CN100464639C - 具有心率降低特性的混合物 - Google Patents

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Abstract

本发明是关于一种具有心率降低特性的混合物，它是通过发酵过程得到的。发酵过程包括利用乳酸菌发酵包含动物乳汁或植物蛋白质的食物材料，以得到发酵的食物材料，这种发酵食物材料包含具有降低心率特性的活性成份，以制造出可降低哺乳动物的心率及/或心率变动的产品。

Description

具有心率降低特性的混合物
技术领域
本发明是有关一种通过发酵制造得到的一种混合物，这种混合物是利用一种乳酸菌(lactic acid bacterium)发酵得到一种食物材料，它包含动物乳汁或植物蛋白质，以得到一种发酵的食物材料，它包含多肽(peptides)或其它能降低心率的活性成份，以制造出可降低哺乳动物心率的产品。
技术背景
已有数篇报导明确的认为，静止心律的降低与增进存活率之间有着非常强烈的相关连性。在一般人群中，几篇研究报告显示较高的静止心率与死亡率的增加有很强的正相关性，报告中显示男性死亡率的观察中有2至3个峰值发生在静止心率高达每分钟88次的地方，相对于群体中其静止心率是低于每分钟65次的其它男性人口，心率不只与心血管系统所造成的死亡率有关，而且也与癌症等其它原因所造成的死亡有关。Zaza等人曾于2001年假设在降低心率与一般寿命的预期之间存在相关性。
在现今发达国家中，最常见的心血管疾病为冠状动脉疾病(coronary artery disease，CAD)或是冠状心脏病(coronary heart disease，CHD)，它们是心脏遭受到攻击的主要原因。CAD及CHD是指位在心脏表面的动脉硬化，“动脉硬化”是指动脉变窄与僵硬而阻碍到血液流动的一种状态。
较低心率与较好的结果有关，特别是降低心律不齐的危险性；较高心率可能反映出较高的新陈代谢率和较低的迷走神经活性，因而增加了缺血性的危险率。此外，较高的心率也可能使心室的功能恶化(Lombardi，F in Zaza et al.，2001)，因此并不奇怪有报道说，较高心率是导致CAD或CHD的非常相关的重要因素。CAD或CHD通常以药物治疗方式来治疗，这些药物治疗是通过不同的机制来进行，例如：
1.β阻断器，通过阻断某种化学物质与心脏上之β接收器之间的连结，来降低心脏的负荷。
2.硝酸盐，直接作用于血管上，使血管松弛并允许更多的富含氧血到达心脏。
3.钙离子通道阻断器，可增加流至心脏的血流量，并通过血管的压缩与绷紧信号通知来阻断钙离子而降低心脏负荷。
4.抗血小板凝集(例如阿斯匹林)，可抑制血小板(存在于血液中的极小颗粒)凝集血液形成凝块，使血液凝块与聚集的情况降低。
在这种疾病的早期发展中，高心率的预防是用药物来治疗高心率的一种手段。大量可产生生物活性成分的食物认为是有益于生命健康或提升健康的。
已知乳酸菌(LAB)可以使牛奶发酵而产生抗高血压(anti-hypertensive)的功效，因为牛奶中酪蛋白的多肽在乳酸菌的作用下进行蛋白质分解，这实施例的相关说明是在EP821968(Calpis Food Industry)、EP 1016709(Calpis Food Industry)及WO 0132836(Valio Ltd.)等专利案中。
Yamamoto等人于1996年发表的文章中表明使用瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)来发酵的牛奶可以降低收缩压与舒张压，然而在其它文献中观察到的则无任何改变，包括脉搏速率。
WO0185984(Davisco International Foods，Inc.)也是有关具有抗高血压功效(血液减少功效)的多肽，这种多肽来自于乳浆蛋白的酶消化。测量心率与血压的变化，可以观察到在平均动脉血压中有一个明显的减少，而且除了75毫克/公斤(mg/kg)的剂量可以导致心率降低之外，其余发生在30至150毫克/公斤间的剂量与心率反应并无任何有意义的差异存在。
Fuglsang，A.等人(2002)的文章描述，如同Yamamoto等人(1996)的结论文章，发酵牛奶多肽具有抗高血压的特性。在3569页第2段第1行中，测试样品的反应表明与非发酵牛奶(安慰剂)相比，发酵牛奶对心率的影响非常微小。
上面所提到的Yamamoto等人(1996)的文章、Fuglsang，A.等人(2002)的文章和WO0185984文件中皆指出，虽然乳酸菌发酵产品具有降低血压特性，但没有理由相信它对于降低心率也具有同样之功效。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种有利于降低心率的产品。
这解决方式是基于本发明人发现通过乳酸菌(LAB)发酵的食物材料，最好是牛奶，可以得到具有增加心率降低特性的活性成份。具体参见实施例1的表1。
因此，本发明的第一方面是有关发酵制程所制得的混合物，这种混合物是利用一种乳酸菌发酵食物材料，包括动物乳汁或植物蛋白质，以得到一种发酵的食物材料，它是包含多肽或其它具有心率降低特性的活性成份，以制造出可以降低哺乳动物之心率的产品。
第二方面，本发明提供一种发酵食物材料，它具有降低哺乳动物的心率的特性，并包含通过至少一种乳酸菌品种发酵所得的活性成份。特别是使用瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)品种CHCC5951(DSM 14998)发酵的食物材料是最佳实施例。
认为提取包含活的及死的菌种的食物是尤其有益于健康的，因此，本发明的第三方面是提供一种发酵食物材料，它具有降低哺乳动物的心率特性，并包含失活的或有活性的瑞士乳杆菌菌种DSM 14998或其突变种。
由剂量反应实验(实施例4)可知，若混合物为高浓度的降低心率合成物，可能得到更大的效果，因此，本发明的第四方面是提供从发酵食物材料中分离出心率降低成份。
更进一方面，本发明是描述使用发酵食物材料或从中分离出心率降低活性成份而制作成药剂，用于治疗或缓和冠状动脉疾病(CAD)或冠状心脏病(CHD)，例如：心绞痛、高血压、动脉硬化、中风、心肌梗塞、大脑血管梗塞，以及血管成形术后再狭窄(restenosis following angioplasty)、心律不齐、心跳节律不齐、充血性心脏衰竭(Congestive Heart Failure，CHF)、主动脉窦逆流、慢性肾衰竭、脂肪代谢障碍、脂蛋白代谢障碍等。
定义
在对本发明的细节进行讨论之前，以下针对本发明主要方面各定义具体详细说明。
″降低哺乳动物心率″定义为心率的降低与使用在此描述的混合物之前的心率间的相关性。在进行人体试验前，最好在动物模式中验证其降低心率的特性。在一个有用的动物模式中是使用胃管灌食法(gavage)将发酵产品提供给自发性高血压大鼠(spontaneous hypertensive rats，SHR)，喂食后再使用远距测量法24小时的监测SHR于不同时间点的心率。安慰剂(Placebo)最好是与未发酵的食物材料有关，例如未发酵的牛奶。更进一步的说明请参见工作实施例1所示，但是也要对血压正常的Wistar大鼠建立一模式，如实施例6所述可用来评估心率的降低。
″乳酸菌″是指一组革兰氏阳性菌、过氧化氢酶阴性菌、无运动性者(non-motile)、微嗜氧菌或厌氧杆菌，它们能使糖发酵而制造出酸，包括主要产生的乳酸，、醋酸、甲酸和丙酸。
下面通过具体实施例配合附图详加说明。
发明详述
食物材料
本发明的食物材料包含动物乳汁蛋白质或是植物蛋白质。
最好，食物材料包含有所列举的动物乳汁蛋白质，例如全脂或脱脂动物乳汁或乳汁酪白质等乳汁蛋白质成份。
食物材料包含所列举的植物蛋白质，最好是例如谷物、谷物蛋白质、小麦、小麦蛋白质、大豆、脱脂大豆或大豆蛋白质。
包含具有降低心率特性的多肽或其它活性成份的产品
在此使用乳酸菌进行发酵，提供了大量有用且具有很好的心率降低特性的多肽或其它活性成份。因此，并不一定要从发酵食物材料中更进一步的纯化或浓缩该多肽或其它活性成份；且发酵食物材料可以直接包装并如食品般于市场上供应，最好是冻干状态的功能食品或食品添加物等。
在实施例1中这将获得验证。简言之，实施例1结果显示，无须任何其它处理，发酵牛奶本身即具有良好的降低心率功效。另外，冻干的发酵牛奶可悬浮于中性牛奶中，进而可产生一适当的食品，冻干的发酵牛奶可因而被视为一适当的食物添加产品。
″功能食物″在这是指一食品，消费者通过某种途径得知这食品具有降低心率特性有关的有用功能，当这种食物被使用时，它亦可为饲料；然而最好是食品。
因此，本发明在这使用的混合物的实施例是一食品，包含具有心率降低特性的多肽或其它活性成份，这食品的制作方法包括下列步骤：
(1)根据这里指述的具有降低心率特性的活性成分的制备方法来准备一种发酵的食物材料；
(2)将这发酵食物材料进行干燥；以及
(3)以适当方式包装这发酵食物材料，以得到一食品或食品添加物。
其中，步骤(2)最好使用冷冻干燥法。
″包装″应该被理解为广义的，其是指当一食物材料被发酵而得到一发酵食物材料，这发酵食物材料应该被包装起来，以提供给消费者。它可以被包装在一瓶子或一利乐包(tetra pack)内，最好是在包装上或相对应的销售材料上能够指明这产品具有心率降低特性。这适用于在这描述的产品可适用任何方面或实施例。
如实施例1所示，由于经过加热处理的发酵食物材料亦具有心率降低特性，所以在食品中的乳酸菌可以是失活的或有活的。
使用具有降低心率特性的产品
如上所述，″降低(还原)哺乳动物心率″定义为心率的降低与使用在这描述的混合物前的心率间的相关性。这心率降低特性的验证最好是使用胃管灌食法(gavage)将发酵产品提供给自发性高血压大鼠(SHR)喂食后再使用远距测量法24小时的侦测SHR于不同时间点的心率和最好是连续性的。然而亦有其它动物模式可以用来评估这发酵产品对心率的功效，一个血压正常的Wistar大鼠模式的实施例是描述如例6所示。安慰剂(Placebo)最好是相关的未发酵的食物材料，例如未发酵的牛奶，更进一步的详细说明参见工作例1。
本产品是可用来治疗冠状动脉疾病(CAD)或冠状心脏病(CHD)，例如：心绞痛、高血压、动脉硬化、中风、心肌梗塞、大脑血管梗塞，以及血管成形术后再狭窄、心律不齐、心跳节律不齐、充血性心脏衰竭(CHF)、主动脉窦逆流、慢性肾衰竭、脂肪代谢障碍、脂蛋白代谢障碍等。对于这些症状而言，本产品是一相当好的药剂，尤其是对心绞痛、高血压和动脉硬化的效果尤佳。
此外，对于心率变动问题也产生兴趣，在实施例1、4和5中证实发酵产品可有效降低心率，但也意外地发现其亦可降低实验动物活性时期的心率变动。尤其在压力情况下观察心率变动频率的一个重要发现，即因为在实验模式中心率变化与死亡率相关，心率变动的阻尼(Damping)可能是一个重要的特征(Zaza et al 2001)。
由于冠状动脉疾病一般是长期逐渐形成的，在其形成过程中具有许多机会来预防或控制它，预防治疗可以早一点开始，如这才可减低动脉硬化生长的速度。因此，本产品的另一种最好使用方法是作为一种预防方式，在这种情形下，本产品更可为一种食品或食物添加物，使人们可以于日常食用或经常性食用。
本产品最好具有超过安慰剂10％以上的心率降低功效，且这安慰剂是如上所述与为发酵食物材料有关。利用这定义，更好的产品是具有超过安慰剂15％以上的心率降低功效；甚至更好的产品是具有一为20％以上的安慰剂的心率降低功效，且最好的产品是具有一为25％以上的安慰剂的心率降低功效。
从发酵食物材料取得的心率降低多肽或其它活性成份的纯化
如上所述，在这描述的乳酸菌的使用，是提供发酵后直接得到大量具有很好心率降低特性的多肽或其它活性成份。
然而，在一些情况下，最好对自发酵食物材料取得的心率降低多肽或其它活性成份进行一后续纯化步骤，例如，当多肽或其它活性成份被制作成药剂，例如药片，其是需要很高浓度的心率降低多肽或其它活性成份。所以，在本发明一种实施例中，本产品是为一药剂。
再者，实施例1显示心率降低功效与产品的浓度因素呈比例关系。
因此，本发明的一实施例是与在这描述的使用有关，即发酵食物材料需经更进一步处理，以纯化或浓缩该具有心率降低特性的多肽或其它活性成份，其取得的制作方法包括下列步骤：
(1)准备一发酵食物材料，其是根据一制法来准备在这描述的具有心率降低特性的多肽或其它活性成份；
(2)对步骤(1)的发酵食物材料进行更进一步的处理，其处理方式是以纯化或向上浓缩这具有心率降低特性的活性成份；以及
(3)以适当方式包装这发酵食物材料，以得到一产品。
这种方式是为一种可获得在本产品中相对高浓度的具有心率降低特性的多肽或其它活性成份的解决方式。
假如这产品是一种食品，则这过程更包含一步骤(4)，将步骤(2)取得的浓缩多肽或其它活性成份添加至一食品中。
根据上述的步骤(2)，向上浓缩的最佳实施例是将包含具有心率降低特性的多肽或其它活性成份的发酵食物材料进行离心，并可在分离后的上清液(supernatant)得到多肽或其它活性成份。假如食物材料是牛奶，则其产物为一乳浆(whey)，如实施例1所示，乳浆是为一具有优异心率降低特性的产品。因此，本产品的较佳实施例为乳浆。
这离心分离法最好使用，例如，转速在2,000rpm至20,000rpm并持续1至20分钟，这离心分离法亦可在一离心机中进行的。
这取得的上清液更可进一步利用反相树脂(reverse-phase resin)进行纯化处理，使得到的样品，其具有心率降低特性的多肽或其它活性成份的含量逐渐增加。这利用反相树脂的纯化处理是以反相树脂对多肽或其它活性成份进行吸收及溶离(elution)，及/或利用利用反相色谱分析法(chromatography)，使多肽或其它活性成份的纯度增加。
有关这反相树脂理论文献的更多的技术说明是请参阅EP 821968。
或者，这发酵食物材料更可进行进一步处理，其方式是为在发酵食物材料上进行纳米过滤(nanofiltration)，这做法可能为了从发酵食物材料中去除乳酸或单价离子。
有关这纳米过滤理论文献的更多的技术说明是请参阅WO 01/32905。
如实施例4所述，浓缩到21倍的乳浆产品在心率上有明显的剂量依赖效应。在这实验中固定或渐进的水平线并未达到，表示，包含更高浓度活性成份的混合物可预期到具有更高的降低心率功效。
发酵
在本发明的制作过程中，这种食物材料是由处于操作状态的乳酸菌进行发酵，可以根据食物材料的种类及/或与乳酸菌的结合不同而变化。如果食物材料并非是水性溶液，最好将食物材料先溶解于适当的水性溶液中，然后再与乳酸菌混合并发酵培养。
乳酸菌的培养可以通过将先培养乳酸菌的菌原(starter)加入食物材料培养基(medium)来完成，培养基可以先经过高温消毒(heat-sterilized)并冷却到一预设的培养温度。乳酸菌菌原的最佳培养浓度为105至107个乳酸菌/每毫升培养基；培养温度通常为20至50℃，最好为30至45℃；培养时间通常为3至48小时，最好为6至24小时。培养过程最好是在pH值在3.5至7范围中的培养基中进行，且为了有效地进行乳酸菌培养，其pH值最好是在5至6的间。再者，为进行固定pH值的培养，其pH值最好维持在4至7的范围内。当乳酸菌的浓度超过108个/毫升的后，培养即可终止而不受限制。
有关制作过程的较佳实施例为，食物材料的发酵是从每100毫升食物材料生产出0.5至25毫克具有心率降低特性的多肽或其它活性成份，更好的是从每100毫升食物材料生产出1至5毫克具有心率降低特性的多肽或其它活性成份。
哺乳动物
哺乳动物包含动物，例如驯养动物(如猫和狗)、猪、牛、羊及鱼，这哺乳动物最佳的实施例为人。
乳酸菌
如上面所述，有关″乳酸菌″的命名是指一组革兰氏阳性菌、过氧化氢酶阴性菌、无运动的(non-motile)、微量嗜氧菌或厌氧细菌，能发酵糖而制造出酸，包括大量产生的乳酸、醋酸、甲酸和丙酸。
另外，还包括属于乳酸杆菌属(genus Lactobacillus)的乳酸菌种类，例如瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillus delbruekii subsp.bulgaricus)等；属于乳球菌属(genus Lactococcus)的乳酸菌，例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)；属于链球菌属(genus Streptococcus)的乳酸菌，例如唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcus salivarius subsp.thermophilus)；属于明串珠球菌属(genusLeuconostoc)的乳酸菌，例如乳酸明串珠球菌(Leuconostoc lactis)；属于双歧杆菌属(genus Bifidobacterium)的乳酸菌，例如长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)或短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)；以及属于片球菌属(genus Pediococcus)的乳酸菌。
所用乳酸菌可以是含有其它微生物的混合物，例如酵母(yeasts)。
对于本领域技术人员，有许多公开可用的不同乳酸菌，请参照德国国家菌种培育中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)，以及国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的因特网分类浏览器。
更好的是一种杆菌门(phylum Firmicutes)的乳酸菌，较好的是杆菌纲(classBacillus)，更好的是乳酸杆菌目(order Lactobacillales)，在这目中的乳酸菌为一种乳酸杆菌科(family Lactobacillaceae)，最好是为乳酸杆菌属，更好地，它是为一种瑞士乳杆菌种。更进一步的详细说明见伯格氏(Bergey)细菌分类手册第二版第一册(Bergey’sManual of Systematic Bacteriology，Second Edition，Volume 1:TheArchea and the DeeplyBranching and Phototrophic Bacteria)的分类法。
一特别好的瑞士乳杆菌种(Lactobacillus helveticus strain)CHCC 5951的样品寄存在DSMZ内，登记号为DSM 14998，寄存日为2002年5月15日。这种寄存是根据微生物有机体保存专利程序的国际认可布达佩斯协议(Budapest Treaty on the InternationalRecognition of the Deposit of Micro organisms for the Purposes of Patent Procedure)的规定。
所以，有关在这使用的乳酸菌的一个较佳实施例是登记号DSM 14998的瑞士乳杆菌。
另外，一种瑞士乳杆菌种CHCC 4080的样品寄存在DSMZ，登记号为DSM 14997，寄存日为2002年5月15日。寄存是根据微生物有机体保存专利程序的国际认可布达佩斯协议的规定。
更好的菌种是登记号为FERM BP-4835的瑞士乳杆菌，登记号为FERM BP-6060的瑞士乳杆菌，登记号为DSM 13137的瑞士乳杆菌种，瑞士乳杆菌种CNRZ32以及瑞士乳杆菌CP790。
含有分子量200kDa细胞壁蛋白酶的乳酸菌(LAB)
较好的乳酸菌是包含一种分子量约200kDa的特定细胞壁蛋白酶的，这种乳酸菌特别适合制备具有心率降低特性的多肽或其它活性成份。较佳的乳酸菌详细说明如下。
这种特定细胞壁蛋白酶在这称为prtH200蛋白酶。如这部份说明的，prtH200蛋白酶是与在美国威斯康星州与犹他州立大学的论文(1999，J.of Bacteriology，181:4592-4597)中所发表的瑞士乳杆菌种CNRZ32相当，在这论文中并未描述有使用CNRZ32种来制造具有心率降低特性的多肽或其它活性成份。
这乳酸菌的特征在于其包含编码细胞壁蛋白酶(称为prtH200)的基因序列，其中定义为prtH200的基因序列是为编码表现细胞壁蛋白酶活性的酶的脱氧核糖核酸(DNA)序列，这DNA序列是选自包括下述的组：
(a)这DNA序列是出现在SEQ ID NO 1的1-5550的位置；
(b)DNA序列包含一至少75碱基对(base pairs，bp)的片段(fragment)，其与(a)所定义的DNA序列的对应片段至少有50％的同源性；
(c)DNA序列是编码表现细胞壁蛋白酶活性的多肽(polypeptide)，多肽包含至少200氨基酸(amino acids，aa)的片段，其与表现在SEQ ID NO 2的1-1849位置的多肽序列的对应片段至少有30％的同源性；
(d)DNA序列是与包含表现在SEQ ID NO 1的1-5550位置的DNA序列的双股DNA探针在低严格性下进行杂交(hybridize)；以及
(e)DNA序列，是(a)、(b)、(c)或(d)中说明的DNA序列片段。
存在于乳酸菌中的基因序列编码成prtH200蛋白酶已被使用适当设计的聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)引物(primer)的PCR扩增方法证实。当本领域技术人员具有适当设计的PCR引物，对他而言，使用其一般知识来选择一特定适当的PCR扩增法去验证这基因序列是否存在于乳酸菌中是相当容易的。
所以，本领域技术人员可以筛选(screen)一定数量的乳酸菌，验明包含有prtH200基因序列的乳酸菌，并因此得到具有改良工业相关特性的特选乳酸菌。
一种特别好的瑞士乳杆菌种CHCC 5951的样品是寄存在DSMZ，登记号为DSM14998，寄存日为2002年5月15日。这寄存是根据微生物有机体保存专利程序的国际认可布达佩斯协议的规定。
因此，有关在这部份使用的乳酸菌的一较佳实施例是为登记号DSM 14998的瑞士乳杆菌。
使用寄存的DSM 14998品种作为起始物质，使这技艺的读者可以藉由传统的突变技术或重新分离技术，以进一步得到突变体或衍生物，其是保持有适合制备具有心率降低特性的多肽或其它活性成份的能力。
乳酸菌的蛋白质水解活性(Proteolytic activity of the lactic acid bacteria)
于这段描述的prtH200、orfF3及orfF4基因序列是可视为指纹，具有高度适合证明在这描述的乳酸菌。不受限于理论，理论上有带有这里描述的指纹基因序列而不展现有利的特性的菌种存在。
因此，一旦验证在乳酸菌中具有于这段描述的指纹基因序列存在时，其是有利于测试乳酸菌的蛋白质水解活性，在本文中，一个较佳的乳酸菌是具有一较佳的蛋白质水解活性，详细说明如下。
在本文中，当一乳酸菌具有合成一活性细胞壁蛋白酶的能力时，这乳酸菌被认为具有蛋白质水解活性；换言的，证明蛋白酶在细菌的细胞部份外有活性。再者，这蛋白酶应该具有使其降解(degrade)蛋白质(例如牛奶中的酪蛋白)的能力，以得到具有心率降低特性的多肽或其它活性成份。
细菌的蛋白质水解活性最好是利用一个程序检测，包括下列步骤：
(1)以细菌发酵200毫升的食物材料一整夜；
(2)提取(extract)产生的多肽或其它活性成份；以及
(3)测量提取出的多肽或其它活性成份的心率降低特性，是通过测量需要抑制50％血管收缩素转化酶(ACE)活性的多肽浓度的一种分析法。
这种ACE抑制活性检测值在这也称为DL50，DL50值越低，即表示包含在本产品中的多肽或其它活性成份的心率降低效果越佳。
在该程序的步骤(1)中，较好的食物材料为新鲜牛奶；再者，细菌最好以1％v/v灌注至食物材料中，并维持于适当的温度过夜培养。这种适当温度是适合细菌生长的温度，本领域技术人员应知道如何去验证其为一特定的细菌。对乳酸杆菌种而言，其适当温度为37℃，对乳酸球菌种的适当温度则为30℃。
在工作实施例3是提供一详细的较佳协议，以说明发酵及提取步骤，并详细说明这DL50的ACE活性检测。
最好，这乳酸菌是具有蛋白质水解活性的能力，这种程序包括下列步骤：
(1)以细菌发酵200毫升的食物材料一整夜；
(2)提取产生的多肽或其它活性成份；以及
(3)测量提取出的多肽或其它活性成份的抗高血压特性，是利用一种检测法来测量需要抑制50％ACE活性的多肽浓度。
产生的多肽或其它活性成份的ACE抑制活性(DL50)为0.25至5.0(毫克/毫升)之间。
最好，乳酸菌具有产生多肽或其它活性成份的ACE抑制活性(DL50)0.25至4.0(毫克/毫升)间的能力；更佳者，乳酸菌具有产生多肽或其它活性成份的ACE抑制活性(DL50)0.25至3.5(毫克/毫升)间的能力。
较低的DL50范围是1.0毫克/毫升而不是0.25毫克/毫升。
根据惯用的定义，有关″基因″的定义为遗传的基本物理与功能单位。基因是一种在特定染色体的特定位置上的整齐序列的核苷酸(例如DNA或RNA)，编码特定功能的产品(例如蛋白质或RNA分子)。
″简并引物的命名(nomenclature of degenerated primers)″是根据现有技术的标准命名法，Y＝C或T；R＝A或G；M＝A或C；K＝G或T；S＝G或C；W＝A或T；H＝A或C或T；B＝G或T或C；V＝G或C或A；D＝G或A或T；N＝G、A、C或T。
有关″片段″的名称是与一DNA/氨基酸有关，这氨基酸是包含代表连续部份序列的片段。例如，在氨基酸序列的75至300位置是具有600个氨基酸。
有关″对应片段″的名称是与比较二序列的片段的相同长度有关，最好，这二片段比较后的长度差异是少于50％；换言的，假如一片段为100bp，另一片段则最好少于150bp。更佳者，这二片段比较后的长度差异是小于25％，以及最佳者，这二片段比较后的长度差异小于5％。
prtH200细胞壁蛋白酶
存在于乳酸菌中的细胞壁蛋白酶的活性已被证实，一合适的策略是通过在编码待检测的细胞壁蛋白酶的基因中的致死突变(lethal mutation)构建一种乳酸菌，然后这构建细菌的蛋白质水解活性(以适当检测)可与相对应的野生型细菌(wild typebacterium)进行比较，实验证明具有致死突变的乳酸菌与野生型细菌比较后，可检测到蛋白质水解活性的减少，证明编码待检测的细胞壁蛋白酶基因是编码活性乳酸细胞壁蛋白酶的基因。
熟悉这种技术的人士知道如何利用适当的致死突变来构建一乳酸菌，其制造方式请参考如Pederson等人(1999)及Yamamoto等人(1994)的论文。
在本发明的申请日，国家生物技术信息中心(NCBI)在其网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上提供一种标准BLAST计算机序列同源性的搜索程序。
SEQ ID NO 1及SEQ ID NO 2里表现的瑞士乳杆菌DSM 14998的prtH200的DNA及氨基酸序列是登记在GeneBank数据库中，登记号为AF 133727，且其数据库序列标记为gi|5758038|gb|AF133727.1|AF133727。
标准蛋白质-蛋白质BLAST[blastp]搜寻是使用表现在SEQ ID NO 2的1-1849位置的prtH200氨基酸序列作为参考序列，其中，搜寻结果如下所示(斜体字代表数据库序列证明，这报告明白确认已发表的序列，且本领域技术人员知道如何藉这得到该些序列)：
gi|129346|sp|P15293|P2P_LACLC：PII型蛋白酶前驱物(Lactocepin)(细胞壁-结合丝蛋白酶)
有机体：Lactococcus lactis subsp.cremoris.
同源性：一1600氨基酸片段与SEQ ID NO2的prtH200氨基酸序列的对应片段有50％的同源性。
gi|149582|gb|AAA25248.1|：蛋白酶
有机体：Lactobacillus paracasei.
同源性：一1632氨基酸片段与SEQ ID NO2的prtH200氨基酸序列的对应片段有49％的同源性。
gi|1381114|gb|AAC41529.1|：(L48487)蛋白酶前驱物
有机体：Lactobacillus delbrueckii.
同源性：一1682氨基酸片段与SEQ ID NO 2的prtH200氨基酸序列的对应片段有32％的同源性。
gi|18568398|gb|AAL76069.1|：(AF468027)细胞膜蛋白酶
有机体：Lactobacillus pentosus.
同源性：一415氨基酸片段与SEQ ID NO 2的prtH200氨基酸序列的对应片段有63％的同源性。
gi|9963932|gb|AAG09771.1|AF243528_1：(AF243528)细胞膜蛋白酶
有机体：Streptococcus thermophilus.
同源性：一781氨基酸片段与SEQ ID NO 2的prtH200氨基酸序列的对应片段有30％的同源性。
gi|482386|pir||A44833：PII型蛋白酶前驱物(EC3.4.21.96)
有机体：Lactococcus lactis.
同源性：一264氨基酸片段与SEQ ID NO 2的prtH200氨基酸序列的对应片段有61％的同源性。
这些特定的序列全部代表一个DNA序列，它编码表现细胞壁蛋白酶活性的一种多肽，包含至少200氨基酸(amino acids，aa)片段，与位于SEQ ID NO 2的1-1849位置的多肽序列的对应片段至少有30％的同源性。
标准核苷酸-核苷酸BLAST[blastn]搜寻是使用表现在SEQ ID NO 1的1-5550位置的prtH200氨基酸序列作为参考序列，其中，搜寻结果如下所示：
gi|149580|gb|M83946.1|LBAMPRO：蛋白酶(prtP)基因
有机体：Lactobacillus paracasei.
同源性：一102bp片段与SEQ ID NO 1的prtH200DNA序列的对应片段有84％的同源性。
gi|47197|emb|X14130.1|SLPRT763：质体pLP763prt基因，细胞壁-结合丝蛋白酶
有机体：Streptococcus lactis
同源性：一81bp片段与SEQ ID NO 1的prtH200DNA序列的对应片段有86％的同源性。
gi|472834|gb|M24767.1|STRWGPROT.：Wg2蛋白酶基因
有机体：S.Cremoris
同源性：一81bp片段与SEQ ID NO1的prtH200 DNA序列的对应片段有86％的同源性。
gi|149476|gb|J04962.1|LACPRASE.：PIII型蛋白酶(prtP)及成熟蛋白质
有机体：Lactococcus lactis
同源性：一81bp片段与SEQ ID NO 1的prtH200DNA序列的对应片段有86％的同源性。
gi|18568397|gb|AF468027.1|：细胞膜蛋白酶(prtP)基因
有机体：Lactobacillus pentosus
同源性：一102bp片段与SEQ ID NO1的prtH200DNA序列的对应片段有83％的同源性。
这些特定的序列全部代表一种包含至少75个碱基对(bp)片段的DNA序列，与位于SEQ ID NO 1的1-5550位置的DNA序列的对应片段至少有50％的同源性。
其它＂指纹″基因序列(orfF3及orfF4)
orfF3：
最好，除了prtH200基因序列的外，乳酸菌也带有一个包括orfF3开放读码框(openreading frame)的基因，这基因可视为一个附加的指纹。
瑞士乳杆菌DSM 14998的orfF3的DNA及氨基酸序列是表现在SEQ ID NO 3及SEQ ID NO 4。
因此，在一较佳实施例中，在这段描述的乳酸菌包括这prtH200基因和基因序列(称为orfF3)编码成一开放读码框，其中这基因序列是使用PCR引物的乳酸菌的基因组PCR扩增方法来进行识别鉴定，这PCR引物是选自下列所组成的群组[正义序列(sense sequence)称为S；反义序列(antisense sequence)称为A]：
orfF3：(a)：(S)：5’CGAAGGCGATAAGTCAAACTTTGATAATGC3’
(A)：5’CCCGGTTCTGTAAGATAATTTGGATCG3’；及
(b)：(S)：5’ASTCWRRYTTYGATRATGCW3’，
(A)：5’BHKYAMSAWARTTTGGATCR3’。
上述合适的PCR引物可以基于这里提供的序列进行识别确认。
因此，在一较佳实施例中，在这段描述的乳酸菌包括这prtH200基因和基因序列编码成一开放读码框(称为orfF3)，其中这定义为orfF3的DNA序列是为一脱氧核糖核酸(DNA)序列编码成一开放读码框，且这DNA序列是选自下列组：
