CN114847347B - 一种含活性益生菌的发酵牛乳及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含活性益生菌的发酵牛乳及其制备方法，涉及食品发酵技术领域。所述益生菌发酵牛乳的制备方法包括以下步骤：将活化益生菌接种到复原全脂牛乳中培养，得到发酵牛乳；其中所述益生菌包括保加利亚乳杆菌或者副干酪乳杆菌。本发明通过以牛乳为原料，ACE抑制率和抗氧化性为指标，并利用超滤和LC‑MS/MS对ACE抑制肽和抗氧化肽进行分离和鉴定，最后优化了菌株MF55发酵牛乳的工艺条件，并对活性益生菌发酵牛乳进行冷藏研究。本发明开发了功能性益生菌发酵牛乳，为生物活性肽益生菌发酵乳的研发提供理论和技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及食品发酵技术领域，特别是涉及一种含活性益生菌的发酵牛乳及其制备方法。
背景技术
膳食中的蛋白质提供了丰富的生物活性肽，这些多肽在亲本蛋白序列中是不活跃的，需要通过酶或者微生物将其水解释放出来。生物活性肽被定义为对身体功能或条件有积极影响并可能最终促进人体健康的特定蛋白质片段。生物活性肽主要来源于动、植物蛋白和一些微生物，目前乳蛋白被认为是生物活性肽很重要的来源，越来越多的生物活性肽在乳蛋白水解物和发酵乳制品中被发现，乳源生物活性肽常作用于心血管系统、胃肠道、免疫系统和神经系统。
ACE抑制肽作为天然的ACE抑制剂，能够使得ACE的活性受到抑制从而降低血管紧张素Ⅱ的浓度，来控制血压的升高，相比于化学合成的ACE抑制剂，天然食品中所得到的ACE抑制肽具有稳定且基本无副作用的特点。抗氧化肽和ACE抑制肽可以从很多食品中获得，其中动物的乳是很重要的一种。
益生菌发酵乳产生物活性肽是国内外研究的热点，但研究主要集中在单种活性肽，比如ACE抑制活性、抗菌性、抗氧化性等。现有技术研究益生菌发酵牛乳产ACE抑制肽和抗氧化肽的研究不多，因此开发出含ACE抑制肽和抗氧化肽的发酵牛乳，以增加发酵牛乳的的功能性，这将为发酵乳行业提供优良菌种和功能性发酵牛乳的研发提供理论支持和技术参考。
发明内容
本发明的目的是提供一种含活性益生菌的发酵牛乳及其制备方法，以解决上述现有技术存在的问题，以增加发酵牛乳的的功能性。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
技术方案一：一种含活性益生菌的发酵牛乳，所述活性益生菌中的活性成分为抗氧化肽和ACE抑制肽，所述益生菌为保加利亚乳杆菌或副干酪乳杆菌。
进一步地，所述保加利亚乳杆菌为保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)MF55，其保藏号为ATCC 7517；所述副干酪乳杆菌为副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)MF48，其保藏编号为CICC 20284。
进一步地，所述益生菌为保加利亚乳杆菌时，所述发酵牛乳中的活性物质抗氧化肽和ACE抑制肽肽段为：EKVNELSK、HIQKEDVPSER、HQGLPQEVLNENLLR、VNELSK、VPQLER、AMKPWIQPK、ITVDDK、ITVDDKHYQK、LTEEEK、LTEEEKNR、NMAINPSK、RNAVPITPTLNR、TKLTEEEK、LNFLK、NAVPITPTLNR、AVPYPQR、EAMAPK、EMPFPK、HKEMPFPK、VKEAMAPK、VLPVPQK、YPVEPFTER、GPFPIIV、SCQAQPTTMAR、FFSDK、LDQWLCEK；所述益生菌为副干酪乳杆菌时，所述发酵牛乳中的活性物质抗氧化肽和ACE抑制肽肽段为：VNELSK、VPQLER、LHSMK、AMKPWIQPK、ITVDDK、ITVDDKHYQK、LTEEEK、LTEEEKNR、TKLTEEEK、TKLTEEEKNR、TVDMESTEVFTK、LNFLK、NAVPITPTLNR、AVPYPQR、EAMAPK、EMPFPK、HKEMPFPK、VKEAMAPK、GPFPIIV、DELQDK、SCQAQPTTMAR、FFSDK、LDQWLCEK。
