KR20020064895A - 항고혈압성 디펩타이드 및 트리펩타이드를 생산하는락토바실러스 헬베티쿠스 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규한 균주, 락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H, DSM 13137 및 이를 함유하는 박테리아 제제에 관한 것이다. 상기 신규한 균주 락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H는 단백질 가수분해 활성을 가지며 산화질소의 생산을 증진시킴으로써, 낙농 산업에 있어서 스타터 박테리아로서, 그리고 그 자체로 및 다양한 건강-증진 제품과 의약품에 있어서의 치료 물질로서 모두 유용하다.

Description

항고혈압성 디펩타이드 및 트리펩타이드를 생산하는 락토바실러스 헬베티쿠스{LACTOBACILLUS HELVETIUS PRODUCING ANTIHYPERTENSIVE DI- AND TRIPEPTIDES}
세균 분류학의 버지 매뉴얼(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, vol. 2 ed. by Sneath et al., Williams & Wilkins, Baltimore, London, Los Angeles, Sydney, 1984, Part 14, p. 1208)에는 "정규 비포자성 그람 양성 간균"이라는 제목 하에서 락토바실러스 헬베티쿠스 종의 특성 뿐 아니라 락토바실러스 속에 속하는 미생물의 특성과 분류가 기재되어 있다. 일반적으로, 락토바실러스 헬베티쿠스 균주는 발효된 유제품 및 치즈와 같은 낙농 제품으로부터 분리할 수 있으며, 통상적으로, 이들은 치즈, 특히 에멘탈 타입(Emmental type) 및 그리엘 타입(Gruyere type)의 치즈의 제조에 있어서, 스타터 미생물(sterter microbes)로서 사용된다.
락토바실러스 헬베티쿠스 균주의 생물학적 효능 또한 선행 기술 문헌에 기재되어 있다. 예컨대, 국제특허출원 공개공보 제99/16862호 (야마모토 등) 에는 트리펩타이드 Val-Pro-Pro 및/또는 Ile-Pro-Pro를 대량으로 생산할 수 있고 높은 세포외 단백질분해효소(protease) 활성을 갖는 락토바실러스 헬베티쿠스 CM4, FERM BP-6060 균주가 기재되어 있다. 상기 공개공보에는 상기한 트리펩타이드와 박테리아를 포함하는 발효된 유제품, 및 상기한 트리펩타이드 서열을 포함하는 산물을 상기한 박테리아로 발효시킴으로써 상기 유제품을 제조하는 방법이 또한 기재되어 있다.
미국특허 제5,449,661호(나카무라 등)에는 상기한 트리펩타이드 서열 Val-Pro-Pro를 포함하는 펩타이드의 제조 및 혈압 강하를 위한 그의 용도를 기재하고 있다. 상기 펩타이드는 무지방(fat-free) 우유를 락토바실러스 헬베티쿠스 JCM 1004 균주로 발효시킴으로써 제조된 후, 크로마토그래상에서 정제되고 동결 건조된다.
야마모토 등에는 락토바실러스 헬베티쿠스 CP790 미생물(J. Biochem., 1993, 114:740)로부터 기원한 단백질 가수분해효소(proteinase)의 정제 및 특성이 또한 기재되어 있다. 게다가, 야마모토 등에는 상기한 단백질 가수분해효소를 사용하여 αS1-카제인 및 β-카제인을 가수분해하여 얻어진 펩타이드의 ACE(J Dairy Sci, 1994, 77:917)에 대한 효과 조사에 대한 연구가 또한 기재되어 있다. 상기 조사된 펩타이드는 총 25개 였으며, 이들의 분자 크기 및 효과는 매우 상이하였다. 가장 효과적인 펩타이드는 β-카제인으로부터 얻어지고, 각각 8, 18 및 27개의 아미노산을 포함하는 3 개의 펩타이드였다. 또한, 락토바실러스 헬베티쿠스 CP790 및 단백질 가수분해효소 활성이 결핍된 변이체 CP791로 발효된 우유의 ACE-활성을 비교하는 연구를 하였으며, 그 결과, 전자는 자발적 고혈압 SHR 래트에 효과적이지만 정상적인 래트에는 효과를 나타내지 않는 반면, 후자는 전혀 활성을 나타내지 않았다.
