KR20060006804A - 심박수 감소 특성을 갖는 조성물 - Google Patents

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Abstract

심박수 감소 특성이 있는 활성 성분을 함유하는 발효 식품을 얻을 수 있도록, 동물의 젖이나 식물성 단백질을 함유하는 식품을 유산균과 함께 발효시키는 공정을 포함하는 방법에 의하여 얻을 수 있는 조성물의, 포유동물의 심박수 및/또는 심박수 변동을 감소시키기 위한 생성물을 제조하기 위한 용도.
심박수, 유산균, 발효

Description

심박수 감소 특성을 갖는 조성물{COMPOSITION WITH HEART RATE REDUCING PROPERTIES}
본 발명은 심박수 감소 특성이 있는 활성 성분을 함유하는 발효 식품을 얻을 수 있도록, 동물의 젖이나 식물성 단백질을 함유하는 식품을 유산균과 함께 발효시키는 공정을 포함하는 방법에 의하여 얻을 수 있는 조성물의, 포유동물의 심박수를 감소시키기 위한 생성물을 제조하기 위한 용도에 관한 것이다.
심박수가 느릴수록 수명이 길어진다는 관념을 명백히 뒷받침해주는 몇가지 연구 결과가 나왔다. 연구 결과, 일반적인 인구 집단에서, 안정시 높은 심박수와 높은 사망률 간에는 높은 상관관계가 있는 것으로 나타났다. 안정시 심박수가 분당 88회 (88 beats pr.minutes: bpm)를 초과하는 남성들은 65 bpm 미만인 남성에 비해 사망률이 2 내지 3배 높은 것으로 관찰되었다. 심박수는 심혈관계 사망률에만 관련된 것이 아니라 암과 같은 다른 병인에 의한 사망과도 관련이 있는 것으로 보인다. 심지어는 낮은 심박수와 예상 수명간의 일반적인 관계에 대한 가설이 세워진 적도 있다 (Zaza 외, 2001).
현재 산업화된 국가에서 가장 흔한 심혈관계 질환은 심장기능부전으로 이어지는 관상 동맥 질환 (CAD) 또는 관상 동맥 심질환 (CHD)이다. CAD와 CHD는 심장 표면의 동맥을 "경화"시키는데 여기서 "경화"라 함은 동맥이 지나치게 좁아지고 뻣뻣해져서 혈액의 자유로운 흐름을 차단시키는 증상을 가리킨다.
심박수가 낮다는 것은 특히 부정맥의 위험성이 낮은 것과 연곤이 있다. 심박수가 높을수록 대사율이 높고 미주신경 긴장도가 낮은 것을 반영하므로 빈혈 위험이 증가된다. 또한 심박수가 높으면 심실기능 역시 저해될 수 있다 (Lombardi, F in Zaza 외, 2001). 따라서, CAD나 CHD와 관련된 중요한 위험 인자들이 높은 심박수와 관련이 있다는 보고 내용은 놀라운 것이 아니다. CAD나 CHD는 흔히 의약으로 치료된다. 이러한 약제들은 다음과 같은 다양한 카테고리에 속한다:
1. 특정 화학물질이 심장 내의 베타 수용체과 결합하는 것을 차단함으로써 심장의 부하를 감소시키는 베타 차단제.
2. 혈관에 직접 작용함으로써, 혈관을 이완시켜 산소가 보다 풍부한 혈액을 심장에 도달하도록 해주는 니트레이트류.
3. 심장을 통한 혈류를 증가시키고 칼슘 이온이 혈관이 수축 또는 위축시키는 시그널링을 차단함으로써 심장의 부하를 감소시키는 칼슘 채널 차단제.
4. 혈소판 (혈액 중에서 발견되는 미세 입자)이 서로 결합하여 응혈을 형성하는 것을 감소시킴으로써 응혈 형성을 저해하는 항혈소판 제제 (예컨대 아스피린).
이러한 질환의 진행 초기 단계에서 높은 심박수를 예방하는 것은 약물을 이용한 높은 심박수 치료의 대안이 될 수 있다. 식품에서 유래된 다수의 바이오활성적인 화합물들이 현재 일반적인 건강이나 건강 증진에 이로운 것으로 여겨지고 있 다.
유산균 (LAB: lactic acid bacteria)에 의해 발효된 젖은, 유산균에 의한 단백질 분해 활성에 의해 젖 중의 카제인으로부터 펩타이드을 방출시킴으로써 항과민성 효과를 나타낼 수 있다. 이것은 예컨대 EP821968 (Calpis Food Industry), EP1016709 (Calpis Food Industry) 및 WO0132836 (Valio Ltd.)에 개시되어 있다.
야마모토 (Yamamoto) 등 (1996)의 논문에는 락토바실러스 헬베티쿠스 (lactobacillus helveticus) 및 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae)를 함유하는 스타터로 발효된 젖이 수축기 혈압과 확장기 혈압을 감소시키면서도 맥박수를 비롯한 다른 지수에는 아무런 변화를 일으키지 않음을 보고한 바 있다.
WO0185984 (Davisco International Foods, Inc.) 역시, 유장 단백질의 효소 절단으로부터 얻어진, 항고혈압 효과가 있는 펩타이드에 관한 문헌이다. 심박수 및 혈압의 변동이 측정되었다. 평균 동맥 혈압의 유의적인 감소가 관찰되었으며, 심박수 감소가 일어난 75 mg/kg 투여량에서 관찰된 결과를 제외하고는, 30 내지 150 mg/kg 투여량에서 일어난 심박수 반응에서는 유의적인 차이가 없었다.
푸글상 (Fuglsang, A.) 등 (2002)의 논문에는, 전술한 야마모토 등의 논문 (1996)과 마찬가지로, 발효유 펩타이드가 항고혈압 특성을 갖는다고 개시되어 있다. 3569 페이지의 컬럼 2에는, 테스트된 샘플과 관련해서, 심박수는 비발효유 (위약군)의 그것과는 별 차이가 없는 것으로 설명되어 있다.
전술한 야마모토 등의 문헌 (1996)과 푸글상의 문헌 (2002) 및 WO0185984호 는 유산균에 의한 발효 산물이 혈압을 감소하는 특성은 갖지만, 이것이 심박수 감소 특성까지 갖는다고 믿을만한 이유는 없다.
발명의 요약
본 발명이 해결하고자 하는 문제는 심박수를 감소시키는데 유용한 대안적인 조성물을 제공하는 것이다.
이러한 해법은 식품, 바람직하게는 젖을 유산균 (LAB)로 발효시킴으로서, 심박수 감소 특성이 증가된 활성 성분이 얻어진다는 본 발명자들의 발견에 기초한 것이다. 더욱 상세히는, 후술하는 실시예 1의 표 1을 참조할 수 있다.
따라서, 본 발명의 첫번째 측면은, 심박수 감소 특성을 갖는 펩타이드 또는 기타 활성 성분들을 함유하는 발효 식품을 얻기 위하여, 동물의 젖 또는 식물성 단백질을 함유하는 식품을 유산균으로 발효시키는 공정에 의해 얻을 수 있는 조성물의, 포유동물의 심박수를 감소시키기 위한 생성물을 제조하기 위한 용도에 관한 것이다.
두번째 측면에서, 본 발명은 적어도 1종의 유산균 균주로 식품을 발효시킴으로써 생산된 활성 성분을 함유하며 포유동물에서 심박수 감소 특성을 나타내는 발효 식품을 제공한다. 특히, 락토바실러스 헬베티쿠스 균주 CHCC5951 (DSM 14998)로 발효된 식품은 바람직한 구체예이다.
죽은 세균 뿐 아니라 살아있는 세균을 함유하는 식품은 특히 섭취하기에 건강한 것으로 자주 주장되어 왔기 때문에, 본 발명의 세번재 측면은 포유 동물에서 심박수 감소 특성을 가지면서 죽거나 살아있는 락토바실러스 헬베티쿠스 균주 DSM 14998 또는 그의 변이체를 함유하는 발효 식품을 제공하는 것이다.
투여량 반응 실험 (실시예 4)으로부터 나타난 바와 같이, 심박수 감소 화합물(들)을 보다 높은 농도로 하여 조성물을 만들 경우 더욱 효과적인 반응을 얻을 수 있는 것으로 나타났다. 따라서, 네번째 측면에서, 발효된 식품으로부터 분리된 심박수 감소 성분(들)이 제공된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 협심증, 고혈압, 동맥경화증, 심장발작, 심근경색증, 뇌경색증 및 혈관성형술 후의 재협착, 부정맥, 부정빈맥, 울혈성 심장기능상실증 (CHF), 대동맥판막 역류증, 만성 신장부전, 이상지혈증, 이상지단백질혈증과 같은 관상 동맥 질환 (CAD) 또는 관상 동맥 심질환 (CHD)의 치료 또는 경감을 위한 약제의 제조를 위한, 발효 식품 또는 이로부터 분리된 심박수 감소 활성 성분의 용도를 설명한다.
정의:
본 발명을 구체예를 들어 설명하기에 앞서, 본 발명의 주요 측면에 관계된 특정 용어를 다음과 같이 정의한다.
"포유동물에 있어서 심박수를 감소시키기 위한"이라는 표현은 본 발명에 따른 조성물 투여 전 심장과 관련된 심박수의 감소를 의미한다. 사람에게 테스트하기에 앞서, 심박수 감소 특성은 동물 모델에서 측정하는 것이 바람직하다. 유용한 동물 모델에서 발효 산물을 위관영양법에 의해 자연발생 고혈압 래트 (SHR: spontaneous hypertensive rats)에게 투여하고 위관영양 투여 후 24시간 동안 여러가지 시간대에서 의식이 있는 SHR의 심박수를 원격측정하였다. 위약은 예컨대 비발 효유와 같은 대응하는 비발효 식품인 것이 바람직하다. 실험에 관한 상세 내용은 후술하는 실시예 1을 참고하면 된다. 실시예 6에 설명된 바와 같이 정상혈압의 Wistar 래트에 기초한 모델 역시 심박수 감소를 평가하는데 이용될 수 있다.
"유산균"이라 함은 당을 발효시켜 주로 젖산과 기타 아세트산, 포름산 및 프로피온산을 비롯한 산을 생산하는 그램 양성, 카탈라제 음성, 비운동성의 미호기성 또는 혐기성 세균을 의미한다.
이하에 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하나 이들은 어디까지나 예시 목적으로 제공되는 것이다.
식품
식품은 동물성 유단백질 또는 식물성 단백질을 포함해야 한다.
바람직하게는, 예컨대 전지유나 탈지유 또는 유카제인과 같은, 동물의 유단백질 성분을 포함하는 것이 좋다.
식물성 단백질을 함유하는 바람직한 식품으로는 예컨대 옥수수, 옥수수 단백질, 밀, 밀단백질, 대두, 탈지 대두 또는 대두 단백질을 들 수 있다.
심박수 감소 특성을 갖는 펩타이드 또는 기타 활성 성분을 함유하는 생성물
본문에 설명된 바와 같은 젖산을 사용하면 발효 후 곧바로, 심박수 감소 특성이 대단히 우수한 펩타이드나 기타 활성 성분들이 제공된다. 결과적으로, 발효된 식품으로부터의 펩타이드나 기타 활성 성분들을 추가로 정제하거나 농축시킬 필요가 없다. 발효 식품은 직접 포장되어 식품으로서 시판될 수 있으며, 바람직하게는, 예컨대 동결 건조 형태로 기능성 식품, 또는 식품 첨가물로서 시판될 수 있다. 실시예 1에서는, 이러한 사항이 입증되어 있다. 요약하면, 실시예 1의 결과는 어떠한 부가 처리도 없이 발효유 자체가 우수한 심박수 감소 효과를 갖는다는 것을 보여준다. 부가적으로 동결건조된 발효유는 중성유 중에 현탁됨으로써 적절한 식품으로 될 수 있다. 동결건조된 발효유는 따라서 적절한 식품첨가물로서 볼 수 있다.
"기능성 식품"이라 함은 소비자가 어떠한 경로로, 심박수 감소 특성에 관련된 유용한 기능을 그 식품이 가지고 있다는 정보를 접한 그러한 식품을 가리킨다. 이것은 사료일 수도 있으나, 식품인 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 구체예는 조성물이 다음 공정들을 포함하는 방법에 의해 얻을 수 있는, 심박수 감소 특성을 갖는 펩타이드나 활성 성분들을 함유하는 식품인 경우의 용도에 관한 것이다:
(i) 본 발명에 설명된 바와 같은 심박수 감소 특성을 갖는 활성 성분들을 제조하기 위한 방법에 따라 발효 식품을 제조하는 공정,
(ii) 발효된 식품을 건조하는 공정 및,
(iii) 식품 또는 식품 첨가물을 얻기에 적당한 방식으로 포장하는 공정.
공정 (ii)는 동결건조인 것이 바람직하다.
"포장"이라는 용어는 광의로 이해되어야 한다. 이것은 일단 식품이 발효되어 발효된 식품이 얻어지면, 발효된 식품을 소비자에게 제공하기 위해 포장하여야 함을 가리킨다. 식품은 병, 테트라팩 등에 포장할 수 있다. 바람직하게는, 포장이나 또는 시판품에 그 물질이 심박수 감소 특성을 갖는다는 것을 표시하는 것이 좋다. 이것은 본 발명에 설명된 바와 같은 식품의 모든 측면이나 구체예에도 적용된다.
실시예 1에 설명된 바와 같이, 열처리된 발효 식품 역시 심박수 감소 특성을 갖기 때문에, 식품 중의 유산균은 죽은 것이어도 좋고 살아있는 것이어도 좋다.
심박수 감소 특성을 갖는 생성물의 용도
전술한 바와 같이, "포유동물에 있어서 심박수를 감소시키기 위한"이라는 용어는 본 발명에 설명된 바와 같은 조성물 투여 전의 심박수와 관련된 심박수를 감소시킨다는 의미이다. 바람직하게는, 심박수 감소 특성은 위관영양법 의한 자연발생적인 고혈압 래트 (SHR)에 생성물을 투여하고 위관영양법 실시 후 24시간 동안 여러 시점에서, 바람직하게는 연속적으로, 의식있는 SHR의 심박수를 원격측정에 의해 측정함으로써 측정하는 것이 좋다. 그러나, 다른 동물 모델 역시 발효 식품의 심박수 효율을 평가하는데 이용될 수 있다. 한가지 예는 실시예 6에 설명된 정상혈압의 위스타 (Wistar) 래트 모델이다. 위약은 예컨대, 비발효유와 같이, 대응하는 비발효 식품인 것이 바람직하다. 추가의 상세 내용에 관해서는 실시예 1을 참조할 수 있다.
이 식품은 협심증, 고혈압, 동맥경화증, 심장발작, 심근경색증, 뇌경색증 및 혈관성형술 후의 재협착, 부정맥, 부정빈맥, 울혈성 심장기능상실증 (CHF), 대동맥판막 역류증, 만성 신장부전, 이상지혈증, 이상지단백질혈증과 같은 관상 동맥 질환 (CAD) 또는 관상 동맥 심질환 (CHD)의 치료에 이용될 수 있다. 이러한 경우, 그 생성물은 의약인 것이 좋다. 바람직한 치료 대상 질환은 협심증, 고혈압 및 동맥경화증이다.
전술한 증상에 더해, 심박수 유동 사안도 관심을 끄는 문제이다. 실시예 1, 4 및 5에서는 발효 식품이 효과적으로 심박수를 감소시킬 뿐만 아니라, 놀랍게도 실험 동물의 활동 기간 중 심박수 변동 역시 감소시켜준다는 것이 입증되어 있다. 특히, 유의적인 심박수 변동이 자주 관찰되는 스트레스 상황에서는, 실험동물의 경우 심박수가 사망률과 관련이 있기 때문에 (Zaza 외 2001), 심박수 변동의 제동은 중요한 특성일 수 있다.
관상 동맥 질환은 장기간에 걸쳐 발병하는 경향이 있기 때문에, 일생에 걸쳐 이 질환을 예방하거나 제어할 기화기 있다. 예방적 처치는 초기에 시작할 수 있기 대문에, 동맥경화증이 발병하는 시기를 늦출 수 있다. 따라서, 이 생성물의 또 다른 바람직한 용도는 예방적 사용 방법에 있다. 이 경우 생성물은 사람들이 매일 또는 지속적으로 섭취할 수 있는 식품이거나 식품 첨가물일 수 있다.
바람직하게는 대응하는 비발효 식품으로 정의되는 위약보다 생성물이 심박수 감소 효율이 10% 높은 것인 것이 좋다. 이 정의에 따라, 더욱 바람직하게는 생성물이 위약보다 심박수 감소 효율이 15% 더 높은 것이, 더욱 바람직하게는 위약보다 심박수 감소 효율이 20% 더 높은 것이, 가장 바람직하게는 위약보다 심박수 감소 효율이 25% 더 높은 것이 좋다.
발효 식품으로부터 얻은 심박수 감소 특성을 갖는 펩타이드 또는 기타 활성 성분의 후속 정제
전술한 바와 같이, 유산균을 이용하면 발효 직후 심박수 감소 특성이 매우 우수한 펩타이드나 기타 활성 성분들을 유용한 양으로 얻을 수 있다.
그러나, 어떤 환경에서는 발효 식품으로부터 얻은 심박수 감소 특성을 갖는 펩타이드나 기타 활성 성분을 후속적으로 정제하는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 예컨대 펩타이드나 기타 활성 성분들을, 심박수 감소 펩타이드나 기타 활성 성분을 매우 고농도로 요구하는 약학적 정제와 같은 약제 중에 사용할 경우이다. 따라서, 본 발명의 한가지 구체예에서 이 제품은 약제이다.
더욱이, 실시예 1은 심박수 감소 효과가 생성물의 농도 인자에 비례함을 보여주고 있다.
따라서, 본 발명의 한가지 구체예는 다음 공정들을 포함하는 방법으로 얻을 수 있는 심박수 감소 특성이 있는 펩타이드나 기타 활성 성분들을 정제하거나 농축시키는 방식으로 발효 식품을 부가적으로 가공하는, 전술한 바와 같은 사용 구체예에 관한 것이다:
(i) 전술한 바와 같이 심박수 감소 특성을 갖는 펩타이드 또는 기타 활성 성분을 제조하는 방법에 따라 발효 식품을 제조하는 공정,
(ii) 심박수 감소 특성을 갖는 활성 성분들을 정제 또는 농축하는 방식으로 공정 (i)에서 얻어진 발효 식품을 추가 가공하는 공정,
(iii) 적절한 방식으로 포장하여 제품을 얻는 공정.
이것은 생성물 중에 심박수 감소 특성을 갖는 펩타이드나 기타 활성 성분들을 비교적 고농도로 원할 경우의 상황에 대응한다.
생성물이 식품인 경우 이 방법은 식품에 공정 (ii)의 농축 펩타이드 또는 기타 활성 성분을 부가하는 공정 (iv)가 부가될 수도 있다.
