KR20140040731A - 건강상의 이익을 갖는 다중 박테리아 제조물: 항산화 효과, 콜레스테롤 농도의 감소, 항염증 면역조절 효과 및 안지오텐신-전환 효소를 저해하는 생물활성 펩타이드의 방출 - Google Patents
건강상의 이익을 갖는 다중 박테리아 제조물: 항산화 효과, 콜레스테롤 농도의 감소, 항염증 면역조절 효과 및 안지오텐신-전환 효소를 저해하는 생물활성 펩타이드의 방출 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) 7/12 NBIMCC No. 8720, 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) F12 NBIMCC No. 8722 및 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) A1 NBIMCC No. 8721의 새로운 스트레인을 포함하며, 하기의 특성들, 항산화제, 저콜레스테롤혈증 효과, 항염증 면역조절 효과, 고혈압에 원인이 있는 안지오텐신-전환 효소(ACE)를 저해하는 생물활성 펩타이드를 방출하는 능력을 갖는, 다중 박테리아 생균제 제조물에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 유용한 특성을 갖는 상기 유산균의 생균제 스트레인 및 발달된 박테리아 산물을 제공하는 것이다. 편입된 생균제 스트레인 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) 7/12 NBIMCC No. 8720은 다수의 특성, 대장의 상피세포에 대한 강한 부착성, 염증전 사이토카인 인터루킨-8의 수준 감소에 의한 콜레스테롤 및 항염증 효과의 감소 능력을 갖는다. 본 발명은 유산균의 스트레인 및 박테리아 제제를 인간 및 동물의 건강에 영향을 미치도록 의도된 종균 배양, 식품 첨가물, 식품, 기능성 제품 및 약학 제조물에 사용하는 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 생명공학 분야에 관한 것으로, 구체적으로 유산균의 생균제 스트레인 및 이에 의해 얻어진 다중 박테리아 제조물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 제조물의 복합적으로 유익한 건강 효과 및 이의 다양한 질병의 예방을 위한 식이 보충제로서의 용도에 관한 것이다.
생균제는 인간 건강에 긍정적인 영향을 미치는 살아있는 식용가능한 미생물이다. 대부분의 생균제는 락토바실리(lactobacilli) 및/또는 비피도박테리아(bifidobacteria)이다. 이들은 위장관 상에서 콜로니화될 수 있는 비-병원성 박테리아이다. 락토바실리 및 비피도박테리아는 인간 마이크로플로라(미생물군)의 주 요소이다. 대표적인 두 속의 미생물은 결장의 점막층에 콜로니화될 수 있으며, 장 생태계의 항상성 유지에 영향을 미칠 수 있다. 이의 존재는 유해한 미생물의 억제, 소화 개선, 면역 자극 효과, 락토즈 과민증의 감소, 혈청 콜레스테롤의 감소, 설사의 예방 등과 같이 유익한 건강 효과와 관련이 있다. 락토바실리의 일부 스트레인은 칼슘- 및 마그네슘-흡수 효과뿐만 아니라 항고혈압성 효과를 갖는 생물활성 펩타이드를 생성한다. 일반적으로, 활생 효과는 락토바실러스(Lactobacillus) 속 및 비피더스박테리움(Bifidobacterium) 속과 관련되지 않으나, 스트레인 특이적이다. 유익한 효과를 입증하기 위해, 종 및 스트레인의 정확한 식별이 연구 중에 수행된다. 다수의 유익한 건강 효과는 생균제 스트레인을 함유하는 산물의 소비 후에 나타난다. 아래에 가장 중요한 유익 효과를 열거한다:
· 유익한 박테리아를 자극하고 유해한 미생물을 억제함으로써 장내 세균총에 대한 호의적 효과
유산균의 여러 스트레인은 클로스트리디움 티로부티리컴(Clostridium tyrobutiricum), 에스티. 아우레우스(St . aureus), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 등과 같은 유해한 미생물을 파괴하는 박테리오신을 생성한다.
· 짧은 사슬 지방산의 생성
건강한 인체에서는 하루에 약 400mM 짧은 사슬 지방산이 생성되며, 가장 중요한 것은 아세트산, 프로피온산 및 부티르산이다. 이들은 장 내의 pH에 호의적으로 영향을 준다. 부티레이트는 니트로사민 및 과산화수소의 유전 독성 효과를 저해함으로써 대장암 발달 위험을 줄여주는 것으로 발견되었다. 또한, 부티르산은 대장의 종양 세포에서 아포토시스를 유도한다. 지방산은 염증전 사이토카인 TNFα, IL-1β, IL-6의 발현을 감소시킨다.
· 유전적 면역의 면역조절 및 향상을 통한 면역 반응의 자극
생균제 박테리아는 필요한 면역 반응과 과잉 면역 반응 사이의 미묘한 균형을 조절한다. IL-10의 유도의 자극을 이끄는 생균제 스트레인은 대장의 염증 질환에 걸린 사람에게 적절하다. 면역조절 효과는 스트레인 특이적이다. 락토바실리 및 비피도박테리아의 여러 스트레인이 조사되며, 이의 일부는 TNFα의 감소 및 IL-10의 증가를 이끈다(McCarthy, 2003).
락토바실리 및 비피도박테리아는 베타-갈락토시다아제 활성을 가져 락토즈 농도를 감소시킨다. 이는 락토즈 민감성으로 고통받는 사람에 유익하다. 일부 비피도박테리아 스트레인에 의한 B-복합 비타민의 생성이 유의하며, 위에서 언급하였다. 락토바실리는 이의 단백질 가수분해 복합체를 통해 단백질 분해에 기여하며, 이에 따라 인간에 의한 단백질 흡수를 촉진한다. 일부 비피도박테리아는 무기 질소를 소화할 수 있으며, 후속적으로 고수준의 발암성일 수 있는 암모니아의 농도를 낮출 수 있다.
· 항산화 효과
조직 내에서 산소 라디컬의 증가된 축적은 세포에 손상을 야기할 수 있다. 활성 산소의 형성은 특정 약물의 사용, 증가된 알코올 소비, 스트레스 및 기타 인자들과 같은 인자들과 관련있을 수 있다. 증가된 산화는 나이, 동맥경화증, 암성 질환뿐만 아니라 일부 소화성 질환 등과 연관된다. 신체는 독성 산소에 대해 여러 방어를 나타내지만, 이러한 시스템의 기능을 향상시키기 위해 항산화제를 소비하는 것이 중요하다. 일부 미생물은 SOD(수퍼옥시드 디스무타아제), 카탈라아제 효소, 글루타티온 리덕타아제 효소 등과 같은 항산화 효소를 갖는다.
· 혈청 콜레스테롤의 환원
콜레스테롤은 장 세포에 의해 합성되며, 장 내로 방출된다. 콜레스테롤의 또 다른 일부는 담즙 분비 및 음식물로부터 비롯된다. 미생물 생태는 콜레스테롤 수준에 영향을 준다. 일부 미생물은 타우린 및 글리신을 이용하여 담즙염을 분해한다. 따라서, 담즙염-순환은 방해되고, 간은 새로운 담즙염의 합성을 위해 여분의 콜레스테롤을 집결시키며, 이는 혈청 콜레스테롤의 감소를 이끈다. Gilliland 등(1985)은 엘. 아시도필러스(L. acidophilus)의 콜레스테롤 소화 능력을 연구하였다.