유산균 및 락토바실러스 헬베티쿠스 종 또한 폭넓게 연구되어 왔으며, 통상적인 스타터 및 건강 증진 물질로서의 사용이 제안되어 왔음에도 불구하고, 천연물 뿐 아니라 낙농 및 다른 식품 산업에 있어서, 또한 제약 산업에 있어서, 스타터 및 생균제(probiotics)로서 유용한 새롭고 효과적인 미생물을 발견하고자 지속적인 연구가 관련 분야에서 계속 진행되고 있다.
본 발명은 새로운 미생물과 그의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helvelticus)의 새로운 균주, 그의 생리학상 특성 및 식품 산업과 제약 산업 등에 있어서의 그의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 우수한 단백질 가수분해 특성 및 생리학적 특성을 가지며, 이로 인하여, 스타터 및 건강-증진 물질로서의 용도에 모두 적합한 신규한 락토바실러스 헬베티쿠스 균주를 제공하는 것이다.
본 발명에 따르면, 이용자들에게 그 자체로 사용되거나 또는 식용 제품, 기능성 제품 또는 의약품의 제조에 사용될 수 있는 균주를 제공한다.
따라서, 본 발명은 락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H, DSM 13137에 관한 것이다.
본 발명은 또한 락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H, DSM 13137 균주를 포함하는 박테리아 제제에 관한 것이다.
본 발명은 또한 식품 산업 또는 제약 산업에 있어서의 락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H, DSM 13137 균주의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기의 균주를 포함하거나 상기의 균주를 이용하여 제조되는, 식료품 및 의약품과 같은 식용 제품에 관한 것이다.
본 발명은 치료 물질로서의 사용을 위한 락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H, DSM 13137 균주에 관한 것이다.
본 발명은 고혈압의 치료에 사용되는 락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H, DSM 13137 균주에 관한 것이다.
본 발명은 또한 항고혈압성 물질의 제조를 위한 락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H, DSM 13137 균주의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H, DSM 13137 균주를 사용하는 항고혈압성 물질의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 1999년 11월 3일자로 독일 미생물 및 배양세포 기탁회사(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ)에 기탁번호 DSM 13137로 기탁된 신규한 락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H 균주를 기초로 하고 있으며, 이 균주는 다음의 특성을 갖는다:
락토바실러스 헬베티쿠스 계통은 그람-양성이고 간상의 길쭉한 세포이다. 성장 온도 범위는 약 35 내지 45℃ 이며, 최적 온도는 약 37 내지 42℃이다.
락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H는 37 내지 42℃ 온도의 우유에서 잘 자라며, 2.5 내지 2.9%의 락트산(DL)을 생산한다. 성장의 최적 pH는 약 4.5 내지 7이다. pH 조정 없이 배양하는 경우, 우유 내의 pH는 3.3 내지 3.6 범위에서 감소한다.
또한, 상기 균주는 락토바실러스를 위하여 일반적으로 사용되는 배지에서도 잘 자라며, 탄소원으로서 시트르산염을 또한 사용할 수 있다.
락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H는 탄수화물을 다음과 같이 발효시킨다:
탄수화물 락토바실러스 헬베티쿠스
LBK-16 H
글리세롤 -
에리트리톨(Erythritol) -
D-아라비노오스 -
L-아라비노오스 -
리보오스 -
D-크실로오스 -
L-크실로오스 -
아도니톨 -
β-메틸크실로사이드 -
갈락토오스 +
D-글루코오스 +
D-프룩토오스 +
D-만노오스 +
L-소르보오스 -
람노오스 -
덜시톨(Dulcitol) -
이노시톨 -
만니톨 -
소르비톨 -
α-메틸-D-만노사이드 -
α-메틸-D-글루코사이드 -
N-아세틸-글루코사민 +
에스쿨린(Esculin) -
셀로비오스 -
말토오스 -
락토오스 +
사카로오스 -
트레할로오스 -
이눌린 -
멜레지토오스 -
D-라피노오스 -
글리코겐 -
크실리톨 -
락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H는 단백질 가수분해 활성을 갖는다. 하기하는 실시예에서 설명되고 o-프탈디알데하이드의 단백질 가수분해성에 기초하는OPA 방법에 따라서 측정하면, 상기 균주의 단백질 가수분해 활성은 0.3 내지 0.6 오더이다. 단백질 가수분해 활성은 스타터로서의 용도 및 생물학적 활성 물질의 제조에 모두 이용될 수 있다.