전술한 공정 (ii)에 따른 농축 공정의 바람직한 구체예는 심박수 감소 특성을 갖는 펩타이드나 기타 활성 성분들을 함유하는 발효 식품을 원심분리하고, 펩타이드 노는 기타 활성 성분들을 함유하는 얻어진 상등액을 회수하는 것이다. 식품이 젖인 경우, 이러한 생성물은 유장이 된다.
원심분리는 바람직하게는 1 내지 20분 동안 예컨대 2,000 내지 20,000 rpm의 속도로 수행한다. 원심분리는 또한 원심분리기에서 수행할 수도 잇다.
얻어진 상등액은 심박수 감소 특성을 갖는 펩타이드나 기타 활성 성분의 함량이 증가된 샘플을 얻기 위해, 역상 수지로 처리하여 추가 정제할 수도 있다. 역상 수지를 이용한 정제 처리는 역상 수지 및/또는 역상 크로마토그래피를 이용하여 펩타이드 또는 기타 활성 성분들을 흡착 및 용출시켜 펩타이드나 기타 활성 성분들의 순도를 증가시킴으로써 수행할 수 있다.
이 역상 수지 프로토콜과 관련한 보다 구체적인 기술 상세는 EP821968의 내용을 참조할 수 있다.
또는 발효 식품은 나노여과를 발효 식품 상에 수행하는 방식으로 추가로 가공될 수도 있다. 이것은 발효 식품으로부터 젖산 또는 일가 이온을 제거하기 위하여 수행할 수 있다.
이 나노여과 프로토콜과 관련한 보다 구체적인 기술 상세는 WO01/32905 내용을 참조할 수 있다.
실시예 4에 설명된 바와 같이, 21배 농축된 유장 산물은 심박수에 대해, 뚜렷한 투여량 의존 효과를 나타내었다. 실험 중 정상적 (stationary) 또는 점근적 (asymptotic) 수준에 도달한 징후는 없으며, 이는 활성 화합물(들)을 대량으로 함유하는 조성물이 약제로서 중요한 용도를 가질 수 있음을 시사하는 것이다.
발효
본 발명의 방법에서는, 식품을 유산균 발효 조건 하에서 발효시키는데, 이것은 식품과 및/또는 유산균 복합체의 종류에 따라 변할 수 있다. 바람직하게는, 식품이 수용액이 아닌 경우라면, 식품을 적절한 수용액에 용해시킨 다음 유산균과 혼합하여 발효 배양하는 것이 좋다.
유산균의 배양은 미리 가열 살균처리되어 소정의 배양온도로 냉각된 식품 배지 내로, 미리 배양해 둔 유산균 스타터를 첨가함으로써 수행할 수 있다. 유산균 스타터의 접종량은 배지 1 ml 당 유산균 105 내지 107개 세포로 하는 것이 바람직하다. 배양 온도는 대개 20 내지 50℃, 바람직하게는 30 내지 45℃이다. 배양 시간은 대개 3 내지 48시간이며 바람직하게는 6 내지 24시간이 좋다. 특히, 유산균의 배양을 효과적으로 수행하기 위해서는 pH 3.5 내지 7, 특히 pH 5 내지 6인 배지 배지에서 배양을 수행하는 것이 바람직하다. 또한, pH 4 내지 7의 범위를 유지시키는 pH-스탯 배양을 수행하는 것이 바람직하다. 인큐베이션은 유산균의 수가 108 세포/ml가 초과하면 제한 없이 종결시킬 수 있다.
바람직한 구체예는 식품 100 ml 당 심박수 감소 특성을 갖는 펩타이드 또는 기타 활성 성분들을 0.5 내지 25 mg, 바람직하게는 식품 100 ml 당 심박수 감소 특성을 갖는 펩타이드나 기타 활성 성분들 1 내지 5 mg을 생산하는 조건 하에서 시품을 발효시키는 것이다.
포유동물
포유동물에는 집에서 기르는 동물 (예컨대 고양이와 개), 돼지, 소, 양 및 물고기와 같은 동물이 포함된다. 바람직한 구체예에서 포유동물은 인간인 것이 좋다.
유산균
전술한 바와 같이, "유산균"이라는 용어는 당을 발효시켜 주로 젖산과 기타 아세트산, 포름산 및 프로피온산을 비롯한 산을 생산하는 그램 양성, 카탈라제 음성의, 운동성이 없는 미호기성 또는 혐기성 세균을 가리킨다.
그 중에서도, 유산균으로는 락토바실러스 헬베티쿠스, 락토바실러스 델브루에키이이 서브스피시즈 불가리쿠스, 등과 같은 락토바실러스 속에 속하는 유산균, 락토코커스 락티스와 같은 락토코커스 속에 속하는 유산균, 스트렙토코커스 살리바리우스 서브스피시즈 써모필러스와 같은 스트렙토코커스 속에 속하는 유산균, 류코노스톡 락티스와 같은 류코노스톡 속에 속하는 유산균, 비피도박테리움 롱검 또는 비피도박테리움 브레베와 같은 비피도박테리움 속에 속하는 유산균, 및 페디코커스 속에 속하는 유산균을 들 수 있다.
유산균은 예컨대 효모와 같은 다른 미생물과의 혼합물로서 사용될 수도 있다. 수많은 여러가지 유산균은 당업자에게 잘 알려져 있으며 공중 이용가능하다. 예컨대 도이취 잠룽 폰 미크로오가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하 (DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkuturen GmbH); 및 NCBI의 인터넷 분류학 브라우저 [출원 당시에는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.]를 이용할 수 있다.
바람직하게는, 유산균이 피르미큐트 (Firmicutes) 문, 더욱 바람직하게는 바실리 (Bacilli) 강, 더욱 바람직하게는 락토바실랄 (Lactobacillales) 과, 더욱 바람직하게는 락토바실러스 (Lactobacillus) 속에 속하는 세균인 것이 좋다. 바람직하게는 유산균이 락토바실러스 헬베티쿠스 균주인 것이 좋다. 분류학과 관련한 상세는 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 제2판, 제1권: The Archea and the Deeply Branching and Phototrophic Bacteria에서 찾아볼 수 있다.
특히 바람직한 락토바실러스 헬베티쿠스 (Lactobacillus helveticus) 균주 CHCC5951을 2002년 5월 15일자로 DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkuturen GmbH)에 수탁번호 DSM 14998로 기탁하였다. 기탁은 특허 절차를 위한 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약에 의거하여 행하여졌다.
따라서, 특히 바람직한 구체예는 수탁번호 DSM 14998인 락토바실러스 헬베티쿠스인 유산균을 사용한 경우이다. 또한, 락토바실러스 헬베티쿠스 균주 CHCC4080 역시 2002년 5월 15일자로 DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkuturen GmbH)에 수탁번호 DSM 14997로 기탁하였다. 기탁은 특허 절차를 위한 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약에 의거하여 행하여졌다.
또 다른 바람직한 미생물로는 수탁번호 FERM BP-4835인 락토바실러스 헬베티쿠스 균주, 수탁번호 FERM BP-6060인 락토바실러스 헬베티쿠스 균주, 수탁번호 DSM 13137인 락토바실러스 헬베티쿠스 균주, 락토바실러스 헬베티쿠스 CNRZ32 균주 및 락토바실러스 헬베티쿠스 CP790 균주를 들 수 있다.
200 kDa 세포벽 단백질분해효소 (proteinase)를 함유하는 LAB
바람직한 유산균은 약 200 kDa의 특이적 세포벽 단백질분해효소를 갖는다. 이러한 유산균은 심박수 감소 특성을 갖는 펩타이드 또는 기타 활성 성분들을 제조하는데 특히 적합하다. 이 바람직한 LAB는 이하에 후술한다.
특이적 세포벽 단백질분해효소는 본 명세서에서 prtH200으로 명명한다. prtH200 단백질분해효소는 이 단락에서 설명되는 바와 같이, University of Wisconsin and Utah State University [Pederson 외 (1999, J. of Bacteriology, 181:4592-4597)] 논문에 설명된 락토바실러스 헬베티쿠스 CNRZ32 균주로부터 얻은 prtH 204 kDa 세포벽 단백질분해호쇼에 대응한다. 이 논문에서는 심박수 감소 특성을 갖는 펩타이드나 기타 활성 성분을 제조하기 위해 CNRZ32 균주를 사용하는 것에 관하여 어떤한 설명이나 암시도 제시되어 있지 않다.
유산균은 세포벽 단백질분해효소 (prtH200이라 명명)를 코딩하는 유전자 서열을 포함한다는 특징을 가지며, 여기서 상기 유전자 서열은 세포벽 단백질분해효소 활성을 나타내는 효소를 코딩하는 DNA 서열로서, 이 DNA 서열은 다음 중에서 선택되는 것이다:
(a) SEQ ID NO 1의 위치 1-5550에 표시된 DNA 서열;
(b) (a)에서 정의된 DNA 서열의 대응 단편과 적어도 50% 동일성을 갖는 75개 이상의 염기쌍 (bp) 단편을 포함하는 DNA 서열;
(c) SEQ ID NO 2의 위치 1-1849에 표시된 폴리펩타이드 서열의 대응 단편과 적어도 30% 동일한 적어도 200개 아미노산 (aa)의 단편을 포함하고, 세포벽 단백질분해효소 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열;
(d) SEQ ID NO 1의 1-5550 위치에 표시된 DNA 서열을 포함하는 이중가닥 DNA 프로브와 낮은 스트린젠시 (low stringency)로 하이브리다이즈된 DNA 서열; 및
(e) (a), (b), (c) 또는 (d)에 특정된 DNA 서열의 단편인 DNA 서열.
유산균 중에 prtH200 단백질분해효소를 코딩하는 유전자 서열이 존재한다는 것은 적절하게 지정된 PCR 프라이머를 이용한 PCR 증폭에 의해 입증될 수 있다. 당업자가 적절히 지정된 PCR 프라이머를 가질 경우, 특히 적합한 PCR 증폭 프로토콜을 제조하기 위한 그의 일반적 지식을 이용함으로써 유산균에 있어서의 유전자 서열의 존재 여부를 쉽게 입증할 수 있다.
결국, 당업자는 유산균의 수를 신속하게 스크리닝할 수 있고, prtH200 유전자 서열을 함유하는 유산균을 동정함으로써, 공업적 유용성이 증진된 특이적으로 선택된 유산균을 수득하는 것이 가능하다.
특히 바람직한 락토바실러스 헬베티쿠스 균주 CHCC5951의 샘플을 2002년 5월 15일자로 DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkuturen GmbH)에 수탁번호 DSM 14998로 기탁하였다. 기탁은 특허 절차를 위한 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약에 의거하여 행하여졌다.
따라서, 특히 바람직한 구체예는 유산균이 수탁번호 14998인 락토바실러스 헬베티쿠스인 섹션의 구체예이다.
출발 물질로서 수탁번호 DSM 14998 균주를 사용함으로써, 당업자라면 통상적인 돌연변이 또는 재분리 기술에 의해, 심박수 감소 특성을 갖는 펩타이드나 기타 활성 성분들을 제조하기에 적합한 능력을 유지하는 또 다른 변이체나 유도체를 반들 수 있을 것이다.
유산균의 단백질분해 활성
이 섹션에서 설명되는 바와 같은 prtH200, orfF3 및 orfF4 유전자 서열은 이 섹션에 설명된 유용한 유산균을 동정하는데 고도로 적합한 핑거프린트로서 볼 수 있을 것이다. 특정 이론에 구애됨이 없이, 이 섹션에서 설명된 바와 같은 핑거프린트 유전자 서열(들)을 함유함에도 불구하고 어떤 균주들은 이 섹션에서 설명된 유리한 특성을 나타내지 않을 수도 있다.
따라서, 유산균 중에 이 섹션에서 설명된 핑거프린트 유전자 서열(들)이 존재하는 것으로 동정되면, 유산균의 단백질분해 활성을 테스트하는데 유리할 수 있다. 이러한 맥락에서, 바람직한 유산균은 후술하는 바와 같이 단백질분해 활성을 갖는 것이 좋다.
이러한 상황에서, 유산균은 활성 세포벽 단백질분해효소를 합성할 수 있다면 단백질분해 활성을 갖는 것으로 간주된다. 달리 말하면, 세균의 세포내 부분 밖에서 활성적인 단백질분해효소를 입증할 수 있다. 또한, 이 단백질분해효소는 심박수 감소 특성을 갖는 펩타이드나 기타 활성 성분들을 얻을 수 있도록, 단백질 (예컨대 젖 중에 포함된 카제인)을 분해할 수 있도록 해주는 특이성을 가져야만 한다.
바람직하게는, 세균의 단백질분해 활성은 다음 공정을 포함하는 프로토콜에 의해 확인하는 것이 좋다:
(i) 식품 200 ml를 유산균과 함께 밤새 발효시키는 공정,
(ii) 생산된 펩타이드 또는 기타 활성 성분들을 추출하는 공정, 및
(iii) ACE 활성을 50% 억제하는데 요구되는 펩타이드 농도를 측정함으로써, 추출된 펩타이드 또는 기타 활성 성분들의 심박수 감소 특성을 측정하는 공정.
본 명세서에서 ACE 억제 활성 분석은 DL50으로 칭한다. DL50 값이 낮을수록 생성물 중에 함유된 펩타이드나 기타 활성 성분의 심박수 감소 효율이 더 좋은 것이다.
전술한 프로토콜의 공정 (i)에서, 식품은 신선한 젖인 것이 바람직하다. 또한, 세균은 밤새 배양된 형태로 (1% v/v) 식품에 접종하여 적절한 온도에서 밤새 유지시키는 것이 바람직하다. 적절한 온도는 세균의 성장에 적절한 온도이다. 당업자라면 특정 유산균에 대한 온도를 설정하는 방법을 잘 알 것이다. 락토바실러스종의 경우 적절한 온도는 37℃이고 락토코커스종의 경우에는 30℃이다.
본 발명의 실시예 3에는 발효 및 추출 공정의 바람직한 상세 프로토콜과 DL50 ACE 활성 분석을 위한 상세한 바람직한 프로토콜이 제시되어 있다.
바람직하게는, 유산균이 다음 공정으로 이루어진 프로토콜에서 단백질분해 활성을 갖는 것이 좋다:
(i) 식품 200 ml를 세균과 함께 밤새 발효시키는 공정,
(ii) 생성된 펩타이드 또는 기타 활성 성분들을 추출하는 공정, 및
(iii) ACE 활성 (DL50) 50%를 억제하는데 필요한 펩타이드 농도를 측정함으로써, 추출된 펩타이드나 기타 활성 성분들의 항고혈압 특성을 측정하는 공정.
안지오텐신 전환 효소 (ACE: angiotensi-converting enzyme) 억제 활성 (DL50)이 0.25 내지 5.0 (mg/ml)인 펩타이드나 기타 활성 성분들이 생산된다.
더욱 바람직하게는, 유산균이 안지오텐신 전환 효소 (ACE) 억제 활성 (DL50)이 0.25 내지 4.0 (mg/ml)인 펩타이드 또는 기타 활성 성분을 생산할 수 있는 것이 좋고, 더욱 바람직하게는 단백질가수분해 유산균이 안지오텐신 전환 효소 (ACE) 억제 활성 (DL50)이 0.25 내지 3.5 (mg/ml)인 펩타이드 또는 기타 활성 성분을 생산할 수 있는 것이 좋다.
DL50 범위의 하한값은 0.25 mg/ml 대신 1.0 mg/ml일 수 있다.
본 발명에서 "유전자"라 함은 유전의 기본적인 물리적 및 기능적 단위로서 보편적으로 정의되는 바에 따른다. 유전자는 특이적인 기능성 산물 (즉, 단백질 또는 RNA 분자)을 코딩하는 특정 염색체 상의 특정 위치에 위치하는 뉴클레오타이드 (예컨대 DNA 또는 RNA)의 정렬된 서열이다.
"축퇴성 프라이머의 명명법"은 관용 기술의 표준 명명법에 준한다.
Y=C 또는 T; R=A 또는 G; M=A 또는 C; K=G 또는 T; S=G 또는 C; W=A 또는 T; H=A 또는 C 또는 T; B=G 또는 T 또는 C; V=G 또는 C 또는 A; D=G 또는 A 또는 T; N=G, A, C 또는 T.
단편을 포함하는 DNA/아미노산 서열이라는 표현과 관련된 "단편"이라는 용어는 연속적인 부분 서열을 의미한다. 예컨대, 600 아미노산을 갖는 아미노산 서열 중 위치 75-300의 것을 가리킨다.
서열 두개를 비교 동정하는 것과 관련된 "대응하는 단편"이라는 표현은 대응하는 크기의 단편을 가리킨다. 바람직하게는, 비교하고자 하는 두개의 단편들 간의 크기 차이가 50% 미만인 것이 좋다. 즉, 한 단편이 100 bp이면 다른 단편은 150 bp 미만인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 비교하고자 하는 두개의 단편 간의 크기 차이가 25% 미만, 더욱 바람직하게는, 비교하고자 하는 두개의 단편 간의 크기 차이가 5% 미만인 것이 좋다.
prtH200 세포벽 단백질분해효소
세포벽 단백질분해효소의 활성은 유산균 내에 존재하는 중에 측정하는 것이 바람직하다. 적절한 전략 중 한가지는 측정하고자 하는 세포벽 단백질분해효소를 코딩하는 유전자에 치사 돌연변이를 갖는 유산균을 제조하는 것이다. 이렇게 제조된 유산균의 단백질분해 활성 (후술하는 적절한 측정을 위한)은 대응하는 야생형 유산균의 활성과 비교할 수 있다. 대응하는 야생형 유산균에 비해, 치사 돌연변이된 유산균의 단백질분해 활성이 측정가능할 정도로 감소되면, 이는 곧, 측정하고자 하는 세포벽 단백질분해효소를 코딩하는 유전자가 활성 유산균 세포벽 단백질분해효소를 코딩하는 유전자라는 것을 실험적으로 확인해줄 것이다.
당업자라면 적절한 치사 돌연변이를 갖는 유산균을 제조하는 방법을 잘 알고 있을 것이다. 이와 관련해서는 전술한 바와 같은 페더슨 등 (Pederson et al. 1999)의 논문과 야먀모토 등 (Yamamoto et al. 1994)의 논문을 참조할 수 있다.
본 발명의 출원 당시, National Center for Biotechnology Information (NCBI)는 인터넷 사이트 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 표준 BLAST 컴퓨터 서열 상동성 서치 가능성을 제시해주고 있었다.
SEQ ID NO 1 및 SEQ ID NO 2에 도시된 바와 같은 락토바실러스 헬베티쿠스 DSM 14998의 prtH200의 DNA 및 아미노산 서열은 GenBank 데이터베이스에 수탁번호 AF133727로서 공개되어 있다. 데이터베이스 서열 동정은
gi|5758038|gb|AF133727.1|AF133727이다.
