃(中/高厳密度)、さらに好ましくは少なくとも70℃(高厳密度)、さらに好ましくは75℃(超高厳密度)の温度で30分間二回洗浄した。
「タンパク質を含む材料を、乳酸菌で発酵する」などの表現における「タンパク質を含む材料」という用語は、本明細書中において、乳酸菌が成長することができ、それゆえペプチドを含む発酵材料を得ることを可能にするタンパク質を含む材料の全てを指す。ペプチドは、タンパク質の加水分解に基く乳酸菌細胞壁プロテイナーゼにより得られるペプチドとして理解されるべきである。
食材は、動物乳タンパク質又は野菜タンパク質を含むべきである。
「乳酸菌」という用語は、本明細書中で、グラム陽性の非出芽菌であって、糖の乳酸発酵を行う菌の群を指す。
本明細書中に記載されるprtH200、orfF3、及びorfF4遺伝子配列は、本明細書中に記載されるように有用な乳酸菌を同定するために、特に適したフィンガープリントとして見ることができる。理論に限られることなく、本明細書中に記載されるフィンガープリント遺伝子配列を含むにもかかわらず、本明細書中に記載される有利な性質を示さない株が存在するということが理論的にありうる。
(i) 食材200mlを該細菌で一晩発酵し、
(ii) 生産されたペプチドを抽出し、そして
(iii) ACE活性の50%を阻害するために必要とされるペプチド濃度を計測するアッセイにより、抽出されたペプチドの抗高血圧特性を計測するステップ
を含むプロトコルにより確定される。
(i) 200mlの食材を、該菌で一晩発酵させ、
(ii) 産生されたペプチドを抽出し、
(iii) ACE活性の50%を阻害するために必要とされるペプチド濃度(DL50)を計測するアッセイにより、抽出されたペプチドの抗高血圧特性を計測するステップ
を含むプロトコルにおいて、0.25〜5.0(mg/ml)のアンジオテンシン-変換酵素(ACE)阻害活性(DL50)を有するペプチドを産生する事ができるタンパク質分解活性を有する。
本発明の方法において、食材の種類及び/又は乳酸菌の組み合わせに依存して変えられることがある稼動条件下で乳酸菌により発酵される。好ましくは、食材が既に水溶液ではないなら、食材は、適切な水性溶液に溶解され、この溶液は次に、乳酸菌と混合され、そして発酵の方法により培養される。
上で記載されるように、本明細書中で記載される乳酸菌の使用は、発酵の後にかなり良好の抗高血圧特性を有するペプチドの有効量を直接提供する。
前述されるように、本明細書中で記載されるprtH200プロテイナーゼを含む乳酸菌の使用は、かなり良好の抗高血圧特性を有するペプチドの有効量を発酵後に直接提供する。結果として、発酵食材から、ペプチドをさらに精製し又は濃縮する必要性が考慮されない。発酵食材は、直接パッキングされ、そして機能性食品として又は食品添加物として、例えばフリーズドライの形態で市場に提供されうる。
(i) 本明細書中に記載される抗高血圧特性を有するペプチドを製造する方法に従って発酵食材を調製し
(ia) 発酵食材を乾燥し;そして
(ii) 機能性食品をえるために適切な方法で乾燥発酵食材をパッキングするステップ
を含む。
ステップ(ia)は、好ましくはフリーズドライである。
(ii)本明細書中に記載される抗高血圧特性を有するペプチドの製造方法に従って発酵食材を製造し、
(ia)発酵の間、存在する乳酸菌の少なくとも一部を該発酵食材中に保持し、
(ii)該発酵食材を機能性食品を得る適切な方法でパッキングする
ステップを含む。
(iii) 本明細書中に記載される抗高血圧特性を有するペプチドの製造方法に従って発酵食材を製造し、
(ia) ステップ(i)の発酵食材を、上で記載される方法に従って抗高血圧特性を有するペプチドを精製又は濃縮する方法でさらに処理し、
(ib) ステップ(ia)の精製又は濃縮されたペプチドを次に食材に加え、そして
(iv) それを適切な方法でパッキングして、機能性食品を得る
ステップを含む。
本発明の方法により得られる、抗高血圧特性を有するペプチドは、通常複数のペプチドの混合体であり、そして他のペプチドを含みうる。食品及び飲料としての使用のため、ペプチド及び/又はその精製された製品を含む発酵食材は、直接使用されうる。或いは、作用物は、使用前に、フリーズドライ、スプレードライ、又はドラム乾燥機乾燥により粉末化されうる。
論文(Teo, K. et al., Circulation (2000) 102: 1748-1754)は、ACE阻害剤( エナラプリル)がコレステロール低減治療、特に冠状動脈アテローム硬化症を低減する点において明確な効果を有するということを記述した。
本発明の態様及び実施態様は、いわゆる特許請求の範囲の形式で提示される。以下に与えられる本発明のいくつかの態様及び実施態様は、そうした特許請求の範囲の形式である。
請求項1.
