CN112401243B - 预防肾结石及其复发的复合益生菌活菌粉剂及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种预防肾结石及其复发的复合益生菌活菌粉剂及制备方法，包括以下质量百分数的组分：复合益生菌微胶囊粉63‑82%、复配糖醇10‑20%、益生元2‑5%、枸橼酸钾6‑8%。其中复合益生菌微胶囊粉李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌的混合发酵产物，添加脱脂乳、OSA变性淀粉、麦芽糊精、海藻酸钠为壁材制成益生菌微胶囊后，往微胶囊中添加脱脂奶粉、海藻糖、抗结块剂、无菌水经冷冻干燥制得微胶囊粉。本发明能够对肠道菌群进行有益调整，降低体内的草酸浓度，以此有效减少草酸钙肾结石的形成与复发风险，为肾结石人群提供专业的膳食解决方案。

Description

预防肾结石及其复发的复合益生菌活菌粉剂及制备方法
技术领域
本发明涉属于食品技术领域，具体涉及一种预防肾结石及其复发的复合益生菌活菌粉剂及制备方法。
背景技术
肾结石是一种常见的泌尿系统疾病，具有高发病率、高复发率的特点，可严重影响全世界人群的健康和生活质量，目前已成为重要的公共健康问题。
目前市面上针对肾结石的药物中，维生素B6不能长期预防肾结石；枸橼酸盐合剂与噻嗪类利尿剂只能通过增加排尿量来预防结石，不能从根源上解决问题，且在食用后具有尿频等副作用，口感较差。相较于药物治疗，复合益生菌活菌粉剂副作用小，成分天然且依赖性小。
面对肾结石问题，饮食预防的重要性远远高于药物治疗。但在预防肾结石方面，几乎没有说明预防肾结石的复合益生菌活菌粉剂的配方与制备方法。现有的复合益生菌活菌粉剂配方及制备方法只有2019.11.19公开的公告号为CN110463892A，但该活菌粉剂陈述的是从人体的肠道微生物出发，通过维护和帮助恢复肠道菌群平衡，改善人体肠道健康。配方成分大部分是各类乳杆菌以及糖醇，不具备降解草酸钙肾结石的作用且不具备良好的口感。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明设计的目的在于提供一种预防肾结石及其复发的复合益生菌活菌粉剂及制备方法。
本发明通过以下技术方案加以实现：
所述的一种预防肾结石及其复发的复合益生菌活菌粉剂，其特征在于含有以下质量百分比的组分：
复合益生菌微胶囊粉63-82%、复配糖醇10-20%、益生元2-7%、枸缘酸钾6-8%；
其中，复合益生菌微胶囊粉由3份益生菌微胶囊、1.44份脱脂奶粉、0.6份海藻糖、0.12份抗结块剂、8.25份无菌水经冷冻干燥制得；
所述益生菌微胶囊由以下重量份的组分组成：20-50份混合发酵产物、 11-16份脱脂乳、3.2-5.4份OSA变性淀粉、7-10份麦芽糊精、6.8-8.5份海藻酸钠；
所述混合发酵产物为鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌混合发酵而成，三者重量比为1-2:1-2:1-2。
所述的一种预防肾结石及其复发的复合益生菌活菌粉剂，其特征在于含有以下质量百分比的组分：
复合益生菌微胶囊粉71%、复配糖醇20%、益生元3%、枸缘酸钾6%；所述益生菌微胶囊由以下重量份的组分组成：39份混合发酵产物、13份脱脂乳、3.74份OSA变性淀粉、7份麦芽糊精、8.3份海藻酸钠；所述混合发酵产物为鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌混合发酵而成，三者重量比为1:1:1。
所述的一种预防肾结石及其复发的复合益生菌活菌粉剂，其特征在于所述复配糖醇由阿拉伯糖、赤藓糖醇、低聚果糖按照重量比5:2:3的比例混合而成；所述益生元由菊粉、谷氨酸钠、山梨醇按照重量比56:32:12的比例混合而成。