(a)这DNA序列是出现在SEQ ID NO 3的1-2679的位置；
(b)一DNA序列包含一至少75碱基对(bp)的片段(fragment)，其与(a)所定义的DNA序列的对应片段至少有40％的同源性。
(c)一DNA序列是编码成一多肽，包含至少200氨基酸(aa)的片段，其与表现在SEQ ID NO 4的1-893位置的多肽序列的对应片段至少有30％的同源性；
(d)一DNA序列是与包含表现在SEQ ID NO 3的1-2679位置的DNA序列的双股DNA探针在低严格性下进行杂交(hybridize)；以及
(e)一DNA序列，其是为(a)、(b)、(c)或(d)中说明的DNA序列片段。
名称″开放读码框(open reading frame)″表示一段DNA，它包含转译的起始信号、形成蛋白质的足够长的正确顺序的氨基酸三联密码子、转译的终止信号，并因此而验证一蛋白质编码基因的存在。
在本发明的申请日，一标准蛋白质-蛋白质BLAST[blastp]搜寻是使用表现在SEQID NO 4的1-893位置的演绎orfF3氨基酸序列作为参考序列，且其相对限制的最终结果是与已发表的同源序列有关。
然而，不限于理论，理论上，在这段描述的orfF3基因编码成一细胞壁蛋白酶是为可信的，因此，在一较佳实施例中在这段描述的orfF3基因可编码成一细胞壁蛋白酶。OrfF4：
最好，除了prtH200基因序列的外，这乳酸菌亦包括一含有开放读码框的基因，在这称为orfF4。
瑞士乳杆菌DSM 14998的orfF4的DNA及氨基酸序列是表现在SEQ ID NO 5及SEQ ID NO 6。
因此，在一较佳实施例中，在这段描述的乳酸菌包括这prtH200基因和基因序列(称为orfF4)编码成一开放读码框，其中这基因序列是使用PCR引物的乳酸菌的基因组PCR扩增方法来进行识别鉴定，这PCR引物是选自包括下列组成的组[正义序列(sense sequence)称为S；反义序列(antisense sequence)称为A]：
orfF4：(a)：(S)：5’GGTGTTGCTCCTGAAGC3’
(A)：5’ACTCTAGCACCAGCTAATTGAACATCATG3’
上述合适的PCR引物可以基于在这揭露的序列进行识别确认。
因此，在一较佳实施例中，在这段描述的乳酸菌是包括这prtH200基因和基因序列编码成一开放读码框(称为orfF4)，其中这定义为orfF4是DNA序列编码成一开放读码框，且这DNA序列是选自下列所组成的群组：
(a)这DNA序列是表现在SEQ ID NO 5的1-4881的位置；
(b)一DNA序列包含一至少75碱基对(bp)的片段，其与(a)所定义的DNA序列的对应片段至少有40％的同源性。
(c)一DNA序列是编码成一多肽，包含至少200氨基酸(aa)的片段，其与表现在SEQ ID NO 6的1-1627位置的多肽序列的对应片段至少有30％的同源性；
(d)一DNA序列是与包含表现在SEQ ID NO 5的1-4881位置的DNA序列的双链DNA探针在低严格性下进行杂交；以及
(e)一DNA序列，其是为(a)、(b)、(c)或(d)中说明的DNA序列片段。
在本发明的申请日，一标准蛋白质-蛋白质BLAST[blastp]搜寻是使用表现在SEQID NO 6的1-1627位置的orfF4氨基酸序列作为参考序列，且其相对限制的最终结果是与已发表的同源序列有关。
然而，无须受限于学理，理论上，在这段描述的orfF4基因编码成一细胞壁蛋白酶是为可信的，因此，在一较佳实施例中在这段描述的orfF4基因是可编码成一细胞壁蛋白酶。
最好，在这段描述的乳酸菌是包括于这叙述的prtH200基因、orfF3基因以及orfF4基因。
聚合酶链反应(PCR)扩增
如上所述，在这描述的基因序列的存在最好利用使用PCR引物的PCR扩增来证实的，且这PCR引物的设计是根据在这所教导者。当本领域技术人员具有适当设计的PCR引物时，对他而言，使用其一般知识来选择一特定适当的PCR扩增程序去验证这些基因是否存在于乳酸菌中是相当容易的。
最好，这PCR扩增协议是根据实施例2所描述的内容来订定的。
一旦进行PCR扩增，不管产生的PCR扩增序列是否相当于在这段描述的基本片段，对本领域技术人员而言，是为其研究惯常的程序。由于本领域技术人员一班概略地知道一阳性PCR片段会有多大的长度，所以通常可基于PCR片段的长度来进行验明，且阳性PCR片段是与在这段描述的基因PCR片段有关。选择性地，PCR片段可以做DNA测序，然后得到的DNA序列可与在这表明的序列相比较；再者，相对这PCR片段的基因致死变种的乳酸菌是可被构建，然后这构建细菌的蛋白质水解活性(参下面)可以与相对的野生细菌进行比较，且在这二细菌间的蛋白质水解活性的量测变化是可被实验确认，而不管相当于扩增PCR片段的基因是否为如这段所描述的编码一种乳酸细胞壁蛋白酶。
总的，不管一特定乳酸菌是否包含给予相对阳性PCR片段的基因能力，本领域技术人员是可使用在这教导所设计的PCR引物来进行验明。
PCR是用来研究这基因是否存在于乳酸菌中最好的方式，然而，他亦可以以其它进行，例如，利用Southern点杂交分析法(Southern blot analysis)。
PCR引物
如上述说明的，关于PrtH200基因的适当PCR引物为：
PrtH200：(a)：(S)5’CGATGATAATCCTAGCGAGC3’，
(A)5’TGGCAGAACCTGTGCCTA3’；
(b)：(S)5’GCCAAGACGCCTCTGGTA3’，
(A)5’TAGGTATAGTTTCCATCAGGA3’；及
(c)：(S)5’AARGTWCCWTAYGGYYWYAAYTA3’，
(A)5’GCCATDSWDGTRCCDSWCATDTK3’。
PrtH200：(a)：(S)是表现在SEQ ID NO 7；
PrtH200：(a)：(A)是表现在SEQ ID NO 8；
PrtH200：(b)：(S)是表现在SEQ ID NO 9；
PrtH200：(b)：(A)是表现在SEQ ID NO 10；
PrtH200：(c)：(S)是表现在SEQ ID NO 11；及
PrtH200：(c)：(A)是表现在SEQ ID NO 12。
当使用(a)的引物时，扩增的PrtH200PCR片段较佳的长度应该介于400bp至800bp的间，更佳的长度则介于500bp至700bp的间。当使用(b)的引物时，这扩增的PrtH200PCR片段较佳的长度应该介于200bp至500bp的间，更佳的长度则介于250bp至375bp的间。当使用(c)的引物时，扩增的PrtH200PCR片段较佳的长度应该介于400bp至800bp的间，更佳的长度则介于500bp至700bp的间。
最佳的PrtH200相关的PCR引物是为编号(a)的引物以及编号(b)的引物。
如上述说明者，关于orfF3的适当PCR引物为：
orfF3：(a)：(S)：5’CGAAGGCGATAAGTCAAACTTTGATAATGC3’
(A)：5’CCCGGTTCTGTAAGATAATTTGGATCG3’；及
(b)：(S)：5’ASTCWRRYTTYGATRATGCW3’，
(A)：5’BHKYAMSAWARTTTGGATCR3’。
orfF3：(a)：(S)是表现在SEQ ID NO 13；
orfF3：(a)：(A)是表现在SEQ ID NO 14；
orfF3：(b)：(S)是表现在SEQ ID NO 15；及
orfF3：(b)：(A)是表现在SEQ ID NO 16。
当使用(a)的引物时，扩增的orfF3PCR片段较佳的长度应该介于1250bp至1900bp的间，更佳的长度则介于1500bp至1725bp的间。当使用(b)的引物时，扩增的orfF3PCR片段较佳的长度应该介于1250bp至1900bp的间，更佳的长度则介于1500bp至1725bp的间。
最佳的orfF3相关的PCR引物是为编号(a)的引物。
如上述说明者，关于orfF4的适当PCR引物为：
orfF4：(a)：(S)：5’GGTGTTGCTCCTGAAGC3’，
(A)：5’ACTCTAGCACCAGCTAATTGAACATCATG3’。
orfF4：(a)：(S)是表现在SEQ ID NO 17；及
orfF4：(a)：(A)是表现在SEQ ID NO 18。
当使用(a)的引物时，扩增的orfF4PCR片段较佳的长度应该介于700bp至1150bp的间，更佳的长度则介于875bp至1025bp的间。
DNA序列的同源/一致性
参照上述内容，DNA序列的同源/一致性是由两序列间的同源性程度所决定的。
在本发明的申请日，国家生物技术信息中心(NCBI)在其网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上提供一种标准BLAST计算机序列同源性的搜索程序。
BLAST程序是叙述于[Altschul et al(1997)，＂Gapped BLAST and PSI-BLAST:a newgeneration of protein database search programs＂，Nucleic Acids Res.25:3389-3402]。
在本文中，较佳的计算机同源搜寻程序是为″标准核苷酸-核苷酸BLAST[blastn]″搜寻，且在本申请案的申请日，在NCBI网站已具有过滤性(filter)：低复杂性；预期性(expect)：10，及序列长度：11等设定。
程序里引入参考序列，且这程序是验明已发表序列与参考序列的对应片段间的同源性百分比。
使用标准核苷酸-核苷酸BLAST计算机程序，在这描述的prtH200序列通常为含有至少75碱基对(bp)片段的DNA序列，其与表现在SEQ ID NO 1的1-5550位置的prtH20 DNA序列的对应片段至少有60％的同源性；更佳者，含有至少75碱基对(bp)片段的DNA序列与表现在SEQ ID NO 1的1-5550位置的prtH20DNA序列的对应片段至少有70％的同源性；最佳者，含有至少75碱基对(bp)片段的DNA序列与表现在SEQ ID NO 1的1-5550位置的prtH20 DNA序列的对应片段至少有80％的同源性。
就上述所提供的同源性百分比而言，这片段通常为至少100碱基对(bp)，最好的片段为至少200碱基对，更佳者的片段为至少400碱基对，最佳者的片段则为至少1500碱基对。
使用标准核苷酸-核苷酸BLAST计算机程序，在这描述的orfF3序列通常为含有至少75碱基对(bp)片段的DNA序列，其与表现在SEQ ID NO 3的1-2679位置的orfF3DNA序列的对应片段至少有60％的同源性；更佳者，含有至少75碱基对(bp)片段的DNA序列与表现在SEQ ID NO 3的1-2679位置的orfF3DNA序列的对应片段至少有70％的同源性；以及，最佳者，含有至少75碱基对(bp)片段的DNA序列与表现在SEQ ID NO 3的1-2679位置的orfF3 DNA序列的对应片段至少有80％的同源性。
就上述所提供的同源性百分比而言，这片段通常为至少100碱基对(bp)，最好的片段为至少200碱基对，更佳者的片段为至少400碱基对，最佳者的片段则为至少1500碱基对。
使用这标准核苷酸-核苷酸BLAST计算机程序，在这描述的orfF4序列通常为含有至少75碱基对(bp)片段的DNA序列，其与表现在SEQ ID NO 5的1-4881位置的orfF4 DNA序列的对应片段至少有60％的同源性；更佳者，含有至少75碱基对片段的DNA序列与表现在SEQ ID NO 5的1-4881位置的orfF4 DNA序列的对应片段至少有70％的同源性；以及，最佳者，含有至少75碱基对片段的DNA序列与表现在SEQ IDNO 5的1-4881位置的orfF4 DNA序列的对应片段至少有80％的同源性。
就上述所提供的同源性百分比而言，这片段通常为至少100碱基对(bp)，最好的片段为至少200碱基对，更佳者的片段为至少400碱基对，最佳者的片段则为至少1500碱基对。
选择性地，这同源/一致性是可适当地利用任何已知的计算机程序工具来决定，例如，在GCG程序软件包中所提供的GAP。
使用GAP来进行DNA序列比对是具有下列设定：GAP创造罚分(creationpenalty)为5.0，且GAP延伸罚分(extension penalty)为0.3；当使用GAP时，关于BLAST程序所提供的同源性百分比亦可为较佳的同源性。
氨基酸序列的同源性
相似于核苷酸同源分析，在本文中，一较佳的计算机同源搜寻程序是为″标准蛋白质-蛋白质BLAST[blastp]″搜寻，且在本申请案的申请日，在NCBI网站已具有统计：是；过滤性：低复杂性；预期性：10；序列长度：3；矩阵：BLOSUM62；间隔损失：存在11延伸1等设定。
使用这标准蛋白质-蛋白质BLAST计算机程序，在这描述的prtH200序列是编码成一多肽(polypeptide)，释出细胞壁蛋白酶活性，包含有至少200氨基酸(amino acids，aa)片段的DNA序列，其与表现在SEQ ID NO 2的1-1849位置的prtH200多肽序列的对应片段至少有40％的同源性；最好，这一编码成多肽，释出细胞壁蛋白酶活性，包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列，其与表现在SEQ ID NO 2的1-1849位置的prtH200多肽序列的对应片段至少有50％的同源性；更佳者，这一编码成多肽，释出细胞壁蛋白酶活性，包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列，其与表现在SEQ ID NO 2的1-1849位置的prtH200多肽序列的对应片段至少有65％的同源性；最佳者，这一编码成多肽，释出细胞壁蛋白酶活性，包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列，其与表现在SEQ ID NO 2的1-1849位置的prtH200多肽序列的对应片段至少有80％的同源性。
就上述所提供的同源性百分比而言，这片段通常为至少300氨基酸(aa)，最好的片段为至少400氨基酸，更佳者的片段为至少800氨基酸，最佳者的片段则为至少1200氨基酸。
使用这标准蛋白质-蛋白质BLAST计算机程序，在这描述的orfF3序列是编码成一多肽(polypeptide)，包含有至少200氨基酸(amino acids，aa)片段的DNA序列，其与表现在SEQ ID NO 4的1-893位置的orfF3多肽序列的对应片段至少有40％的同源性；最好，这一编码成多肽，包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列，其与表现在SEQ ID NO 4的1-893位置的orfF3多肽序列的对应片段至少有50％的同源性；更佳者，这一编码成多肽，包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列，其与表现在SEQ ID NO 4的1-893位置的orfF3多肽序列的对应片段至少有65％的同源性；最佳者，这一编码成多肽，包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列，其与表现在SEQ ID NO 4的1-893位置的orfF3多肽序列的对应片段至少有80％的同源性。
就上述所提供的同源性百分比而言，这片段通常为至少300氨基酸(aa)，最好的片段为至少400氨基酸，更佳者的片段为至少800氨基酸，最佳者的片段则为至少1200氨基酸。
使用这标准蛋白质-蛋白质BLAST计算机程序，在这描述的。rfF4序列是编码成一多肽，包含有至少200氨基酸(amino acids，aa)片段的DNA序列，其与表现在SEQID NO 6的1-1627位置的orfF4多肽序列的对应片段至少有40％的同源性；最好，这一编码成多肽，包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列，其与表现在SEQ ID NO6的1-1627位置的orfF4多肽序列的对应片段至少有50％的同源性；更佳者，这一编码成多肽，包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列，其与表现在SEQ ID NO 6的1-1627位置的orfF4多肽序列的对应片段至少有65％的同源性；最佳者，这一编码成多肽，包含有至少200氨基酸(aa)片段的DNA序列，其与表现在SEQ ID NO 6的1-1627位置的orfF4多肽序列的对应片段至少有80％的同源性。
就上述所提供的同源性百分比而言，这片段通常为至少300氨基酸(aa)，最好的片段为至少400氨基酸，更佳者的片段为至少800氨基酸，最佳者的片段则为至少1200氨基酸。
选择性地，这同源性是可适当地利用任何已知的计算机程序工具来决定，例如，在GCG程序软件包中所提供的GAP。
使用GAP来进行DNA序列比对是具有下列设定：GAP创造罚分为3.0，且GAP延伸罚分为0.1；当使用GAP时，关于BLAST程序所提供的同源性百分比亦可为较佳的同源性。
杂交反应(Hybridisation)
这杂交反应根据前文所预期是包含一同功DNA序列(analogous DNA sequence)，其是杂交至一双链DNA探针。在一核苷酸探针与一同源DNA或RNA序列的间决定杂交反应为低严格性、中严格性或高严格性的适当实验条件是包含，将含有欲杂交DNA片段或RNA的滤膜(fliter)预浸(pre-soaking)在5x SSC(氯化钠/柠檬酸钠，Sambrooket al.1989)溶液中10分钟，并将滤膜置于5 x SSC、5 x Denhard’s溶液(Sambrook et al.1989)、0.5％SDS及100mug/ml超声波处理变性的鲑鱼精DNA(Sambrook et al.1989)的溶液中进行预杂交(prehybridization)，随后在含有10ng/ml随机引物(Feinberg，A.P.andVogelstein，B.(1983)Anal.Biochem.132:6-13)、P-dCTP-标记(特定活性>1x10cpm/mug)探针的相同溶液中杂交12小时，且其温度为45℃。然后这滤膜在2x SSC、0.5％SDS溶液下清洗二次30分钟，其温度为至少55℃(低严格性)，最好的温度为至少60℃(中严格性)，仍为较佳的温度为至少65℃(中/高严格性)，更佳者的温度为至少70℃(高严格性)，以及最佳者的温度为至少75℃(很高严格性)。
利用用X光片(X-ray film)检测在上述条件下的寡核苷酸探针杂交的分子。
附图说明
图1为以浓度3(含有浓缩14.3倍的固体乳浆颗粒的乳浆混合物)或安慰剂治疗的动物的心率测量示意图，每一数据点代表8个动物的平均值，其中这些动物的活性周期是符合无光线的周期，如以黑色条表示的周期。
图2为在动物接受含有固体乳浆成份的乳浆混合物后，于周期12-15小时的动物心率降低示意图，这固体乳浆成份是分别经浓缩2、6、14.3及21次，相对于在牛奶发酵后取得的乳浆中所含有的固体成份数量。这些动物是以胃管喂食法给予乳浆产品，即利用一胃管喂食。(O)表示安慰剂，动物心率的测定是如例1所述，且与未经治疗动物的心率相比较。
实施例
实施例1：心率降低特性的体内(in vivo)试验
材料与方法
菌种与培养(Strains and cultivation)
将菌种涂布在耐甲氧西林葡萄球菌琼脂(MRS agar)上，并在厌氧性、37℃的环境下培养48小时，选择单一菌落(colony)，再接种至MRS培养液中，并于37℃下过夜培养。准备来自隔夜的贮存培养菌，将其贮存在-80℃的20％甘油中；再将这一菌种置于牛奶中预培养过夜，以1％(v/v)活化到新鲜牛奶中准备发酵。
样品的制备
乳浆：样品1
将含有1％(v/v)单一菌落菌种的牛奶(蛋白质含量9.5％)发酵16小时，这发酵产品先经过离心，将颗粒状物去除，且乳浆是通过0.45毫米滤膜进行过滤，并冷冻干燥的。第二次发酵，在与第一次发酵的相同条件下进行发酵，经离心后取得乳浆部份，其颗粒状物是已去除，并将乳浆通过0.45毫米滤膜进行过滤并冷冻的。在喂食大鼠的前，这乳浆是用来溶解冷冻干燥乳浆粉末并浓缩21倍。
溶解在乳浆中的冷冻干燥发酵牛奶：样品2
将含有1％(v/v)单菌落菌种的牛奶(蛋白质含量9.5％)发酵16小时，且所有产品皆为冷冻干燥。第二次发酵，在与第一次发酵的相同条件下进行发酵，经离心，以去除颗粒状物，并将乳浆通过0.45厘米滤膜进行过滤并冷冻的。在喂食大鼠的前，这乳浆是用来溶解冷冻干燥乳浆粉末并浓缩5倍。
溶解在牛奶中的冷冻干燥发酵牛奶：样品3
将含有1％(v/v)单菌落菌种的牛奶(蛋白质含量9.5％)发酵16小时，且所有产品皆为冷冻干燥。在喂食大鼠的前，这牛奶(蛋白质含量9.5％)是用来溶解冷冻干燥乳浆粉末并因此浓缩5倍。
隔夜牛奶发酵产品：样品4
将含有1％(v/v)单菌落菌种的牛奶(蛋白质含量9.5％)发酵16小时。经热处理的隔夜牛奶发酵产品：样品5
将含有1％(v/v)单菌落菌种的牛奶(蛋白质含量9.5％)发酵16小时。
自发性高血压大鼠(Spontaneous Hypertensive Rats)
自发性高血压大鼠(SHR)是来自于IFFA CREDO(a Charles River company)，里昂，法国。
每一次治疗是在9：15至9：30的间以胃管灌食法实施，且每一只动物接受总体积2.5毫升的剂量。
实验设计
分成三组别
第1组(n＝16)：接受治疗1(牛奶；n＝16)
第2组(n＝12)：接受连续治疗，每一次实施是间隔3天的间隔
组别：(1)安慰剂(牛奶)
(2)样品1(悬浮在乳浆中的冷冻干燥乳浆，并浓缩21倍)
(3)样品2(悬浮在乳浆中的冷冻干燥发酵牛奶，并浓缩5倍)
(4)样品3(悬浮在中性pH值牛奶中的冷冻干燥发酵牛奶，并浓缩5倍)
(5)样品4(只是发酵牛奶产品)
(6)样品5(在发酵后经过加热处理的发酵牛奶)
(7)样品6(未经过发酵，但具有乳酸菌的牛奶)
在所有SHR进行实验的前，先使其适应动物环境9星期，这外，在进行第一次胃管灌食法的前，所有动物须先习惯胃管灌食法，并测量3天的心脏收缩压。
研究参数(Investigated parameters)
在经胃管喂食24小时后，利用遥测技术(telemetry，Data Sciences Int.)测定清醒的SHR在不同时间点的心脏收缩压及心率。
简言的，在喂食前24小时及喂食后48小时的间，每15分钟记录其心脏收缩压、心脏舒张压及心率的平均值(超过一分钟周期)。
藉由这些追踪记录，计算每一组别的心脏收缩压、心脏舒张压以及心率的24小时平均值。
再者，心脏收缩压与心脏舒张压的变动是由每个样本与未经治疗的数值相比较，是计算喂食24小时，且在喂食后的时间3至6、12至15及21至24小时周期。
统计(Statistics)
所有结果皆以平均值±平均标准误差来表示，在未经治疗数值与每一本体经胃管喂食后取得的值间的差异是使用配对student’的t-试验(paired student’s t-test)来计算统计，且这计算是利用计算机程序SIS TAT8.0来进行。
结果
在表1中是显示测定心率的变动。
表1 胃管喂食后的心率(心跳次数/分钟，beats/min)
Figure C200480009291D00281
*：p<0.05vs.未经治疗
未经治疗1及未经治疗2是分别作为研究编号1与研究编号2的控制组，未经治疗1是作为样品1的安慰剂且未经治疗2则是作为其它样品的安慰剂。由于本研究是分别以二种不同的体内研究来进行，故在这是具有2种安慰剂。
上述的结果证明，浓缩21倍的(例1)浓缩的乳浆产品是具有最强的心率降低特性。
这些结果亦证明，无须浓缩发酵牛奶产品来取得一显著的心率降低功效。样品4和样品5是为发酵整晚的发酵牛奶产品，且其是具有心率降低功效，然而，这心率降低功效是与产品的浓缩倍数成比例关系。
显然地，包含多肽或其它活性成份的产品的乳浆部份是为心率降低功效的决定因素，并可在这产品中观察到一剂量-心率降低功效。
样品3是为悬浮在中性pH值牛奶中的冷冻干燥发酵牛奶，可降低心率。证明在这描述的发酵产品是具有广泛的应用，这是因为它可溶解在不同液体中，以得到所需的最终的适当使用。不同pH值并不影响产品的心率降低活性。
发酵后经热处理的样品5也可降低心率，一般来说，所有在这样品内的细菌皆被杀死，因此，即证明在最终产品中并不需要活的细菌。
样品6是没有经过发酵，但其含有活的细菌，其无法降低心率，故证明发酵步骤为必须的。
实施例2：PCR扩增反应
模板DNA(template DNA)是通过酚-氯仿(phenol-chloroform)抽提法取得的，如前面所述(Marmur(1961，Journal of Molecular Biology，3，208-218)。最终制备的是在TE缓冲液+RNA酶中的基因组模板DNA。
这PCR反应的制备如下所述：
(1)1.0μl的模板DNA；
1.0μl的正向引物(forward primer)(5pmol/μl)；
1.0μl的反向引物(reverse primer)(5pmol/μl)；
1.0μl、2.5mM的dNTP(dATP、dCTP、dGTP及dTTP的混合物)；
5.0μl Mg缓冲液(20mM MgSO4)；
0.5μl DNA聚合酶(Pwo，100U)；以及
10.5μl水(H2O)。
(2)PCR扩增的热程序是为30个循环，包括在94℃下1分钟，在50℃下90秒(当引物Tm在55℃左右)、55℃下90秒(当引物Tm在62℃左右)、45℃下90秒(当引物Tm在50℃左右)以及在72℃下1分钟。在30个循环完成后，这些样品冷却到4℃。
(3)这PCR产品是跑在60V的1.5％琼脂糖胶(agarose gel)中，在紫外光下自琼脂糖胶中分离，并根据制造商操作指南(Qiagen，Cat.No.28704)来使用器材QIAquick GelExtractionKit进行纯化。
实施例3：蛋白质水解(ACE)活性分析
保存菌种的制备(stock culture)
乳酸杆菌(Lactobacillus)菌种接种在耐甲氧西林葡萄球菌琼脂(MRS agar)上，并在厌氧性(anaerobically)、37℃的环境下培养48小时，选择单一菌落(colony)，再接种至MRS培养液中，并于37℃下培养过夜。乳酸杆菌种是形成在M17琼脂上，并在好氧性(aerobically)、30℃的环境下培养48小时，选择单一菌落，再接种至M17培养液中，并于30℃下培养过夜。从上述过夜培养物里得到保存菌种，在20％甘油中贮存在-80℃。
发酵牛奶的制备与多肽或其它活性成份的提取
在以实施例1(1％v/v)的隔夜贮存培养菌接种至200毫升新鲜牛奶中进行发酵，并根据使用的菌种不同判断其温度是整夜保持在37℃或30℃。
在该新鲜牛奶中，多肽或其它活性成份的提取是可藉由使用下列程序来得到：
-在室温下进行10分钟、3000g的离心。
-分离出上清液，并以NaOH调整酸碱值至pH8.3(ACE活性试验的最佳pH值)。
-在室温下对取得的上清液进行10分钟、3000g的离心。
-分离出上清液(乳浆)，其是包含多肽或其它活性成份。
-利用Lowry试验(Lowry et al，1951.J.Biol.Chem.，193:265-275)，测定在乳浆中的多肽浓度(每毫升乳浆中含有的多肽毫克数)。
乳浆是直接以ACE分析并在-20℃下冷冻的，且这乳浆包含多肽或其它活性成份，即是实施例3的″多肽溶液″。
ACE活性分析
发酵牛奶中的多肽是进行体外(in vitro)ACE活性试验。多肽浓度为DL50(mg/ml)，其是抑制50％的ACE活性，这值越低，发酵牛奶就具有越好的抗高血压功效。提取出的多肽或其它活性成份是以下列的程序来进行检测：
这试验分析主要是ACE降解一HHL(hippuryl-L-histidyl-L-leucine)基质，并加入染色剂(color reagent)进行染色。若存在有多肽或其它活性成份，这多肽或其它活性成份是抑制ACE，并有较少的HHL基质降解，亦即在加入染色剂的后，形成有较少的颜色。
溶液制备：
培养缓冲液(Incubation buffer)：188mmole/l硼酸，pH值为8.3，及1.375mmole/l的氯化钾。(将2.91克硼酸与25.63克氯化钾溶解在200ml的蒸馏水中，以1mol/l的氢氧化钾(potassium hydroxide)将pH值调整为8.3，并以250毫升蒸馏水稀释的；贮存在室温下)。
基质溶液(Substrate solution)：5.8mmol/l的HHL。(将250毫克的HHL溶解在90毫升的培养缓冲液中，并以相同缓冲液补充到100毫升，这基质溶液是可使用至少2星期)。
终止溶液(Stop solution)：100mmol/l的HEPES，pH值为9，2.5mmol的EDTA。(将23.83克的HEPES与0.93克的EDTA溶解在800毫升的蒸馏水中，以1mol/l的氢氧化钠将pH值调整为9，并以蒸馏水稀释到1公升；贮存在室温下)。
染色剂：136mmol/l的三聚氯氰(cyanuric chloride)在1，4-二氧陆圜(1，4-dioxane)中。(将12.50毫克的三聚氯氰溶解在400毫升的1，4-二氧陆圜中，并补加1，4-二氧陆圜至500毫升，贮存在室温下及暗棕色玻璃瓶内)。
分析：(所有溶液先冷却至室温)
-制造一经由培养缓冲液连续稀释的多肽溶液，这连续6次稀释是将未稀释的多肽溶液稀释至空白(只有培养缓冲液)。
-对每次稀释而言，放置10μl的多肽溶液、40μl的基质(HHL)溶液(2.5g/l)以及2.5μl的ACE(0.25单位/毫升)于一玻璃管中。
-阳性对照包括2.5μl的ACE、10μl的培养缓冲液以及40μl的基质(HHL)溶液。
-阴性对照包括12μl的培养缓冲液以及40μl的基质(HHL)溶液。
-在37℃下培养1小时。
-加入300μl的终止溶液停止反应，随后以150μl的染色剂混合。
-沉积5分钟，并在室温下以3300g离心30分钟，以去除变质的蛋白质和过量的三聚氯氰。
-转移每一样品的300μl上清液至微量滴定盘(microtiterplate)的孔洞中。
-在405nm下一水作对照进行读取。
这SCE抑制百分比是以下列公式表示的：
ACE抑制活性＝(OD 405nm阳性对照-OD 405nm样品)/(OD 405nm阳性对照-OD405nm阴性对照)
每次稀释是具有其所属的ACE抑制百分比值，提供一曲线表示ACE抑制百分比与乳浆的多肽浓度的函数。DL 50(具50％抑制活性的多肽浓度)的获得是藉由读取位在该曲线与轴上对应的50％ACE抑制点的交叉点的多肽浓度而得到。
实施例4：剂量反应实验
为了更进一步证实在实施例1的结果，一剂量反应实验的进行是藉由调控含有不同的量来自发酵牛奶的乳浆中分离的发酵奶的冷冻干燥乳浆给自发性高血压大鼠(SHR)。
一般而言，使用的材料、方法与实验设计是与实施例1所描述的内容相同。
简言的，将具有瑞士乳杆菌品种CHCC5951(DSM 14998)的牛奶接种1％(v/v)菌种发酵16小时，这发酵牛奶先经过离心，将颗粒状物去除，并将乳浆冷冻干燥。在与第一次发酵的相同条件下进行第二次发酵，经离心，再将颗粒状物去除，并将乳浆放置在4℃下。这乳浆是用来溶解冷冻干燥乳浆粉末，以产生包含固体乳浆成份的混合物，其是经2、6及14.3次的浓缩，相对于在第二次发酵中获得的乳浆固体成份数量。在喂食这混合物给大鼠之前很短时间进行溶解的最后一步。
如实施例1所示，未发酵牛奶是作为安慰剂。
以最低浓度的剂量开始，在三组分开试验-周期的相同实验动物上进行试验，每一试验-周期的间是以三天的间隔分开的，这期间的动物并不接受发酵乳浆产品，以排除前次剂量的影响。
上述的实验结果显示在表2的表格中。
表2胃管喂食后的心率(beats/min)
 
组别                 周期                相对于安慰剂的变动0-24   3-6    12-15   21-24   0-24   3-6   12-15   21-24
未经治疗 306±2   265±5  337±5  273±2安慰剂   304±2   268±2  333±3  278±4   -2     +3    -4     +5
安慰剂   314±11  282±12 335±12 295±14浓度1    302±7   278±10 324±7  274±7 -12    -4    -11    -21