乳酸菌の取得方法であって、以下のステップ:
(i) 乳酸菌が、(prtH200と名付けられる)細胞壁プロテイナーゼをコードする遺伝子配列を含む乳酸菌であるかを調べるステップ、ここで該遺伝子配列は、以下の配列[センス配列(S):アンチセンス配列(A)]:
(ii) 該乳酸菌が、ステップ(i)の判定基準を満たすなら、次に該乳酸菌の培養株を取得し;又は
(iii) 該乳酸菌が、ステップ(i)の判定基準を満たさないなら、次にステップ(i)を別の乳酸菌で繰り返すステップ
を含む、前記方法。
ステップ(i)がまた、前記乳酸菌が、(orfF3と名付けられる)オープン・リーディング・フレームをコードする遺伝子配列を含むかどうかを調べることを含み、ここで、該遺伝子配列が、以下の配列[センス配列(S);アンチセンス配列(A)]:
乳酸菌の取得方法であって、以下の:
(i)乳酸菌が、(prtH200と名付けられる)細胞壁プロテイナーゼをコードする遺伝子配列を含む乳酸菌であるかを調べるステップ、ここで該遺伝子配列は、以下:
prtH200が酵素阻害細胞壁プロテイナーゼ活性を示す酵素をコードするDNA配列であり、該DNA配列が以下の:
(a) 配列番号1の1〜5550位で表されるDNA配列
(b) (a)において定義されるDNA配列の対応する断片に少なくとも50%同一である少なくとも75塩基対(bp)の断片を含むDNA配列
(c) 細胞壁プロテイナーゼ活性を示すポリペプチドであって、配列番号2の1〜1849位で表されるポリペプチド配列の対応する断片に少なくとも30%同一である少なくとも200個のアミノ酸(aa)の断片を含むポリペプチドをコードするDNA配列;
(d) 配列番号1の1〜5550位で表されるDNA配列を含む二重鎖DNAプローブと、低い厳密度でハイブリダイズするDNA配列;及び
(e) (a)、(b)、(c)、又は(d)で特定されるDNA配列の断片であるDNA配列
からなる群から選ばれるというように定義され、
(ii) 上記乳酸菌がステップ(i)の判定基準を満たすなら、次に該乳酸菌を取得し;又は
(iii)上記乳酸菌がステップ(i)の判定基準を満たさないなら、次にステップ(i)を別の乳酸菌で繰り返すステップ
を含む前記方法。
ステップ(i)がまた、前記乳酸菌が(orfF3と名付けられる)オープン・リーディング・フレームをコードする遺伝子配列を含むかどうかを調べることを含み、ここで該遺伝子配列は、以下:
orfF3が、オープン・リーディング・フレームをコードするDNA配列であり、該DNA配列が、以下の:
(a) 配列番号3の1〜2679位で表されるDNA配列
(b) (a)で定義されるDNA配列の対応する断片に少なくとも40%同一である、少なくとも75塩基対(bp)の断片を含むDNA配列
(c) 配列番号4の1〜893位で表されるポリペプチド配列の対応する断片に少なくとも30%同一である少なくとも200個のアミノ酸(aa)の断片を含むポリペプチドをコードするDNA配列
(d) 配列番号3の1〜5550位で表されるDNA配列を含む二重鎖DNAプローブと、低い厳密度でハイブリダイズするDNA配列、並びに
(e) (a)、(b)、(c)、又は(d)で特定されるDNA配列の断片であるDNA配列
を含む群から選ばれるように定義される、請求項3に記載の乳酸菌の取得方法。
前記乳酸菌が、以下のステップ:
(i)200mlの食材を前記菌で一晩発酵し;
(ii)産生されたペプチドを抽出し、そして
(iii)抽出されたペプチドの抗高血圧特性を、ACE活性の50%を阻害するために必要とされるペプチド濃度(DL50)を計測するアッセイにより計測するステップ
を含むプロトコルで、0.25〜5.0(mg/ml)のアンジオテンシン-変換酵素(ACE)阻害活性(DL50)を有するペプチドを産生することを可能にするタンパク質分解活性を有する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の乳酸菌の取得方法。
