JP2010142231A - 抗高血圧特性を有するペプチドの製造方法 - Google Patents

抗高血圧特性を有するペプチドの製造方法 Download PDF

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Abstract

【課題】抗高血圧特性を有するペプチドの作成に関して特に改良された特徴を有する乳酸菌(ＬＡＢ)の取得方法を提供する。
【解決手段】ｐｒｔＨ２００細胞壁プロテイナーゼを有する乳酸菌（ラクトバチルス・ヘルベチカスＤＳＭ１４９９８）、及び上記乳酸菌の使用による、抗高血圧特性を有するペプチドの製造方法。前記乳酸菌を用いた機能性食品の製造方法、及び上記機能性食品。また、高血圧治療用医薬の製造のための、上記機能性食品の使用。
【選択図】図１

Description

発明の分野
本発明は、抗高血圧特性を有するペプチドを製造するために、約２００ｋＤａの細胞壁プロテイナーゼを含む乳酸菌を使用すること、及びそうした乳酸菌の取得方法に関する。
背景技術の記載
高血圧は、先進工業国において、心発作に関する最も主要な危険因子のうちの一つであると報告されている。高血圧は、アンジオテンシン変換酵素(ＡＣＥ)を強く阻害する薬剤で治療されることが多い。疾患発達の初期段階で、高血圧を予防することは、薬剤による高血圧の治療の代わりとなりうる。現在では、多数の食物由来の生理活性化合物が、健康に有益であり、また健康を促進すると考えられている。
血圧制御において、アンジオテンシンＩ変換酵素(ＡＣＥ)は、重要な役割を果たす。ＡＣＥは、血圧を増大するように作用する。レニン-アンジオテンシン系において、ＡＣＥは、アンジオテンシンＩを、そのＣ末端のＨｉｓ-Ｌｅｕを加水分解することにより、アンジオテンシンＩＩへと変換する。アンジオテンシンＩＩは、強い血管収縮性作用を示す。さらに、キニン-カリクレイン系において、ＡＣＥは、血管拡張を助けるブラジキニンを不活性化する。ＡＣＥ阻害剤はそれゆえ、血圧低減に有用である。現在、幾つかのＡＣＥ阻害剤が既に存在している。最初に報告されたＡＣＥ阻害剤は、蛇毒中に見つかった天然ペプチドであった。それから、多くの他のＡＣＥ阻害剤が発見されてきた。
乳酸菌(ＬＡＢ)により発酵された乳汁は、乳酸菌のタンパク質分解活性によって乳汁中のカゼインからペプチドが遊離することに起因する抗高血圧効果を作り出しうるということが知られている。このペプチドはＡＣＥ阻害剤として作用する。
カルピス食品工業(the company Calpis Food Industry)の論文[Yamamoto et al(1994, J. Dairy Sci., 77: 917-922)は、ラクトバチルス・ヘルベチカスＣＰ７９０株(Lactobacillus helveticus CP790 strain)による乳汁発酵が、抗高血圧効果をもたらし、この効果は、エル・ヘルベチカス(L.helveticus)のタンパク質分解活性によって乳汁中カゼインからペプチドが遊離することに起因するということを開示した。このペプチドは、ＡＣＥ阻害剤として作用する。これらのペプチドの抗-高血圧特性は、自然発症高血圧ラットにおいて試験された。タンパク質分解活性を持たないエルビー.ヘルベチカス(Lb.helveticus)の同系突然変異体による乳汁発酵は、抗高血圧効果を示さなかった。
論文[Gobbetti M. et al (2000, Appl Environ Microbiol, 66 (9), 3898-3904.]は、乳汁を発酵するためのラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＦＴ４(Lactococcus lactis subsp. cremoris FT4)又はラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスＳＳ１(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus SS1)を使用することによって生産されるＡＣＥ阻害ペプチドを含む発酵乳を記載した。
EP821968(カルピス食品工業)は、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ-４８３５のラクトバチルス・ヘルベチカス株を使用することによって生産されるＡＣＥ-阻害ペプチドを含む発酵乳を記載する。
EP1016709(カルピス食品工業)は、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ-６０６０のラクトバチルス・ヘルベチカス株を使用することにより生産されるＡＣＥ阻害ペプチドを含む発酵乳を記載する。
WO01/32836(Valio Ltd)は、受託番号DSM 13137のラクトバチルス・ヘルベチカス株を使用することにより生産されるＡＣＥ阻害ペプチドを含む発酵乳を記載する。
乳酸菌(ＬＡＢ)は幾つかのアミノ酸について栄養要求性であるので、ＬＡＢは、乳汁中で成長する間、複合的なタンパク質分解系に依存して必須アミノ酸を得る。カゼインを、ＬＡＢにより利用されるアミノ酸へ加水分解することは、カゼインをオリゴペプチドへと加水分解する細胞壁プロテイナーゼにより開始される。オリゴペプチドは、次にオリゴペプチド輸送システムを通して、細胞壁中へ輸送される。オリゴペプチドがひとたび細胞内に入ると、細胞内ペプチダーゼがオリゴペプチドを遊離アミノ酸へと加水分解する。
ウィスコンシン大学及びユタ州立大学の論文[Pederson et al (1999, J. of Bacteriology, 181: 4592-4597]は、ラクトバチルス・ヘルベチカスＣＮＲＺ３２株由来のprtH ２０４ｋＤａの細胞壁プロテイナーゼのＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を記載する。この論文では、抗高血圧特性を有するペプチドを作るためにこの株を使用することについては記載されていないし、また提案されていない。
カルピス食品工業の論文[Yamamoto et al (2000), Biosci.Biotechnol. Biochem., 64 (6): 1217-1222]は、ラクトバチルス・ヘルベチカスＣＰ７９０株由来のｐｒｔＹ ４５ｋＤａの細胞壁プロテイナーゼのＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を記述する。ＣＰ７９０株は、ｐｒｔＨ ２０４ｋＤａの細胞壁プロテイナーゼを含まない[Yamamoto et al (2000)の考察を参照のこと ]。「材料と方法」の項目において「ＣＰ７９０は、日本の発酵乳製品であるカルピスのスターターカルチャーから単離された」と記述されるように、ＣＰ７９０株は、カルピス食品工業の商品において使用される。
発明の要約
本発明により解決される課題は、抗高血圧特性を有するペプチドの作成に関して特に改良された特徴を有する乳酸菌(ＬＡＢ)の取得方法を提供することである。
課題の解決方法は、本発明の発明者により、特定の細胞壁プロテイナーゼを含む乳酸菌が、そうした性質を有するということが同定されたことに基いている。この特定の細胞壁プロテイナーゼは、本明細書中でｐｒｔＨ２００と呼ばれる。本明細書中で記載されるｐｒｔＨ２００細胞壁プロテイナーゼを有する乳酸菌が、改良された抗高血圧特性を有するペプチドを作ることができるということが、本明細書中の実施例５において示される。
本明細書中に記載されるｐｒｔＨ２００プロテイナーゼは、ウィスコンシン大学及びユタ州立大学の論文[Pederson et al (1999)、上記参照]において記載されるラクトバチルス・ヘルベチカスＣＮＲＺ３２株由来のｐｒｔＨ２０４ｋＤａ細胞壁プロテイナーゼに一致する。この論文では、抗高血圧特性を有するペプチドを作るためにＣＮＲＺ３２を使用することについては、記載されていないし又は提案されていない。
本発明者の知る限りでは、本明細書中に記載されるｐｒｔＨ２００プロテイナーゼに対応する細胞壁プロテイナーゼを含む乳酸菌を記載しているほかの参考文献はない。
ＷＯ01/32836(Valio Ltd)で記載される受託番号ＤＳＭ１３１３７のラクトバチルス・ヘルベチカス株は、本明細書中で記載されるｐｒｔＨ２００特異的ＰＣＲプライマーにより同定できるｐｒｔＨ２００細胞壁プロテイナーゼ遺伝子配列を含まないということが、本明細書中の実施例３において実験的に示された。カルピス食品工業の論文[Yamamoto et al (2000)、上記参照のこと]において説明されるように、カルピス食品工業の少なくとも１の日本の発酵乳製品は、本明細書中で記載されるｐｒｔＨ２００細胞壁プロテイナーゼを持たない株(ＣＰ７９０)を含む。
ｐｒｔＨ２００プロテイナーゼをコードする遺伝子配列が乳酸菌内に存在することは、適切に設計されたＰＣＲプライマーを使用するＰＣＲ増幅により確認されうる。当業者が、適切に設計されたＰＣＲプライマーを持っている場合、適切な特異的ＰＣＲ増幅プロトコルを行うための一般的な知識を使用して、乳酸菌に遺伝子配列が存在するかどうかを確認することはたやすいことである。
結果として、当業者は、いくつかの乳酸菌を迅速に選別し、ｐｒｔＨ２００遺伝子配列を有する株を同定し、そしてそれにより産業に関連する改良された特性を有する特異的に選ばれた乳酸菌を取得しうる。
従って、本発明の第一の態様は、乳酸菌の取得方法であって、以下のステップ：
(ｉ) 乳酸菌が、(ｐｒｔＨ２００と名づけられる)細胞壁プロテイナーゼをコードする遺伝子配列を含む乳酸菌であるかを調べ、（ここで該遺伝子配列は、以下の[センス配列(Ｓ)；アンチセンス配列(Ａ)]：
からなる群から選ばれるＰＣＲプライマー・セットを使用して、上記乳酸菌のゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅することにより同定できる）；そして
(ｉｉ) もし該乳酸菌が、ステップ(ｉ)の判定基準を満たすなら、該乳酸菌を取得し；又は
(iii) もし乳酸菌が、ステップ(ｉ)の判定基準を満たさないなら、別の乳酸菌についてステップ(ｉ)を繰り返すステップ
を含む前記方法に関する。
但し、上記乳酸菌がラクトバチルス・ヘルベチカスＣＮＲＺ３２株である場合を除く。
「ラクトバチルス・ヘルベチカスＣＮＲＺ３２株」という用語は、ウィスコンシン大学及びユタ州立大学の論文 [Pederson et al (1999)、上記参照のこと]において記載される株のことを指す。
ラクトバチルス・ヘルベチカスＤＳＭ１４９９８のｐｒｔＨ２００のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は、配列番号１及び配列番号２に示される。
ｐｒｔＨ２００配列及びそれらに相同な配列に基いて、適切なＰＣＲプライマーは、配列番号１のｐｒｔＨ２００遺伝子及び該配列に相同な遺伝子を同定するために、ルーチンに決められる。
従って、本発明の第二の態様は、乳酸菌の取得方法であって、以下のステップ：
(ｉ) 乳酸菌が、(ｐｒｔＨ２００と名付けられる)細胞壁プロテイナーゼをコードする遺伝子配列を含む乳酸菌であるかを調べ、ここで該遺伝子配列は、
ｐｒｔＨ２００が細胞壁プロテイナーゼ活性を示す酵素をコードするＤＮＡ配列であり、該ＤＮＡ配列が、以下の：
(ａ) 配列番号１の１〜５５５０位で表されるＤＮＡ配列
(ｂ) (ａ)において定義されるＤＮＡ配列の断片に少なくとも５０％同一である少なくとも７５塩基対(ｂｐ)の断片を含むＤＮＡ配列
(ｃ) 細胞壁プロテイナーゼ活性を示すポリペプチドであって、配列番号２の１〜１８４９位で表されるポリペプチド配列の対応する断片に少なくとも３０％同一である少なくとも２００個のアミノ酸(ａａ)断片を含む、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
(ｄ) 配列番号１の１〜５５５０位で表されるＤＮＡ配列を含む二重鎖ＤＮＡプローブと低い厳密度でハイブリダイズするＤＮＡ配列；及び
(ｅ) (ａ)、(ｂ)、(ｃ)、又は(ｄ)において特定化されるＤＮＡ配列の断片であるＤＮＡ配列
からなる群から選ばれる；そして
(ii) 上記乳酸菌が、ステップ(i)の判定基準を満たすなら、次に該乳酸菌を取得し；又は
(iii) 上記乳酸菌が、ステップ(i)の判定基準を満たさないなら、次に他の乳酸菌でステップ(i)を繰り返すステップ
を含む、前記方法に関する。但し、上記乳酸菌が、ラクトバチルス・ヘルベチカスＣＮＲＺ３２株である場合を除く。
上で記載されるように、本明細書中で記載されるｐｒｔＨ２００プロテイナーゼを含む 乳酸菌の利点は、抗高血圧特性を有するペプチドの作製に関して改良された特徴である。
結果として、第三の態様において、本発明は、抗-高血圧特性を有するペプチドの製造方法に関する。該方法は、動物乳タンパク質又は野菜タンパク質を含む食材を、乳酸菌で発酵して、抗高血圧特性を有するペプチドを含む発酵食材を取得することを含み、該乳酸菌が、(ｐｒｔＨ２００と名付けられる)細胞壁プロテイナーゼをコードする遺伝子配列を含み、そして該細胞壁プロテイナーゼの存在が、以下の[センス配列(Ｓ)；アンチセンス配列(Ａ)]：
からなる群から選ばれるＰＣＲプライマー・セットを使用して、乳酸菌のゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅することにより同定できることを特徴とする。
第四の態様では、本発明は、抗高血圧特性を有するペプチドの製造方法に関する。該方法は、動物乳タンパク質又は植物タンパク質を含む食材を、乳酸菌で発酵して、抗高血圧特性を有するペプチドを含む発酵食材を取得することを含み、該乳酸菌が(ｐｒｔＨ２００と名付けられる)細胞壁プロテイナーゼをコードする遺伝子配列を含むことを特徴とする。ここで該遺伝子配列は、
ｐｒｔａＨ２００が、細胞壁プロテイナーゼ活性を示す酵素をコードするＤＮＡ配列であり、該ＤＮＡ配列が、以下の：
(ａ) 配列番号１の１〜５５５０位で表されるＤＮＡ配列
(ｂ) (ａ)において定義されるＤＮＡ配列の対応する断片に少なくとも５０％同一である少なくとも７５塩基対(ｂｐ)の断片を含むＤＮＡ配列
(ｃ) 細胞壁プロテイナーゼ活性を示すポリペプチドであって、配列番号２の１〜１８４９位で表されるポリペプチド配列の対応する断片に少なくとも３０％同一である少なくとも２００個のアミノ酸(ａａ)断片を含む上記ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