· 항고혈압 활성을 갖는 생물활성 펩타이드 및 칼슘과 마그네슘의 흡수를 향상시키는 펩타이드의 분비
유즙 단백질을 분해함으로써 유산균은 저분자량 펩타이드를 방출한다. 이의 일부는 안지오텐신-전환 효소(ACE)를 저해한다. ACE는 안지오텐신 I으로부터 디펩타이드를 분할하며, 이는 안지오텐신 II(알도스테론 생성을 유도하는 혈관 수축 신경)로 전환되고, 이는 소듐 이온의 농도 및 혈압의 상승을 일으킨다. 가장 잘 연구된 효과는 엘. 헬베티쿠스(L. helveticus)의 특정 스트레인의 단백질 가수 분해 활성 중에 방출되는 올리고펩타이드 Ile, Pro-Pro 및 Val-Pro-Pro의 항고혈압 효과이다. 이들은 ACE의 강한 저해를 유도한다. 항고혈압 효과는 임상 시험에서 확인된다.
현재, 예를 들어 엘. 라모서스(L. rhamnosus) GG(Saxelin M. Lactobacillus GG - 임상 기록을 통한 인간 생균제 스트레인. Food Rev Int 1997, 13:293-313)과 같은 성공적으로 사용되는 여러 상업적 생균제가 있다. 다른 산업적 생균제는 과세균증(dysbacteriosis) 중에 장 마이크로플로라의 안정화에 사용되는 엘. 퍼멘텀(L. fermentum) 39이다(1).
SOD 활성 및 병원균에 대한 활성을 갖는 박테리아 스트레인 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) ME3가 존재한다(Mikelsaar et al., 2007).
화제의 문제는 유산균의 생균제 스트레인의 식별 및 분리, 그리고 위장관 내에서 고 생존률, 항산화 효과, 대장의 상피층에 대한 강한 부착성, 콜레스테롤 감소 능력, 면역 조절 및 항-염증 효과, ACE 저해 활성과 같은 다수의 유용한 특성을 갖는 다중 박테리아성 산물의 제조에 이를 이용하는 것이다.
본 발명의 목적은 유익한 건강한 특성을 갖는 생균제 유산균의 스트레인을 식별 및 선별하는 것이며, 이는 여러 기능적 효과를 갖는 생균제 제조물을 생성하는데 사용될 것이다.
본 발명의 목적인 생균제 제조물은 유산균의 3가지 생균제 스트레인, 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) 7/12(NBIMCC(National Bank for Industrial Microorganisms and Cell Cultures)에 제 8720호로 기탁됨), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) F12(NBIMCC에 제 8722호로 기탁됨) 및 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) A1(NBIMCC에 제 8721호로 기탁됨)으로 구성되는 다중 박테리아성 조합이다. 상기 산물은 다수의 건강적 이익을 갖는다: 항산화 효과; 담즙염의 가수분해 및 콜레스테롤의 직접적 흡수에 기인한 콜레스테롤 농도의 감소; 염증전 사이토카인 "인터루킨-8"의 수준의 감소에 의한 항염증 면역 조절 효과; 고혈압에 관여하는 효소(ACE)를 저해하는 생물활성 펩타이드를 방출하는 능력.
또한, 본 발명의 목적은 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) 7/12 NBIMCC No. 8720, 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) F12 NBIMCC No. 8722 및 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) A1 NBIMCC No. 8721의 새로운 스트레인 및 이의 유익한 특성을 제공하는 것이다.
생균제 스트레인 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) F12 NBIMCC No. 8722는 항산화 활성 및 상피 세포에 대한 현저한 부착성 모두를 갖는다.
생균제 스트레인 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) 7/12 NBIMCC No. 8720은 일련의 하기의 유용한 특성을 갖는다: 위장관 내에서 높은 생존성, 대장의 상피층에 대한 강한 부착성, 콜레스테롤을 감소시키는 능력 및 염증전 사이토카인 "인터루킨-8"의 수준을 감소시키는 것에 의한 항-염증 효과.
생균제 스트레인 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) A1 NBIMCC No. 8721은 강한 항-ACE 효과를 갖는다.
본 발명의 목적은 새로운 생균제 스트레인 및 그 생균제 다중 박테리아성 제조물을 이용하여, 약제 및 산업 분야에서 고혈압, 동맥경화증 및 과콜레스테롤혈증, 면역 약화 및 장관에서의 염증 진행, 장내균총의 저해된 균형과 같은 사회적으로 중요한 질병들을 예방하기 위한 용도에 관한 것이다.
도 1: 효소 XhoI .으로 가수분해 및 24시간 동안 5volts/centimeter에서 임펄스 1s-12s 후에, 엘. 플란타럼(L. plantarum) F12의 펄스-전기영동 스트레인-특이적 DNA 프로파일. 분자 마커 - λ-DNA HindIII(0.1-200kbp).
도 2: 효소 ApaI .으로 가수분해 및 24시간 동안 5volts/centimeter에서 임펄스 2s-28s 후에, 엘. 가세리(L. gasseri) 7/12의 펄스-전기영동 스트레인-특이적 DNA 프로파일. 분자 마커 - λ-Ladder DNA(50-1000kbp).
도 3: 효소 SmaI .으로 가수분해 및 26시간 동안 5.2volts/centimeter에서 임펄스 5s-30s 후에, 엘. 헬베티쿠스(L. helveticus) A1의 펄스-전기영동 스트레인-특이적 DNA 프로파일. 분자 마커 - λ-Ladder DNA(50-1000kbp) 및 λ-DNA HindIII(0.1-200kbp).
도 4: 상피 세포 Caco-2에 대한 엘. 플란타럼(L. plantarum) F12의 부착.
도 5: 엘. 헬베티쿠스(L. helveticus) A1의 ACE-저해 효과의 도표. 가로 좌표 - ㎕ 펩타이드 추출물, 세로 좌표 - % ACE-저해율
도 6: 엘. 헬베티쿠스(L. helveticus) A1의 펩타이드 농축물의 거친 분별
도 7: 스트레인 엘. 헬베티쿠스(L. helveticus) A1에 대한 최고 항-ACE 활성을 갖는 예비 분획의 펩타이드 분획의 정밀 역상 정제.
도 8: 스트레인 엘. 헬베티쿠스(L. helveticus) A1에 대한 선행 정제 사이클의 활성 분획의 이온-교환 정제.
도 2: 효소 ApaI .으로 가수분해 및 24시간 동안 5volts/centimeter에서 임펄스 2s-28s 후에, 엘. 가세리(L. gasseri) 7/12의 펄스-전기영동 스트레인-특이적 DNA 프로파일. 분자 마커 - λ-Ladder DNA(50-1000kbp).
도 3: 효소 SmaI .으로 가수분해 및 26시간 동안 5.2volts/centimeter에서 임펄스 5s-30s 후에, 엘. 헬베티쿠스(L. helveticus) A1의 펄스-전기영동 스트레인-특이적 DNA 프로파일. 분자 마커 - λ-Ladder DNA(50-1000kbp) 및 λ-DNA HindIII(0.1-200kbp).
도 4: 상피 세포 Caco-2에 대한 엘. 플란타럼(L. plantarum) F12의 부착.
도 5: 엘. 헬베티쿠스(L. helveticus) A1의 ACE-저해 효과의 도표. 가로 좌표 - ㎕ 펩타이드 추출물, 세로 좌표 - % ACE-저해율
도 6: 엘. 헬베티쿠스(L. helveticus) A1의 펩타이드 농축물의 거친 분별
도 7: 스트레인 엘. 헬베티쿠스(L. helveticus) A1에 대한 최고 항-ACE 활성을 갖는 예비 분획의 펩타이드 분획의 정밀 역상 정제.