前記乳酸菌が、発酵菌(Firmicutes)門、より好ましくは、バチルス(Bacilli)綱、さらにより好ましくは、ラクトバチルス(Lactobacillales)目の細菌である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の乳酸菌の取得方法。
前記ラクトバチルス(Lactobacillales)目の細菌が、乳酸桿菌(Lactobacillaceae)科、より好ましくは、ラクトバチルス(Lactobacillus)属の細菌、そしてさらに好ましくはラクトバチルス・ヘルベチカス菌である、請求項6に記載の乳酸菌の取得方法。
前記細菌が、受託番号DSM14998を有するラクトバチルス・ヘルベチカス菌又はその突然変異体である、請求項7に記載の乳酸菌の取得方法。
抗高血圧特性を有するペプチドの製造方法であって、該方法が、動物乳タンパク質又は植物タンパク質を含む食材を乳酸菌で発酵して、抗高血圧特性を有するペプチドを含む発酵食材を得ることを含み、該乳酸菌が、(prtH200と名付けられる)細胞壁プロテイナーゼをコードする遺伝子配列を含むことを特徴とし、ここで該遺伝子配列は、以下の配列[センス配列(S);アンチセンス配列(A)]:
前記乳酸菌がまた、(orfF3と名付けられる)オープン・リーディング・フレームをコードする遺伝子配列を含み、ここで該遺伝子配列が、以下の配列:[センス配列(S);アンチセンス配列(A)]:
抗高血圧特性を有するペプチドの製造方法であって、該方法が、動物乳タンパク質又は野菜タンパク質を含む食材を乳酸菌で発酵して、抗高血圧特性を有するペプチドを含む発酵食材を得ることを含み、上記乳酸菌が、(prtH200と名付けられる)細胞壁プロテイナーゼをコードする遺伝子配列を含むことを特徴とし、ここで該遺伝子配列は以下の:
prtH200が、細胞壁プロテイナーゼ活性を示す酵素をコードするDNA配列であり、該DNA配列が以下の:
(a) 配列番号1の1〜5550位で表されるDNA配列;
(b) (a)で定義されるDNA配列の対応する断片に少なくとも50%同一である、少なくとも75塩基対(bp)の断片を含むDNA配列;
(c) 細胞壁プロテイナーゼ活性を示すポリペプチドであって、配列番号2の1〜1849位で表されるポリペプチドの対応する断片に少なくとも30%同一である、少なくとも200個のアミノ酸の断片を含むポリペプチドをコードするDNA配列;
(d) 配列番号1の1〜5550位で表されるDNA配列を含む二重鎖DNAプローブと低い厳密度でハイブリダイズするDNA配列;
(e) (a)、(b)、(c)、又は(d)で特定されるDNA配列の断片であるDNA配列
からなる群から選ばれるように定義される、前記方法。
前記乳酸菌がまた、(orfF3と名付けられる)オープン・リーディング・フレームをコードする遺伝子配列を含み、ここで該遺伝子配列は以下、
orfF3がオープン・リーディング・フレームをコードするDNA配列であり、該DNA配列は以下の:
(a) 配列番号3の1〜2679位で表されるDNA配列;
(b) (a)で定義されるDNA配列の対応する断片に少なくとも40%同一である、少なくとも75塩基対(bp)の断片を含むDNA配列;
(c) 配列番号4の1〜893位で表されるポリペプチド配列の対応する断片に少なくとも30%同一である少なくとも200個のアミノ酸(aa)の断片を含むポリペプチドをコードするDNA配列;
(d) 配列番号3の1〜2679位で表されるDNA配列を含む二重鎖DNAプローブと、低い厳密度でハイブリダイズするDNA配列;並びに
(e) (a)、(b)、(c)、又は(d)で特定されるDNA配列の断片であるDNA配列を含む群から選ばれるように定義される、請求項11に記載のの抗高血圧特性を有するペプチドの製造方法。
ペプチドの製造方法であって、以下のステップ:
(i) 請求項1〜8のいずれか1項に記載の乳酸菌取得方法により乳酸菌を取得し;
(ii) (i)において獲得される乳酸菌でタンパク質を含む材料を発酵して、上記ペプチドを含む発酵材料を取得するステップ
を含む前記方法。
前記方法が、抗高血圧特性を有するペプチドの製造方法であり、以下のステップ:
