JP2018500048A - プレバイオティック組成物及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
ガラクトオリゴ糖(GOS)は、均質のオリゴ糖を含んでも、または異種のオリゴ糖を含んでもよい。
増殖培地は、MRS培地またはその改変バージョンを含む。
MRS培地は:好ましくは、約8〜約12g/Lの細菌学的ペプトン;約7〜約9g/Lの肉エキス;約3〜約5g/Lの酵母抽出物;約1〜約3g/Lのリン酸一ナトリウム;約4〜約6g/Lの酢酸ナトリウム;約1〜約2g/Lのクエン酸三アンモニウム;約0.1〜約0.3g/LのMgSO4;約0.02〜約0.15g/LのMnSO4;約1〜約3ml/LのTween80;約0.25〜約0.75g/LのLシステインHCL;約2〜約6ml/Lのレザスリン(rezasurin);および約20〜約55%のラクトース、を含む。
好ましくは、ラクトースの変換は、最高約70%である。より好ましくはラクトースの変換は、最高約68%である。最も好ましくは、ラクトースの変換は、最高約66%である。
本明細書中で先に記載した方法は、本発明の組成に関する態様において使用するためのGOSを生成するのに使用されてもよい。
ここで、本発明の実施形態を、以下の図面の詳細な説明を単なる例として用いて説明する。
1.様々なプロバイオティクスの乳酸桿菌を集め、GOSを産生するそれらの能力について試験し、β−ガラクトシダーゼ活性を測定すること、
2.逆酵素手順を使用してプレバイオティクスGOSを産生すること、
3.新規な分子をスケールアップして、インビトロ試験を行うこと、
4.プロバイオティクスおよびシンバイオティクスを試験する一連の「腸モデル」実験において、プレバイオティクスが存在しない状態および存在する状態で、乳酸桿菌の生存および増殖を比較すること、
5.乳酸桿菌のためのカプセル化材料としてGOSを使用できる可能性を評価すること、ならびに
6.カプセル化材料の送達特性を試験すること。
コレステロール%×乾燥重量(g)-1=(B−T/B×100)/W
式中、B=接種されなかった対照中のコレステロール含量(mg/l-1)、T=培養培地中のコレステロール(mg/l-1)およびW=細胞(12時間のインキュベーション後の乾燥重量(g))。
(a)健康上の必要性を識別するステップ、
(b)プロバイオティクス作用、例えばBSH活性、コレステロール同化および心疾患にとって非常に重要な交差(interjection)点を識別するステップ、
(c)ハイスループットスクリーニング方法を使用するプロバイオティクスライブラリーをスクリーニングするステップ、
(d)潜在的な活性および健康上の利益を有する株を識別するステップ、
(e)発酵過程を使用して活性の発現を最適化するステップ、
(f)ベータガラクトシダーゼ活性について株をスクリーニングするステップ、
(g)新規なGOSを産生するステップ、
(h)インビトロ試験を可能にするためにスケールアップするステップ、
(i)プレバイオティクスが存在しない状態および存在する状態で、インビトロプレートアッセイおよび腸モデルを使用して、プロバイオティクスの生存および増殖を比較するステップ(株が特徴付けられたら、集団変化を経時的に研究するための分子方法論を使用する。このことは、数の増大または活性の増大に起因して影響を受ける場合にわかる)、ならびに
(j)プレバイオティクスおよびプロバイオティクスを組み合わせて、組み合わされたプレバイオティクスおよびプロバイオティクスの効果を調査するステップ。
これらの実験では、嫌気性培養物を試験して、蛍光in situハイブリダイゼーションおよび短鎖脂肪酸(SCFA)を使用して24時間目の腸内細菌群の集団をモニタすることによって、新規なラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)のガラクトオリゴ糖のインビトロ利用を評価した。フラクトオリゴ糖(FOS)、メリビオースおよびラフィノースを、参照炭水化物として使用した。以下の表3は、これらの実験結果を示している。
これらの実験では、10種類の乳酸桿菌種を、β−ガラクトシダーゼ活性について、標準酵素アッセイを使用してo−NPGを基質として用いて三連でスクリーニングした。実験は、MRS、基本培地中1%および5%ラクトースの3種類の異なる培地で実施した。ラクトースは、β−ガラクトシダーゼのための一次基質なので、最高活性を呈すると予測された。活性を0〜24時間の間の時点で測定し、最高活性は、24時間後に示された。図5〜6に示されている通り、一般に、5%ラクトースは、最高酵素活性を呈し、MRSブロス(炭素源としてグルコースだけを含有する)よりも高い傾向がある。高い酵素活性は、GOSを産生するために必須であり、全体的に高い活性を示す3種類の生物は、両方のL.ファーメンタム株およびL.カゼイを含む。
これらの実験では、L.ファーメンタムATCC11976およびL.ファーメンタムNCIMB30226を、それらのGOS、ラクトースおよび単糖の生成(および消費)に関して168時間かけて評価した。
