PL241893B1 - Sposób przeprowadzenia selekcji mikroorganizmów proteolitycznych, sposób wytwarzania hydrolizatu białek serwatkowych, zawierającego bioaktywne peptydy i hydrolizat białek serwatkowych - Google Patents

Abstract

Sposób przeprowadzenia selekcji mikroorganizmów proteolitycznych polegający na: (1) wyizolowaniu ze środowiska naturalnego szczepów zdolnych do biosyntezy enzymów proteolitycznych i wybranie szczepów o największych aktywnościach katalitycznych, (2) ustaleniu chemoselektywności białek enzymów proteolitycznych wybranego szczepu poprzez określenie miejsca, w którym enzymy tego szczepu przecinają łańcuchy polipeptydowe białek, (3) przeprowadzeniu badań in silico, wykorzystując dostępne bazy danych, w celu określenie ilości i rodzaju uwalnianych peptydów w reakcji proteolizy białek danego surowca pod wpływem enzymów wybranego mikroorganizmu, (4) porównaniu jakości i ilości uwalnianych peptydów przy proteolizie prowadzonej w układzie sekwencyjnym „enzymy badanego mikroorganizmu›pepsyna›trypsyna i ewentualnie chymotrypsyna”, wobec układu opartego na samych naturalnych enzymach trawiennych „pepsyna›trypsyna i ewentualnie chymotrypsyna”, w celu wykrycia, czy użycie enzymów drobnoustrojowych daje dodatkowe bioaktywne peptydy, co z punktu żywieniowego mogłoby być uznane jako wartość dodana, (5) wyborze szczepu produkcyjnego, przeznaczonego do produkcji bioaktywnych peptydów w warunkach technicznych. Ponadto przedmiotem zgłoszenia jest też sposób wytwarzania hydrolizatów białek serwatkowych zawierających bioaktywne peptydy, oraz hydrolizat białek serwatkowych, otrzymany powyższym sposobem, zawierający peptydy inhibujące konwertazę angiotensyny i obniżające ciśnienie krwi, i peptydy o aktywności przeciwdrobnoustrojowej.

Description

Opis wynalazku

Wynalazek ujawnia sposób wytwarzania hydrolizatu białek serwatkowych, zawierającego bioaktywne peptydy (BP) oraz sposób selekcji drobnoustrojów zdolnych do biosyntezy enzymów niezbędnych do hydrolizy tych białek. Uzyskane bioaktywne peptydy wykazują zdolność do inhibicji enzymu konwertazy angiotensyny i tym samym obniżania ciśnienia krwi u człowieka, właściwości antybakteryjne w stosunku do wybranych bakterii chorobotwórczych i peptydy o aktywności antyoksydacyjnej. Sposób wytwarzania hydrolizatu zawierającego BP z białek serwatkowych obejmuje: selekcję szczepów bakterii mlekowych zdolnych do biosyntezy enzymów proteolitycznych w kierunku wytworzenia BP o projektowanych aktywnościach biologicznych, biosyntezę enzymów proteolitycznych przez wyselekcjonowany szczep bakteryjny oraz hydrolizę enzymatyczną białek serwatkowych z użyciem enzymów wytworzonych przez stosowany szczep bakteryjny. Zgodnie ze sposobem wytwarzania hydrolizatu białek serwatkowych według wynalazku hydrolizat białek serwatkowych o określonej aktywności prozdrowotnej jest przeznaczony do stosowania w profilaktyce chorób cywilizacyjnych oraz do celów paszowych. Wynalazek odnosi się do obszaru biotechnologii żywności, a szczególnie produkcji fermentowanej żywności funkcjonalnej oraz wysokobiałkowych dodatków paszowych.

Pogarszające się warunki środowiskowe i intensywny tryb życia wywołują u ludzi szereg chorób cywilizacyjnych. Wiele z nich wymaga leczenia farmakologicznego, co często pociąga za sobą skutki uboczne. Aktualnie zwraca się coraz większą uwagę na metody alternatywne do metod farmakologicznych, a szczególnie na bioaktywne składniki żywności, które z dużym skutkiem mogą zapobiegać tego typu chorobom. Wśród najczęściej występujących zaburzeń zdrowotnych wymienia się zwiększone ciśnienie krwi, choroby nowotworowe, choroby układu sercowo-naczyniowego, cukrzycę, zaburzenia jelitowe o podłożu mikrobiologicznym i szereg innych. Wiele chorób jest wywołanych destrukcyjnym działaniem wolnych rodników tlenowych i azotowych w organizmie.

W ostatnich latach można obserwować intensywny rozwój badań nad prozdrowotnym działaniem naturalnych przeciwutleniaczy, szczególnie polifenolowych. Znacznie później zainteresowano się prozdrowotnym potencjałem peptydów i białek. Badania prowadzone w ostatnich dwóch dekadach wykazały, że wiele niskocząsteczkowych peptydów wywiera istotny wpływ na fizjologię człowieka i ma działanie prozdrowotne. Peptydy stanowią odcinki łańcuchów białkowych, i jako ich fragmenty mogą z nich być uwolnione w wyniku proteolizy. W publikacjach przeglądowych z ostatnich lat podsumowano wiedzę na ten temat i przedstawiono wyniki badań potwierdzające przeciwdrobnoustrojowe, przeciwnadciśnieniowe, przeciwzakrzepowe, opioidowe, immunomodulacyjne i przeciwutleniające właściwości wybranych peptydów (Sanchez i Vazques 2017, Sharma i in. 2011, Dziuba i Dziuba 2014, Shori i Baba 2015).

Do najważniejszych aktywności peptydów należy ich działanie przeciwnadciśnieniowe. Polega ono na hamowaniu aktywności enzymu konwertazy (ACE), przekształcającej angiotensynę I w angiotensynę II. Ta ostatnia powoduje zwężanie światła naczyń krwionośnych i w konsekwencji wzrost ciśnienia krwi. Hamowanie ACE przez peptydy może być wykorzystane w prewencji i leczeniu nadciśnienia. Wykazano, że peptydy o takim działaniu mogą być uwalniane z wielu białek w procesie proteolizy.

Szeroko zakrojone badania wykazały też, że niektóre peptydy hamują wzrost mikroorganizmów, stając się czynnikiem, który można wykorzystać w kontroli populacji mikroorganizmów chorobotwórczych. Część tych peptydów określanych jest terminem bakteriocyn. Znajdują one szerokie zastosowanie w ochronie produktów spożywczych, pasz, w medycynie, a także kosmetologii.

Szereg niskocząsteczkowych peptydów wykazuje także silny potencjał przeciwutleniający. Jest to cecha szczególnie atrakcyjna w aplikacjach żywnościowych, jako czynnik ochronny przed licznymi chorobami cywilizacyjnymi.

Wymienione właściwości fizjologiczne peptydów powodują, że rośnie zainteresowanie ich wykorzystaniem w ochronie zdrowia człowieka i stają się one ważnym bioaktywnym składnikiem żywności funkcjonalnej i nutraceutyków.

Największym źródłem BP jest mleko krowie i produkty mleczne, ale także mięso, żelatyna, jaja, wiele gatunków ryb oraz białka roślinne z pszenicy, kukurydzy, soi, ryżu, grzybów i innych roślin. Produkcja BP odbywa się trzema metodami: przez enzymatyczną hydrolizę białek, przez mikrobiologiczną fermentację lub na drodze syntezy chemicznej (Korhonen i Pihlanto 2006). Wiadomo także, że do uwolnienia bioaktywnych peptydów z białek mogą się przyczynić drastyczne warunki obróbki surowców żywnościowych (wysoka temperatura, wysokie ciśnienie, kwasy, alkalia), jednak takie procesy trudno precyzyjnie kontrolować.

PL 241 893 B1

Wiele BP powstaje w przewodzie pokarmowym z diety bogatej w białka pod wpływem działania enzymów trawiennych (pepsyny, trypsyny, elastazy i innych), jednak nie są to procesy przebiegające w warunkach technicznych.

Jedną z najbardziej atrakcyjnych metod produkcji (BP) jest proces fermentacji. Jego główną zaletą jest jego naturalność i fakt, że przebiega on przy udziale bezpiecznych, powszechnie akceptowanych drobnoustrojów z grupy bakterii fermentacji mlekowej. Nie wymaga on dodatku enzymów komercyjnych i przebiega w warunkach naturalnych, zbliżonych do warunków trawienia białek w przewodzie pokarmowym. Dla producentów żywności proces ten ma tę dodatkową zaletę, że nie wymaga deklarowania na etykiecie gotowego produktu żadnych dodatkowych substancji, zwykle słabo akceptowanych przez konsumentów.