进一步地，所述发酵牛乳中ACE抑制率为48.71％-69.03％，DPPH自由基清除率为65.02％-72.72％，亚铁离子螯合率为61.67％-76.45％，感官评价为81.17％-87.17％。
技术方案二：一种所述的发酵牛乳的制备方法，包括以下步骤：将活化益生菌接种到复原全脂牛乳中培养，得到益生菌发酵牛乳；所述益生菌包括所述的保加利亚乳杆菌或副干酪乳杆菌。
进一步地，所述复原全脂牛乳中固形物含量，按照体积比计为12.5％。
进一步地，所述益生菌按照体积比计，按0.5％-1.5％接种于所述复原全脂牛乳中。
进一步地，所述益生菌发酵牛乳的发酵时间为8-12h，发酵温度为34-37℃。
进一步地，所述发酵牛乳在2-4℃下保质期为28d，所述发酵牛乳的肽含量为0.44mg/mL-0.52mg/mL、ACE抑制活性为45％-69％、DPPH自由基清除率为68％-75％、亚铁离子螯合能力为60％-83％、羟自由基清除率为72％-77％、活菌数为3.08×108CFU/g-8.90×108CFU/g和感官评价为75分-88分。
本发明公开了以下技术效果：
本发明通过以牛乳为原料，ACE抑制率和抗氧化性为指标，将菌株MF55和MF48在牛乳中培养后进行代谢组学分析，并利用超滤和LC-MS/MS对ACE抑制肽和抗氧化肽进行分离和鉴定，最后优化了菌株MF55发酵牛乳的工艺条件，并对发酵乳进行冷藏研究。
通过单因素试验和定制试验设计对保加利亚乳杆菌MF55发酵牛乳工艺进行了优化，得到活性益生菌发酵牛乳的制备工艺参数范围为：保加利亚乳杆菌MF55接种量0.5％-1.5％，发酵时间8-12h，培养温度34-37℃，制备的活性益生菌发酵牛乳ACE抑制率为48.71％-71.33％，DPPH自由基清除率为65.02％-72.72％，亚铁离子螯合率为61.67％-76.45％，感官评价为81.17-87.17分。冷藏过程中，冷藏4周其活菌数仍高于108CFU/ml，表明菌株MF55在冷藏期内较稳定。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1中的A为样品的ACE抑制率变化；B为样品的DPPH自由基清除率变化；C为样品的羟自由基螯合率变化；D为样品的超氧阴离子清除率变化；E为样品的亚铁离子螯合率变化；F为样品的酸度变化；G为样品的pH值变化；
图2为接种量对保加利亚乳杆菌MF55发酵牛乳的影响；其中，A为ACE抑制率变化；B为DPPH自由基清除率变化；C为亚铁离子螯合率变化；D为羟自由基清除率变化；E为酸度变化；F为pH值变化；G为感官评价得分变化；H为蛋白质水解度变化；
图3为发酵温度对保加利亚乳杆菌MF55发酵牛乳的影响；A为ACE抑制率变化；B为DPPH自由基清除率变化；C为亚铁离子螯合率变化；D为羟自由基清除率变化；E为酸度变化；F为pH值变化；G为蛋白质水解度变化；
图4为发酵时间对保加利亚乳杆菌MF55发酵牛乳的影响；其中，A为ACE抑制率变化；B为DPPH自由基清除率变化；C为亚铁离子螯合率变化；D为羟自由基清除率变化；E为酸度变化；F为pH值变化；G为感官评价得分变化；H为蛋白质水解度变化；
图5为保加利亚乳杆菌MF55菌株发酵牛乳冷藏过程中肽含量和ACE抑制率的变化；其中，A为肽含量浓度变化；B为ACE抑制率的变化；
图6为保加利亚乳杆菌MF55菌株发酵牛乳冷藏过程中的变化；其中，A为DPPH自由基清除率；B为亚铁离子螯合能力；C为羟自由基清除率的变化；
图7为保加利亚乳杆菌MF55菌株发酵牛乳冷藏过程中pH和酸度的变化；其中，A为pH值变化；B为酸度变化。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