레퍼런스 서열로서 SEQ ID NO 2의 1-1849 위치에 표시된 prtH200 아미노산 서열표준 단백질-단백질 BLAST[blastp]은 특히 다음의 결과를 나타낸다 (데이터베이스 서열 동정은 이탤릭체로 표시하였다. 이 정보는 공개된 서열을 명백하게 동정하여 주는 것으로 당업자라면 이에 기초하여 서열을 어떻게 얻을 수 있는지 이해할 수 있을 것이다):
gi|129346|sp|P15293|P2P_LACLC: PII형 단백질분해효소 전구체 (Lactoceptin) (세포벽 관련 세린 단백질분해효소). 미생물: 락토코커스 락티스 서브스피시즈.크레모리스 (Lactococcus lactis subsp. cremoris).
동일성: SEQ ID NO 2의 prtH200 아미노산 서열의 대응 단편에 대해 50% 동일성을 갖는 1600 아미노산 단편.
gi|149582|gb|AAA25248.1|: 단백질분해효소 미생물: 락토바실러스 파라카제이 (Lactobacillus paracasei).
동일성: SEQ ID NO 2의 prtH200 아미노산 서열의 대응 단편에 대해 49% 동일성을 갖는 1632 아미노산 단편.
gi|1381114|gb|AAC41529.1|: (L48487) 단백질분해효소 전구체 미생물: 락토바실러스 델브루에키이 (Lactobacillus delbrueckii).
동일성: SEQ ID NO 2의 prtH200 아미노산 서열의 대응 단편에 대해 32% 동일성을 갖는 1682 아미노산 단편.
gi|18568398|gb|AAL76069.1|: (AF468027) 세포-엔벨록 단백질분해효소. 미생물: 락토바실러스 펜토서스. (Lactobacillus pentosus).
동일성: SEQ ID NO 2의 prtH200 아미노산 서열의 대응 단편에 대해 63% 동일성을 갖는 415 아미노산 단편.
gi|9963932|gb|AAG09771.1|AF243528_1: (AF243528) 세포 엔벨롭 단백질분해효소. 미생물: 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus)
동일성: SEQ ID NO 2의 prtH200 아미노산 서열의 대응 단편에 대해 30% 동일성을 갖는 781 아미노산 단편.
gi|482386|pir||A44833: 락토셉틴 (EC 3.4.21.96). 미생물: 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis).
동일성: SEQ ID NO 2의 prtH200 아미노산 서열의 대응 단편에 대해 61% 동일성을 갖는 264 아미노산 단편.
이들 특이적인 서열들은 모두 SEQ ID NO 2의 1-1849 위치에 도시된 폴리펩타이드 서열의 대응 단편과 30% 이상의 동일성을 갖는 적어도 200개의 아미노산 (aa) 단편을 포함하는, 세포벽 단백질분해효소 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 나타낸다.
레퍼런스 서열로서 SEQ ID NO 1의 1-5550 위치에 표시된 prtH200 DNA 서열을 이용한 표준 뉴클레오타이드-뉴클레오타이드 BLAST[blastn] 서치에 의해 다음 결과가 얻어졌다:
gi|149580|gb|M83946.1|LBAMPRO. 단백질분해효소 (prtP) 유전자. 미생물: 락토바실러스 파라카제이 (Lactobacillus paracasei).
동일성: SEQ ID NO 1의 prtH200 DNA 서열의 대응 단편에 대해 84% 동일성을 갖는 102 bp 단편.
gi|47197|emb|X14130.1|SLPRT763. 세포벽 -관련 세린 단백질분해효소에 대한 플라스미드 pLP763 prt 유전자. 미생물: 스트렙토코커스 락티스 (Streptococcus lactis)
동일성: SEQ ID NO 1의 prtH200 DNA 서열의 대응 단편에 대해 86% 동일성을 갖는 81 bp 단편.
gi|472834|gb|M24767.1|STRWGPROT. Wg2 단백질분해효소 유전자. 미생물: 에스.크레모리스 (S. cremoris)
동일성: SEQ ID NO 1의 prtH200 DNA 서열의 대응 단편에 대해 86% 동일성을 갖는 81 bp 단편.
gi|149476|gb|J04962.1|LACPRASE. PIII형 단백질분해효소 (prtP) 및 돌연변이 단백질. 미생물: 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis).
동일성: SEQ ID NO 1의 prtH200 DNA 서열의 대응 단편에 대해 86% 동일성을 갖는 81 bp 단편.
gi|18568397|gb|AF468027.1|. 세포-엔벨롭 단백질분해효소 (prtP) 유전자. 미생물: 락토바실러스 펜토서스 (Lactobacillus pentosus)
동일성: SEQ ID NO 1의 prtH200 DNA 서열의 대응 단편에 대해 83% 동일성을 갖는 102 bp 단편.
이들 특이적 서열들은 모두 SEQ ID NO 1의 1-5550 위치에 도시된 DNA 서열의 대응 단편과 50% 이상의 동일성을 갖는 적어도 75 염기쌍 (bp)의 단편을 포함하는, DNA 서열을 나타낸다.
기타 "핑거프린트" 유전자 서열 (orfF3 및 orfF4);
orfF3:
바람직하게는, prtH200 유전자 서열 외에 LAB 역시 본 발명에서 orfF3으로 명명한 로픈 리딩 프레임을 갖는 유전자를 포함한다. 이 유전자는 부가적인 핑거프린트로서 볼 수 있다.
락토바실러스 헬베티쿠스 DSM 14998의 orfF3의 DNA 및 아미노산 서열을 SEQ ID NO 3 및 SEQ ID NO:4에 제시하였다.
따라서 바람직한 구체예에서, 이 섹션에 설명된 바와 같은 유산균은 그 유전자 서열이, 다음에서 선택된 PCR 프라이머 세트를 이용하는 유산균의 게놈 DNA의 PCR 증폭에 의해 동정 가능한 것인 오픈 리딩 프레임을 코딩하는 prtH200 유전자와 유전자 서열 (orfF3이라 칭함)을 포함한다. [센스 서열 (S); 안티센스 서열 (A)]:
orfF3: (a): (S): 5' CGAAGGCGATAAGTCAAACTTTGATAATGC 3',
(A): 5'CCCGGTTCTGTAAGATAATTTGGATCG 3' 및
(b):(S): 5' ASTCWRRYTTYGATRATGCW 3'
(A): 5'BHKYAMSAWARTTTGGATCR 3'
전술한 바와 같이 적절한 PCR 프라이머는 본 명세서에 설명된 바와 같은 서열에 기초하여 동정될 수 있다.
따라서, 바람직한 구체예에서, 이 섹션에서 설명된 바와 같은 유산균은 prtH200 유전자와 오픈 리딩 프레임을 코딩하는 유전자 서열 (orfF3이라 칭함)을 포함하며, 상기 유전자 서열은 다음과 같이 정의된다:
orfF3는 오픈 리딩 프레임을 코딩하는 DNA 서열로서, 이 DNA 서열은 다음 중에서 선택된다:
(a) SEQ ID NO 3의 1-2799 위치에 표시된 DNA 서열;
(b) (a)에 정의된 DNA 서열의 대응 단편과 적어도 40% 동일성을 갖는 75개 이상의 염기쌍 (bp) 단편을 포함하는 DNA 서열;
(c) SEQ ID NO 4의 1-893 위치에 표시된 폴리펩타이드 서열의 대응 단편과 적어도 30% 동일성을 갖는 적어도 200 개 아미노산 (aa)의 단편을 포함하는 DNA 서열;
(d) 낮은 스트린젠시에서 SEQ ID NO 3의 1-2679 위치에 표시된 DNA 서열을 포함하는 이중 가닥 DNA 프로브와 하이브리다이즈된 DNA 서열; 및
(e) (a), (b), (c) 또는 (d)에 특정된 DNA 서열 단편인 DNA 서열.
"오픈 리딩 프레임"이라 함은 올바른 레지스터로, 단백질을 형성하기 위한 충분한 길이의 아미노산 코딩 트리플렛을 수반하는 번역 개시용 시그날, 및 번역 종결용 시그널을 수반하는 DNA 스트렛치로서 단백질 코딩 유전자의 존재를 가리키는 것이다.
본 발명의 출원 당시, 레퍼런스 서열로서 SEQ ID NO 4의 1-893 위치에 표시된 연역된 orfF3 아미노산 서열을 이용하는 표준 단백질-단백질 BLAST[blastp] 서치에 의해, 공개된 상동 서열과 연관된 비교적 제한된 결론이 얻어졌다.
그러나, 특정 이론에 구애됨이 없이, 이 섹션에서 설명된 orfF3 유전자는 세포벽 단백질분해효소를 코딩하는 것으로 믿어진다. 결과적으로, 바람직한 구체예에서 이 섹션에서 설명된 orfF3 유전자는 세포벽 단백질분해효소를 코딩한다.
orfF4:
바람직하게는 prtH200 유전자 서열 외에 LAB 역시 본 발명에서 orfF4로 명명한 로픈 리딩 프레임을 갖는 유전자를 포함한다.
락토바실러스 헬베티쿠스 DSM 14998의 orfF4의 DNA 및 아미노산 서열을 SEQ ID NO 5 및 SEQ ID NO:6에 제시하였다.
따라서 바람직한 구체예에서, 이 섹션에 설명된 바와 같은 유산균은 그 유전자 서열이, 다음에서 선택된 PCR 프라이머 세트를 이용하는 유산균의 게놈 DNA의 PCR 증폭에 의해 동정 가능한 것인 오픈 리딩 프레임을 코딩하는 prtH200 유전자와 유전자 서열 (orfF4라 칭함)을 포함한다. [센스 서열 (S); 안티센스 서열 (A)]:
orfF4: (a): (S): 5'GGTGTTGCTCCTGAAGC 3'
(A): 5'ACTCTAGCACCAGCTAATTGAACATCATG 3'
전술한 바와 같이, 적절한 PCR 프라이머는 본 명세서에 개시된 서열에 기초하여 동정될 수 있다.
따라서, 바람직한 구체예에서, 이 섹션에서 설명된 바와 같은 유산균은 prtH200 유전자와 오픈 리딩 프레임을 코딩하는 유전자 서열 (orfF4라 칭함)을 포함하며, 상기 유전자 서열은 다음과 같이 정의된다:
orfF4는 오픈 리딩 프레임을 코딩하는 DNA 서열로서, 이 DNA 서열은 다음 중에서 선택된다:
(a) SEQ ID NO 5의 1-4881 위치에 표시된 DNA 서열;
(b) (a)에 정의된 DNA 서열의 대응 단편과 적어도 40% 동일성을 갖는 75개 이상의 염기쌍 (bp) 단편을 포함하는 DNA 서열;
(c) SEQ ID NO 6의 1-1627 위치에 표시된 폴리펩타이드 서열의 대응 단편과 적어도 30% 동일성을 갖는 적어도 200 개 아미노산 (aa)의 단편을 포함하는 DNA 서열;
(d) 낮은 스트린젠시에서 SEQ ID NO 5의 1-4881 위치에 표시된 DNA 서열을 포함하는 이중 가닥 DNA 프로브와 하이브리다이즈된 DNA 서열; 및
(e) (a), (b), (c) 또는 (d)에 특정된 DNA 서열 단편인 DNA 서열.
본 발명의 출원 당시, 레퍼런스 서열로서 SEQ ID NO 6의 1-1627 위치에 표시된 연역된 orfF4 아미노산 서열을 이용하는 표준 단백질-단백질 BLAST[blastp] 서치에 의해, 공개된 상동 서열과 연관된 비교적 제한된 결론이 얻어졌다.
그러나, 특정 이론에 구애됨이 없이, 이 섹션에서 설명된 orfF4 유전자는 세포벽 단백질분해효소를 코딩하는 것으로 믿어진다. 결과적으로, 바람직한 구체예에서 이 섹션에서 설명된 orfF4 유전자는 세포벽 단백질분해효소를 코딩한다.
바람직하게는, 이 섹션에서 설명된 바와 같은 유산균은 이 섹션에서 설명된 바와 같은 prtH200 유전자, orfF3 유전자 및 orf4 유전자를 포함한다.
PCR 증폭
전술한 바와 같이, 이 섹션에 설명된 바와 같은 유전자 서열의 존재 여부는 본 명세서의 설명에 따라 지정된 PCR 프라이머를 이용하는 PCR 증폭에 의해 바람직하게 입증되리 수 있다. 당업자가 적절하게 지정된 PCR 프라이머를 가지고 있을 경우, 적절한 특정 PCR 증폭 프로토콜을 구축하는데 있어서의 일반 지식을 이용함으로써 유산균에 이들 유전자가 존재하는지 또는 부재하는지를 쉽게 결정할 수 있다.
바람직하게는 PCR 증폭 프로토콜 (반응)이 본 명세서의 실시예 2의 설명란에 따르는 것이 좋다.
일단 PCR이 수행되면, 결과적인 PCR이 이 섹션에서 설명된 바와 같은 유전자 단편에 대응하는 단편들을 증폭시켰는지의 여부를 조사하는 것은 통상적인 일이다. 일반적으로 이것은 PCR 단편의 크기에 기초하여 미리 동정될 수 있는데, 이는 당업자는 일반적으로 양성 PCR 단편 (a positive PCR fragment)의 크기가 얼마나 될런지 대략 알 수 있기 때문이다. 양성 PCR 단편은 이 섹션에 설명된 바와 같은 유전자의 PCR 단편과 연관이 있다. 또는, PCR 단편의 DNA 서열을 결정한 다음, 얻어진 DNA 서열을 본 발명에 개시된 서열들과 비교할 수 있다. 또한, PCR 단편에 대응하는 유전자 중에 치사 돌연변이를 일으킨 유산균을 구축할 수도 있다. 다음으로, 이렇게 구축된 세균의 단백질분해 활성 (후술 내용 참조)을 대응하는 야생형 세균에과 비교하여, 두 세포들 간의 단백질 분해활성의 측정가능한 차이는, 증폭된 PCR 단편에 대응하는 유전자가 이 섹션에 설명된 바와 같은 유산균 세포벽 단백질분해효소를 코딩하는 유전자인지 아닌지를 실험적으로 결정해 줄 것이다.
요약하면, 당업자는 본 발명에 설명된 내용에 따라 지정된 PCR 프라이머를 이용함으로써, 특정 유산균이 대응하는 양성 PCR 단편을 제공할 수 있는지의 여부를 통상적으로 결정할 수 있다는 것이다.
PCR은 유산균 중에 이 섹션에 설명된 바와 같은 유전자가 존재하는지 또는 부재하는지를 조사하는 바람직한 방법이다. 그러나, 예컨대 서던 블롯 분석과 같은 다른 방식으로도 이러한 조사를 행할 수 있다.
PCR 프라이머
전술한 바와 같이, Prt200 유전자와 관련하여 적절한 PCR 프라이머들은 다음과 같다:
PrtH200: (a): (S): 5'CGATGATAATCCTAGCGAGC3',
(A): 5'TGGCAGAACCTGTGCCTA 3';
(b): (S): 5'GCCAAGACGCCTCTGGTA 3',
(A): 5'TAGGTATAGTTTCCATCAGGA 3'; 및
(c): (S): 5'AARGTWCCWTAYGGYYWYAAYTA 3',
(A): 5'GCCATDSWDGTRCCDSWCATDTK 3'.
PrtH200: (a): (S)는 SEQ ID NO 7에 제시되어 있다;; PrtH200: (a): (A)는SEQ ID NO 8에 제시되어 있다;
PrtH200: (b): (S)는 SEQ ID NO 9에 제시되어 있다; PrtH200: (b): (A)는 SEQ ID NO 10에 제시되어 있다;
PrtH200: (c): (S)는 SEQ ID NO 11에 제시되어 있다; PrtH200: (c): (A)는SEQ ID NO 12에 제시되어 있다.
프라이머 세트 (a)를 이용하는 경우 증폭된 PrtH200 PCR 단편의 크기는 400 bp 내지 800 bp인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 500 bp 내지 700 bp인 것이 바람직하다.
프라이머 세트 (b)를 이용하는 경우 증폭된 PrtH200 PCR 단편의 크기는 200 bp 내지 500 bp인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 250 bp 내지 375 bp인 것이 바람직하다.
프라이머 세트 (c)를 이용하는 경우 증폭된 PrtH200 PCR 단편의 크기는 400 bp 내지 800 bp인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 500 bp 내지 700 bp인 것이 바람직하다.
가장 바람직한 PrtH200 관련 PCR 프라이머는 프라이머 세트 (a)와 프라이머 세트 (b)이다.
전술한 바와 같이 orfF3과 관련하여 적절한 PCR 프라이머들은 다음과 같다:
orfF3: (a): (S): 5'CGAAGGCGATAAGTCAAACTTTGATAATGC 3',
(A): 5'CCCGGTTCTGTAAGATAATTTGGATCG 3'; 및
(b):(S): 5'ASTCWRRYTTYGATRATGCW 3',
(A): 5'BHKYAMSAWARTTTGGATCR 3'.
orfF3:(a):(S)는 SEQ ID NO 13에 개시되어 있다; orfF3:(a):(A)는 SEQ ID NO 14에 개시되어 있다;
orfF3:(b):(S)는 SEQ ID NO 15에 개시되어 있다; orfF3:(b):(A)는 SEQ ID NO 16에 개시되어 있다.
프라이머 세트 (a)를 이용하는 경우 증폭된 orfF3 PCR 단편의 크기는 1250 bp 내지 1900 bp인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 1500 bp 내지 1725 bp인 것이 바람직하다.
프라이머 세트 (b)를 이용하는 경우 증폭된 orfF3 PCR 단편의 크기는 1250 bp 내지 1900 bp인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 1500 bp 내지 1725 bp인 것이 바람직하다.
가장 바람직한 orfF3 관련 PCR 프라이머는 프라이머 세트 (a)이다.
전술한 바와 같이 orfF4와 관련하여 적절한 PCR 프라이머는 다음과 같다:
orfF4: (a): (S): 5' GGTGTTGCTCCTGAAGC 3'
(A): 5' ACTCTAGCACCAGCTAATTGAACATCATG 3'.
프라이머 세트 (a)를 이용할 경우, 증폭된 orfF4 PCR 단편의 크기는 700 bp 내지 1150 bp인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 876 bp 내지 1025 bp인 것이 좋다.
DNA 서열의 동일성/정체성
상기한 DNA 서열 상동성/동일성 (homology/identity)은 첫번째 서열과 두번째 서열 간의 편차를 가리키는 두 서열들 간의 동일성 정도로서 측정된다.
본 발명의 출원 당시, National Center for Biotechnology Information (NCBI)는 인터넷 사이트 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 표준 BLAST 컴퓨터 서열 상동성 서치 가능성을 제시해주고 있었다.
BLAST 프로그램은 [Altschul 외 (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 설명되어 있다.
현 상황에서, 바람직한 컴퓨터 상동성 서치 프로그램은, "Standard nucleotide-nucleotide BLAST [blastn]" 서치로서, 본 발명 출원 당시 NCBI 인터넷 사이트에서 세팅 필터: 낮은 복잡도; 기대치: 10, 단어 크기: 11로 설정 제공되고 있었다.
레퍼런스 서열을 프로그램에 도입하면 프로그램은 레퍼런스 서열의 대응 단편에 대한 동일성 백분율과 함께 공개 서열의 단편을 동정한다.