安慰剂   314±9   278±8  346±9  288±8浓度2    309±9   287±10 334±9  289±11 -5     +8     -12    +1
安慰剂   311±9   278±9  337±11 279±8浓度3    297±9   279±15 314±7  277±10 -14    +1    -24     -2
注：未经治疗大鼠是指未接受牛奶及乳浆产品者，安慰剂是非发酵牛奶，浓度1、2及3分别为包含有固体乳浆成份的浓缩2、6及14.3次的乳浆混合物，且动物的活性周期是符合无光线周期，亦即时间周期9至21。
在第3图中是显示一浓度3(14.3倍浓缩)的完全周期。
另外，冷冻干燥乳浆粉末是产生包含固体乳浆成份的混合物，其是经21次的浓缩，相对于在第二次发酵中获得的乳浆固体成份数量。将浓缩2、6、14.3次以及21次的的乳浆产品喂食给动物的结果是如第2图所示。
这结果显示浓缩至21倍的乳浆产品对心率作用有一个明显的剂量依赖效应。乳浆产品的剂量越高，具有越大的心率降低效应。固定或渐进的水平线并未达到，表示，包含更高浓度活性成份的混合物可预期到具有更高的降低心率功效。
实施例5：降低在高活性期间的心率变动
在这些动物的活性周期间，其心率是增加的。本研究的动物活性周期几乎与无光线周期相符合，即第1图所示的黑色条状的周期。然而，由观察第1图结果可判断，未经治疗动物相对于以14.3倍浓缩发酵乳浆产品治疗的动物而言，具有较大的心率以及心率变动。
为了对心率变动进行定量，估计在时间周期12及15小时的间所观察到的心率值变动。标准误差(standard deviation)是用以估计已经治疗及未经治疗动物，且这估计是利用在实施例1中所描述的SISTAT 8.0程序来进行，并用来计算变动值((标准误差)2＝变动值)。
用于已治疗动物的标准误差是估计为5.9，则其相对的变动值为(5.9)2＝34.8。
用于未经治疗动物的标准误差是估计为10.4，则其相对的变动值为(10.4)2＝108.2。
假定主要数据是为正常分布的，34.8的变动值的统计意义与位于95％层级的108.2变动值有所不同。
因此，相对于以14.3倍浓缩发酵乳浆产品治疗的动物的心率变动而言，是可推断出在已治疗动物中的活性周期的心率变动是相当地大。
总之，心率变动是藉由以瑞士乳杆菌品种CHCC5951(DSM 14998)发酵的乳浆产品来使之稳定，这一点可以成为这产品的重要特征，因为在一实验性兔模型(Zaza etal 2001)中观察到心率变化与死亡率的关连性，以及特别是在紧张处境下屡次观察到心率的变动。
实施例6：以瑞士乳杆菌品种CHCC5951发酵的乳浆产品与以不同菌种发酵的类似商业性产品间的比较
这实施例的目的是用来比较以商业性乳酸菌发酵的乳浆产品，表明具有以瑞士乳杆菌品种CHCC5951(DSM 14998)发酵的产品的血压还原特性。
这二种产品在血压与心率功效的检测，是将这二混合物提供给Wistar大鼠，并测量麻醉动物的心脏收缩压、心脏舒张压以及心率。
假如没有特别提及，材料与方法是与实施例1所描述的内容相同。
简言之，将含有瑞士乳杆菌品种CHCC5951(DSM 14998)的牛奶以1％(v/v)接种发酵16小时，且产生的产品是经冷冻干燥而得到冷冻干燥牛奶粉末。第二次发酵，在与第一次发酵的相同条件下进行发酵及离心，且其颗粒状物是已去除，并将乳浆通过0.45厘米滤膜进行过滤并冷冻的；在喂食大鼠之前很短时间，冷冻干燥牛奶粉末才溶解在乳浆中。溶解粉末的乳浆体积相当于得到这些粉末的乳将体积的1/5(如4.28克的粉末溶解在30毫升的乳浆中)。本例中所指的混合物是5倍浓度的。这混合物是在9：15时至9：30时的间提供给整夜血压正常的Wistar大鼠上，并以每公斤7.5毫升的x5混合物的剂量进行胃管灌食法；再口服(oral administration)之后，测量麻醉动物的动脉血压值与心率值，以计算14：30时至16：30时之间的混合物的功效。
得到的结果如表3所示。
表3两种不同发酵产品的血压与心率功效
 
未经治疗 商业性产品 CHCC5951发酵牛奶产品
心脏收缩压(mmHg) 134±3 125±3* 125±3*
心脏舒张压(mmHg) 107±3 98±4* 96±2*
平均血压(mm Hg) 116±3 107±4* 106±2*
心率(心跳次数/分钟) 390±7 387±6 353±6*
经胃管喂食后5-7小时，在这三种群组的心脏收缩压、舒张压、平均动脉血压及心率的值(平均±SEM)。
*表示在已治疗与未经治疗大鼠间的p<0.05层级的显著差异。在以Tukey试验倍数比较后，再使用ANOVA进行统计分析。
通过这些数据，可以推断出商业性产品与CHCC5951发酵产品皆可降低血压，并可达到相同的程度。然而，表3中的数据意外地显示，只有CHCC5951发酵产品可有效降低心率。
以上所述的实施例仅是为说明本发明的技术思想及特点，其目的在使熟习这项技艺的人士能够了解本发明的内容并据以实施，不能以此限定本发明的专利范围，即凡是依本发明所揭示的精神所作的均等变化或修饰，仍应涵盖在本发明的专利范围内。
<110> 科.汉森有限公司(Chr.Hansen A/S)
<120> 具有心率降低特性的混合物(Composition with heart rate reducing properties)
<130> P1040PC00
<160> 18
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 5550
<212> DNA
<213> 瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(5550)
<223>
<300>
<308> GeneBank/A133727
<309> 1999-08-23
<313> (1)..(5550)
<400> 1
atg agg aga aac aaa tat gca ggc tta tta gtt tgt gcc act act cta  48
Met Arg Arg Asn Lys Tyr Ala Gly Leu Leu Val Cys Ala Thr Thr Leu
1            5               10               15
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Ser Val Val Ser Val Phe Ser Thr Ala Glu Gln Gln Val Lys Ala Ser
          20              25               30
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Val Asp Ser Gln Thr Lys Thr Val Glu Lys Ser Thr Lys Ala Ala Glu
      35                40             45
tct act aca gca aat tta act aac aaa gca gtt gaa gcg caa tta gcc   192
Ser Thr Thr Ala Asn Leu Thr Asn Lys Ala Val Glu Ala Gln Leu Ala
   50              55               60
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Ala Lys Gly val Asn Phe Lys His Leu Thr Val Asn Gln Lys Gln Asp
65              70               75             80
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val Tyr val Asp ValIle Val Gln Leu Ser Ala Thr Pro Ala Ala Thr
              85            90              95
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Asn Gly Ser Val Ser Ala Asn Ser Ser Ser Ala Glu Ile Glu Gln Ala
         100              105             110
tct aaa aaa gta att gcc aat caa gct tct att aag gaa aaa gtt aag  384
Ser Lys Lys Val Ile Ala Asn Gln Ala Ser Ile Lys Glu Lys Val Lys
      115               120            125
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Ala Ile Thr Asn Gln Ala Ile Gly Lys Ser Tyr Gly Tyr Val Val Asn
   130              135             140
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Gly Phe Ala Thr Lys Ala Lys Val Lys Asp Ile Gln Lys Leu Arg Asn
145             150             155              160
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             165            170              175
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Asp Ser Ser Ala Asp Asn Met Ala Asn Val Ser Thr Val Trp Asn Asn
          180             185             190
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Tyr Lys Tyr Lys Gly Glu Gly Thr Val Val Ser Ile Ile Asp Thr Gly
      195              200             205
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Ile Asp Pro Asn His Lys Asp Leu Arg Leu Ser Asp Asp Ser Lys Val
   210              215              220
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Lys Leu Thr Lys Asp Lys Val Asn Ala Phe Thr Lys Glu Ser Gly Tyr
225              230             235              240
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Gly Arg Tyr Phe Thr Asp Lys Val Pro Tyr Gly His Asn Tyr Ser Asp
             245             250              255
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Asn Asn Asp Asn Ile Thr Asp Asp Asn Pro Ser Glu Gln His Gly Met
         260               265             270
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      275              280              285
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Ser Val Val Gly Val Ala Pro Glu Ala Gln Leu Leu Ala Met Lys Ala
   290              295                300
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Phe Ser Asn Ser Asp Ser Ser Ala Ser Thr Asp Ser Thr Ser Ile Ile
305              310             315              320
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Gly Ala Ile Asp Asp Ser Ala Lys Leu Gly Ala Asp Val Leu Asn Met
            325             330               335
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Ser Leu Gly Ser Val Ser Gly Glu Gln Thr Glu Asp Asp Pro Glu Val
        340              345                  350
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Ala Ala Val Glu Arg Ala Thr Lys Lys Gly Thr Ala Ala Val Ile Ser
      355              360               365
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Ala Gly Asn Ser Gly Thr Ser Asn Ser Glu Ile Glu Gly Val Asn Lys
   370               375             380
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Ala Tyr Tyr Gly Asn Pro Asp Met Glu Thr Leu Gly Asn Pro Gly Thr
385              390               395             400
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Ala Arg Ser Ala Thr Thr Val Ala Ser Ala Glu Asn Thr Lys Ala Thr
            405               410              415
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Thr Asp Gly Val Thr Ile Thr Ser Ala Asp Gly Lys Thr Thr Ile Ala
          420              425               430
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Gly Pro Glu Ala Thr Gln Leu Ser Glu Gly Thr Asp Arg Ala Phe Phe
      435              440               445
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    450              455              460
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465               470            475               480
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Ile Val Lys Arg Gly Glu Leu Thr Phe Thr Asp Lys Gln Lys Tyr Ala
              485            490                495
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Gln Glu Ala Gly Ala Ala Gly Leu Ile Ile Val Asn Asn Lys Ala Gly
         500             505                510
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Asp Ile Thr Gly Met Leu Leu Asn Ala Gly Phe Pro Thr Ala Gly Leu
      515            520                  525
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Ser Ala Thr Ser Gly Glu Lys Leu Val Lys Tyr Val Glu Ala His Pro
    530              535             540
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Asp Glu Ala Leu Lys Val Ser Ile Val Val Gln Ala Leu Asn Asn Ser
545              550          555                  560
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             565             570              575
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Ser Ser Leu Ala Phe Lys Pro Asp Ile Ser Ala Pro Gly Gly His Ile
         580              585                590
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Trp Ser Thr Gln Asn Asn Asn Gly Tyr Thr Asn Met Ser Gly Thr Ser
      595              600              605
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   610               615              620
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625              630             635               640
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              645             650               655
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Ser Ile Gln Pro Asp Ile Ser His Asp Asn Val Ile Val Ser Pro Arg
          660             665              670
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      675              680               685
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Thr Asn Arg Thr Asn Lys Ala Leu Thr Tyr Lys Leu Ala Asn Asn Gly
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Lys Asn Ser Asp Val Tyr Thr Ser Ala Thr Asp Ser Ser Ala Val Leu
          740             745                750
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Tyr Asp Lys Lys Ile Asp Gly Ala Ser Val Lys Ala Ser Gly Asp Ile
      755              760               765
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Phe Val Pro Ala Asn Ser Thr Lys Glu Leu Thr Leu Thr Leu Thr Leu
  770                775             780
cct agt gac ttt aaa gaa aat caa tat gtt gaa ggc ttc tta aca ttt  2400
Pro Ser Asp Phe Lys Glu Asn Gln Tyr Val Glu Gly Phe Leu Thr Phe
785                790            795               800
aat agt tca gat tct tca caa ttg cgt ctt cca tat atg ggc ttc ttt  2448
Asn Ser Ser Asp Ser Ser Gln Leu Arg Leu Pro Tyr Met Gly Phe Phe
             805               810              815
ggc gat tgg gca agt tca gat ctt cca atc ttt gct agt ctt aat gat  2496
Gly Asp Trp Ala Ser Ser Asp Leu Pro Ile Phe Ala Ser Leu Asn Asp
           820            825                830
cca aat gta ttt cag cct gac aac aat atg ttt ggt aca ttg gta act  2544
Pro Asn Val Phe Gln Pro Asp Asn Asn Met Phe Gly Thr Leu Val Thr
      835              840                845
gta ggt aat agt tca gac aat act aat cct ggt tta agc caa gac gcc  2592
Val Gly Asn Ser Ser Asp Asn Thr Asn Pro Gly Leu Ser Gln Asp Ala
   850                  855           860
tct ggt aac tta agt ttt gat tct tcg aaa ttt gca att tct aat gct  2640
Ser Gly Asn Leu Ser Phe Asp Ser Ser Lys Phe Ala Ile Ser Asn Ala
865              870                875             880
aaa aat gca caa ttt aag tgg ttt aaa cct act tac tac tta tac aga  2688
Lys Asn Ala Gln Phe Lys Trp Phe Lys Pro Thr Tyr Tyr Leu Tyr Arg
             885              890               895
aac gca aac aac gtt aaa atc caa att tta gat aag aat ggt aaa gta  2736
Asn Ala Asn Asn Val Lys Ile Gln Ile Leu Asp Lys Asn Gly Lys Val
          900              905             910
atc aat act tta gcc tct ttg agt aac gca acc aag act tac tat aac  2784
Ile Asn Thr Leu Ala Ser Leu Ser Asn Ala Thr Lys Thr Tyr Tyr Asn
      915               920               925
tct caa gct caa agc tat act tat ttt gac gat gct cct tct tgg gac  2832
Ser Gln Ala Gln Ser Tyr Thr Tyr Phe Asp Asp Ala Pro Ser Trp Asp
  930              935                940
ggc aca tac ttc gat caa caa gct aat aaa act gtt aat gct cct gat  2880
Gly Thr Tyr Phe Asp Gln Gln Ala Asn Lys Thr Val Asn Ala Pro Asp
945              950             955               960
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Gly Asn Tyr Thr Tyr Arg Ile Ser Ala Thr Ile Asp Gly Thr Asn Thr
         965                   970              975
gaa caa cat tac gat atc cct gtt aaa gtt gac agt gtt gca cct gta  2976
Glu Gln His Tyr Asp Ile Pro Val Lys Val Asp Ser Val Ala Pro Val
          980             985                990
gta aag aac ctt aaa tta gaa tca agc aag gtt gaa gat gct aaa ggt  3024
Val Lys Asn Leu Lys Leu Glu Ser Ser Lys Val Glu Asp Ala Lys Gly
      995               1000             1005
caa gag caa aca cgt tac tac tta tct gca gaa gca aaa gat gaa  3069
Gln Glu Gln Thr Arg Tyr Tyr Leu Ser Ala Glu Ala Lys Asp Glu
   1010             1015             1020
ctc agt ggt tta agt gga gac gca aat gtt tct gtc aat ggc gtt  3114
Leu Ser Gly Leu Ser Gly Asp Ala Asn Val Ser Val Asn Gly Val
   1025             1030             1035
tca gct caa tta gaa tac gat cct act gct aag gct gat aag gat  3159
Ser Ala Gln Leu Glu Tyr Asp Pro Thr Ala Lys Ala Asp Lys Asp
  1040             1045             1050
ggt ttc caa aaa gtg gaa atc gat tta tcc cca gct caa gca aag  3204
Gly Phe Gln Lys Val Glu Ile Asp Leu Ser Pro Ala Gln Ala Lys
   1055               1060           1065
gct ctt caa gca ggt aca aac acc ttt tct gtt gcc tta ttc gat  3249
Ala Leu Gln Ala Gly Thr Asn Thr Phe Ser Val Ala Leu Phe Asp
  1070               1075           1080
aat gct gca aat gca ggt aca gct tca ggt gaa ggc aat aaa cca  3294
Asn Ala Ala Asn Ala Gly Thr Ala Ser Gly Glu Gly Asn Lys Pro
    1085             1090            1095
ggt gaa act aac ttc ggt tta gtt ctt aga aac ggt ggc tta cca  3339
Gly Glu Thr Asn Phe Gly Leu Val Leu Arg Asn Gly Gly Leu Pro
 1100                 1105            1110
gac aaa atc tca tct caa act aag ggc tac gat gcc aaa aat ggt  3384
Asp Lys Ile Ser Ser Gln Thr Lys Gly Tyr Asp Ala Lys Asn Gly
  1115                1120            1125
act tat gta ttc tct ggt act tac cca agc aaa ctc tat gga act  3429
Thr Tyr Val Phe Ser Gly Thr Tyr Pro Ser Lys Leu Tyr Gly Thr
  1130              1135                  1140
tac act gat aaa gat ggt caa acc cat gac tta aat gta gaa agt  3474
Tyr Thr Asp Lys Asp Gly Gln Thr His Asp Leu Asn Val Glu Ser
  1145               1150            1155
gat ggc aac aag tta ttc gtt gca aag ctt cca ctt tct aaa gat  3519