Na podstawie przeglądu literatury naukowej można stwierdzić, że do procesu obróbki proteolitycznej białek spożywczych wykorzystuje się szczepy bakterii i drożdży z gatunków Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbruesckii subsp. cremoris, Lactobacillus GG, Lactobacillus delbruecki subsp. bulgaricus, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus jenseni, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis, Saccharomyces cerevisiae (Korhonen i Pihlanto 2006, Beltran-Barrientos i in. 2016).

Virtanen i in. (2007) wykazali, że użycie bakterii Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris, Lactobacillus jensenii ATCC 25258 i Lb. acidophilus ATCC 4356 do fermentacji mleka powoduje hydrolizę białek do peptydów o wysokiej aktywności przeciwutleniającej. Autorzy stwierdzili, że największą aktywność miały peptydy przechodzące do serwatki o masie 4-20 kDa. Wśród nich większość miała hydrofobowy charakter.

Japońscy badacze Baria i in. (2016) badali aktywność biologiczną peptydów produkowanych przez bakterie wyizolowane z tradycyjnych fermentowanych produktów wytwarza nych w prefekturze Ishikawa w Japonii. Wyizolowali oni 53 szczepy bakterii fermentacji mlekowej, które poddali szczegółowym studiom. Spośród nich 10 wykazało zdolność do produkcji peptydów hamujących aktywność konwertazy angiotensyny. Należały one do gatunków Lactobacillus buchneri, Lb. brevis i Weisella hellenica. Bioaktywne peptydy były obecne w serwatce po fermentacji odtłuszczonego mleka i białek sojowych, przy czym większą aktywność stwierdzono po fermentacji białek mleka. Fermentacja trwała 72 godziny w temperaturze 35°C. Szczepy te wykazywały jednocześnie zdolność do syntezy kwasu gamma-aminomasłowego.

Chobert i in. (2005) badali aktywność przeciwnadciśnieniową jogurtów wyprodukowanych z owczego mleka przy użyciu różnych kultur starterowych. Autorzy stwierdzili, że rodzaj użytych mikroorganizmów ma istotne znaczenie i wykazali, że największą aktywność hamującą konwertazę angiotensyny wykazała kultura bakterii YC-183.

Hemandez-Ledesma i in. (2004) badali aktywność enzymu konwertazy angiotensyny (ACE) w kilku fermentowanych handlowych produktach mlecznych. Większość z nich wykazała umiarkowaną aktywność przeciwnadciśnieniową. Wykazano jednak, że w niektórych produktach aktywność ACE była bardzo wysoka i istotną rolę w aktywności odgrywał rodzaj mleka poddawanego fermentacji.

W publikacji przeglądowej Beltran-Barrientos i in. (2015) przedstawiono wyniki szeregu badań naukowych, w których wykorzystano bakterie mlekowe do produkcji przeciwnadciśnieniowych BP na drodze fermentacyjnej. Autorzy wymieniają szereg szczepów z gatunków należących do bakterii fermentacji mlekowej produkujących BP o aktywności ACE. Najczęściej do produkcji BP wykorzystuje się odtłuszczone mleko oraz słodką serwatkę. Aktywne peptydy uwalniane są z białek pod wpływem proteolitycznych enzymów bakteryjnych, głównie związanych ze ścianą komórkową. Do najbardziej znanych BP o tej aktywności zaliczane są peptydy walina-prolina-prolina oraz izoleucyna-prolina-prolina. Stężenie tych peptydów w fermentowanych produktach mlecznych wynosi ok. 10-20 mg/L.

Donkor i in. (2007) badali właściwości funkcjonalne probiotycznych jogurtów i wykazali, że niektóre z nich zawierają BP o działaniu inhibującym ACE. W jogurtach tych, obok typowych bakterii jogurtowych, zastosowano dodatkowe szczepy, a mianowicie Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus Lb1466 i Streptococcus thermophilus St1342 lub L. acidophilus L10, L. casei L26 I Bifidobacterium lactis B94. Autorzy ci wyizolowali BP wykazujące inhibicję ACE. Jednocześnie stwierdzili, że BP występują tylko w jogurtach świeżych i w miarę upływu czasu ich przechowywania działanie przeciwnadciśnieniowe wyraźnie słabnie. Źródłem powstawania BP w jogurtach jest proteoliza kazeiny i powstawanie peptydów Val-Pro-Pro lub Ile-Pro-Pro.

Pihlanto i in. (2010) testowali 25 szczepów bakterii fermentacji mlekowej pod kątem aktywności ACE. Pięć spośród nich wykazało niskie IC50 w serwatce: Leuconostoc mesenteroides 356 (0,44 mg/mL), Leuconostoc mesenteroides 358 (0,48 mg/mL), Lactococcus lactis ssp. lactis ATCC 19435 (0,5 mg/mL),

PL 241 893 B1

Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 (0,42 mg/mL) i Lactobacillus jensenii ATCC 25258 (0,52 mg/mL). Najaktywniejszym okazał się szczep Lactobacillus jensenii. Bakteria ta uwalniała BP głównie z kazeiny, co wykazano w badaniach wykorzystujących technikę LC-MS. Testy biologiczne potwierdziły wyraźną redukcję ciśnienia krwi u szczurów doświadczalnych.

Meksykańscy badacze Gonzales-Cordova i in. (2011) określili aktywność ACE w odtłuszczonym mleku fermentowanym przy użyciu ośmiu różnych bakterii Lactobacillus. Wykazano, że największą aktywność ACE wykazywało mleko fermentowane przy użyciu Lactobacillus reuteri, Lb. johnsonii i Lb. helveticus.

W pracy przeglądowej Korhonen i Pihlanto (2006) przedstawiono podsumowanie badań nad produkcją bioaktywnych peptydów metodą fermentacyjną. Autorzy wymieniają wiele szczepów bakterii fermentacji mlekowej stosowanych przez innych badaczy, odkryte sekwencje aminokwasowe i rodzaje aktywności odkrytych peptydów. W większości są to aktywności przeciwnadciśnieniowe, antyoksydacyjne i opioidowe, a peptydy składają się z dwóch do 11 aminokwasów, najczęściej z 3-6 reszt aminokwasowych, w tym zawsze w sekwencji występuje prolina.

W rozwiązaniu CN102286397 (A) przedstawiono wynalazek polegający na uzyskaniu bioaktywnych peptydów z mleka w wyniku jego fermentacji przy użyciu mieszanej kultury bakterii. Opisano metodę wytwarzania fermentowanego produktu i jego działanie przeciwmiażdżycowe. Mleko poddawano pasteryzacji, następnie schładzano do 40-45°C, zaszczepiano kulturą bakterii mlekowych i poddawano procesowi fermentacji przez 8-12 h w celu namnożenia drobnoustrojów. W skład kultury mieszanej weszły bakterie Lactobacillus brevis, Lb. plantarum, Lb. helveticus, Lb. casei, Lb. sausage, Lactococcus lactis, Issatchenkia orientalis i drożdże Saccharomyces cerevisiae, stosowane w ściśle określonych proporcjach. Następnie prowadzono inkubację w stałej temperaturze, mieszano, oddzielano tłuszcz i wygrzewano pozostałość przez 1-2 godzin w temp. 50-60°C, po czym sterylizowano, schładzano do 18-23°C, ponownie fermentowano przez 72-120 h i rozdzielano na filtrze uzyskując serwatkę i ser. W wyniku tych zabiegów uzyskano bioaktywną serwatkę, wykazującą aktywność przeciwnadciśnieniową, probiotyczną, przeciwutleniającą i zapobiegającą miażdżycy.

Opis CN104839332 (A) ujawnia metodę produkcji mleka acidofilnego bogatego w bioaktywne peptydy. Pierwszy etap produkcji polega na namnożeniu materiału posiewowego w odtłuszczonym mleku. W skład kultury starterowej wchodziły bakterie z gatunku Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus i Lb. helveticus, w proporcji 1 : 1 : 3. Następnie uzyskaną kulturą starterową, w ilości 5% v/v, zaszczepiano odtłuszczone mleko i przeprowadzano dwustopniową fermentację, w czasie której obniżano temperaturę od 41°C do 37°C. Bakterie użyte w tym procesie charakteryzowały się zdolnościami symbiotycznymi i odpowiadały za zakwaszenie mleka, utworzenie związków zapachowych i proteolizę białek mleka, dzięki czemu w sfermentowanym mleku otrzymywano zwiększoną ilość niskocząsteczkowych peptydów. Kazeina i białka serwatkowe ulegały depolimeryzacji w czasie procesu fermentacji, a uzyskany produkt był łatwo trawiony i przyswajany przez organizm człowieka. Do fermentowanego mleka dodawano roztwór beta-glukanu z owsa w ilości 10%. Finalny produkt, zawierający 0,5-2% beta-glukanu i sfermentowane mleko, obniżał poziom cholesterolu i glukozy we krwi, zapobiegał nadciśnieniu, poprawiał funkcjonowanie przewodu pokarmowego i hamował reakcje utleniania.

