KR102621766B1 - 항노화, 항균 및 항염 활성을 갖는 발효녹용 추출물의 제조방법, 이로부터 얻어진 추출물 및 이러한 추출물의 용도 - Google Patents

항노화, 항균 및 항염 활성을 갖는 발효녹용 추출물의 제조방법, 이로부터 얻어진 추출물 및 이러한 추출물의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 발효 녹용 추출물 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 발효 녹용 추출물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 발효 녹용 추출물 제조방법은 기존의 발효 녹용 또는 이의 추출물보다 유용성 성분을 높게 보유하고 있는 바, 기능성 발효 녹용을 효과적으로 제조할 수 있다.

Description

항노화, 항균 및 항염 활성을 갖는 발효녹용 추출물의 제조방법, 이로부터 얻어진 추출물 및 이러한 추출물의 용도 {Method for producing fermented antler extract having anti-aging, antibacterial and anti-inflammatory activity, extract obtained therefrom, and use of such extract}
본 발명은 발효녹용 추출물의 제조방법, 이로부터 얻어진 추출물 및 이러한 추출물의 용도에 관한 것이다.
2019년 기준 국내 녹용 원료 소비시장은 약 630억원 374.7톤으로 녹용을 소비하는 세계 20여개 국가 중에서 우리나라는 중국 다음으로 세계 2번째로 녹용을 많이 소비하는 국가이다. 국내에서 한약제로 유통되는 수입 녹용은 뉴질랜드산(레드디어), 러시아산(엘크)이 주종을 이루고 있으며, 2019년 녹용 수입량은 306톤(523억원)이 수입되고 있으며, 국내산 녹용은 약 68.6톤이 생산되고 있으며, 엘크(대형종)가 47.0톤, 매화록(소형종)이 18.5톤이 생산되고 있으며, 이러한 녹용 사용 용도는 녹용추출액을 활용한 건강식품이 주종을 이루고 있으며, 파우치, 스틱, 분말, 액상분말 제품으로 활용되고 있다.
최근, 건강을 위해 다양한 발효녹용 가공제품의 수요가 늘어나고 있지만, 녹용의 노화 상태나 이용 부위에 따라 유용성 성분과 품질이 크게 좌우되어, 효능의 차이가 현저하므로 이에 대한 각별한 주의가 요구되고 있다. 녹용의 발효는 이용 부위를 기준으로 발효 이후 효과가 있으나, 녹용 유용성분이 높고 품질 좋은 녹용과의 비교시 녹용 고유 유용성분의 저하가 발생한다. 따라서 녹용의 하대 또는 녹각(오래된 녹용)만을 활용한 발효녹용은 정상적인 우수녹용(1~3등급)의 전녹용(전체부위의 녹용)부위를 원료로 발효녹용에 비하여 유용성분이 떨어진다. 또한 인류의 대부분의 발효식품은 신선한 원료를 기준으로 발효를 하지만, 건조 녹용에 대한 발효는 이미 물리화학적 열변성이 진행된 건조 원료를 기초로 발효하기 때문에 발효 효과가 미흡할 수 밖에 없다.
기존의 발효 기술은 녹용을 이미 건조하여 건조과정중 불용화가 진행된 이후 단계의 건조 녹용에 대한 발효 생산기술로, 신선한 생녹용 상태에 존재하는 녹용 고유의 가치가 높은 생리활성물질의 불활성화를 차단하지 못한 상태에서 발효이기 때문에 유용성분의 함량 및 최종 획득 고형분량이 제한되는 한계가 있다. 발효녹용의 기능성·생산성 향상을 위하여 녹용원료 품질 상태 가공건조 상태에 따라 최적합된 발효균주를 선택할 필요가 있으며, 녹용 품질과 제한된 균주를 선택할 경우, 다양한 다른 품질의 녹용에 대한 고유 유용물질 획득이나 기능성 물질의 생산수율 예측이 지난하다는 한계점에 있을 수 있다.
대한민국 등록특허 제10-2456704호
일 양상은 1) 녹용 원료를 1차 추출하여 1차 녹용 추출물을 수득하는 단계; 2) 상기 1차 추출 잔여물을 유산균으로 발효하는 단계; 3) 상기 2) 단계의 발효물로부터 2차 추출하여 2차 녹용 추출물을 수득하는 단계; 및 4) 상기 1차 녹용 추출물 및 2차 녹용 추출물을 포함하는 혼합물을 유산균으로 발효하는 단계를 포함하는, 녹용 발효 추출물 제조방법을 제공한다.
다른 양상은 상기 방법으로 제조된, 녹용 발효 추출물을 제공한다.
또 다른 양상은 상기 녹용 발효 추출물을 포함하는, 항노화용 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 상기 녹용 발효 추출물을 포함하는, 항균 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 상기 녹용 발효 추출물을 포함하는, 면역 증강용 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus) JLFR LR04 (수탁번호: KACC92399P), 락토바실러스 사케이 (Lactobacillus sakei) JLFR LS07 (수탁번호: KACC92398P) 및 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) LP20B49 (수탁번호: KACC92397P)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 균주; 상기 균주의 배양물; 상기 균주 또는 배양액의 농축물; 및 이들의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는, 녹용 발효용 조성물을 제공한다.