이 표준 뉴클레오타이드-뉴클레오타이드 BLAST 컴퓨터 프로그램을 이용하면, 이 섹션에 설명된 바와 같은 prtH200 서열은 바람직하게는 SEQ ID NO 1의 1-5550 위치에 제시된 prtH200 DNA 서열의 대응 단편과 적어도 60% 동일한 75 이상의 염기쌍 (bp) 단편을 포함하는 DNA 서열인 것이 좋고, 더욱 바람직하게는, SEQ ID NO 1의 1-5550 위치에 제시된 prtH200 DNA 서열의 대응 단편과 적어도 70% 동일한 75 이상의 염기쌍 (bp) 단편을 포함하는 DNA 서열인 것이 좋으며, 더욱 바람직하게는, SEQ ID NO 1의 1-5550 위치에 제시된 prtH200 DNA 서열의 대응 단편과 적어도 80% 동일한 75 이상의 염기쌍 (bp) 단편을 포함하는 DNA 서열인 것이 좋다.
전술한 동일성 백분율에서, 단편은 적어도 100 염기쌍 (bp), 더욱 바람직하게는 단편이 적어도 200 염기쌍 (bp), 더욱 바람직하게는 단편이 적어도 400 bp 염기쌍 (bp), 가장 바람직하게는 단편이 적어도 1500 염기쌍 (bp)인 것이 좋다.
이 표준 뉴클레오타이드-뉴클레오타이드 BLAST 컴퓨터 프로그램을 이용하면, 이 섹션에 설명된 바와 같은 orfF3 서열은 바람직하게는 SEQ ID NO 3의 1-2679 위치에 제시된 orfF3 DNA 서열의 대응 단편과 적어도 60% 동일한 75 이상의 염기쌍 (bp) 단편을 포함하는 DNA 서열인 것이 좋고, 더욱 바람직하게는, SEQ ID NO 3의 1-2679 위치에 제시된 orfF3 DNA 서열의 대응 단편과 적어도 70% 동일한 75 이상의 염기쌍 (bp) 단편을 포함하는 DNA 서열인 것이 좋으며, 더욱 바람직하게는, SEQ ID NO 3의 1-2679 위치에 제시된 orfF3 DNA 서열의 대응 단편과 적어도 8% 동일한 75 이상의 염기쌍 (bp) 단편을 포함하는 DNA 서열인 것이 좋다.
전술한 동일성 백분율에서, 단편은 적어도 100 염기쌍 (bp), 더욱 바람직하게는 단편이 적어도 200 염기쌍 (bp), 더욱 바람직하게는 단편이 적어도 400 bp 염기쌍 (bp), 가장 바람직하게는 단편이 적어도 1500 염기쌍 (bp)인 것이 좋다.
이 표준 뉴클레오타이드-뉴클레오타이드 BLAST 컴퓨터 프로그램을 이용하면, 이 섹션에 설명된 바와 같은 orfF4 서열은 바람직하게는 SEQ ID NO 5의 1-4881 위치에 제시된 orfF4 DNA 서열의 대응 단편과 적어도 60% 동일한 75 이상의 염기쌍 (bp) 단편을 포함하는 DNA 서열인 것이 좋고, 더욱 바람직하게는, SEQ ID NO 5의 1-4881 위치에 제시된 orfF4 DNA 서열의 대응 단편과 적어도 70% 동일한 75 이상의 염기쌍 (bp) 단편을 포함하는 DNA 서열인 것이 좋으며, 더욱 바람직하게는, SEQ ID NO 5의 1-4881 위치에 제시된 orfF4 DNA 서열의 대응 단편과 적어도 80% 동일한 75 이상의 염기쌍 (bp) 단편을 포함하는 DNA 서열인 것이 좋다.
전술한 동일성 백분율에서, 단편은 적어도 100 염기쌍 (bp), 더욱 바람직하게는 단편이 적어도 200 염기쌍 (bp), 더욱 바람직하게는 단편이 적어도 400 bp 염기쌍 (bp), 가장 바람직하게는 단편이 적어도 1500 염기쌍 (bp)인 것이 좋다.
또는, 상동성/동일성은 GCG 프로그램 패키지에 제공된 GAP와 같이, 기술 분야에 공지인 콤퓨터 프로그램에 의해 적절히 측정될 수 있다 (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)(Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453).
DNA 서열 비교를 위한 다음의 세팅, GAP 크리에이션 벌점 5.0 및 GAP 익스텐젼 벌점 0.3을 이용하면, BLAST 프로그램과 관련한 전술한 바람직한 동일성 백분율은 GAP을 이용한 경우의 바람직한 동일성이기도 하다.
아미노산 서열에 대한 상동성
현 상황에서, 바람직한 컴퓨터 상동성 서치 프로그램은 뉴클레오타이드 상동성 분석과 마찬가지로, "Standard protein-protein BLAST [blastp]" 서치 프로그램인데, 이것은 본 발명 출원 당시 NCBI 인터넷 사이트에 세팅 조성-기준 통계가 다음과 같이 설정된 것이다: 낮은 복잡도; 기대치: 10, 단어 크기: 3; 매트릭스: BLOSUM 62, 갭 코스트: 존재 11 익스텐젼 1.
이 표준 단백질-단백질 BLAST 컴퓨터 프로그램을 이용하면, 이 섹션에 설명된 바와 같은 prtH200 서열은 바람직하게는 SEQ ID NO 2의 1-1849 위치에 제시된 prtH200 폴리펩타이드 서열의 대응 단편과 적어도 40% 동일한 200개 이상의 아미노산 (aa) 단편을 포함하며 세포벽 단백질분해효소 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열인 것이 좋고, 더욱 바람직하게는, SEQ ID NO 2의 1-1849 위치에 제시된 prtH200 폴리펩타이드 서열의 대응 단편과 적어도 50% 동일한 200개 이상의 아미노산 (aa) 단편을 포함하며 세포벽 단백질분해효소 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열인 것이 좋으며, 더욱 바람직하게는, SEQ ID NO 2의 1-1849 위치에 제시된 prtH200 폴리펩타이드 서열의 대응 단편과 적어도 65% 동일한 200개 이상의 아미노산 (aa) 단편을 포함하며 세포벽 단백질분해효소 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열인 것이 좋고, 가장 바람직하게는, SEQ ID NO 2의 1-1849 위치에 제시된 prtH200 폴리펩타이드 서열의 대응 단편과 적어도 840% 동일한 200개 이상의 아미노산 (aa) 단편을 포함하며 세포벽 단백질분해효소 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열인 것이 좋다.
전술한 동일성 백분율에서, 단편은 적어도 300개 아미노산 (aa), 더욱 바람직하게는 단편이 적어도 400개 아미노산 (aa), 더욱 바람직하게는 단편이 적어도 800개 아미노산 (aa), 가장 바람직하게는 단편이 적어도 1200개 아미노산 (aa)인 것이 좋다.
이 표준 단백질-단백질 BLAST 컴퓨터 프로그램을 이용하면, 이 섹션에 설명된 바와 같은 orfF3 서열은 바람직하게는 SEQ ID NO 4의 1-893 위치에 제시된 orfF3 폴리펩타이드 서열의 대응 단편과 적어도 40% 동일한 200개 이상의 아미노산 (aa) 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열인 것이 좋고, 더욱 바람직하게는, SEQ ID NO 4의 1-893 위치에 제시된 orfF3 폴리펩타이드 서열의 대응 단편과 적어도 50% 동일한 200개 이상의 아미노산 (aa) 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열인 것이 좋으며, 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO 4의 1-893 위치에 제시된 orfF3 폴리펩타이드 서열의 대응 단편과 적어도 65% 동일한 200개 이상의 아미노산 (aa) 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열인 것이 좋고, 가장 바람직하게는, SEQ ID NO 4의 1-893 위치에 제시된 orfF3 폴리펩타이드 서열의 대응 단편과 적어도 80% 동일한 200개 이상의 아미노산 (aa) 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열인 것이 좋다.
전술한 동일성 백분율에서, 단편은 적어도 300개 아미노산 (aa), 더욱 바람직하게는 단편이 적어도 400개 아미노산 (aa), 더욱 바람직하게는 단편이 적어도 800개 아미노산 (aa), 가장 바람직하게는 단편이 적어도 1200개 아미노산 (aa)인 것이 좋다.
이 표준 단백질-단백질 BLAST 컴퓨터 프로그램을 이용하면, 이 섹션에 설명된 바와 같은 orfF4 서열은 바람직하게는 SEQ ID NO 6의 1-1627 위치에 제시된 orfF4 폴리펩타이드 서열의 대응 단편과 적어도 40% 동일한 200개 이상의 아미노산 (aa) 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열인 것이 좋고, 더욱 바람직하게는, SEQ ID NO 6의 1-1627 위치에 제시된 orfF4 폴리펩타이드 서열의 대응 단편과 적어도 50% 동일한 200개 이상의 아미노산 (aa) 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열인 것이 좋으며, 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO 6의 1-1627 위치에 제시된 orfF4 폴리펩타이드 서열의 대응 단편과 적어도 65% 동일한 200개 이상의 아미노산 (aa) 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열인 것이 좋고, 가장 바람직하게는, SEQ ID NO 6의 1-1627 위치에 제시된 orfF4 폴리펩타이드 서열의 대응 단편과 적어도 80% 동일한 200개 이상의 아미노산 (aa) 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열인 것이 좋다.
전술한 동일성 백분율에서, 단편은 적어도 300개 아미노산 (aa), 더욱 바람직하게는 단편이 적어도 400개 아미노산 (aa), 더욱 바람직하게는 단편이 적어도 800개 아미노산 (aa), 가장 바람직하게는 단편이 적어도 1200개 아미노산 (aa)인 것이 좋다.
또는, 상동성은 GCG 프로그램 패키지에 제공된 GAP와 같이, 기술 분야에 공지인 콤퓨터 프로그램에 의해 적절히 측정될 수 있다 (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)(Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453).
DNA 서열 비교를 위한 다음의 세팅, GAP 크리에이션 벌점 3.0 및 GAP 익스텐젼 벌점 0.1을 이용하면, BLAST 프로그램과 관련한 전술한 바람직한 동일성 백분율은 GAP을 이용한 경우의 바람직한 동일성이기도 하다.
하이브리다이제이션
전술한 하이브리다이제이션이라 함은 이중 가닥 DNA 프로브에 하이브리다이즈하는 유사한 DNA 서열을 포함하는 것으로 의도된다. 낮은, 중간 또는 높은 스트린젠시 조건에서 뉴클레오타이드 프로브와 상동성 DNA 또는 RNA 서열 간의 하이브리다이제이션을 측정하기 위한 적절한 실험 조건은 DNA 단편이나 RNA를 함유하는 필터를 5 x SSC (소듐 클로라이드/소듐 시트레이트, Sambrook 외, 1989)에 10분간 예비정치시키고, 5 x SSC, 5 x Denhardt' 용액 (Sambrook 외, 1989) 용액, 0.5% SDS 및 100 mu g/ml 초음화처리된 변성 연어정자 DNA (Sambrook 외, 1989) 중에서 필터를 프리하이브리다이즈시킨 다음, 45℃에서 12시간 동안 랜덤 프라임된 (Feinberg, A.P. 및 Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132:6-13), 10 ng/ml의 P-dCTP-표지된 (비활성 > 1 x 10 cpm/mu g) 프로브를 함유하는 동일 용액 중에서 하이브리다이제이션시키는 것을 포함한다. 이어서, 필터를 2 x SSC, 0.5% SDS 중에서 55℃ 이상의 온도(낮은 스트린젠시), 보다 바람직하게는 60℃ 이상의 온도 (중간 스트린젠시), 더욱 바람직하게는 65℃ 이상의 온도 (중간/높은 스트린젠시), 더더욱 바라직하게는 70℃ 이상의 온도 (높은 스트린젠시), 더욱 바람직하게는 75℃ 이상의 온도 (매우 높은 스트린젠시)에서 30분간 2회 세정한다.
이러한 조건 하에서 올리고뉴클레오타이드 프로브가 하이브리다이즈하는 분자들을 X선 필름을 이용하여 검출한다.
도 1은 농도 3 (14.3배의 인수로 농축된 고체성 유장 성분을 함유하는 유장 조성물) 또는 위약으로 처리된 동물에 있어서의 심박수 측정 결과를 나타낸다. 각각의 데이터 포인트는 8마리 동물로부터 얻어진 평균값을 나타낸다. 동물의 활동 기간은 빛이 없는 기간, 즉, 검은색 막대로 표시된 기간이다.
도 2는 젖을 발효시켜 얻어진 유장 중의 고체 성분량에 대하여, 2배, 6배, 14.3배 및 21배 농축시킨 유장 성분을 함유하는 유장 조성물이 투여된 동물의 12-15시간 후의 동물에 있어서의 심박수 감소를 도시한 도면이다. 동물에게 위장 튜브 를 이용하여 위관영양법에 의해 유장 산물을 투여하였다. (O)는 위약을 가리킨다. 동물의 심박수를 실시예 1에 설명된 바와 같이 측정하고 미처리 동물의 심박수와 비교하였다.
실시예 1: 심박수 감소 특성의 생체내 테스트
재료 및 방법
균주 및 배양
균주는 MRS 한천 상에서 스트리킹하여 37℃에서 48시간 동안 혐기 배양시켰다. 단일 콜로니를 채취하여 MRS 브로쓰에 접종한 다음 37℃에서 밤새 배양하였다. 스톡 배양체를 이 하룻밤 배양체로부터 준비하여 20% 글리세롤 중에서 -80℃에서 보관하였다. 균주를 젖 중에서 밤새 예비배양하고 발효를 위해 신선한 젖에 1% (v/v) 접종하여다.
샘플의 제조
유장: 샘플 1
젖 (9.5% 단백질 함량)을 1% (v/v)의 접종 농도에서 16시간 동안 단일 배양체 균주와 함께 발효시켰다. 발효 산물을 원심분리하고, 펠렛을 폐기한 다음 유장을 0.45 mm 필터를 통해 여과하고 동결 건조시켰다. 1차 발효와 동일한 조건 하에서 2차 발효시키고, 발효 산물을 원심분리하여 유장 분획을 수득하였다. 펠렛을 폐기하고 유장을 0.45 mm 필터를 통해 여과하여 동결시켰다. 유장을 이용하여 동결건조된 유장 분말을 용해시켜 래트에게 급식하기 전에 21배 농축시켰다.
유장에 용해된 동결건조 발효유: 샘플 2
젖 (9.5% 단백질 함량)을 1% (v/v)의 접종 농도에서 16시간 동안 단일 배양체 균주와 함께 발효시켰다. 총생성물을 동결 건조시켰다. 1차 발효와 동일한 조건 하에서 2차 발효시키고, 발효 산물을 원심분리하여 유장 분획을 수득하였다. 펠렛을 폐기하고 유장을 0.45 mm 필터를 통해 여과하여 동결시켰다. 유장을 이용하여 동결건조된 발효유 분말을 용해시켜 래트에게 급식하기 전에 5배 농축시켰다.
젖에 용해된 동결건조 발효유: 샘플 3
젖 (9.5% 단백질 함량)을 1% (v/v)의 접종 농도로 16시간 동안 단일 배양체 균주와 함께 발효시켰다. 총생성물을 동결건조시켰다. 젖 (9.5% 단백질 함량)을 이용하여 동결건조된 분말을 용해시켜 래트에게 급식하기 전에 5배 농축시켰다.
하룻밤 발효시킨 발효유 제품: 샘플 4
젖 (9.5% 단백질 함량)을 1% (v/v)의 접종 농도로 16시간 동안 단일 배양체 균주와 함께 발효시켰다.
열처리한 하룻밤 발효시킨 발효유 제품: 샘플 5
젖 (9.5% 단백질 함량)을 1% (v/v)의 접종 농도로 16시간 동안 단일 배양체 균주와 함께 발효시켰다.
자연발생적인 고혈압 래트
IFFA CREDO (Charles River Comopany), (프랑스 리용)로부터 자연발생적인 고혈압 래트 (SHR)을 얻었다.
각각의 처리군에게 9:15h 및 9:30h 사이에 위관 영양법에 의해 급식하고 각각의 동물들에게 1마리 당 총 2.5 ml 부피를 급식하였다.
실험 설계
3 그룹을 만들었다:
그룹 1 (n=16): 처리 1이 투여된 그룹 (젖: n=16)
그룹 2 (n=12): 연속 처리된 그룹, 각각의 투여는 3일간의 워시아웃 기간을 두고 수행됨.
그룹: 1) 위약 (젖)
2) 샘플 1 (유장에 현탁된 동결건조된 유장. 21배 농축 투여됨)
2) 샘플 2 (유장에 현탁된 동결건조된 발효유. 5배 농축 투여됨)
3) 샘플 3 (중성pH 젖에 현탁된 동결건조된 발효유. 5배 농축 투여됨)
4) 샘플 4 (발효유 산물)
5) 샘플 5 (발효 후 열처리한 발효유)
6) 샘플 6 (발효되지는 않았으나 살아있는 세균을 포함하는 젖).
실험에 앞서 모든 SHR을 9주일 동안 동물 수용 시설에 순응시켰다. 또한, 모든 동물에게 위관 영양법을 실시하고 최초의 위관 영양 급식에 앞서 3일간 수축기 혈압을 측정하였다.
연구 파라미터
여러 시점에서, 의식이 있는 SHR에 대해 원격 측정법으로, 위관 영양 실시 24시간 후에 수축기 혈압과 심박수를 측정하였다. 요약하면, 투여 24시간 전부터 투여 48시간 후까지 15분마다, 수축기 혈압, 확장기 혈압 및 심박수의 평균값을 (1분 이상의 기간 동안) 기록하였다. 이러한 추적시험으로부터, 각 그룹마다 심박수는 물론 수축기 혈압과 확장기 혈압의 24시간 평균값을 산출하였다.
또한, 미처리 그룹에서 얻어진 값과 비교하여 각 물질에 의해 유도된 수축기 및 확장기 혈압의 변동을 위관 영양 후 24시간 동안, 및 위관 영양 후 3 내지 6시간, 12 내지 15시간 및 21 내지 24시간 동안 산출하였다.
통계
모든 결과들을 평균±표준오차 평균으로서 표시하였다. 미처리 그룹의 값과 각각의 물질을 위관 영양 급식후 얻어진 값 사이의 차이를 SISTAT 8.0 프로그램을 이용하여 계산을 수행하는 페어 스튜던트 t-테스트로 측정하였다.
결과
표 1에 심박수 변동 측정치를 나타내었다.
Figure 112005056889184-PCT00001
미처리1과 미처리2는 각각 연구 1과 연구 2의 대조군이다. 미처리 1은 샘플 1에 대한 위약이었고 미처리 2는 그 밖의 다른 모든 샘플에 대한 위약이었다. 두가지 연구가 생체내 연구에서 두가지로 독립적으로 수행되었기 때문에 본 발명자들은 두가지 위약을 이용하였다.