Asp Gly Asn Lys Leu Phe Val Ala Lys Leu Pro Leu Ser Lys Asp
   1160              1165            1170
gac tat aag act act gtt acc ctt tac gct gat tct gac cat aag  3564
Asp Tyr Lys Thr Thr Val Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Asp His Lys
  1175             1180             1185
acc ttg ctt aag aaa caa gac att acc gta agc tta gtc cca gct  3609
Thr Leu Leu Lys Lys Gln Asp Ile Thr Val Ser Leu Val Pro Ala
  1190               1195            1200
aag gtc gaa agt ttg tct gta gat aag aat gat act tat gat gag  3654
Lys Val Glu Ser Leu Ser Val Asp Lys Asn Asp Thr Tyr Asp Glu
  1205              1210           1215
act aaa gat tcg tcg gct gca tta gct caa act tct gaa aac act  3699
Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Leu Ala Gln Thr Ser Glu Asn Thr
  1220               1225             1230
gta aaa ctt tct ggt aaa gta agt ggt gat act aag act tta gtg  3744
Val Lys Leu Ser Gly Lys Val Ser Gly Asp Thr Lys Thr Leu Val
  1235                1240            1245
gtt aaa caa aaa ggt cag aaa gac atc tca gtt aaa ctt aat gct  3789
Val Lys Gln Lys Gly Gln Lys Asp Ile Ser Val Lys Leu Asn Ala
  1250               1255             1260
gat cac aca ttt agt act gaa ctg cca gta agc ttt ggt gaa aat  3834
Asp His Thr Phe Ser Thr Glu Leu Pro Val Ser Phe Gly Glu Asn
   1265             1270            1275
gac ttt act att gta gca acc gac tct aat ggt aat tca tct agt  3879
Asp Phe Thr Ile Val Ala Thr Asp Ser Asn Gly Asn Ser Ser Ser
  1280                1285           1290
gta gaa caa aaa gtt aaa tct agt gat cgt ggt aaa act act gtt  3924
Val Glu Gln Lys Val Lys Ser Ser Asp Arg Gly Lys Thr Thr Val
  1295                 1300            1305
tca agt agt gat gtt acc ttc gat aac ggt atc aag tgg ggt act  3969
Ser Ser Ser Asp Val Thr Phe Asp Asn Gly Ile Lys Trp Gly Thr
  1310               1315               1320
cgt aac gtt aac ggt att cgt aac gtt aac gcc aag act aag aac  4014
Arg Asn Val Asn Gly Ile Arg Asn Val Asn Ala Lys Thr Lys Asn
  1325              1330             1335
tac aat cct aag act ggt gag tta acc ctt act ggt aaa gta aaa  4059
Tyr Asn Pro Lys Thr Gly Glu Leu Thr Leu Thr Gly Lys Val Lys
  1340               1345            1350
aga cca act act act ttg caa att ggc ggt aaa aac gta aaa att  4104
Arg Pro Thr Thr Thr Leu Gln Ile Gly Gly Lys Asn Val Lys Ile
   1355              1360           1365
aat tca gat cag aca ttt aaa gta gta tta aat att ggt act cat  4149
Asn Ser Asp Gln Thr Phe Lys Val Val Leu Asn Ile Gly Thr His
  1370               1375            1380
ggt gct aag att ttc cct gcg ttg atc ggt gat tca act gtt aga  4194
Gly Ala Lys Ile Phe Pro Ala Leu Ile Gly Asp Ser Thr Val Arg
   1385               1390            1395
gaa act act caa gaa aga tta agt ttc tat gta gat gca gaa gct  4239
Glu Thr Thr Gln Glu Arg Leu Ser Phe Tyr Val Asp Ala Glu Ala
  1400               1405            1410
cct act ttg aac tta gat agt gaa aac act gtc tac acc aac aag  4284
Pro Thr Leu Asn Leu Asp Ser Glu Asn Thr Val Tyr Thr Asn Lys
  1415              1420             1425
gat aag ttt act atc tca ggc act ata agt gat gat tac aag ttc  4329
Asp Lys Phe Thr Ile Ser Gly Thr Ile Ser Asp Asp Tyr Lys Phe
  1430              1435             1440
tac gac tta tca ata aat ggt aac gat gtt gaa act agc tgg agc  4374
Tyr Asp Leu Ser Ile Asn Gly Asn Asp Val Glu Thr Ser Trp Ser
  1445              1450             1455
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Ala Val Asp Tyr His Ser Lys Glu Gly Ile Lys Lys Asn Phe Lys
   1460               1465           1470
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His Glu Val Asp Leu Lys Lys Gly Lys Asn Thr Phe Asn Val Lys
   1475                  1480           1485
gta act gac att cag ggt aac tca agt tca caa gca tta gtt gta  4509
Val Thr Asp Ile Gln Gly Asn Ser Ser Ser Gln Ala Leu Val Val
  1490               1495            1500
tac tat gaa cct gct aag act tta gct gag cct agt gta gac aag  4554
Tyr Tyr Glu Pro Ala Lys Thr Leu Ala Glu Pro Ser Val Asp Lys
  1505                1510           1515
ttg tta aca aag acg gca aat ttg caa ctt ctt aaa gct act act  4599
Leu Leu Thr Lys Thr Ala Asn Leu Gln Leu Leu Lys Ala Thr Thr
  1520                1525            1530
gat gaa tct gaa gct aaa gtt gtt tac agc ctt gat aat ggc aag  4644
Asp Glu Ser Glu Ala Lys Val Val Tyr Ser Leu Asp Asn Gly Lys
  1535              1540             1545
aca ttc aac gat gta cca gct gat ggt ttc aag gtt act gaa aac  4689
Thr Phe Asn Asp Val Pro Ala Asp Gly Phe Lys Val Thr Glu Asn
  1550               1555              1560
gga act gta caa ttt aaa gca gtt gat aaa tac ggc aac gaa tcc  4734
Gly Thr Val Gln Phe Lys Ala Val Asp Lys Tyr Gly Asn Glu Ser
  1565              1570             1575
aaa gtc aag tct gta gaa att aag gga ctt aac aag gaa aac caa  4779
Lys Val Lys Ser Val Glu Ile Lys Gly Leu Asn Lys Glu Asn Gln
   1580              1585            1590
cct agc gaa gat aag gaa tta gct aag gct aag gaa aat ctt cag  4824
Pro Ser Glu Asp Lys Glu Leu Ala Lys Ala Lys Glu Asn Leu Gln
  1595               1600            1605
gct aag gtt gat gcc ggt gaa aag aag gat ctt gat aag tac act  4869
Ala Lys Val Asp Ala Gly Glu Lys Lys Asp Leu Asp Lys Tyr Thr
  1610                1615           1620
gct gac tcc aag aag gac ttc aat gat gcc ttg aag aag gct aag  4914
Ala Asp Ser Lys Lys Asp Phe Asn Asp Ala Leu Lys Lys Ala Lys
  1625              1630             1635
gat gtt tta gct gac aag aat gct aaa tta gct gac ctt caa gat  4959
Asp Val Leu Ala Asp Lys Asn Ala Lys Leu Ala Asp Leu Gln Asp
  1640              1645             1650
gct gct aag gct ctt gat aag gca gag caa gct tta act gaa aag  5004
Ala Ala Lys Ala Leu Asp Lys Ala Glu Gln Ala Leu Thr Glu Lys
  1655              1660             1665
cct gct gaa cca act atc cca ctg cta caa ggg aac aat aat gct  5049
Pro Ala Glu Pro Thr Ile Pro Leu Leu Gln Gly Asn Asn Asn Ala
  1670               1675              1680
gta tcg aat att aat act tcc tct gat aac caa gtt gca gct cct  5094
Val Ser Asn Ile Asn Thr Ser Ser Asp Asn Gln Val Ala Ala Pro
  1685              1690             1695
gtg cat gct gaa aaa gac acc aag aat gat aac aag aat aca aca  5139
Val His Ala Glu Lys Asp Thr Lys Asn Asp Asn Lys Asn Thr Thr
  1700             1705              1710
gaa gaa ggt aag gac act aag gta atg ttc aag tca gtt ctt tac  5184
Glu Glu Gly Lys Asp Thr Lys Val Met Phe Lys Ser Val Leu Tyr
    1715            1720            1725
act aaa gac ctt aaa aag aca agg agc act gcc caa gcc tac agt  5229
Thr Lys Asp Leu Lys Lys Thr Arg Ser Thr Ala Gln Ala Tyr Ser
  1730              1735              1740
tca ctc aaa ctt gta acc gaa aaa gga aag ctt aag gtt tac aca  5274
Ser Leu Lys Leu Val Thr Glu Lys Gly Lys Leu Lys Val Tyr Thr
  1745              1750             1755
ttc aaa ggt cac tac ttc tac aag gtt gtt gat cgg aat gca tat  5319
Phe Lys Gly His Tyr Phe Tyr Lys Val Val Asp Arg Asn Ala Tyr
  1760               1765             1770
gtt cgt gta aga aat gtg act ggt act aag gca acg tta aag aga  5364
Val Arg Val Arg Asn Val Thr Gly Thr Lys Ala Thr Leu Lys Arg
  1775               1780            1785
aat tca ttt gtc tac caa tca aat ggt aag aaa gca tca cgt aaa  5409
Asn Ser Phe Val Tyr Gln Ser Asn Gly Lys Lys Ala Ser Arg Lys
  1790               1795            1800
ctt ctc aag aaa ggt act acc att acc gtc tac ggc gat caa tac  5454
Leu Leu Lys Lys Gly Thr Thr Ile Thr Val Tyr Gly Asp Gln Tyr
  1805               1810            1815
aaa gct ctt aag cat tac aag aag tat gct tac aga atc ggt gaa  5499
Lys Ala Leu Lys His Tyr Lys Lys Tyr Ala Tyr Arg Ile Gly Glu
  1820              1825               1830
ggt aga tac ata aag agt gtc aat gtt aac aga gtt gat ctt gta  5544
Gly Arg Tyr Ile Lys Ser Val Asn Val Asn Arg Val Asp Leu Val
  1835            1840                1845
aaa taa                                                 5550
Lys
<210> 2
<211> 1849
<212> PRT
<213> Lactobacillus helveticus
<400> 2
Met Arg Arg Asn Lys Tyr Ala Gly Leu Leu Val Cys Ala Thr Thr Leu
1             5             10                 15
Ser Val Val Ser Val Phe Ser Thr Ala Glu Gln Gln Val Lys Ala Ser
          20             25               30
Val Asp Ser Gln Thr Lys Thr Val Glu Lys Ser Thr Lys Ala Ala Glu
      35              40                45
Ser Thr Thr Ala Asn Leu Thr Asn Lys Ala Val Glu Ala Gln Leu Ala
   50               55                60
Ala Lys Gly Val Asn Phe Lys His Leu Thr Val Asn Gln Lys Gln Asp
65              70               75              80
Val Tyr Val Asp Val Ile Val Gln Leu Ser Ala Thr Pro Ala Ala Thr
              85             90              95
Asn Gly Ser Val Ser Ala Asn Ser Ser Ser Ala Glu Ile Glu Gln Ala
         100              105              110
Ser Lys Lys Val Ile Ala Asn Gln Ala Ser Ile Lys Glu Lys Val Lys
     115               120                125
Ala Ile Thr Asn Gln Ala Ile Gly Lys Ser Tyr Gly Tyr Val Val Asn
    130              135               140
Gly Phe Ala Thr Lys Ala Lys Val Lys Asp Ile Gln Lys Leu Arg Asn
145              150              155            160
Ile Pro Gly Val Lys Ser Val Thr Leu Ala Lys Val Tyr Tyr Ala Asn
               165            170              175
Asp Ser Ser Ala Asp Asn Met Ala Asn Val Ser Thr Val Trp Asn Asn
           180             185               190
Tyr Lys Tyr Lys Gly Glu Gly Thr Val Val Ser Ile Ile Asp Thr Gly
      195               200              205
Ile Asp Pro Asn His Lys Asp Leu Arg Leu Ser Asp Asp Ser Lys Val
    210            215               220
Lys Leu Thr Lys Asp Lys Val Asn Ala Phe Thr Lys Glu Ser Gly Tyr
225              230              235              240
Gly Arg Tyr Phe Thr Asp Lys Val Pro Tyr Gly His Asn Tyr Ser Asp
             245              250              255
Asn Asn Asp Asn Ile Thr Asp Asp Asn Pro Ser Glu Gln His Gly Met
           260            265                270
His Val Ala Gly Ile Val Ala Ala Asn Gly Thr Ala Asp Ser Val Asn
       275             280              285
Ser Val Val Gly Val Ala Pro Glu Ala Gln Leu Leu Ala Met Lys Ala
    290              295             300
Phe Ser Asn Ser Asp Ser Ser Ala Ser Thr Asp Ser Thr Ser Ile Ile
305                310           315                320
Gly Ala Ile Asp Asp Ser Ala Lys Leu Gly Ala Asp Val Leu Asn Met
              325             330               335
Ser Leu Gly Ser Val Ser Gly Glu Gln Thr Glu Asp Asp Pro Glu Val
          340              345              350
Ala Ala Val Glu Arg Ala Thr Lys Lys Gly Thr Ala Ala Val Ile Ser
      355               360              365
Ala Gly Asn Ser Gly Thr Ser Asn Ser Glu Ile Glu Gly Val Asn Lys
    370             375               380
Ala Tyr Tyr Gly Asn Pro Asp Met Glu Thr Leu Gly Asn Pro Gly Thr
385               390            395               400
Ala Arg Ser Ala Thr Thr Val Ala Ser Ala Glu Asn Thr Lys Ala Thr
             405             410               415
Thr Asp Gly Val Thr Ile Thr Ser Ala Asp Gly Lys Thr Thr Ile Ala
         420              425             430
Gly Pro Glu Ala Thr Gln Leu Ser Glu Gly Thr Asp Arg Ala Phe Phe
       435             440               445
Asn Asp Lys Lys Phe Tyr Val Val Lys Asp Lys Asn Gly Asn Leu Gly
     450            455              460
Thr Gly Ser Ala Lys Gln Tyr Thr Ser Ala Val Lys Gly Lys Ile Ala
465              470             475              480
Ile Val Lys Arg Gly Glu Leu Thr Phe Thr Asp Lys Gln Lys Tyr Ala
             485             490                495
Gln Glu Ala Gly Ala Ala Gly Leu Ile Ile Val Asn Asn Lys Ala Gly
          500             505               510
Asp Ile Thr Gly Met Leu Leu Asn Ala Gly Phe Pro Thr Ala Gly Leu
      515              520                525
Ser Ala Thr Ser Gly Glu Lys Leu Val Lys Tyr Val Glu Ala His Pro
    530            535                 540
Asp Glu Ala Leu Lys Val Ser Ile Val Val Gln Ala Leu Asn Asn Ser
545              550              555              560
Ala Arg Gln Thr Asp Leu Met Ser Asp Phe Thr Ser Tyr Gly Pro Thr
                565             570             575
Ser Ser Leu Ala Phe Lys Pro Asp Ile Ser Ala Pro Gly Gly His Ile
         580               585                590
Trp Ser Thr Gln Asn Asn Asn Gly Tyr Thr Asn Met Ser Gly Thr Ser
      595                600              605
Met Ala Ser Pro Phe Ile Ala Gly Thr Gln Ala Leu Val Ser Gln Thr
    610               615            620
Met Asn AspLys Asn Gly Ala Phe Tyr Ala Thr Tyr Gln Lys Met Ser
625               630             635              640
Ala Glu Glu Arg Thr Pro Phe Ile Lys Thr Leu Glu Met Asn Thr Ala
              645             650              655
Ser Ile Gln Pro Asp Ile Ser His Asp Asn Val Ile Val Ser Pro Arg
         660               665               670
Arg Gln Gly Ala Gly Phe Ile Asn Ala Asn Ala Thr Ile Gln Ala Leu
      675                680               685
Ala Lys Asn Pro Ser Thr Val Val Ser Ser Asn Gly Tyr Pro Gly Val
    690               695            700
Glu Leu Lys Ser Phe Lys Asp Arg Thr Leu Asn Phe Gln Val Lys Phe
705              710               715            720
Thr Asn Arg Thr Asn Lys Ala Leu Thr Tyr Lys Leu Ala Asn Asn Gly
             725             730               735
Lys Asn Ser Asp Val Tyr Thr Ser Ala Thr Asp Ser Ser Ala Val Leu
           740              745                750
Tyr Asp Lys Lys Ile Asp Gly Ala Ser Val Lys Ala Ser Gly Asp Ile
     755                760               765
Phe Val Pro Ala Asn Ser Thr Lys Glu Leu Thr Leu Thr Leu Thr Leu
    770               775             780
Pro Ser Asp Phe Lys Glu Asn Gln Tyr Val Glu Gly Phe Leu Thr Phe
785              790              795                800
Asn Ser Ser Asp Ser Ser Gln Leu Arg Leu Pro Tyr Met Gly Phe Phe
               805             810               815
Gly Asp Trp Ala Ser Ser Asp Leu Pro Ile Phe Ala Ser Leu Asn Asp
           820             825            830
Pro Asn Val Phe Gln Pro Asp Asn Asn Met Phe Gly Thr Leu Val Thr
      835              840               845
Val Gly Asn Ser Ser Asp Asn Thr Asn Pro Gly Leu Ser Gln Asp Ala
   850             855                860
Ser Gly Asn Leu Ser Phe Asp Ser Ser Lys Phe Ala Ile Ser Asn Ala