この実験では、L.ファーメンタムATCC11976のβ−ガラクトシダーゼからのGOSの合成を調査した。溶解した後、粗製抽出物を、20%ラクトース中、24時間かけてインキュベートし、サンプルを0時間目および24時間目に得た。
この実験では、GOSを、L.ファーメンタムATCC11976およびL.ファーメンタムNCIMB30226から生成し、糖の酵素活性対GOS%を、先の実験中にほとんどの活性が生じたとき、そのままの状態で50時間にわたって評価した。
GOSを、以下のプロトコルを使用して生成した。
1.L.ファーメンタムATCC11976およびL.ファーメンタムNCIMB30226のために、2%ラクトースを補充した改変MRSブロス中、一晩培養物50mlをセットアップする。
2.2%ラクトースを含有するmMRSブロス1Lに、一晩培養物50mlを懸濁させる。
3.嫌気性キャビネット中で37℃においてインキュベートする。
4.L.ファーメンタムATCC11976については14時間。
5.L.ファーメンタムNCIMB30226については8時間。
6.OD660を測定する。
7.培養物を10000g×10分で遠心分離処理する。
8.リン酸ナトリウム緩衝液中、40%ラクトースを作製する。400g/L。
9.上清を捨てる。
10.ペレットをリン酸ナトリウム緩衝液に再懸濁させる(50mM、pH6.8)。
11.falcon50mlにペレットをプールする。
12.液体窒素で3回凍結融解させる。
13.フレンチプレスする。30,000PSI、1回通過、5滴/分。
14.溶菌液を遠沈させる−15,000g×45分。
15.上清を新しいfalconに注ぐ。
16.β−gal活性アッセイを実施して、酵素濃縮を行う。
17.遊離細胞抽出物を、40%ラクトース/リン酸ナトリウム緩衝液と共にインキュベートする。
18.200μlを50時間にわたって2時間ごとにサンプリングする。
19.サンプルを凍結させる。
20.0.2μmフィルタを介してすべてのサンプルを滅菌濾過する。
21.HPLCで分析する。
図9〜12に示されている通り、ラクトース変換は30〜45%であり、GOS収率は10%であった。
L.ファーメンタムATCC11976およびL.ファーメンタムNCIMB30226から生成されたGOSの酵素活性(従って効率)を確認するために、さらなる実験を実施した。
図13〜16に示されている通り、ラクトース変換は40〜50%であり、GOS収率は15〜20%であった。
この実験では、この種に特異的なGOSが任意の増殖特異性を提供するかどうかを知るために、L.ファーメンタムATCC11976から生成されたGOSを、様々な細菌の増殖培地の一部として使用した。
L.ファーメンタムATCC11976を、2%ラクトースを補充した改変MRS中、培養物1Lにおいて14時間増殖させた。培養物を遠心沈殿させ、リン酸ナトリウム緩衝液に再懸濁させた。細胞を、液体窒素およびフレンチプレスを使用して溶解し、溶菌液をスピンして、遊離細胞抽出物を得た。遊離細胞抽出物を、40%ラクトースと共にインキュベートし、サンプルを50時間にわたって2時間ごとに得た。サンプルを、分析のためにすべての時点後にHPLCに搭載した。
初期に生成された不純GOSの1%を、mMRS hungate9mlに添加した。この混合物上で、以下の様々な生物の増殖を分析した。クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)、ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)ATCC11976、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)およびラクトバチルス・デルブリュッキ(Lactobacillus delbrueccki)。実験を、列挙したものを用いて、0、3、6、8、16および24時間において3回の反復し三連で実施した。
次に、最適化試験を、ラクトバチルス・ファーメンタムATCC11976、ラクトバチルス・ファーメンタムNCIMB30226、およびラクトバチルス・プランタルム2830(ECGC13110402)に関して実施した。
以下の成分:細菌学的ペプトン10g/L;肉エキス8g/L;酵母抽出物4g/L;リン酸一ナトリウム2g/L;酢酸ナトリウム5g/L;クエン酸三アンモニウム2g/L;MgSO4 0.2g/L;MnSO4 0.05g/L;Tween80 1ml/L;LシステインHCL0.5g/L;レザスリン4ml/Lを有し;および2%のラクトースを補充した、改変MRS培地を増殖培地として使用した。
増殖期中のβ−ガラクトシダーゼ(β−gal)発現に関する最適期間を確立するために初期段階を調べた。方法は以下の通りであった。最初に、細胞を、37℃にて大きなチューブ内で嫌気的に、10mlの改変MRS(mMRS)(先に詳述)中で培養した。次に、0、2、4、6、8、12、16、および24時間の間隔でサンプルを採取し、そして、酵素発現の最適期間を確立するために各時点でβ−gal活性分析を実施した。