Kolejne rozwiązanie polegające na produkcji bioaktywnych peptydów na drodze fermentacji serwatki opisano w opisie CN105483201 (A). W tym przypadku finalny produkt bogaty w peptydy wykazuje silne właściwości przeciwutleniające. Kultura bakteryjna stosowana w tym rozwiązaniu obejmuje mieszaninę Bifidobacterium lactis, Lactobacillus bulgaricus i Streptococcus thermophilus (1 : 1 : 1). Surowcem użytym w tym procesie jest odsolona, sproszkowana serwatka, z której przygotowano pożywkę ciekłą dla bakterii, zawierającą 13,4 g/l s.m. serwatki. Pożywka była sterylizowana w 100-120°C przez 20 min, a następnie schłodzona. Fermentację prowadzono przez 20-24 h, w temperaturze 37-47°C, przy pH początkowym 6,0-6,5. Wielkość inoculum wynosiła 3-5%. Peptydy uzyskane w wyniku rozkładu białek serwatkowych posiadają masę cząsteczkową w przedziale od 500 Da do 800 Da, a ich zawartość wynosi nie mniej niż 2,1 g/L, przy czystości powyżej 94%. Po zakończeniu fermentacji odfermentowaną serwatkę wirowano, oczyszczano na żywicach i filtrowano stosując najpierw ultrafiltr membranowy o punkcie odcięcia 800-1000 Da, a potem 100-200 Da. Następnie przeprowadzano proces oczyszczania peptydów metodami chromatograficznymi i ponownej ultrafiltracji.

Znana jest także metoda pozyskiwania bioaktywnych peptydów na drodze fermentacyjnej z mleczka sojowego. Otrzymany produkt jest przeznaczony na cele paszowe. W zgłoszeniu CN101642221 (A) ujawniono proces produkcyjny obejmujący moczenie nasion sojowych w roztworze NaHCO3 przez 6-10 h, obłuskanie nasion i przemycie ich wodą, obróbkę ultradźwiękową przy 550-600 W przez 20-30 min,

PL 241 893 B1 odfiltrowanie dużych cząstek z zawiesiny i wprowadzenie 4-8% sacharozy. Mieszaninę rozdrabniano w młynku koloidalnym, homogenizowano i sterylizowano wysokociśnieniowo. Równolegle przygotowano starterową kulturę mieszaną składającą się z bakterii Lactobacillus bulgaricus, Lb. casei, Lb. helveticus, Lb. acidophilus, Bifidobacterium i Streptococcus thermophilus. Bakterie hodowano jako pojedyncze gatunki lub w formie mieszaniny gatunków. Pożywkę z mleczka sojowego chłodzono do 37-42°C i zaszczepiano 4-6% kultury starterowej. W trakcie fermentacji zachodził proces proteolizy. Po fermentacji do mleczka dodawano kwas cytrynowy, sól sodową karboksymetylocelulozy, alginian, emulgator i miąższ owoców, a następnie całość homogenizowano przy ciśnieniu 40-60 MPa. Produkt zawierał aktywne peptydy, miał przedłużoną trwałość i mógł być przechowywany w temperaturze pokojowej.

Znany jest także proces produkcji substytutu sproszkowanej serwatki uzyskany na drodze biofermentacyjnej, znany z opisu CN101664102 (A). Rozwiązanie to odznacza się użyciem substratów skrobiowych i mieszanej kultury drobnoustrojów, w skład której weszły bakterie z rodzaju Bacillus i drożdże. Jako substratu użyto kukurydzę, otręby pszenne lub ziarno pszenicy, odpady rolnicze oraz proszek białek roślinnych. Proces produkcyjny obejmował mieszanie substratów, zaszczepienie ich kulturą starterową, dodanie wody, ponowne wymieszanie, przeprowadzenie procesu fermentacji, suszenie oraz rozdrabnianie. Proces fermentacji był prowadzony przez 48 h w warunkach tlenowych, w temperaturze 20-55°C, w podłożu półstałym o wilgotności 48-50% i grubości warstwy 50-60 cm. Dodatkowo do podłoża dodawano enzymy celulolityczne i ksylanolityczne, dzięki czemu uzyskiwano eliminację czynników antyżywieniowych. W trakcie fermentacji następowała hydroliza skrobi do niskocząsteczkowych cukrów, poprawiał się smak i zapach produktu, a białka zawarte w surowcach ulegały proteolizie. Uzyskany produkt o wilgotności końcowej 12% był słodki, kwaskawy i chętnie pobierany przez prosięta. Jednocześnie był to produkt wysokoenergetyczny.

W rozwiązaniu znanym z opisu CN104738384 (A) ujawniono metodę wytworzenia produktu o złożonym składzie surowcowym, poddanym procesowi fermentacji, bogatym w peptydy. Pierwszy etap produkcji polega na sporządzeniu mieszaniny substratów składającej się z 8 części hydrolizowanego proszku białkowego, 6-8 części proszku białek pieczarkowych, 15-35 części białek serwatkowych, 1-3 części hydrochlorku glukozoaminy, 0,01-0,05 części soli selenowych, 2-5 części witaminy C, 30-50 części oligosacharydów izomaltozowych, 6-10 części dekstryny, 2-6 części kwiatów wiciokrzewu oraz 0,95-0,99 części łodyg dendrobium. Wymienione składniki zawieszano w wodzie i obniżano pH do 3,1-5,1, w celu uzyskania jednorodnej mieszaniny. Następnie mieszaninę gotowano w temperaturze 80-99°C przez 70-150 min. Po schłodzeniu mieszaninę zaszczepiano mikroorganizmami i dodawano składnik zawierający cynk. Fermentację prowadzono przez 24-120 h w temperaturze 15-22°C. Po zakończeniu fermentacji mieszaninę sterylizowano w 150-220°C, płukano wodą, suszono i rozdrabniano. Uzyskany produkt był bogaty w peptydy zawierające cynk. Do proszku dodawano wodę, rozdrabniano i separowano niezhydrolizowane białka, w celu wyizolowania peptydów bogatych w cynk.

W zgłoszeniu EA200802409 przedstawiono rozwiązanie, w którym do produkcji antybakteryjnego peptydu użyto szczep bakterii Enterococcus mundtii ST4SA, zdeponowany w kolekcji ATCC pod numerem PTA-7278. Autorzy opisali także sekwencję nukleotydową genu kodującego strukturę peptydu ST4SA. Wskazali przy tym, że sekwencja ta może być wykorzystana do klonowania genu w innych bakteriach i drożdżach. Produkcja bioaktywnego peptydu może być dokonana metodą fermentacyjną, przez hodowlę wymienionego szczepu bakteryjnego w warunkach mikro-tlenowych w pożywce płynnej, w temperaturze 37°C. Pożywka hodowlana składa się z namoku kukurydzianego, sproszkowanej serwatki kwaśnej, bulionu MRS, ekstraktu drożdżowego i melasy, jednak najkorzystniejszą pożywką jest MRS. Aktywny produkt stanowi płyn pohodowlany, zawierający przeciwdrobnoustrojowy peptyd, względnie liofilizat tego płynu. Produkt ten może być użyty jako czynnik ochronny w produkcji żywności, w farmacji, kosmetologii, przy produkcji bioaktywnych opakowań i w innych aplikacjach. Wykazano, że peptyd hamuje wzrost wielu groźnych bakterii chorobotwórczych.

Do produkcji bioaktywnych peptydów o działaniu przeciwnadciśnieniowym zastosowano proces oparty na fermentacji mleka, znanym z opisu US2005074500 (Al), przy użyciu mieszanej kultury bakterii mlekowych, zawierającej między innymi szczep Lactobacillus helveticus CM4. Przygotowane mleko zaszczepiano kulturą starterową bakterii i prowadzono fermentację do momentu wydzielenia się skrzepu mlekowego i powstania peptydów wykazujących zdolność do hamowania enzymu konwertazy angiotensyny. Po zakończeniu fermentacji mieszaninę wirowano, filtrowano ciśnieniowo i wyodrębniano serwatkę, która stanowiła bioaktywny produkt zawierający peptydy Val-Pro-Pro oraz Ile-Pro-Pro.