865                870              875                880
Lys Asn Ala Gln Phe Lys Trp Phe Lys Pro Thr Tyr Tyr Leu Tyr Arg
              885             890           895
Asn Ala Asn Asn Val Lys Ile Gln Ile Leu Asp Lys Asn Gly Lys Val
         900              905              910
Ile Asn Thr Leu Ala Ser Leu Ser Asn Ala Thr Lys Thr Tyr Tyr Asn
      915              920              925
Ser Gln Ala Gln Ser Tyr Thr Tyr Phe Asp Asp Ala Pro Ser Trp Asp
   930             935            940
Gly Thr Tyr Phe Asp Gln Gln Ala Asn Lys Thr Val Asn Ala Pro Asp
945             950               955              960
Gly Asn Tyr Thr Tyr Arg Ile Ser Ala Thr Ile Asp Gly Thr Asn Thr
            965               970            975
Glu Gln His Tyr Asp Ile Pro Val Lys Val Asp Ser Val Ala Pro Val
         980              985               990
Val Lys Asn Leu Lys Leu Glu Ser Ser Lys Val Glu Asp Ala Lys Gly
     995                1000             1005
Gln Glu Gln Thr Arg Tyr Tyr Leu Ser Ala Glu Ala Lys Asp Glu
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Leu Ser Gly Leu Ser Gly Asp Ala Asn Val Ser Val Asn Gly Val
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Ser Ala Gln Leu Glu Tyr Asp Pro Thr Ala Lys Ala Asp Lys Asp
   1040              1045             1050
Gly Phe Gln Lys Val Glu Ile Asp Leu Ser Pro Ala Gln Ala Lys
   1055              1060             1065
Ala Leu Gln Ala Gly Thr Asn Thr Phe Ser Val Ala Leu Phe Asp
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Asn Ala Ala Asn Ala Gly Thr Ala Ser Gly Glu Gly Asn Lys Pro
   1085             1090               1095
Gly Glu Thr Asn Phe Gly Leu Val Leu Arg Asn Gly Gly Leu Pro
    1100             1105             1110
Asp Lys Ile Ser Ser Gln Thr Lys Gly Tyr Asp Ala Lys Asn Gly
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Thr Tyr Val Phe Ser Gly Thr Tyr Pro Ser Lys Leu Tyr Gly Thr
    1130              1135            1140
Tyr Thr Asp Lys Asp Gly Gln Thr His Asp Leu Asn Val Glu Ser
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Asp Gly Asn Lys Leu Phe Val Ala Lys Leu Pro Leu Ser Lys Asp
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Asp Tyr Lys Thr Thr Val Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Asp His Lys
  1175                1180             1185
Thr Leu Leu Lys Lys Gln Asp Ile Thr Val Ser Leu Val Pro Ala
  1190                1195             1200
Lys Val Glu Ser Leu Ser Val Asp Lys Asn Asp Thr Tyr Asp Glu
  1205                1210                1215
Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Leu Ala Gln Thr Ser Glu Asn Thr
  1220                1225                1230
Val Lys Leu Ser Gly Lys Val Ser Gly Asp Thr Lys Thr Leu Val
  1235                1240                1245
val Lys Gln Lys Gly Gln Lys Asp Ile Ser Val Lys Leu Asn Ala
  1250                1255                1260
Asp His Thr Phe Ser Thr Glu Leu Pro Val Ser Phe Gly Glu Asn
  1265                1270                1275
Asp Phe Thr Ile Val Ala Thr Asp Ser Asn Gly Asn Ser Ser Ser
  1280                1285P                1290
val Glu Gln Lys Val Lys Ser Ser Asp Arg Gly Lys Thr Thr Val
  1295                1300                1305
Ser Ser Ser Asp Val Thr Phe Asp Asn Gly Ile Lys Trp Gly Thr
  1310                1315                1320
Arg Asn Val Asn Gly Ile Arg Asn Val Asn Ala Lys Thr Lys Asn
  1325                1330                1335
Tyr Asn Pro Lys Thr Gly Glu Leu Thr Leu Thr Gly Lys Val Lys
  1340                1345                1350
Arg Pro Thr Thr Thr Leu Gln Ile Gly Gly Lys Asn Val Lys Ile
  1355                1360                1365
Asn Ser Asp Gln Thr Phe Lys Val Val Leu Asn Ile Gly Thr His
  1370                1375                1380
Gly Ala Lys Ile Phe Pro Ala Leu Ile Gly Asp Ser Thr Val Arg
  1385                1390                1395
Glu Thr Thr Gln Glu Arg Leu Ser Phe Tyr Val Asp Ala Glu Ala
  1400P                1405               1410
Pro Thr Leu Asn Leu Asp Ser Glu Asn Thr Val Tyr Thr Asn Lys
  1415                1420                1425
Asp Lys Phe Thr Ile Ser Gly Thr Ile Ser Asp Asp Tyr Lys Phe
  1430                1435                1440
Tyr Asp Leu Ser Ile Asn Gly Asn Asp Val Glu Thr Ser Trp Ser
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Ala Val Asp Tyr His Ser Lys Glu Gly Ile Lys Lys Asn Phe Lys
  1460                1465P                1470
His Glu Val Asp Leu Lys Lys Gly Lys Asn Thr Phe Asn Val Lys
  1475                1480                1485
Val Thr Asp Ile Gln Gly Asn Ser Ser Ser Gln Ala Leu Val Val
  1490                1495                1500
Tyr Tyr Glu Pro Ala Lys Thr Leu Ala Glu Pro Ser Val Asp Lys
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Leu Leu Thr Lys Thr Ala Asn Leu Gln Leu Leu Lys Ala Thr Thr
  1520                1525                1530
Asp Glu Ser Glu Ala Lys Val Val Tyr Ser Leu Asp Asn Gly Lys
  1535                1540                1545
Thr Phe Asn Asp Val Pro Ala Asp Gly Phe Lys Val Thr Glu Asn
  1550                1555                1560
Gly Thr Val Gln Phe Lys Ala Val Asp Lys Tyr Gly Asn Glu Ser
  1565                1570                1575
Lys Val Lys Ser Val Glu Ile Lys Gly Leu Asn Lys Glu Asn Gln
  1580                1585                1590
Pro Ser Glu Asp Lys Glu Leu Ala Lys Ala Lys Glu Asn Leu Gln
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Ala Lys Val Asp Ala Gly Glu Lys Lys Asp Leu Asp Lys Tyr Thr
  1610                1615                1620
Ala Asp Ser Lys Lys Asp Phe Asn Asp Ala Leu Lys Lys Ala Lys
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Asp Val Leu Ala Asp Lys Asn Ala Lys Leu Ala Asp Leu Gln Asp
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Ala Ala Lys Ala Leu Asp Lys Ala Glu Gln Ala Leu Thr Glu Lys
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Pro Ala Glu Pro Thr Ile Pro Leu Leu Gln Gly Asn Asn Asn Ala
  1670                1675                1680
Val Ser Asn Ile Asn Thr Ser Ser Asp Asn Gln Val Ala Ala Pro
  1685                1690                1695
Val His Ala Glu Lys Asp Thr Lys Asn Asp Asn Lys Asn Thr Thr
  1700                1705                1710
Glu Glu Gly Lys Asp Thr Lys Val Met Phe Lys Ser Val Leu Tyr
  1715                1720                1725
Thr Lys Asp Leu Lys Lys Thr Arg Ser Thr Ala Gln Ala Tyr Ser
  1730                1735                1740
Ser Leu Lys Leu Val Thr Glu Lys Gly Lys Leu Lys Val Tyr Thr
  1745                1750                1755
Phe Lys Gly His Tyr Phe Tyr Lys Val Val Asp Arg Asn Ala Tyr
  1760                1765                1770
Val Arg Val Arg Asn Val Thr Gly Thr Lys Ala Thr Leu Lys Arg
  1775                1780                1785
Asn Ser Phe Val Tyr Gln Ser Asn Gly Lys Lys Ala Ser Arg Lys
  1790                1795                1800
Leu Leu Lys Lys Gly Thr Thr Ile Thr Val Tyr Gly Asp Gln Tyr
  1805                1810                1815
Lys Ala Leu Lys His Tyr Lys Lys Tyr Ala Tyr Arg Ile Gly Glu
  1820                1825                1830
Gly Arg Tyr Ile Lys Ser Val Asn Val Asn Arg Val Asp Leu Val
  1835                1840                1845
Lys
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<21l> 2679
<212> DNA
<213> Lactobacillus helveticus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2679)
<223>
<400> 3
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Met Ile Arg Leu Leu Gly Arg Trp Leu Cys Ser Arg Trp Ser Ile His
1            5               10               15
tta ccg ctt tgt tgc ccc ttg tac aac aat ggt gaa aac aaa gtt caa  96
Leu Pro Leu Cys Cys Pro Leu Tyr Asn Asn Gly Glu Asn Lys Val Gln
          20               25              30
act aat gac act cca gtt atc att gat act act gct cct gtt ttg aac  144
Thr Asn Asp Thr Pro Val Ile Ile Asp Thr Thr Ala Pro Val Leu Asn
      35                 40              45
aat gtg aaa tat gat aca tct tct ttc aca ttg tca ggt gat tac gct  192
Asn Val Lys Tyr Asp Thr Ser Ser Phe Thr Leu Ser Gly Asp Tyr Ala
   50               55                60
gat gca ggt gca ggc ttt act gac tac tca tat gca act gta act gtt  240
Asp Ala Gly Ala Gly Phe Thr Asp Tyr Ser Tyr Ala Thr Val Thr Val
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aac gat cat gtc ttt ggc ttt aag tta aac gaa ggc gat aag tca aac  288
Asn Asp His Val Phe Gly Phe Lys Leu Asn Glu Gly Asp Lys Ser Asn
             85               90              95
ttt gat aat gct aat aaa acc aag gga cac ttt gtc ttt gtt ttg act  336
Phe Asp Asn Ala Asn Lys Thr Lys Gly His Phe Val Phe Val Leu Thr
         100              105               110
ccg gaa gaa caa gct gct tta act agc gct gct aac aag gtt acc gtt  384
Pro Glu Glu Gln Ala Ala Leu Thr Ser Ala Ala Asn Lys Val Thr Val
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gcc ttt agt gat gtc gca gat aac act gca acg caa aca ttt aat gtt  432
Ala Phe Ser Asp Val Ala Asp Asn Thr Ala Thr Gln Thr Phe Asn Val
   130               135              140
gca cct gta gca ggt cat aaa aag att gca gtt tgg aat gca att aat  480
Ala Pro Val Ala Gly His Lys Lys Ile Ala Val Trp Asn Ala Ile Asn
145              150            155               160
ggg tta cca ttc aat gaa aat tcc gat gat tat aat gtt ggt cgc aaa  528
Gly Leu Pro Phe Asn Glu Asn Ser Asp Asp Tyr Asn Val Gly Arg Lys
             165             170              175
gta ttt atg ctt cgt ggt ggt gct gaa cat gat ttc tat gtc aat ggt  576
Val Phe Met Leu Arg Gly Gly Ala Glu His Asp Phe Tyr Val Asn Gly
         180                185               190
aag tgg gtt cag gtt gat caa ggt caa ttt gta ttg cca gtt agt gtt  624
Lys Trp Val Gln Val Asp Gln Gly Gln Phe Val Leu Pro Val Ser Val
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gat gaa cag aat ttt gtt ttc agt tca gat caa gcg ggt aaa aat att  672
Asp Glu Gln Asn Phe Val Phe Ser Ser Asp Gln Ala Gly Lys Asn Ile
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tta ggt aag ttc act act ttt act cct aaa gct caa ttc gca tgg caa  720
Leu Gly Lys Phe Thr Thr Phe Thr Pro Lys Ala Gln Phe Ala Trp Gln
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cat gtt gat ggt gaa gaa aga tca ttt ggt gtc agt gtt tac tca gta  768
His Val Asp Gly Glu Glu Arg Ser Phe Gly Val Ser Val Tyr Ser Val
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gaa ggc aag gat cca caa gat att gtt gtt caa gca tca gta ccc aag  816
Glu Gly Lys Asp Pro Gln Asp Ile Val Val Gln Ala Ser Val Pro Lys
          260            265                270
ggt gac aat gtt aaa gct ttt gcg aag gac tac ttc act cat gaa gtt  864
Gly Asp Asn Val Lys Ala Phe Ala Lys Asp Tyr Phe Thr His Glu Val
      275              280               285
tat acc ggt gag gtt cat gac ggt gta gct act ttc cac att cat acc  912
Tyr Thr Gly Glu Val His Asp Gly Val Ala Thr Phe His Ile His Thr
   290               295             300
agt gtc aat aaa gac gct gca act ggc att aat tta aga gcc ctt ctt  960
Ser Val Asn Lys Asp Ala Ala Thr Gly Ile Asn Leu Arg Ala Leu Leu
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caa ggt tgg gtt gaa att gat gga cca aca ttt aat gct aaa caa gta  1008
Gln Gly Trp Val Glu Ile Asp Gly Pro Thr Phe Asn Ala Lys Gln Val
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acg gat cca tcg cca att aat gat gct aac tac ttg ggt gtg tac tac  1056
Thr Asp Pro Ser Pro Ile Asn Asp Ala Asn Tyr Leu Gly Val Tyr Tyr
         340               345              350
aat cca aat gct gaa gag aga aag aat tat gat aat cgc gat gat ctt  1104
Asn Pro Asn Ala Glu Glu Arg Lys Asn Tyr Asp Asn Arg Asp Asp Leu
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ggc gta gac ttt gaa gat gaa gca gct gac aca aac aca ttt ggc cca  1152
Gly Val Asp Phe Glu Asp Glu Ala Ala Asp Thr Asn Thr Phe Gly Pro
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ggg aat tat tca agt gcg aaa gat gac gct aaa att cat ttc gac tac  1200
Gly Asn Tyr Ser Ser Ala Lys Asp Asp Ala Lys Ile His Phe Asp Tyr
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ttg aat aat aat ggt att tct act ttg ggt aat aaa gca gta gaa aag  1248
Leu Asn Asn Asn Gly Ile Ser Thr Leu Gly Asn Lys Ala Val Glu Lys
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ggt tat tac aat cca gca act cat aaa ttt act ttg act ggt cgg gtt  1296
Gly Tyr Tyr Asn Pro Ala Thr His Lys Phe Thr Leu Thr Gly Arg Val
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aat cca gaa gtt att agc tta aca ttc tta gct gat agt ccg tat gaa  1344
Asn Pro Glu Val Ile Ser Leu Thr Phe Leu Ala Asp Ser Pro Tyr Glu
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gtc gat cca gaa aat caa gct gat att cat gat aat ggt aaa ttc tct  1392
Val Asp Pro Glu Asn Gln Ala Asp Ile His Asp Asn Gly Lys Phe Ser
   450               455             460
gta aca ttc aca att gat aat cca gca aca cgt caa tta tca tat ttc  1440
Val Thr Phe Thr Ile Asp Asn Pro Ala Thr Arg Gln Leu Ser Tyr Phe
465             470                475               480
ttt aag acg aat gat ggc aaa aca aca aga ggc tct ttg act tta att  1488
Phe Lys Thr Asn Asp Gly Lys Thr Thr Arg Gly Ser Leu Thr Leu Ile
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ctt gac act gtt gat cca act ctt act gta gat caa tta ggc gac aag  1536
Leu Asp Thr Val Asp Pro Thr Leu Thr Val Asp Gln Leu Gly Asp Lys
       500                 505              510
gat gag gct gaa att act act aat aag cca acc ttt aag tta tcc ggt  1584
Asp Glu Ala Glu Ile Thr Thr Asn Lys Pro Thr Phe Lys Leu Ser Gly
      515               520               525
gag gcc aac gat aac att gat ggt tac aat gta ttt atc aat ggt gat  1632
Glu Ala Asn Asp Asn Ile Asp Gly Tyr Asn Val Phe Ile Asn Gly Asp
    530             535              540
aat gtt ttt ggg caa ttt ggt aat tcg ggt tat gat ttt ctg cca gga  1680
Asn Val Phe Gly Gln Phe Gly Asn Ser Gly Tyr Asp Phe Leu Pro Gly
545             550              555               560
atc tac aat gat tta aat caa aat act cca aat ttg tac gga tct tac  1728
Ile Tyr Asn Asp Leu Asn Gln Asn Thr Pro Asn Leu Tyr Gly Ser Tyr
             565              570             575
aag ttt gat caa gaa gag caa ttg gat gat cag aat ggg caa cca aca  1776
Lys Phe Asp Gln Glu Glu Gln Leu Asp Asp Gln Asn Gly Gln Pro Thr