(ｄ) 配列番号１の１〜５５５０位で表されるＤＮＡ配列を含む二重鎖ＤＮＡプローブと低い厳密度でハイブリダイズするＤＮＡ配列；及び
(ｅ) (ａ)、(ｂ)、(ｃ)、又は(ｄ)において特定されるＤＮＡ配列の断片であるＤＮＡ配列
からなる群から選ばれる
と定義される。
上で説明されるように、本発明の発明者の知る限りでは、本明細書中の第三及び第四の態様に記載の方法で、本明細書中に記載される乳酸菌の使用を明確に記載する参考文献はない。但し、本出願の出願日前に、本明細書中の第三及び第四の態様に記載の方法で使用されると記載された乳酸菌が、本明細書中に記載されるｐｒｔＨ２００遺伝子配列を含むということを将来の実験が示すこともある。そうした仮定の場合では、そうした特定の乳酸菌は、本発明の第三及び第四の態様の特許請求の範囲から削除されるだろう。言い換えれば、第三及び第四の態様は、「ある特定の乳酸株を除く」と読むことができる記載を含むだろう。
本発明の第五の態様は、ペプチドの製造方法であって、以下のステップ：
(i) 本発明の第一及び第二態様に従った乳酸菌を取得する方法により、乳酸菌を取得し；
(ii) タンパク質を含む食材を、(i)で得られた乳酸菌で発酵して、上記ペプチドを含む発酵食材を取得するステップ
を含む方法に関する。
本発明の第五態様の一の実施態様は、抗高血圧特性を有するペプチドの製造方法であって、以下のステップ：
(i) 本発明の第一及び/又は第二態様に従った乳酸菌の取得方法により、乳酸菌取得し；
(ii) 動物乳タンパク質又は野菜タンパク質を含む食材を、(i)で得られた乳酸菌で発酵して、抗高血圧特性を有するペプチドを含む発酵食材を取得するステップ：
を含む方法に関する。
本発明の第三及び第四態様に関する上記但し書きは、第五態様及びその実施態様には関係しない。第五態様は、乳酸菌において、本発明で議論されるｐｒｔＨ２００プロテイナーゼの存在を積極的に調べるステップを含む。この点で、このステップは新規のステップである。
本明細書中に記載されるように作られるペプチドは、抗高血圧特性を有する機能性食品を製造するために使用されうる。
従って、本発明の第六態様は、抗高血圧特性を有するペプチドを含む機能性食品を製造することに関し、この方法は、以下のステップ：
(i) ペプチドに抗高血圧特性を有するペプチドを製造する方法に従って、発酵食材を製造し、そして
(ii) 適切な方法で該食材をパッキングして、機能性食品を得るステップ
を含む。
「パッキング」という用語は、広義に理解されるべきである。ひとたび食材が発酵されるか、発酵食材が得られるなら、発酵食材は、消費者に提供されるためにパッキングされるべきである。該食品は、ボトル、テトラパック（登録商標）などの中にパッキングされる。好ましくは、該パッケージ上に又は付随する宣伝用材料に、この機能性食品が抗高血圧特性を有するということが表示される。
第六態様の方法は、本明細書中に記載される方法の利点の一つを示す。本明細書中に記載されるｐｒｔＨ２００プロテイナーゼを含む乳酸菌を使用することにより、発酵の後に、良好の抗高血圧特性を有するペプチドの有効量が直接与えられる。その結果、発酵食材からペプチドをさらに精製し又は濃縮する必要性を考慮されない。発酵食材は、直接パッキングされ、そして市場に機能性食品として提供されうる。
第七態様では、本発明は、本明細書中に記載される抗高血圧特性を有するペプチドを製造する方法により得ることができる抗高血圧特性を有するペプチドに関する。
本明細書中で記載されるｐｒｔＨ２００プロテイナーゼを含む乳酸菌で発酵することにより生産されるペプチドは、これらのプロテイナーゼを含まない乳酸菌で発酵することにより生産されるペプチドとは異なる。このことは、本明細書中で記載されるｐｒｔＨ２００プロテイナーゼを含む乳酸菌で発酵することにより生産されるペプチドの改良された抗高血圧効果により機能的に確認された。
第八態様では、本発明は、本明細書中で記載される機能性食品を製造する方法により得ることができる抗高血圧特性を有するペプチドを含む機能性食品に関する。
第九態様では、本発明は、高血圧治療用医薬の製造のための、抗高血圧特性を有する第七態様のペプチドの使用に関する。
第十態様では、本発明は、高血圧治療用医薬の製造のための、抗高血圧特性を有する第八態様のペプチドを含む機能性食品の使用に関する。
定義：
本発明の詳細な実施態様を記述する前に、本発明の主要な態様に関わる特徴的な用語の定義を与える。
「乳酸菌」という用語は、本明細書中で、グラム陽性、非発芽性の細菌であって、糖の乳酸発酵を行う細菌の群を指す。
「遺伝子」という用語は、本明細書中で、基礎理学的及び機能的な遺伝単位として通常の意味に従って定義される。遺伝子は、特定のクロモソーム上の特定の位置に位置する秩序だったヌクレオチドの配列(例えばＤＮＡ又はＲＮＡ)であって、特定の機能的産物(つまり、タンパク質又はＲＮＡ分子)をコードする。
「縮重(degenerated)プライマーの命名法」は、当該技術分野の標準的命名法に従う。つまりＹ＝Ｃ又はＴ；Ｒ＝Ａ又はＧ；Ｍ＝Ａ又はＣ；Ｋ＝Ｇ又はＴ；Ｓ＝Ｇ又はＣ；Ｗ＝Ａ又はＴ；Ｈ＝Ａ又はＣ又はＴ；Ｂ＝Ｇ又はＴ又はＣ；Ｖ＝Ｇ又はＣ又はＡ；Ｄ＝Ｇ又はＡ又はＴ；Ｎ＝Ｇ,Ａ,Ｃ又はＴである。
断片を含むＤＮＡ/アミノ酸配列に関する「断片」という用語は、連続的かつ部分的な配列、例えば、６００個のアミノ酸を有するアミノ酸配列において７５位〜３００位のことを指す。
二つの配列間の同一性比較に関して、「対応する断片」という用語は、対応する大きさの断片に関する。好ましくは、比較される二つの断片間のサイズの違いは、５０％未満である。言い換えれば、一の断片が１００ｂｐであるなら、もう一方の断片は好ましくは１５０ｂｐ未満である。より好ましくは、比較される二つの断片間におけるサイズの違いは、２５％未満であり、さらにより好ましくは比較される二つの断片間のサイズの違いは、５％未満である。
本発明の実施態様は、一例として、以下に記載される。
図１は、ラクトバチルス・ヘルベチカスＣＨＣＣ５９５１株(受託番号第ＤＳＭ１４９９８号)のパルス・フィールド・ゲル電気泳動(ＰＦＧＥ)のフィンガープリントである。
発明の詳細な記載
ＰｒｔＨ２００細胞壁プロテイナーゼ
細胞壁プロテイナーゼの活性は、好ましくは乳酸菌の中に存在する間に確認される。適切な戦略は、分析される細胞壁プロテイナーゼをコードする遺伝子に致死変異を有する乳酸菌を構築することである。この構築された細菌のタンパク質分解活性(適切なアッセイについては以下を参照のこと)を、対応する野生型細菌の活性と比較した。対応する野生型と比較したとき、致死変異を有する乳酸菌のタンパク質分解活性の計測できる低減により、分析される細胞壁プロテイナーゼをコードする遺伝子が、活性のある乳酸細胞壁プロテイナーゼをコードする遺伝子であるということが実験的に確認されるだろう。
当業者は、適切な致死変異を有する乳酸菌の構築の仕方を知っている。例えば、上記Pederson et al (1999)及びYamamoto et al (1994)を参照のこと。
本発明の出願日において、国立バイオテクノロジー情報センター(ＮＣＢＩ)は、そのインターネットのサイト(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)で、標準ＢＬＡＳＴコンピューター・配列相同性検索を提供した。
配列番号１及び配列番号２に示されるラクトバチルス・ヘルベチカスＤＳＭ14998のｐｒｔＨ２００のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は、受託番号ＡＦ133727でGeneBankデーターベースで公表された。このデーターベースの配列識別番号は、gi|5758038|gb|AF133727.1|AF133727である。
配列番号２の1〜１８４９位で表されるｐｒｔＨ２００アミノ酸配列を、参照配列として使用する標準タンパク質-タンパク質ＢＬＡＳＴ[blastp]検索は、数ある中で以下の結果を与えた。(データーベース配列識別番号は、イタリック体で与えられる。この情報は、公表された配列を明らかに特定し、そして当業者は、これに基く配列の取得の仕方を知っている)：
gi|129346|sp|P15293|P2P LACLC : ＰＩＩ型プロテイナーゼ前駆体(ラクトセピン( (Lactocepin))(細胞壁結合セリンプロテアーゼ). 生物体: ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス(Lactococcus lactis subsp. cremoris)
同一性：配列番号２のｐｒｔＨ２００のアミノ酸配列の対応する断片に対して５０％の同一性を有する１６００個のアミノ酸断片
gi|149582|gb|AAA25248.1|:プロテイナーゼ 生物体：ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)
同一性：配列番号２のｐｒｔＨ２００のアミノ酸配列の対応する断片に対して４９％の同一性を有する１６３２個のアミノ酸断片
gi|1381114|gb|AAC41529.1|：(L48487)プロテイナーゼ前駆体 生物体:ラクトバチルスデルブレッキー(Lactobacillus delbrueckii)
同一性：配列番号２のｐｒｔＨ２００のアミノ酸配列の対応する断片に対して３２％の同一性を有する１６８２個のアミノ酸断片
gi|18568398|gb|AAL76069.1|：(AF468027)細胞外皮プロテイナーゼ 生物体：ラクトバチルス・ペントサス(Lactobacillus pentosus)
同一性：配列番号２のｐｒｔＨ２００のアミノ酸配列の対応する断片に対して６３％の同一性を有する４１５個のアミノ酸断片
gi|9963932|gb|AAGO9771.1|AF243528 1:(AF243528) 細胞外皮プロテイナーゼ
生物体：ストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)
同一性：配列番号２のｐｒｔＨ２００のアミノ酸配列の対応する断片に対して３０％の同一性を有する７８１個のアミノ酸断片
gi|482386|pir||A44833: ラクトセピン(EC 3.4.21.96) 生物体:ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)
同一性：配列番号２のｐｒｔＨ２００のアミノ酸配列の対応する断片に対して６１％の同一性を有する２６４個のアミノ酸断片
これらの特異的配列は、全て、細胞壁プロテイナーゼ活性を示すポリペプチドであって、配列番号２の１〜１８４９位で表されるポリペプチド配列の対応する断片に少なくとも３０％同一である少なくとも２００個のアミノ酸配列の断片を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を表す。
配列番号１の１〜５５５０位において示されるｐｒｔＨ２００のＤＮＡ配列を、参照配列として使用する標準ヌクレオチド-ヌクレオチドブラスト[Blastn]検索は、数ある中で、以下の結果を与えた。
gi|14958O|gb|M83946.1|LBAMPRO プロテイナーゼ(ｐｒｔＰ)遺伝子. 生物体：ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)
同一性：配列番号１のｐｒｔＨ２００ＤＮＡ配列の対応する断片に対して、８４％の同一性を有する１０２ｂｐの断片
gi|47197|emb|X14130.1|SLPRT763 細胞壁結合セリンプロテイナーゼのプラスミドpLP763ｐｒｔ遺伝子。生物体：ストレプトコッカス・ラクチス(Streptococcus lactis )
同一性：配列番号１のｐｒｔＨ２００ＤＮＡ配列の対応する断片に対して、８６％の同一性を有する８１ｂｐの断片。
gi|472834|gb|M24767.1|STRWGPROT Ｗｇ２プロテイナーゼ遺伝子。生物体：エス.クレモリス(S. cremoris)
同一性：配列番号１のｐｒｔＨ２００ＤＮＡ配列の対応する断片に対して、８６％の同一性を有する８１ｂｐの断片。
gi|149476|gb|J04962.1|LACPRASE ＰIII型プロテイナーゼ(prtP)及び成熟タンパク質。生物体：ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)
同一性：配列番号１のｐｒｔＨ２００ＤＮＡ配列の対応する断片に対して、８６％の同一性を有する８１ｂｐの断片。
gi|18568397|gb|AF468027.1| 細胞外皮プロテイナーゼ(ｐｒｔＰ)遺伝子。生物体：ラクトバチルス・ペントサス(Lactobacillus pentosus)
同一性：配列番号１のｐｒｔＨ２００ＤＮＡ配列の対応する断片に対して、８３％の同一性を有する１０２ｂｐの断片。
これらの特異的配列は、全て、配列番号１の１〜５５５０位で表されるＤＮＡ配列の対応する断片に少なくとも５０％同一である少なくとも７５塩基対(ｂｐ)の断片を含むＤＮＡ配列を示す。
他の「フィンガープリント」遺伝子配列(ｏｒｆＦ３、ｏｒｆＦ４、及びｏｒｆＦ１)：
本明細書中で記載されるｐｒｔＨ２００遺伝子配列は、乳酸菌(ＬＡＢ)の「フィンガープリント」として検出されうる。
ｏｒｆＦ３：
好ましくは、ｐｒｔＨ２００遺伝子配列とは別に、ＬＡＢはまた、本明細書中でｏｒｆＦ３と名付けられるオープン・リーディング・フレームを含む遺伝子を含む。この遺伝子は、さらなるフィンガープリントとして検出されうる。
ラクトバチルス・ヘルベチカスＤＳＭ１４９９８のｏｒｆＦ３のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は、配列番号３及び配列番号４において記載される。実施例３は、適切なプライマーに基いたｏｒｆＦ３の同定を表す。
従って、好ましい実施態様において、本明細書中に記載される乳酸菌は、ｐｒｔＨ２００遺伝子及び(ｏｒｆＦ３と名付けられる)オープン・リーディング・フレームをコードする遺伝子配列を含み、ここで該配列は、以下の[センス配列(Ｓ)；アンチセンス配列(Ａ)]からなる群から選ばれるＰＣＲプライマー・セットを使用して、乳酸菌のゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅することにより、同定される。
上記の様に、適切なＰＣＲプライマーは、本明細書中に開示される配列に基いて同定される。
従って、好ましい実施態様において、本明細書中に記載される乳酸菌は、ｐｒｔＨ２００遺伝子と(ｏｒｆＦ３と名付けられる)オープン・リーディング・フレームをコードする遺伝子配列を含み、ここで該遺伝子配列は、以下のように定義される。
ｏｒｆＦ３はオープン・リーディング・フレームをコードするＤＮＡ配列であって、該ＤＮＡ配列は以下：
(ａ)配列番号３の１〜２６７９位で表されるＤＮＡ配列
(ｂ) (ａ)において定義されるＤＮＡ配列の対応する断片に少なくとも４０％同一である少なくとも７５塩基対(ｂｐ)の断片を含むＤＮＡ配列
(ｃ)配列番号４の１〜８９３位で表されるポリペプチド配列の対応する断片に少なくとも３０％同一である、少なくとも２００個のアミノ酸断片を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
(ｄ)配列番号３の１〜２６７９位で表されるＤＮＡ配列を含む二本鎖ＤＮＡプローブと低い厳密度でハイブリダイズするＤＮＡ配列
(ｅ) (ａ)、(ｂ)、(ｃ)、又は(ｄ)において特定化されるＤＮＡ配列の断片であるＤＮＡ配列
を含む群から選ばれる。
「オープン・リーディング・フレーム」という用語は、ＤＮＡ配列であって、翻訳開始シグナル、それに正確な順で続くタンパク質を形成するために十分な長さのアミノ酸をコードするトリプレット、続いて翻訳終結シグナルを含むＤＮＡ配列を表し、それゆえタンパク質をコードする遺伝子の存在を指し示しうる。
本出願の出願日で、配列番号４の１〜８９３位で表される推定のｏｒｆＦ３アミノ酸配列を参照配列として使用するタンパク質-タンパク質ＢＬＡＳＴ[ｂｌａｓｔｐ]検索は、公表された相同性配列に関して、比較的限られた最終的な結果を与えた。
しかしながら、理論に限られることなく、本明細書中で記載されるｏｒｆＦ３遺伝子は、細胞壁プロテイナーゼをコードすると信じられる。結果として、好ましい実施態様において、本明細書中に記載されるｏｒｆＦ３遺伝子は、細胞壁プロテイナーゼをコードする。
ｏｒｆＦ４：
好ましくは、ｐｒｔＨ２００遺伝子配列とは別に、ＬＡＢはまた、本明細書中でｏｒｆＦ４と名付けられるオープン・リーディング・フレームを含む遺伝子を含む。
ラクトバチルス・ヘルベチカスＤＳＭ１４９９８のｏｒｆＦ４のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は、配列番号５及び配列番号６において示される。実施例３は、適切なプライマーに基くｏｒｆＦ４の同定を示す。
従って、好ましい実施態様において、本明細書中で記載される乳酸菌は、ｐｒｔＨ２００遺伝子及び(ｏｒｆＦ４と名付けられる)オープン・リーディング・フレームをコードする遺伝子配列を含み、ここでこの遺伝子配列は、以下の[センス配列(Ｓ)；アンチセンス配列(Ａ)からなる群から選ばれるＰＣＲプライマー・セットを使用する乳酸菌のゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅により同定できる。
上記の様に、適切なＰＣＲプライマーは、本明細書中に開示される配列に基いて同定されうる。
従って、好ましい実施態様では、本明細書中で記載される乳酸菌は、ｐｒｔＨ２００遺伝子及び(ｏｒｆＦ４と名付けられる)オープン・リーディング・フレームをコードする遺伝子配列を含み、ここで該遺伝子配列は、以下の様に定義される。
ｏｒｆ４は、オープン・リーディング・フレームをコードするＤＮＡ配列であり、該ＤＮＡ配列は、以下の：
(ａ)配列番号５の１〜４８８１位で表されるＤＮＡ配列
(ｂ)(ａ)において定義されるＤＮＡ配列の対応する断片に対して少なくとも４０％同一である、少なくとも７５塩基対(ｂｐ)の断片を含むＤＮＡ配列
(c)配列番号６の１〜１６２７位で表されるポリペプチド配列の対応する断片に少なくとも３０％同一である少なくとも２００個のアミノ酸(ａａ)の断片を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
(ｄ)配列番号５の１〜４８８１位で表されるＤＮＡ配列を含む二重鎖ＤＮＡプローブと、低い厳密度でハイブリダイズするＤＮＡ配列
(ｅ)(ａ)、(ｂ)、(ｃ)、又は(ｄ)において特定化されるＤＮＡ配列の断片であるＤＮＡ配列
を含む群から選ばれる。
本出願の出願日では、配列番号６の１〜１６２７位で表される推定ｏｒｆＦ４アミノ酸配列を参照配列として使用する標準タンパク質-タンパク質ＢＬＡＳＴ[ｂｌａｓｔｐ]検索は、公表された相同性配列に関して、比較的限られた最終的な結果を与えた。
しかしながら、理論に限られることなく、本明細書中で記載されるｏｒｆＦ４遺伝子が、細胞壁プロテイナーゼをコードするということが信じられている。結果として、好ましい実施態様では、本明細書中に記載されるｏｒｆＦ４遺伝子は、細胞壁プロテイナーゼをコードする。
好ましくは、本明細書中に記載される乳酸菌は、ｐｒｔＨ２００遺伝子、本明細書中に記載されるｏｒｆ３遺伝子及びｏｒｆ４遺伝子を含む。
ｏｒｆＦ１：
好ましくは、ｐｒｔＨ２００遺伝子配列とは別に、ＬＡＢは、本明細書中でｏｒｆＦ１と名付けられるオープン・リーディング・フレームを含む遺伝子を含む。
ラクトバチルス・ヘルベチカスＤＳＭ１４９９８のｏｒｆＦ１のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は、配列番号１９及び配列番号２０で表される。
従って、好ましい実施態様では、本明細書中に記載される乳酸菌は、ｐｒｔＨ２００遺伝子及び(ｏｒｆＦ１)と名付けられるオープン・リーディング・フレームをコードする遺伝子配列を含み、ここで該遺伝子配列は、以下のように定義される。
ｏｒｆＦ１は、オープン・リーディング・フレームをコードするＤＮＡ配列であり、該ＤＮＡ配列は、以下の：
(ａ)配列番号１９の１〜５３５８位で表されるＤＮＡ配列：
(ｂ) (ａ)において定義されるＤＮＡ配列の対応する断片に対して少なくとも４０％同一である少なくとも７５塩基対(ｂｐ)の断片を含むＤＮＡ配列
(ｃ)配列番号２０の１〜１７８５位で表されるポリペプチド配列の対応する断片に少なくとも３０％同一である少なくとも２００個のアミノ酸(ａａ)の断片を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
(ｄ)配列番号１９の１〜５３５８位で表されるＤＮＡ配列を含む二重鎖ＤＮＡプローブと、低い厳密度でハイブリダイズするＤＮＡ配列；及び
(ｅ) (ａ)、(ｂ)、(ｃ)、又は(ｄ)で特定化されたＤＮＡ配列の断片である、ＤＮＡ配列
を含む群から選ばれる。
本出願の出願日で、配列番号２０の１〜１７８５位で表される推定ｏｒｆＦ１アミノ酸配列を参照配列として使用する標準タンパク質-タンパク質ＢＬＡＳＴ[ｂｌａｓｔｐ]検索は、公表された相同性配列に関して、比較的限られた最終的な結果を与えた。
しかしながら、理論に限られることなく、本明細書中に記載されるｏｒｆＦ１遺伝子が、細胞壁プロテイナーゼをコードすることが信じられている。結果として、好ましい実施態様では、本発明中で記載されるｏｒｆＦ１遺伝子は、細胞壁プロテイナーゼをコードする。
好ましくは、本明細書中で記載される乳酸菌は、本明細書中に記載されるｐｒｔＨ２００遺伝子、ｏｒｆＦ３遺伝子、ｏｒｆＦ４遺伝子、及びｏｒｆＦ１遺伝子を含む。
パルスフィールド・ゲル電気泳動(ＰＦＧＥ)フィンガープリント
本明細書中で記載されるＬＡＢの特徴を記述する別の適切な方法は、いわゆるパルスフィールド・ゲル・電気泳動(ＰＦＧＥ)フィンガープリント技術を使用する方法である。
ＰＦＧＥフィンガープリントは、標準的な技術である。本明細書中の好ましいプロトコルは、クロモソームＤＮＡを関心の細菌から単離し、制限酵素ＳｍａＩで完全に切断し、そしてアガロースゲル上で、適切な標準分子量マーカーと共に電気泳動を行うことである。本明細書中の実施例７は、さらに詳細に好ましいＰＦＧＥプロトコルを記述する。
アガロース・ゲルを分析することにより、関心のＬＡＢについての特異的ＤＮＡバンドは同定される。本明細書中の図１は、本明細書中に記載される最良のラクトバチルス・ヘルベチカスＣＨＣＣ５９５１株(受託番号ＤＳＭ１４９９８で寄託された株)についての電気泳動を示す。ＣＨＣＣ５９５１株のＰＦＧＥフィンガープリントは、少なくとも１２個の特徴的なバンドを示すということを図１及び実施例７は示す。これらのバンドは以下：
バンド番号１：２８３ｋｂｐ
バンド番号２：２５９ｋｂｐ
バンド番号３：２１９ｋｂｐ
バンド番号４：１３８ｋｂｐ
バンド番号５：１２７ｋｂｐ
バンド番号６：１１９ｋｂｐ
バンド番号７：１０６ｋｂｐ
バンド番号８：８８ｋｂｐ
バンド番号９：７１ｋｂｐ
バンド番号１０：５９ｋｂｐ
バンド番号１１：５４ｋｂｐ
バンド番号１２：４６ｋｂｐ
である。
同一のＰＦＧＥフィンガープリントが、上記背景技術部分で記載されるカルピス食品工業及びValio Ltdの菌株を含む多数の菌株で作られた。
試験された菌株は、どれも２８３ｋｂｐのバンド番号１及び２１９ｋｂｐのバンド番号３に対応する２個のバンドの組み合わせを含まなかった。さらに、試験された菌株はどれも、４６ｋｂｐのバンド番号１２に対応するバンドを含まなかった。
これらのバンドは、本明細書中に記載されるＬＡＢの改良された特徴に関する情報をコードする。
従って、好ましい実施態様では、本明細書中に記載される乳酸菌は、ｐｒｔＨ２００遺伝子、並びに受託番号ＤＳＭ１４９９８を有するラクトバチルス・ヘルベチカス菌のＰＦＧＥフィンガープリントの２８３ｋｂｐのバンドと２１９ｋｂｐのバンドに対応する二つのＰＦＧＥフィンガープリントの組み合わせを含む。ここで、該ＰＦＧＥフィンガープリントは、乳酸菌のクロモソームＤＮＡを単離し、該クロモソームＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩで完全に切断し、そして切断されたＤＮＡをアガロースゲル上で電気泳動することを含むプロトコルにより成される。
「ＰＦＧＥフィンガー・プリントのバンドであって、受託番号ＤＳＭ１４９９８を有するラクトバチルス・ヘルベチカス菌についてのＰＦＧＥフィンガー・プリントの特記されたサイズのバンドに対応するバンド」という用語は、ラクトバチルス・ヘルベチカスＤＳＭ１４９９８が、参照の菌株としてみなされうるという意味で理解されるべきである。好ましくは、同じプロトコルを使用して関心のＬＡＢの同様のＰＦＧＥフィンガープリントと、ラクトバチルス・ヘルベチカスＤＳＭ１４９９８のフィンガープリントを作るべきである。関心のＬＡＢとラクトバチルス・ヘルベチカスＤＳＭ１４９９８の切断されたＤＮＡは、その後に適切な分子量マーカーと一緒に、同一のアガロースゲル上で電気泳動されうる。電気泳動されたアガロースゲルを分析することにより、当業者は次に、ルーチン技術を使用することにより、関心のＬＡＢが、ラクトバチルス・ヘルベチカスＤＳＭ１４９９８についての特記された大きさのバンドに対応するバンドを含むかどうかを測定する。当業者に知られるように、大きさがわずかに変化しうる。本文脈において、そうしたわずかな変化は、好ましくは５ｋｂｐの範囲内であるべきである。従って、ラクトバチルス・ヘルベチカスＤＳＭ１４９９８の参照バンドが、例えば２８３ｋｂｐであるなら、関心の分析されたＬＡＢの対応するバンドは、好ましくは、２８３ｋｂｐ±５ｋｂの大きさであるはずである。
別の好ましい実施態様では、本明細書中で記載される乳酸菌は、ｐｒｔＨ２００遺伝子、及び受託番号ＤＳＭ１４９９８のラクトバチルス・ヘルベチカス菌についてのＰＦＧＥフィンガープリントの４６ｋｂｐのバンドに対応するＰＦＧＥフィンガープリントのバンドを含む。ここで該ＰＦＧＥフィンガープリントは、乳酸菌のクロモソームＤＮＡを単離し、クロモソームＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩで完全に切断し、そしてアガロースゲル上で切断されたＤＮＡを電気泳動することを含むプロトコルにより成される。
同様に分析されるとき、本明細書中で記載される乳酸菌が、以下のフィンガープリントのバンドの全てを含むことがより好ましい。
ラクトバチルス・ヘルベチカスＤＳＭ１４９９８の２８３ｋｂｐのバンドに対応するバンド
ラクトバチルス・ヘルベチカスＤＳＭ１４９９８の２１９ｋｂｐのバンドに対応するバンド
ラクトバチルス・ヘルベチカスＤＳＭ１４９９８の４６ｋｂｐのバンドに対応するバンド
最も好ましくは、本明細書中に記載される乳酸菌は、ラクトバチルス・ヘルベチカスＤＳＭ１４９９８について上で与えられた１２個のＰＦＧＥフィンガープリント・バンドの全てに対応するバンドを含む。
ＰＣＲ増幅
上記されるように、本明細書中に記載される遺伝子配列の存在は、好ましくは本明細書中の教示に従って設計されたＰＣＲプライマーを使用するＰＣＲ増幅により確認される。当業者が、適切に設計されたＰＣＲプライマーを持つ場合、適切な特意的ＰＣＲ増幅プロトコルを行う一般的な知識を使用して乳酸菌の遺伝子の有無を確認することは、当業者にとってたやすいことである。
好ましくは、ＰＣＲ増幅プロトコル(反応)は、本明細書中の実施例１の記載に従って行われる。
ひとたびＰＣＲが行われると、得られたＰＣＲ増幅断片が、本明細書中で記載される遺伝子の断片に一致するかどうかを調べることは、当業者にとってルーチンである。通常、一致するかどうかは、ＰＣＲ断片の大きさに基いてすでに同定されているかもしれない。なぜなら、当業者は一般的に、所望のＰＣＲ断片の大きさを大体知っているからである。所望のＰＣＲ断片は、本明細書中に記載される遺伝子のＰＣＲ断片に合致する。或いは、ＰＣＲ断片は、ＤＮＡ配列を決定され、そして得られたＤＮＡ配列が、本明細書中に開示される配列と比較されうる。さらに、ＰＣＲ断片に対応する遺伝子において致死変異を有する乳酸菌を構築することができる。この構築された細菌のタンパク質分解活性(以下を参照のこと)は、対応する野生型の細菌のタンパク質分解活性と比較され、そして二つの細胞におけるタンパク質分解活性の計測できる変化により、増幅されたＰＣＲ断片が、本発明の乳酸菌細胞壁プロテイナーゼをコードする遺伝子であるかどうかが実験的に確かめられるであろう。
要約すると、当業者は、本明細書中の記載に従って設計されたＰＣＲプライマーを使用して、特定の乳酸菌が、対応する所望のＰＣＲ断片を与えることができる遺伝子を含むかどうかをルーチンに同定できる。