所述的预防肾结石及其复发的复合益生菌活菌粉剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）草酸降解菌筛选：利用体外模拟筛选降解草酸的装置对粪便微生物进行混合发酵，该装置包括富集培养发酵罐（1）、选择培养基发酵罐（2）及选择固体培养基器皿（3），粪便微生物以10%接种量接进富集培养罐中，培养72h左右，开启位于富集培养发酵罐（1）和选择培养基发酵罐（2）之间管道上的电子泵（4），将富集培养发酵罐（1）中的菌液吸入选择培养基发酵罐（2）主体中，进行选择发酵，选择培养完毕后，缓慢旋转位于选择培养基发酵罐（2）与选择固体培养基器皿（3）之间管道上的橡皮夹（5），使选择培养基发酵罐（2）中的菌液少量流入选择固体培养基器皿（3）中，再摇晃培养皿使菌液平铺在选择固体培养基上方，出现菌群则筛选出能降解草酸盐的细菌。
2）混菌发酵扩培：筛选完毕后，利用肠培养基对筛选出的能降解草酸盐的菌进行扩培，分别以3%接种量接种至富集培养发酵罐（1）中，进行混合发酵培养；
3）微生物包埋：将步骤2）扩培所得的处于稳定期前期的混合菌液经离心分离后，弃上清，将收集到的菌体制成菌悬液，加入配方量的脱脂乳、OSA变性淀粉、麦芽糊精作为壁材，静置一段时间，加入到冷却好的灭菌的海藻酸钠溶液中混合，搅拌均匀后，用玻璃注射器将混合液逐滴滴入冷却好的灭菌的0.20mol/L氯化钙溶液中，固化一定时间，形成微胶囊，过滤取得样品,用清水漂去氯化钙残液，再用经灭菌后0.85％的生理盐水洗涤微胶囊表面菌体，即得益生菌微胶囊；
4）冻干微胶囊粉的制备：往步骤3）制得的益生菌微胶囊中加入配方量的脱脂奶粉、乳糖、海藻糖、抗结块剂作为冻干保护剂，用无菌水溶解混匀，然后将此混合物均匀铺于托盘上，每个托盘装1L，将托盘置于隔板上，在物料中放置温度探头，开始冷冻干燥，冻干结束后，冻干菌微胶囊呈饼状，粉碎后过100目筛，制得复合益生菌微胶囊粉于-20℃冰箱保存；
5）复合益生菌活菌粉剂的制备：取配方量的复合益生菌微胶囊粉、复配糖醇、益生元及枸橼酸钾混合即得复合益生菌活菌粉剂。
所述的预防肾结石及其复发的复合益生菌活菌粉剂的制备方法，其特征在于步骤1）中富集培养发酵罐中装有200mL的肠培养基，所述肠培养基为蛋白胨10g/L、牛肉浸膏10g/L、酵母提取物5g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠5g/L、吐温801mL/L、柠檬酸氢二铵2g/L、磷酸氢二钾2g/L、七水硫酸镁0.6g/L、一水硫酸锰0.25g/L；
发酵培养条件为：设定人体仿真数据，模拟人体每日进食排便情况，温度30-45℃、发酵液初始pH为6-8，培养时间约72h，为控制发酵严格的厌氧环境，每日早、中、晚对每个发酵罐通氮气以排尽发酵罐内的空气。
所述的预防肾结石及其复发的复合益生菌活菌粉剂的制备方法，其特征在于步骤1）中选择培养基发酵罐内装有选择培养基，选择培养基以草酸盐为唯一碳源的选择培养基，具体包括：蛋白胨10g/L、牛肉浸膏10g/L、酵母提取物5g/L、草酸盐20g/L、乙酸钠5g/L、吐温80 1mL/L、柠檬酸氢二铵2g/L、磷酸氢二钾2g/L、七水硫酸镁0.6g/L、一水硫酸锰0.25g/L；
选择培养条件：温度30-45℃、选择培养夜初始pH为6-8，培养时间约72h，为控制发酵严格的厌氧环境，每日早、中、晚对每个发酵罐通氮气以排尽发酵罐内的空气。
所述的预防肾结石及其复发的复合益生菌活菌粉剂的制备方法，其特征在于步骤）中选择固体培养基为：琼脂12g/L、胨化乳15g/L、酵母提取物5g/L、葡萄糖20g/L、番茄浸出粉、吐温80 1mL/L、磷酸二氢钾2g/L；