도 8: 스트레인 엘. 헬베티쿠스(L. helveticus) A1에 대한 선행 정제 사이클의 활성 분획의 이온-교환 정제.
락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) 7/12 NBIMCC No. 8720 및 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) F12 NBIMCC No. 8722는 건강한 지원자의 장관으로부터 분리된다. 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) A1 NBIMCC No. 8721은 GRAS 상태를 입증하는(보통 안전한 것으로 인정되는) 홈매이드 화이트 치즈로부터 분리된다. 이들 3가지 스트레인의 종 계열 및 스트레인 식별은 16S 리보좀 유전자의 정밀 DNA-기초 방법(2) 시퀀싱, ARDRA, 펄스 전기영동, AFLP를 통해 확립된다.
상기 3가지 스트레인의 표현형 식별은 API 50 CHL System(BioMerieux, France)을 이용하여 수행된다.
스트레인은 AFLP 및 펄스 전기영동 수단에 의해 분자적으로 식별된다. 상기 3가지 스트레인의 식별 및 이들의 스트레인-특이적 DNA 프로파일을 얻는데 사용되는 2가지 주요 분자적 방법은 상술한 문헌(Dimitrov Zh. et al., 2008)에 기재되어 있다. 도 1에, 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) F12 NBIMCC No. 8722의 펄스 전기영동 DNA 프로파일을 나타내었으며, 도 2에 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) 7/12 NBIMCC No. 8720의 전기영동 DNA 프로파일을 나타내었으며, 그리고 도 3에 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) A1 NBIMCC No. 8721의 펄스 전기영동 DNA 프로파일을 나타내었다.
락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) F12 NBIMCC No. 8722는 1-2mm 크기를 가진 화이트 S-콜로니를 형성한다. 박테리아 세포는 짧고(0.9-1.2 X 3-8㎛), 둥근 코너를 갖는다. 주요 배양 배지는 MRS 브로스 및 아가(OXOID)이다. 식별은 Api 웹 데이터베이스(API 50CHL 스트립) 및 MicroLog M5.1.1 데이터베이스(Biolog AN Microplate)를 이용하여 Bergey의 매뉴얼(2009)에 따라 수행된다. ARDRA 프로파일은 상기 스트레인 엘. 플란타럼에 대해 전형적이다. 가용성 세포 단백질의 프로파일은 엘. 플란타럼(ATCC)의 프로파일과 동일하다. 이는 0.1%로 접종한 후에 MRS 브로스에서 성장된다. 배양은 37℃에서 약 18-24시간 수행된다. 브로스 배지 및 대기는 배양 중에 어떠한 예비적 무산소화를 필요로 하지 않는다. 상기 스트레인은 MRS 아가 상에서 혐기 환경에서 48시간 동안 성장된다.
락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) 7/12 NBIMCC No. 8720은 1-2mm의 크기를 가진 화이트 S-콜로니를 형성한다. 박테리아 세포는 짧고(0, 6-0.8 X 3.0-5.0㎛), 둥근 코너를 갖는다. 주요 배양 배지는 MRS 브로스 및 아가(OXOID)이다. 스트레인은 Api 웹 데이터베이스(API 50CHL 스트립) 및 MicroLog M5.1.1 데이터베이스(Biolog AN Microplate)를 이용하여 Bergey의 매뉴얼(2009)에 따라 식별된다. ARDRA 프로파일은 상기 스트레인 엘. 가세리에 대해 전형적이다. 가용성 세포 단백질의 프로파일은 엘. 가세리 33323(ATCC)의 프로파일과 동일하다. 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) 7/12는 0.1%로 접종한 후에 MRS 브로스에서 성장된다. 배양은 37℃에서 약 18-24시간 수행된다. 브로스 배지 및 대기는 배양 중에 어떠한 예비적 무산소화를 필요로 하지 않는다. 상기 스트레인은 MRS 아가 상에서 혐기 환경에서 48시간 동안 성장된다.
락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) A1 NBIMCC No. 8721은 1-2mm의 크기를 가진 화이트 R-콜로니를 형성한다. 박테리아 세포는 3.0-5.0㎛의 길이를 갖는다. 기본 배양 배지는 MRS 브로스 및 아가(OXOID), 그리고 미생물용 멸균 탈지 우유, 10% 건물량(dry matter)(OXOID)이다. 스트레인은 Api 웹 데이터베이스(API 50CHL 스트립) 및 MicroLog M5.1.1 데이터베이스(Biolog AN Microplate)를 이용하여 Bergey의 매뉴얼(2009)에 따라 식별된다. ARDRA 프로파일은 엘. 헬베티쿠스에 대해 전형적이다. 가용성 세포 단백질의 프로파일은 엘. 헬베티쿠스 15009(ATCC)의 프로파일과 동일하다. 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) A1은 0.1%로 접종한 후에 MRS 브로스에서 성장된다. 배양은 37℃에서 약 18-24시간 수행된다. 브로스 배지 및 대기는 배양 중에 어떠한 예비적 무산소화를 필요로 하지 않는다. 상기 스트레인은 MRS 아가 상에서 혐기 환경에서 48시간 동안 성장된다. 상기 스트레인은 0.1%로 접종하고 37℃에서 18-24시간 동안 배양한 후 멸균 탈지 우유 상에서 성장된다.
스트레인
락토바실러스
플란타럼
(
Lactobacillus
plantarum
) F12
NBIMCC
No. 8722의 기능적 특성
● 항산화 효과의 측정
스트레인 엘. 플란타럼(L. plantarum) F12는 항산화 특성을 가지며, 이는 400 이상의 락토바실리로부터 선별된다. 항산화 특성에 대한 선별을 위해, 스트레인들을 MRS 브로스에서 24시간 배양하고, 3500g, 4℃에서 10분간 원심분리한다. 염수로 세정 후, 세포들을 1.15% KCl에 재부유하여 1ml에 1x109 cells로 준비한다. 세포 부유물을 아이스 배스에서 5분간 초음파처리(Branson B-12 Sonic power Company)한 다음, -20℃에서 10분간 둔다. 상기 부유물을 10,000g, 4℃에서 10분간 원심분리한다. 그 상층물을 무세포성 추출물로 사용한다. 3가지 타입의 활성을 측정한다:
- 총 항산화 활성
ORAC
총 항산화 활성을 측정하는 주요 방법은 ORAC(Oxygen radical absorbance capacity)이다. 그 결과를 109 미생물 세포의 TROLOX 당량으로 나타낸다. Cao 등(1995)에 의한 방법이 사용된다. 원리는 다음과 같다: 기질 OI-피코에리트린(Sigma Chemical Co.)을 라디컬 발생제 2.2 vToI-아조비스(2-아미디노프로판) 디하이드로클로라이드(AAPH; Waco Chemical USA)에 의해 산화제 공격이 이루어지도록 한다. 스탠다드 용액 TROLOX(6-하이드록시-2 ,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카르복시산, Trolox; Aldrich)은 200ml의 0.2M 인산염 버퍼에 상기 물질 5mg을 용해하여 준비한다(모액). 작업 용액은 모액 1ml와 인산염 버퍼 9ml를 혼합하여 획득된다.