ＰＣＲは、本明細書中に記載される遺伝子が、乳酸菌中に存在するかどうかを調べる好ましい方法である。しかしながら、例えばサザンブロット分析などの別の方法でも行われうる。
ＰＣＲプライマー：
上記で説明されるように、ＰｒｔＨ２００遺伝子に関する適切なＰＣＲプライマーは：
ＰｒｔＨ２００：(ａ)：(Ｓ)は、配列番号７で表される；ＰｒｔＨ２００：(ａ)：(Ａ)は配列番号８で表される。ＰｒｔＨ２００：(Ｂ)：(Ｓ)は、配列番号９で表される；ＰｒｔＨ２００：(ｂ)：(Ａ)は配列番号１０で表される；ＰｒｔＨ２００：(ｃ)：(Ｓ)は配列番号１１で表される：ＰｒｔＨ２００：(ｃ)：(Ａ)は配列番号１２で表される。
プライマー・セット(ａ)を使うとき、増幅されたＰｒｔＨ２００のＰＣＲ断片は、好ましくは４００ｂｐ〜８００ｂｐ、より好ましくは５００ｂｐ〜７００ｂｐの大きさであるはずである。 プライマー・セット(ｂ)を使用するとき、増幅されたＰｒｔＨ２００のＰＣＲ断片は、好ましくは２００ｂｐ〜５００ｂｐ、より好ましくは２５０ｂｐ〜３７５ｂｐの大きさであるはずである。プライマー・セット(ｃ)を使用するとき、増幅されたＰｒｔＨ２００ＰＣＲ断片は、好ましくは４００ｂｐ〜８００ｂｐ、より好ましくは５００ｂｐ〜７００ｂｐの大きさであるはずである。
最も好ましいＰｒｔＨ２００に関するＰＣＲプライマーは、プライマー・セット(ａ)及びプライマー・セット(ｂ)である。
上記の様に、ｏｒｆＦ３に関する適切なＰＣＲプライマーは、
ｏｒｆＦ３: (ａ): (Ｓ)は、配列番号１３で表される。; ｏｒｆＦ３:(ａ): (Ａ)は、配列番号１４で表される; ｏｒｆＦ３: (ｂ): (Ｓ)は、配列番号１５で表される; ｏｒｆＦ３: (ｂ): (Ａ)は、配列番号１６で表される。
プライマー・セット(ａ)を使用したとき、増幅されるｏｒｆＦ３・ＰＣＲ断片は、好ましくは１２５０〜１９００ｂｐ、より好ましくは１５００〜１７２５ｂｐの大きさであるはずである。プライマー・セット(ｂ)を使用したとき、増幅されたｏｒｆＦ３・ＰＣＲ断片は、好ましくは１２５０ｂｐ〜１９００ｂｐ、より好ましくは、１５００〜１７２５ｂｐの大きさであるはずである。
最も好ましいｏｒｆＦ３に関するＰＣＲプライマーは、プライマー・セット(ａ)である。
上記のように、ｏｒｆＦ４に関する適切なＰＣＲ断片は：
である。
ｏｒｆＦ４: (Ａ): (Ｓ)は、配列番号１７で表される; ｏｒｆＦ４: (ａ): (A)は、配列番号１８で表される。
プライマー・セット(ａ)を使用するとき、増幅されたｏｒｆＦ４・ＰＣＲ断片は、好ましくは７００ｂｐ〜１１５０ｂｐ、より好ましくは８７５ｂｐ〜１０２５ｂｐの大きさであるはずである。
ＤＮＡ配列の相同性/同一性
上記ＤＮＡ配列の相同性/同一性は、二つの配列間の同一性の程度として測定され、第二配列からの第一配列の偏差を指し示す。
本発明の出願日において、国立バイオテクノロジー情報センター(ＮＣＢＩ)は、そのインターネットサイト(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)で、標準ＢＬＡＳＴコンピューター配列相同性検索を提供した。
ＢＬＡＳＴプログラムは、[Altschul et al (1997),"Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402]で記載される。
本発明の文脈では、好ましいコンピューター相同性検索プログラムは、本出願の出願日において、ＮＣＢＩインターネットサイトにおいて特定される「標準ヌクレオチド-ヌクレオチドＢＬＡＳＴ[blastn]」検索であって、filterをLow complexity、Expectを１０に、Word Sizeを１１に設定した検索である。
参照配列は、プログラム内に導入され、そしてプログラムは、参照配列の対応する断片に対する同一性の割合と共に、公表されている配列の断片を同定する。
この標準的ヌクレオチド-ヌクレオチドＢＬＡＳＴコンピュータープログラムを使用すると、本明細書中で記載されるＰｒｔＨ２００配列は、好ましくは、配列番号１の１〜５５５０位で表されるｐｒｔＨ２００ＤＮＡ配列の対応する断片と少なくとも６０％同一である少なくとも７５塩基対(ｂｐ)の断片を含むＤＮＡ配列、より好ましくは、配列番号１の１〜５５５０位で表されるｐｒｔＨ２００ＤＮＡ配列の対応する断片に少なくとも７０％同一である少なくとも７５塩基対(ｂｐ)の断片を含むＤＮＡ配列、そしてさらに好ましくは、配列番号１の１〜５５５０位で表されるｐｒｔＨ２００ＤＮＡ配列の対応する断片に少なくとも８０％同一である少なくとも７５塩基対(ｂｐ)の断片を含むＤＮＡ配列である。
上で与えられる同一性の割合で、断片が少なくとも１００塩基対(ｂｐ)、より好ましくは、少なくとも２００塩基対(ｂｐ)、さらにより好ましくは、少なくとも４００塩基対(ｂｐ)、及び最も好ましくは少なくとも１５００塩基対(ｂｐ)であることが好ましい。
この標準ヌクレオチド-ヌクレオチドＢＬＡＳＴコンピューター・プログラムを使用すると、本明細書中で記載されるｏｒｆＦ３配列は、配列番号３の１〜２６７９位で表されるｏｒｆＦ３ＤＮＡ配列の対応する断片と少なくとも６０％同一である少なくとも７５塩基対(ｂｐ)の断片を含むＤＮＡ配列、配列番号３の１〜２６７９位で表されるｏｒｆＦ３ＤＮＡ配列の対応する断片と少なくとも７０％同一である少なくとも７５塩基対(ｂｐ)の断片を含むＤＮＡ配列、及びより好ましくは、配列番号３の１〜２６７９位で表されるｏｒｆＦ３のＤＮＡ配列の対応する断片と少なくとも８０％同一である少なくとも７５塩基対(ｂｐ)の断片を含むＤＮＡ配列である。
上で与えられる同一性の割合で、断片が少なくとも１００塩基対(ｂｐ)、より好ましくは、少なくとも２００塩基対(ｂｐ)、さらにより好ましくは、少なくとも４００塩基対(ｂｐ)、及び最も好ましくは少なくとも１５００塩基対(ｂｐ)であることが好ましい。
この標準ヌクレオチド-ヌクレオチドＢＬＡＳＴコンピューター・プログラムを使用すると、本明細書中で記載されるｏｒｆＦ４配列は、配列番号５の１〜４８８１位で表されるｏｒｆＦ４・ＤＮＡ配列の対応する断片と少なくとも６０％同一である少なくとも７５塩基対(ｂｐ)の断片を含むＤＮＡ配列、配列番号５の１〜４８８１位で表されるｏｒｆＦ４ＤＮＡ配列の対応する断片と少なくとも７０％同一である少なくとも７５塩基対(ｂｐ)の断片を含むＤＮＡ配列、及びより好ましくは、配列番号５の１〜４８８１位で表されるｏｒｆＦ４のＤＮＡ配列の対応する断片と少なくとも８０％同一である少なくとも７５塩基対(ｂｐ)の断片を含むＤＮＡ配列である。
上で与えられる同一性の割合で、断片が少なくとも１００塩基対(ｂｐ)、より好ましくは、少なくとも２００塩基対(ｂｐ)、さらにより好ましくは、少なくとも４００塩基対(ｂｐ)、及び最も好ましくは少なくとも１５００塩基対(ｂｐ)であることが好ましい。
或いは、相同性/同一性は、当該技術分野に周知のコンピューター・プログラム、例えばＧＣＧプログラム・パッケージ(ウィスコンシン・パッケージに対するプログラムマニュアル、第八版、1994年8月,Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman,S. B. and Wunsch,C. D. ,(1970),Journal of Molecular Biology,48,443-453)において提供されるＧＡＰを用いて適切に測定されうる。
ＧＡＰをＤＮＡ配列比較について以下の設定、つまり、ＧＡＰクリエーション・ペナルティー(creation penalty)を５.０及びＧＡＰ伸張ペナルティー(extension penalty)を０.３で使用すると、ＢＬＡＳＴプログラムに関して上で与えられる好ましい同一性割合はまた、ＧＡＰを使用したときの好ましい同一性である。
アミノ酸配列に対する相同性
ヌクレオチド・ホモロジー分析に類似して、本文脈において、好ましいコンピューターホモロジー検索プログラムは、本特許出願の出願日において、ＮＣＢＩのインターネットサイトにおいて特定される「標準タンパク質-タンパク質ＢＬＡＳＴ[blastp]」検索であって、Composition-based statisticsをYes、FilterをLow complexity、Expectを１０、Word Sizeを３、MatrixをBLOSUM 62、Gap CostsをExistance 11 Extension1に設定する検索である。
この標準タンパク質-タンパク質ＢＬＡＳＴコンピューター・プログラムを使用すると、本明細書中で記載されるｐｒｔＨ２００配列は、好ましくは、細胞壁プロテイナーゼ活性を示すポリペプチドであって、配列番号２の１〜１８４９位で表されるｐｒｔＨ２００のポリペプチド配列の対応する断片に少なくとも４０％同一である少なくとも２００個のアミノ酸(ａａ)の断片を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、より好ましくは細胞壁プロテイナーゼ活性を示すポリペプチドであって、配列番号２の１〜１８４９位で表されるｐｒｔＨ２００のポリペプチド配列の対応する断片に少なくとも５０％同一である少なくとも２００個のアミノ酸(ａａ)の断片を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、さらにより好ましくは、細胞壁プロテイナーゼ活性を示すポリペプチドであって、配列番号２の１〜１８４９位で表されるｐｒｔＨ２００ポリペプチド配列の対応する断片に少なくとも６５％同一である少なくとも２００個のアミノ酸(ａａ)の断片を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、そして最も好ましくは、細胞壁プロテイナーゼ活性を示すポリペプチドであって、配列番号２の１〜１８４９位で表されるｐｒｔＨ２００ポリペプチド配列の対応する断片に少なくとも８０％同一である少なくとも２００個のアミノ酸(ａａ)の断片を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列である。
上で与えられる同一性の割合で、断片が少なくとも３００個のアミノ酸(ａａ)、より好ましくは、少なくとも４００個のアミノ酸(ａａ)、さらにより好ましくは少なくとも８００個のアミノ酸(ａａ)、及び最も好ましくは少なくとも１２００個のアミノ酸(ａａ)であることが好ましい。
この標準タンパク質-タンパク質ＢＬＡＳＴコンピューター・プログラムを使用すると、本明細書中で記載されるｏｒｆＦ３配列は、好ましくは少なくとも２００個のアミノ酸(ａａ)の断片を含むポリペプチドであって、配列番号４の１〜８９３位で表されるｏｒｆＦ３ポリペプチド配列の対応する断片に少なくとも４０％同一であるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、より好ましくは、少なくとも２００個のアミノ酸(ａａ)の断片を含むポリペプチドであって、配列番号４の１〜８９３位で表されるｏｒｆＦ３のポリペプチド配列の対応する断片に少なくとも５０％同一であるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、さらにより好ましくは、少なくとも２００個のアミノ酸(ａａ)の断片を含むポリペプチドであって、配列番号４の１〜８９３位で表されるｏｒｆＦ３のポリペプチド配列の対応する断片に少なくとも６５％同一であるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、及び最も好ましくは、少なくとも２００個のアミノ酸(ａａ)の断片を含むポリペプチドであって、配列番号４の１〜８９３位で表されるｏｒｆＦ３のポリペプチド配列の対応する断片に少なくとも８０％同一であるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列である。
上で与えられる同一性の割合で、断片が少なくとも３００個のアミノ酸(ａａ)、より好ましくは、少なくとも４００個のアミノ酸(ａａ)、さらにより好ましくは少なくとも８００個のアミノ酸(ａａ)、及び最も好ましくは少なくとも１２００個のアミノ酸(ａａ)であることが好ましい。
この標準タンパク質-タンパク質ＢＬＡＳＴコンピューター・プログラムを使用すると、本明細書中で記載されるｏｒｆＦ４配列は、好ましくは少なくとも２００個のアミノ酸(ａａ)の断片を含むポリペプチドであって、配列番号６の１〜１６２７位で表されるｏｒｆＦ４のポリペプチド配列の対応する断片に少なくとも４０％同一であるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、より好ましくは、少なくとも２００個のアミノ酸(ａａ)の断片を含むポリペプチドであって、配列番号６の１〜１６２７位で表されるｏｒｆＦ４のポリペプチド配列の対応する断片に少なくとも５０％同一であるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、さらにより好ましくは、少なくとも２００個のアミノ酸(ａａ)の断片を含むポリペプチドであって、配列番号６の１〜１６２７位で表されるｏｒｆＦ４のポリペプチド配列の対応する断片に少なくとも６５％同一であるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、及び最も好ましくは、少なくとも２００個のアミノ酸(ａａ)の断片を含むポリペプチドであって、配列番号６の１〜１６２７位で表されるｏｒｆＦ４のポリペプチド配列の対応する断片に少なくとも８０％同一であるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列である。
上で与えられる同一性の割合で、断片が少なくとも３００個のアミノ酸(ａａ)、より好ましくは、少なくとも４００個のアミノ酸(ａａ)、さらにより好ましくは少なくとも８００個のアミノ酸(ａａ)、及び最も好ましくは少なくとも１２００個のアミノ酸(ａａ)であることが好ましい。
或いは、相同性は、当該技術分野に周知であるコンピュータープログラム、例えばＧＣＧプログラム・パッケージ(ウィスコンシン・パッケージのプログラム・マニュアル、第八版、1994年8月, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. and Wunsch, C.D.,(1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453)で提供されるＧＡＰなどを用いて、適切に測定されうる。