选择培养条件：温度30-45℃、选择培养液初始pH为6-8，培养时间约48h。
所述的预防肾结石及其复发的复合益生菌活菌粉剂的制备方法，其特征在于步骤2）中筛选出能降解草酸的菌为鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌进行活化扩培，分别接种3%鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌至富集发酵罐中混合发酵扩培；
扩培的条件为：温度37℃，摇床150r/min，通风量13.5mL/min，初始 pH值为7.5，培养时间约24 h。
所述的预防肾结石及其复发的复合益生菌活菌粉剂的制备方法，其特征在于步骤4）中冷冻干燥过程可分为三个阶段，第一阶段为预冻，将物料降温至-40℃，维持冷却4小时后开始抽真空；第二阶段为升华，为干燥的主要阶段，打开真空泵，同时将物料温度由-50℃升温至-30℃，通过间隙开循环泵使物料升温速度控制在每小时5℃，物料温度维持在-25℃，维持时间为10小时；第三阶段为终干燥，通过快速升温，将物料温度由-25℃升至20℃，升温速度控制在每小时5℃，使物料中最后的结合水蒸发掉，维持时间为2h。
本发明通过筛选功能性益生菌，进行科学配伍，成功研制出一种预防肾结石及其复发，促进肠道健康的复合益生菌活菌粉剂，通过增加肠道内菌群的丰度，降解肠道内草酸，进而科学预防肾结石的形成，改善人体肠道健康。且本发明从调节肠道菌群平衡出发，相较于药物治疗，该方法的副作用和依赖性更小。同时，本发明采用混菌发酵技术、包埋技术和冻干技术，能使益生菌的浓度和活性更高，并且顺利到达肠道产生有益效果。本发明中还添加了适量复配糖醇，在保留良好口感的同时能减少人体的能量吸收，基本不会引起血糖的变化。
而且，初步人体试验证实：利用该预防肾结石及其复发的复合益生菌活菌粉剂治疗肾结石患者的效果比对照组显著，10名志愿者食用该产品12周后肾结石患者基础代谢评价统计为：草酸钙含量分析68%、血清电解质59%、尿液排泄检查23%、晨尿检查分析34%、甲状旁腺激素含量46%（百分数为有效率，即与服用前相比出现显著性差异）。综上所述，本发明中混菌发酵所制备的复合益生菌活菌粉剂在降解草酸、定点释放和改善肠道菌群等方面效果显著。
附图说明
图1为体外模拟筛选降解草酸的装置；
图中，1-富集培养发酵罐，2-选择培养基发酵罐，3-选择固体培养基器皿，4-电子泵，5-橡皮夹。
具体实施方式
以下结合实施例和对比例，对本发明作详细说明。但本发明的保护范围不限于下述实施例和对比例，即但凡以本发明申请专利范围及说明书内容所作的简单的等效变化与修饰，皆仍属本发明专利涵盖范围之内。
实施例1
一种预防肾结石及其复发的复合益生菌活菌粉剂，包括以下质量百分数的组分：
复合益生菌微胶囊粉71%、复配糖醇20%、益生元3%、枸橼酸钾6%。其中复合益生菌微胶囊粉为每39份按照鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌比例为1:1:1的混合发酵产物，添加13份脱脂乳、3.7份OSA变性淀粉、7份麦芽糊精、8.3份海藻酸钠为壁材制成益生菌微胶囊后，每3份微胶囊添加1.44份脱脂奶粉、0.6份海藻糖、0.12份抗结块剂、8.25份无菌水经冷冻干燥制得微胶囊粉；复配糖醇组成为阿拉伯糖、赤藓糖醇、低聚果糖按照5:2:3的比例混合；益生元组成为菊粉、谷氨酸钠、山梨醇按照56:32:12的比例混合物。
上述预防肾结石及其复发的复合益生菌活菌粉剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：混菌发酵