항산화 특성을 갖는 시료의 존재하에서, 피코에리트린의 산화는 다소 감소된다. 상대 형광도를 535nm(여기) 및 595nm(방출)의 길이를 갖는 파장을 이용하여 각각, 60분간 측정한다. 하기 식이 사용된다:
ORAC 값 = X K (S시료 - S블랭크) / (S트로록스 - S블랭크)
여기서, X는 마이크로리터로 시료 체적이며, K는 희석 계수이다. S - 형광 곡선의 면적
- 일반적
항라디컬
활성
자유 라디컬을 포획하는 물질은 화합물 1,1-디페닐-2-피크릴하이드라진(DPPH)의 염색 강도의 감소 정도에 기초하여 각 염색에 대해 측정된다. 라디컬 포획 활성의 강도는 DPPH의 자주색의 변색 정도에 비례한다. 해당 스트레인으로 발효된 우유를 원심분리하고, 그 상층물을 디에틸 에테르로 추출한다. 그 다음 에테르층을 증발시키고, 잔류물을 메탄올에 용해하는 공정을 수행한다. 이 용액 0.1ml 체적을 DPPH 용액(메탄올에 용해된 40㎍/ml) 1.4ml와 혼합한다. 라디컬 포획 활성은 상기 시료와 빈 시료 사이의 517nm에서의 흡광도 차이로 정의된다[A517(빈 시료) - A517(시료)].
-
SOD
활성
시험은 Chang & Hasan(1997)에 따라 수행된다. 스트레인들을 브로스(스트렙토코시에 대해 M17, 락토바실리에 대해 MRS)에서 성장시키고, 배양 후에 그 배양물을 원심분리하고, 0.1mM EDTA(pH 7.8)로 인산염 버퍼로 세정하고, 동일한 버퍼에 재부유한 다음, 초음파처리한다. 17000g에서 원심분리하고, 상기 인산염 버퍼에 대해 24시간 동안 투석한다. 20000g에서 다시 원심분리한다. 무세포 추출물의 총 단백질 농도를 Lowry에 따라 측정한다. 두 가지 모두의 효소 활성을 특수 시험 키트(SIGMA)를 제조자의 지시에 따라 사용하여 정의한다. SOD를 잔틴 옥시다아제를 이용하여 컨주게이티드 효소 시스템에서 시토크롬 C 방법에 의해 측정한다. 원리는 다음과 같다: 잔틴 옥시다아제는 시토크롬 C가 환원되는 동안 잔틴을 산화한다. SOD 활성을 갖는 시료의 존재하에서, 시토크롬 C의 환원은 다소 저해되며, 그 이유는 두 양성자가 시토크롬 C로 이송되는 것 대신에 SOD로부터 과산화 라디컬에 바인딩하기 때문이다.
표 1은 여러 가지 항산화 활성의 측정 결과를 보여준다: ORAC 시험에 의한 총 항산화 활성, 총 항라디컬 활성 및 SOD 활성.
| 활성 | 온전한 세포(Intact cells) | 무세포 추출물 |
| 총 항산화 활성 ORAC, 트로록스 eq./109 cells |
1488 ± 72 n = 5 |
1764 ±110 n = 5 |
| 총 항라디컬 활성, A517(빈 시료) - A517(시료) | 0.19 ± 0.02 n = 5 |
0.32 ± 0.04 n = 5 |
| 수퍼옥시드 디스무타아제 활성 | 38.4 ± 2.4 U/mg 단백질 n = 3 |
유의한 총 항산화 활성이 무세포 추출물뿐만 아니라 스트레인 엘. 플란타럼(L. plantarum) F12의 온전한 세포 모두에서 발견된다. SOD 활성면에서, 이 스트레인의 무세포 추출물은 여러 박테리아종의 모든 시험된 락토바실리를 능가한다.
● 상피 세포에 대한
부착성의
측정
상피 세포주 Caco-2 및 HT29를 10% 우태아혈청이 함유된 DMEM 배지(Dilbecco's modified Eagle's medium, Gibco, UK)에서 모노레이어로 배양한다. 배양 온도는 5% CO2를 함유하는 수 포화 분위기에서 37℃이다. 약 90%의 형성 모노레이어에서, 세포들을 0.25% 트립신 및 10mM EDTA 용액으로 37℃에서 10분간 배양을 통해 패시징한다. 부착성을 측정하기 위해, 상기 진핵 세포들을 2x105 cells/ml의 농도에서 6-웰 클러스터 배양 디쉬에 시딩한다. 배지를 총 10일간 2일마다 갈아주며, 한편 모노레이어가 형성되고(3-4일), 세포 리셉터가 성숙된다. 부착 후, 모노레이어를 PBS 버퍼로 2회 세정한다. 항생제를 함유하지 않은 DMEM 2ml에 담긴 108 cells/ml의 농도의 박테리아 배양물을 상기 모노레이어에 첨가한다. 5% CO2를 함유하는 수 포화 분위기에서 37℃에서 60분간 배양을 수행한다. 그 다음 웰들을 PBS로 5회 세정하고, 메탄올로 3분간 고정한다. 20 상피 세포에 부착된 박테리아의 수를 센다. 시험은 10 현미경 필드를 기록하는 것을 포함한다.
도 4는 상피 세포 Caco-2에 대한 스트레인 엘. 플란타럼(L. plantarum) F12의 부착 사진을 나타낸다. 진핵 세포에 부착된 박테리아의 평균 수로 표현된, 상기 스트레인의 부착 결과를 표 2에 나타낸다. 시험은 세포주 Caco-2 및 HT-29, 각각 모두에서 부착성을 평가하기 위해 3회 수행되며, 그 결과에 대해 평균을 낸다.
| 스트레인 | Caco-2 진핵 세포에 부착된 박테리아의 평균 수 | HT-29 진핵 세포에 부착된 박테리아의 평균 수 |
| 엘. 플란타럼(L. plantarum) F12 | 25 | 29 |
스트레인 엘. 가세리(
L.
gasseri
) 7/12
NBIMCC
No
. 8720의 기능적 특성
● 상피 세포에 대한
부착성의
측정
방법은 상술한 바와 같다. 도 5는 상피 세포 Caco-2에 대한 스트레인 엘. 가세리(L. gasseri) 7/12의 부착 사진을 나타낸다. 진핵 세포에 부착된 박테리아의 평균 수로 표현된 상기 스트레인의 부착 결과를 표 3에 나타낸다. 시험은 세포주 Caco-2 및 HT-29, 각각 모두에서 부착성을 평가하기 위해 3회 수행되며, 그 결과에 대해 평균을 낸다.
| 스트레인 | Caco-2 진핵 세포에 부착된 박테리아의 평균 수 | HT-29 진핵 세포에 부착된 박테리아의 평균 수 |
| 엘. 가세리(L. gasseri) 7/12 | 20 | 22 |
● 항염증 면역 조절 효과의 측정
염증 사이토카인의 유도를 증가시키는 것은 염증성 장 질환(IBD)을 가진 사람에서 매우 바람직하지 않다. 염증 사이토카인의 합성은 신호 펩타이드 인터루킨 10(IL-10)에 의해 저해되며, 이는 나이브 T-헬퍼 세포 또는 마크로파지에 의해 생성된다. 인간 모노사이트 세포주 U-937은 세포독성 TNF-α 및 IL-1의 유도의 평가뿐만 아니라 신호 펩타이드 IL-10의 유도를 측정하는데 적절한 것으로 입증되었다.