ポリペプチド配列比較について以下の設定：ＧＡＰクリエーション・ペナルティー(creation penalty)を３.０及びＧＡＰ伸張ペナルティー(extension penalty)を０.１で使用すると、ＢＬＡＳＴプログラムに関して上で与えられる好ましい同一性の割合はＧＡＰを使用した時の好ましい同一性である。
ハイブリッド形成
上で記載されるハイブリッド形成は、二重鎖ＤＮＡプローブにハイブリダイズする類似のＤＮＡ配列を含むように企図される。ヌクレオチドプローブと、相同ＤＮＡ又はＲＮＡは配列とのあいだの低い、中間の、又は高い厳密度でのハイブリッド形成を測定するための適切な実験条件は、以下の手順を含む。ＤＮＡ断片又はＲＮＡを含むフィルターを、５×ＳＳＣ(塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、Sambrook et al., 1989)で１０分間予浸して、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液(Sambrook et al.,1989)、０.５％ＳＤＳ及び１００ｍｕ ｇ/ｍｌの変性され超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ(Sambrook et al.,1989)の溶液中でプレハイブリダイゼーションを行ない、続いて、１０ng/ｍｌのランダム-プライム化(Feinberg,A. P. and Vogelstein,B. (1983) Anal. Biochem. 132: 6-13)Ｐ-ｄＣＴＰ-標識プローブ(比活性＞１×１０ｃｐｍ/ｍｕ ｇ)で４５℃１２時間ハイブリッド形成させた。フィルターを次に、２×ＳＳＣ、０.５％ＳＤＳ中で、少なくとも５５℃(低厳密度)、より好ましくは少なくとも６０℃(中厳密度)、より好ましくは少なくとも６５℃(中/高厳密度)、さらに好ましくは少なくとも７０℃(高厳密度)、さらに好ましくは７５℃(超高厳密度)の温度で３０分間二回洗浄した。
これらの条件下でオリゴヌクレオチドプローブがハイブリッド形成する分子は、Ｘ線フイルムを使用して検出される。
タンパク質を含む発酵可能材料
「タンパク質を含む材料を、乳酸菌で発酵する」などの表現における「タンパク質を含む材料」という用語は、本明細書中において、乳酸菌が成長することができ、それゆえペプチドを含む発酵材料を得ることを可能にするタンパク質を含む材料の全てを指す。ペプチドは、タンパク質の加水分解に基く乳酸菌細胞壁プロテイナーゼにより得られるペプチドとして理解されるべきである。
例えば、タンパク質を含む材料は、適切な標準乳酸菌発酵培地、例えばＭ１７培養液又はＭＲＳ培養液でありうる。好ましくは、培地は、乳タンパク質構成要素、例えば動物乳汁全体又は脱脂動物乳汁、或いは乳カゼインなどの乳タンパク質要素により好ましく列挙される動物乳タンパク質を含む。
食材
食材は、動物乳タンパク質又は野菜タンパク質を含むべきである。
好ましくは、食材は、動物乳汁全体若しくは脱脂動物乳汁又は乳カゼインなどの乳タンパク質構成要素により列挙される動物乳タンパク質を含む。
野菜タンパク質を有する食材は、好ましくは、トウモロコシ、トウモロコシタンパク質、小麦、小麦タンパク質、ダイズ、脱脂ダイズ又はダイズ・タンパク質により列挙されうる。
乳酸菌
「乳酸菌」という用語は、本明細書中で、グラム陽性の非出芽菌であって、糖の乳酸発酵を行う菌の群を指す。
数ある中で特に、乳酸菌は、ラクトバチルス(Lactobacillus)属に属する乳酸菌、例えば、ラクトバチルス・ヘルベチカス(Lactobacillus helveticus)、ラクトバチルス・デルブレッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス(Lactobacillus delbruekii subsp. bulgaricus)など、ラクトコッカス属に属する乳酸菌、例えば、ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)など、ストレプトコッカス属に属する乳酸菌、例えば、ストレプトコッカス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サーモフィルス(Streptococcus salivarius subsp. thermophilus)、ルコノストック属に属する乳酸菌、例えば、ルコノストック・ラクチス(Leuconostoc lactis)、ビフィドバクテリウム属に属する乳酸菌、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)又はビフィドバクテリウム・ブレーブ(Bifidobacterium breve)など、並びにペディノコッカス属に属する乳酸菌を含む。
乳酸菌は、他の微生物、例えば酵母などとの混合体として使用されうる。
多数の異なる乳酸菌を、当業者が公共利用できる。例えば、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ); 及びインターネット上のＮＣＢＩの分類学ブラウザ[出願日においては、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/で利用できる]を参照のこと。
適切な特異的乳酸菌を同定するために、例えば、適切な量の異なる公衆に利用可能な細菌を簡単に取得し、そして本発明に記載される遺伝子配列を含む特異的な株を１以上同定することは、当業者にとって決まりきった仕事である。好ましくは、この過程は、本明細書中に記載されるＰＣＲ増幅プロトコルにより行われる。
好ましくは、乳酸菌は、発酵菌(Firmicutes)門(Phylum Firmicutes)、より好ましくは、バチルス(Bacilli)綱、さらに好ましくはラクトバチルス(Lactobacillales)目の細菌である。該目のうちで、好ましい乳酸菌は、乳酸桿菌(Lactobacillaceae)科の細菌であり、より好ましくはラクトバチルス属の細菌である。最も好ましくは、該乳酸菌は、ラクトバチルス・ヘルベチカス株である。生物分類学に関しさらに詳述するために、(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology,第二版,第一巻: The Archea and the Deeply Branching and Phototrophic Bacteria)を参照のこと。
特に好ましいラクトバチルス・ヘルベチカス株CHCC5951のサンプルは、ＤＳＭＺ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)に、受託番号ＤＳＭ１４９９８、２００２年５月１５日付けで寄託された。寄託は、特許手続きの目的のため、微生物寄託を国際的に認めるブダペスト条約の条件に従って行われた。
従って、特に好ましい実施態様は、本明細書中に記載される方法に関連しており、ここで、乳酸菌は、受託番号ＤＳＭ１４９９８のラクトバチルス・ヘルベチカスである。
この関係において、本発明の別の態様は、登録番号ＤＳＭ１４９９８を有するラクトバチルス・ヘルベチカス菌、又はそれらの変異体に関する。
開始材料として寄託されたＤＳＭ１４９９８株を使用すると、当業者は、慣用の突然変異誘発技術又は再単離技術により、抗高血圧特性を有するペプチドを調製するために適した能力を保持する突然変異体又は誘導体をさらに取得できる。
さらに、ラクトバチルス・ヘルベチカス株CHCC4080のサンプルは、ＤＳＭＺ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)において、受託番号ＤＳＭ１４９９７、２００２年５月１５日の受託日付で寄託された。寄託は、特許手続きの目的のため、微生物寄託を国際的に認めるブダペスト条約の条件に従って行われた。
乳酸菌のタンパク質分解活性
本明細書中に記載されるｐｒｔＨ２００、ｏｒｆＦ３、及びｏｒｆＦ４遺伝子配列は、本明細書中に記載されるように有用な乳酸菌を同定するために、特に適したフィンガープリントとして見ることができる。理論に限られることなく、本明細書中に記載されるフィンガープリント遺伝子配列を含むにもかかわらず、本明細書中に記載される有利な性質を示さない株が存在するということが理論的にありうる。
従って、本明細書中に記載されるフィンガープリント遺伝子配列の存在が、乳酸菌において同定されたなら、乳酸菌のタンパク質分解活性を試験することは都合の良いことでありうる。本文脈において、好ましい乳酸菌は、以下に記載される好ましいタンパク質分解活性を有する。
本文脈において、活性細胞壁プロテイナーゼを合成することができるとき、乳酸菌は、タンパク質分解活性を有すると考えられる。 言い換えれば、細菌の細胞内部分の外側で活性のあるプロテイナーゼを提供することができる。さらに、プロテイナーゼは、タンパク質(例えば乳中に含まれるカゼイン)を分解して、抗高血圧特性を有するペプチドを得ることを可能にする特異性を持つべきである。
好ましくは、細菌のタンパク質分解活性は、以下のステップ：
(ｉ) 食材２００ｍｌを該細菌で一晩発酵し、
(ｉｉ) 生産されたペプチドを抽出し、そして
(iii) ＡＣＥ活性の５０％を阻害するために必要とされるペプチド濃度を計測するアッセイにより、抽出されたペプチドの抗高血圧特性を計測するステップ
を含むプロトコルにより確定される。
ＡＣＥ阻害活性アッセイは、本明細書中でＤＬ５０と名付けられる。ＤＬ５０値が低ければ低いほど、発酵食材中に含まれるペプチドの抗高血圧効果が高くなる。
上記プロトコルのステップ(i)において、食材は、好ましくは新鮮な乳汁である。さらに、細菌は、一晩保存培養した形態で、食材に植菌され、そして適切な温度で一晩維持される。適切な温度は、この細菌の成長に適している温度である。当業者は、特定の乳酸菌に対して適した温度の同定の仕方を知っている。ラクトバチルス株では、適切な温度は３７℃であり、そしてラクトコッカス株では適切な温度は３０℃である。
本明細書中の実施例２において、発酵及び抽出ステップの詳細で好ましいプロトコル、並びにＤＬ５０・ＡＣＥ活性アッセイの詳細で好ましいプロトコルが提供される。
好ましくは、乳酸菌は、以下のステップ：
(ｉ) ２００ｍｌの食材を、該菌で一晩発酵させ、
(ii) 産生されたペプチドを抽出し、
(iii) ＡＣＥ活性の５０％を阻害するために必要とされるペプチド濃度(ＤＬ５０)を計測するアッセイにより、抽出されたペプチドの抗高血圧特性を計測するステップ
を含むプロトコルにおいて、０.２５〜５.０(ｍｇ/ｍｌ)のアンジオテンシン-変換酵素(ＡＣＥ)阻害活性(ＤＬ５０)を有するペプチドを産生する事ができるタンパク質分解活性を有する。
より好ましくは、乳酸菌は、０.２５〜４.０(ｍｇ/ｍｌ)のアンジオテンシン変換酵素(ＡＣＥ)阻害活性(ＤＬ５０)を有するペプチドを産生することができ、そしてより好ましくは、このタンパク質分解性乳酸菌は、０.２５〜３.５(ｍｇ/ｍｌ)のアンジオテンシン-変換酵素(ＡＣＥ)阻害活性(ＤＬ５０)を有するペプチドを産生することができる。
ＤＬ５０範囲の下限は、０.２５ｍｇ/ｍｌの代わりに、１.０ｍｇ/ｍｌでありうる。
発酵
本発明の方法において、食材の種類及び/又は乳酸菌の組み合わせに依存して変えられることがある稼動条件下で乳酸菌により発酵される。好ましくは、食材が既に水溶液ではないなら、食材は、適切な水性溶液に溶解され、この溶液は次に、乳酸菌と混合され、そして発酵の方法により培養される。
乳酸菌の培養は、前培養された乳酸菌スターターを、前もって熱滅菌され、そしてインキュベーションのための既定の温度へと冷まされた食材溶媒へと加えることにより行われうる。乳酸菌スターターの植菌量は、好ましくは１０5〜１０7個の乳酸菌細胞数/溶媒ｍｌでありうる。インキュベーション温度は、通常、２０℃〜５０℃であり、好ましくは３０℃〜４５℃である。インキュベーション時間は、通常３〜４８時間であり、好ましくは６〜２４時間である。特に、乳酸菌の培養を効率的に行うために、３.５〜７、より好ましくは５〜６の範囲のｐＨを有する溶媒中において培養を行うことが望ましい。さらに、４〜７の範囲でｐＨを維持するｐＨ固定培養を行うことが好ましい。インキュベーションは、乳酸菌の数が１０8細胞/ｍｌを超えたときに、制限なしに終結されうる。
好ましい実施態様は、本明細書中に記載される方法に関する。ここで、食材の発酵は、食材１００ｍｌあたり、抗高血圧特性を有するペプチド０.５〜２５ｍｇを産生する条件下、より好ましくは、食材１００ｍｌあたり、抗高血圧特性を有するペプチド１〜５ｍｇを産生する条件下で行われる。
発酵された食材からの抗高血圧ペプチドの精製
上で記載されるように、本明細書中で記載される乳酸菌の使用は、発酵の後にかなり良好の抗高血圧特性を有するペプチドの有効量を直接提供する。
しかしながら、幾つかの場合において、発酵食材から抗高血圧ペプチドの精製を引き続いて行うことが好ましいことがある。これは、ペプチドが、かなり高濃度の抗高血圧ペプチドが必要とされる医薬錠剤中に使用される場合でありうる。
従って、本発明の実施態様は、本明細書中に記載される抗高血圧特性を有するペプチドを製造するための方法に関し、ここで発酵された食材は、さらに抗高血圧特性を有するペプチドを精製又は濃縮する方法に供せられる。
例えば、抗高血圧特性を有するペプチドを含む発酵食材は、遠心され、そして得られた上清は、抗高血圧特性を有するペプチドの量が増加するサンプルを得るため、逆相レジンを用いる精製処理へと供せられる。
遠心は、好ましくは、例えば２０００〜２００００ｒｐｍで１〜２０分行われうる。遠心を遠心機内で行うこともある。
逆相レジンを用いる精製処理は逆相レジンでペプチドを吸収しそして溶出することにより行われうるし、及び/又は逆相クロマトグラフィーにより行われて、それによりペプチドの純度を増大する。
逆相レジン・プロトコルに関するさらなる技術的な詳細は、ＥＰ８２１９６８を参照のこと。
或いは、発酵食材はさらに、発酵食材にナノろ過を行う方法においてさらに加工される。ナノろ過は、乳酸又は一価イオンを発酵食材から取り除くために行われうる。
ナノろ過プロトコロルに関するさらなる技術的な詳細は、ＷＯ０１/３２９０５を参照のこと。
抗高血圧特性を有するペプチドを含む機能性食品