락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H는 낮은 pH 값에서 매우 잘 견딜 수 있다. 이는 보존성 및 생리학적 활성의 관점 모두에 있어서 중요한 특성이다. 실시예에서 설명되는 바와 같이, 상기 균주는 pH 4 및 심지어는 pH 3 에서도 4 시간동안 매우 잘 견디며, 특히 유제품에 있어서의 상기 균주의 보존성은 매우 우수하여, pH 2와 같이 낮은 pH에서 4 시간까지 견딜 수 있다. 상기 결과를 기초로 볼 때, 상기 균주는 위를 지나서 소화관 내에서 생존하고 결장에 살아있는 채로 남아있을 것이라고 예측할 수 있다.
락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H는 또한 담즙에 대한 우수한 내성을 나타내며, 0.5% 까지의 농도의 담즙에서 견딜 수 있다. 이러한 결과는 또한 상기 균주가 위와 소장을 거쳐서 소화관 내에서 생존하고 결장에 살아있는 채로 남아있다는 것을 보여준다.
락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H는 또한 산화질소(nitric oxide)를 생산하는 능력을 가진다고 확인되었다. 산화질소의 생산은 산화질소 신테타아제(synthetase)의 활성화에 의하여 제공되는 산화질소의 생성으로서 연구되었다. J774 대식 세포 세포주에 있어서, 상기 균주는 0.4 μM의 NO를 생산하고, T84 인간 장세포 세포주에서는 약 2 내지 6 μM의 NO를 생산한다. 이러한 특성은 매우 중요하다: 적절한 정도의 NO 생산의 활성화는 예컨대 염증반응 및 혈압 조절에 있어서 유리하다.
락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H는 또한 생활성 펩타이드를 생산하는 능력을 갖는다고 확인되었다. 핀랜드 특허 출원 제992360호에는 항고혈압성 펩타이드를 함유하는 매우 보존적인 산물을 2-단계 공정으로 제조하는 방법에 대하여 개시되어 있으며, 그 중 첫 번째 공정에 있어서, 락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H 단독으로 또는 상기 균주와 다른 유산균 균주와의 혼합으로, 예컨대 다양한 유제품을 발효시킴으로써, 상기한 생물학적 활성 펩타이드를 제조한다. 상기 공개된 출원의 실시예에 따르면, 락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H는 공지된 항고혈압성 트리펩타이드 VPP(Val-Pro-Pro) 및 IPP(Ile-Pro-Pro)을 각각 13 내지 15 mg/l 및 6 내지 8 mg/l 생산하였다. 상기 공개된 출원은 상이한 펩타이드의 혼합물이 발효반응에서 형성된다는 것을 보여준다. 발효가 충분히 지속되었을 때, 비교적 작은 디펩타이드 및 트리펩타이드를 얻었다.
상기한 특성을 기초로 할 때, 락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H를 생균활성(probiotic) 미생물로 생각할 수 있다.
락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H는, 예컨대 발효 유제품 및 치즈의 생산과 같은 낙농 산업에 있어서 통상적인 스타터 등으로서 유용하다. 치즈의 생산, 특히 에멘탈 치즈의 생산에 있어서의 사용을 바람직한 구체예로서 고려할 수 있다.
락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H는 또한 생활성 펩타이드를 함유하는 발효 유제품, 특히 발효 우유(sour milk) 및 요구르트와 같은 특수 제품의 생산에 매우 유용할 수 있다.
락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H는 또한 식용 물질의 제조 등에 있어서의 기능성 물질로서, 또는 식용 물질 내의 성분 또는 첨가제로서 사용 가능하다.
락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H는 박테리아를 통상적인 방법을 이용하여, 락토바실러스에 일반적으로 사용되는, 예컨대 MRS 또는 로고사(Rogosa)와 같은 배지, 생유(raw milk), 재생유(reconstituted milk), 분유 또는 초음파로 처리된 우유와 같은 우유, 또는 MRS 육즙 등에서 배양함으로써 생산한다. 적절한 배양 조건 및 온도, pH 및 통기(aeration)와 같은 변수의 선택은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 것이다. 예컨대, 온도를 30 내지 45℃로 할 수 있다. pH의 조정이 필요할 것이다.