상기 결과는 21배 농축된 유장 산물 (샘플 1)이 가장 강한 심박수 감소 특성을 가짐을 입증해준다.
상기 결과는 또한 이미 심박수 감소 효과를 갖는 발효유 제품의 경우 더 농축시킬 필요가 없음을 입증해준다. 샘플 4와 샘플 5는 밤새 발효된 발효유 제품으로서 이들은 심박수 감소 효과를 갖는다. 그러나, 심박수 감소 효과는 생성물의 농축 배수에 비례하였다.
펩타이드 또는 기타 활성 성분들을 함유하는 생성물의 유장 부분이 심박수 감소 효과의 결정인자라는 것은 명백하다. 생성물을 한번 투여해도 심박수 감소 효과가 나타났다.
샘플 3은 중성pH의 젖에 현탁된 동결건조된 발효유이다. 이것은 심박수를 크게 감소시킨다. 이것은 최종 용도에 알맞은 여러가지 액체에 용해될 수 있기 때문에, 전술한 바와 같은 발효 산물의 광범한 적용범위를 입증해준다. 상이한 pH와 같은 특성들은 생성물의 심박수 감소 활성에 영향을 미치지 않는다.
발효 후 열처리된 샘플 5 역시 심박수를 감소시킨다. 실제로 이 샘플 중의 모든 세균들은 사멸된 것이다. 따라서, 이는 최종 생성물에 들어있는 세균이 살아있을 필요는 없음을 입증해준다.
샘플 6은 발효되지는 않았으나 살아있는 세균을 함유한다. 이것은 심박수를 감소시키지 않는다. 따라서, 발효 공정이 필요함을 입증해주는 것이다.
실시예 2: PCR 증폭 반응
전술한 바와 같이 페놀-클로로포름 추출에 의해 주형 DNA를 얻었다 (Marmur (1961, Journal of Molecular Biology, 3, 208-218). 최종 조제물은 TE 완충액 + RNAse 중의 게놈 주형 DNA였다.
PCR 반응물을 다음과 같이 제조하였다:
(i) 주형 DNA 1.0 ㎕
전방향 프라이머 (5 pmol/㎕) 1.0 ㎕
역방향 프라이머 (5 pmol/㎕) 1.0 ㎕
2.5mM dNTD (dATP, dCTP, dGTP, dTTP의 혼합물) 1.0 ㎕
Mg 완충액 (20 mM MgSO4) 5.0 ㎕
DNA 폴리머라제 (Pwo, 100U) 0.5 ㎕
H2O 10.5 ㎕
(ii) 94℃에서 1분간, 50℃에서 90초간 (프라이머 온도는 약 55℃인 경우), 55℃에서 90초간 (프라이머 온도가 약 62℃인 경우), 45℃에서 90초간 (프라이머 온도가 약 50℃인 경우), 그리고 72℃에서 1분간 PCR 증폭 열 프로그램을 30사이클 수행하였다. 30사이클 종료 후 샘플들을 4℃로 냉각하였다.
(iii) PCR 산물을 60 V, 1.5% 아가로스 젤에서 수행하고, UV 하에서 젤을 전단한 다음 제조자 지침에 따라 (Qiagen, Cat. No. 28704) QIA퀵 젤 추출 키트를 이용하여 정제하였다.
실시예 3: 단백질분해 (ACE) 활성 측정
스톡 배양체 조제
MRS 한천 상에 락토바실러스 (Lactobacillus) 종을 스트리킹하고 37℃에서 48시간 동안 혐기 배양시켰다. 단일 콜로니를 채취하고, MRS 브로쓰에 접종한 다음 37℃에서 하룻밤 배양시켰다. M17 한천 상에 락토코커스 (Lactococcus) 종을 스트리킹하고 30℃에서 48시간 동안 호기 배양시켰다. 단일 콜로니를 채취하고, M17 브로쓰에 접종한 다음 30℃에서 하룻밤 배양시켰다. 이들 밤새 배양시킨 배양체로부터 스톡 배양체를 제조하여 -80℃에서 20% 글리세롤 중에 보관하였다.
발효유 및 펩타이드 또는 기타 활성 성분 추출물의 조제
신선한 젖 200 ml에 실시예 1의 밤새 배양한 스톡 배양체 (1% v/v)를 접종하고 사용된 균주에 따라 37℃ 또는 30℃에서 하룻밤 유지시킴으로써 발효시켰다.
발효유로부터, 다음 프로토콜을 이용함으로써 펩타이드 또는 기타 활성 성분들을 추출해낼 수 있다:
- 실온에서 3000 g에서 10분간 원심분리.
- 상등액을 회수하여 NaOH를 이용하여 pH 8.3 (ACE 저해 테스트용 최적 pH)으로 조정.
- 얻어진 상등액을 실온에서 10분간 3000 g로 원심분리.
- 펩타이드 또는 기타 활성 성분들을 포함하는 상등액 (유장)을 회수.
- 로리 (Lowry) 테스트법 (mg 펩타이드/ml 유장)에 따라 (Lowry 외, 1951, J. Biol. Chem., 193: 265-275) 펩타이드 농도를 측정.
유장은 ACE 분석에 직접 사용할 수도 있고 -20℃로 동결시켜도 좋다. 펩타이드 또는 기타 활성 성분을 함유하는 유장을 실시예 3의 "펩타이드 용액"이라 칭한다.
ACE 활성 측정
발효유의 펩타이드 풀을 생체외에서 ACE 활성에 대해 테스트한다. ACE 활성을 50% 저해하는 펩타이드 농도를 DL50 (mg/ml)이라 한다. 이 값이 낮을수록, 발효유의 항고혈압 효과는 더 좋은 것이다. 추출된 펩타이드 또는 기타 활성 성분들의 ACE 활성을 다음 프로토콜에 따라 측정한다:
이 측정법의 핵심은 ACE가 히푸릴-L-히스티딜-L-류신 (HHL: hippuryl-L-histidyl-L-leucine) 기질을 분해하고 발색을 위해 착색제를 첨가한다는데 있다. 펩타이드 또는 기타 활성 성분들이 존재할 경우 펩타이드나 기타 활성 성분들은 ACE를 억제하고 따라서, 분해되는 HHL 기질은 적어진다. 이는, 착색제 첨가 후에 발색이 덜 이루어진다는 의미이다.
용액 조제:
배양 완충액: 188 mmol/붕산 pH 8.3, 1.375 mmol/염화칼륨 (증류수 200 ml에 붕산 2.91 g과 염화칼륨 25.63 g을 용해시킨다. 수산화칼륨 1 mol/l을 이용하여 pH를 8.3으로 조정하고 증류수 250 ml로 희석한다. 실온에서 보관한다).'
기질 용액: 5.8 mmol/l 히푸릴-L-히스티딜-L-류신 (HHL).
(약 90 ml의 배양 완충액에 히푸릴-L-히스티딜-L-류신 250 mg을 용해시키고 동 완충액 100 ml를 채웠다. 40℃에서 보관한다. 기질 용액은 적어도 2주일간 사용가능하다).
스톱 용액: 100 mmol/l HEPES pH 9, 2.5 mmol EDTA.
(800 ml의 증류수에 23.83 g HEPES와 0.93 g의 EDTA를 용해시킨다. 수산화나트륨 1 mol/l을 이용하여 pH를 9로 조정하고 증류수 1l로 희석한다. 실온에서 보관한다).
착색 시약: 1,4-디옥산 중 136 mmol/l 시아뉴릭 클로라이드
(1,4-디옥산 약 400 ml 중 시아뉴릭 클로라이드 12.50 g을 용해시키고 1,4-디옥산을 500 ml까지 충전시킨다. 암갈색 유리병 속에서 실온 보관한다).
측정: (모든 용액들을 실온에서 평형상태이다).
- 배양 완충액을 이용하여 펩타이드 용액의 희석 시리즈를 제조한다. 이 희석 시리즈는 미희석 펩타이드 용액으로부터 블랭크 (배양 완충액만을 함유함)에 이르기까지 6단계 희석물로 구성된다.
- 각 희석물, 펩타이드 용액 10 ㎕, 기질 (HHL) 용액 (2.5 g/l) 40 ㎕ 및 유리튜브 중 ACE (0.25 유닛/ml) 2.5 ㎕를 첨가한다.
- 양성 대조군은 ACE 2.5 ㎕, 배양 완충액 10 ㎕ 및 기질 (HHL) 40 ㎕를 함유한다.
- 음성 대조군은 배양 완충액 12 ㎕ 및 기질 (HHL) 40 ㎕를 함유한다.
- 37℃에서 1시간 배양한다.
- 스톱 용액 300 ㎕를 첨가하여 반응을 종결시킨 다음, 착색제 150 ㎕를 첨가한다.
- 격렬히 혼합한다.
- 5분간 방치한 다음 실온에서 30분간 3300 g에서 원심분리하여 변성 단백지리과 과량의 시아뉴릭 클로라이드를 제거한다.
- 각 샘플의 상등액 300 ㎕를 마이크로타이터 플레이트 구멍에 넣는다.
- 405 nm에서 블랭크로서 물에 대해 판독한다.
ACE 억제 백분율은 다음 식으로 표현된다:
ACE 억제 활성 = (OD405nm 양성 대조군 - OD405nm 샘플) / (OD405nm 양성
대조군 - OD405nm 음성 대조군)
각 희석물은 유장의 펩타이드 농도의 함수로서 ACE 억제 백분율을 나타내는 곡선을 부여하는 고유의 ACE 억제 백분율값을 갖는다. 곡선과 축 상의 대응하는 50% ACE 억제값 사이의 절단점 (intersection point)에서의 펩타이드 농도를 판독함으로서 DL50 (ACE 활성을 50% 억제하는 펩타이드 농도)을 구하였다.
실시예 4: 투여량-반응 실험
실시예 1에서 얻은 결과를 보다 구체화하기 위하여, 자연발생적 고혈압 래트 (SHR)에게 발효유로부터 얻은 유장에 현탁된 발효유로부터 동결건조된 유장의 여러가지 양으로 함유하는 조성물을 투여함으로써, 투여량 반응 실험을 수행하였다.
일반적으로, 재료 및 방법과 실험 설계는 실시예 1에 설명된 바와 같다.
요약하면, 접종 농도 1% (v/v)로 락토바실러스 헬베티쿠스 균주 CHCC5951 (DSM 14998)을 이용하여 젖을 16시간 동안 발효시켰다. 발효유를 원심분리하고, 펠렛을 폐기한 다음 유장을 동결건조시켰다. 1차 발효와 동일 조건 하에서 2차 발효시켜 원심분리하였다. 펠렛을 폐기하고 유장을 4℃에서 방치하였다. 유장을 이용하여 동결건조된 유장 분말을 용해시켜 2차 발효시 얻어진 유장 중 고체 성분량을 2배, 6배 및 14.3배 농축시킨 고체 유장 성분을 함유하는 조성물을 얻었다. 응고의 최종 공정은 래트에게 조성물을 주입하기 직전에 수행하였다.
실시예 1에서와 같이, 비발효류를 위약으로서 이용하였다.
최저 농도로부터 출발하여 이들 별도 테스트 기간 동안, 동일한 실험 동물에 대해 테스트하였다. 각 테스트 기간은 3일 간의 "워시 아웃"에 의해 이격시켰으며 이 워시 아웃 기간 동안에는, 이전 투여량에 의한 활성을 제거하기 위해, 발효된 유장 생성물을 투여하지 않았다.
결과를 표 2에 나타내었다.
위관 영양 급식 후 심박수 (심박수/분)
기간 위약에 대한 편차
0-24 3-6 12-15 21-24 0-24 3-6 12-15 21-24
미처리군 306±2 265±5 337±5 273±2 -2 +3 -4 +5
위약 304±2 268±2 333±3 278±4
위약 314±11 282±12 335±12 295±14 -12 -4 -11 -21
농도 1 302±7 278±10 324±7 274±7
위약 314±9 278±8 346±9 288±8 -5 +8 -12 1
농도 2 309±9 287±10 334±9 289±11
위약 311±9 278±9 337±11 279±8 -14 +1 -24 -2
농도 3 297±9 279±15 314±7 277±10
표 각주: 미처리 래트는 젖도, 유장 산물도 투여받지 않았다. 유약은 비발효유이다. 농도 1, 2, 및 3은 각각 2배, 6배 및 14.3배 농축된 고형 유장 성분을 함유하는 유장 조성물이다. 동물의 활동 기간은 빛이 없는 기간, 즉 9-21의 기간과 일치함을 주의.
도 1에 농도 3 (x14.3배 농축)의 전기간에 걸친 실험 결과를 도시하였다.
또한, 동결 건조된 유장 분말로부터 2차 발효에서 얻어진 유장 중 고형 성분량에 대해 21배 농축된 고형 유장 성분을 함유하는 조성물을 얻었다. 2배, 6배, 14.3배 및 21배 농축된 유장 생성물을 동물에게 주입한 결과를 도 2에 도시하였다.
이 결과는 21배까지 농축된 유장 생성물의 심박수에 미치는, 명백한 투여량 의존 효과를 보여준다. 유장 생성물 투여량이 높을수록 심박수 감소율이 높다. 정상 (stationary) 또는 점근 (asymptotic) 수준에 도달하지 않은 것으로 나타났는데, 이는, 활성 성분을 보다 높은 농도로 함유한느 조성물은 심박수를 감소시키는 효능이 더 클 것으로 기대할 수 있음을 가리키는 것이다.
실시예 5: 고활동 기간 동안 심박수 변동이 감소된다
동물의 활동 기간 중에 심박수는 증가한다. 이 연구의 동물의 활동 기간은 빛이 없는 기간, 즉 검은 막대 (도 1 참조)로 표시된 기간과 거의 일치하였다. 그러나, 도 1의 관찰 결과를 판단해 보면, 놀랍게도 심박수 뿐만 아니라, 심박수의 변화 역시 14.3배 농축된 발효 유장 산물로 처리된 동물에 비해 미처리 동물이 더 큰 것으로 나타났다.
심박수 변동을 정량하기 위하여 12시 내지 15시의 기간 동안 관찰된 심박수 값의 변화를 평가하였다. 실시예 1에 설명된 바와 같이 SISTAT 8.0 프로그램을 이용함으로써 미처리 동물 뿐만 아니라 처리된 동물에서도 표준 편차를 평가하여, 분산치를 산출하는데 이용하였다 ((표준 편차)2 = 분산).
처리된 동물의 표준 편차는 5.9로 평가되었고, 이는 분산치 (5.9)2 = 34.8에 대응하였다.
미처리 동물의 표준 편차는 10.4로 평가되었고, 이는 분산치 (10.4)2 = 108.2에 대응하였다.
1차 데이터가 정규분포된 것으로 가정하면 분산치 34.8은 95% 수준에서 분산치 108.2와 유의적으로 다른 것이다.
따라서, 활동 기간 (분산치로서 평가됨) 동안의 심박수 변동은 x14.3 (14.3배) 농축된 발효 유장 생성물로 처리된 동물의 심박수의 변동에 비해 미처리 동물의 경우 유의적으로 더 큰 것이다.
결론적으로, 심박수 변동은 락토바실러스 헬베티쿠스 (Lactobacillus helveticus) 균주 CHCC5951 (DSM 14998)를 이용하여 발효된 유장 산물에 의해 안정화된다. 이것은 심박수 변화가 실험 토끼 모델 (Zaza 외 2001) 중의 치사율과 깊은 연관이 있는 것으로 관찰되었고, 특히 스트레스 받은 상황에서는 유의적인 심박수 변동이 자주 관찰된 점으로 볼 때, 이 생성물의 중요한 특성일 수 있다.
실시예 6: 락토바실러스 헬베티쿠스 균주 (L. helveticus) CHCC5951을 이용하여 발효시킨 발효유와, 상이한 균주를 이용하여 발효시킨 유사한 시판 발효 제품과의 비교.
이 실시예의 목적은 혈압 강하 특성이 있는 것으로 주장된 시판 유산균 발효유 제품과, 락토바실러스 헬베티쿠스 (Lactobacillus helveticus) 균주 CHCC5951 (DSM 14998)를 이용하여 발효된 제품을 비교하는데 있었다.
이들 두가지 제품의 혈압에 미치는 효과와 심박수에 미치는 효과는, 이들 두 제품을 위스타 래트에 투여하고 마취시킨 동물의 수축기 혈압, 확장기 혈압 및 심박수를 측정함으로써 평가하였다.
특별히 명시하지 않는 한, 재료와 방법은 실시예 1에 설명된 바와 같다.
요약하면, 락토바실러스 헬베티쿠스 (Lactobacillus helveticus) 균주 CHCC5951 (DSM 14998)를 이용하여 젖을 1% (v/v) 접종 농도로 16시간 동안 발효시키고, 얻어진 발효 산물을 동결 건조시켜 동결건조된 발효유 분말을 얻었다. 1차 발효와 동일한 조건 하에서 2차 발효를 실시한 다음 원심분리하였다. 펠렛을 폐기하고 유장을 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과시킨 다음 동결시켰다. 래트에게 급식하기 직전에, 동결건조된 발효유 분말을 유장에 용해시켰다. 이 분말의 용해량은 발효유 부피로부터 얻어진 양에 대응하였는데 상기 발효유 부피는 그것이 용해된 유장 부피의 5배였다 (유장 30 ml 중 4.28 g 분말 in casu). 이 조성물을 이 실시예에서 x5 농도라 칭하기로 한다. 이 조성물을 09:15시와 09:30시 사이에 하룻밤 굶긴 정상 혈압의 위스타 래트 (300-320 그램)에게 x5 농도를 kg 당 7.5 ml의 양으로 투여하였다. 조성물의 효과를 14:30시와 16:30시 사이, 즉, 경구 투여 후 5-7시간 후에에, 마취시킨 동물의 동맥 혈압값과, 심박수를 측정함으로써 평가하였다.
결과를 표 3에 나타내었다.
혈압 및 심박수에 미치는 2가지 서로 다른 발효 산물의 효과
미처리군 시판 제품군 CHCC5951 발효유 제품
수축기 혈압 (mm Hg) 134±3 134±3* 125±3*
확장기 혈압 (mm Hg) 107±3 98±4* 96±2*
평균 혈압 (mm Hg) 116±3 107±4* 106±2*
심박수 (심박수. 분-1) 390±7 387±6* 353±6*
위관 영양 급식 5-7시간 후, 3개의 그룹에서의 수축기 혈압, 확장기 혈압, 평균 동맥 혈압 및 심박수의 값 (평균±SEM).
*는 처리된 래트와 미처리 래트 사이의 p<0.05 수준에서의 유의차를 가리킨다. 통계 분석은 ANOVA를 이용하여 수행한 다음 다중 검정 비교를 위해 Tukey 테스트를 수행하였다.
전술한 데이터로부터 시판 제품과 CHCC5951 발효 산물은 두가지 모두 혈압을 강하시킬 뿐만 아니라, 그 효과의 정도도 같은 것으로 결론지을 수 있다. 그러나, 표 3은 놀랍게도, CHCC5951 발효 산물은 심박수도 유의적으로 감소시킴을 보여준다.