利用一种体外模拟筛选降解草酸的细菌的装置对三种乳杆菌进行混合发酵，包括富集培养发酵罐、选择培养基发酵罐和选择固体培养基器皿，见图1，其中，富集培养发酵罐与选择培养基发酵罐之间通过管道连接，管道上设置有电子泵，选择培养基发酵罐和选择固体培养基器皿之间连接的管道上设置有橡皮夹。具体操作如下：
将粪便微生物 种以10%的接种量接种至富集培养发酵罐中，富集培养发酵罐内装200mL肠培养基。
肠培养基为：蛋白胨10 g/L、牛肉浸膏10 g/L、酵母提取物5 g/L、葡萄糖20 g/L、乙酸钠5g/L、吐温80 1 mL/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、七水硫酸镁0.6 g/L、一水硫酸锰0.25 g/L。
发酵培养条件为：设定人体仿真数据，模拟人体每日进食排便情况，温度30-45℃、发酵液初始pH为6-8，培养时间约72h，为控制发酵严格的厌氧环境，每日早、中、晚对每个发酵罐通氮气以排尽发酵罐内的空气。
发酵完毕后，开启电子泵，将富集培养发酵罐中的菌液吸入选择培养基发酵罐主体中，进行选择发酵。
选择培养基为：以草酸盐为唯一碳源的选择培养基，具体包括：蛋白胨10 g/L、牛肉浸膏10 g/L、酵母提取物5 g/L、草酸盐20 g/L、乙酸钠5g/L、吐温80 1 mL/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、七水硫酸镁0.6 g/L、一水硫酸锰0.25 g/L。
选择培养条件：温度30-45℃、选择培养夜初始pH为6-8，培养时间约72h，为控制发酵严格的厌氧环境，每日早、中、晚对每个发酵罐通氮气以排尽发酵罐内的空气。
选择培养完毕后，缓慢旋转橡皮夹，使选择培养基发酵罐中的菌液少量流入选择固体培养基器皿中，再摇晃培养皿使菌液平铺在固体培养基上方，出现菌群则筛选出能降解草酸盐的细菌。
选择固体培养基为：琼脂12 g/L、胨化乳15 g/L、酵母提取物5 g/L、葡萄糖20 g/L、番茄浸出粉、吐温80 1 mL/L、磷酸二氢钾2 g/L。
选择培养条件：温度30-45℃、选择培养夜初始pH为6-8，培养时间约48h。
筛选完毕后，利用肠培养基对筛选出的能降解草酸盐的微生物进行活化扩培，后分别以3%接种量接种至富集培养发酵罐（1）中，进行混合发酵培养。
扩培条件：温度37℃，摇床150r/min，通风量13.5mL/min，初始 pH值为7.5，培养时间约24 h。
测得的总活菌数为5.77×1011 CFU/g。其中鼠李糖乳杆菌活菌数为3.54×1011CFU/g，干酪乳杆菌活菌数为1.28×1011 CFU/g，植物乳杆菌活菌数为9.5×1010 CFU/g。
步骤2：微生物包埋
将培养所得的处于稳定期前期的混合菌液经离心分离后，弃上清，将收集到的菌体制成菌悬液，每39份菌悬液加入13份脱脂乳、3.7份OSA变性淀粉、7份麦芽糊精作为壁材，静置一段时间，加入到冷却好的灭菌的8.3份海藻酸钠溶液中混合，搅拌均匀后，用玻璃注射器将混合液逐滴滴入冷却好的灭菌的0.2 mol/L氯化钙溶液中，固化一定时间，形成微胶囊，过滤取得样品,用清水漂去氯化钙残液，再用经灭菌后0.85％的生理盐水洗涤微胶囊表面菌体，即得益生菌微胶囊。
步骤3：冻干菌剂的制备
每3份益生菌微胶囊加入脱脂奶粉1.44 份，乳糖0.84 份，海藻糖0.6份，抗结块剂0.12份作为冻干保护剂，用8.25份无菌水溶解混匀。然后将此混合物均匀铺于托盘上，每个托盘装1L，将托盘置于隔板上，在物料中放置温度探头，开始冻干。冷冻干燥过程可分为三个阶段，第一阶段为预冻，将物料降温至-40℃，维持冷却4小时后开始抽真空；第二阶段为升华，这是干燥的主要阶段，打开真空泵，同时将物料温度由-50℃升温至-30℃，通过间隙开循环泵，使物料升温速度控制在每小时5℃，物料温度维持在-25℃，维持时间为10小时；第三阶段为终干燥，通过快速升温，将物料温度由-25℃升至20℃，升温速度控制在每小时5℃，使物料中最后的结合水蒸发掉，维持时间为2h。冷冻干燥结束后，冻干菌剂应为饼状，收集冻干菌粉即复合益生菌粉，过100目筛，粉碎后，收集菌粉重量为3.75Kg左右，置于-20℃冰箱保存。