락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H는 단독으로 배양되어 순수 배양균을 형성할 수 있다. 또한, 상기 균주를 관련분야에서 공지된 다른 발아 미생물과 함께 혼합 배양균으로 배양시킬 수도 있다. 원하는 경우, 상이한 유형의 미생물을 별도로 배양한 후, 상기 상이한 미생물을 원하는 비율로 조합하여 혼합 배양균을 제공하는 것도 가능하다. 최종 생성물이 가능한 한의 특성의 가지게 하고 오염의 위험을 제거하도록 하기에 적절하도록 미생물 조합을 선택한다.
배양 후, 세포 현탁액을 수거하고, 그 자체로 사용하거나 예컨대 농축, 건조 또는 동결 건조 등의 원하는 방법으로 처리한다.
물론, 락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H를 순수 배양균 또는 혼합 배양균으로서, 개별적으로 또는 예컨대 통상적으로 사용되고 상업적으로 입수 가능한 스타터 또는 생균제와 함께 사용할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 바람직한 제제로서 동결 건조되고 적절한 보조제 내에 락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H, DSM 13137을 함유하는 박테리아 제제를 고려할 수 있다.
본 발명의 박테리아 제제는 상기한 박테리아를 그 자체로 또는 다른 미생물과 같이 다른 구성 성분과 조합하여 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 균주를 식용 제품, 특히 (기능성) 식품, 천연물 또는 의약품의 제조에 또한 사용할 수 있다.
본 발명의 식용 제품은 락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H, DSM 13137, 또는 이를 포함하는 박테리아 생성물, 및 (최종) 생성물의 통상적인 성분들을 사용하여 제조한다. 상기 박테리아를 제조 과정 중의 식품 또는 다른 생성물 또는 완성된 제품에 첨가할 수 있다. 비 박테리아 세포와 같은 생성물의 제조와 관련하여 박테리아를 사용하는 것 또한 가능하지만, 향료 및 방향 물질 또는 생물학적 활성을 갖는 물질 등과 같이 박테리아 성장 동안 생산되는 산물만이 최종 생성물에 잔류한다.
본 명세서에 있어서, 식품이라는 단어는 고체, 겔, 또는 액체 형태의 모든 식용 가능한 제품을 포함하며, 인스턴트 제품 및 본 발명의 생성물이 첨가물로서 또는 제품의 구성 성분으로서, 소비와 관련하여 첨가된 제품 모두를 포함하는 광범위한 의미로 사용된다. 예컨대, 상기 식품은 낙농 산업, 육 가공 산업, 식품 가공 산업, 음료 산업, 제빵 산업 및 제과 산업의 제품일 수 있다. 전형적인 제품은 무지방 우유, 다양한 지방을 그 자체로 또는 해당하는 분유의 형태로 함유하는 우유 및 발효 우유, 버터밀크, 응유 치즈(curd cheese), 요구르트, 응유(curded milk),미발효 치즈 및 발효 치즈, 스낵 속(snack fillings) 등과 같은 발효 유제품을 포함한다. 유장(whey) 음료, 과일 음료 및 맥주와 같은 음료들도 또 다른 중요한 그룹을 구성한다.
본 발명과 관련하여, 제약 산업의 제품은 다양한 약학적 제제는 물론이고, 건강-증진 천연물 등을 또한 포함한다. 제제의 전형적 형태는 예컨대 캡슐, 환약 및 용액이다.
본 발명에 있어서, 원하는 효과를 제공하기에 충분한 양으로 락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H, DSM 13137을 사용한다. 따라서, 사용되는 양은 적용과 효과에 따라서 넓은 범위 내에서 다양한 값을 가질 것이다.
이하, 실시예를 통하여 보다 상세히 본 발명을 설명할 것이다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니다.
실시예 1
락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H 균주의 배양
원 균주(stock strain)를 1%의 접종물로써 우유 육즙 또는 MRS 육즙에 두 번 접종하여 락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H, DSM 13137를 37℃의 온도에서 20 내지 24 시간동안 배양하였다. 균주를 20 내지 48 시간 동안 성장시킴으로써(pH 조절을 하거나 또는 하지 아니하고) MRS-기재 또는 우유-기재 육즙에서 배양온도 53℃ 내지 42℃ 하에서 실제적인(생산적인) 배양을 수행하였다.