Analizując stan techniki można stwierdzić, że znanych jest szereg mikroorganizmów, które w trakcie procesu fermentacji wytwarzają enzymy proteolityczne i depolimeryzują białka zawarte w podłożu

PL 241 893 B1 hodowlanym. Wśród produktów proteolizy znajdują się peptydy o właściwościach prozdrowotnych, które mogą być wykorzystane do celów profilaktycznych i leczniczych. Aktywne peptydy podawane są do spożycia bądź w formie fermentowanego produktu, lub jako czyste substancje, po ich izolacji z fermentowanego podłoża i oczyszczeniu. Należy przy tym zaznaczyć, że procesy oczyszczania są skomplikowane i pracochłonne, stąd peptydy podawane są najczęściej jako składnik fermentowanego pro duktu, najczęściej fermentowanego mleka.

Proces wytwarzania BP metodą fermentacyjną jest znany z literatury naukowej i patentowej i polega na przygotowaniu mleka, przygotowaniu kultury starterowej drobnoustrojów, zaszczepienia mleka mikroorganizmami i prowadzeniu procesu fermentacji połączonej z jednoczesnym procesem hydrolizy białek w kontrolowanych warunkach. Po zakończeniu fermentacji produkt jest schładzany i przechowywany w warunkach chłodniczych do momentu spożycia, względnie utrwalany przez suszenie.

Mimo licznych badań naukowych i patentowania ich wyników, ciągle poszukuje się nowych szczepów i nowych technologii produkcji bioaktywnych peptydów. Szczególnie poszukiwane są rozwiązania dające produkt wykazujący kilka bioaktywności jednocześnie. W praktyce kombinacja stosowanego surowca białkowego i enzymów bakteryjnych stwarza niepowtarzalne warunki do produkcji oryginalnych zestawów aktywnych peptydów, stąd każde nowe rozwiązanie spotyka się z dużym zainteresowaniem przemysłu produkującego żywność funkcjonalną i konsumentów poszukujących takiej żywności, a także producentów bioaktywnych składników paszowych.

W celu pozyskania szczepów bakterii mlekowych wykazujących aktywności biologiczne korzystne dla zdrowia człowieka opracowano sposób wyłaniania drobnoustrojów produkcyjnych, pozwalający na uzyskanie puli bioaktywnych peptydów uwalnianych z białek surowca przewyższającą ilościowo pulę peptydów uwalnianych z białek tego surowca pod wpływem wyłącznie samego trawienia żołądkowo-jelitowego.

Sposób wyłaniania drobnoustrojów produkcyjnych do produkcji bioaktywnych peptydów według wynalazku polega na:

(1) wyizolowaniu ze środowiska naturalnego szczepów zdolnych do biosyntezy enzymów proteolitycznych i wybranie szczepów o największych aktywnościach katalitycznych, (2) ustaleniu chemoselektywności białek enzymów proteolitycznych wybranego szczepu poprzez określenie miejsca, w którym enzymy tego szczepu przecinają łańcuchy polipeptydowe białek, (3) przeprowadzeniu badań in silico, wykorzystując dostępne bazy danych, w celu określenia ilości i rodzaju uwalnianych peptydów w reakcji proteolizy białek danego surowca pod wpływem enzymów wybranego mikroorganizmu, (4) porównaniu jakości i ilości uwalnianych peptydów przy proteolizie prowadzonej w układzie sekwencyjnym „enzymy badanego mikroorganizmu ^- pepsyna ^- trypsyna i ewentualnie chymotrypsyna”, wobec układu opartego na samych naturalnych enzymach trawiennych „pepsyna ^- trypsyna i ewentualnie chymotrypsyna”, w celu wykrycia, czy użycie enzymów drobnoustrojowych daje dodatkowe bioaktywne peptydy, co z punktu żywieniowego mogłoby być uznane jako wartość dodana, (5) wyborze szczepu produkcyjnego, przeznaczonego do produkcji bioaktywnych peptydów w warunkach technicznych.

Dla zrealizowania procedury wyłaniania szczepu produkcyjnego według wynalazku izoluje się ze środowiska naturalnego szczepy, które wykazują zdolność do wzrostu na pożywce wybiórczej, stosowanej do namnażania i określania liczby bakterii fermentacji mlekowej, korzystnie MRS. Na tej podstawie zostaje stworzona kolekcja izolatów bakteryjnych. Następnie poszczególne szczepy poddaje się testom biochemicznym, korzystnie w pożywce kazeiną. Bakterie posiadające zdolność do hydrolizy białek kazeinowych tworzą strefę rozjaśnienia wokół kolonii rosnącej na płytce. Na podstawie pomiaru średnicy strefy rozjaśnienia pożywki typuje się szczepy wykazujące największą aktywność proteolityczną.

Dalsze wyłanianie szczepów przeznaczonych do hydrolizy białek serwatkowych w kierunku uwalniania z nich bioaktywnych peptydów opiera się na metodzie wykorzystującej zarówno badania biochemiczne, jak i bioinformatyczne dla typowania najlepszych szczepów bakteryjnych. Istotą procedury jest określenie enzymów stanowiących podstawę kompleksu proteolitycznego badanego szczepu bakterii i dalej na podstawie danych literaturowych wskazuje się miejsca cięcia polipeptydów przez te enzymy, a następnie ocenia się przydatności tych enzymów do hydrolizy białek serwatkowych pod kątem uwalniania dodatkowych bioaktywnych peptydów z białek serwatkowych ponad pulę bioaktywnych peptydów uwalnianych w trakcie trawienia tych białek pod wpływem enzymów trawiennych, korzystnie pepsyny,

PL 241 893 B1 trypsyny i chymotrypsyny. Korzystnie, ocena ta jest przeprowadzona przy użyciu znanych narzędzi bioinformatycznych przeznaczonych do oceny reakcji proteolizy in silico.

Kluczowe znaczenie ma znajomość miejsca cięcia białek przez enzymy wytwarzane przez wybrany szczep bakteryjny. Informację tę można znaleźć w bazach danych, o ile wyizolowany mikroorganizm zostanie zidentyfikowany, a baza danych zawiera informacje dotyczące proteaz tego gatunku bakterii. Jeśli takich danych nie ma, konieczne są własne badania biochemiczne ustalające miejsce cięcia białek przez enzymy wybranego szczepu i warunki, w jakich przebiega ta reakcja. Niekiedy konieczne jest również sekwencjonowanie łańcuchów polipeptydowych białek.

Zgodnie z wynalazkiem przeprowadza się identyfikację najlepszego szczepu proteolitycznego w oparciu o analizę molekularną sekwencji 16 rRNA. W tym celu badane bakterie namnaża się w ciekłej pożywce namnażającej, odwirowuje komórki, kilkukrotnie je przemywa, a następnie izoluje z nich DNA i przeprowadza analizę sekwencji genu 16S rRNA. Na podstawie oceny homologii sekwencji wybranego szczepu z sekwencjami wzorcowymi mikroorganizmów z bazy danych ustala się najbardziej aktywny szczep, korzystnie należący do gatunku Enterococcus faecalis.

W kolejnym etapie przeprowadza się charakterystykę biochemiczną enzymów proteolitycznych wybranego szczepu, korzystnie E. faecalis. Obejmuje ona wykonanie zymogramów, izolację i oczyszczenie białek proteolitycznych przy użyciu technik wysalania siarczanem amonu, diafiltracji i chomatografii żelowej. Na podstawie uzyskanych informacji dotyczących chemoselektywności enzymów wybranego szczepu, korzystnie E. faecalis, przeprowadza się analizę reakcji proteolizy białek serwatkowych in silico z zastosowaniem enzymów „kokolizyna ^ pepsyna ^ trypsyna” oraz „glutamyloendopeptydaza ^ pepsyna ^ trypsyna” i wyniki odnosi się do układu samych enzymów trawiennych „pepsyna ^ trypsyna”.

Sposób produkcji bioaktywnych peptydów o aktywności prozdrowotnej według wynalazku polega na

1. biosyntezie enzymów proteolitycznych przez mikroorganizm wybrany sposobem wyłaniania drobnoustrojów produkcyjnych do produkcji bioaktywnych peptydów,

2. przeprowadzeniu procesu proteolizy białek serwatkowych w kontrolowanych warunkach w celu uwolnienia bioaktywnych peptydów.

W pierwszym etapie przeprowadza się biosyntezę enzymów proteolitycznych na podłożu, które korzystnie stanowi mleko krowie, a następnie przeprowadza się proces hydrolizy białek serwatkowych przy użyciu wytworzonych uprzednio enzymów bakteryjnych.