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Ser Val Val Ser Val Phe Ser Thr Ala Glu Gln Gln Val Lys Ala Ser 20 25 30 Val Asp Ser Gln Thr Lys Thr Val Glu Lys Ser Thr Lys Ala Ala Glu 35 40 45 Ser Thr Thr Ala Asn Leu Thr Asn Lys Ala Val Glu Ala Gln Leu Ala 50 55 60 Ala Lys Gly Val Asn Phe Lys His Leu Thr Val Asn Gln Lys Gln Asp 65 70 75 80 Val Tyr Val Asp Val Ile Val Gln Leu Ser Ala Thr Pro Ala Ala Thr 85 90 95 Asn Gly Ser Val Ser Ala Asn Ser Ser Ser Ala Glu Ile Glu Gln Ala 100 105 110 Ser Lys Lys Val Ile Ala Asn Gln Ala Ser Ile Lys Glu Lys Val Lys 115 120 125 Ala Ile Thr Asn Gln Ala Ile Gly Lys Ser Tyr Gly Tyr Val Val Asn 130 135 140 Gly Phe Ala Thr Lys Ala Lys Val Lys Asp Ile Gln Lys Leu Arg Asn 145 150 155 160 Ile Pro Gly Val Lys Ser Val Thr Leu Ala Lys Val Tyr Tyr Ala Asn 165 170 175 Asp Ser Ser Ala Asp Asn Met Ala Asn Val Ser Thr Val Trp Asn Asn 180 185 190 Tyr Lys Tyr Lys Gly Glu Gly Thr Val Val Ser Ile Ile Asp Thr Gly 195 200 205 Ile Asp Pro Asn His Lys Asp Leu Arg Leu Ser Asp Asp Ser Lys Val 210 215 220 Lys Leu Thr Lys Asp 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Ile Asp Leu Ser Pro Ala Gln Ala Lys Ala Leu Gln Ala 1060 1065 1070 Gly Thr Asn Thr Phe Ser Val Ala Leu Phe Asp Asn Ala Ala Asn Ala 1075 1080 1085 Gly Thr Ala Ser Gly Glu Gly Asn Lys Pro Gly Glu Thr Asn Phe Gly 1090 1095 1100 Leu Val Leu Arg Asn Gly Gly Leu Pro Asp Lys Ile Ser Ser Gln Thr 1105 1110 1115 1120 Lys Gly Tyr Asp Ala Lys Asn Gly Thr Tyr Val Phe Ser Gly Thr Tyr 1125 1130 1135 Pro Ser Lys Leu Tyr Gly Thr Tyr Thr Asp Lys Asp Gly Gln Thr His 1140 1145 1150 Asp Leu Asn Val Glu Ser Asp Gly Asn Lys Leu Phe Val Ala Lys Leu 1155 1160 1165 Pro Leu Ser Lys Asp Asp Tyr Lys Thr Thr Val Thr Leu Tyr Ala Asp 1170 1175 1180 Ser Asp His Lys Thr Leu Leu Lys Lys Gln Asp Ile Thr Val Ser Leu 1185 1190 1195 1200 Val Pro Ala Lys Val Glu Ser Leu Ser Val Asp Lys Asn Asp Thr Tyr 1205 1210 1215 Asp Glu Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Leu Ala Gln Thr Ser Glu Asn 1220 1225 1230 Thr Val Lys Leu Ser Gly Lys Val Ser Gly Asp Thr Lys Thr Leu Val 1235 1240 1245 Val Lys Gln Lys Gly Gln Lys Asp Ile Ser Val Lys Leu 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Lactobacillus helveticus <220> <221> CDS <222> (1)..(2679) <400> 3 atg ata aga cta ctg gga aga tgg ttg tgc tcc aga tgg tca ata cac 48 Met Ile Arg Leu Leu Gly Arg Trp Leu Cys Ser Arg Trp Ser Ile His 1 5 10 15 tta ccg ctt tgt tgc ccc ttg tac aac aat ggt gaa aac aaa gtt caa 96 Leu Pro Leu Cys Cys Pro Leu Tyr Asn Asn Gly Glu Asn Lys Val Gln 20 25 30 act aat gac act cca gtt atc att gat act act gct cct gtt ttg aac 144 Thr Asn Asp Thr Pro Val Ile Ile Asp Thr Thr Ala Pro Val Leu Asn 35 40 45 aat gtg aaa tat gat aca tct tct ttc aca ttg tca ggt gat tac gct 192 Asn Val Lys Tyr Asp Thr Ser Ser Phe Thr Leu Ser Gly Asp Tyr Ala 50 55 60 gat gca ggt gca ggc ttt act gac tac tca tat gca act gta act gtt 240 Asp Ala Gly Ala Gly Phe Thr Asp Tyr Ser Tyr Ala Thr Val Thr Val 65 70 75 80 aac gat cat gtc ttt ggc ttt aag tta aac gaa ggc gat aag tca aac 288 Asn Asp His Val Phe Gly Phe Lys Leu Asn Glu Gly Asp Lys Ser Asn 85 90 95 ttt gat aat gct aat aaa acc aag gga cac ttt gtc ttt gtt ttg act 336 Phe Asp Asn Ala 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caa gta 1008 Gln Gly Trp Val Glu Ile Asp Gly Pro Thr Phe Asn Ala Lys Gln Val 325 330 335 acg gat cca tcg cca att aat gat gct aac tac ttg ggt gtg tac tac 1056 Thr Asp Pro Ser Pro Ile Asn Asp Ala Asn Tyr Leu Gly Val Tyr Tyr 340 345 350 aat cca aat gct gaa gag aga aag aat tat gat aat cgc gat gat ctt 1104 Asn Pro Asn Ala Glu Glu Arg Lys Asn Tyr Asp Asn Arg Asp Asp Leu 355 360 365 ggc gta gac ttt gaa gat gaa gca gct gac aca aac aca ttt ggc cca 1152 Gly Val Asp Phe Glu Asp Glu Ala Ala Asp Thr Asn Thr Phe Gly Pro 370 375 380 ggg aat tat tca agt gcg aaa gat gac gct aaa att cat ttc gac tac 1200 Gly Asn Tyr Ser Ser Ala Lys Asp Asp Ala Lys Ile His Phe Asp Tyr 385 390 395 400 ttg aat aat aat ggt att tct act ttg ggt aat aaa gca gta gaa aag 1248 Leu Asn Asn Asn Gly Ile Ser Thr Leu Gly Asn Lys Ala Val Glu Lys 405 410 415 ggt tat tac aat cca gca act cat aaa ttt act ttg act ggt cgg gtt 1296 Gly Tyr Tyr Asn Pro Ala Thr His Lys Phe Thr Leu Thr Gly Arg Val 420 425 430 aat cca gaa gtt att agc tta aca ttc tta gct gat agt ccg tat gaa 1344 Asn Pro Glu Val Ile Ser Leu Thr Phe Leu Ala Asp Ser Pro Tyr Glu 435 440 445 gtc gat cca gaa aat caa gct gat att cat gat aat ggt aaa ttc tct 1392 Val Asp Pro Glu Asn Gln Ala Asp Ile His Asp Asn Gly Lys Phe Ser 450 455 460 gta aca ttc aca att gat aat cca gca aca cgt caa tta tca tat ttc 1440 Val Thr Phe Thr Ile Asp Asn Pro Ala Thr Arg Gln Leu Ser Tyr Phe 465 470 475 480 ttt aag acg aat gat ggc aaa aca aca aga ggc tct ttg act tta att 1488 Phe Lys Thr Asn Asp Gly Lys Thr Thr Arg Gly Ser Leu Thr Leu Ile 485 490 495 ctt gac act gtt gat cca act ctt act gta gat caa tta ggc gac aag 1536 Leu Asp Thr Val Asp Pro Thr Leu Thr Val Asp Gln Leu Gly Asp Lys 500 505 510 gat gag gct gaa att act act aat aag cca acc ttt aag tta tcc ggt 1584 Asp Glu Ala Glu Ile Thr Thr Asn Lys Pro Thr Phe Lys Leu Ser Gly 515 520 525 gag gcc aac gat aac att gat ggt tac aat gta ttt atc aat ggt gat 1632 Glu Ala Asn Asp Asn Ile Asp Gly Tyr Asn Val Phe Ile Asn Gly Asp 530 535 540 aat gtt ttt ggg caa ttt ggt aat tcg ggt tat gat ttt ctg cca gga 1680 Asn Val Phe Gly Gln Phe Gly Asn Ser Gly Tyr Asp Phe Leu Pro Gly 545 550 555 560 atc tac aat gat tta aat caa aat act cca aat ttg tac gga tct tac 1728 Ile Tyr Asn Asp Leu Asn Gln Asn Thr Pro Asn Leu Tyr Gly Ser Tyr 565 570 575 aag ttt gat caa gaa gag caa ttg gat gat cag aat ggg caa cca aca 1776 Lys Phe Asp Gln Glu Glu Gln Leu Asp Asp Gln Asn Gly Gln Pro Thr 580 585 590 acc cat gtc ttt act att gca gta gag gac caa gct ggt aac aga gtt 1824 Thr His Val Phe Thr Ile Ala Val Glu Asp Gln Ala Gly Asn Arg Val 595 600 605 gaa aag aag gtt act gtt cat tac gat cca aat tat ctt aca gaa ccg 1872 Glu Lys Lys Val Thr Val His Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Thr Glu Pro 610 615 620 ggt aat aca gga aaa aaa gat gat caa gca gat gta aaa ccg gca gaa 1920 Gly Asn Thr Gly Lys Lys Asp Asp Gln Ala Asp Val Lys Pro Ala Glu 625 630 635 640 ggt caa aag caa gat aaa aat gac aac caa act gtt aac aat tca aaa 1968 Gly Gln Lys Gln Asp Lys Asn Asp Asn Gln Thr Val Asn Asn Ser Lys 645 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att 48 Met Leu Leu Val Phe Gln Lys Leu Gln Leu Trp Val Ala Ala Ala Ile 1 5 10 15 att gct ctt gct tca ggc tcc act gtt ttt ctt agt caa aat act gct 96 Ile Ala Leu Ala Ser Gly Ser Thr Val Phe Leu Ser Gln Asn Thr Ala 20 25 30 gaa gca gca act aat gat cct ggt gct tca gat gtt caa gtt aaa gta 144 Glu Ala Ala Thr Asn Asp Pro Gly Ala Ser Asp Val Gln Val Lys Val 35 40 45 gta caa caa gat caa aaa caa gac caa aac agt act gct aac gca gct 192 Val Gln Gln Asp Gln Lys Gln Asp Gln Asn Ser Thr Ala Asn Ala Ala 50 55 60 gtt tca aat tct gat tct gcc aag aca cag act aat gca acg gac cag 240 Val Ser Asn Ser Asp Ser Ala Lys Thr Gln Thr Asn Ala Thr Asp Gln 65 70 75 80 aca caa aat tca act gtg gtt tct ggt gat tcc acg act gcg aat tct 288 Thr Gln Asn Ser Thr Val Val Ser Gly Asp Ser Thr Thr Ala Asn Ser 85 90 95 aag acc tca cag act tct aat gca caa act aca agt aca aca aca aat 336 Lys Thr Ser Gln Thr Ser Asn Ala Gln Thr Thr Ser Thr Thr Thr Asn 100 105 110 agt gta gat cca aac cag gaa caa caa cct gct aat caa gct gat cat 384 Ser Val Asp Pro Asn Gln Glu Gln Gln Pro Ala Asn Gln Ala Asp His 115 120 125 gtt aaa gga aat gtg cag tct gca tgg gat caa gga tat agg gga caa 432 Val Lys Gly Asn Val Gln Ser Ala Trp Asp Gln Gly Tyr Arg Gly Gln 130 135 140 gga aca gtt gtt gca gtc atc gat tcc ggt gca gat cca act cat aaa 480 Gly Thr Val Val Ala Val Ile Asp Ser Gly Ala Asp Pro Thr His Lys 145 150 155 160 gat ttt aaa acc atg cca gaa gat cct aag ctg tcc gag gat gat atg 528 Asp Phe Lys Thr Met Pro Glu Asp Pro Lys Leu Ser Glu Asp Asp Met 165 170 175 caa gct aag atc gcc aag caa ggc tat ggt aaa tat gtg aat gaa aag 576 Gln Ala Lys Ile Ala Lys Gln Gly Tyr Gly Lys Tyr Val Asn Glu Lys 180 185 190 ttc cca tat gtt tat aat tat gcc gat cgt gat aat gac tat att act 624 Phe Pro Tyr Val Tyr Asn Tyr Ala Asp Arg Asp Asn Asp Tyr Ile Thr 195 200 205 tcg gat gac acc aat gct aat gat tct cca cac ggt caa cac gtt tca 672 Ser Asp Asp Thr Asn Ala Asn Asp Ser Pro His Gly Gln His Val Ser 210 215 220 gga atc att gca gct gat ggt aag cca gat gga aat aaa gaa tat gtc 720 Gly Ile Ile Ala Ala Asp Gly Lys Pro Asp Gly Asn Lys Glu Tyr Val 225 230 235 240 gtt ggt gtt gct cct gaa gct caa ttg atg cag ctg aga gtt ttt gga 768 Val Gly Val Ala Pro Glu Ala Gln Leu Met Gln Leu Arg Val Phe Gly 245 250 255 caa ttt tca gat gaa aaa act gat gat gtg gca aaa gca atc tac gat 816 Gln Phe Ser Asp Glu Lys Thr Asp Asp Val Ala Lys Ala Ile Tyr Asp 260 265 270 gct acc aat tta ggt gcg gat gtc atc caa atg tca tta gga caa ggt 864 Ala Thr Asn Leu Gly Ala Asp Val Ile Gln Met Ser Leu Gly Gln Gly 275 280 285 gtt gcc gat caa caa ttg acc aat att gag caa aaa gct gtt caa tat 912 Val Ala Asp Gln Gln Leu Thr Asn Ile Glu Gln Lys Ala Val Gln Tyr 290 295 300 gca att gat cac ggt gta ttt gta tca att tca gca tct aat aac ggt 960 Ala Ile Asp His Gly Val Phe Val Ser Ile Ser Ala Ser Asn Asn Gly 305 310 315 320 aat tca gct tca gtt gat aat cca agt aaa gtt aaa gat caa gga tat 1008 Asn Ser Ala Ser Val Asp Asn Pro Ser Lys Val Lys Asp Gln Gly Tyr 325 330 335 caa tct ggt agc caa gct ggt aac tat gaa cct ctt aat tta agt act 1056 Gln Ser Gly Ser Gln Ala Gly Asn Tyr Glu Pro Leu Asn Leu Ser Thr 340 345 350 gta gca aac cct ggt gtg tca aag aac gca tta act gtt gct gca gaa 1104 Val Ala Asn Pro Gly Val Ser Lys Asn Ala Leu Thr Val Ala Ala Glu 355 360 365 aca tca gat act ggt gat tta agc gat atg gcc tac ttc tca tca tgg 1152 Thr Ser Asp Thr Gly Asp Leu Ser Asp Met Ala Tyr Phe Ser Ser Trp 370 375 380 ggc cca gct caa gac tat act tta aag cca gat tta tca gca cct gga 1200 Gly Pro Ala Gln Asp Tyr Thr Leu Lys Pro Asp Leu Ser Ala Pro Gly 385 390 395 400 tat caa gta gtt tct acc gtt aat cat gat cag tac caa aca atg agt 1248 Tyr Gln Val Val Ser Thr Val Asn His Asp Gln Tyr Gln Thr Met Ser 405 410 415 ggt act tca atg gct ggt cca ttt gcc gca gct agt gct gcc tta gta 1296 Gly Thr Ser Met Ala Gly Pro Phe Ala Ala Ala Ser Ala Ala Leu Val 420 425 430 att caa cga ttg aag caa act aat cct gaa ttg aag ggt gca caa tta 1344 Ile Gln Arg Leu Lys Gln Thr Asn Pro Glu Leu Lys Gly Ala Gln Leu 435 440 445 gta gct gct gct aaa gca atg ctg atg aat acg gcc aaa cca caa aca 1392 Val Ala Ala Ala Lys Ala Met Leu Met Asn Thr Ala Lys Pro Gln Thr 450 455 460 caa tta ggc tat aca aca cct gtt tca cca aga cgt caa ggt gca ggt 1440 Gln Leu Gly Tyr Thr Thr Pro Val Ser Pro Arg Arg Gln Gly Ala Gly 465 470 475 480 caa att gat gtt ggt gct gct acg gct act cca gtt tat gta act act 1488 Gln Ile Asp Val Gly Ala Ala Thr Ala Thr Pro Val Tyr Val Thr Thr 485 490 495 gat gac ggc act agt tca gta tca ctt cat caa gtt ggt gaa agt act 1536 Asp Asp Gly Thr Ser Ser Val Ser Leu His Gln Val Gly Glu Ser Thr 500 505 510 aaa ttt acg tta acc ttc cat aat tta act gac caa agc cga act tat 1584 Lys Phe Thr Leu Thr Phe His Asn Leu Thr Asp Gln Ser Arg Thr Tyr 515 520 525 act ttc gat gat tat ggt gga ggt tac act gaa caa aga gat aca acc 1632 Thr Phe Asp Asp Tyr Gly Gly Gly Tyr Thr Glu Gln Arg Asp Thr Thr 530 535 540 acc ggc gtt ttt cat gat gtt caa tta gct ggt gct aga gta aat ggt 1680 Thr Gly Val Phe His Asp Val Gln Leu Ala Gly Ala Arg Val Asn Gly 545 550 555 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Val Ala Thr Leu Trp Asn Lys Gly 770 775 780 cca cat caa gtt caa aca gct gat ttc cca gta gta gtt gat aca gtt 2400 Pro His Gln Val Gln Thr Ala Asp Phe Pro Val Val Val Asp Thr Val 785 790 795 800 gct cca aca ttg tca aat gtg aaa tat gat gct gcc tca cat act ttg 2448 Ala Pro Thr Leu Ser Asn Val Lys Tyr Asp Ala