1、菌株：保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)MF55，购自美国典型培养物收藏中心，保藏编号ATCC 7517；副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)MF48购自中国工业微生物菌种收藏中心，保藏编号CICC 20284。
2、实验方法
2.1复原全脂牛乳制备
复原全脂牛乳：用水将全脂牛乳配制成12.5％(m/v)的复原乳，灭菌获得复原全脂牛乳。
2.2菌株活化
将实验室冷冻保藏的保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)MF55和副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)MF48两株益生菌菌粉，分别接种于MRS肉汤培养基中，37℃恒温培养24h。再将其以2％的接种量(v/v)接种于10％(m/v)的复原全脂牛乳(115℃灭菌10min，冷却至室温)中，混匀后于37℃恒温18h，完成一次活化，重复以上操作两次，活化三代。
2.3发酵乳清制备
将活化的益生菌以5％的接种量接种于复原全脂牛乳，37℃恒温培养18h后取出，然后将发酵乳置于100ml烧杯中，测定pH值。之后用1mol/L的HCL将pH调至3.4-3.6，在4℃于5000r/min离心15min，分离上清液，再用1mol/L的NaOH将上清液pH调节至8.3，在4℃于5000r/min离心15min，分离并收集上清液即乳清样品备用。
2.4抗氧化肽和ACE抑制肽样品制备
采用超滤分离MF55与MF48发酵获得的牛乳乳清各组分，各乳清样品名称分别为：MF55_N和MF48_N，先将聚醚砜膜用0.1％的NaOH溶液进行清洗，再用蒸馏水清洗到中性，然后将牛乳发酵乳的乳清先通过孔径为5KDa的聚醚砜膜，再把得到的滤液通过孔径为3KDa的聚醚砜膜，分别得到分子量大于5KDa、3-5KDa之间和小于3KDa的超滤液，再将其冷冻干燥，冻干条件为-35℃预冻4-6h，-55℃真空度4-6pa下冻干24h，获得抗氧化肽和ACE抑制肽样品，并测定抗氧化性和ACE抑制活性。
2.5质谱法鉴定ACE抑制肽和抗氧化肽
1)供试品预处理
将牛乳乳清小于3KDa的超滤液复溶于0.1％FA溶液中，-20℃保存待用。
2)质谱分析
A液为0.1％甲酸的水溶液，B液为0.1％甲酸的乙腈水溶液(乙腈为84％)。色谱柱以95％的A液平衡后,样品由自动进样器上样至Trap柱，0.5H梯度。
3)质谱数据采集
多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集:每次全扫描(full scan)后采集20个碎片图谱(MS2 scan)。
4)数据分析
质谱测试原始文件(raw file)用Proteome Discoverer1.4软件检索相应的数据库,最后得到鉴定的肽及其在乳蛋白中的氨基酸序列。
2.6定制试验设计优化益生菌发酵牛乳乳工艺及冷藏研究
将目的菌株用方法2.2活化三代，将活化的菌种接种于12.5％(m/v)复原的全脂牛乳中，研究发酵时间(3h、6h、9h、12h)、发酵温度(31℃、34℃、37℃、40℃)、接种量(1％、2％、3％、4％、5％)对MF55菌株发酵牛乳的影响，以发酵乳pH值、酸度、水解度、味道，发酵乳乳清ACE抑制率、DPPH自由基清除率、羟自由基清除率、亚铁离子螯合能力为指标进行测定。基础实验条件为发酵时间9h、发酵温度37℃、接种量3％，获得各单因素适宜条件，然后采用定制试验设计优化抗氧化肽和ACE抑制肽益生菌发酵乳工艺参数，并进行验证。按照确定的工艺参数，制作全脂牛乳的益生菌发酵乳，将其置于冰箱4℃冷藏，在0d、1d、3d、7d、14d、21d、28d测定其ACE抑制率、DPPH自由基清除率、羟自由基清除率、亚铁离子螯合能力、感官评价、持水力、质构、粒径、活菌数、肽含量、pH值和酸度的变化。
3、分析检测方法
3.1发酵乳酸度和pH值测定