步骤 4：复合益生菌活菌粉剂的制备
一种预防肾结石及其复发的复合益生菌活菌粉剂，包括以下质量百分数的组分：复合益生菌微胶囊粉71%、复配糖醇20%、益生元3%、枸橼酸钾6%。其中复合益生菌微胶囊粉为鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌按照比例为1:1:1的混合发酵产物，每39份菌悬液添加13份脱脂乳、3.7份 OSA变性淀粉、7份麦芽糊精、8.3份海藻酸钠为壁材制成益生菌微胶囊后，每3份微胶囊添加1.44份脱脂奶粉、0.6份海藻糖、0.12份抗结块剂、8.25份无菌水经冷冻干燥制得微胶囊粉；复配糖醇组成为阿拉伯糖、赤藓糖醇、低聚果糖，按照5:2:3的比例混合；益生元组成为菊粉、谷氨酸钠、山梨醇按照56:32:12的比例混合物。将步骤3制备得到的益生菌微胶囊与复配糖醇、益生元和枸橼酸钾，按比例混合即制得复合益生菌活菌粉剂。
对比例1
一种预防肾结石及其复发的复合益生菌活菌粉剂，包括以下质量百分数的组分：
复合益生菌微胶囊粉71%、复配糖醇20%、益生元3%、枸橼酸钾6%。其中复合益生菌微胶囊粉为每39份按照鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌比例为1:2:1的混合发酵产物，添加13份脱脂乳、3.7份OSA变性淀粉、7份麦芽糊精、8.3份海藻酸钠为壁材制成益生菌微胶囊后，每3份微胶囊添加1.44份脱脂奶粉、0.6份海藻糖、0.12份抗结块剂、8.25份无菌水经冷冻干燥制得微胶囊粉；复配糖醇组成为阿拉伯糖、赤藓糖醇、低聚果糖按照5:2:3的比例混合；益生元组成为菊粉、谷氨酸钠、山梨醇按照56:32:12的比例混合物。
对比例2
一种预防肾结石及其复发的复合益生菌活菌粉剂，包括以下质量百分数的组分：
复合益生菌微胶囊粉71%、复配糖醇20%、益生元3%、枸橼酸钾6%。其中复合益生菌微胶囊粉为每39份按照鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌比例为2:1:1的混合发酵产物，添加13份脱脂乳、3.7份OSA变性淀粉、7份麦芽糊精、8.3份海藻酸钠为壁材制成益生菌微胶囊后，每3份微胶囊添加1.44份脱脂奶粉、0.6份海藻糖、0.12份抗结块剂、8.25份无菌水经冷冻干燥制得微胶囊粉；复配糖醇组成为阿拉伯糖、赤藓糖醇、低聚果糖按照5:2:3的比例混合；益生元组成为菊粉、谷氨酸钠、山梨醇按照56:32:12的比例混合物。
对比例3
一种预防肾结石及其复发的复合益生菌活菌粉剂，包括以下质量百分数的组分：
复合益生菌微胶囊粉71%、复配糖醇10%、膳食纤维10%，益生元3%、枸橼酸钾6%。其中复合益生菌微胶囊粉为每39份按照鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌比例为1:1:1的混合发酵产物，添加13份脱脂乳、3.7份OSA变性淀粉、7份麦芽糊精、8.3份海藻酸钠为壁材制成益生菌微胶囊后，每3份微胶囊添加1.44份脱脂奶粉、0.6份海藻糖、0.12份抗结块剂、8.25份无菌水经冷冻干燥制得微胶囊粉；复配糖醇组成为阿拉伯糖、赤藓糖醇、低聚果糖按照5:2:3的比例混合；益生元组成为菊粉、谷氨酸钠、山梨醇按照56:32:12的比例混合物。膳食纤维组成为低聚果糖、聚葡萄糖按照5：4的比例混合物。