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acc cat gtc ttt act att gca gta gag gac caa gct ggt aac aga gtt  1824
Thr His Val Phe Thr Ile Ala Val Glu Asp Gln Ala Gly Asn Arg Val
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gaa aag aag gtt act gtt cat tac gat cca aat tat ctt aca gaa ccg  1872
Glu Lys Lys Val Thr Val His Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Thr Glu Pro
    610             615               620
ggt aat aca gga aaa aaa gat gat caa gca gat gta aaa ccg gca gaa  1920
Gly Asn Thr Gly Lys Lys Asp Asp Gln Ala Asp Val Lys Pro Ala Glu
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ggt caa aag caa gat aaa aat gac aac caa act gtt aac aat tca aaa  1968
Gly Gln Lys Gln Asp Lys Asn Asp Asn Gln Thr Val Asn Asn Ser Lys
             645            650                 655
gaa gat cca gag agt ggt caa act act gaa aat gct caa tct aca gaa  2016
Glu Asp Pro Glu Ser Gly Gln Thr Thr Glu Asn Ala Gln Ser Thr Glu
         660              665              670
agt caa gag caa aat aag act gat gta act aaa cca gca gca aag cca  2064
Ser Gln Glu Gln Asn Lys Thr Asp Val Thr Lys Pro Ala Ala Lys Pro
      675               680                685
agt aac gat gat caa aaa gaa aat cac aga gct ggt gaa tcg acc att  2112
Ser Asn Asp Asp Gln Lys Glu Asn His Arg Ala Gly Glu Ser Thr Ile
   690              695               700
gag tta aat caa gag aaa caa cta ggt caa agt aat gtc caa gcc caa  2160
Glu Leu Asn Gln Glu Lys Gln Leu Gly Gln Ser Asn Val Gln Ala Gln
705              710             715                720
gat act aaa cca gat aaa aca gta gtt caa ggt aat gtt caa aat act  2208
Asp Thr Lys Pro Asp Lys Thr Val Val Gln Gly Asn Val Gln Asn Thr
              725             730               735
gca ccg aca aca ggt cat ttg act aat tct tca gta aat gtg caa caa  2256
Ala Pro Thr Thr Gly His Leu Thr Asn Ser Ser Val Asn Val Gln Gln
          740              745               750
ttt aag act aag aaa gaa aca cta caa tta aag aag ttt aag tta tta  2304
Phe Lys Thr Lys Lys Glu Thr Leu Gln Leu Lys Lys Phe Lys Leu Leu
      755              760             765
aag aat aca tat ggc tac act tta aat ggt aaa att gct aaa aaa cac  2352
Lys Asn Thr Tyr Gly Tyr Thr Leu Asn Gly Lys Ile Ala Lys Lys His
  770                775             780
ggt aaa aag tta ctc ttt aag aaa gga aaa acc gtc ctt gtt tgg aac  2400
Gly Lys Lys Leu Leu Phe Lys Lys Gly Lys Thr Val Leu Val Trp Asn
785               790            795              800
aac agt aga gtt gtg act atc aag gga caa aag tac tac cgt gct act  2448
Asn Ser Arg Val Val Thr Ile Lys Gly Gln Lys Tyr Tyr Arg Ala Thr
             805             810               815
aag aat gta ttt gtt aaa gtt tca act atc aag cag gtt aaa gac ttg  2496
Lys Asn Val Phe Val Lys Val Ser Thr Ile Lys Gln Val Lys Asp Leu
          820             825               830
aaa tta gtt tta acg aag aac tcc tac gtt tac aat aaa ttg ggc aaa  2544
Lys Leu Val Leu Thr Lys Asn Ser Tyr Val Tyr Asn Lys Leu Gly Lys
      835               840              845
cgc gtt aag tat aag agt caa agt ttg ctt aag gaa ggt aaa cat ctt  2592
Arg Val Lys Tyr Lys Ser Gln Ser Leu Leu Lys Glu Gly Lys His Leu
   850                855            860
tct acc cac aat aat gga aaa gtt gtg act att aaa aat ata cat ttt  2640
Ser Thr His Asn Asn Gly Lys Val Val Thr Ile Lys Asn Ile His Phe
865              870            875                880
ttt aat ata tct ctt ttc tta aaa tat ttc caa caa cgt  2679
Phe Asn Ile Ser Leu Phe Leu Lys Tyr Phe Gln Gln Arg
              885              890
<210> 4
<211> 893
<212> PRT
<213> Lactobacillus helveticus
<400> 4
Met Ile Arg Leu Leu Gly Arg Trp Leu Cys Ser Arg Trp Ser Ile His
1            5               10             15
Leu Pro Leu Cys Cys Pro Leu Tyr Asn Asn Gly Glu Asn Lys Val Gln
          20              25               30
Thr Asn Asp Thr Pro Val Ile Ile Asp Thr Thr Ala Pro Val Leu Asn
      35               40              45
Asn Val Lys Tyr Asp Thr Ser Ser Phe Thr Leu Ser Gly Asp Tyr Ala
    50              55               60
Asp Ala Gly Ala Gly Phe Thr Asp Tyr Ser Tyr Ala Thr Val Thr Val
65              70               75             80
Asn Asp His Val Phe Gly Phe Lys Leu Asn Glu Gly Asp Lys Ser Asn
             85               90             95
Phe Asp Asn Ala Asn Lys Thr Lys Gly His Phe Val Phe Val Leu Thr
        100               105                110
Pro Glu Glu Gln Ala Ala Leu Thr Ser Ala Ala Asn Lys Val Thr Val
     115               120               125
Ala Phe Ser Asp Val Ala Asp Asn Thr Ala Thr Gln Thr Phe Asn Val
   130              135              140
Ala Pro Val Ala Gly His Lys Lys Ile Ala Val Trp Asn Ala Ile Asn
145               150            155                160
Gly Leu Pro Phe Asn Glu Asn Ser Asp Asp Tyr Asn Val Gly Arg Lys
           165               170              175
Val Phe Met Leu Arg Gly Gly Ala Glu His Asp Phe Tyr Val Asn Gly
         180               185              190
Lys Trp Val Gln Val Asp Gln Gly Gln Phe Val Leu Pro Val Ser Val
      195              200             205
Asp Glu Gln Asn Phe Val Phe Ser Ser Asp Gln Ala Gly Lys Asn Ile
  210                215             220
Leu Gly Lys Phe Thr Thr Phe Thr Pro Lys Ala Gln Phe Ala Trp Gln
225           230                235               240
His Val Asp Gly Glu Glu Arg Ser Phe Gly Val Ser Val Tyr Ser Val
              245            250               255
Glu Gly Lys Asp Pro Gln Asp Ile Val Val Gln Ala Ser Val Pro Lys
         260               265              270
Gly Asp Asn Val Lys Ala Phe Ala Lys Asp Tyr Phe Thr His Glu Val
   275                   280            285
Tyr Thr Gly Glu Val His Asp Gly Val Ala Thr Phe His Ile His Thr
   290               295              300
Ser Val Asn Lys Asp Ala Ala Thr Gly Ile Asn Leu Arg Ala Leu Leu
305               310             315              320
Gln Gly Trp Val Glu Ile Asp Gly Pro Thr Phe Asn Ala Lys Gln Val
             325             330              335
Thr Asp Pro Ser Pro Ile Asn Asp Ala Asn Tyr Leu Gly Val Tyr Tyr
         340               345               350
Asn Pro Asn Ala Glu Glu Arg Lys Asn Tyr Asp Asn Arg Asp Asp Leu
      355               360              365
Gly Val Asp Phe Glu Asp Glu Ala Ala Asp Thr Asn Thr Phe Gly Pro
    370               375             380
Gly Asn Tyr Ser Ser Ala Lys Asp Asp Ala Lys Ile His Phe Asp Tyr
385              390              395              400
Leu Asn Asn Asn Gly Ile Ser Thr Leu Gly Asn Lys Ala Val Glu Lys
            405              410               415
Gly Tyr Tyr Asn Pro Ala Thr His Lys Phe Thr Leu Thr Gly Arg Val
         420               425                430
Asn Pro Glu Val Ile Ser Leu Thr Phe Leu Ala Asp Ser Pro Tyr Glu
      435               440              445
Val Asp Pro Glu Asn Gln Ala Asp Ile His Asp Asn Gly Lys Phe Ser
  450               455                460
Val Thr Phe Thr Ile Asp Asn Pro Ala Thr Arg Gln Leu Ser Tyr Phe
465               470            475              480
Phe Lys Thr Asn Asp Gly Lys Thr Thr Arg Gly Ser Leu Thr Leu Ile
            485              490               495
Leu Asp Thr Val Asp Pro Thr Leu Thr Val Asp Gln Leu Gly Asp Lys
         500             505                510
Asp Glu Ala Glu Ile Thr Thr Asn Lys Pro Thr Phe Lys Leu Ser Gly
     515                520                525
Glu Ala Asn Asp Asn Ile Asp Gly Tyr Asn Val Phe Ile Asn Gly Asp
   530              535               540
Asn Val Phe Gly Gln Phe Gly Asn Ser Gly Tyr Asp Phe Leu Pro Gly
545              550             555               560
Ile Tyr Asn Asp Leu Asn Gln Asn Thr Pro Asn Leu Tyr Gly Ser Tyr
               565           570              575
Lys Phe Asp Gln Glu Glu Gln Leu Asp Asp Gln Asn Gly Gln Pro Thr
          580              585              590
Thr His Val Phe Thr Ile Ala Val Glu Asp Gln Ala Gly Asn Arg Val
       595             600               605
Glu Lys Lys Val Thr Val His Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Thr Glu Pro
   610               615             620
Gly Asn Thr Gly Lys Lys Asp Asp Gln Ala Asp Val Lys Pro Ala Glu
625             630              635                640
Gly Gln Lys Gln Asp Lys Asn Asp Asn Gln Thr Val Asn Asn Ser Lys
             645             650               655
Glu Asp Pro Glu Ser Gly Gln Thr Thr Glu Asn Ala Gln Ser Thr Glu
         660                665              670
Ser Gln Glu Gln Asn Lys Thr Asp Val Thr Lys Pro Ala Ala Lys Pro
     675                680              685
Ser Asn Asp Asp Gln Lys Glu Asn His Arg Ala Gly Glu Ser Thr Ile
   690                695            700
Glu Leu Asn Gln Glu Lys Gln Leu Gly Gln Ser Asn Val Gln Ala Gln
705              710               715             720
Asp Thr Lys Pro Asp Lys Thr Val Val Gln Gly Asn Val Gln Asn Thr
             725              730               735
Ala Pro Thr Thr Gly His Leu Thr Asn Ser Ser Val Asn Val Gln Gln
         740               745             750
Phe Lys Thr Lys Lys Glu Thr Leu Gln Leu Lys Lys Phe Lys Leu Leu
     755                760              765
Lys Asn Thr Tyr Gly Tyr Thr Leu Asn Gly Lys Ile Ala Lys Lys His
   770              775              780
Gly Lys Lys Leu Leu Phe Lys Lys Gly Lys Thr Val Leu Val Trp Asn
785               790             795               800
Asn Ser Arg Val Val Thr Ile Lys Gly Gln Lys Tyr Tyr Arg Ala Thr
             805               810              815
Lys Asn Val Phe Val Lys Val Ser Thr Ile Lys Gln Val Lys Asp Leu
         820               825              830
Lys Leu Val Leu Thr Lys Asn Ser Tyr Val Tyr Asn Lys Leu Gly Lys
      835              840               845
Arg Val Lys Tyr Lys Ser Gln Ser Leu Leu Lys Glu Gly Lys His Leu
   850              855              860
Ser Thr His Asn Asn Gly Lys Val Val Thr Ile Lys Asn Ile His Phe
865             870              875               880
Phe Asn Ile Ser Leu Phe Leu Lys Tyr Phe Gln Gln Arg
             885             890
<210> 5
<211> 4881
<212> DNA
<213> Lactobacillus helveticus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(4881)
<223>
<400> 5
atg cta ctg gta ttc cag aaa ttg cag tta tgg gtg gct gca gca att  48
Met Leu Leu Val Phe Gln Lys Leu Gln Leu Trp Val Ala Ala Ala Ile
1           5                 10               15
att gct ctt gct tca ggc tcc act gtt ttt ctt agt caa aat act gct  96
Ile Ala Leu Ala Ser Gly Ser Thr Val Phe Leu Ser Gln Asn Thr Ala
         20               25               30
gaa gca gca act aat gat cct ggt gct tca gat gtt caa gtt aaa gta  144
Glu Ala Ala Thr Asn Asp Pro Gly Ala Ser Asp Val Gln Val Lys Val
       35              40               45
gta caa caa gat caa aaa caa gac caa aac agt act gct aac gca gct  192
Val Gln Gln Asp Gln Lys Gln Asp Gln Asn Ser Thr Ala Asn Ala Ala
   50               55                60
gtt tca aat tct gat tct gcc aag aca cag act aat gca acg gac cag  240
Val Ser Asn Ser Asp Ser Ala Lys Thr Gln Thr Asn Ala Thr Asp Gln
65                70             75               80
aca caa aat tca act gtg gtt tct ggt gat tcc acg act gcg aat tct  288
Thr Gln Asn Ser Thr Val Val Ser Gly Asp Ser Thr Thr Ala Asn Ser
              85             90              95
aag acc tca cag act tct aat gca caa act aca agt aca aca aca aat  336
Lys Thr Ser Gln Thr Ser Asn Ala Gln Thr Thr Ser Thr Thr Thr Asn
          100             105               110
agt gta gat cca aac cag gaa caa caa cct gct aat caa gct gat cat  384
Ser Val Asp Pro Asn Gln Glu Gln Gln Pro Ala Asn Gln Ala Asp His
      115              120               125
gtt aaa gga aat gtg cag tct gca tgg gat caa gga tat agg gga caa  432
Val Lys Gly Asn Val Gln Ser Ala Trp Asp Gln Gly Tyr Arg Gly Gln
    130               135            140
gga aca gtt gtt gca gtc atc gat tcc ggt gca gat cca act cat aaa  480
Gly Thr Val Val Ala Val Ile Asp Ser Gly Ala Asp Pro Thr His Lys
145             150              155             160
gat ttt aaa acc atg cca gaa gat cct aag ctg tcc gag gat gat atg  528
Asp Phe Lys Thr Met Pro Glu Asp Pro Lys Leu Ser Glu Asp Asp Met
              165              170              175
caa gct aag atc gcc aag caa ggc tat ggt aaa tat gtg aat gaa aag  576
Gln Ala Lys Ile Ala Lys Gln Gly Tyr Gly Lys Tyr Val Asn Glu Lys
          180             185              190
ttc cca tat gtt tat aat tat gcc gat cgt gat aat gac tat att act  624
Phe Pro Tyr Val Tyr Asn Tyr Ala Asp Arg Asp Asn Asp Tyr Ile Thr
     195               200               205
tcg gat gac acc aat gct aat gat tct cca cac ggt caa cac gtt tca  672
Ser Asp Asp Thr Asn Ala Asn Asp Ser Pro His Gly Gln His Val Ser
    210             215              220
gga atc att gca gct gat ggt aag cca gat gga aat aaa gaa tat gtc  720
Gly Ile Ile Ala Ala Asp Gly Lys Pro Asp Gly Asn Lys Glu Tyr Val
225              230              235              240
gtt ggt gtt gct cct gaa gct caa ttg atg cag ctg aga gtt ttt gga  768
Val Gly Val Ala Pro Glu Ala Gln Leu Met Gln Leu Arg Val Phe Gly
            245               250              255
caa ttt tca gat gaa aaa act gat gat gtg gca aaa gca atc tac gat  816
Gln Phe Ser Asp Glu Lys Thr Asp Asp Val Ala Lys Ala Ile Tyr Asp
         260              265              270
gct acc aat tta ggt gcg gat gtc atc caa atg tca tta gga caa ggt  864
Ala Thr Asn Leu Gly Ala Asp Val Ile Gln Met Ser Leu Gly Gln Gly
      275               280              285
gtt gcc gat caa caa ttg acc aat att gag caa aaa gct gtt caa tat  912
Val Ala Asp Gln Gln Leu Thr Asn Ile Glu Gln Lys Ala Val Gln Tyr
    290             295               300
gca att gat cac ggt gta ttt gta tca att tca gca tct aat aac ggt  960
Ala Ile Asp His Gly Val Phe Val Ser Ile Ser Ala Ser Asn Asn Gly
305              310                315              320
aat tca gct tca gtt gat aat cca agt aaa gtt aaa gat caa gga tat  1008
Asn Ser Ala Ser Val Asp Asn Pro Ser Lys Val Lys Asp Gln Gly Tyr
              325             330              335
caa tct ggt agc caa gct ggt aac tat gaa cct ctt aat tta agt act  1056
Gln Ser Gly Ser Gln Ala Gly Asn Tyr Glu Pro Leu Asn Leu Ser Thr
       340                345              350
gta gca aac cct ggt gtg tca aag aac gca tta act gtt gct gca gaa  1104