前述されるように、本明細書中で記載されるｐｒｔＨ２００プロテイナーゼを含む乳酸菌の使用は、かなり良好の抗高血圧特性を有するペプチドの有効量を発酵後に直接提供する。結果として、発酵食材から、ペプチドをさらに精製し又は濃縮する必要性が考慮されない。発酵食材は、直接パッキングされ、そして機能性食品として又は食品添加物として、例えばフリーズドライの形態で市場に提供されうる。
実施例６において、このことが示される。要約すると、実施例６の結果は、発酵乳がそれ自身で、さらなる処理をすることなく、血圧減退効果をさらに有するということを示す。さらにフリーズ-ドライ化された発酵乳は、天然乳に懸濁され、それにより適切な機能性食品を与えうる。フリーズドライ化された発酵乳は、それゆえ適切な食品添加製品としてみなされうる。
従って、本発明の実施態様は、抗高血圧特性を有するペプチドを含む機能性食品の製造方法に関する。該方法は、以下のステップ：
(ｉ) 本明細書中に記載される抗高血圧特性を有するペプチドを製造する方法に従って発酵食材を調製し
(ｉａ) 発酵食材を乾燥し；そして
(ｉｉ) 機能性食品をえるために適切な方法で乾燥発酵食材をパッキングするステップ
を含む。
ステップ(ia)は、好ましくはフリーズドライである。
言い換えれば、最終的な機能性食品をさらに処理する必要性がないので、機能性食品が発酵の間存在する乳酸菌のかなりの部分を含むということにより、特徴付けられる。実施例６は、そうした製品が、良好に作用することを明確に示し、そして、乳酸菌が多くの点において有益であると知られていることから、そうした乳酸菌が機能性食品中に存在するということは、実際に利点があるだろう。
従って、本発明の実施態様は、抗高血圧特性を有するペプチドを含む機能性食品の製造方法に関する。該方法は、以下のステップ：
(ｉｉ)本明細書中に記載される抗高血圧特性を有するペプチドの製造方法に従って発酵食材を製造し、
(ｉａ)発酵の間、存在する乳酸菌の少なくとも一部を該発酵食材中に保持し、
(ｉｉ)該発酵食材を機能性食品を得る適切な方法でパッキングする
ステップを含む。
「発酵の間存在する乳酸菌の少なくとも一部を発酵食材中に保持する」という用語は、乳酸菌を取り除くことが必要であるとは考えられないということを説明する点で理解されるべきである。細菌のいくつかは、取り除かれうる。量的に、発酵の間存在する乳酸菌の少なくとも５％を発酵食材中に保持するか、又は発酵の間存在する乳酸菌の少なくとも２０％を発酵食材中に保持するというように表現されうる。
実施例６に示されるように、熱処理された発酵食材もまた、良好の血液減少活性を有するので、機能性食品中に保持される乳酸菌は、死滅していてもよいし又は生存していてもよい。
発酵食材から抗高血圧ペプチドの精製を続いて行うことが、好ましいかもしれない。
従って、本発明の実施態様は、抗高血圧特性を有するペプチドを含む機能性食品を製造する方法に関する。この方法は、以下のステップ：
(iii) 本明細書中に記載される抗高血圧特性を有するペプチドの製造方法に従って発酵食材を製造し、
(ｉａ) ステップ(i)の発酵食材を、上で記載される方法に従って抗高血圧特性を有するペプチドを精製又は濃縮する方法でさらに処理し、
(ib) ステップ(ｉａ)の精製又は濃縮されたペプチドを次に食材に加え、そして
(iv) それを適切な方法でパッキングして、機能性食品を得る
ステップを含む。
好ましくは、ステップ(ｉｂ)の食材は、本明細書中に記載される方法に従って製造された発酵食材である。これの状況は、比較的高い濃度の抗高血圧特性を有するペプチドを、機能性食品中に所望する状況に対応する。
抗高血圧特性を有するペプチドの使用及び好ましい投与量
本発明の方法により得られる、抗高血圧特性を有するペプチドは、通常複数のペプチドの混合体であり、そして他のペプチドを含みうる。食品及び飲料としての使用のため、ペプチド及び/又はその精製された製品を含む発酵食材は、直接使用されうる。或いは、作用物は、使用前に、フリーズドライ、スプレードライ、又はドラム乾燥機乾燥により粉末化されうる。
本発明の抗高血圧ペプチドの好ましい有効量は、年齢及び個人の状態に依存して変わり、そして０.０５〜１０ｍｇ/体重ｋｇ/日の範囲内である。０.３〜３.０ｍｇ/体重ｋｇ/日の投与が好ましい。投与量が０.０５ｍｇ/体重ｋｇ/日以上であるなら、十分な効果が期待されるだろう。投与量が１０ｍｇ/体重ｋｇ/日以下であるなら、効果は効率的に示されるだろう。
コレステロール低減治療での使用
論文(Teo, K. et al., Circulation (2000) 102: 1748-1754)は、ＡＣＥ阻害剤( エナラプリル)がコレステロール低減治療、特に冠状動脈アテローム硬化症を低減する点において明確な効果を有するということを記述した。
従って、本発明の分離した態様は、本発明の方法により得られる抗高血圧特性を有するペプチドを、コレステロール低減治療、特に冠状動脈アテローム硬化症を低減することに関して使用される医薬又は機能性食品の製造のために使用することに関する。
態様及び実施態様のクレーム提示
本発明の態様及び実施態様は、いわゆる特許請求の範囲の形式で提示される。以下に与えられる本発明のいくつかの態様及び実施態様は、そうした特許請求の範囲の形式である。
請求項１.
乳酸菌の取得方法であって、以下のステップ：
(ｉ) 乳酸菌が、(ｐｒｔＨ２００と名付けられる)細胞壁プロテイナーゼをコードする遺伝子配列を含む乳酸菌であるかを調べるステップ、ここで該遺伝子配列は、以下の配列[センス配列(Ｓ)：アンチセンス配列(Ａ)]：
からなる群から選ばれるＰＣＲプライマーのセットを使用して、乳酸菌のゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅により同定でき、そして
(ｉｉ) 該乳酸菌が、ステップ(ｉ)の判定基準を満たすなら、次に該乳酸菌の培養株を取得し；又は
(iii) 該乳酸菌が、ステップ(i)の判定基準を満たさないなら、次にステップ(i)を別の乳酸菌で繰り返すステップ
を含む、前記方法。
請求項２.
ステップ(i)がまた、前記乳酸菌が、(ｏｒｆＦ３と名付けられる)オープン・リーディング・フレームをコードする遺伝子配列を含むかどうかを調べることを含み、ここで、該遺伝子配列が、以下の配列[センス配列(Ｓ)；アンチセンス配列(Ａ)]：
からなる群から選ばれるＰＣＲプライマー・セットを使用して乳酸菌のゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅することにより同定できる、請求項１に記載の乳酸菌の取得方法。
請求項３.
乳酸菌の取得方法であって、以下の：
(ｉ)乳酸菌が、(ｐｒｔＨ２００と名付けられる)細胞壁プロテイナーゼをコードする遺伝子配列を含む乳酸菌であるかを調べるステップ、ここで該遺伝子配列は、以下：
ｐｒｔＨ２００が酵素阻害細胞壁プロテイナーゼ活性を示す酵素をコードするＤＮＡ配列であり、該ＤＮＡ配列が以下の：
(ａ) 配列番号１の１〜５５５０位で表されるＤＮＡ配列
(ｂ) (ａ)において定義されるＤＮＡ配列の対応する断片に少なくとも５０％同一である少なくとも７５塩基対(ｂｐ)の断片を含むＤＮＡ配列
(ｃ) 細胞壁プロテイナーゼ活性を示すポリペプチドであって、配列番号２の１〜１８４９位で表されるポリペプチド配列の対応する断片に少なくとも３０％同一である少なくとも２００個のアミノ酸(ａａ)の断片を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列；
(ｄ) 配列番号１の１〜５５５０位で表されるＤＮＡ配列を含む二重鎖ＤＮＡプローブと、低い厳密度でハイブリダイズするＤＮＡ配列；及び
(ｅ) (ａ)、(ｂ)、(ｃ)、又は(ｄ)で特定されるＤＮＡ配列の断片であるＤＮＡ配列
からなる群から選ばれるというように定義され、
(ｉｉ) 上記乳酸菌がステップ(ｉ)の判定基準を満たすなら、次に該乳酸菌を取得し；又は
(ｉｉｉ)上記乳酸菌がステップ(ｉ)の判定基準を満たさないなら、次にステップ(ｉ)を別の乳酸菌で繰り返すステップ
を含む前記方法。
請求項４.
ステップ(ｉ)がまた、前記乳酸菌が(ｏｒｆＦ３と名付けられる)オープン・リーディング・フレームをコードする遺伝子配列を含むかどうかを調べることを含み、ここで該遺伝子配列は、以下：
ｏｒｆＦ３が、オープン・リーディング・フレームをコードするＤＮＡ配列であり、該ＤＮＡ配列が、以下の：
(ａ) 配列番号３の１〜２６７９位で表されるＤＮＡ配列
(ｂ) (ａ)で定義されるＤＮＡ配列の対応する断片に少なくとも４０％同一である、少なくとも７５塩基対(ｂｐ)の断片を含むＤＮＡ配列
(ｃ) 配列番号４の１〜８９３位で表されるポリペプチド配列の対応する断片に少なくとも３０％同一である少なくとも２００個のアミノ酸(ａａ)の断片を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
(ｄ) 配列番号３の１〜５５５０位で表されるＤＮＡ配列を含む二重鎖ＤＮＡプローブと、低い厳密度でハイブリダイズするＤＮＡ配列、並びに
(ｅ) (ａ)、(ｂ)、(ｃ)、又は(ｄ)で特定されるＤＮＡ配列の断片であるＤＮＡ配列
を含む群から選ばれるように定義される、請求項３に記載の乳酸菌の取得方法。
請求項５.
前記乳酸菌が、以下のステップ：
(ｉ)２００ｍｌの食材を前記菌で一晩発酵し；
(ｉｉ)産生されたペプチドを抽出し、そして
(iii)抽出されたペプチドの抗高血圧特性を、ＡＣＥ活性の５０％を阻害するために必要とされるペプチド濃度(ＤＬ５０)を計測するアッセイにより計測するステップ
を含むプロトコルで、０.２５〜５.０(ｍｇ/ｍｌ)のアンジオテンシン-変換酵素(ＡＣＥ)阻害活性(ＤＬ５０)を有するペプチドを産生することを可能にするタンパク質分解活性を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の乳酸菌の取得方法。
請求項６.
前記乳酸菌が、発酵菌(Firmicutes)門、より好ましくは、バチルス(Bacilli)綱、さらにより好ましくは、ラクトバチルス(Lactobacillales)目の細菌である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の乳酸菌の取得方法。
請求項７.
前記ラクトバチルス(Lactobacillales)目の細菌が、乳酸桿菌(Lactobacillaceae)科、より好ましくは、ラクトバチルス(Lactobacillus)属の細菌、そしてさらに好ましくはラクトバチルス・ヘルベチカス菌である、請求項６に記載の乳酸菌の取得方法。
請求項８.
前記細菌が、受託番号ＤＳＭ１４９９８を有するラクトバチルス・ヘルベチカス菌又はその突然変異体である、請求項７に記載の乳酸菌の取得方法。
請求項９.
抗高血圧特性を有するペプチドの製造方法であって、該方法が、動物乳タンパク質又は植物タンパク質を含む食材を乳酸菌で発酵して、抗高血圧特性を有するペプチドを含む発酵食材を得ることを含み、該乳酸菌が、(ｐｒｔＨ２００と名付けられる)細胞壁プロテイナーゼをコードする遺伝子配列を含むことを特徴とし、ここで該遺伝子配列は、以下の配列[センス配列(Ｓ)；アンチセンス配列(Ａ)]：
からなる群から選ばれるＰＣＲプライマー・セットを使用して、乳酸菌のゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅することにより同定できる、前記方法。
請求項１０.
前記乳酸菌がまた、(ｏｒｆＦ３と名付けられる)オープン・リーディング・フレームをコードする遺伝子配列を含み、ここで該遺伝子配列が、以下の配列：[センス配列(Ｓ)；アンチセンス配列(Ａ)]：
からなる群から選ばれるＰＣＲプライマー・セットを使用して乳酸菌のゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅することにより同定できる、請求項１０に記載の抗高血圧特性を有するペプチドの製造方法。
請求項１１.
抗高血圧特性を有するペプチドの製造方法であって、該方法が、動物乳タンパク質又は野菜タンパク質を含む食材を乳酸菌で発酵して、抗高血圧特性を有するペプチドを含む発酵食材を得ることを含み、上記乳酸菌が、(ｐｒｔＨ２００と名付けられる)細胞壁プロテイナーゼをコードする遺伝子配列を含むことを特徴とし、ここで該遺伝子配列は以下の：
ｐｒｔＨ２００が、細胞壁プロテイナーゼ活性を示す酵素をコードするＤＮＡ配列であり、該ＤＮＡ配列が以下の：
(ａ) 配列番号１の１〜５５５０位で表されるＤＮＡ配列；
(ｂ) (ａ)で定義されるＤＮＡ配列の対応する断片に少なくとも５０％同一である、少なくとも７５塩基対(ｂｐ)の断片を含むＤＮＡ配列；
(ｃ) 細胞壁プロテイナーゼ活性を示すポリペプチドであって、配列番号２の１〜１８４９位で表されるポリペプチドの対応する断片に少なくとも３０％同一である、少なくとも２００個のアミノ酸の断片を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列；
(ｄ) 配列番号１の１〜５５５０位で表されるＤＮＡ配列を含む二重鎖ＤＮＡプローブと低い厳密度でハイブリダイズするＤＮＡ配列；
(ｅ) (ａ)、(ｂ)、(ｃ)、又は(ｄ)で特定されるＤＮＡ配列の断片であるＤＮＡ配列
からなる群から選ばれるように定義される、前記方法。
請求項１２.
前記乳酸菌がまた、(ｏｒｆＦ３と名付けられる)オープン・リーディング・フレームをコードする遺伝子配列を含み、ここで該遺伝子配列は以下、
ｏｒｆＦ３がオープン・リーディング・フレームをコードするＤＮＡ配列であり、該ＤＮＡ配列は以下の：
(ａ) 配列番号３の１〜２６７９位で表されるＤＮＡ配列；
(ｂ) (ａ)で定義されるＤＮＡ配列の対応する断片に少なくとも４０％同一である、少なくとも７５塩基対(ｂｐ)の断片を含むＤＮＡ配列；
(ｃ) 配列番号４の１〜８９３位で表されるポリペプチド配列の対応する断片に少なくとも３０％同一である少なくとも２００個のアミノ酸(ａａ)の断片を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列；
(ｄ) 配列番号３の１〜２６７９位で表されるＤＮＡ配列を含む二重鎖ＤＮＡプローブと、低い厳密度でハイブリダイズするＤＮＡ配列；並びに
(ｅ) (ａ)、(ｂ)、(ｃ)、又は(ｄ)で特定されるＤＮＡ配列の断片であるＤＮＡ配列を含む群から選ばれるように定義される、請求項１１に記載のの抗高血圧特性を有するペプチドの製造方法。
請求項13.