酸度值的测定采用NaOH滴定法，最终值用吉尔涅尔度(°T)表示。取发酵乳5ml于锥形瓶中，加入10ml蒸馏水和2-3滴1.0％酚酞试剂，并用0.1mol/L的NaOH溶液滴定，滴定过程中不断摇匀，直至观察到有微红色出现且在半分钟内颜色不褪去即为滴定终点。记录消耗的NaOH溶液体积(ml)并乘以20，即得到酸度值。
pH值测定：取5ml发酵乳于小烧杯中，用酸度计进行测定。
3.2ACE抑制率测定
硼酸盐缓冲溶液：用超纯水配制的0.3mol/LNaCl和0.1mol/L硼酸的混合溶液用6mol/L的NaOH将pH调节到8.3即得到所需缓冲液。
如表1所示，按照顺序将溶液加入到试管中，在37℃水浴预热5min后，加入ACE溶液(0.1U/ml，硼酸盐缓冲液配制)，在37℃水浴中反应30min，加入1mol/L的盐酸终止反应，在试管中加入1.5ml乙酸乙酯，用涡旋混合器混合15s，静置10min使溶液分层。取上层溶液1ml，置于120℃烘箱中30min待溶液完全烘干。取出试管待试管冷却后加入2ml超纯水，用涡旋混合器混合15s，于228nm处测定吸光度，按照公式1计算ACE抑制率：
式中：Aa——a组的吸光度，试管中ACE、发酵乳乳清和HHL同时发生反应；Ab—b组的吸光度，试管中无发酵乳乳清，ACE与HHL发生反应；Ac—c组的吸光度，反应前先用盐酸让ACE失活，作为空白组。
表1
3.3抗氧化性测定
a.DPPH自由基清除率测定
用95％的乙醇将DPPH配制成0.1mmol/L的溶液，在试管中加入1ml发酵乳和4mlDPPH溶液混匀后为实验组，将1ml乙醇溶液与4ml DPPH溶液混匀后作为对照组，1ml发酵乳乳清与4ml乙醇溶液混合作为空白组。混匀后，在黑暗中静置30min，在517nm处测量吸光度。按照公式2计算DPPH自由基清除率：
式中：A1——实验组吸光度；A2——对照组吸光度；A3——空白组吸光度。
b.亚铁离子螯合能力测定
向试管中加入1ml待测液和3.7ml蒸馏水，再加入0.1ml 2mmol/L的FeCl2溶液和0.2ml 5mmol/L的ferrozine溶液，混合均匀，在室温下静置20min，于562nm处测定吸光度，对照组用蒸馏水代替待测液，其余操作相同。按照公式3计算亚铁离子螯合能力：
式中：A1——样品组吸光度；A2——对照组吸光度。
c.羟自由基清除率测定
向试管中加入0.5ml待测液和1ml 9mmol/L FeSO4溶液混合均匀，再向试管中加入1ml 10mmol/L的H2O2溶液，混匀后在37℃水浴锅中静置10min，取出后在试管中加入9mmol/L的水杨酸溶液1ml，混匀后在37℃水浴锅中静置30min，取出后在510nm处测定混合液的吸光度。对照组把待测液换成蒸馏水，其余操作相同。按照公式4计算羟自由基清除率：
式中：A1——样品组吸光度；A2——对照组吸光度。
d.超氧阴离子自由基清除率测定
向试管中加入150mmol/LTris-HCl缓冲液(pH＝8.0)2ml，再加入1.2mmol/L的邻苯三酚溶液(10mmol/L盐酸配制)，最后加入0.5ml样品溶液，充分混匀，在室温下静置30min，测定溶液在325nm处的吸光度，对照组把待测液换成蒸馏水，其余操作相同。按照公式5计算超氧阴离子自由基清除率：
式中：A1——样品组吸光度；A2——对照组吸光度。
3.4蛋白质水解度测定
利用pH-state法通过加入的用于维持体系pH的碱或酸的量可以直接计算出蛋白水解度DH。DH按照公式6计算：
式中：B——NaOH体积(ml)；Mb——NaOH浓度(mol/L)；α——酪蛋白水解的解离度；Mp——蛋白质质量(g)；Htot——每克蛋白质中肽键毫摩尔数(mmol/g)，酪蛋白取8.2。
3.5益生菌发酵牛乳感官评价
表2
3.6持水力
称取20g(0.001g)发酵乳于4℃在6000r/min离心20min。将上清液倒去，称取沉淀的质量m，持水力按照公式7计算：
式中：m——沉淀的质量(g)；M——发酵乳的质量(g)。
3.7肽含量测定