对比例4
一种预防肾结石及其复发的生产复合益生菌活菌粉剂，包括以下质量百分数的组分：复合益生菌微胶囊粉71%、复配糖醇20%、益生元3%、枸橼酸钾6%。其中复合益生菌微胶囊粉为每39份按照鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌比例为1:1:1的混合发酵产物，添加13份脱脂乳、3.7份变性淀粉、7份麦芽糊精、8.3份无菌水制成益生菌混合物，每3份混合物添加1.44份脱脂奶粉、0.6份海藻糖、0.12份抗结块剂、8.25份无菌水经冷冻干燥制得微胶囊粉；复配糖醇组成为阿拉伯糖、赤藓糖醇、低聚果糖按照5:2:3的比例混合；益生元组成为菊粉、谷氨酸钠、山梨醇按照56:32:12的比例混合物。
对比例5
一种预防肾结石及其复发的复合益生菌活菌粉剂，包括以下质量百分数的组分：复合益生菌微胶囊粉71%、复配糖醇20%、益生元3%、枸橼酸钾6%。其中复合益生菌微胶囊粉为每39份按照发酵好的鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌比例为1:1:1的混合发酵产物，添加13份脱脂乳、3.7份OSA变性淀粉、7份麦芽糊精、8.3份海藻酸钠为壁材制成益生菌微胶囊后，每3份微胶囊添加1.44份脱脂奶粉、0.6份海藻糖、0.12份抗结块剂、8.25份无菌水经冷冻干燥制得微胶囊粉；复配糖醇组成为阿拉伯糖、赤藓糖醇、低聚果糖按照5:2:3的比例混合；益生元组成为菊粉、谷氨酸钠、山梨醇按照56:32:12的比例混合物。
此处复合益生菌粉由鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌先分别发酵（具体操作与实施例1中步骤1相同，在此不赘述），再混合得混合菌液，然后进行实施例1中的步骤2、3、4所得。
测得的总活菌数为4.53×1011 CFU/g。其中鼠李糖乳杆菌活菌数为2.15×1011CFU/g，干酪乳杆菌活菌数为1.21×1011CFU/g，植物乳杆菌活菌数为1.17×1011 CFU/g。
以下结合实施例和对比例对本发明的效果做详细说明。
1、实验准备
1)实验人员：肾结石患者60例；
2)实验产品：本发明的复合益生菌活菌粉剂；
2、实验设计
1)将实验人员分成六组，每组10人，一组实验组（服用本发明实施例1制备的固体粉剂），五组对照组（本发明对比例1-5制备的固体粉剂）。
2)本发明的产品服用方法为：一天2次（早晚各一次），一次15克。
3)效果统计:受试前，将所有受试者的评价指标统计一次，此后每一周都需统计一次直至第12周，将第1周和第12周数据进行对比分析，各个指标好转程度用百分比表示。评价指标为草酸钙含量分析、血清电解质、尿液排泄检查、晨尿检查分析、甲状旁腺激素含量，将这5项指标前后对比统计结果。
3、实验结果
饮食干预12周后5组肾结石患者基础代谢评价统计见表1，表中百分数为有效率，即与服用前相比出现显著性差异。
表1实施例和对比例效果分析
Figure DEST_PATH_IMAGE001
4、实验结论
通过实施例1、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4和对比例5的实验结果数据可以看出：本发明实施例和对比例制备的固体粉剂对肾结石疾病均具有一定的预防和辅助治疗作用，能够减轻和缓解肾结石疾病的临床表现症状。其中，实施例1制备的活菌微胶囊粉剂对肾结石的预防效果最明显。虽然在体外肠道模拟体系中评价得到三株菌株都具有降解草酸的作用，但是其复配比例的改变，会导致菌株之间的协同配合能力变化，于是经过体外评价体系以及对比实施例1和对比例1、2 ，可以得出当鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌按照1:1:1的比例配制时，具有更加良好的降解草酸钙肾结石效果。