상기 세포를 배양균으로부터 그 자체로 수거하거나 또는 공지된 기술을 사용하여 상기 세포를 농축시키고 세포 농축액으로 사용하거나, 또는 농축 후 이들을 동결 건조시켜 분말상의 제품을 제조할 수도 있다.
실시예 2
락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H 균주의 단백질 가수분해 활성
OPA 방법(Church, F.C., Swaisgood, H.E., Poeter, D.H., Catigna, G.L., 1983, o-프탈디알데하이드를 사용하는 우유에서 단백질 가수분해의 측정을 위한 스펙트로포토미터 에세이,J Dairy Sci66:1219-1227)을 이용하여 우유로부터 락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H의 단백질 가수분해 활성을 측정하였다.
상기의 방법을 수행하기 위하여, 박테리아 세포를 10 ml 튜브 내 MRS 육즙에서 배양시킨 후, 0.9% NaCl을 사용하여 상기 현탁액을 세척하고 10 ml로 현탁시킨다. 상기 박테리아 세포를 1% 접종물로써 22도 우유 10 ml에 접종하였다. 박테리아접종물이 없는 상응하는 우유 샘플을 대조군으로 사용하였다.
샘플 25 ml, 물 0.5 ml 및 0.75N 트리클로로 아세트산(TCA) 0.5 ml를 볼텍스 장치에서 완전히 혼합하고, 10 분동안 정치시킨 후, 와트만 #2 여과지를 통하여 여과시켰다. 샘플 150 ㎕ 를 TCA 여과액으로부터 취하였고 일회용 큐벳에서 OPA 시약 3 ml와 혼합하였다. 상기 혼합물을 실온에서 2분 동안 인큐베이팅시킨 후, 340 nm 파장에서 스펙트로포토미터를 이용하여 측정하였다. 측정된 값에서 대조값을 공제하였으며, 이에 따르면 락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H의 단백질 가수분해 활성이 0.3 에서 0.6이 되었다.
OPA 시약:
100 mmol 나트륨 메타보레이트 25 ml
20%(w/w) SDS 2.5 ml
1 ml의 메탄올에 용해된 OPA(o-phthaldialdehyde) 40 mg
β-메르캅토에탄올 100 ㎕
상기 물질을 혼합하고 최종 부피가 50 ml가 되도록 물에 용해시켰다. 상기 시약을 어두운 곳에서 하루동안 저장하였다.
실시예 3
락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H의 pH 내성
LBK-16 H를 테스트 전에 MRS 육즙에서 17 내지 18 시간 동안 2 배 배양하였다. 그리고 나서, 상기 균주를 테스트 동안 MRS 육즙 또는 우유 육즙에서 배양하였다. pH 테스트에 있어서, 테스트 육즙(MRS)의 pH를 pH 6.5, pH 4 및 pH 2로 조정(락트산으로)하였다. 이들 육즙을 개시 농도 107cfu/ml로 하여 MRS 또는 우유 육즙 배양균으로 접종시키고, 37 ℃에서 3 및 4 시간 동안 배양시킨 후, 배양균으로부터 LBK-16 H 균주의 농도를 측정하였다(MRS 아가 상에서의 락토바실러스의 측정방법을 사용). 그 결과를 표 1에 나타내었다.
LBK-16 H 균주의 pH 내성
3 시간 4 시간
개시 농도 pH 6.5 pH 4 pH 3 pH 6.5 pH 4 pH 3 pH 2
MRS 4 ×107 6 ×107 3 ×107 5 ×107 6 ×107 3 ×107 3 ×107 < 100
우유 5 ×107 5 ×107 3 ×107 6 ×107 5 ×107 4 ×107 7 ×107 1 ×104
따라서, 상기 균주는 pH 4 정도 및 심지어는 pH 3 정도에서 4 시간동안 매우 양호한 내성을 나타낸다. 상기 균주의 pH 2 정도의 낮은 pH 수준에서의 4 시간 동안의 보존력은 수용성 제품 내에서 섭취되었을 때 보다 유제품 내에서 섭취되었을 때 더욱 우수하였다.