항원-제시 세포의 상기 두 신호 펩타이드 TNF-α 및 IL-10의 정량적 검출은 면역 조절 효과를 측정하는데 사용된다: 인간 모노사이트 세포주 U-937(ATCC)의 분화된 마크로파지. 상기 세포주의 유지는 10% 우태아혈청(ATCC 30-2020), 4.5g/l 글루코즈, 10mM HEPES, 1mM 소듐 피루베이트, 2mM L-글루타민, 1.5g/l 소듐 비카보네이트, 100U/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 1640 배지(ATCC 30-2001)에서 37℃ 및 5% CO2에서 수행된다. 밀리리터당 2 x 105 내지 1 x 106 cells 범위 내로 유지한다. 약 1 x 106의 밀도에 도달하면, 세포들을 원심분리하고, 배지를 갈아준다. 사이토미터로 기록된 세포 함량은 2 x 105이다. 48-웰 클러스터 배양 디쉬에서, 성장 배지에 첨가된 5㎍/ml PMA(포볼(phorbol) 12-미리스테이트-13-아세테이트, SIGMA)의 도움으로 CO2 배양기에서 48시간 동안 밀리리터당 1 x 106 cells(웰에 대해 5 x 105)이 마크로파지로 분화될 수 있다. 분화되고 부착된 마크로파지를 PBS 버퍼(Dulbecco's phosphate-buffered saline, GibcoBRL)로 2회 세정하고, PMA없이 48시간 동안 새로운 배지로 배양한다. 부착된 마크로파지가 함유된 각 웰에서 배지를 흡입한 후, ml당 1 x 106의 농도로 0.5ml 박테리아 세포를 첨가하고, 마크로파지의 성장 배지에 부유시킨다. 세포들을 CO2 배양기에서 24시간 동안 배양한다.
- 유산균의 신호 펩타이드 TNF -α의 유도 평가를 샌드위치 ELISA에 의해 수행한다. 배양 마지막에, 상층물을 수집하고, 원심분리하여 박테리아 및 인간 세포를 제거한다. 그 결과 형성된 상층물 200㎕을 R&D Systems(Human TNF-α/TNFSF1A Immunoassay, Cat. # DTA00C)의 특수 키트를 통한 제조자의 지시에 따른 TNF-α의 측정에 사용한다. 간략히: 면역 디쉬들을 특별한 방식으로 TNF-α를 잡고있는 인간 TNF-α에 대한 모노클로날 항체로 덮는다. 세정 후, 웰을 서양고추냉이 관산화효소에 연결된 TNF-α에 대한 폴리클로날 항체로 처리한다. 그 후에, 상기 기질, 과산화수소 및 테트라메틸벤지딘을 첨가하고, 어둠에서 20분간 실온에서 효소 반응 후, 그 반응을 2N 황산으로 마무리한다. 흡광도를 450nm에서 측정한다. TNF-α 농도의 계산을 위해 스탠다드들을 사용하며, 스탠다드 곡선을 도출한다.
- 유산균의 신호 펩타이드 IL -6의 유도 평가를 샌드위치 ELISA에 의해 수행한다. 검출 원리는 상술한 바와 유사하다. 평가 중에 분석 ELISA 키트가 사용되며, 그 다음 정량 평가가 제조자의 지시에 따라 수행된다.
- 유산균의 신호 펩타이드 IL -10의 유도 평가를 샌드위치 ELISA에 의해 수행한다. 평가 중에 분석 ELISA 키트가 사용되며, 그 다음 정량 평가가 제조자의 지시에 따라 수행된다.
각 분리된 스트레인에 대한 5개의 사이토카인 TGF-β, IL-8, IL-6, IL-10 및 TNFα의 평가를 3회 수행한다. 표 4는 상기 5 사이토카인에 대한 평균 유도 결과를 제공한다. 중간 부착성을 갖는 스트레인 엘. 가세리(L. gasseri) 7/12는 다른 것들 중에 가장 성공적인 항염증 스트레인이다. 이는 IL-10과 TNF-α 사이에 우수한 상관성을 가지며, IL-8 및 TGF-β의 유의한 감소를 가지며, IL-6의 유의하지 않은 감소를 갖는다. 염증전 사이토카인 IL-8은 상피 세포에 의해 합성된다. 평가를 위해 세포주 Caco-2 및 HT-29가 사용된다. IL-8의 증가된 수준은 호중구 세포의 증가된 활성을 이끌 수 있으며, 이에 따라 대장에서 염증 문제를 일으킬 수 있다. IL-8의 수준을 감소시킬 수 있는 스트레인의 발견은 위장관의 염증 질환의 예방을 위한 박테리아 제조물의 확립에 필수적이다. 스트레인 엘. 가세리(L. gasseri) 7/12는 이러한 점에서 가치있다. 엘. 가세리(L. gasseri) 7/12를 이용한 상피 세포의 자극 결과를 표 5에 나타낸다.
| 스트레인 | IL-10 ng/ml |
TNF-α ng/ml |
TGF-β ng/ml |
IL-6 ng/ml |
| 컨트롤(U-937) | 0.10 | 0.2 | 0.88 | 27.2 |
| 엘. 가세리(L. gasseri) 7/12 | 2.3 | 0.7 | 0.82 | 28.7 |
| 스트레인 | IL-8 ng/ml |
TGF-β ng/ml |
| 컨트롤(HT-29) | 8.7 | 0.37 |
| 엘. 가세리(L. gasseri) 7/12 | 6.2 | 0.30 |
● 콜레스테롤 수준을 감소시키는 능력의 측정
-
담즙염
가수분해효소(
BSH
) 활성
스트레인들을 상기 주어진 브로스에 2가지 가장 중요한 담즙염, 소듐 타우로콜레이트(TCA) 및 소듐 글리코콜레이트(GCA)를 첨가한 것을 제외하고, 상기 주어진 브로스 배지에서 최적 조건하에서 성장시킨다. 염의 농도는 1mM이다. 이들은 상기 브로스의 마이크로여과에 의한 멸균 후에 첨가된다. 접종은 1%이며, 배양 시간은 24시간이다. 접종되지 않은 브로스를 컨트롤로 사용한다. BSH 활성은 1분간 디컨주게이트 나노몰 TCA 및 GCA로 측정한다. 측정은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 수행한다. 사용된 컬럼은 울트라스피어 ODS 컬럼, 80옹스트롬, 15cm, 3㎛ 직경의 필러 그레인이다. 사용된 원심분리기는 210nm에서의 SHIMADZU UV 검출기이다. 유리 및 컨주게이티드 담즙산은 구배 역상 모드에서 검출된다. 용매 A는 인산으로 조정된 pH 4.3의 0.03M 소듐 아세테이트에 담긴 65% 메탄올이다. 용매 B는 HPLC 품질을 가진 메탄올이다. 용리 프로그램은 15% 용리액 B에서 8분간 등용매 단계, 그 다음 17분간 85%로의 선형 구배이다. 이 공정은 85%에서 5분의 등용매 단계가 후속된다. 주입량은 10㎕이다. BSH 활성값은 분당 및 24시간 배양 시간에 1010 cells로부터 방출된 콜린산으로 표현된다.
- 콜레스테롤의 직접적인 감소
스트레인들을 24시간 동안 각 배지에 1%의 농도로 접종한다. 브로스 배지는 0.3% Oxgal 및 ml당 100㎍의 수용성 콜레스테롤(콜레스테롤-PEG600, SIGMA)을 함유한다. 배양 후, 원심분리하여 세포들을 펠릿화하고, 상층물 0.5ml를 80℃에서 20분간 가열하여 4ml의 메탄올 2M KOH로 처리한다. 이는 5ml의 헥산으로 추출되고, 헥산층 4ml을 시험관으로 이송하고, 60℃에서 질소로 증발시킨다. 건조 잔류물을 0.5ml의 이소프로판올에 용해하고, 콜레스테롤 함량을 Boeringer Manhaim의 분석 키트로 측정한다. 콜레스테롤 감소 정도는 접종되지 않은 컨트롤 배지를 기초로 측정된다.