Sposób wymaga wcześniejszego przygotowania kultury starterowej bakterii przez ich hodowlę na sterylnej pożywce przeznaczonej do rozmnażania bakterii fermentacji mlekowej. Pożywką jest korzystnie pożywka płynna MRS (wg de Man, Rogosa, Sharpe) lub odtłuszczone mleko, lub inne ze znanych pożywek do namnażania tej grupy drobnoustrojów. Fermentację przeprowadza się w warunkach sterylnych przez 18-48 godzin w temperaturze 32-37°C, korzystnie 37°C, przy pH powyżej 5,0, korzystnie 6,5, aż do osiągnięcia gęstości populacji komórek bakteryjnych powyżej 106 jtk/ml, korzystnie powyżej 10⁸ jtk/ml. Tak przygotowaną kulturę starterową wykorzystuje się do zaszczepienia mleka umieszczonego w zbiorniku fermentora. W tym celu dodaje się do mleka 2-10% v/v kultury starterowej, miesza i rozpoczynano proces biosyntezy enzymów proteolitycznych.

Proces fermentacji mleka połączony z jednoczesną syntezą enzymów proteolitycznych przeprowadza się w kontrolowanych warunkach, mieszając łagodnie pożywkę przez okres fermentacji, utrzymując optymalną temperaturę i optymalne pH dla tego procesu. Po osiągnięciu plateau aktywności proteolitycznej proces przerywa się. Do hydrolizy białek serwatkowych wykorzystuje się płyn pofermentacyjny łącznie z komórkami (supernatant) lub same komórki, po ich wydzieleniu z płynu. Wydzielanie komórek przeprowadza się za pomocą wirowania lub filtracji membranowej.

W następnym etapie przeprowadza się proces hydrolizy białek serwatkowych do peptydów, z których część stanową peptydy bioaktywne. Korzystnie, proces prowadza się w termostatowanym zbiorniku, wyposażonym w system regulacji temperatury i mieszania cieczy. Korzystnie, jako surowiec do produkcji bioaktywnych peptydów wykorzystuje się białka serwatkowe przez rozpuszczenie w wodzie suchego koncentratu białek serwatkowych (WPC-80). Korzystnie, przed rozpoczęciem hydrolizy roztwór białek serwatkowych sterylizuje się przez membranę o wielkości porów poniżej 0,45 μm, korzystnie 0,22 μm, a następnie korzystnie dodatkowo pasteryzuje. Stężenie białek serwatkowych w roztworze wynosi 20-200 g/L, korzystnie 70-120 g/L. Reakcję hydrolizy białek serwatkowych prowadza się przez okres 2-48 godzin, korzystnie 13 godzin, w temperaturze 32-38°C, korzystnie 37°C, z regulacją pH do wartości 6,5-7,5, korzystnie 6,9, przy ciągłym mieszaniu roztworu. Następnie reakcję hydrolizy przerywa się, korzystnie przez ogrzanie mieszaniny reakcyjnej do 90°C przez 10-15 min. Zabieg ten powoduje

PL 241 893 B1 jednocześnie termiczną inaktywację bakterii. Następnie usuwa się komórki bakterii przez filtrację membranową, a finalny produkt utrwala bądź przez suszenie sublimacyjne, bądź przez suszenie rozpyłowe.

Analiza aktywności biologicznych przeprowadzona z użyciem testów biochemicznych i mikrobiologicznych wykazała, że finalny produkt hamuje aktywność enzymu konwertazy angiotensyny i aktywność dipeptydylopeptydazy IV, w stosunku do nietrawionych białek serwatkowych oraz hamuje wzrost chorobotwórczych bakterii z gatunku Listeria monocytogenes.

Na podstawie analizy LC-MS-MS/MS stwierdzono, że wśród bioaktywnych peptydów o aktywności przeciwdrobnoustrojowej znalazły się peptydy o sekwencji AASDISLLDAQSAPLR, IIAEKTKIPAVF, IDALNEMK, i VLVLDTDYK, peptydy o aktywności inhibitorów konwertazy angiotensyny o sekwencji LDAQSAPLR, LKGYGGVSLPEW i LKALPMH, peptydy o aktywności inhibitora dipeptydylopeptydazy IV: LKALPMH, LKPTPEGDLEIL, LKGYGGVSLPE, LKPTPEGGLE, ILDKVGINY i VLVLDTDYK.

Hydrolizat białek serwatkowych otrzymany sposobem według wynalazku zawiera peptydy inhibujące konwertazę angiotensyny I obniżające ciśnienie krwi, peptydy o aktywności przeciwdrobnoustrojowej w stosunku do Salmonella Paratyphi, Salmonella Enteritidis i Listeria monocytogenes oraz peptydy o aktywności przeciwutleniającej. Hydrolizat może być stosowany w profilaktyce choroby nadciśnienia krwi i/albo we wspomaganiu leczenia zaburzeń jelitowych wywołanych przez chorobotwórcze bakterie i/albo w ogólnej profilaktyce wobec chorób cywilizacyjnych, jak miażdżyca, choroby nowotworowe, stany zapalne. Może być także stosowany jako aktywny składnik pasz.

Piśmiennictwo

Barla F., Koyanagi T., Tokuda N. i in.: The gamma-amonobutyric acid-producing ability under low pH conditions of lactic acid bacteria isolated from traditional fermented foods of Ishikawa Prefecture , Japan, with a strong ability to produce ACE-inhibitory peptides. Biotechnol Rep. 10, 105-110, 2016.

Beltran-Barrientos LM, Hernandez-Mendoza A, Torres-Llanez MJ, Gonzales-Cordova AF, Vallejo-Cordoba B. Fermented milk as antihypertensive functional food. J. Dairy Sci 99, 4099-4110, 2015.

Chobert J-M, El-Zahar K., Sitohy M., Dalgalarrondo M., Metro F., Choiset Y. : Angiotensin I-converting-enzyme (ACE)-inhibitory activity of tryptic peptides of ovine beta-lactoglobulin and milk yoghurts obtained by using different starters. Fait 141-152, 2005. DOI: 10.1051/lait:2005005.

Donkor ON, Henriksson A, Singh TK, Vsiljevic T, Shah NP: ACE-inhibitory activity of probiotic yoghurt. Int, Dairy J. 17(11), 1321-1331,2007.

Dziuba B., Dziuba M. Milk proteins-derived bioactive peptides in dairy products: molecular, biological and methodological aspects. Acta Sci. Pol., Technol. Aliment. 13(1) 5-25 (2014)

Gonzales-Cordova AF, Torres-Llanez MJ, Rodriguez-Figueroa JC, Espinosa-de-los-Monteros JJ, Garcia HS, Vallejo-Cordoba B : Actividad inhibidora de la enzima convertidora de angiotensina en leches fermentadascon cepas de Factobacillus, Angiotensin converting enzymeinhibitory activity in milks fermented by Factobacillus strains. CyTA J. Food 9(2), 146-151,2011.

Hemandez-Ledesma B, Amigo F, Ramos M, Recio A: Angiotensin converting enzyme inhibitory activity in commercial fermented products. Formation of peptides under simulated gastrointestinal digestion. J. Agric. Food Chem 52(6), 1504-1510, 2004.

Korhonen H., Pihlanto A. Bioactive peptides: production and functionality. International Dairy Journal 16, 945-960, 2006.

Lucarini M.: Bioactive peptides in milk: from encrypted sequences to nutraceutical aspects. Beverages 3, 41, 1-10, 2017.

Pihlanto A, Virtanen T, Korhonen H: Angiotensin I converting enzyme (ACE) inhibitory activity and antihypertensive effect of fermented milk. Int. Dairy J. 20(1), 3-10, 2010.

Sharma S., Singh R., Rana S.: Bioactive peptides: a review. Int. J. Bioautomation, 15(4), 223-250, 2011.

Shori AB, Baba AS. : Fermented milk derives bioactive peptides with antihyertensive effects. Integr Food Nutr Metab 2(3), 180-183, 2015.

Virtanen T., Pihlanto A., Akkanen S., Korhonen H. Development of antioxidant activity in milk whey during fermentation with lactic acid bacteria. J. Appl. Microbiol. 102(1), 106-115,2007.

Wynalazek przedstawiono w przykładach wykonania

Przykład 1.