取待测乳清样液2.5mL，加入10％(W/V)的三氯乙酸(TCA)水溶液2.5mL，充分混匀后静置10min，于4000r/min离心15min。将得到的上清液置于50mL容量瓶中以5％的TCA溶液定容匀，并取6.0mL上述溶液与4.0mL双缩脲充分混合，静置10min，于2000r/min离心10min后取出。将上清液于540nm下测定吸光度，代入关系式y＝0.1669x-0.0051，得到肽浓度，其中y和x分别为样品吸光度和肽浓度。
3.8活菌数测定
利用涂布平板法测定活菌数，将配好的MRS培养基分装到250ml锥形瓶中121℃灭菌15min，冷却至60℃左右，向无菌平皿中加入15ml的培养基，待冷却凝固时可使用。将1ml发酵乳用无菌生理盐水按照10的倍数进行梯度稀释，进行预实验预估合适稀释倍数后，选择该倍数及相邻的两个梯度，将0.1ml菌液涂布在平板上，37℃恒温培养箱中倒置培养48h左右，选取菌落数在30-300的平板进行计数。
3.9质构分析
用英国SMS公司TA.XT型物性测试仪，选用A/BE探头对样品进行测试，每个样品平行测定三次，具体参数如表3所示：
表3
最终通过测定可以获得硬度、稠度、粘聚性、粘度指数四个物理性质。
2保加利亚乳杆菌MF55发酵牛乳的工艺优化
2.1发酵条件对保加利亚乳杆菌MF55发酵牛乳的影响
接种量对保加利亚乳杆菌MF55发酵牛乳的ACE抑制率、DPPH自由基清除率、羟自由基清除率、亚铁离子螯合能力、味道、pH值、酸度和蛋白质水解度的影响如图2所示。
发酵温度对保加利亚乳杆菌MF55发酵牛乳的ACE抑制率、DPPH自由基清除率、羟自由基清除率、亚铁离子螯合能力、味道、pH值、酸度和蛋白质水解度的影响如图3所示。
发酵时间对保加利亚乳杆菌MF55发酵牛乳的ACE抑制率、DPPH自由基清除率、羟自由基清除率、亚铁离子螯合能力、味道、pH值、酸度和蛋白质水解度的影响如图4所示。
如图2所示，牛乳ACE抑制率随着接种量的升高而不断降低，在接种量为2％时达到最大值。判断是因为接种量在上升时菌种在相同时间内生长速度更快，产肽多，但接种量过大时，菌体产酸过快，pH下降快，在pH下降到一定程度后抑制了ACE抑制肽的产生。
抗氧化性方面，牛乳的DPPH自由基清除率几乎不受接种量的影响。牛乳亚铁离子螯合率随着接种量增加先增加后降低，在接种量3％时取得最大值，牛乳的羟自由基清除率几乎不受接种量的影响。
牛乳的酸度随着接种量的增加酸度缓慢上升，pH值都随着接种量的上升缓慢下降，可以看出菌体初试基数越大，一定时间内，菌体数量增长快，产酸更多。牛乳在接种量为3％时的感官得分有明显优势，可能是因为接种量小，发酵不完全，影响凝乳状态，在接种量过大时，产酸过度，影响口感。牛乳的蛋白质水解度随着接种量的升高而上升，和酸度变化趋势一致，但从变化幅度来看，菌体接种量对牛乳蛋白质的水解度影响并不明显。
通过发酵乳产肽情况和口感得分综合考虑，选择牛乳的接种量为1％继续优化。
如图3所示，牛乳ACE抑制率随温度升高先上升后下降，均于37℃达到最大值，考虑随着发酵温度的升高，菌体生长代谢速度加快，产ACE抑制肽的量升高，在温度过高时，菌体生长受到影响导致产ACE抑制肽的含量降低。
抗氧化性方面，牛乳的DPPH自由基清除率随发酵温度的上升不断增加，可能是由于温度越高越有利于能够清除DPPH自由基的抗氧化肽的产生。牛乳的亚铁离子螯合率随着发酵温度的增加先上升后下降，在34℃达到最大值，37℃到40℃明显下降，可能是在31℃-34℃菌体代谢加快，发酵9h时产肽量更多，超过34℃时，尤其是在37℃以上牛乳中的菌体代谢过快，产生的能够螯合亚铁离子的肽被当作营养物质利用，进一步分解成小分子肽。牛乳羟自由基清除率随着温度的升高先减小后增加，在发酵温度为40℃时达到最高。
牛乳的酸度随着发酵温度的上升而上升，pH随着发酵温度的上升不断下降，可能是因为随着温度的升高，菌株生长速度加快，产酸量多。感官评价均随着温度的升高先增加后降低，分别在34℃、37℃和34℃得到最佳感官评价。蛋白质水解度均随着温度的升高而升高，可以看出温度对菌体整体生长的过程起促进作用。通过发酵乳产肽情况和口感得分综合考虑，选择牛乳的发酵温度为34℃进一步优化。