콜레스테롤의 감소와 관련된 2가지의 주요 활성, 콜레스테롤 수준의 직접적인 감소 및 담즙산염(BSH)에 대한 디컨주게이티드 활성의 결과로서 혈청 콜레스테롤의 간접적인 콜레스테롤 감소를 조사한다. 주로 미생물의 세포벽 성분 상에서의 흡착에 기인한 콜레스테롤의 직접적인 제거에서, 잔류 콜레스테롤은 방법론적인 부분에 기재된 바와 같이 측정된다. 콜레스테롤의 농도 측정은 효소 시험을 이용하여 수행된다. 측정은 3회 이루어지며, 그 결과의 평균을 구했다. 표 6은 콜레스테롤의 퍼센트 감소로 표현된 직접적인 항콜레스테롤 활성의 결과를 나타낸다.
| 스트레인 | % 콜레스테롤 감소 |
| 엘. 가세리(L. gasseri) 7/12 | 36.2 |
BSH 디컨주게이티드 활성은 혈청 콜레스테롤 수준에 간접적으로 영향을 준다. BSH 활성을 갖는 스트레인은 담즙산염을 가수분해한 다음, 디컨주게이티드 담즙산은 장관의 출구로 이송된다. 담즙산염은 체내에서 재순환되고, 간에서 이의 농도가 감소된 후에, 콜레스테롤의 일부는 담즙산, 그리고 후속적으로 담즙산염의 생성을 위해 전환된다(담즙산은 아미노산 타우린 및 글리신과 컨주게이트된다). 그럼에도 불구하고, 혈청 콜레스테롤의 수준은 저하되는 것으로 기대된다. 표 7에 3회 시험한 다음 그 결과를 평균낸 후의 엘. 가세리(L. gasseri) 7/12의 BSH 활성 결과를 나타낸다.
| 스트레인 | % 담즙산염의 디컨주게이션 |
| 엘. 가세리(L. gasseri) 7/12 | 60.1 |
스트레인 엘.
헬베티쿠스
(
L.
helveticus
) A1
NBIMCC
No
. 8721의 기능적 특성
● 생물활성
ACE
-저해
펩타이드의
분비 능력의 측정
-
ACE
-저해 활성
0.1%의 접종으로 정제된 스트레인을 37℃에서 9% 탈지 우유에서 18시간 동안 배양한다. 50% 젖산으로 pH를 조정한 후에, 그 시료를 원심분리한다(5000g, 10분).상층물을 역상 카트리지에 투여하고, 물로 세정한다. 그 다음, 0.1% 트리플루오로아세트산에 담긴 60% 아세토니트릴로 용리한 다음, 증발시키고, 그 결과 형성된 추출물을 재구성한다. 그 추출물 또는 이의 희석물을 ACE에 대한 저해에 대해 분석한다.
총 펩타이드 추출물을 준비한다. 이의 체적이 20㎕이기 때문에, 펩타이드 추출물의 다른 희석물을 사용한 것을 제외하고, 통상의 시험으로 효소 반응을 수행한다. 효소 용액은 0.1U/ml의 활성을 갖는 40㎕이었다. 기질 히퓨릴-히스티딜-루신(hipuril-histidil-leucine)을 보레이트 버퍼(pH 8.3)에 용해하고, 190㎕의 체적을 갖는다. 상기 기질의 최종 농도는 6mM이며, 소듐 클로라이드의 최종 농도는 300mM이다. 반응은 37℃에서 30분간 수행한다. 시징(seizing)은 4n HCl 100마이크로리터로 수행하며, 공급물 히푸르산의 추출은 에틸 아세테이트 1ml로 수행한다. 용매 증발 후, 잔류물을 1ml의 물에 용해하고, 228nm에서 분광 광도계로 시험한다.
ACE 효소의 저해 퍼센트는 하기 식에 의해 기록된다:
여기서, A는 상위 반응하에서의 흡광도이며, C는 효소가 없는 경우의 흡광도이며, B는 펩타이드 추출물이 관여하지 않은 경우의 흡광도이다.
그래프를 작성하고, 가로 좌표에 펩타이드 추출물의 마이크로리터 - 20, 10, 5를 나타내고, 세로 좌표에 저해율을 퍼센트로 나타낸다. 저해 효과의 강도는 ACE 효소의 50% 저해를 일으키는 펩타이드 추출물의 체적으로서 그래프로 고려된다. 보다 작은 부피는 그 산물의 보다 우수한 ACE 저해 능력을 제시한다. 표 8은 스트레인 엘. 헬베티쿠스(L. helveticus) A1의 중요한 펩티다아제 활성을 제공하며, 이는 이 스트레인의 생물활성 펩타이드를 방출하는 능력에 주로 기초한다. 표 9는 정수에 가장 가깝도록 라운딩한 ACE의 % 저해율로 엘. 헬베티쿠스(L. helveticus) A1의 ACE-저해 활성을 제공한다.
| 스트레인 |
아미노-펩티다아제 N (PepN) |
X-프롤릴-아미노-펩티다아제 | 글루-아미노-펩티다아제 | 프로-이미노-펩티다아제 | 올리고-펩티다아제 |
엔도-펩티다아제 | 프로테아제 |
| (PepX) | (PepA) | (PIP) | |||||
| 엘. 헬베티쿠스(L. helveticus) A1 | 690 | 405 | 3 | 14 | 7 | 2 | 10 |
| 스트레인 | % ACE-저해 |
| 엘. 헬베티쿠스(L. helveticus) A1 | 88% |
엘. 헬베티쿠스(L. helveticus) A1에 대해 그래프를 도시하며(도 5), 이는 분석된 상층물의 희석물 1/2 및 1/4의 저해 효과를 정의한다. 주요 목적은 시료의 희석물에 미치는 항-ACE 효과의 강도를 측정하는 것이다. 가로 좌표에 시험에 사용된 상층물의 마이크로리터를 나타내고, 세로 좌표는 ACE의 저해 퍼센트를 나타낸다.
그 결과는 스트레인 엘. 헬베티쿠스(L. helveticus) A1이 강한 항-ACE 효과를 가짐을 보여준다.
- 스트레인 엘.
헬베티쿠스
(
L.
helveticus
) A1으로부터
ACE
-저해
펩타이드의
서열 결정
농축
펩타이드
추출물의 제조
각 스트레인의 상층물을 5000Da의 분자량 컷오프로 특수 한외여과 카트리지를 통해 원심분리 한외여과한다. 일반적으로 항-ACE를 나타내는 것을 찾는 저 분자량 소수성 및 중간의 소수성 펩타이드를 역상 카트리지 상에 농축한다. 특히, 이러한 시료들의 한외여과 후에, 트리플루오로아세트산을 0.1%로 첨가하고, 그 혼합물을 카트리지를 통해 통과한다. 펩타이드들이 보유된다. 0.1% TFA로 세정한 후, 0.1% TFA에 담긴 60% 아세토니트릴로 저 분자량 펩타이드를 용리한다. 증발 후, 펩타이드들을 0.1% TFA에 담긴 10% 아세토니트릴에 재부유하고, 조제용 역상 HPLC 컬럼 Nucleosil C18 상에 투여한다. 고성능 액체 크로마토그래피 장치 SHIMADZU에 2개의 펌프, 특정 온도를 유지하기 위한 성능을 가진 HPLC 컬럼 모듈, 흡광도 측정기 및 프렉션 콜렉터를 장착한다.