ペプチドの製造方法であって、以下のステップ：
(ｉ) 請求項１〜８のいずれか１項に記載の乳酸菌取得方法により乳酸菌を取得し；
(ii) (i)において獲得される乳酸菌でタンパク質を含む材料を発酵して、上記ペプチドを含む発酵材料を取得するステップ
を含む前記方法。
請求項１４.
前記方法が、抗高血圧特性を有するペプチドの製造方法であり、以下のステップ：
(i) 請求項１〜８のいずれか１項に記載の乳酸菌取得方法により乳酸菌を取得し；
(ii) (i)で取得される乳酸菌で、動物乳タンパク質又は野菜タンパク質を含む食材を発酵して、抗高血圧特性を有するペプチドを含む発酵食材を取得する
ステップを含む、請求項１３に記載のペプチドの製造方法。
請求項１５.
前記食材が、動物乳タンパク質を含む、請求項９〜１４のいずれか１項に記載のペプチドの製造方法。
請求項１６.
前記動物乳タンパク質が、カゼインである、請求項１５に記載のペプチドの製造方法。
１７.
前記食材が、乳汁又は乳汁に基く材料である、請求項１５に記載のペプチドの製造方法。
請求項18.
前記乳酸菌が、以下のステップ：
(iv) ２００ｍｌの食材を該乳酸菌で発酵し
(ｖ) 産生されたペプチドを抽出し、そして
(vi) ＡＣＥ活性(ＤＬ５０)の５０％を阻害するために必要とされるペプチドの濃度を計測するアッセイにより、抽出されたペプチドの抗高血圧特性を計測するステップ
を含むプロトコルにおいて、０.２５〜５.０(ｍｇ/ｍｌ)のアンジオテンシン変換酵素(ＡＣＥ)阻害活性(ＤＬ５０)を有するペプチドを産生することを可能にするタンパク質分解活性を有する、請求項９〜１７のいずれか１項のペプチドの製造方法。
請求項１９.
前記乳酸菌が、発酵菌(Firmicutes)門、より好ましくは、バチルス(Bacilli)綱、さらにより好ましくは、ラクトバチルス(Lactobacillales)目の細菌である、請求項９〜１８のいずれか１項に記載のペプチドの製造方法。
請求項２０.
前記ラクトバチルス(Lactobacillales)目の細菌が、乳酸桿菌(Lactobacillaceae)科、より好ましくは、ラクトバチルス(Lactobacillus)属の細菌、及びさらに好ましくはラクトバチルス・ヘルベチカス菌である、請求項１９に記載のペプチドの製造方法。
請求項２１.
前記細菌が、受託番号ＤＳＭ１４９９８を有するラクトバチルス・ヘルベチカス菌又はその突然変異体である、請求項２０に記載のペプチドの製造方法。
請求項２２.
前記食材の発酵が、１００ｍｌの食材あたり、０.５〜２５ｍｇの抗高血圧特性を有するペプチドを産生する条件下で行われる、請求項９〜２１のいずれか１項に記載のペプチドの製造方法。
請求項２３.
前記食材の発酵が、２０〜５０℃で、３〜４８時間行われる、請求項９〜２２のいずれか１項に記載のペプチドの製造方法。
請求項２４.
前記食材の発酵が、ｐＨが、ｐＨ３.５〜７の範囲である条件下で行われる、請求項９〜２３のいずれか１項に記載のペプチドの製造方法。
請求項２５.
前記発酵食材が、抗高血圧特性を有するペプチドを精製又は濃縮する方法でさらに処理される、請求項９〜２４のいずれか１項に記載のペプチドの製造方法。
請求項２６.
前記発酵食材が遠心され、そして得られた上清であって、抗高血圧特性を有する前記ペプチドを含む上清を単離する、請求項２５に記載のペプチドの製造方法。
請求項２７.
前記ペプチドが、逆相レジンを用いて上清から精製される、請求項２６に記載のペプチドの製造方法。
請求項２８.
発酵食材についてナノろ過を行う、請求項２５に記載のペプチドの製造方法。
請求項２９.
抗高血圧特性を有するペプチドを含む機能性食品の製造方法であって、該方法が、以下のステップ：
(ｉ) 請求項９〜２４のいずれか１項に記載の方法に従って、発酵食材を製造し、そして
(ｉｉ)該発酵食材を適切な方法でパッキングして、機能性食品を得るステップ
を含む、前記方法。
請求項３０.
前記製造方法が、以下のさらなる中間ステップ：
(ｉａ) 請求項２０のステップ(ｉ)に記載の発酵食材を、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載の方法に従って、抗高血圧特性を有するペプチドを精製又は濃縮する方法でさらに処理し；
(ｉｂ) ステップ(ｉａ)に記載の精製又は濃縮されたペプチドを、次に食材に加えるステップ
をステップ(ｉ)と(ｉｉ)との間に含む、請求項２９に記載の機能性食材の製造方法。
請求項３１.
請求項２１のステップ(ｉｂ)の食材が、請求項９〜２４のいずれか１項に記載の方法に従って製造される発酵食材である、請求項３０に記載の機能性食品の製造方法。
請求項３２.
請求項２５〜２８のいずれか１項に記載される抗高血圧特性を有するペプチドの製造方法により得ることができる、抗高血圧特性を有するペプチド。
請求項３３.
請求項２９〜３１のいずれか１項の機能性食品の製造方法により得ることができる、抗高血圧特性を有するペプチドを含む機能性食品。
請求項３４.
高血圧治療用医薬の製造のための、請求項３２に記載される抗高血圧特性を有するペプチドの使用。
請求項３５.
高血圧治療用医薬の製造のための、請求項３３に記載される抗高血圧特性を有するペプチドを含む機能性食品の使用。
請求項３６.
受託番号ＤＳＭ１４９９８を有するラクトバチルス・ヘルベチカス菌又はその突然変異体。
他に記載がない限り、それぞれのステップは、標準的な方法、例えば一般的な教科書(Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J.著 "Molecular Cloning. A laboratory manual". Cold Spring Harbor Laboratories, 第二版三巻, 1989; Ausubel,F. M., et al.(eds.)"Current Protocols in Molecular Biology". John Wiley 及び Sons著,1995)において記載される方法を使用して行われる。
実施例１： ＰＣＲ増幅反応
鋳型ＤＮＡを、以前に記載されたフェノール-クロロホルム抽出(Marmur (1961, Journal of Molecular Biology, 3, 208-218)により得た。最終調製品は、ＴＥ緩衝液＋ＲＮＡｓｅ中のゲノム鋳型ＤＮＡであった。
ＰＣＲ反応を、以下の通りに行った：
(ｉ)
１.０μｌ 鋳型ＤＮＡ
１.０μｌ フォワード・プライマー(５ｐｍｏｌ／μｌ)
１.０μｌ リバース・プライマー(５ｐｍｏｌ／μｌ)
１.０μｌ ２.５ｍＭ ｄＮＴＰ(ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの混合体)
５.０μｌ Ｍｇ緩衝液(２０ｍＭ ＭｇＳＯ4)
０.５μｌ ＤＮＡポリメラーゼ(Ｐｗｏ １００Ｕ)
１０.５μｌ Ｈ2Ｏ
(ｉｉ)
ＰＣＲ増幅の熱プログラムは、９４℃で１分、(プライマーのＴｍが５５℃付近のとき) ５０℃、(プライマーのＴｍが６２℃付近のとき)５５℃、(プライマーのＴｍが５０℃付近のとき)４５℃で９０秒、７２℃で１分を３０サイクルであった。
該サンプルは、３０サイクルが完了した後に４℃に冷却された。
(iii)
ＰＣＲ産物を、１.５％アガロースゲル上で６０Ｖで流し、ＵＶ光の下でゲルを切り出し、そしてQIAquick Gel Extraction KIT(Qiagen,カタログ番号28704)を、製品取扱説明書に従い使用して精製した。
実施例２：タンパク質分解(ＡＣＥ)活性アッセイ
ストック・カルチャーの調製
ラクトバチルス株を、ＭＲＳ寒天上にストリークし、そして嫌気的に４８時間３７℃でインキュベーションした。単一コロニーを拾い、ＭＲＳ培養液中に植菌し、そして３７℃で一晩成長させた。ラクトコッカス株は、Ｍ１７寒天上にストリークし、そして３０℃で好気的に４８時間インキュベーションした。単一コロニーを拾い、Ｍ１７培養液中に植菌し、そして３０℃で一晩成長させた。これらの一晩培養したものからストックカルチャーを調製し、２０％グリセロール中に-８０℃で貯蔵した。
発酵乳の製造及びペプチドの抽出
２００ｍｌの新鮮な乳汁に、実施例１の一晩培養したストックカルチャー(１％ｖ／ｖ)を植菌し、そして使用される菌によって３７℃又は３０℃で一晩維持することにより、発酵を行った。
以下のプロトコル：
-３０００ｇで１０分間室温で遠心し、
-上清をとり、そしてＮａＯＨでｐＨ８.３(ＡＣＥ活性試験の最適ｐＨ)に調節し、
-得られた上清を、３０００ｇで１０分間、室温で遠心し、
-ペプチドを含む上清(乳清)をとり、
-ローリー試験(Lowry et al., 1951. J. Bio. Chem., 193：265ー275)により、乳清中のペプチドの濃度(ペプチドｍｇ／乳性ｍｌ)を測定するプロトコル
を使用して、発酵乳からペプチドの抽出を達成した。
乳清は、直接ＡＣＥアッセイに使用されるか、又は-２０℃で凍結される。ペプチドを含む乳清は、実施例３において「ペプチド溶液」と名付けられる。
ＡＣＥ活性アッセイ
発酵乳のペプチド・プールは、in vitroでＡＣＥ活性を試験される。ＤＬ５０(ｍｇ／ｍｌ)は、ＡＣＥ活性の５０％を阻害するペプチド濃度である。この値が低くなればなるほど、発酵乳の抗高血圧効果は高くなる。抽出されたペプチドのＡＣＥ活性は、以下のプロトコルにより計測される：
このアッセイの本質は、ＡＣＥがヒプリル-Ｌ-ヒスチジル-Ｌ-ロイシン(ＨＨＬ)基質を分解し、そして着色剤を加えて着色することである。もしペプチドが存在し、このペプチドがＡＣＥを阻害し、そしてＨＨＬ基質があまり分解されないなら、着色剤を加えた後の着色が少なくなる。
溶液調製
インキュベーション緩衝液： ホウ酸１８８ｍｍｏｌ/ｌ、塩化ナトリウム１.３７５ｍｍｏｌ/ｌ、ｐＨ８.３。(２.９１ｇのホウ酸と２５.６３ｇの塩化カリウムを２００ｍｌの蒸留水中に溶解した。１ｍｏｌ/ｌ水酸化カリウムでｐＨを８.３に調節し、そして蒸留水で２５０ｍｌに希釈した。室温で貯蔵した。)
基質溶液： ヒプリル-Ｌーヒスチジル-Ｌーロイシン(ＨＨＬ)５.８ｍｍｏｌ/ｌ
(約９０ｍｌのインキュベーション緩衝液中に２５０ｍｇのヒプリル-Ｌ-ヒスチジル-Ｌ-ロイシン(ＨＨＬ)を溶解し、そして同緩衝液で１００ｍｌにフィルアップした。４０℃で貯蔵し、該基質溶液は、少なくとも２週間使用できる。)
ストップ溶液： １００ｍｍｏｌ/ｌＨＥＰＥＳ、２.５ｍｍｏｌＥＤＴＡ、ｐＨ９
(２３.８３ｇのＨＥＰＥＳと０.９３ｇのＥＤＴＡを８００ｍｌの蒸留水中に溶解した。１ｍｏｌ/ｌ水酸化ナトリウムでｐＨを９に調節し、そして蒸留水で１Ｌに希釈した。室温で保存した。)
着色剤：１,４-ジオキサン中の１３６ｍｍｏｌ/ｌの塩化シアヌル
(１２.５０ｇの塩化シアヌルを、約４００ｍｌの１,４-ジオキサン中に溶解し、そして１,４-ジオキサンで５００ｍｌにフィルアップした。暗茶色ガラスビン中に室温で貯蔵した)
アッセイ：(全ての溶液は室温に平衡化した)
-ペプチド溶液の希釈系列を、インキュベーション緩衝液を用いて作る。希釈系列は、未希釈ペプチド溶液〜ブランク(インキュベーション溶液のみ)の６個の希釈液からなった。
-各希釈液について、１０μｌのペプチド溶液、４０μｌの基質(ＨＨＬ)溶液(２.５ｇ/ｌ)、及び２.５μｌのＡＣＥ(０.２５ユニット/ｍｌ)をガラス製チューブ内に配置した。
-ポジティブコントロールは、２.５μｌＡＣＥ、１０μｌインキュベーション緩衝液、４０μｌの基質(ＨＨＬ)を含んだ。
-ネガティブコントロールは、１２μｌのインキュベーション緩衝液及び４０μｌの基質(ＨＨＬ)を含んだ。
-３７℃で１時間インキュベーションした。
-３００μｌのストップ溶液を加えることにより、反応を止め、続いて１５０μｌの着色剤を加えて、激しく攪拌した。
-５分間静置し、そして３３００ｇで３０分間室温で遠心し、解離したタンパク質及び過剰量の塩化シアヌルを取り除いた。
-各サンプルの上清３００μｌを、マイクロタイター・プレートの穴に移した。
-ブランクとしての水に対する４０５ｎｍの吸光度を計測した。
ＡＣＥ阻害割合は、以下の数式：
により表される。
各希釈は、各自のＡＣＥ阻害割合を有し、それにより乳性のペプチド濃度に対するＡＣＥ阻害割合を示す曲線が与えられる。ＤＬ５０(ＡＣＥ活性の５０％を阻害するペプチド濃度)は、この曲線と軸上の５０％ＡＣＥ阻害点に一致する線との間の交点を読むことにより得られる。
実施例３：異なる細菌における、ｐｒｔＨ２００、ｏｒｆＦ３、及びｏｒｆＦ４遺伝子配列の存在の調査
異なる乳酸菌株を、ｐｒｔＨ２００、ｏｒｆＦ３、及びｏｒｆＦ４遺伝子配列の存在について調べた。ＰＣＲ反応を実施例１に記載されるように行った。表１ａは、プロテイナーゼをコードするｐｒｔＨ２００遺伝子の存在について調べるために使用されたＰＣＲプライマーのセットを示す。表１ｂは、ｏｒｆＦ３遺伝子の存在について調べるために使用されたＰＣＲプライマーのセットを示す。表１ｃは、ｏｒｆＦ４遺伝子の存在について調べるために使用されたＰＣＲプライマーのセットを示す。
これらの表において、増幅されたＰＣＲ断片の見積もりの長さが与えられる。見積もりの長さは、ｐｒｔＨ２００では配列番号１、ｏｒｆＦ３では配列番号３、及びｏｒｆＦ４では配列番号５に基いて決定された。
表２は、ＰＣＲに基く調査の結果を示す。
表２の所望のＰＣＲ断片は、表１で与えられる予期された大きさの範囲内であった。それらは、全てＤＮＡ配列であり、そして予期されるＤＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列を含むことが確認された。