Z serów produkowanych metodą chałupniczą wyizolowano 50 szczepów bakterii, sporządzono z nich zawiesinę komórkową i wysiano na płytki Petriego z pożywką agarową MRS. Bakterie hodowano w temperaturze 37°C przez 48 godzin. Z kolonii bakteryjnych, które wyrosły na tej pożywce, pobrano

PL 241 893 B1 komórki bakteryjne i przeniesiono do probówek z pożywką bulionową MRS, uzyskując w ten sposób monokultury izolatów bakteryjnych. Następnie przeprowadzono test biologiczny metodą dyfuzyjno-studzienkową na aktywność proteolityczną bakterii. Wyizolowane szczepy wysiewano na pożywkę agarową z 10% odtłuszczonym mlekiem krowim. W pożywce wycinano korkoborem studzienki, do których wprowadzano po 100 μl przygotowanej zawiesiny bakteryjnej. Tak przygotowane próby inkubowano przez 48 h w temperaturze 37°C. Obecność i rozmiar stref przejaśnień sprawdzano po 24 i 48 h inkubacji. Opisana metoda zakłada, że w trakcie inkubacji bakterii proteolitycznych zachodzi hydroliza obecnej w podłożu kazeiny, czemu towarzyszy powstawanie stref przejaśnienia wokół otworu z zawiesiną bakterii. Na podstawie pomiaru średnic stref rozjaśnień sporządzono ranking wyizolowanych szczepów według rosnącej aktywności proteolitycznej.

Następnie dokonano identyfikacji najaktywniejszego szczepu w oparciu o sekwencjonowanie genu 16S rRNA. W tym celu identyfikowany szczep namnożono w bulionie MRS, odwirowano komórki i wyizolowano z nich genomowy DNA metodą kolumienkową. Na podstawie analizy homologii badanego genu pobranego z izolatu z wzorcami DNA bakteryjnego zamieszczonymi w bazie danych serwisu NCBI przy pomocy narzędzia BLAST stwierdzono, że badany szczep 2/28 należy do gatunku Enterococcus faecalis.

Następnie przeprowadzono charakterystykę enzymów proteolitycznych tych bakterii. Pod uwagę wzięto enzymy pozakomórkowe wydzielone przez komórki do pożywki oraz enzymy związane ze ścianą komórkową bakterii (EZK). Do izolacji enzymów pozakomorkowych wykorzystano płyn pohodowlany wirowany przy 4000 g przez 10 min w temperaturze 4°C, natomiast enzymy związane ze ścianami komórkowymi pozyskiwano przez przemycie komórek buforem 0,05 M Tris-HCl, pH 7,5 i inkubację komórek w 30°C przez 60 min. W tych warunkach enzymy odczepiają się od ścian i przechodzą do roztworu. Roztwór wirowano w warunkach identycznych z wirowaniem enzymów pozakomórkowych. Wyizolowane enzymy przebadano na aktywność proteolityczną wykorzystując do tego metodę spektrofotometryczną, w której reakcję proteolizy prowadzono wobec azokazeiny, przez 60 min w temperaturze 37°C w warunkach ciągłego wytrząsania (400 obr/min). Po zakończeniu inkubacji pobrano 1 ml próby i dodano 4 ml 5% (v/v) TCA, a następnie próbę filtrowano. Jeden ml przesączu mieszano z 3 ml 0,5 M NaOH i mierzono absorbancję przy długości fali λ = 440 nm. Na podstawie wykazano, że enzymy związane ze ściankami komórkowymi bakterii są znacznie aktywniejsze.

Enzymy EZK oczyszczano kolejno metodą wysalania, diafiltracji i chromatografii żelowej. Do wysalania użyto siarczan amonu w stężeniach 14%, 30% i 50%. Osad wydziel ano przez wirowanie w temp. 4°C przy 4000 obr/min przez 20 min. Uzyskany osad rozpuszczano w 0,05 M Tris-HCl, a supernatant przekazywano do kolejnych badań. Frakcję o najwyższej aktywności enzymatycznej, uzyskaną po procesie wysalania, poddano diafiltracji, którą prowadzono wobec wody destylowanej, stosując ultrafiltr AmiconUltra-15/10kDa. Frakcję o masie cząsteczkowej >10 kDa zbierano i mierzono aktywność enzymu oraz zawartość białka. Próbę po procesie diafiltracji poddano rozdziałowi z wykorzystaniem techniki chromatografii żelowej. Rozdziały przeprowadzono przy użyciu chromatografu AKTA Explorer 100 Air (Amersham Pharmacia, Szwecja), na kolumnie HiLoad 26/600 Sephadex G-75 (GE Healthcare, Wielka Brytania) w układzie izokratycznym, stosując jako eluent 50 mM bufor fosforanowy o pH 7,12 zawierający 0,15 M NaCl. Detekcję związków prowadzono z wykorzystaniem detektora UV/Vis przy długości fali 280 nm. Uzyskane frakcje zebrano i zagęszczono za pomocą ultrafiltra Amicon Ultra-15 (10 kDa). W wyniku tych operacji enzymy EZK zagęszczono 70-krotnie.

Następnie przeprowadzono identyfikację proteaz frakcji EZK. Analizę przeprowadzono metodą chromatografii cieczowej sprzężonej z spektrometrem masowym LC-MS-MS/MS. Rozdział mieszaniny peptydów prowadzono z wykorzystaniem techniki ultrasprawnej chromatografii cieczowej (UPLC), na kolumnie nanoACQUITY UPLC BEH130, w liniowym gradiencie acetonitrylu w czasie 45 min. Pomiar mas peptydów i ich fragmentów prowadzono w spektrometrze mas Orbitrap Velos (Thermo, USA) z jonizacją typu elektrorozpylanie (ESI) oraz analizatorem typu orbitrap. Uzyskane wyniki analizowano z wykorzystaniem oprogramowania Distiller Mascot 2.4.2.0 (MatrixScience), a następnie porównywano masy peptydów i ich fragmentów z bazą danych sekwencji białkowych Merops (449126 sekwencji) przy pomocy programu Mascot (Mascot Demon v. 2.4.0, Mascot Server v. 2.4.1, Matrix Science). Na podstawie tych analiz stwierdzono, że enzymami frakcji EZK E. faecalis są kokolizyna i glutamylo-endopeptydaza.

Znając najbardziej aktywne proteazy badanego szczepu bakteryjnego oraz sekwencje aminokwasowe głównych białek serwatkowych przeznaczonych do procesu hydrolizy, przeprowadzono reakcję proteolizy głównych białek serwatkowych in silico przy użyciu enzymów E. faecalis. Analizę przepro

PL 241 893 B1 wadzono wykorzystując bazę danych BIOPEP (http://uwm.edu.pl/biochemia). W celu wykazania, że enzymy bakteryjne w połączeniu z enzymami przewodu trawiennego człowieka produkują dodatkowe, bioaktywne peptydy, przeprowadzono analizę porównawczą w układach kokolizyna ^- pepsyna ^- trypsyna i glutamyloendopeptydaza ^- pepsyna ^- trypsyna wobec układu pepsyna ^- trypsyna. Wyniki analizy wskazały, że kokolizyna uwalnia bioaktywne peptydy ze wszystkich analizowanych białek serwatki. Wartość parametru opisującego sprawność enzymu do uwalniania peptydów była najwyższa dla peptydów o aktywności inhibitora DPP-IV oraz inhibitora ACE. Wśród zaobserwowanych peptydów pojawiły się także nieliczne fragmenty o aktywności: immunomodulacyjnej, stymulującej, antyoksydacyjnej, antyamnezyjnej i przeciwdrobnoustrojowej. Glutamylo-endopeptydaza wykazała znacznie niższy potencjał do hydrolizy białek serwatki. Poddanie białek serwatki działaniu obu enzymów bakteryjnych, które stanowią podstawę kompleksu enzymatycznego E. feacalis 2/28, w znacznym stopniu zwiększyło ilość uwalnianych biopeptydów, szczególnie o aktywności inhibitora DPP-IV oraz inhibitora ACE.

Wyniki analizy in silico dały podstawy do przeprowadzenia głównych eksperymentów polegających na produkcji bioaktywnych peptydów w warunkach technicznych. Pierwszy etap założonego procesu hybrydowego polegał na biosyntezie proteolitycznych enzymów, głównie EZK, przez bakterie E. faecalis 2/28. W tym celu przygotowano mleko, jako pożywkę produkcyjną. Technologia przygotowania mleka polegała na odpowietrzeniu mleka metodą podciśnieniową w komorze próżniowej. Następnie mleko poddawano obróbce znanej z przygotowania mleka do produkcji serów. Obejmowała ona odtłuszczanie mleka przez wirowanie i poddanie mleka baktofugacji, w celu usunięcia bakterii zanieczyszczających mleko. Następnie mleko homogenizowano i poddano jałowieniu przez pasteryzację w temperaturze 85°C przez 20 min. Sterylne mleko umieszczano we wcześniej wysterylizowanym bioreaktorze (fermentorze).