如图4所示，牛乳的ACE抑制率随着发酵时间的延长不断增加。抗氧化性方面，牛乳的DPPH自由基清除率随发酵时间的延长先增加后降低，在9h左右出现最大值，可能是由于随着发酵时间延长，有一部分抗氧化肽被分解成更小的肽段导致失去了DPPH自由基清除的能力。牛乳在3h-6h亚铁离子螯合率明显降低，可能是因为乳清中能够清除亚铁离子的可溶性酪蛋白被分解，在6h-9h亚铁离子螯合率增加，9h-12h稍有降低，可能是在9h后，能够清除亚铁离子的肽被分解成更小的肽，从而导致清除率降低。牛乳的羟自由基清除率随着发酵时间延长不断上升。
随着发酵时间延长，牛乳的酸度不断上升，且上升速度不断降低，pH值不断下降，且下降速度不断放缓，可能是因为随着发酵时间越来越长，营养物质的减少和产酸的积累菌体生长代谢速度下降导致。牛乳的感官得分均在3h-6h内明显提高，6h-12h逐渐降低。在3h的时候，乳发酵十分不完全，还未完成凝乳，味道寡淡，不够细腻。在6h的时候，发酵乳味觉感受达到最佳。继续发酵，酸度继续增大，乳清析出，导致味道过酸，感官评价变差。随着发酵时间的延长，牛乳的蛋白质水解度逐渐上升，且在12h内蛋白质水解的速度很快，可以看出，在12h以内菌体生长代谢的速度持续比较高。
通过发酵乳产肽情况和口感得分综合考虑，牛乳的发酵时间为10h进一步优化。
3定制设计法优化保加利亚乳杆菌MF55发酵牛乳
定制试验设计优化益生菌发酵牛乳工艺及冷藏研究：将目的菌株活化三代，将活化的菌种接种于复原的全脂12.5％(m/v)牛乳中，研究发酵时间、发酵温度、接种量对MF55菌株发酵牛乳的影响，以发酵乳pH值、酸度、水解度、味道，发酵乳乳清ACE抑制率、DPPH自由基清除率、羟自由基清除率、亚铁离子螯合能力为指标进行测定。基础实验条件为发酵时间9h、发酵温度37℃、接种量3％，获得各单因素适宜条件，然后采用定制试验设计优化抗氧化肽和ACE抑制肽益生菌发酵乳工艺参数，并进行验证。按照确定的工艺参数，制作牛乳的益生菌发酵乳，将其置于冰箱冷藏，在0d、1d、3d、7d、14d、21d、28d测定其ACE抑制率、DPPH自由基清除率、羟自由基清除率、亚铁离子螯合能力、感官评价、持水力、质构、粒径、活菌数、肽含量、pH值和酸度的变化。
根据单因素试验结果，以X1(接种量)、X2(发酵时间)、X3(发酵温度)为因素，以发酵乳Y1(ACE抑制率)、Y2(DPPH自由基清除率)、Y3(亚铁离子螯合率)、Y4(感官评价)和Y5(pH)为效应，采用定制试验设计优化发酵工艺。牛乳发酵工艺优化试验设计及结果详见表4。
表4
根据表4可知，当保加利亚乳杆菌MF55接种量0.5％-1.5％，发酵时间8-12h，培养温度34-37℃时，制备的活性益生菌发酵牛乳ACE抑制率为48.71％-71.33％，DPPH自由基清除率为65.02％-72.72％，亚铁离子螯合率为61.67％-76.45％，感官评价为81.17-87.17分。
4保加利亚乳杆菌MF55发酵牛乳的冷藏变化
4.1肽含量和ACE抑制率
冷藏期间保加利亚乳杆菌MF55发酵牛乳的肽含量和ACE抑制率变化如图5所示。牛乳在发酵终点到冷藏3d期间，肽含量小幅度上升，应该是因为牛乳中还有少量的酪蛋白未分解，在冷藏的过程中菌体继续代谢，肽含量增加。在冷藏的3-14d，肽含量开始降低，这可能是因为有一部分肽被分解成了更小的肽，导致检测不到。在冷藏14d以后，肽含量开始明显降低，可能是菌体在冷藏过程中的缓慢代谢将一部分肽继续当作营养物质消耗掉了。
牛乳ACE抑制率在发酵终点到冷藏3d几乎不变，之后的冷藏过程开始下降，在21d后下降明显。ACE抑制率下降的原因可能是因为小分子的肽在一段时间后也作为营养物质被菌体消耗。
4.2抗氧化性
冷藏期间保加利亚乳杆菌MF55发酵牛乳的DPPH自由基清除率、羟自由基清除率和亚铁离子螯合能力变化如图6所示。
牛乳DPPH自由基清除率随着冷藏时间先上升后下降，在7d出现最大值75.75％，随后便逐渐降低。牛乳的亚铁离子螯合率都随着冷藏时间的延长而增加。牛乳的羟自由基清除率随着冷藏时间延长先上升后下降，变化幅度不大。
4.3活菌数和感官评价