Ala Ser His Thr Leu 805 810 815 tca ggt gaa tac caa gat gct ggt gca gga ttt acg aat tat tca tat 2496 Ser Gly Glu Tyr Gln Asp Ala Gly Ala Gly Phe Thr Asn Tyr Ser Tyr 820 825 830 gca acg gta aca gtt aat gat aag gtc ttt ggc tat aag ttg agt gat 2544 Ala Thr Val Thr Val Asn Asp Lys Val Phe Gly Tyr Lys Leu Ser Asp 835 840 845 ggt gga tca ggc ttc gat aat gca gaa aag act aag gga cat ttt agc 2592 Gly Gly Ser Gly Phe Asp Asn Ala Glu Lys Thr Lys Gly His Phe Ser 850 855 860 ttt gtg tta ggt caa gat gca ctt tct gca tta aca gct gct gca aac 2640 Phe Val Leu Gly Gln Asp Ala Leu Ser Ala Leu Thr Ala Ala Ala Asn 865 870 875 880 aag gtg acc gta gcc ttg agt gat gtc gct gat aat act tca ttg gct 2688 Lys Val 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tac ttt gct gat gca gct aat cgc cca gtt tat aca 3360 Leu Gly Val Phe Tyr Phe Ala Asp Ala Ala Asn Arg Pro Val Tyr Thr 1105 1110 1115 1120 gat aga aat gcc ttg gga gta gaa gct aaa gat gaa gct gca aag tta 3408 Asp Arg Asn Ala Leu Gly Val Glu Ala Lys Asp Glu Ala Ala Lys Leu 1125 1130 1135 gat tca ttt tgc cca ggt gca tac cca gga cac gca cca tca gct ctg 3456 Asp Ser Phe Cys Pro Gly Ala Tyr Pro Gly His Ala Pro Ser Ala Leu 1140 1145 1150 aca acc aga acg gat cct aat cca gat att cat ttt gat tat atg aat 3504 Thr Thr Arg Thr Asp Pro Asn Pro Asp Ile His Phe Asp Tyr Met Asn 1155 1160 1165 gac aac gat act act cgt ttt ggt cag aat gcc gtt act cat gga tac 3552 Asp Asn Asp Thr Thr Arg Phe Gly Gln Asn Ala Val Thr His Gly Tyr 1170 1175 1180 tat gat cct tca act cag aag ttt acg gtt acc ggt aaa gtt gat gac 3600 Tyr Asp Pro Ser Thr Gln Lys Phe Thr Val Thr Gly Lys Val Asp Asp 1185 1190 1195 1200 aat gta gta tct cta act gtg tta ggc gat aac tca aat gaa aat gct 3648 Asn Val Val Ser Leu Thr Val Leu Gly Asp Asn Ser 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gat gct tat atc tac aac aaa 4320 Thr Gly Lys Ser Phe Asn Leu Leu His Asp Ala Tyr Ile Tyr Asn Lys 1425 1430 1435 1440 gat ggt caa gtc gtt tta agt act gat act aat aag agt agc ttg ctt 4368 Asp Gly Gln Val Val Leu Ser Thr Asp Thr Asn Lys Ser Ser Leu Leu 1445 1450 1455 aag aaa ggc caa aga att act gca tta gac aat ggc aaa act gtt gta 4416 Lys Lys Gly Gln Arg Ile Thr Ala Leu Asp Asn Gly Lys Thr Val Val 1460 1465 1470 atc aat ggc gtg caa tac tat cgt gtc ggc gat aat cag ttt gtg aag 4464 Ile Asn Gly Val Gln Tyr Tyr Arg Val Gly Asp Asn Gln Phe Val Lys 1475 1480 1485 gta act aat acg att tta caa gcc ggt aag aga ttg cag tta aag cat 4512 Val Thr Asn Thr Ile Leu Gln Ala Gly Lys Arg Leu Gln Leu Lys His 1490 1495 1500 aat gca cac ctt tat gat aag aac ggt aaa gtt gtt aaa aga aat ggc 4560 Asn Ala His Leu Tyr Asp Lys Asn Gly Lys Val Val Lys Arg Asn Gly 1505 1510 1515 1520 aaa cct gtc ttg tta aga aag ggt aga tgg atc agt gct ttg aac aac 4608 Lys Pro Val Leu Leu Arg Lys Gly Arg Trp Ile Ser Ala Leu Asn Asn 1525 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Ile Ala Leu Ala Ser Gly Ser Thr Val Phe Leu Ser Gln Asn Thr Ala 20 25 30 Glu Ala Ala Thr Asn Asp Pro Gly Ala Ser Asp Val Gln Val Lys Val 35 40 45 Val Gln Gln Asp Gln Lys Gln Asp Gln Asn Ser Thr Ala Asn Ala Ala 50 55 60 Val Ser Asn Ser Asp Ser Ala Lys Thr Gln Thr Asn Ala Thr Asp Gln 65 70 75 80 Thr Gln Asn Ser Thr Val Val Ser Gly Asp Ser Thr Thr Ala Asn Ser 85 90 95 Lys Thr Ser Gln Thr Ser Asn Ala Gln Thr Thr Ser Thr Thr Thr Asn 100 105 110 Ser Val Asp Pro Asn Gln Glu Gln Gln Pro Ala Asn Gln Ala Asp His 115 120 125 Val Lys Gly Asn Val Gln Ser Ala Trp Asp Gln Gly Tyr Arg Gly Gln 130 135 140 Gly Thr Val Val Ala Val Ile Asp Ser Gly Ala Asp Pro Thr His Lys 145 150 155 160 Asp Phe Lys Thr Met Pro Glu Asp Pro Lys Leu Ser Glu Asp Asp Met 165 170 175 Gln Ala Lys Ile Ala Lys Gln Gly Tyr Gly Lys Tyr Val Asn Glu Lys 180 185 190 Phe Pro Tyr Val Tyr Asn Tyr Ala Asp Arg Asp Asn Asp Tyr Ile Thr 195 200 205 Ser Asp Asp Thr Asn Ala Asn Asp Ser Pro His Gly Gln His Val Ser 210 215 220 Gly Ile Ile Ala Ala Asp Gly Lys Pro Asp Gly Asn Lys Glu Tyr Val 225 230 235 240 Val Gly Val Ala Pro Glu Ala Gln Leu Met Gln Leu Arg Val Phe Gly 245 250 255 Gln Phe Ser Asp Glu Lys Thr Asp Asp Val Ala Lys Ala Ile Tyr Asp 260 265 270 Ala Thr Asn Leu Gly Ala Asp Val Ile Gln Met Ser Leu Gly Gln Gly 275 280 285 Val Ala Asp Gln Gln Leu Thr Asn Ile Glu Gln Lys Ala Val Gln Tyr 290 295 300 Ala Ile Asp His Gly Val Phe Val Ser Ile Ser Ala Ser Asn Asn Gly 305 310 315 320 Asn Ser Ala Ser Val Asp Asn Pro Ser Lys Val Lys Asp Gln Gly Tyr 325 330 335 Gln Ser Gly Ser Gln Ala Gly Asn Tyr Glu Pro Leu Asn Leu Ser Thr 340 345 350 Val Ala Asn Pro Gly Val Ser Lys Asn Ala Leu Thr Val Ala Ala Glu 355 360 365 Thr Ser Asp Thr Gly Asp Leu Ser Asp Met Ala Tyr Phe Ser Ser Trp 370 375 380 Gly Pro Ala Gln Asp Tyr Thr Leu Lys Pro Asp Leu Ser Ala Pro Gly 385 390 395 400 Tyr Gln Val Val Ser Thr Val Asn His Asp Gln Tyr Gln Thr Met Ser 405 410 415 Gly Thr Ser Met Ala Gly Pro Phe Ala Ala Ala Ser Ala Ala Leu Val 420 425 430 Ile Gln Arg Leu Lys Gln Thr Asn Pro Glu Leu Lys Gly Ala Gln Leu 435 440 445 Val Ala Ala Ala Lys Ala Met Leu Met Asn Thr Ala Lys Pro Gln Thr 450 455 460 Gln Leu Gly Tyr Thr Thr Pro Val Ser Pro Arg Arg Gln Gly Ala Gly 465 470 475 480 Gln Ile Asp Val Gly Ala Ala Thr Ala Thr Pro Val Tyr Val Thr Thr 485 490 495 Asp Asp Gly Thr Ser Ser Val Ser Leu His Gln Val Gly Glu Ser Thr 500 505 510 Lys Phe Thr Leu Thr Phe His Asn Leu Thr Asp Gln Ser Arg Thr Tyr 515 520 525 Thr Phe Asp Asp Tyr Gly Gly Gly Tyr Thr Glu Gln Arg Asp Thr Thr 530 535 540 Thr Gly Val Phe His Asp Val Gln Leu Ala Gly Ala Arg Val Asn Gly 545 550 555 560 Glu His Ser Phe Thr Leu Ala Pro Lys Glu Glu Arg Gln Val Ser Tyr 565 570 575 Ser Leu Asp Leu Thr Gly Leu Lys Lys Asn Gln Leu Val Glu Gly Phe 580 585 590 Leu Arg Phe Thr Asn Ala Asn Asn Ala Ser Thr Val Ser Val Pro Tyr 595 600 605 Leu Ala Tyr Tyr Gly Asp Leu Thr Ser Glu Asn Val Phe Asp Gln Asn 610 615 620 Ala Asn Glu Glu His Leu Asp Ile Gln Gly Asn Arg Leu Val Asn Glu 625 630 635 640 Gln Asn Tyr Pro Arg Gly Ile Ala Asp Gln Glu Ser Leu Lys Glu Leu 645 650 655 Val Asn Val Asp Gly Asn Tyr Asn Trp Gln Glu Val Ala Lys Leu Tyr 660 665 670 Glu Ser Gly Lys Val Ala Phe Ser Pro Asn Asp Asn Gln Lys Ser Asp 675 680 685 Leu Leu Lys Pro Tyr Val Tyr Leu Lys Gln Asn Val Lys Asp Leu Lys 690 695 700 Val Glu Ile Leu Asp Ala Gln Gly Asn Val Val Arg Val Val Ser Asp 705 710 715 720 Val Gln Gly Val Asp Lys Ser Tyr Asp Glu Asn Gly Val Thr Lys Asp 725 730 735 Thr Ser Leu Ser Val Ser Met Arg Asp Asn Pro Asp Ala Leu Glu Trp 740 745 750 Asp Gly Lys Val Tyr Asn Ser Lys Thr Gly Lys Met Glu Thr Ala Lys 755 760 765 Asp Gly Asn Tyr Thr Tyr Arg Leu Val Ala Thr Leu Trp Asn Lys Gly 770 775 780 Pro His Gln Val Gln Thr Ala Asp Phe Pro Val Val Val Asp Thr Val 785 790 795 800 Ala Pro Thr Leu Ser Asn Val Lys Tyr Asp Ala Ala Ser His Thr Leu 805 810 815 Ser Gly Glu Tyr Gln Asp Ala Gly Ala Gly Phe Thr Asn Tyr Ser Tyr 820 825 830 Ala Thr Val Thr Val Asn Asp Lys Val Phe Gly Tyr Lys Leu Ser Asp 835 840 845 Gly Gly Ser Gly Phe Asp Asn Ala Glu Lys Thr Lys Gly His Phe Ser 850 855 860 Phe Val Leu Gly Gln Asp Ala Leu Ser Ala Leu Thr Ala Ala Ala Asn 865 870 875 880 Lys Val Thr Val Ala Leu Ser Asp Val Ala Asp Asn Thr Ser Leu Ala 885 890 895 Thr Val Asn Val Ala Gly Asp His Asp Ser Glu Thr Gly Val Ser Val 900 905 910 Trp Asn Ala Val Asn Gly Leu Ala Phe Asp Gln Lys Ser Pro Asn Tyr 915 920 925 Asp Ala Ala Thr Lys Thr Tyr Thr Leu Val Gly Gly Ala Asn His Asp 930 935 940 Phe Tyr Leu Asn Gly Lys Leu Val Gln Val Gln Asp Gly Lys Tyr Gln 945 950 955 960 Val Pro Val Ser Val Asn Thr Thr Lys Phe Val Phe Ser Thr Asp Pro 965 970 975 Glu Gly Gln His Val Leu Lys Asp Leu Ser Thr Val Thr Ala Lys Ala 980 985 990 Phe Phe Asn Trp Gln Lys Thr Asp Thr Phe Asp Gly Asn Phe Gly Val 995 1000 1005 Thr Ile Ser Ser Val Lys Thr Asn Asn Pro Asn Asp Thr Val Val Gln 1010 1015 1020 Ala Val Val Thr Lys Gly Lys Asn Val Lys Ala Tyr Ala Met Asp Tyr 1025 1030 1035 1040 Phe Thr Gly Glu Val Tyr Thr Gly Glu Val Lys Asp Gly Ile Ala Thr 1045 1050 1055 Phe His Val His Thr Ser Ile Asn Lys Asp Ala Thr Thr Gly Val Tyr 1060 1065 1070 Arg Arg Ala Leu Leu Thr Gly Trp Thr Glu Val Asp Gly Pro Ser Phe 1075 1080 1085 Asn Asp Lys Gln Glu Thr Ser Arg Asp Gly Val Ser Ser Ser Asn His 1090 1095 1100 Leu Gly Val Phe Tyr Phe Ala Asp Ala Ala Asn Arg Pro Val Tyr Thr 1105 1110 1115 1120 Asp Arg Asn Ala Leu Gly Val Glu Ala Lys Asp Glu Ala Ala Lys Leu 1125 1130 1135 Asp Ser Phe Cys Pro Gly Ala Tyr Pro Gly His Ala Pro Ser Ala Leu 1140 1145 1150 Thr Thr Arg Thr Asp Pro Asn Pro Asp Ile His Phe Asp Tyr Met Asn 1155 1160 1165 Asp Asn Asp Thr Thr Arg Phe Gly Gln Asn Ala Val Thr His Gly Tyr 1170 1175 1180 Tyr Asp Pro Ser Thr Gln Lys Phe Thr Val Thr Gly Lys Val Asp Asp 1185 1190 1195 1200 Asn Val Val Ser Leu Thr Val Leu Gly Asp Asn Ser Asn Glu Asn Ala 1205 1210 1215 Pro Glu Asn Gln Val Lys Leu Gly Asn Asp Gly Lys Phe Ser Phe Thr 1220 1225 1230 Val Thr Ala Asn Arg Thr Gly Gln Arg Pro Ile Ala Tyr Ile Tyr Lys 1235 1240 1245 Ala Lys Asp Gly Gln Arg Val Arg Gly Thr Leu Asn Leu Ile Leu Asp 1250 1255 1260 Thr Val Ala Pro Ser Leu Glu Val Asn Gln Val Asn Gly Asp Glu Leu 1265 1270 1275 1280 Glu Leu Trp Thr Asn Asn Pro Lys Phe Thr Leu Ser Gly Lys Val Asn 1285 1290 1295 Asp Asn Leu Asp Gly Tyr Arg Leu Phe Val Asn Gly Asn Asn Ile Tyr 1300 1305 1310 Arg Glu Phe Leu Asn Ser Gly Tyr Asn Gln Val Ala Gly Leu Asn Thr 1315 1320 1325 Asp Thr Glu Phe Thr Asn Pro Tyr Gly Ala His Asp Phe Glu Glu Val 1330 1335 1340 Glu Asn Leu Asn Asp Asn Asn Asp Gln Pro Thr Thr His Val Phe Thr 1345 1350 1355 1360 Val Tyr Val Val Asp Gln Val Gly Asn Lys Val Glu Lys Lys Leu Thr 1365 1370 1375 Val His Phe Asp Pro Asn Tyr Val Ala Pro Glu Glu Val Pro Asn Thr 1380 1385 1390 Asp Thr Ser Tyr Thr Leu Glu Asn Pro Leu Ser Thr Thr Thr Val Glu 1395 1400 1405 Asn Pro Val Thr Asp Val Ser Thr Val Gln Pro Lys Gly Glu Thr Leu 1410 1415 1420 Thr Gly Lys Ser Phe Asn Leu Leu His Asp Ala Tyr Ile Tyr Asn Lys 1425 1430 1435 1440 Asp Gly Gln Val Val Leu Ser Thr Asp Thr Asn Lys Ser Ser Leu Leu 1445 1450 1455 Lys Lys Gly Gln Arg Ile Thr Ala Leu Asp Asn Gly Lys Thr Val Val 1460 1465 1470 Ile Asn Gly Val Gln Tyr Tyr Arg Val Gly Asp Asn Gln Phe Val Lys 1475 1480 1485 Val Thr Asn Thr Ile Leu Gln Ala Gly Lys Arg Leu Gln Leu Lys His 1490 1495 1500 Asn Ala His Leu Tyr Asp Lys Asn Gly Lys Val Val Lys Arg Asn Gly 1505 1510 1515 1520 Lys Pro Val Leu Leu Arg Lys Gly Arg Trp Ile Ser Ala Leu Asn Asn 1525 1530 1535 Ala Asp Lys Tyr Val Ile Asn Gly Lys Thr Phe Tyr Lys Leu Ala Asn 1540 1545 1550 Gly Glu Phe Val Lys Val Ala Asn Thr Lys Leu Gln Lys Pro Lys Ala 1555 1560 1565 Leu Lys Leu Thr His Asn Ala Phe Val Tyr Asp Glu Asn Gly Lys Arg 1570 1575 1580 Val Lys Lys Ser Lys Val Leu Lys Lys Gly Gln Thr Ile Leu Ala Glu 1585 1590 1595 1600 Asn Asn Ala Glu Lys Phe His Ile Lys Gly Lys Ala Tyr Tyr Lys Val 1605 1610 1615 Asn Gly His Phe Val Lys Val Ala Asn Thr Leu 1620 1625 <210> 8 <211> 1627 <212> PRT <213> Lactobacillus helveticus <400> 8 Met Leu Leu Val Phe Gln Lys Leu Gln Leu Trp Val Ala Ala Ala Ile 1 5 10 15 Ile Ala Leu Ala Ser Gly Ser Thr Val Phe Leu Ser Gln Asn Thr Ala 20 25 30 Glu Ala Ala Thr Asn Asp Pro Gly Ala Ser Asp Val Gln Val Lys Val 35 40 45 Val Gln Gln Asp Gln Lys Gln Asp Gln Asn Ser Thr Ala Asn Ala Ala 50 55 60 Val Ser Asn Ser Asp Ser Ala Lys Thr Gln Thr Asn Ala Thr Asp Gln 65 70 75 80 Thr Gln Asn Ser Thr Val Val Ser Gly Asp Ser Thr Thr Ala Asn Ser 85 90 95 Lys Thr Ser Gln Thr Ser Asn Ala Gln Thr Thr Ser Thr Thr Thr Asn 100 105 110 Ser Val Asp Pro Asn Gln Glu Gln Gln Pro Ala Asn Gln Ala Asp His 115 120 125 Val Lys Gly Asn Val Gln Ser Ala Trp Asp Gln Gly Tyr Arg Gly Gln 130 135 140 Gly Thr Val Val Ala Val Ile Asp Ser Gly Ala Asp Pro Thr His Lys 145 150 155 160 Asp Phe Lys Thr Met Pro Glu Asp Pro Lys Leu Ser Glu Asp Asp Met 165 170 175 Gln Ala Lys Ile Ala Lys Gln Gly Tyr Gly Lys Tyr Val Asn Glu Lys 180 185 190 Phe