W międzyczasie przygotowano kulturę starterową bakterii (inoculum). Istota tego procesu polegała na przygotowaniu bulionu MRS, jego sterylizacji w 121°C przez 15 min, schłodzeniu do 35-37°C i zaszczepieniu bakteriami E. faecalis w ilości 3% v/v, przy gęstości komórek 1,5 χ 10⁸ jtk/ml. Hodowlę prowadzono przez 36 godzin w bioreaktorze inokulacyjnym o objętości roboczej 15 l, w warunkach beztlenowych. Uzyskana kultura stanowiła w całości kulturę starterową do zaszczepienia bioreaktora przeznaczonego do biosyntezy enzymów proteolitycznych.

Biosyntezę enzymów proteolitycznych prowadzono w bioreaktorze o objętości roboczej 300 l. Hodowlę prowadzono w odtłuszczonym, wysterylizowanym mleku przez okres 25 godzin, przy ciągłym mieszaniu, utrzymując temperaturę 35-37°C. Po zakończeniu biosyntezy enzymów proteolitycznych proces przerywano przez wychłodzenie do 10°C.

W międzyczasie przygotowano roztwór białek serwatkowych w mieszalniku. W tym celu w 700 l wody o temperaturze 30-37°C rozpuszczono 750 kg sproszkowanego koncentratu białek serwatkowych. Koncentrat dodawano do wody bardzo wolno, przy ciągłym delikatnym mieszaniu, aby ograniczyć pienienie się roztworu. Następnie gotowy roztwór filtrowano przez mikrofiltr w celu usunięcia zanieczyszczających go drobnoustrojów i przepompowywano do reaktora o obj. 1500 l. Ustalano temperaturę 37°C i wprowadzano 300 l odfermentowanego mleka zawierającego komórki bakteryjne i enzymy. Następnie ustalano pH mieszaniny na 6,9 i rozpoczęto proces hydrolizy, który prowadzono przy łagodnym mieszaniu przez 13 godzin.

Po zakończeniu procesu hydrolizy całość podgrzewano do 90°C i utrzymywano w tej temperaturze przez 20 min, po czym roztwór kierowano do suszarni rozpyłowej. Proces suszenia prowadzono przy temperaturze wlotowej powietrza 160°C, a wylotowej 70-80°C.

Uzyskany proszek pakowano w hermetyczne opakowania i przechowywano w warunkach chłodniczych.

W celu określenia aktywności biologicznej hydrolizatu przeprowadzono analizę produktu pod kątem aktywności inhibitora konwertazy angiotensyny, aktywności przeciwutleniającej i aktywności przeciwdrobnoustrojowej. W tym celu hydrolizat rekonstytuowano przez rozpuszczenie w wodzie, sporządzając roztwór o stężeniu 5 % w/v.

Oznaczenie aktywności inhibitora ACE wykonano metodą opisaną przez Nakamura i in. (1995) (Nakamura Y., Yamamoto N., Sakai K., Okubo A, Yamazaki S., Takano T.: Purification and characterization of angiotensin I-converting enzyme inhibitors from sour milk. J. Dairy Sci., 1995, 78, 777-783). W metodzie wykorzystany jest mechanizm reakcji, gdzie ACE katalizuje hydrolizę hipurylo-histydylo-leucynę (HHL) z wytworzeniem dipeptydu His-Leu (HL) oraz kwasu hipurowego (HA). Spektrofotometryczny pomiar ilości uwolnionego HA informuje o poziomie aktywności ACE. Stwierdzono, że roztwór białek serwat

PL 241 893 B1 kowych przed hydrolizą nie wykazywał aktywności inhibitora ACE, natomiast hydrolizat między 5 a 9 godziną hydrolizy wykazywał zdolność do inhibicji ACE na poziomie 65%, natomiast w 13 godzinie hydrolizy hamowanie ACE było pełne.

Wpływ hydrolizatu białek serwatki na aktywność inhibitora dipeptydylopeptydazy IV (DPP-IV) oznaczono wg metody opisanej przez Lacroix i Li-Chan (2013) (Lacroix I.M.E., Li-Chan E.C.Y.: Inhibition of dipeptidyl peptidase (DPP)-IV and a-glucosidase activities by pepsin-treated whey proteins. J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 7500-7506). Na podstawie analizy tej aktywności w czasie procesu hydrolizy stwierdzono, że największa zdolność hamowania aktywności DPP-IV wykazał hydrolizat po 13 godzinie prowadzenia hydrolizy. Oznaczanie aktywności przeciwutleniającej hydrolizatu wykonano metodą Re (Re R., Pellegrini N., Proteggente A, Pannal a A, Yang M., Rice-Evans C.: Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Rad. Biol. Med., 1999; 26(9-10): 1231-1237) wobec kationorodnika ABTS++ oraz metodą Brandta-Williamsa i in.

(Brand-Williams W., Cuvelier M.E., Berset C.: Use of free radical method to evaluate antioxidant activity. Lebensm.-Wiss.-Technol., 1995; 28: 25-30) z użyciem rodników DPPH*.

Aktywność przeciwdrobnoustrojową hydrolizatów białek serwatki oznaczono z wykorzystaniem metody punktowo-dyfuzyjnej, wobec następujących szczepów wskaźnikowych: Salmonella Enteritidis, Salmonella Paratyphi, Salmonella Typhimurium, Listeria monocytogenes, Listeria innocua, Yersinia enterocolitica, Escherichia coli i Staphylococcus aureus. Wyniki testów wykazały, że hydrolizat białek serwatkowych wykazał antagonistyczną aktywność wobec Salmonella Paratyphi, Salmonella Enteritidis oraz Listeria monocytogenes.

P r z y k ł a d 2.

Do produkcji hydrolizatów białek serwatkowych zawierających bioaktywne peptydy zastosowano szczep E. faecalis 5/16 wyselekcjonowany i scharakteryzowany pod kątem aktywności proteolitycznych według procedury opisanej w przykładzie 1.

Kulturę starterową bakterii hodowano w warunkach beztlenowych w 20 l pożywki M17 przez 48 godzin w temperaturze 35°C. Gotowe inoculum zawierało populację komórek o gęstości 4,1 χ 10⁸ jtk/ml.

W międzyczasie przygotowano mleko owcze w ilości 380 l. Mleko wirowano w celu wydzielenia tłuszczu (temp. 4°C, 16 000 xg, 10 min) i poddawano filtracji w celu usunięcie bakterii. Następnie mleko umieszczano w sterylnym fermentorze, ustalano temperaturę 37°C, regulowano wyjściowe pH do wartości 6,7, i wprowadzano kulturę starterową. Biosyntezę enzymów proteolitycznych prowadzono przez 24 godziny. Pod koniec tego procesu do mleka dodawano podpuszczkę cielęcą w ilości 0,3 g/l, o aktywności ścinającej 95 jednostek/ml, doprowadzając do wytrącenia pozostałości białek mleka, w tym kazeiny. Grudki kazeiny usuwano przez filtrację, a frakcję ciekłą poddawano wirowaniu przez 15 min przy 4000 g, w celu wydzielenia komórek bakteryjnych. Uzyskane komórki były źródłem enzymów związanych ze ściankami komórkowymi bakterii.

Równolegle przygotowano roztwór białek serwatkowych. Białka te pozyskiwano z serwatki po produkcji sera Emmentaler. Białka serwatkowe izolowano i zagęszczano metodą ultrafiltracji do ok. 20% w/w. Roztwór białek serwatkowych w ilości 1000 l umieszczano w termostatowanym zbiorniku i dodawano do niego zawiesinę komórek wydzielonych z odfermentowanego mleka. Proces hydrolizy prowadzono w temperaturze 36°C przez 13 godzin, przy ciągłym mieszaniu. Po zakończeniu hydrolizy roztwór hydrolizatu zagęszczano metodą odwróconej osmozy i suszono w liofilizatorze. Uzyskany produkt wykazywał właściwości inhibicji ACE oraz właściwości przeciwdrobnoustrojowe wobec bakterii Salmonella Enteritidis. Produkt był kierowany na rynek jako wysokobiałkowy, aktywny hydrolizat przeznaczony do żywienia sportowców rozwijających masę mięśniową, do osób z nadciśnieniem krwi oraz jako aktywny dodatek białkowy w żywieniu zwierząt.