酸奶和发酵乳之所以对人体有益处，是因为其中含有大量的活菌，此为发酵乳营养价值的最重要指标，国标(GB 19302-2010)规定发酵乳中的益生菌数量应大于等于1×106CFU/ml。因此本研究对发酵乳在保藏中的活菌数变化做了测定。表5为保加利亚乳杆菌MF55发酵牛乳冷藏过程中活菌数和感官评价变化。
表5
由表5可知，发酵乳的活菌数均随着冷藏天数先增加后慢慢减少，牛乳发酵结束后活菌数在(8.69-9.11)×108CFU/ml之间，最大活菌数在冷藏一天后达到，这是因为在发酵结束后即便将发酵乳放进不适合菌体生长的4℃环境中，也会因为生长惯性导致生长在一定时间内继续进行，但在低温环境下时间延长后，菌体基本不再生长，冷藏时间继续延长，一定数量的菌体开始死亡。在冷藏后期，冷藏至第28d的时候牛乳下降至(3.06-3.10)×108CFU/ml，虽然远远小于最高值，但仍都在106CFU/ml以上，符合国标规定。
4.4pH值和酸度
冷藏期间MF55菌株发酵牛乳的pH和酸度的变化如图7所示。酸奶发酵的原因主要是益生菌在适宜温度下生长繁殖并产生乳酸，在这个过程中乳的pH值不断降低，酸度逐渐升高，4℃冷藏是为了通过低温降低菌体活力，防止产酸过度影响味道。
pH和酸度的变化，牛乳pH下降了0.08个单位，酸度上升了17.5°T，1-28d牛乳pH继续下降，酸度继续上升，但十分缓慢，牛乳每天pH约下降0.02-0.04个单位，酸度每天约上升2-4°T。在28d的保藏周期内，牛乳酸度上升了28.15°T，pH下降了0.21个单位。
5超滤发酵牛乳各组分的ACE抑制活性和抗氧化性
保加利亚乳杆菌MF55和MF48发酵牛乳到的2种发酵乳乳清(MF55_N，MF48_N)经过超滤后得到组分(A1：>5kDa；A2:3-5kDa；A3:<3kDa)，如表6所示，所有发酵乳乳清的组分多肽得率都随着分子量的减小而减小，可能是小分子量的肽中含有较多的寡肽和氨基酸，能通过双缩脲试剂检测到的肽含量少所导致，这和蔡俊研究大米抗氧化肽得到的结论一致。肽的ACE抑制活性和抗氧化活性随着组分的分子量减小升高，ACE抑制活性在肽的分子量小于3kDa的时候最高，有研究表明很多高ACE抑制活性的肽分子量都在3kDa以下，同样的，抗氧化性也在肽的分子量小于3kDa的时候最高，这与Kim等研究结果一致。结果表明，乳清经过超滤之后3kDa以下的组分具有较强的ACE抑制活性和抗氧化性，因此选择小于3kDa以下的组分进行下一步分析。
表6
将保加利亚乳杆菌MF55和MF48发酵牛乳乳清经超滤获得的A3(＜3KDa)组分，采用LC-MS/MS进行肽段分离和氨基酸序列鉴定。各肽段的氨基酸序列通过Mascot软件与数据库中牛乳蛋白进行比对，确定肽段来源及其在蛋白质中的具体位置，结果如表7所示。
表7
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肽段AMKPWIQPK、AVPYPQR、EAMAPK、EMPFPK、FFSDK、GPFPIIV、HKEMPFPK、ITVDDK、ITVDDKHYQK、LDQWLCEK、LNFLK、LTEEEK、LTEEEKNR、NAVPITPTLNR、SCQAQPTTMAR、TKLTEEEK、VKEAMAPK、VNELSK、VPQLER在MF55_N和MF48_N中均存在，说明保加利亚乳杆菌MF55和MF48在牛乳中产生的蛋白酶具有相同的酶切位点，说明保加利亚乳杆菌MF55和MF48在牛乳中产生的蛋白酶具有相同的酶切位点。
结论分析
定制试验设计优化保加利亚乳杆菌MF55发酵牛乳是可行的。牛乳发酵最佳工艺参数为接种量1.5％，发酵时间10h，发酵温度37℃，制备的发酵乳ACE抑制率70.11％，DPPH自由基清除率为69.20％，亚铁离子螯合率为60.02％，感官评价分数为89.50。
冷藏过程中，保加利亚乳杆菌MF55的发酵牛乳的pH逐渐下降，酸度逐渐上升，持水性逐渐上升，硬度，稠度，粘聚性比发酵终点高，亚铁离子螯合率不断上升，羟自由基清除率基本不变，肽浓度略低于发酵终点，牛乳ACE抑制率下降显著，但DPPH自由基清除率基本不变。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (6)