以下の試薬:リン酸ナトリウム緩衝液(50mM、pH6.8);塩化マグネシウム(50mM);炭酸ナトリウム(1M);O−NPG(0.2M);および(検量線用に)o−NP(10mM)、を使用した。250μlのo−NPG、20μlのMgCl2、200μlの緩衝液、および40μlの酵素サンプルを、37℃、120rpmにて8分間インキュベートした。次に、500μlの炭酸ナトリウムを加え、そして、サンプルをOD420で計測して、o−ニトロフェノールの量を算定し、その結果として、検量線に対して結果を比較することによってβ−gal活性を確立した。図19は、ラクトバチルス・プランタルム2830(ECGC13110402)のOD420計測を示し、図20は、ラクトバチルス・ファーメンタムNCIMB30226のOD420計測を示し、それに対し、図21は、ラクトバチルス・ファーメンタムATCC11976のOD420計測を示す。β−gal活性は、ラクトバチルス・プランタルム2830(ECGC13110402)では約12時間にてピークに達し、ラクトバチルス・ファーメンタムNCIMB30226では約10時間にてピークに達し、およびラクトバチルス・プランタルム2830(ECGC13110402)では約16時間にてピークに達する。
β−gal活性の研究に基づいて、次に、ピーク活性の時点で細胞を採取することによって、GOSを各種/菌株で合成した。50mlの予備一晩培養物を、改変MRS培地を使って37℃にて嫌気的に調製した。3Lバッチで一晩培養物を、改変MRS培地を使って嫌気的に37℃にて調製した。ラクトバチルス・プランタルム2830(ECGC13110402)では12時間にて、ラクトバチルス・ファーメンタムNCIMB30226では10時間にて、およびラクトバチルス・ファーメンタムATCC11976では16時間にて、細胞を採取した。
潜在的な最適化条件の範囲を、3種類の生物体それぞれで評価した:1、2、および4Uの酵素活性/ml;15、20、30、40、50%のラクトースを含む増殖培地;40、50、55、60、65、75℃の培養温度;および0、4、8、12、24、30時間の間隔でサンプリングをおこなう。インキュベーション後に、サンプルを、95℃にて5分間加熱して、酵素を変性させ、次に、濾過し、そして、さらなる分析の前に−20℃にて保存した。
60、65および75℃にて無GOS産生が確立された(しかし、β−gal活性アッセイをこれらの温度にて実施すると、活性を示した)。概して、10%未満の低いGOS収率が見出され、これは、濃縮されていない酵素による可能性が高く、高レベルの水反応が加水分解を促進する。ラクトバチルス・プランタルム2830(ECGC13110402)からのGOS産生の根拠があった。図22〜25は、20%のラクトース、2単位の酵素において、50℃にて培養し、そして、6時間にてサンプル抽出した、選択された生物体および対照としてのラクトバチルス・デルブリュッキのGOS産生の証拠を例示するクロマトグラムを示す。図22は、ラクトバチルス・プランタルム2830(ECGC13110402)(GOS%=5.2およびラクトース%=89)の結果を示し;図23は、ラクトバチルス・ファーメンタムNCIMB30226(GOS%=5.5およびラクトース%=82)の結果を示し;図24は、ラクトバチルス・ファーメンタムATCC11976(GOS%=6およびラクトース%=75)の結果を示し;および図25は、ラクトバチルス・デルブリュッキ(GOS%=17およびラクトース%=32)の対照株の結果を示して、反応が作動していたことを証明している。
40%のラクトース中、50℃にて24時間にわたるラクトバチルス・ファーメンタムATCC11976に関する糖のパーセンテージの結果を、以下の図30および表11に示す:
図31Aおよび31Bは、15%のラクトース中、40℃にて培養したときのラクトバチルス・ファーメンタムNCIMB30226とラクトバチルス・ファーメンタムATCC11976との間の糖(およびGOS収率)のパーセンテージの比較上の違いを示し、そして、両方とも同様の時点にて同様のGOS収率を示す。結果はまた、わずかなトランスガラクトシル化が低いラクトース濃度(15%)に起因すると予想されることも実証する。それが(加水分解)であり、そして、これらの条件下で高い単糖産生も示す、反応を実施して、酵素が活性であることを確実にした。
前述の実施形態は、特許請求の範囲によって与えられる保護範囲を制限するものではなく、本発明を実施することができる実施例を例示する。
当該出願は、寄託された生物材料に関する以下の表示に関係し、および主張する。
名称:欧州細胞培養物保存機関
住所:英国公衆衛生培養物保存施設、ポートンダウン、ソールズベリー、SP4 0JG、英国
日付:2013年11月4日
受入番号:13110401
−および−
名称:欧州細胞培養物保存機関
住所:英国公衆衛生培養物保存施設、ポートンダウン、ソールズベリー、SP4 0JG、英国
日付:2013年11月4日
受入番号:13110402
−および−
名称:欧州細胞培養物保存機関
住所:英国公衆衛生培養物保存施設、ポートンダウン、ソールズベリー、SP4 0JG、英国
日付:2013年11月4日
受入番号:13110403
Claims (23)