Claims (21)

1. Sposób przeprowadzenia selekcji mikroorganizmów proteolitycznych znamienny tym, że polega na:

(1) wyizolowaniu ze środowiska naturalnego szczepów zdolnych do biosyntezy enzymów proteolitycznych i wybranie szczepów o największych aktywnościach katalitycznych, (2) ustaleniu chemoselektywności białek enzymów proteolitycznych wybranego szczepu poprzez określenie miejsca, w którym enzymy tego szczepu przecinają łańcuchy polipeptydowe białek,

PL 241 893 B1 (3) przeprowadzeniu badań in silico, wykorzystując dostępne bazy danych, w celu określenia ilości i rodzaju uwalnianych peptydów w reakcji proteolizy białek danego surowca pod wpływem enzymów wybranego mikroorganizmu, (4) porównaniu jakości i ilości uwalnianych peptydów przy proteolizie prowadzonej w układzie sekwencyjnym „enzymy badanego mikroorganizmu ^- pepsyna ^- trypsyna i ewentualnie chymotrypsyna”, wobec układu opartego na samych naturalnych enzymach trawiennych „pepsyna ^- trypsyna i ewentualnie chymotrypsyna”, w celu wykrycia, czy użycie enzymów drobnoustrojowych daje dodatkowe bioaktywne peptydy, co z punktu żywieniowego mogłoby być uznane jako wartość dodana, (5) wyborze szczepu produkcyjnego, przeznaczonego do produkcji bioaktywnych peptydów w warunkach technicznych.

2. Sposób przeprowadzenia selekcji mikroorganizmów proteolitycznych wg zastrz. 1 znamienny tym, że obejmuje testy izolacyjne bakterii fermentacji mlekowej na selektywnej pożywce namnażającej, korzystnie MRS.

3. Sposób przeprowadzenia selekcji mikroorganizmów proteolitycznych wg zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że testy wykrywające aktywność katalityczną szczepów prowadzone są metodą dyfuzyjną z pomiarem stref rozjaśnienia i/lub testem fermentacyjnym na podłożu zawierającym składnik białkowy.

4. Sposób przeprowadzania selekcji mikroorganizmów proteolitycznych wg zastrz. 1 albo 2, albo 3 znamienny tym, że wyniki analiz bioinformatycznych sprawdza się w testach biologicznych.

5. Sposób wytwarzania hydrolizatów białek serwatkowych zawierających bioaktywne peptydy znamienny tym, że obejmuje on etap biosyntezy enzymów proteolitycznych przez szczepy mikroorganizmów wyselekcjonowane sposobem jak określono w zastrzeżeniu 1 albo 2, albo 3 oraz etap hydrolizy enzymatycznej białek serwatkowych przy użyciu tych enzymów w kontrolowanych warunkach reakcji proteolizy.

6. Sposób wytwarzania hydrolizatów białek serwatkowych zawierających bioaktywne peptydy według zastrz. 5 znamienny tym, że wybrany szczep bakteryjny hoduje się w pożywce składającej się z mleka, korzystnie z mleka odpowietrzonego, odtłuszczonego i wyjałowionego.

7. Sposób wytwarzania hydrolizatów białek serwatkowych zawierających bioaktywne peptydy według zastrz. 6 znamienny tym, że stosuje się mleko krowie, kozie lub owcze, korzystnie mleko krowie.

8. Sposób wytwarzania hydrolizatów białek serwatkowych zawierających bioaktywne peptydy według zastrz. 5 albo 6, albo 7 znamienny tym, że do biosyntezy enzymów proteolitycznych stosuje się szczepy z gatunku Enterococcus faecalis.

9. Sposób wytwarzania hydrolizatów białek serwatkowych zawierających bioaktywne peptydy według zastrz. 8 znamienny tym, że proces biosyntezy enzymów proteolitycznych rozpoczyna się od wprowadzenia do mleka 1-20% v/v kultury starterowej, korzystnie 2-5% v/v, zawierającej 106-10¹¹ jtk/ml, korzystnie powyżej 10⁸ jtk/ml.

10. Sposób wytwarzania hydrolizatów białek serwatkowych zawierających bioaktywne peptydy według zastrz. 8 albo 9 znamienny tym, że biosyntezę enzymów proteolitycznych przez szczep Enterococcus faecalis prowadzi się przez 18-48 h, korzystnie 25 h, w temperaturze 30-38°C, korzystnie 37°C, przy pH początkowym mleka 6,5-7,5, korzystnie 6,9, przy mieszaniu pożywki.

11. Sposób wytwarzania hydrolizatów białek serwatkowych zawierających bioaktywne peptydy według któregokolwiek z zastrz. od 5 do 10 znamienny tym, że do produkcji hydrolizatu stosowane są białka serwatkowe izolowane ze słodkiej serwatki, zagęszczone jedną ze znanych metod.

12. Sposób wytwarzania hydrolizatów białek serwatkowych zawierających bioaktywne peptydy według któregokolwiek z zastrz. od 5 do 10 znamienny tym, że do produkcji hydrolizatu stosowany jest roztwór białek sporządzony z gotowego wysuszonego koncentratu białek serwatkowych, zawierającego do 80% białek.

13. Sposób wytwarzania hydrolizatów białek serwatkowych zawierających bioaktywne peptydy według zastrz. 11 albo 12 znamienny tym, że stosuje się roztwór białek serwatkowych o stężeniu 20-200 g/L.

PL 241 893 B1

14. Sposób wytwarzania hydrolizatów białek serwatkowych zawierających bioaktywne peptydy według któregokolwiek z zastrz. od 5 do 13 znamienny tym, że reakcję hydrolizy przeprowadza się przy użyciu enzymów wytworzonych przez wybrany szczep bakterii w mleku, a enzymy stosowane są jako preparat surowy, nieoczyszczony, w formie odfermentowanego mleka, i/albo jako odfermentowane mleko po wytrąceniu i wydzieleniu białek mle ka, korzystnie kazeinowych, i/albo jako zawiesina samych komórek bakteryjnych, wyizolowanych z odfermentowanego mleka technikami filtracji membranowej i/albo wirowania, po procesie biosyntezy enzymów.

15. Sposób wytwarzania hydrolizatów białek serwatkowych zawierających bioaktywne peptydy według zastrz. 14 znamienny tym, że preparat enzymatyczny wprowadza się do roztworu białek serwatkowych w ilości 20-60% v/v.

16. Sposób wytwarzania hydrolizatów białek serwatkowych zawierających bioaktywne peptydy według któregokolwiek z zastrz. od 5 do 15 znamienny tym, że jest reakcja hydrolizy prowadzona jest przez 2-48 godzin, korzystnie 13 godzin, w temperaturze 32-38°C, korzystnie 37°C, przy pH początkowym mieszaniny reakcyjnej 6,5-7,5, korzystnie 6,9, przy ciągłym mieszaniu roztworu.

17. Sposób wytwarzania hydrolizatów białek serwatkowych zawierających bioaktywne peptydy według któregokolwiek z zastrz. od 5 do 16 znamienny tym, że reakcję enzymatyczną przerywa się przez inaktywację termiczną enzymów lub przez zmianę pH mieszaniny.

18. Sposób wytwarzania hydrolizatów białek serwatkowych zawierających bioaktywne peptydy według któregokolwiek z zastrz. od 5 do 17 znamienny tym, że z hydrolizatu białek serwatkowych wydziela się frakcję wzbogaconą w bioaktywne peptydy przez ultrafiltrację przy zastosowaniu membran o punkcie odcięcia 2 kDa.

19. Sposób wytwarzania hydrolizatów białek serwatkowych zawierających bioaktywne peptydy według któregokolwiek z zastrz. od 5 do 18 znamienny tym, że po zakończeniu hydrolizy hydrolizat poddaje utrwaleniu przez suszenie sublimacyjne lub suszenie rozpyłowe, korzystnie uprzednio go zagęszczając metodami ultrafiltracyjnymi i/lub przez odwróconą osmozę.

20. Sposób wytwarzania hydrolizatów białek serwatkowych zawierających bioaktywne peptydy według zastrz. 19 znamienny tym, że proces liofilizacji prowadzi się w temperaturze około 10°C przy ciśnieniu około 0,1 mbar przez około 21 h, a następnie dosusza w temperaturze około 20°C przez około 3 h, natomiast proces suszenia rozpyłowego przy temperaturze powietrza wlotowego 150-180°C i temperaturze powietrza wylotowego 65-85°C.

21. Hydrolizat białek serwatkowych otrzymany sposobem jak określono w którymkolwiek z zastrzeżeń od 5 do 20 znamienny tym, że zawiera peptydy inhibujące konwertazę angiotensyny I obniżające ciśnienie krwi, peptydy o aktywności przeciwdrobnoustrojowej w stosunku do Salmonella Paratyphi, Salmonella Enteritidis i Listeria monocytogenes oraz peptydy o aktywności przeciwutleniającej.