실시예 4
락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H 균주의 담즙 내성
LBK-16 H를 실시예 3과 같이 배양하였다. 담즙산, 소의 담즙(Bile Bovine; Sigma B-3883)을 0.3% 및 0.5% 첨가한 MRS 육즙에서 테스트를 수행하였다. MRS- 또는 우유-기재의 배양균으로부터 얻은 1%의 신선한 배양균을 담즙-함유 육즙에 첨가하였으며, 개시 농도는 2~5 ×106cfu/ml였다. 상기 균주를 육즙에서 3 시간 동안 배양한 후, MRS 아가 상에서 세포 농도를 측정하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.
LBK-16 H의 담즙 내성
담즙 농도
성장배지 0 0.3 % 0.5 %
MRS 2 ×106 2 ×106 4 ×106
우유 5 ×106 6 ×106 5 ×106
상기 표에 나타난 바와 같이, LBK-16 H는 0.5% 까지의 담즙 농도에 내성이 있다.
실시예 5
락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H 균주에 의한 산화질소의 생산
Korhonen 등(J774 대식세포 및 T84 결장 상피 세포에서의 생균활성 락토바실러스 GG에 의한 산화질소 합성의 유도, Korhonen, R., Korpela, R., Saxelin, M., Maki, M., Kankaanranta, H. 및 Moilanen, E., 제출)에 개시된 방법을 사용하여 락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H 균주에 의한 질산의 생산을 연구하였다. 이 방법은 유도성 산화질소 신테타아제(inducible nitric oxide synthetase, iNOS)의 유도 및 산화질소(NO)의 최종 산물에 기초한다. 테스트에 상이한 두 개의 세포주를 사용하였다: J774 쥐 대식세포 세포주 및 T 84 인간 장세포 세포주. 박테리아 세포는 단독으로 NO를 생산하지 않기 때문에, γ-인터페론의 존재하에서 락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H 세포를 사용하여 J774 세포주에서의 유도를 수행하였다. 상기 세포주와 박테리아 균주와의 세포 비율은 1:10 이었다.
iNOS 효소의 발현을 리포폴리사카라이드(LPS) 및 리포테이코산(LA)을 기준으로 사용하여 웨스턴 블러트 기술에 의하여 측정하였다.
산화질소(NO)의 생산을 24 시간 인큐베이팅 후 성장 배지에서의 산화질소 대사산물 아질산염의 양으로 측정하였다. 아질산염의 양은 그리스 반응(Griess reaction, Green 등, 1988, Analytical Biochemistry, vol. 126, pp. 131 내지 138)으로 측정하였다.
락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H는 쥐 대식세포 세포주에서는 0.4 μM의 산화질소를 생산하였고, 인간 상피(epitheal) 세포주에서는 5 내지 6 μM의 산화질소를 생산할 수 있었다. 비교를 위하여, 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) LC 705, DSM 7061은 T84 세포에서 단지 0.7 μM의 산화질소를 생산하였다.
실시예 6
락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H에 의한 생활성 펩타이드의 생산
락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H 균주를 37℃에서 24시간 동안 MRS 육즙에서 배양하고, 재생유(10%)에 접종물의 생성을 위하여 접종하였다. 두 배양 주기(cultivation round) 후, 접종물(15%)을 9 내지 10 %의 무지방유 분유로 구성되고 110℃에서 10분 동안 살균 처리된 발효조 배지에 접종하였다. 37℃에서 22 내지 24 시간 동안 내내 격렬하게 혼합하면서 발효를 수행하였다.
비교 실험의 수행을 위하여, 몇 가지 균주의 혼합물, 즉 락토바실러스 헬베티쿠스 LB161, 락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H 및 락토바실러스 헬베티쿠스 LB230 균주의 혼합물(a), 락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H 및 락토바실러스 람노서스 LC705, DSM 7061 균주의 혼합물(b), 및 락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H 및스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) T101, DSM 4022 균주의 혼합물(c)를 사용하여 발효를 반복하였다.