활성을 검증하기 위해, 모든 농축물들을 항-ACE 활성에 대해 측정한다.
크로마토그래프
분리 후
펩타이드
농축물의
거친 분별
상기한 바와 같이 HPLC 내로 주입된 시료를 역상 구배 분별에 적용한다. 아세토니트릴 구배는 0.1% TFA에서 0% 내지 80%이다. 펩타이드들은 214nm의 파장에서 검출된다. 분획 콜렉터에 의해 1ml의 분획을 포획한다. 거친 분별(coarse fractionation) 후에, 이러한 분획들을 진공 원심분리기에서 증발시키고, 0.1% TFA에 재부유한다. 이러한 활성을 갖는 분획들을 선별하기 위해 분획들의 항-ACE 활성을 시험한다. 스트레인 엘. 헬베티쿠스(L. helveticus) A1의 펩타이드 농축물의 거친 분별을 나타내는 크로마토그램을 도 6에 나타낸다.
고성능
역상
크로마토그래피 후에 정제된
펩타이드를
수집하기 위해 선별된 분획의 재분별
체계적인 정밀한 분별을 상기 거친 분별과 같은 원리로, 즉 역상으로 수행하며, 다만 구배의 경사를 보다 온화하게 한다. 스트레인 엘. 헬베티쿠스(L. helveticus) A1의 분획을 위한 구배 조건은 25-35% 아세토니트릴이다. 사용된 컬럼은 반-조제용 뉴클레오더 스핑크스(Nucleodur Sphinx)이다.
도 7에 스트레인 엘. 헬베티쿠스(L. helveticus) A1의 예비선별된 거친 펩타이드 분획의 정밀한 역상 재분별 시료의 크로마토그램을 나타낸다. ACE의 저해에 대한 효소 시험을 수행한 후에, 활성적인 항-ACE 분획을 굵은 선으로 마크한다. 선별된 펩타이드 분획의 정제를 위한 최종 단계는 이온 교환 HPLC 컬럼을 통한 정제이다. 컬럼은 리튬 형태의 벤젠설포네이트 이온-활성기를 갖는 고산성 양이온-교환 컬럼이다. 용리는 pH 3.0 내지 9.0에서 시트레이트 버퍼에서 pH 구배에 의해 달성된다.
도 7에서 스트레인 엘. 헬베티쿠스(L. helveticus) A1의 예비선별된 활성 항-ACE 분획에 대한 이온-교환 처리의 크로마토그램을 나타낸다. 항-ACE 활성을 갖는 단일 펩타이드를 굵은 선으로 마크한다.
펩타이드
시퀀싱
시퀀싱 원리는 페틸이소티오시아네이트를 이용한 수동 시퀀싱의 고전적 형식이다: 페틸 티오이소시아네이트로 출발: 펩타이드의 아미노 말단의 초기 유도체화; 100% 트리플루오로아세트산(TFA)을 이용한 유도체 N-말단 아미노산(CA)의 컷오프; 잔류 펩타이드로부터 유도체 N-말단 아미노산의 추출에 의한 분리; 40% (TFA) 처리에 의한 N-말단 아미노산의 페닐티오히단토인으로의 전환; PTH-아미노산의 HPLC 분석; 새로운 N-말단 아미노산을 위한 새로운 사이클. 작은 소수성 펩타이드의 경우에, 잔류 펩타이드로부터 유도체 N-말단 아미노산의 추출에 의한 분리 단계는 불가능하다. 이는 상기 펩타이드의 C-말단을 아릴아민-PVDF 멤브레인에 예비 고정함으로써 수행될 수 있다. 따라서, 펩타이드는 N-말단으로부터 마지막 C-말단 아미노산으로 시퀀싱될 수 있다. COOH-말단으로부터 펩타이드의 고정은 EDC(에틸-디메틸아미노프로필 카보디이미드) 처리에 의한 COOH-말단의 활성화 및 활성화된 카르복시기와 상기 멤브레인의 아릴아민 분자의 후속 반응 후에 가능하다. 표 10은 스트레인 엘. 헬베티쿠스(L. helveticus) A1에 의해 방출되는 항-ACE 펩타이드의 서열을 나타낸다.
| 스트레인 | 항-ACE 활성 % |
펩타이드 서열 |
| 엘. 헬베티쿠스(L. helveticus) A1 | 78.0 | Ala-Leu-Pro-Met |
다중 박테리아 제조물은 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) 7/12 NBIMCC No. 8720, 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) F12 NBIMCC No. 8722 및 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) A1 NBIMCC No. 8721의 동결 건조 스트레인을 함유한다. 상기 3 스트레인들은 각각 5리터의 실험실 발효 챔버에서 배지로서 우유에서 생물량 축적을 위해 각각 성장되며, 이는 접종량이 1%이고, pH는 소듐 하이드록시드로 5.7로 유지되어, 영양 목적으로 0.2% 이스트 자가분해 물질이 보충된 알칼린 프로테아제(Springer Biotec)로 가수분해된다. 접종은 정지기 시작까지 계속된다. 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) F12 및 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) A1에 대해 약 109 그리고 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) 7/12에 대해 2x108의 풍부한 바이오매스를 함유하는 3 배양물로, 산업적 발효제를 우유 배지에 접종하며, 이는 접종량이 2%이고, 영양 목적으로 0.2% 이스트 자가분해 물질의 첨가로 알칼린 프로테아제(Springer Biotec)로 가수분해된다. pH는 소듐 하이드록시드로 5.7로 유지된다. 그 결과물인 3 생균제 스트레인의 바이오매스 혼합물을 산업용 동결 건조기에 투여한다. 승화 건조가 -28℃ 내지 -29℃에서 수행된다. 최종 가열은 30℃까지이다. 잔류 수분은 4%이다. 그 혼합물을 불활성(질소) 분위기에서 패킹한다. 이러한 기술적 사이클 중에 상기 스트레인들의 치사율을 감소하기 위해 특별한 측정을 수행한다. 발효, 동결 건조 및 패키징의 파라미터가 최적화된다. 상기 스트레인들의 생존율 및 활성을 현대 분자생물 기술(실시간 PCR)에 의해 조절한다. 생균제 효과의 존재 및 강도를 고-정밀 기술 - 고성능 액체 크로마토그래피(담즙산염의 가수분해, 생물활성 펩타이드의 분석), 가스 크로마토그래피(콜레스테롤-감소 활성의 측정), 실시간 PCR(스트레인의 활력 및 그 수의 측정), 스펙트럼 장치(항산화 활성의 측정, 면역조절 활성의 측정)을 이용하여 조절한다.
사용할 준비가 된 동결건조된 다중 박테리아 제조물은 적어도 109의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) 7/12, 2x109의 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) A1, 9x109의 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) F12의 상기 3가지 생균제 스트레인의 살아있는 박테리아(1g당 생 세포의 수)를 함유한다.