对比实施例1和对比例3说明，添加复配糖醇对于复合益生菌微胶囊粉剂的作用比膳食纤维更为显著，糖醇能够改善肠道菌群，抑制蔗糖酶的水解，降低因为高糖而导致的肾结石风险。而对比实施例1和对比例4，可以得出以海藻酸钠为主要成分组成的包埋剂对使益生菌有效进入肠道有着重要作用，减弱胃酸和胰液的侵蚀，增加益生菌的存活率，使得更多的益生菌有效到达肠道并发挥作用。对比例5和实施例1的主要区别在于两者发酵方式不同，但是单菌发酵得到的活菌数更低，所以相较于实施例1，益生菌到达肠道的数量较少，发挥的作用更有限，两种发酵方式的比较见表2。
表2 益生菌混菌发酵与单菌发酵的比较
Figure 555272DEST_PATH_IMAGE002
综上所述，本发明实施例1所制备的复合益生菌活菌微胶囊粉剂在降解草酸、定点释放和改善肠道菌群等方面,效果较对比例1、对比例2、对比例3、对比例4和对比例5显著。

Claims (8)

1.一种预防肾结石及其复发的复合益生菌活菌粉剂，其特征在于由以下质量百分比的组分组成：
复合益生菌微胶囊粉63-82%、复配糖醇10-20%、益生元2-7%、枸橼酸钾6-8%；
其中，复合益生菌微胶囊粉由3份益生菌微胶囊、1.44份脱脂奶粉、0.6份海藻糖、0.12份抗结块剂、8.25份无菌水经冷冻干燥制得；
所述益生菌微胶囊由以下重量份的组分组成：20-50份混合发酵产物、 11-16份脱脂乳、3.2-5.4份OSA变性淀粉、7-10份麦芽糊精、6.8-8.5份海藻酸钠；
所述混合发酵产物为鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌混合发酵而成，三者重量比为1:1:1；
其中，复合益生菌活菌粉剂采用以下步骤制备：
1）草酸降解菌筛选：利用体外模拟筛选降解草酸的装置对粪便微生物进行混合发酵，该装置包括富集培养发酵罐（1）、选择培养基发酵罐（2）及选择固体培养基器皿（3）,粪便微生物以10%接种量接进富集培养罐中，培养72h，开启位于富集培养发酵罐（1）和选择培养基发酵罐（2）之间管道上的电子泵（4），将富集培养发酵罐（1）中的菌液吸入选择培养基发酵罐（2）主体中，进行选择发酵，选择培养完毕后，缓慢旋转位于选择培养基发酵罐（2）与选择固体培养基器皿（3）之间管道上的橡皮夹（5），使选择培养基发酵罐（2）中的菌液少量流入选择固体培养基器皿（3）中，再摇晃培养皿使菌液平铺在选择固体培养基上方，出现菌群则筛选出能降解草酸盐的细菌；
2）混菌发酵扩培：筛选完毕后，利用肠培养基对筛选出的能降解草酸盐的菌进行活化扩培，后分别以3%接种量接种至富集培养发酵罐（1）中，进行混合发酵培养；
3）微生物包埋：将步骤2）扩培所得的处于稳定期前期的混合菌液经离心分离后，弃上清，将收集到的菌体制成菌悬液，加入配方量的脱脂乳、OSA变性淀粉、麦芽糊精作为壁材，静置一段时间，加入到冷却好的灭菌的海藻酸钠溶液中混合，搅拌均匀后，用玻璃注射器将混合液逐滴滴入冷却好的灭菌的0.20 mol/L氯化钙溶液中，固化一定时间，形成微胶囊，过滤取得样品,用清水漂去氯化钙残液，再用经灭菌后0.85％的生理盐水洗涤微胶囊表面菌体，即得益生菌微胶囊；
4）冻干微胶囊粉的制备：往步骤3）制得的益生菌微胶囊中加入配方量的脱脂奶粉、乳糖、海藻糖、抗结块剂作为冻干保护剂，用无菌水溶解混匀，然后将此混合物均匀铺于托盘上，每个托盘装1L，将托盘置于隔板上，在物料中放置温度探头，开始冷冻干燥，冻干结束后，冻干菌微胶囊呈饼状，粉碎后过100目筛，制得复合益生菌微胶囊粉于-20℃冰箱保存；