100℃에서 15분 동안 살균된 9% 우유를 성장 배지로 사용하였다. 접종물의 생성을 위하여, 락토바실러스 헬베티쿠스 균주 및 락토바실러스 람노서스 LC705 균주를 37℃에서 24 시간동안 MRS 육즙 배지에서 배양하였고, 그리고 나서, 이것으로부터 1%의 접종물을 우유로 전달시켰다. 스트렙토코커스 써모필러스 T101을 37℃에서 18시간 동안 LM17 육즙에서 배양시키고, 이것으로부터 접종물을 우유로 전달시켰다.
37℃에서 24 시간동안 인큐베이팅하여 우유에서 모든 균주를 각각 개별적으로 배양함으로써 첫 번째 배양을 수행하였다. 두 번째 배양을 위하여, 각 혼합물의 균주 1%를 우유로 피펫팅한 후, 37℃에서 24시간 동안 공동-배양을 계속하였다. 세 번째 배양을 위하여, 상기 얻어진 공동-배양물의 5 내지 10 %를 우유로 피펫팅하고, 37℃에서 24 시간 동안 인큐베이팅하였다.
락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H 균주 및 다른 미생물 혼합물에 의하여 생산되는 VPP 및 IPP의 양을 표 3에 나타내었다. 본 발명의 락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H는 다량의 생활성 펩타이드를 생성할 수 있다. 상이한 혼합물의 다른 미생물은 생활성 펩타이드를 생산하지 않았으며 LBK-16 H의 활성을 저해하지도 않았다. 상기 혼합물들 사잉에서 또는 LBK-16 H 균주와 관련하여 단독으로 차이점이 발견되지 않았다.
LBK-16 H 균주 및 상이한 미생물 혼합물에 의하여 생산되는 IPP 및 VPP의 양
미생물(혼합물) VPP, mg/l IPP, mg/l
L161 + LBK-16H + LB230, 5% 13-14 6-7
L161 + LBK-16H + LB230, 10% 13-14 6-7
LBK 16H + LC705, 5% 13-14 6-7
LBK 16H + LC705, 10% 13-14 6-7
LBK 16H + Str.T101, 10% 13-15 6-8
LBK 16H (단독) 13-15 6-8
본 발명은 신규한 균주, 락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H, DSM 13137 및 이를 함유하는 박테리아 제제에 관한 것이다. 상기 신규한 균주 락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H는 단백질 가수분해 활성을 가지며 산화질소의 생산을 증진시킴으로써, 낙농 산업에 있어서 스타터 박테리아로서, 그리고 그 자체로 및 다양한 건강-증진 제품과 의약품에 있어서의 치료 물질로서 모두 유용하다.

Claims (14)

  1. 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) LBK-16 H, DSM 13137.
  2. 락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H, DSM 13137 균주를 함유하는 박테리아 제제.
  3. 제 2 항에 있어서, 다른 미생물들을 추가적으로 함유하는 것이 특징인 박테리아 제제
  4. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 동결 건조된 분말 또는 캡슐의 형태인 것이 특징인 박테리아 제제.
  5. 식품 산업에 있어서의 락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H, DSM 13137 균주의 용도.
  6. 제 5 항에 있어서, 낙농 산업 또는 음료 산업의 제품을 생산하는 것이 특징인 용도.
  7. 제 1 항에 따른 박테리아 또는 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른박테리아 제제 또는 이들을 사용하여 제조되는 것을 포함하는 것이 특징인 식용 제품.
  8. 제 7 항에 있어서, 유제품인 것이 특징인 식용 제품.
  9. 제 7 항에 있어서, 음료, 바람직하게는 유장(whey) 음료, 과일 음료 또는 맥주인 것이 특징인 식용 제품.
  10. 치료 물질로서의 용도를 위한 락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H, DSM 13137 균주.
  11. 고혈압 치료에 있어서의 용도를 위한 락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H, DSM 13137 균주.
  12. 항고혈압성 제품의 제조에 있어서의 용도를 위한 락토바실러스 헬베티쿠스 LBK-16 H, DSM 13137 균주.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 항고혈압성 제품이 항고혈압성 디펩타이드 및 트리펩타이드를 함유하는 것을 특징으로 하는 용도.
  14. 제 12 항에 있어서, 트리펩타이드, 특히 Ile-Pro-Pro 및/또는 Val-Pro-Pro를 고농도로 함유하는 것이 특징인 제품.
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