1.一种含活性益生菌的发酵牛乳，其特征在于，所述活性益生菌中的活性成分为抗氧化肽和ACE抑制肽，所述益生菌为保加利亚乳杆菌或副干酪乳杆菌；所述保加利亚乳杆菌为保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）MF55，其保藏号为ATCC 7517；所述副干酪乳杆菌为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）MF48，其保藏编号为CICC 20284；所述益生菌为保加利亚乳杆菌时，所述发酵牛乳中的活性物质抗氧化肽和ACE抑制肽肽段为：EKVNELSK、HIQKEDVPSER、HQGLPQEVLNENLLR、VNELSK、VPQLER、AMKPWIQPK、ITVDDK、ITVDDKHYQK、LTEEEK、LTEEEKNR、NMAINPSK、RNAVPITPTLNR、TKLTEEEK、LNFLK、NAVPITPTLNR、AVPYPQR、EAMAPK、EMPFPK、HKEMPFPK、VKEAMAPK、VLPVPQK、YPVEPFTER、GPFPIIV、SCQAQPTTMAR、FFSDK、LDQWLCEK；所述益生菌为副干酪乳杆菌时，所述发酵牛乳中的活性物质抗氧化肽和ACE抑制肽肽段为：VNELSK、VPQLER、LHSMK、AMKPWIQPK、ITVDDK、ITVDDKHYQK、LTEEEK、LTEEEKNR、TKLTEEEK、TKLTEEEKNR、TVDMESTEVFTK、LNFLK、NAVPITPTLNR、AVPYPQR、EAMAPK、EMPFPK、HKEMPFPK、VKEAMAPK、GPFPIIV、DELQDK、SCQAQPTTMAR、FFSDK、LDQWLCEK。
2.如权利要求1所述的发酵牛乳，其特征在于，所述保加利亚乳杆菌MF55制备得到的发酵牛乳中ACE抑制率为48.71%-69.03%，DPPH自由基清除率为65.02%-72.72%，亚铁离子螯合率为61.67%-76.45%，感官评价为81.17%-87.17%。
3.一种如权利要求1所述的发酵牛乳的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将活化益生菌接种到复原全脂牛乳中培养，得到益生菌发酵牛乳；所述益生菌为保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）MF55，其保藏号为ATCC 7517；所述副干酪乳杆菌为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）MF48，其保藏编号为CICC 20284；所述复原全脂牛乳中固形物含量，按照体积比计为12.5%。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，当所述益生菌为保加利亚乳杆菌MF55时，所述益生菌按照体积比计，按0.5%-1.5%接种于所述复原全脂牛乳中。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，当所述益生菌为保加利亚乳杆菌MF55时，所述益生菌发酵牛乳的发酵时间为8-12h，发酵温度为34-37˚C。
6.如权利要求3中所述的制备方法，其特征在于，当所述益生菌为保加利亚乳杆菌MF55时，所述益生菌制备得到的发酵牛乳在2-4℃下保质期为28d、肽含量为0.44mg/mL-0.52mg/mL、ACE抑制活性为45%-69%、DPPH自由基清除率为68%-75%、亚铁离子螯合能力为60%-83%、羟自由基清除率为72%-77%、活菌数为3.08×108CFU/g-8.90×108CFU/g和感官评价为75分-88分。
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