(i) 請求項1〜8のいずれか1項に記載の乳酸菌取得方法により乳酸菌を取得し;
(ii) (i)で取得される乳酸菌で、動物乳タンパク質又は野菜タンパク質を含む食材を発酵して、抗高血圧特性を有するペプチドを含む発酵食材を取得する
ステップを含む、請求項13に記載のペプチドの製造方法。
前記食材が、動物乳タンパク質を含む、請求項9〜14のいずれか1項に記載のペプチドの製造方法。
前記動物乳タンパク質が、カゼインである、請求項15に記載のペプチドの製造方法。
前記食材が、乳汁又は乳汁に基く材料である、請求項15に記載のペプチドの製造方法。
前記乳酸菌が、以下のステップ:
(iv) 200mlの食材を該乳酸菌で発酵し
(v) 産生されたペプチドを抽出し、そして
(vi) ACE活性(DL50)の50%を阻害するために必要とされるペプチドの濃度を計測するアッセイにより、抽出されたペプチドの抗高血圧特性を計測するステップ
を含むプロトコルにおいて、0.25〜5.0(mg/ml)のアンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害活性(DL50)を有するペプチドを産生することを可能にするタンパク質分解活性を有する、請求項9〜17のいずれか1項のペプチドの製造方法。
前記乳酸菌が、発酵菌(Firmicutes)門、より好ましくは、バチルス(Bacilli)綱、さらにより好ましくは、ラクトバチルス(Lactobacillales)目の細菌である、請求項9〜18のいずれか1項に記載のペプチドの製造方法。
前記ラクトバチルス(Lactobacillales)目の細菌が、乳酸桿菌(Lactobacillaceae)科、より好ましくは、ラクトバチルス(Lactobacillus)属の細菌、及びさらに好ましくはラクトバチルス・ヘルベチカス菌である、請求項19に記載のペプチドの製造方法。
前記細菌が、受託番号DSM14998を有するラクトバチルス・ヘルベチカス菌又はその突然変異体である、請求項20に記載のペプチドの製造方法。
前記食材の発酵が、100mlの食材あたり、0.5〜25mgの抗高血圧特性を有するペプチドを産生する条件下で行われる、請求項9〜21のいずれか1項に記載のペプチドの製造方法。
前記食材の発酵が、20〜50℃で、3〜48時間行われる、請求項9〜22のいずれか1項に記載のペプチドの製造方法。
前記食材の発酵が、pHが、pH3.5〜7の範囲である条件下で行われる、請求項9〜23のいずれか1項に記載のペプチドの製造方法。
前記発酵食材が、抗高血圧特性を有するペプチドを精製又は濃縮する方法でさらに処理される、請求項9〜24のいずれか1項に記載のペプチドの製造方法。
前記発酵食材が遠心され、そして得られた上清であって、抗高血圧特性を有する前記ペプチドを含む上清を単離する、請求項25に記載のペプチドの製造方法。
前記ペプチドが、逆相レジンを用いて上清から精製される、請求項26に記載のペプチドの製造方法。
発酵食材についてナノろ過を行う、請求項25に記載のペプチドの製造方法。
抗高血圧特性を有するペプチドを含む機能性食品の製造方法であって、該方法が、以下のステップ:
(i) 請求項9〜24のいずれか1項に記載の方法に従って、発酵食材を製造し、そして
(ii)該発酵食材を適切な方法でパッキングして、機能性食品を得るステップ
を含む、前記方法。
前記製造方法が、以下のさらなる中間ステップ:
(ia) 請求項20のステップ(i)に記載の発酵食材を、請求項25〜28のいずれか1項に記載の方法に従って、抗高血圧特性を有するペプチドを精製又は濃縮する方法でさらに処理し;
(ib) ステップ(ia)に記載の精製又は濃縮されたペプチドを、次に食材に加えるステップ
をステップ(i)と(ii)との間に含む、請求項29に記載の機能性食材の製造方法。
請求項21のステップ(ib)の食材が、請求項9〜24のいずれか1項に記載の方法に従って製造される発酵食材である、請求項30に記載の機能性食品の製造方法。
請求項25〜28のいずれか1項に記載される抗高血圧特性を有するペプチドの製造方法により得ることができる、抗高血圧特性を有するペプチド。