Val Ala Asn Pro Gly Val Ser Lys Asn Ala Leu Thr Val Ala Ala Glu
      355              360               365
aca tca gat act ggt gat tta agc gat atg gcc tac ttc tca tca tgg  1152
Thr Ser Asp Thr Gly Asp Leu Ser Asp Met Ala Tyr Phe Ser Ser Trp
   370              375              380
ggc cca gct caa gac tat act tta aag cca gat tta tca gca cct gga  1200
Gly Pro Ala Gln Asp Tyr Thr Leu Lys Pro Asp Leu Ser Ala Pro Gly
385              390              395              400
tat caa gta gtt tct acc gtt aat cat gat cag tac caa aca atg agt  1248
Tyr Gln Val Val Ser Thr Val Asn His Asp Gln Tyr Gln Thr Met Ser
              405              410              415
ggt act tca atg gct ggt cca ttt gcc gca gct agt gct gcc tta gta  1296
Gly Thr Ser Met Ala Gly Pro Phe Ala Ala Ala Ser Ala Ala Leu Val
          420              425              430
att caa cga ttg aag caa act aat cct gaa ttg aag ggt gca caa tta  1344
Ile Gln Arg Leu Lys Gln Thr Asn Pro Glu Leu Lys Gly Ala Gln Leu
       435             440              445
gta gct gct gct aaa gca atg ctg atg aat acg gcc aaa cca caa aca  1392
Val Ala Ala Ala Lys Ala Met Leu Met Asn Thr Ala Lys Pro Gln Thr
   450              455              460
caa tta ggc tat aca aca cct gtt tca cca aga cgt caa ggt gca ggt  1440
Gln Leu Gly Tyr Thr Thr Pro Val Ser Pro Arg Arg Gln Gly Ala Gly
465              470              475              480
caa att gat gtt ggt gct gct acg gct act cca gtt tat gta act act  1488
Gln Ile Asp Val Gly Ala Ala Thr Ala Thr Pro Val Tyr Val Thr Thr
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Asp Asp Gly Thr Ser Ser Val Ser Leu His Gln Val Gly Glu Ser Thr
         500              505              510
aaa ttt acg tta acc ttc cat aat tta act gac caa agc cga act tat  1584
Lys Phe Thr Leu Thr Phe His Asn Leu Thr Asp Gln Ser Arg Thr Tyr
       515              520              525
act ttc gat gat tat ggt gga ggt tac act gaa caa aga gat aca acc  1632
Thr Phe Asp Asp Tyr Gly Gly Gly Tyr Thr Glu Gln Arg Asp Thr Thr
   530              535              540
acc ggc gtt ttt cat gat gtt caa tta gct ggt gct aga gta aat ggt  1680
Thr Gly Val Phe His Asp Val Gln Leu Ala Gly Ala Arg Val Asn Gly
545              550              555              560
gaa cat agt ttt act tta gct cct aaa gaa gaa cgt caa gtt agc tat  1728
Glu His Ser Phe Thr Leu Ala Pro Lys Glu Glu Arg Gln Val Ser Tyr
              565              570              575
tca tta gac ttg acc ggc tta aag aag aac caa tta gtt gaa gga ttt  1776
Ser Leu Asp Leu Thr Gly Leu Lys Lys Asn Gln Leu Val Glu Gly Phe
          580              585              590
tta cgc ttt act aat gcc aat aat gca tct acg gtt tct gtt cct tac  1824
Leu Arg Phe Thr Asn Ala Asn Asn Ala Ser Thr Val Ser Val Pro Tyr
      595              600              605
tta gct tat tat ggg gac tta act agt gaa aac gtc ttt gat caa aat  1872
Leu Ala Tyr Tyr Gly Asp Leu Thr Ser Glu Asn Val Phe Asp Gln Asn
   610              615              620
gca aat gag gag cat cta gat atc cag ggt aat cgt tta gtt aat gaa  1920
Ala Asn Glu Glu His Leu Asp Ile Gln Gly Asn Arg Leu Val Asn Glu
625              630              635              640
caa aac tat cct cgt ggt att gca gat caa gaa tca ttg aag gaa ctt  1968
Gln Asn Tyr Pro Arg Gly Ile Ala Asp Gln Glu Ser Leu Lys Glu Leu
              645              650              655
gta aat gtt gat gga aac tat aat tgg caa gaa gta gcc aaa tta tat  2016
Val Asn Val Asp Gly Asn Tyr Asn Trp Gln Glu Val Ala Lys Leu Tyr
         660              665              670
gaa agt ggt aaa gtt gcc ttt tca cca aat gat aat caa aag agc gat  2064
Glu Ser Gly Lys Val Ala Phe Ser Pro Asn Asp Asn Gln Lys Ser Asp
       675              680              685
tta ctg aag cca tat gtt tac ttg aag caa aat gtt aaa gat ctt aag  2112
Leu Leu Lys Pro Tyr Val Tyr Leu Lys Gln Asn Val Lys Asp Leu Lys
   690               695             700
gta gaa atc ctc gat gca caa ggt aac gtg gtt aga gtg gtt tct gac  2160
Val Glu Ile Leu Asp Ala Gln Gly Asn Val Val Arg Val Val Ser Asp
705              710              715              720
gtt caa ggc gta gat aaa tct tac gat gaa aat ggt gta act aaa gat  2208
Val Gln Gly Val Asp Lys Ser Tyr Asp Glu Asn Gly Val Thr Lys Asp
              725             730              735
act agt tta tca gtt tca atg aga gat aat cct gac gct ctt gaa tgg  2256
Thr Ser Leu Ser Val Ser Met Arg Asp Asn Pro Asp Ala Leu Glu Trp
          740p              745              750
gat ggt aaa gtt tat aac agc aaa aca ggc aaa atg gaa act gcc aaa  2304
Asp Gly Lys Val Tyr Asn Ser Lys Thr Gly Lys Met Glu Thr Ala Lys
      755              760              765
gat ggc aat tac act tac cgt tta gtt gct act ctt tgg aac aaa gga  2352
Asp Gly Asn Tyr Thr Tyr Arg Leu Val Ala Thr Leu Trp Asn Lys Gly
  770               775              780
cca cat caa gtt caa aca gct gat ttc cca gta gta gtt gat aca gtt  2400
Pro His Gln Val Gln Thr Ala Asp Phe Pro Val Val Val Asp Thr Val
785              790              795              800
gct cca aca ttg tca aat gtg aaa tat gat gct gcc tca cat act ttg  2448
Ala Pro Thr Leu Ser Asn Val Lys Tyr Asp Ala Ala Ser His Thr Leu
              805              810              815
tca ggt gaa tac caa gat gct ggt gca gga ttt acg aat tat tca tat  2496
Ser Gly Glu Tyr Gln Asp Ala Gly Ala Gly Phe Thr Asn Tyr Ser Tyr
          820              825              830
gca acg gta aca gtt aat gat aag gtc ttt ggc tat aag ttg agt gat  2544
Ala Thr Val Thr Val Asn Asp Lys Val Phe Gly Tyr Lys Leu Ser Asp
      835              840              845
ggt gga tca ggc ttc gat aat gca gaa aag act aag gga cat ttt agc  2592
Gly Gly Ser Gly Phe Asp Asn Ala Glu Lys Thr Lys Gly His Phe Ser
    850              855              860
ttt gtg tta ggt caa gat gca ctt tct gca tta aca gct gct gca aac  2640
Phe Val Leu Gly Gln Asp Ala Leu Ser Ala Leu Thr Ala Ala Ala Asn
865              870              875              880
aag gtg acc gta gcc ttg agt gat gtc gct gat aat act tca ttg gct  2688
Lys Val Thr Val Ala Leu Ser Asp Val Ala Asp Asn Thr Ser Leu Ala
              885              890              895
act gtt aat gtt gcc ggt gac cat gat agt gag act ggt gta agt gtt  2736
Thr Val Asn Val Ala Gly Asp His Asp Ser Glu Thr Gly Val Ser Val
          900              905              910
tgg aat gct gtc aat ggt tta gcc ttt gat caa aaa tca cca aac tat  2784
Trp Asn Ala Val Asn Gly Leu Ala Phe Asp Gln Lys Ser Pro Asn Tyr
       915              920              925
 act aag act tac aca tta gtt ggt gga gct aac cat gac  2832
Asp Ala Ala Thr Lys Thr Tyr Thr Leu Val Gly Gly Ala Asn His Asp
   930              935              940
ttc tac tta aat ggc aag ttg gtc caa gta caa gat ggc aaa tat caa  2880
Phe Tyr Leu Asn Gly Lys Leu Val Gln Val Gln Asp Gly Lys Tyr Gln
945              950              955              960
gtt cca gtc agt gta aat aca act aag ttt gtg ttt agt act gat cct  2928
Val Pro Val Ser Val Asn Thr Thr Lys Phe Val Phe Ser Thr Asp Pro
              965              970              975
gaa ggt caa cat gtt ctt aag gat ctt tca act gta acg gct aaa gca  2976
Glu Gly Gln His Val Leu Lys Asp Leu Ser Thr Val Thr Ala Lys Ala
          980              985              990
ttc ttt aat tgg caa aag act gat aca ttt gat gga aac ttt ggt gta  3024
Phe Phe Asn Trp Gln Lys Thr Asp Thr Phe Asp Gly Asn Phe Gly Val
      995               1000              1005
act att agt tca gtt aaa act aat aat cca aat gat aca gtt gtt  3069
Thr Ile Ser Ser Val Lys Thr Asn Asn Pro Asn Asp Thr Val Val
   1010              1015              1020
caa gct gtt gta acc aaa ggt aaa aat gta aag gcc tat gca atg  3114
Gln Ala Val Val Thr Lys Gly Lys Asn Val Lys Ala Tyr Ala Met
   1025              1030              1035
gat tac ttt act ggg gaa gtt tat acc ggt gaa gta aaa gac gga  3159
Asp Tyr Phe Thr Gly Glu Val Tyr Thr Gly Glu Val Lys Asp Gly
   1040              1045              1050
att gca aca ttc cat gtt cat act tca atc aat aaa gat gct aca  3204
Ile Ala Thr Phe His Val His Thr Ser Ile Asn Lys Asp Ala Thr
   1055              1060              1065
act ggt gtt tat agg aga gca tta cta aca ggt tgg act gaa gtg  3249
Thr Gly Val Tyr Arg Arg Ala Leu Leu Thr Gly Trp Thr Glu Val
   1070              1075              1080
gat gga cca tcc ttt aat gat aaa caa gaa aca tct aga gat ggt  3294
Asp Gly Pro Ser Phe Asn Asp Lys Gln Glu Thr Ser Arg Asp Gly
   1085              1090              1095
gta tca agt agt aac cac cta ggg gtt ttc tac ttt gct gat gca  3339
Val Ser Ser Ser Asn His Leu Gly Val Phe Tyr Phe Ala Asp Ala
   1100              1105              1110
gct aat cgc cca gtt tat aca gat aga aat gcc ttg gga gta gaa  3384
Ala Asn Arg Pro Val Tyr Thr Asp Arg Asn Ala Leu Gly Val Glu
   1115              1120              1125
gct aaa gat gaa gct gca aag tta gat tca ttt tgc cca ggt gca  3429
Ala Lys Asp Glu Ala Ala Lys Leu Asp Ser Phe Cys Pro Gly Ala
   1130              1135              1140
tac cca gga cac gca cca tca gct ctg aca acc aga acg gat cct  3474
Tyr Pro Gly His Ala Pro Ser Ala Leu Thr Thr Arg Thr Asp Pro
   1145              1150              1155
aat cca gat att cat ttt gat tat atg aat gac aac gat act act  3519
Asn Pro Asp Ile His Phe Asp Tyr Met Asn Asp Asn Asp Thr Thr
   1160              1165              1170
cgt ttt ggt cag aat gcc gtt act cat gga tac tat gat cct tca  3564
Arg Phe Gly Gln Asn Ala Val Thr His Gly Tyr Tyr Asp Pro Ser
   1175              1180              1185
act cag aag ttt acg gtt acc ggt aaa gtt gat gac aat gta gta  3609
Thr Gln Lys Phe Thr Val Thr Gly Lys Val Asp Asp Asn Val Val
   1190              1195              1200
tct cta act gtg tta ggc gat aac tca aat gaa aat gct cct gaa  3654
Ser Leu Thr Val Leu Gly Asp Asn Ser Asn Glu Asn Ala Pro Glu
   1205              1210              1215
aac caa gtt aag tta ggc aac gac ggt aag ttt agc ttt acg gta  3699
Asn Gln Val Lys Leu Gly Asn Asp Gly Lys Phe Ser Phe Thr Val
   1220              1225              1230
aca gct aac aga aca ggg caa cgt cca att gca tat att tac aaa  3744
Thr Ala Asn Arg Thr Gly Gln Arg Pro Ile Ala Tyr Ile Tyr Lys
   1235              1240              1245
gct aaa gat gga caa aga gtt cgt ggt acc ttg aat ctt att ctt  3789
Ala Lys Asp Gly Gln Arg Val Arg Gly Thr Leu Asn Leu Ile Leu
   1250              1255             1260
gat act gtt gct cct agc ttg gaa gta aat cag gtt aat ggg gat  3834
Asp Thr Val Ala Pro Ser Leu Glu Val Asn Gln Val Asn Gly Asp
  1265              1270              1275
gaa tta gag ctt tgg act aat aat cca aaa ttc act ctg tcc gga  3879
Glu Leu Glu Leu Trp Thr Asn Asn Pro Lys Phe Thr Leu Ser Gly
   1280              1285              1290
aag gta aat gat aat ctt gat gga tat agg tta ttc gtt aat ggt  3924
Lys Val Asn Asp Asn Leu Asp Gly Tyr Arg Leu Phe Val Asn Gly
   1295              1300              1305
aat aat att tat cga gaa ttc cta aac tct ggt tat aat cag gtt  3969
Asn Asn Ile Tyr Arg Glu Phe Leu Asn Ser Gly Tyr Asn Gln Val
   1310              1315              1320
gca gga ttg aat acg gat act gag ttt act aat cca tat gga gct  4014
Ala Gly Leu Asn Thr Asp Thr Glu Phe Thr Asn Pro Tyr Gly Ala
   1325              1330              1335
cat gat ttt gaa gag gtt gaa aac tta aat gac aat aat gat caa  4059
His Asp Phe Glu Glu Val Glu Asn Leu Asn Asp Asn Asn Asp Gln
   1340              1345              1350
ccg act act cat gtc ttc aca gtt tat gtt gta gac caa gtt gga  4104
Pro Thr Thr His Val Phe Thr Val Tyr Val Val Asp Gln Val Gly
   1355              1360              1365
aac aag gta gaa aag aaa tta act gtt cac ttt gat cca aat tat  4149
Asn Lys Val Glu Lys Lys Leu Thr Val His Phe Asp Pro Asn Tyr
   1370              1375              1380
gtt gct cca gaa gaa gta cca aat act gat act tca tat act tta  4194
Val Ala Pro Glu Glu Val Pro Asn Thr Asp Thr Ser Tyr Thr Leu
   1385              1390              1395
gag aat cca tta agt act aca act gta gaa aac cca gtt act gat  4239
Glu Asn Pro Leu Ser Thr Thr Thr Val Glu Asn Pro Val Thr Asp
   1400              1405              1410
gtt tct acg gtt caa cct aag ggt gaa act tta act ggt aag tca  4284
Val Ser Thr Val Gln Pro Lys Gly Glu Thr Leu Thr Gly Lys Ser
   1415              1420              1425
ttc aac tta tta cac gat gct tat atc tac aac aaa gat ggt caa  4329
Phe Asn Leu Leu His Asp Ala Tyr Ile Tyr Asn Lys Asp Gly Gln
   1430              1435              1440
gtc gtt tta agt act gat act aat aag agt agc ttg ctt aag aaa  4374
Val Val Leu Ser Thr Asp Thr Asn Lys Ser Ser Leu Leu Lys Lys
   1445              1450              1455
ggc caa aga att act gca tta gac aat ggc aaa act gtt gta atc 4419
Gly Gln Arg Ile Thr Ala Leu Asp Asn Gly Lys Thr Val Val Ile
   1460              1465              1470
aat ggc gtg caa tac tat cgt gtc ggc gat aat cag ttt gtg aag  4464
Asn Gly Val Gln Tyr Tyr Arg Val Gly Asp Asn Gln Phe Val Lys
   1475              1480              1485
gta act aat acg att tta caa gcc ggt aag aga ttg cag tta aag  4509
Val Thr Asn Thr Ile Leu Gln Ala Gly Lys Arg Leu Gln Leu Lys
   1490              1495              1500
cat aat gca cac ctt tat gat aag aac ggt aaa gtt gtt aaa aga  4554
His Asn Ala His Leu Tyr Asp Lys Asn Gly Lys Val Val Lys Arg
   1505              1510              1515
aat ggc aaa cct gtc ttg tta aga aag ggt aga tgg atc agt gct  4599
Asn Gly Lys Pro Val Leu Leu Arg Lys Gly Arg Trp Ile Ser Ala
   1520              1525              1530
ttg aac aac gcc gat aag tat gta atc aat ggc aag acc ttc tac  4644
Leu Asn Asn Ala Asp Lys Tyr Val Ile Asn Gly Lys Thr Phe Tyr
   1535              1540              1545
aag tta gct aat ggt gaa ttt gtg aag gtg gca aac act aaa ctt  4689
Lys Leu Ala ASn Gly Glu Phe Val Lys Val Ala Asn Thr Lys Leu
   1550              1555              1560
caa aag cct aaa gct ttg aag ctt aca cac aat gca ttt gtt tac  4734
Gln Lys Pro Lys Ala Leu Lys Leu Thr His Asn Ala Phe Val Tyr
   1565              1570              1575
gat gaa aat ggt aag cgt gta aag aag agt aaa gtt tta aag aaa  4779
Asp Glu Asn Gly Lys Arg Val Lys Lys Ser Lys Val Leu Lys Lys
   1580              1585              1590
ggc caa acg att tta gca gaa aat aat gca gaa aaa ttc cat atc  4824