표 11에 완성된 산물의 총 항산화 활성, 총 항라디컬 활성, SOD 활성과 같은 특정 항산화 활성의 측정 결과를 나타낸다.
| 활성 | 온전한 세포(Intact cells) | 무세포 추출물 |
| 총 항산화 활성 ORAC, 트로록스 eq./109 cells |
1105 ± 68 n = 3 |
1320 ±95 n = 3 |
| 총 항라디컬 활성, A517(빈 시료) - A517(시료) | 0.12 ± 0.02 n = 3 |
0.22 ± 0.03 n = 3 |
| 수퍼옥시드 디스무타아제 활성 | 21.2 ± 2.0 U/mg 단백질 n = 3 |
표 12 및 표 13에, 상기 제조물의 108/ml 박테리아 세포에 의한 인간 세포주 U-937 및 HT-29의 유도 후 사이토카인 수준을 나타낸다.
| 산물 | IL-10 ng/ml |
TNF-α ng/ml |
TGF-β ng/ml |
IL-6 ng/ml |
| 컨트롤(U-937) | 0.11 | 0.22 | 0.90 | 25.1 |
| 다중 박테리아 제조물 | 1.1 | 0.24 | 0.87 | 18.1 |
| 산물 | IL-8 ng/ml |
TGF-β ng/ml |
| 컨트롤(HT-29) | 8.9 | 0.40 |
| 다중 박테리아 제조물 | 7.7 | 0.35 |
표 14에, 담즙산염의 가수분해 능력 및 퍼센트로 콜레스테롤 감소에 대한 다중 박테리아 제조물의 항-콜레스테롤 활성을 나타낸다.
| 산물 | % 콜레스테롤 감소 | % 담즙산염의 디컨주게이션 |
| 다중 박테리아 제조물 | 21.0 | 42.4 |
표 15에, 상기 제조물의 ACE-저해 활성을 나타낸다.
| 산물 | % ACE-저해 |
| 다중 박테리아 제조물 | 65% |
산업상 이용가능성
다중 박테리아 제조물은 고혈압, 동맥경화 및 과콜레스테롤혈증, 면역 약화 및 장관에서의 염증 진행, 장내균총의 저해된 균형과 같은 사회적으로 중요한 질병들을 예방하기에 적합한 생균제 특성의 독특한 조합을 갖는 동결건조된 다이어트 보충제이다. 이러한 산물의 제조는 선진 산업 장치 및 첨단 연구 장치의 공유를 필요로 한다. 상기 산물의 제조 원리가 실시예에 기재된다.
참고문헌:
1. PCT/SU89/00264, C12N1/20, A61K35/74, University of Tartu, 1991
2. Dimitrov Zh. et al., 2008. Comparative evaluation of three molecular typing methods in their applicability to differentiate Latobacillus strains with human origin. World Journal of Microbiology and Biotechnology 24:1305-1312
Claims (24)
- 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) 7/12 NBIMCC No. 8720, 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) F12 NBIMCC No. 8722, 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) A1 NBIMCC No. 8721의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 박테리아 제조물.
- 제1항에 있어서,
측정된 생 세포가 cfu/g으로 적어도 109의 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) 7/12, 적어도 2x109의 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) A1 및 적어도 9x109의 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) F12로 함유된 다중 박테리아 제조물.
- 제1항에 있어서,
항산화제, 항염증 면역조절 효과, 저콜레스테롤혈증 효과 및 항고혈압 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 다중 박테리아 제조물.
- 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) 7/12 NBIMCC No. 8720, 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) F12 NBIMCC No. 8722, 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) A1 NBIMCC No. 8721로부터 선택된 적어도 하나의 스트레인을 함유하는 것을 특징으로 하는 박테리아 제조물.
- 박테리아 제조물의 생산자로서, 도 2에 나타낸 스트레인-특이적 DNA 프로파일을 갖는 스트레인 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) 7/12 NBIMCC No. 8720.
- 제5항에 있어서,
저콜레스테롤혈증 활성 및 항염증 면역조절 활성을 갖는 박테리아 제조물의 생산자인, 스트레인 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) 7/12 NBIMCC No. 8720.
- 박테리아 제조물의 생산자로서, 도 1에 나타낸 스트레인-특이적 DNA 프로파일을 갖는 스트레인 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) F12 NBIMCC No. 8722.
- 제7항에 있어서,
항산화 활성을 갖는 박테리아 제조물의 생산자인, 스트레인 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) F12 NBIMCC No. 8722.
- 박테리아 제조물의 생산자로서, 도 3에 나타낸 스트레인-특이적 DNA 프로파일을 갖는 스트레인 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) A1 NBIMCC No. 8721.
- 제9항에 있어서,
안지오텐신-전환 효소(ACE)에 대한 저해 활성을 갖는 항고혈압 활성을 갖는 박테리아 제조물의 생산자인, 스트레인 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) A1 NBIMCC No. 8721.
- 제1항 및 제4항에 있어서,
동결 건조물 또는 액체 배양물 형태인 것을 특징으로 하는, 다중 박테리아 제조물 및 박테리아 제조물.
- 알칼린 프로테아제로 가수분해된 우유, 및 영양 목적으로 0.2% 이스트 자가분해 물질의 보충물로 구성된 배지에서 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) 7/12 NBIMCC No. 8720, 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) F12 NBIMCC No. 8722 및 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) A1 NBIMCC No. 8721을 개별적으로 성장시키며, 여기서 접종량은 1%이며, pH는 소듐 하이드록시드로 5.7로 유지되는, 성장 단계, 및
후속 배양 단계로서, 알칼린 프로테아제로 가수분해된 우유, 및 영양 목적으로 0.2% 이스트 자가분해 물질의 보충물로 구성된 배지에서 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) F12, 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) A1 및 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) 7/12의 풍부한 바이오매스를 함유하는 3가지 단일 배양물의 조합를 배양하며, 접종량은 2%이며, pH는 소듐 하이드록시드로 5.7로 유지되는, 후속 배양 단계
를 포함하는, 제1항에 따른 다중 박테리아 제조물을 제조하는 방법.
- 제1항에 따른 다중 박테리아 제조물을 생균제로 사용하는 용도.
- 제13항에 따른 다중 박테리아 제조물을 식품 첨가물로서 사용하며 그리고/또는 인간 및 동물을 위한 식품에 어떠한 형태로 포함하는데 사용하는 용도.
- 제13항에 따른 다중 박테리아 제조물을 식품 제조용 종균 배양물을 얻기 위해 사용하는 용도.
- 제13항에 따른 다중 박테리아 제조물을, 인간 및 동물의 건강에 영향을 미치도록 의도된 기능성 제품 및 약학 제조의 조성물에 사용하는 용도.
- 제4항에 따른 박테리아 제조물을 생균제로서 사용하는 용도.
- 제17항에 따른 박테리아 제조물을 식품 첨가물로서 사용하며 그리고/또는 인간 및 동물을 위한 식품에 어떠한 형태로 포함하는데 사용하는 용도.
- 제17항에 따른 박테리아 제조물을 식품 제조용 종균 배양물을 얻기 위해 사용하는 용도.
- 제17항에 따른 박테리아 제조물을 인간 및 동물의 건강에 영향을 미치도록 의도된 기능성 제품 및 약학 제조의 조성물에 사용하는 용도.
- 제1항에 따른 다중 박테리아 제조물을, 항산화 활성, 항염증 면역조절 활성, 저콜레스테롤혈증 활성 및 항고혈압 활성을 갖는 제조물로서 사용하는 용도.
- 제5항에 따른 스트레인 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) 7/12 NBIMCC No. 8720을, 저콜레스테롤혈증 활성 및 항염증 면역조절 활성을 갖는 박테리아 제조물의 생산에 사용하는 용도.
- 제7항에 따른 스트레인 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) F12 NBIMCC No. 8722를, 항산화 활성을 갖는 박테리아 제조물의 생산에 사용하는 용도.
- 제9항에 따른 스트레인 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) A1 NBIMCC No. 8721를, 안지오텐신-전환 효소(ACE)에 대한 저해 활성을 갖는 항고혈압 활성을 갖는 박테리아 제조물의 생산에 사용하는 용도.
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