ｒｅｆ番号５９５１で特定される株は、本発明に従ったｐｒｔＨ２００、ｏｒｆＦ３、及びｏｒｆＦ４遺伝子配列を含む。
実施例４：ＡＣＥ活性
実施例３で記載された株は、実施例２で記載されるタンパク質分解(ＡＣＥ)活性試験で試験された。表３は、その結果を示す。
実施例５： 抗高血圧特性のin vivo試験
材料と方法
菌株と培養
菌株をＭＲＳ寒天培地上に画線し、そして嫌気的に４８時間３７℃でインキュベーションした。単一コロニーを拾い上げ、ＭＲＳ培養液中に植菌し、そして３７℃で一晩成長させた。この一晩培養した培養液からストックカルチャーを調製し、そして２０％グリセロール中で-８０℃で貯蔵した。この菌株を乳汁中で一晩前培養し、そして発酵用の新鮮な乳汁中に植菌した(１％(ｖ/ｖ))。
サンプルの調製
濃縮発酵乳：
乳汁を、単一の菌株又は混合カルチャーを用いて、１％(ｖ/ｖ)の植菌レベルで１６時間発酵させた。産物の全てを凍結乾燥した。最初の発酵条件と同じ条件を用いて得た第二発酵産物を遠心した。ペレットを取り除き、そして乳清を０.４５ｍｍフィルターに通し、そして凍結させた。ラットに与える前に、乳性を使用して凍結乾燥粉末を溶解し、係数５になるように濃縮した。
自然発症高血圧ラット：
自然発症高血圧ラット(ＳＨＲ)を、ＩＦＦＡ ＣＲＥＤＯ(Charles River社)、リヨン、フランスから購入した。
全ての処置物質(発酵産物)を、９：００〜９：１５の間に、産物の投与量２ｍｌで強制飼養により投与した。
実験デザイン：
３つの群を作った：
群１(ｎ＝１６)：処置１を受けた(乳汁；ｎ＝１６)
群２(ｎ＝１２)：連続的な処置２〜７を受けた、各投与は、３日の休薬期間をあけた。
群３(ｎ＝１２)：連続的な処置８〜１２を受けた、各投与は、３日間の休薬期間をあけた。
調べられるパラメーター：
以下に記載される異なった時間において、強制飼養前、強制飼養後５時間及び２４時間で、目覚めているＳＨＲの最大血圧をプレチスモグラフィーにより測定した。
実験前に、全てのＳＨＲを動物施設に９週間順応させた。さらに、最初の強制飼養の３日前に、全ての動物を強制飼養と最大血圧の計測に慣れさせた。
群１の最大血圧を、群２及び３の最大血圧と平行して測定し、そしてコントロールとした。
強制飼養の日に、強制飼養前、並びに強制飼養後６時間及び２４時間で、血圧を測定した。
結果
異なる物質の投与後５時間及び２４時間において、測定された最大血圧の変動が、表４で示される。
ＣＨＣＣ５９５１が、最良の抗高血圧特性を有するペプチドを作ることができる乳酸菌株であるということを結果が示す。(上記)表２は、本明細書中に記載されるｐｒｔＨ２００、ｏｒｆＦ３、及びｏｒｆＦ４遺伝子を含むということを示す。２４時間では、ＣＨＣＣ５９５１株の使用により産生されたペプチドは、エナラプリル薬に匹敵する効果を有した。
ＣＨＣＣ４０８０は、遺伝子のどれも含まない。ＣＨＣＣ６３７は、ｏｒｆＦ３とｏｒｆＦ４を含むが、ｐｒｔＨ２００を含まない。
上で記載されるように、カルピス食品工業の商品は、ＣＰ７９０乳酸菌を使用することにより製造され、そして該菌は、ｐｒｔＨ２００を含まない [Yamamoto et al (2000)]。
実施例６：ＣＨＣＣ５９５１株を使用するさらなるin vivo試験
菌株及び培養並びにＳＨＲラット：実施例５と同じ
サンプル調製
発酵乳：
乳汁を、単一菌株又は混合菌株を用いて植菌レベル１％(ｖ/ｖ)で、１６時間発酵させた。産物全体を凍結乾燥させた。最初と同じ条件で発酵させた第二発酵産物を遠心した。ペレットを取り除き、そして乳清を０.４５ｍｍフィルターを通してろ過し、そして凍結させた。この乳清は、凍結乾燥粉末を溶解するために使用され、ラットに与える前に異なる係数で濃縮した。
実験デザイン：
動物：自然発症高血圧ラット(２２週齢)
群： １)偽薬(乳汁)
２)サンプル１(３の用量で濃縮されたの異なる３の乳清で投与される発酵乳。用量１：係数１、用量２：係数２.５、用量３：係数５)
３)サンプル２(中性ｐＨの乳汁中に懸濁される凍結乾燥発酵乳)
４)サンプル３(発酵乳産物のみ)
５)サンプル４(発酵後に熱処理された発酵乳)
６)サンプル５(発酵されていないが、生菌を含む乳汁)
すべての処置物質を、２ｍｌの投与量で、強制飼養により１０：００〜１０：０５に投与した。
調べられたパラメーター：最大血圧は、テレメトリー(Data Sciences Int.)により、強制飼養後２４時間異なる時間点で、目覚めているＳＨＲにおいて測定した。要するに、(一分間に渡る)最大血圧の平均と最低血圧の平均を、投与の２４時間前と投与の４８時間後において１５分間毎に記録した。
これらの追跡調査から、２４時間の最大血圧の平均と最低血圧の平均は、各群において計算された。さらに、各物質により誘導されて偽薬の同じパラメーターに対する変化量が、強制飼養後２４時間、及び強制飼養後３〜６、１２〜１５、及び２１〜２４時間の間で計算された。
実験に先立って、全てのＳＨＲは、９週間動物施設に順応させた。さらに、全ての動物を、物質の初回投与の３日前に、強制飼養に慣れさせた。
統計
全ての結果は、平均値±標準誤差として表される。
結果表
結果は、発酵乳産物を濃縮する必要がないことを示す。サンプル３は、発酵乳産物のみであり、そしてこの発酵乳産物は、凍結乾燥された濃縮発酵サンプル１(用量１,２,３)及びサンプル２に匹敵する血圧減少効果を有する。
サンプル２は、中性ｐＨ乳汁中に懸濁される凍結乾燥発酵乳汁である。このサンプルは、血圧を低下させる。このことは、本明細書中に記載される発酵産物の幅広い用途を示す。なぜなら、凍結乾燥発酵乳汁は、様々な液体中に溶解して、所望される最終的な適切な使用形態を得ることができるからである。ｐＨの違いなどの性質は、産物の血圧低減活性に影響を与えない。
発酵後の熱処理を行ったサンプル４もまた、血圧を低下させた。このサンプル中の全ての細菌は、実質的に死滅している。従って、このことは、最終製品中に生菌を有する必要性がないことを示す。
サンプル５は、発酵されていないが、生菌を含む。サンプル５は、血圧を低下させなかった。このことにより、発酵ステップが必要であることが示された。
実施例７： パルスフィールドゲル電気泳動(ＰＦＧＥ)フィンガープリント
(受託番号ＤＳＭ１４９９８で寄託される)ラクトバチルス・ヘルベチカスＣＨＣＣ５９５１株を標準ＭＲＳ培地中で一晩３７℃で成長させた。クロモソームＤＮＡを、QiagenKIｔを使用することにより単離した。単離クロモソームＤＮＡを完全に制限酵素ＳｍａＩで切断した(製品説明書に従って行った)。
切断したＤＮＡについての電気泳動条件は：
CHEF Mapper XA Systemを使用し、パルス時間２〜３０秒、直線勾配(linearly ramped)、５.３Ｖ/ｃｍで２４時間、１.１％アガロース、１/２×ＴＢＥ、１４℃であった。
ゲルを泳動するために使用したプログラムは以下のとおりである。
バンドをＧｅｌ ＣｏｍｐａｒＩＩプログラムを使用することによりコンピューター上で比較した。
バンドサイズは、三回の独立したパルス・フィールド電気泳動におけるバンドの移動距離を計測し、そして既知のバンドサイズを有する標準バンドの移動に対して、距離を補正することにより測定される。バンドサイズは、三回計測された値の平均である(±５ｋｂｐ)。
得られたアガロースゲルは、図１に示される。１２個のバンドのサイズは：
バンド番号１：２８３ｋｂｐ
バンド番号２：２５９ｋｂｐ
バンド番号３：２１９ｋｂｐ
バンド番号４：１３８ｋｂｐ
バンド番号５：１２７Ｋｂｐ
バンド番号６：１１９ｋｂｐ
バンド番号７：１０６ｋｂｐ
バンド番号８：８８ｋｂｐ
バンド番号９：７１ｋｂｐ
バンド番号１０：５９ｋｂｐ
バンド番号１１：５４Ｋｂｐ
バンド番号１２：４６ｋｂｐ
である。
参考文献：
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Claims (13)

  1. 抗高血圧特性を有するペプチドの製造方法であって、該方法が、動物乳タンパク質又は野菜タンパク質を含む食材を乳酸菌で発酵して、抗高血圧特性を有するペプチドを含む発酵食材を得ることを含み、上記乳酸菌が、(ｐｒｔＨ２００と名付けられる)細胞壁プロテイナーゼをコードする遺伝子配列を含むことを特徴とし、ここで該遺伝子配列は、
    ｐｒｔＨ２００が、細胞壁プロテイナーゼ活性を示す酵素をコードするＤＮＡ配列であり、該ＤＮＡ配列が以下の：
    (ａ) 配列番号１の１〜５５５０位で表されるＤＮＡ配列；
    (ｂ) (ａ)で定義されるＤＮＡ配列の対応する断片に少なくとも５０％同一である、少なくとも７５塩基対(ｂｐ)の断片を含むＤＮＡ配列；
    (ｃ) 細胞壁プロテイナーゼ活性を示すポリペプチドであって、配列番号２の１〜１８４９位で表されるポリペプチド配列の対応する断片に少なくとも３０％同一である、少なくとも２００個のアミノ酸の断片を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列；
    (ｄ) 配列番号１の１〜５５５０位で表されるＤＮＡ配列を含む二重鎖ＤＮＡプローブと低い厳密度でハイブリダイズするＤＮＡ配列；及び
    (ｅ) (ａ)、(ｂ)、(ｃ)、又は(ｄ)で特定されるＤＮＡ配列の断片であるＤＮＡ配列；
    からなる群から選ばれるように定義される、前記方法。
  2. 前記乳酸菌がまた、(ｏｒｆＦ３と名付けられる)オープン・リーディング・フレームをコードする遺伝子配列を含み、ここで該遺伝子配列は、
    ｏｒｆＦ３がオープン・リーディング・フレームをコードするＤＮＡ配列であり、該ＤＮＡ配列は以下の：
    (ａ) 配列番号３の１〜２６７９位で表されるＤＮＡ配列；
    (ｂ) (ａ)で定義されるＤＮＡ配列の対応する断片に少なくとも４０％同一である、少なくとも７５塩基対(ｂｐ)の断片を含むＤＮＡ配列；
    (ｃ) 配列番号４の１〜８９３位で表されるポリペプチド配列の対応する断片に少なくとも３０％同一である少なくとも２００個のアミノ酸(ａａ)の断片を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列；
    (ｄ) 配列番号３の１〜２６７９位で表されるＤＮＡ配列を含む二重鎖ＤＮＡプローブと低い厳密度でハイブリダイズするＤＮＡ配列；及び
    (ｅ) (ａ)、(ｂ)、(ｃ)、又は(ｄ)で特定されるＤＮＡ配列の断片であるＤＮＡ配列
    を含む群から選ばれるように定義される、請求項１に記載の抗高血圧特性を有するペプチドの製造方法。
  3. 前記乳酸菌がまた、受託番号ＤＳＭ１４９９８を有するラクトバチルス・ヘルベチカス(Lactobacillus helveticus)菌のＰＦＧＥフィンガープリントの２８３ｋｂｐのバンド及び２１９ｋｂｐのバンドに対応する２個のＰＦＧＥフィンガープリントのバンドの組み合わせを含み、ここで、該ＰＦＧＥフィンガープリントが、上記乳酸菌のクロモソームＤＮＡを単離し、該クロモソームＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩで完全に切断し、そして該切断されたＤＮＡをアガロースゲル上で電気泳動することを含むプロトコルにより作られる、請求項１又は２に記載の抗高血圧特性を有するペプチドの製造方法。
  4. 前記食材が、動物の乳タンパク質を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチドの製造方法。
  5. 前記動物の乳タンパク質が、カゼインである、請求項４に記載のペプチドの製造方法。
  6. 前記食材が、乳汁又は乳汁に基く材料である、請求項４に記載のペプチドの製造方法。
  7. 前記乳酸菌が、発酵菌(Firmicutes)門、より好ましくは、バチルス(Bacilli)綱、さらにより好ましくは、ラクトバチルス(Lactobacillales)目の細菌である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のペプチドの製造方法。
  8. 前記ラクトバチルス(Lactobacillales)目の細菌が、乳酸桿菌(Lactobacillaceae)科、より好ましくは、ラクトバチルス(Lactobacillus)属の細菌、及びさらに好ましくはラクトバチルス・ヘルベチカス(Lactobacillus helveticus)菌である、請求項７に記載のペプチドの製造方法。
  9. 前記細菌が、受託番号ＤＳＭ１４９９８のラクトバチルス・ヘルベチカス菌又はその突然変異体である、請求項８に記載のペプチドの製造方法。
  10. 抗高血圧特性を有するペプチドを含む機能性食品の製造方法であって、該方法が以下のステップ：
    (iii) 請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法に従って発酵食材を製造し、そして
    (iv) 該発酵食材を適切な方法でパッキングして機能性食品を得るステップ
    を含む、前記方法。
  11. 請求項１０に記載の機能性食品を製造する方法によって獲得できる抗高血圧特性を有するペプチドを含む機能性食品。
  12. 高血圧治療用医薬の製造のための、請求項１１に記載される抗高血圧特性を有するペプチドを含む機能性食品の使用。
  13. 受託番号ＤＳＭ１４９９８のラクトバチルス・ヘルベチカス菌又はその突然変異体。
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