Gly Gln Thr Ile Leu Ala GluAsn Asn Ala Glu Lys Phe His Ile
   1595             1600             1605
aaa ggt aag gct tac tat aaa gtt aat ggt cat ttt gta aaa gtt  4869
Lys Gly Lys Ala Tyr Tyr Lys Val Asn Gly His Phe Val Lys Val
   1610              1615              1620
gca aat act ttg                                             4881
Ala Asn Thr Leu
   1625
<210> 6
<211> 1627
<212> PRT
<213> Lactobacillus helveticus
<400> 6
Met Leu Leu Val Phe Gln Lys Leu Gln Leu Trp Val Ala Ala Ala Ile
1            5                10              15
Ile Ala Leu Ala Ser Gly Ser Thr Val Phe Leu Ser Gln Asn Thr Ala
          20               25              30
Glu Ala Ala Thr Asn Asp Pro Gly Ala Ser Asp Val Gln Val Lys Val
       35              40              45
Val Gln Gln Asp Gln Lys Gln Asp Gln Asn Ser Thr Ala Asn Ala Ala
   50              55              60
Val Ser Asn Ser Asp Ser Ala Lys Thr Gln Thr Asn Ala Thr Asp Gln
65               70               75              80
Thr Gln Asn Ser Thr Val Val Ser Gly Asp Ser Thr Thr Ala Asn Ser
             85               90               95
Lys Thr Ser Gln Thr Ser Asn Ala Gln Thr Thr Ser Thr Thr Thr Asn
          100               105               110
Ser Val Asp Pro Asn Gln Glu Gln Gln Pro Ala Asn Gln Ala Asp His
       115               120               125
Val Lys Gly Asn Val Gln Ser Ala Trp Asp Gln Gly Tyr Arg Gly Gln
  130               135               140
Gly Thr Val Val Ala Val Ile Asp Ser Gly Ala Asp Pro Thr His Lys
145               150               155               160
Asp Phe Lys Thr Met Pro Glu Asp Pro Lys Leu Ser Glu Asp Asp Met
             165               170               175
Gln Ala Lys Ile Ala Lys Gln Gly Tyr Gly Lys Tyr Val Asn Glu Lys
          180               185               190
Phe Pro Tyr Val Tyr Asn Tyr Ala Asp Arg Asp Asn Asp Tyr Ile Thr
      195               200               205
Ser Asp Asp Thr Asn Ala Asn Asp Ser Pro His Gly Gln His Val Ser
   210               215               220
Gly Ile Ile Ala Ala Asp Gly Lys Pro Asp Gly Asn Lys Glu Tyr Val
225               230               235               240
Val Gly Val Ala Pro Glu Ala Gln Leu Met Gln Leu Arg Val Phe Gly
               245               250               255
Gln Phe Ser Asp Glu Lys Thr Asp Asp Val Ala Lys Ala Ile Tyr Asp
          260               265               270
Ala Thr Asn Leu Gly Ala Asp Val Ile Gln Met Ser Leu Gly Gln Gly
      275               280               285
Val Ala Asp Gln Gln Leu Thr Asn Ile Glu Gln Lys Ala Val Gln Tyr
   290               295               300
Ala Ile Asp His Gly Val Phe Val Ser Ile Ser Ala Ser Asn Asn Gly
305               310               315               320
Asn Ser Ala Ser Val Asp Asn Pro Ser Lys Val Lys Asp Gln Gly Tyr
             325               330               335
Gln Ser Gly Ser Gln Ala Gly Asn Tyr Glu Pro Leu Asn Leu Ser Thr
          340               345               350
Val Ala Asn Pro Gly Val Ser Lys Asn Ala Leu Thr Val Ala Ala Glu
       355               360               365
Thr Ser Asp Thr Gly Asp Leu Ser Asp Met Ala Tyr Phe Ser Ser Trp
   370               375               380
Gly Pro Ala Gln Asp Tyr Thr Leu Lys Pro Asp Leu Ser Ala Pro Gly
385               390               395               400
Tyr Gln Val Val Ser Thr Val Asn His Asp Gln Tyr Gln Thr Met Ser
              405             410               415
Gly Thr Ser Met Ala Gly Pro Phe Ala Ala Ala Ser Ala Ala Leu Val
          420               425               430
Ile Gln Arg Leu Lys Gln Thr Asn Pro Glu Leu Lys Gly Ala Gln Leu
      435               440               445
Val Ala Ala Ala Lys Ala Met Leu Met Asn Thr Ala Lys Pro Gln Thr
   450               455               460
Gln Leu Gly Tyr Thr Thr Pro Val Ser Pro Arg Arg Gln Gly Ala Gly
465               470               475               480
Gln Ile Asp Val Gly Ala Ala Thr Ala Thr Pro Val Tyr Val Thr Thr
              485               490               495
Asp Asp Gly Thr Ser Ser Val Ser Leu His Gln Val Gly Glu Ser Thr
          500               505               510
Lys Phe Thr Leu Thr Phe His Asn Leu Thr Asp Gln Ser Arg Thr Tyr
       515               520               525
Thr Phe Asp Asp Tyr Gly Gly Gly Tyr Thr Glu Gln Arg Asp Thr Thr
   530               535               540
Thr Gly Val Phe His Asp Val Gln Leu Ala Gly Ala Arg Val Asn Gly
545               550               555               560
Glu His Ser Phe Thr Leu Ala Pro Lys Glu Glu Arg Gln Val Ser Tyr
               565               570               575
Ser Leu Asp Leu Thr Gly Leu Lys Lys Asn Gln Leu Val Glu Gly Phe
         580               585               590
Leu Arg Phe Thr Asn Ala Asn Asn Ala Ser Thr Val Ser Val Pro Tyr
      595               600               605
Leu Ala Tyr Tyr Gly Asp Leu Thr Ser Glu Asn Val Phe Asp Gln Asn
   610               615               620
Ala Asn Glu Glu His Leu Asp Ile Gln Gly Asn Arg Leu Val Asn Glu
625               630               635               640
Gln Asn Tyr Pro Arg Gly Ile Ala Asp Gln Glu Ser Leu Lys Glu Leu
             645              650               655
l Asn Val Asp Gly Asn Tyr Asn Trp Gln Glu Val Ala Lys Leu Tyr
          660              665              670
Glu Ser Gly Lys Val Ala Phe Ser Pro Asn Asp Asn Gln Lys Ser Asp
       675              680              685
Leu Leu Lys Pro Tyr Val Tyr Leu Lys Gln Asn Val Lys Asp Leu Lys
   690              695              700
Val Glu Ile Leu Asp Ala Gln Gly Asn Val Val Arg Val Val Ser Asp
705              710              715              720
Val Gln Gly Val Asp Lys Ser Tyr Asp Glu Asn Gly Val Thr Lys Asp
             725              730              735
Thr Ser Leu Ser Val Ser Met Arg Asp Asn Pro Asp Ala Leu Glu Trp
          740              745              750
Asp Gly Lys Val Tyr Asn Ser Lys Thr Gly Lys Met Glu Thr Ala Lys
      755              760              765
Asp Gly Asn Tyr Thr Tyr Arg Leu Val Ala Thr Leu Trp Asn Lys Gly
   770              775              780
Pro His Gln Val Gln Thr Ala Asp Phe Pro Val Val Val Asp Thr Val
785              790              795              800
Ala Pro Thr Leu Ser Asn Val Lys Tyr Asp Ala Ala Ser His Thr Leu
             805              810              815
Ser Gly Glu Tyr Gln Asp Ala Gly Ala Gly Phe Thr Asn Tyr Ser Tyr
          820              825              830
Ala Thr Val Thr Val Asn Asp Lys Val Phe Gly Tyr Lys Leu Ser Asp
       835              840              845
Gly Gly Ser Gly Phe Asp Asn Ala Glu Lys Thr Lys Gly His Phe Ser
   850              855              860
Phe Val Leu Gly Gln Asp Ala Leu Ser Ala Leu Thr Ala Ala Ala Asn
865              870              875              880
Lys Val Thr Val Ala Leu Ser Asp Val Ala Asp Asn Thr Ser Leu Ala
             885              890              895
Thr Val Asn Val Ala Gly Asp His Asp Ser Glu Thr Gly Val Ser Val
          900              905              910
Trp Asn Ala Val Asn Gly Leu Ala Phe Asp Gln Lys Ser Pro Asn Tyr
       915              920              925
Asp Ala Ala Thr Lys Thr Tyr Thr Leu Val Gly Gly Ala Asn His Asp
   930              935              940
Phe Tyr Leu Asn Gly Lys Leu Val Gln Val Gln Asp Gly Lys Tyr Gln
945              950              955              960
Val Pro Val Ser Val Asn Thr Thr Lys Phe Val Phe Ser Thr Asp Pro
              965              970              975
Glu Gly Gln His Val Leu Lys Asp Leu Ser Thr Val Thr Ala Lys Ala
          980              985              990
Phe Phe Asn Trp Gln Lys Thr Asp Thr Phe Asp Gly Asn Phe Gly Val
      995              1000              1005
Thr Ile Ser Ser Val Lys Thr Asn Asn Pro Asn Asp Thr Val Val
   1010              1015              1020
Gln Ala Val Val Thr Lys Gly Lys Asn Val Lys Ala Tyr Ala Met
   1025              1030              1035
Asp Tyr Phe Thr Gly Glu Val Tyr Thr Gly Glu Val Lys Asp Gly
   1040              1045              1050
Ile Ala Thr Phe His Val His Thr Ser Ile Asn Lys Asp Ala Thr
   1055              1060              1065
Thr Gly Val Tyr Arg Arg Ala Leu Leu Thr Gly Trp Thr Glu Val
   1070              1075              1080
Asp Gly Pro Ser Phe Asn Asp Lys Gln Glu Thr Ser Arg Asp Gly
   1085              1090              1095
Val Ser Ser Ser Asn His Leu Gly Val Phe Tyr Phe Ala Asp Ala
   1100              1105              1110
Ala Asn Arg Pro Val Tyr Thr Asp Arg Asn Ala Leu Gly Val Glu
   1115              1120              1125
Ala Lys Asp Glu Ala Ala Lys Leu Asp Ser Phe Cys Pro Gly Ala
   1130              1135              1140
Tyr Pro Gly His Ala Pro Ser Ala Leu Thr Thr Arg Thr Asp Pro
   1145              1150              1155
Asn Pro Asp Ile His Phe Asp Tyr Met Asn Asp Asn Asp Thr Thr
   1160              1165              1170
Arg Phe Gly Gln Asn Ala Val Thr His Gly Tyr Tyr Asp Pro Ser
   1175              1180              1185
Thr Gln Lys Phe Thr Val Thr Gly Lys Val Asp Asp Asn Val Val
   1190              1195              1200
Ser Leu Thr Val Leu Gly Asp Asn Ser Asn Glu Asn Ala Pro Glu
   1205              1210              1215
Asn Gln Val Lys Leu Gly Asn Asp Gly Lys Phe Ser Phe Thr Val
   1220              1225              1230
Thr Ala Asn Arg Thr Gly Gln Arg Pro Ile Ala Tyr Ile Tyr Lys
   1235             1240               1245
Ala Lys Asp Gly Gln Arg Val Arg Gly Thr Leu Asn Leu Ile Leu
   1250              1255              1260
Asp Thr Val Ala Pro Ser Leu Glu Val Asn Gln Val Asn Gly Asp
   1265              1270              1275
Glu Leu Glu Leu Trp Thr Asn Asn Pro Lys Phe Thr Leu Ser Gly
   1280              1285              1290
Lys Val Asn Asp Asn Leu Asp Gly Tyr Arg Leu Phe Val Asn Gly
   1295              1300              1305
Asn Asn Ile Tyr Arg Glu Phe Leu Asn Ser Gly Tyr Asn Gln Val
   1310              1315              1320
Ala Gly Leu Asn Thr Asp Thr Glu Phe Thr Asn Pro Tyr Gly Ala
   1325              1330              1335
His Asp Phe Glu Glu Val Glu Asn Leu Asn Asp Asn Asn Asp Gln
   1340              1345              1350
Pro Thr Thr His Val Phe Thr Val Tyr Val Val Asp Gln Val Gly
   1355              1360              1365
Asn Lys Val Glu Lys Lys Leu Thr Val His Phe Asp Pro Asn Tyr
   1370              1375              1380
Val Ala Pro Glu Glu Val Pro Asn Thr Asp Thr Ser Tyr Thr Leu
   1385              1390              1395
Glu Asn Pro Leu Ser Thr Thr Thr Val Glu Asn Pro Val Thr Asp
   1400              1405              1410
Val Ser Thr Val Gln Pro Lys Gly Glu Thr Leu Thr Gly Lys Ser
   1415              1420              1425
Phe Asn Leu Leu His Asp Ala Tyr Ile Tyr Asn Lys Asp Gly Gln
   1430              1435              1440
Val Val Leu Ser Thr Asp Thr Asn Lys Ser Ser Leu Leu Lys Lys
   1445              1450              1455
Gly Gln Arg Ile Thr Ala Leu Asp Asn Gly Lys Thr Val Val Ile
   1460              1465              1470
Asn Gly Val Gln Tyr Tyr Arg Val Gly Asp Asn Gln Phe Val Lys
   1475              1480              1485
Val Thr Asn Thr Ile Leu Gln Ala Gly Lys Arg Leu Gln Leu Lys
   1490              1495              1500
His Asn Ala His Leu Tyr Asp Lys Asn Gly Lys Val ValLys Arg
   1505              1510              1515
Asn Gly Lys Pro Val Leu Leu Arg Lys Gly Arg Trp Ile Ser Ala
   1520              1525              1530
Leu Asn Asn Ala Asp Lys Tyr Val Ile Asn Gly Lys Thr Phe Tyr
   1535              1540              1545
Lys Leu Ala Asn Gly Glu Phe Val Lys Val Ala Asn Thr Lys Leu
   1550              1555              1560
Gln Lys Pro Lys Ala Leu Lys Leu Thr His Asn Ala Phe Val Tyr
   1565              1570              1575
Asp Glu Asn Gly Lys Arg Val Lys Lys Ser Lys Val Leu Lys Lys
   1580              1585              1590
Gly Gln Thr Ile Leu Ala Glu Asn Asn Ala Glu Lys Phe His Ile
   1595              1600              1605
Lys Gly Lys Ala Tyr Tyr Lys Val Asn Gly His Phe Val Lys Val
   1610              1615              1620
Ala Asn Thr Leu
   1625
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 7
cgatgataat cctagcgagc                           20
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 8
tggcagaacc tgtgccta                             18
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 9
gccaagacgc ctctggta                             18
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 10
taggtatagt ttccatcagg a                             21
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 11
aargtwccwt ayggyywyaa yta                           23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 12
gccatdswdg trccdswcat dtk                           23
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
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cgaaggcgat aagtcaaact ttgataatgc                    30
<210> 14
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<212> DNA
<213> Artificial
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cccggttctg taagataatt tggatcg                       27
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<213> Artificial
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astcwrrytt ygatratgcw                               20
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ggtgttgctc ctgaagc                                        17
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<213> Artificial
<400> 18
actctagcac cagctaattg aacatcatg                           29

Claims (12)

1、一种混合物在制备降低哺乳动物心率的产品中的应用，所述混合物通过包括利用登记号为DSM 14998的瑞士乳杆菌种发酵包含非人动物乳汁蛋白质的食物材料以得到发酵食物材料的过程而制得，所述发酵食物材料包含具有心率降低特性的活性成份。
2、如权利要求1所述的应用，其中所述发酵食物材料包含多肽或其它具有心率降低特性的活性成份。
3、如权利要求1或2所述的应用，其中所述产品是一种食品或饲料。
4、如权利要求1或2所述的应用，其中所述产品产生心率变动的降低。
5、如权利要求1或2所述的应用，其中所述发酵食物材料经进一步处理，以纯化或浓缩所述具有心率降低特性的多肽或其它活性成份。
6、如权利要求5所述的应用，其中所述的浓缩是以离心机进行，并得到含有所述活性成份的上清液。
7、如权利要求1或2所述的应用，其中所述食物材料为乳汁，所述产品是为乳浆。
8、如权利要求5所述的应用，其中所述食物材料为乳汁，所述产品是为乳浆。
9、一种发酵食物材料，其具有降低哺乳动物心率的特性，并包含用登记号为DSM 14998的瑞士乳杆菌种发酵包含非人动物乳汁蛋白质的食物材料而制得的活性成分。
10、从如权利要求9所述的发酵食物材料分离出的降低心率的成份。
11、如权利要求9所述的发酵发酵食物材料在制备降低心率的药物中的应用。
12、如权利要求10所述的从发酵食物材料中分离出的降低心率的活性成份制备降低心率的药物中的应用。
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