5）复合益生菌活菌粉剂的制备：取配方量的复合益生菌微胶囊粉、复配糖醇、益生元及枸橼酸钾混合即得复合益生菌活菌粉剂。
2.如权利要求1所述的一种预防肾结石及其复发的复合益生菌活菌粉剂，其特征在于由以下质量百分比的组分组成：
复合益生菌微胶囊粉71%、复配糖醇20%、益生元3%、枸橼酸钾6%；所述益生菌微胶囊由以下重量份的组分组成：39份混合发酵产物、13份脱脂乳、3.74份OSA变性淀粉、7份麦芽糊精、8.3份海藻酸钠。
3.如权利要求1或2所述的一种预防肾结石及其复发的复合益生菌活菌粉剂，其特征在于所述复配糖醇由阿拉伯糖、赤藓糖醇、低聚果糖按照重量比5:2:3的比例混合而成；所述益生元由菊粉、谷氨酸钠、山梨醇按照重量比56:32:12的比例混合而成。
4.如权利要求1所述的一种预防肾结石及其复发的复合益生菌活菌粉剂，其特征在于步骤1）中富集培养发酵罐中装有200mL的肠培养基，所述肠培养基为蛋白胨10g/L、牛肉浸膏10g/L、酵母提取物5g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠5g/L、吐温801mL/L、柠檬酸氢二铵2g/L、磷酸氢二钾2g/L、七水硫酸镁0.6g/L、一水硫酸锰0.25g/L；
发酵培养条件为：设定人体仿真数据，模拟人体每日进食排便情况，温度30-45℃、发酵液初始pH为6-8，培养时间72h，为控制发酵严格的厌氧环境，每日早、中、晚对每个发酵罐通氮气以排尽发酵罐内的空气。
5.如权利要求1所述的一种预防肾结石及其复发的复合益生菌活菌粉剂，其特征在于步骤1）中选择培养基发酵罐内装有选择培养基，选择培养基以草酸盐为唯一碳源的选择培养基，具体包括：蛋白胨10g/L、牛肉浸膏10g/L、酵母提取物5g/L、草酸盐20g/L、乙酸钠5g/L、吐温801mL/L、柠檬酸氢二铵2g/L、磷酸氢二钾2g/L、七水硫酸镁0.6g/L、一水硫酸锰0.25g/L；
选择培养条件：温度30-45℃、选择培养夜初始pH为6-8，培养时间72h，为控制发酵严格的厌氧环境，每日早、中、晚对每个发酵罐通氮气以排尽发酵罐内的空气。
6.如权利要求1所述的一种预防肾结石及其复发的复合益生菌活菌粉剂，其特征在于步骤1）中选择固体培养基为：琼脂12g/L、胨化乳15g/L、酵母提取物5g/L、葡萄糖20g/L、番茄浸出粉、吐温801 mL/L、磷酸二氢钾2g/L；
选择培养条件：温度30-45℃、选择培养液初始pH为6-8，培养时间48h。
7.如权利要求1所述的一种预防肾结石及其复发的复合益生菌活菌粉剂，其特征在于步骤2）中筛选出能降解草酸的菌为鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌,分别接种3%鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌至富集发酵罐中混合发酵扩培；
扩培的条件为：温度37℃，摇床150r/min，通风量13.5mL/min，初始 pH值为7.5，培养时间24 h。
8.如权利要求1所述的一种预防肾结石及其复发的复合益生菌活菌粉剂，其特征在于步骤4）中冷冻干燥过程可分为三个阶段，第一阶段为预冻，将物料降温至-40℃，维持冷却4小时后开始抽真空；第二阶段为升华，为干燥的主要阶段，打开真空泵，同时将物料温度由-50℃升温至-30℃，通过间隙开循环泵使物料升温速度控制在每小时5℃，物料温度维持在-25℃，维持时间为10小时；第三阶段为终干燥，通过快速升温，将物料温度由-25℃升至20℃，升温速度控制在每小时5℃，使物料中最后的结合水蒸发掉，维持时间为2h。
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