請求項29〜31のいずれか1項の機能性食品の製造方法により得ることができる、抗高血圧特性を有するペプチドを含む機能性食品。
高血圧治療用医薬の製造のための、請求項32に記載される抗高血圧特性を有するペプチドの使用。
高血圧治療用医薬の製造のための、請求項33に記載される抗高血圧特性を有するペプチドを含む機能性食品の使用。
受託番号DSM14998を有するラクトバチルス・ヘルベチカス菌又はその突然変異体。
鋳型DNAを、以前に記載されたフェノール-クロロホルム抽出(Marmur (1961, Journal of Molecular Biology, 3, 208-218)により得た。最終調製品は、TE緩衝液+RNAse中のゲノム鋳型DNAであった。
(i)
1.0μl 鋳型DNA
1.0μl フォワード・プライマー(5pmol/μl)
1.0μl リバース・プライマー(5pmol/μl)
1.0μl 2.5mM dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTPの混合体)
5.0μl Mg緩衝液(20mM MgSO4)
0.5μl DNAポリメラーゼ(Pwo 100U)
10.5μl H2O
(ii)
PCR増幅の熱プログラムは、94℃で1分、(プライマーのTmが55℃付近のとき) 50℃、(プライマーのTmが62℃付近のとき)55℃、(プライマーのTmが50℃付近のとき)45℃で90秒、72℃で1分を30サイクルであった。
該サンプルは、30サイクルが完了した後に4℃に冷却された。
(iii)
PCR産物を、1.5%アガロースゲル上で60Vで流し、UV光の下でゲルを切り出し、そしてQIAquick Gel Extraction KIT(Qiagen,カタログ番号28704)を、製品取扱説明書に従い使用して精製した。
実施例2:タンパク質分解(ACE)活性アッセイ
ストック・カルチャーの調製
ラクトバチルス株を、MRS寒天上にストリークし、そして嫌気的に48時間37℃でインキュベーションした。単一コロニーを拾い、MRS培養液中に植菌し、そして37℃で一晩成長させた。ラクトコッカス株は、M17寒天上にストリークし、そして30℃で好気的に48時間インキュベーションした。単一コロニーを拾い、M17培養液中に植菌し、そして30℃で一晩成長させた。これらの一晩培養したものからストックカルチャーを調製し、20%グリセロール中に-80℃で貯蔵した。
200mlの新鮮な乳汁に、実施例1の一晩培養したストックカルチャー(1%v/v)を植菌し、そして使用される菌によって37℃又は30℃で一晩維持することにより、発酵を行った。
-3000gで10分間室温で遠心し、
-上清をとり、そしてNaOHでpH8.3(ACE活性試験の最適pH)に調節し、
-得られた上清を、3000gで10分間、室温で遠心し、
-ペプチドを含む上清(乳清)をとり、
-ローリー試験(Lowry et al., 1951. J. Bio. Chem., 193:265ー275)により、乳清中のペプチドの濃度(ペプチドmg/乳性ml)を測定するプロトコル
を使用して、発酵乳からペプチドの抽出を達成した。
発酵乳のペプチド・プールは、in vitroでACE活性を試験される。DL50(mg/ml)は、ACE活性の50%を阻害するペプチド濃度である。この値が低くなればなるほど、発酵乳の抗高血圧効果は高くなる。抽出されたペプチドのACE活性は、以下のプロトコルにより計測される:
インキュベーション緩衝液: ホウ酸188mmol/l、塩化ナトリウム1.375mmol/l、pH8.3。(2.91gのホウ酸と25.63gの塩化カリウムを200mlの蒸留水中に溶解した。1mol/l水酸化カリウムでpHを8.3に調節し、そして蒸留水で250mlに希釈した。室温で貯蔵した。)
基質溶液: ヒプリル-Lーヒスチジル-Lーロイシン(HHL)5.8mmol/l
(約90mlのインキュベーション緩衝液中に250mgのヒプリル-L-ヒスチジル-L-ロイシン(HHL)を溶解し、そして同緩衝液で100mlにフィルアップした。40℃で貯蔵し、該基質溶液は、少なくとも2週間使用できる。)