- ラクトバチルス・プランタルムによって生成されるガラクトオリゴ糖(GOS)を含むプレバイオティック組成物であって、ここで、該GOSは、選択されたラクトバチルス・プランタルムプロバイオティクス細菌株の選択増殖培地としての役割を果たし、かつ、該GOSは、選択されたプロバイオティクス細菌株における逆β−ガラクトシダーゼ反応によって生成される形態と実質的に同じである、組成物。
- 前記GOSが、以下の菌株:ラクトバチルス・プランタルム2828(ECGC13110403);ラクトバチルス・プランタルム2830(ECGC13110402);ラクトバチルス・プランタルム2691(ECGC13110401)、またはその突然変異株の1もしくは複数によって生成される、および/またはそれらに対して選択性である、請求項1に記載の組成物。
- 前記組成物がカプセル化されている、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記組成物が、身体の胃腸環境を通過し、かつ、その機能特性を維持できるようにするための賦形剤または担体化合物をさらに含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記組成物が、飲むことができる液体の形態であり、そして/または固体もしくは液体食料品と混合できる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
- 薬品として使用するための、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
- 栄養補助食品として使用するための、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
- コレステロールの管理または高コレステロールの処置に使用するための、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
- メタボリック症候群の管理または処置に使用するための、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
- 体重管理に使用するための、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
- 糖尿病の管理または処置に使用するための、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
- ガラクトオリゴ糖(GOS)を生成する方法であって、嫌気条件下、最高55℃の温度にて最長16時間、最高50%のラクトースを含む増殖培地中で1若しくは複数のラクトバチルス・プランタルムを培養し、そして、ラクトバチルス・プランタルム細胞からGOSを採取するステップを含む方法。
- 前記1若しくは複数のラクトバチルス・プランタルム菌株を、最高50℃の温度にて最長14時間、最高40%のラクトースを含む増殖培地中で培養する、請求項12に記載の方法。
- 前記増殖培地が、MRS培地またはその改変バージョンを含む、請求項12または13に記載の方法。
- 前記MRS培地が:約10g/Lの細菌学的ペプトン;約8g/Lの肉エキス;約4g/Lの酵母抽出物;約2g/Lのリン酸一ナトリウム;約5g/Lの酢酸ナトリウム;約2g/Lのクエン酸三アンモニウム;約0.2g/LのMgSO4;約0.05g/LのMnSO4;1ml/LのTween80;約0.5g/LのLシステインHCL;約4ml/Lのレザスリン;および最高約50%のラクトース、を含む、請求項14に記載の方法。
- 前記GOSが、溶解によってラクトバチルス・プランタルム細胞から採取される、請求項12〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記溶解が、1若しくは複数の凍結−融解ステップを伴う、請求項16に記載の方法。
- 前記ラクトバチルス・プランタルム菌株は、次の:ラクトバチルス・プランタルム2828(ECGC13110403);ラクトバチルス・プランタルム2830(ECGC13110402);ラクトバチルス・プランタルム2691(ECGC13110401)、またはその突然変異株のうちの1もしくは複数から選択される、請求項12〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記GOSの収率が、最高約35%である、請求項12〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記GOSの収率が、最高約31%である、請求項12〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ラクトースの変換が、最高約70%である、請求項12〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ラクトースの変換が、最高約66%である、請求項12〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法が、請求項1〜11のいずれか1項に記載の組成物に使用するためのGOSを生成するのに使用される、請求項12〜22のいずれか1項に記載の方法。
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