Pro Tyr Val Tyr Asn Tyr Ala Asp Arg Asp Asn Asp Tyr Ile Thr 195 200 205 Ser Asp Asp Thr Asn Ala Asn Asp Ser Pro His Gly Gln His Val Ser 210 215 220 Gly Ile Ile Ala Ala Asp Gly Lys Pro Asp Gly Asn Lys Glu Tyr Val 225 230 235 240 Val Gly Val Ala Pro Glu Ala Gln Leu Met Gln Leu Arg Val Phe Gly 245 250 255 Gln Phe Ser Asp Glu Lys Thr Asp Asp Val Ala Lys Ala Ile Tyr Asp 260 265 270 Ala Thr Asn Leu Gly Ala Asp Val Ile Gln Met Ser Leu Gly Gln Gly 275 280 285 Val Ala Asp Gln Gln Leu Thr Asn Ile Glu Gln Lys Ala Val Gln Tyr 290 295 300 Ala Ile Asp His Gly Val Phe Val Ser Ile Ser Ala Ser Asn Asn Gly 305 310 315 320 Asn Ser Ala Ser Val Asp Asn Pro Ser Lys Val Lys Asp Gln Gly Tyr 325 330 335 Gln Ser Gly Ser Gln Ala Gly Asn Tyr Glu Pro Leu Asn Leu Ser Thr 340 345 350 Val Ala Asn Pro Gly Val Ser Lys Asn Ala Leu Thr Val Ala Ala Glu 355 360 365 Thr Ser Asp Thr Gly Asp Leu Ser Asp Met Ala Tyr Phe Ser Ser Trp 370 375 380 Gly Pro Ala Gln Asp Tyr Thr Leu Lys Pro Asp Leu Ser Ala Pro Gly 385 390 395 400 Tyr Gln Val Val Ser Thr Val Asn His Asp Gln Tyr Gln Thr Met Ser 405 410 415 Gly Thr Ser Met Ala Gly Pro Phe Ala Ala Ala Ser Ala Ala Leu Val 420 425 430 Ile Gln Arg Leu Lys Gln Thr Asn Pro Glu Leu Lys Gly Ala Gln Leu 435 440 445 Val Ala Ala Ala Lys Ala Met Leu Met Asn Thr Ala Lys Pro Gln Thr 450 455 460 Gln Leu Gly Tyr Thr Thr Pro Val Ser Pro Arg Arg Gln Gly Ala Gly 465 470 475 480 Gln Ile Asp Val Gly Ala Ala Thr Ala Thr Pro Val Tyr Val Thr Thr 485 490 495 Asp Asp Gly Thr Ser Ser Val Ser Leu His Gln Val Gly Glu Ser Thr 500 505 510 Lys Phe Thr Leu Thr Phe His Asn Leu Thr Asp Gln Ser Arg Thr Tyr 515 520 525 Thr Phe Asp Asp Tyr Gly Gly Gly Tyr Thr Glu Gln Arg Asp Thr Thr 530 535 540 Thr Gly Val Phe His Asp Val Gln Leu Ala Gly Ala Arg Val Asn Gly 545 550 555 560 Glu His Ser Phe Thr Leu Ala Pro Lys Glu Glu Arg Gln Val Ser Tyr 565 570 575 Ser Leu Asp Leu Thr Gly Leu Lys Lys Asn Gln Leu Val Glu Gly Phe 580 585 590 Leu Arg Phe Thr Asn Ala Asn Asn Ala Ser Thr Val Ser Val Pro Tyr 595 600 605 Leu Ala Tyr Tyr Gly Asp Leu Thr Ser Glu Asn Val Phe Asp Gln Asn 610 615 620 Ala Asn Glu Glu His Leu Asp Ile Gln Gly Asn Arg Leu Val Asn Glu 625 630 635 640 Gln Asn Tyr Pro Arg Gly Ile Ala Asp Gln Glu Ser Leu Lys Glu Leu 645 650 655 Val Asn Val Asp Gly Asn Tyr Asn Trp Gln Glu Val Ala Lys Leu Tyr 660 665 670 Glu Ser Gly Lys Val Ala Phe Ser Pro Asn Asp Asn Gln Lys Ser Asp 675 680 685 Leu Leu Lys Pro Tyr Val Tyr Leu Lys Gln Asn Val Lys Asp Leu Lys 690 695 700 Val Glu Ile Leu Asp Ala Gln Gly Asn Val Val Arg Val Val Ser Asp 705 710 715 720 Val Gln Gly Val Asp Lys Ser Tyr Asp Glu Asn Gly Val Thr Lys Asp 725 730 735 Thr Ser Leu Ser Val Ser Met Arg Asp Asn Pro Asp Ala Leu Glu Trp 740 745 750 Asp Gly Lys Val Tyr Asn Ser Lys Thr Gly Lys Met Glu Thr Ala Lys 755 760 765 Asp Gly Asn Tyr Thr Tyr Arg Leu Val Ala Thr Leu Trp Asn Lys Gly 770 775 780 Pro His Gln Val Gln Thr Ala Asp Phe Pro Val Val Val Asp Thr Val 785 790 795 800 Ala Pro Thr Leu Ser Asn Val Lys Tyr Asp Ala Ala Ser His Thr Leu 805 810 815 Ser Gly Glu Tyr Gln Asp Ala Gly Ala Gly Phe Thr Asn Tyr Ser Tyr 820 825 830 Ala Thr Val Thr Val Asn Asp Lys Val Phe Gly Tyr Lys Leu Ser Asp 835 840 845 Gly Gly Ser Gly Phe Asp Asn Ala Glu Lys Thr Lys Gly His Phe Ser 850 855 860 Phe Val Leu Gly Gln Asp Ala Leu Ser Ala Leu Thr Ala Ala Ala Asn 865 870 875 880 Lys Val Thr Val Ala Leu Ser Asp Val Ala Asp Asn Thr Ser Leu Ala 885 890 895 Thr Val Asn Val Ala Gly Asp His Asp Ser Glu Thr Gly Val Ser Val 900 905 910 Trp Asn Ala Val Asn Gly Leu Ala Phe Asp Gln Lys Ser Pro Asn Tyr 915 920 925 Asp Ala Ala Thr Lys Thr Tyr Thr Leu Val Gly Gly Ala Asn His Asp 930 935 940 Phe Tyr Leu Asn Gly Lys Leu Val Gln Val Gln Asp Gly Lys Tyr Gln 945 950 955 960 Val Pro Val Ser Val Asn Thr Thr Lys Phe Val Phe Ser Thr Asp Pro 965 970 975 Glu Gly Gln His Val Leu Lys Asp Leu Ser Thr Val Thr Ala Lys Ala 980 985 990 Phe Phe Asn Trp Gln Lys Thr Asp Thr Phe Asp Gly Asn Phe Gly Val 995 1000 1005 Thr Ile Ser Ser Val Lys Thr Asn Asn Pro Asn Asp Thr Val Val Gln 1010 1015 1020 Ala Val Val Thr Lys Gly Lys Asn Val Lys Ala Tyr Ala Met Asp Tyr 1025 1030 1035 1040 Phe Thr Gly Glu Val Tyr Thr Gly Glu Val Lys Asp Gly Ile Ala Thr 1045 1050 1055 Phe His Val His Thr Ser Ile Asn Lys Asp Ala Thr Thr Gly Val Tyr 1060 1065 1070 Arg Arg Ala Leu Leu Thr Gly Trp Thr Glu Val Asp Gly Pro Ser Phe 1075 1080 1085 Asn Asp Lys Gln Glu Thr Ser Arg Asp Gly Val Ser Ser Ser Asn His 1090 1095 1100 Leu Gly Val Phe Tyr Phe Ala Asp Ala Ala Asn Arg Pro Val Tyr Thr 1105 1110 1115 1120 Asp Arg Asn Ala Leu Gly Val Glu Ala Lys Asp Glu Ala Ala Lys Leu 1125 1130 1135 Asp Ser Phe Cys Pro Gly Ala Tyr Pro Gly His Ala Pro Ser Ala Leu 1140 1145 1150 Thr Thr Arg Thr Asp Pro Asn Pro Asp Ile His Phe Asp Tyr Met Asn 1155 1160 1165 Asp Asn Asp Thr Thr Arg Phe Gly Gln Asn Ala Val Thr His Gly Tyr 1170 1175 1180 Tyr Asp Pro Ser Thr Gln Lys Phe Thr Val Thr Gly Lys Val Asp Asp 1185 1190 1195 1200 Asn Val Val Ser Leu Thr Val Leu Gly Asp Asn Ser Asn Glu Asn Ala 1205 1210 1215 Pro Glu Asn Gln Val Lys Leu Gly Asn Asp Gly Lys Phe Ser Phe Thr 1220 1225 1230 Val Thr Ala Asn Arg Thr Gly Gln Arg Pro Ile Ala Tyr Ile Tyr Lys 1235 1240 1245 Ala Lys Asp Gly Gln Arg Val Arg Gly Thr Leu Asn Leu Ile Leu Asp 1250 1255 1260 Thr Val Ala Pro Ser Leu Glu Val Asn Gln Val Asn Gly Asp Glu Leu 1265 1270 1275 1280 Glu Leu Trp Thr Asn Asn Pro Lys Phe Thr Leu Ser Gly Lys Val Asn 1285 1290 1295 Asp Asn Leu Asp Gly Tyr Arg Leu Phe Val Asn Gly Asn Asn Ile Tyr 1300 1305 1310 Arg Glu Phe Leu Asn Ser Gly Tyr Asn Gln Val Ala Gly Leu Asn Thr 1315 1320 1325 Asp Thr Glu Phe Thr Asn Pro Tyr Gly Ala His Asp Phe Glu Glu Val 1330 1335 1340 Glu Asn Leu Asn Asp Asn Asn Asp Gln Pro Thr Thr His Val Phe Thr 1345 1350 1355 1360 Val Tyr Val Val Asp Gln Val Gly Asn Lys Val Glu Lys Lys Leu Thr 1365 1370 1375 Val His Phe Asp Pro Asn Tyr Val Ala Pro Glu Glu Val Pro Asn Thr 1380 1385 1390 Asp Thr Ser Tyr Thr Leu Glu Asn Pro Leu Ser Thr Thr Thr Val Glu 1395 1400 1405 Asn Pro Val Thr Asp Val Ser Thr Val Gln Pro Lys Gly Glu Thr Leu 1410 1415 1420 Thr Gly Lys Ser Phe Asn Leu Leu His Asp Ala Tyr Ile Tyr Asn Lys 1425 1430 1435 1440 Asp Gly Gln Val Val Leu Ser Thr Asp Thr Asn Lys Ser Ser Leu Leu 1445 1450 1455 Lys Lys Gly Gln Arg Ile Thr Ala Leu Asp Asn Gly Lys Thr Val Val 1460 1465 1470 Ile Asn Gly Val Gln Tyr Tyr Arg Val Gly Asp Asn Gln Phe Val Lys 1475 1480 1485 Val Thr Asn Thr Ile Leu Gln Ala Gly Lys Arg Leu Gln Leu Lys His 1490 1495 1500 Asn Ala His Leu Tyr Asp Lys Asn Gly Lys Val Val Lys Arg Asn Gly 1505 1510 1515 1520 Lys Pro Val Leu Leu Arg Lys Gly Arg Trp Ile Ser Ala Leu Asn Asn 1525 1530 1535 Ala Asp Lys Tyr Val Ile Asn Gly Lys Thr Phe Tyr Lys Leu Ala Asn 1540 1545 1550 Gly Glu Phe Val Lys Val Ala Asn Thr Lys Leu Gln Lys Pro Lys Ala 1555 1560 1565 Leu Lys Leu Thr His Asn Ala Phe Val Tyr Asp Glu Asn Gly Lys Arg 1570 1575 1580 Val Lys Lys Ser Lys Val Leu Lys Lys Gly Gln Thr Ile Leu Ala Glu 1585 1590 1595 1600 Asn Asn Ala Glu Lys Phe His Ile Lys Gly Lys Ala Tyr Tyr Lys Val 1605 1610 1615 Asn Gly His Phe Val Lys Val Ala Asn Thr Leu 1620 1625 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence <400> 9 cgatgataat cctagcgagc 20 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 10 tggcagaacc tgtgccta 18 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 11 gccaagacgc ctctggta 18 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 12 taggtatagt ttccatcagg a 21 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 13 aargtwccwt ayggyywyaa yta 23 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 14 gccatdswdg trccdswcat dtk 23 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 15 cgaaggcgat aagtcaaact ttgataatgc 30 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 16 cccggttctg taagataatt tggatcg 27 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 17 astcwrrytt ygatratgcw 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 18 bhkyamsawa rtttggatcr 20 <210> 19 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 19 ggtgttgctc ctgaagc 17 <210> 20 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 20 actctagcac cagctaattg aacatcatg 29

Claims (20)

  1. 심박수 감소 특성을 갖는 활성 성분을 포함하는 발효 식품을 얻기 위하여, 동물의 젖이나 식물성 단백질을 발효시키는 공정에 의해 얻어질 수 있는 조성물의, 포유동물에 있어서 심박수를 감소시키는 생성물의 제조를 위한 용도.
  2. 제1항에 있어서, 심박수 감소 특성을 갖는 펩타이드 또는 기타 활성 성분을 포함하는 발효 식품을 얻기 위하여, 동물의 젖이나 식물성 단백질을 발효시키는 공정에 의해 얻어질 수 있는 조성물의, 포유동물에 있어서 심박수를 감소시키는 생성물의 제조를 위한 용도.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 생성물이 식품 또는 사료 생성물인 용도.
  4. 전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 심박수 감소는 협심증, 고혈압, 동맥경화증, 심장발작, 심근경색증, 뇌경색증 및 혈관성형술 후의 재협착, 부정맥, 부정빈맥, 울혈성 심장기능상실증 (CHF), 대동맥판막 역류증, 만성 신장부전, 이상지혈증, 이상지단백질혈증과 같은 관상 동맥 질환 (CAD) 또는 관상 동맥 심질환 (CHD)의 치료 또는 경감을 위하여 행하여지는 것이 특징인 용도.
  5. 전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 치료가 심박수 변동을 감소시키는 것인 용도.
  6. 전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 다음의 공정을 포함하는 방법에 의해 수득가능한 심박수 감소 특성을 갖는 활성 성분들을 정제하거나 농축하는 방식으로 발효 식품을 추가로 처리하는 것이 특징인 용도.
    (i) 전술한 항 중 어느 하나의 항에 따른 심박수 감소 특성을 갖는 활성 성분들을 제조하기 위한 방법에 따라 발효 식품을 제조하는 공정,
    (ii) 심박수 감소 특성을 갖는 활성 성분들을 정제 또는 농축하는 방식으로 공정 (i)의 발효 식품을 추가로 처리하는 공정 및,
    (iii) 공정 (ii)의 생성물을 적절한 방식으로 포장하여 생성물을 얻는 공정.
  7. 제6항에 있어서, 공정 (ii)에 따른 농축은 원심분리 후 활성 성분을 함유하는 결과적인 상등액을 회수함으로써 수행되는 것인 용도.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 식품이 젖이고 생성물은 유장인 용도.
  9. 전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 유산균은 락토바실러스 (Lactobacillus)속, 락토코커스 (Lactococcus)속, 스트렙토코커스 (Streptococcus)속, 류코노스톡 (Leuconostoc)속, 비피도발테리움 (Bifidobacterium) 속 및 페디오코커스 (Pediococcus)속 중에서 선택된 유산균인 용도.
  10. 제9항에 있어서, 유산균은 락토바실러스 (Lactobacillus)속이고 특히 락토바실러스 헬베티쿠스 (Lactobacillus helveticus)인 용도.
  11. 전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 유산균은 세포벽 단백질분해효소 (prtH200이라 칭함)를 코딩하는 유전자 서열을 포함하며, 여기서 상기 유전자 서열은 다음과 같이 정의되는 것인 용도.
    prtH200은 세포벽 단백질분해효소 활성을 나타내는 효소를 코딩하는 DNA 서열로서, 상기 DNA 서열은 다음 중에서 선택된다:
    (a) SEQ ID NO 1의 위치 1-5550에 표시된 DNA 서열;
    (b) (a)에서 정의된 DNA 서열의 대응 단편과 적어도 50% 동일성을 갖는 75개 이상의 염기쌍 (bp) 단편을 포함하는 DNA 서열;
    (c) SEQ ID NO 2의 위치 1-1849에 표시된 폴리펩타이드 서열의 대응 단편과 적어도 30% 동일한 적어도 200개 아미노산 (aa)의 단편을 포함하고, 세포벽 단백질분해효소 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열;
    (d) SEQ ID NO 1의 1-5550 위치에 표시된 DNA 서열을 포함하는 이중가닥 DNA 프로브와 낮은 스트린젠시 (low stringency)로 하이브리다이즈된 DNA 서열; 및
    (e) (a), (b), (c) 또는 (d)에 특정된 DNA 서열의 단편인 DNA 서열.
  12. 전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 유산균이 수탁번호 DSM14998의 락토 바실러스 헬베티쿠스 (Lactobacillus helveticus) 세균 또는 그의 변이주인 용도.
  13. 적어도 1종의 유산균 균주를 이용하여 식품을 발효시킴으로써 생산된 활성 성분을 포함하고, 포유동물의 심박수를 감소시키는 특성을 갖는 발효 식품.
  14. 제13항에 있어서, 유산균은 락토바실러스 (Lactobacillus)속, 락토코커스 (Lactococcus)속, 스트렙토코커스 (Streptococcus)속, 류코노스톡 (Leuconostoc)속, 비피도발테리움 (Bifidobacterium) 속 및 페디오코커스 (Pediococcus)속 중에서 선택된 1종 이상의 유산균인 발효 식품.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 유산균 중 적어도 하나는 락토바실러스 헬베티쿠스 (Lactobacillus helveticus) 세균인 발효 식품.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 유산균 중 적어도 하나는 수탁번호 DSM14998의 락토바실러스 헬베티쿠스 (Lactobacillus helveticus) 세균 또는 그의 변이주인 발효 식품.
  17. 살아있거나 죽은 수탁번호 DSM14998의 락토바실러스 헬베티쿠스 (Lactobacillus helveticus) 세균 또는 그의 변이주를 포함하고, 포유동물의 심박수를 감소시키는 특성을 갖는 발효 식품.
  18. 전술한 항 중 어느 하나의 항에 따른 발효 식품으로부터 분리된 심박수를 감소시키는 성분.
  19. 협심증, 고혈압, 동맥경화증, 심장발작, 심근경색증, 뇌경색증 및 혈관성형술 후의 재협착, 부정맥, 부정빈맥, 울혈성 심장기능상실증 (CHF), 대동맥판막 역류증, 만성 신장부전, 이상지혈증, 이상지단백질혈증과 같은 관상 동맥 질환 (CAD) 또는 관상 동맥 심질환 (CHD)의 치료 또는 경감을 위한 약제를 제조하기 위한, 제13항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 따른 발효 식품의 용도.
  20. 협심증, 고혈압, 동맥경화증, 심장발작, 심근경색증, 뇌경색증 및 혈관성형술 후의 재협착, 부정맥, 부정빈맥, 울혈성 심장기능상실증 (CHF), 대동맥판막 역류증, 만성 신장부전, 이상지혈증, 이상지단백질혈증과 같은 관상 동맥 질환 (CAD) 또는 관상 동맥 심질환 (CHD)의 치료 또는 경감을 위한 약제를 제조하기 위한, 발효식품으로부터 분리된 심박수를 감소 시키는 활성 성분의 용도.
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