ストップ溶液: 100mmol/lHEPES、2.5mmolEDTA、pH9
(23.83gのHEPESと0.93gのEDTAを800mlの蒸留水中に溶解した。1mol/l水酸化ナトリウムでpHを9に調節し、そして蒸留水で1Lに希釈した。室温で保存した。)
(12.50gの塩化シアヌルを、約400mlの1,4-ジオキサン中に溶解し、そして1,4-ジオキサンで500mlにフィルアップした。暗茶色ガラスビン中に室温で貯蔵した)
-ペプチド溶液の希釈系列を、インキュベーション緩衝液を用いて作る。希釈系列は、未希釈ペプチド溶液〜ブランク(インキュベーション溶液のみ)の6個の希釈液からなった。
-各希釈液について、10μlのペプチド溶液、40μlの基質(HHL)溶液(2.5g/l)、及び2.5μlのACE(0.25ユニット/ml)をガラス製チューブ内に配置した。
-ポジティブコントロールは、2.5μlACE、10μlインキュベーション緩衝液、40μlの基質(HHL)を含んだ。
-ネガティブコントロールは、12μlのインキュベーション緩衝液及び40μlの基質(HHL)を含んだ。
-37℃で1時間インキュベーションした。
-300μlのストップ溶液を加えることにより、反応を止め、続いて150μlの着色剤を加えて、激しく攪拌した。
-5分間静置し、そして3300gで30分間室温で遠心し、解離したタンパク質及び過剰量の塩化シアヌルを取り除いた。
-各サンプルの上清300μlを、マイクロタイター・プレートの穴に移した。
-ブランクとしての水に対する405nmの吸光度を計測した。
異なる乳酸菌株を、prtH200、orfF3、及びorfF4遺伝子配列の存在について調べた。PCR反応を実施例1に記載されるように行った。表1aは、プロテイナーゼをコードするprtH200遺伝子の存在について調べるために使用されたPCRプライマーのセットを示す。表1bは、orfF3遺伝子の存在について調べるために使用されたPCRプライマーのセットを示す。表1cは、orfF4遺伝子の存在について調べるために使用されたPCRプライマーのセットを示す。
実施例3で記載された株は、実施例2で記載されるタンパク質分解(ACE)活性試験で試験された。表3は、その結果を示す。
材料と方法
菌株と培養
菌株をMRS寒天培地上に画線し、そして嫌気的に48時間37℃でインキュベーションした。単一コロニーを拾い上げ、MRS培養液中に植菌し、そして37℃で一晩成長させた。この一晩培養した培養液からストックカルチャーを調製し、そして20%グリセロール中で-80℃で貯蔵した。この菌株を乳汁中で一晩前培養し、そして発酵用の新鮮な乳汁中に植菌した(1%(v/v))。
濃縮発酵乳:
乳汁を、単一の菌株又は混合カルチャーを用いて、1%(v/v)の植菌レベルで16時間発酵させた。産物の全てを凍結乾燥した。最初の発酵条件と同じ条件を用いて得た第二発酵産物を遠心した。ペレットを取り除き、そして乳清を0.45mmフィルターに通し、そして凍結させた。ラットに与える前に、乳性を使用して凍結乾燥粉末を溶解し、係数5になるように濃縮した。
自然発症高血圧ラット(SHR)を、IFFA CREDO(Charles River社)、リヨン、フランスから購入した。
全ての処置物質(発酵産物)を、9:00〜9:15の間に、産物の投与量2mlで強制飼養により投与した。
3つの群を作った:
群1(n=16):処置1を受けた(乳汁;n=16)
群2(n=12):連続的な処置2〜7を受けた、各投与は、3日の休薬期間をあけた。
群3(n=12):連続的な処置8〜12を受けた、各投与は、3日間の休薬期間をあけた。
以下に記載される異なった時間において、強制飼養前、強制飼養後5時間及び24時間で、目覚めているSHRの最大血圧をプレチスモグラフィーにより測定した。
菌株及び培養並びにSHRラット:実施例5と同じ
サンプル調製
発酵乳:
乳汁を、単一菌株又は混合菌株を用いて植菌レベル1%(v/v)で、16時間発酵させた。産物全体を凍結乾燥させた。最初と同じ条件で発酵させた第二発酵産物を遠心した。ペレットを取り除き、そして乳清を0.45mmフィルターを通してろ過し、そして凍結させた。この乳清は、凍結乾燥粉末を溶解するために使用され、ラットに与える前に異なる係数で濃縮した。
動物:自然発症高血圧ラット(22週齢)
群: 1)偽薬(乳汁)
2)サンプル1(3の用量で濃縮されたの異なる3の乳清で投与される発酵乳。用量1:係数1、用量2:係数2.5、用量3:係数5)
3)サンプル2(中性pHの乳汁中に懸濁される凍結乾燥発酵乳)
4)サンプル3(発酵乳産物のみ)
5)サンプル4(発酵後に熱処理された発酵乳)
6)サンプル5(発酵されていないが、生菌を含む乳汁)
全ての結果は、平均値±標準誤差として表される。
(受託番号DSM14998で寄託される)ラクトバチルス・ヘルベチカスCHCC5951株を標準MRS培地中で一晩37℃で成長させた。クロモソームDNAを、QiagenKItを使用することにより単離した。単離クロモソームDNAを完全に制限酵素SmaIで切断した(製品説明書に従って行った)。
CHEF Mapper XA Systemを使用し、パルス時間2〜30秒、直線勾配(linearly ramped)、5.3V/cmで24時間、1.1%アガロース、1/2×TBE、14℃であった。
ゲルを泳動するために使用したプログラムは以下のとおりである。
得られたアガロースゲルは、図1に示される。12個のバンドのサイズは:
バンド番号1:283kbp
バンド番号2:259kbp
バンド番号3:219kbp
バンド番号4:138kbp
バンド番号5:127Kbp
バンド番号6:119kbp
バンド番号7:106kbp
バンド番号8:88kbp
バンド番号9:71kbp
バンド番号10:59kbp
バンド番号11:54Kbp
バンド番号12:46kbp
である。
本発明に関して関連があると考えられる参照分権を以下に記載する。
Yamamoto et al, (1994), J Dairy Sci., 77: 917-922
Gobbetti M. et al(2000), Appl Environ Microbiol, 66 (9), 3898-3904
EP821968
EP1016709
WO01/32836
Pederson et al (1999), J. of Bacteriology, 181: 4592-4597
Yamamoto et al (2000), Biosci. Biotechnol. Biochem., 64(6): 1217-1222
EP058074
Claims (9)
- 抗高血圧特性を有するペプチドの製造方法であって、該方法が、動物乳タンパク質又は植物タンパク質を含む食材を受託番号DSM14998のラクトバチルス・ヘルベチカス(Lactobacillus helveticus)株で発酵して、抗高血圧特性を有するペプチドを含む発酵食材を得ることを含む、前記方法。
- 前記食材が、動物の乳タンパク質を含む、請求項1に記載のペプチドの製造方法。
- 前記動物の乳タンパク質が、カゼインである、請求項2に記載のペプチドの製造方法。
- 前記食材が、乳汁又は乳汁に基く材料である、請求項1に記載のペプチドの製造方法。
- 抗高血圧特性を有するペプチドを含む機能性食品の製造方法であって、当該方法が以下のステップ:
動物乳タンパク質又は植物タンパク質を含む食材を受託番号DSM14998のラクトバチルス・ヘルベチカス株で発酵して、抗高血圧特性を有するペプチドを含む発酵食材を製造し、そして
当該発酵食材を適切な方法でパッキングして機能性食品を得るステップ
を含む、前記方法。 - 前記食材が、動物の乳タンパク質を含む、請求項5に記載の機能性食品の製造方法。
- 前記動物の乳タンパク質が、カゼインである、請求項6に記載の機能性食品の製造方法。
- 前記食材が、乳汁又は乳汁に基く材料である、請求項5に記載の機能性食品の製造方法。
- 受託番号DSM14998のラクトバチルス・ヘルベチカス株。
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