일 양상은 1) 녹용 원료를 1차 추출하여 1차 녹용 추출물을 수득하는 단계; 2) 상기 1차 추출 잔여물을 유산균으로 발효하는 단계; 3) 상기 2) 단계의 발효물로부터 2차 추출하여 2차 녹용 추출물을 수득하는 단계; 및 4) 상기 1차 녹용 추출물 및 2차 녹용 추출물을 포함하는 혼합물을 유산균으로 발효하는 단계를 포함하는, 녹용 발효 추출물 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 방법은 1) 녹용 원료를 1차 추출하여 1차 녹용 추출물을 수득하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서의 용어 "녹용(velvet antler)"은 숫사슴의 굳어지지 않은 어린 뿔을 채취하여 가공한 약재를 말하며, 한방에서는 늦봄에 숫사슴의 뿔이 떨어진 자리에 새롭게 자라기 시작한 뿔로서 털이 밀생되고 아직 골질화되지 않았거나 일부 골질화된 어린 뿔을 자른 다음 말린 것을 녹용이라 하고 가을이 되어 각질화된 뿔은 녹각이라고 한다.
사슴 중대형종의 녹용은 계절성 번식 특징을 갖는다. 녹용 성장은 하지(최장 일조량) 이후에도 외형적인 성장을 하나, 급격한 골질화로 인하여 유용성 기능물질의 감소가 일어나는 노화상태가 진행되어 품질이 떨어지게 된다. 국내에서는 이러한 녹용품질을 구분할 수 있도록 절각시기와 녹용의 노화상태에 따라 정상적인 제품은 1등급에서부터 5등급으로 구분되며, 비정상적인 제품은 등외 등급으로 구분한다. 또한 녹용의 부위는 최성장점을 기준으로 팁·분골·상대·중대·하대로 구분하고 있으며, 팁에서 하대로 진행될수록 유용성 기능물질의 현저한 감소가 발생한다. 이외의 녹각은 녹용 전체가 각질화가 진행된 상태로 녹용의 범주에 들어 가지 않는다.
녹용에는 다양한 활성 성분들이 함유되어 있는데, 특히 강장보신의 효능이 있어 여러 가지 허약증을 치료하는 대표적인 보약으로 알려져 왔다. 녹용은 간질, 궤양, 빈혈, 류머티즘, 중풍 등의 질환 치료 및 예방, 불면, 피로, 두통, 경련 등의 증상의 개선, 위장운동 촉진, 식욕증진, 신경쇠약 치료 및 개선, 병후회복, 노화방지, 기억력 증진, 성기능 회복 촉진, 그리고 상처 치유 촉진효능 등이 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 이유로 녹용은 우리나라에서 가장 많이 소모되는 동물성 생약이다.
상기 녹용 발효 추출물은 발효된 녹용으로부터 수득한 추출물을 의미하거나 및/또는 녹용 또는 이의 추출물을 발효시켜 수득한 발효물을 의미하는 것일 수 있다. 상기 녹용 발효 추출물은 발효 녹용 추출물 또는 녹용 발효물 등과 혼용하여 사용될 수 있다.
또한, 상기 추출물, 발효물 또는 발효 추출물은 발효 또는 추출 후 농축한 농축액 또는 농축물일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 녹용 원료는 생녹용, 건조 녹용 또는 발효 녹용일 수 있다. 또한, 상기 발효 녹용은 생녹용을 발효시키거나 또는 건조 녹용을 발효시킨 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 발효 녹용은 생녹용을 발효시킨 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 녹용 원료는 생녹용을 유산균으로 발효시킨 후 동결 건조시킨 것일 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "추출물"은 목적하는 물질을 다양한 용매에 침지한 다음, 상온 또는 가온상태에서 일정시간 동안 추출하여 수득한 액상성분, 상기 액상성분으로부터 용매를 제거하여 수득한 고형분 등의 결과물을 의미할 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 결과물에 더하여, 상기 결과물의 희석액, 이들의 농축액, 이들의 조정제물, 정제물, 건조물, 분말 또는 이들의 혼합물 등 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함하는 것으로 포괄적으로 해석될 수 있다.
상기 추출물은 상기 해당 원료의 천연, 혼합, 가공 상태로부터 추출될 수 있고, 조직 배양물 또는 건조물로부터도 추출이 가능하다.
상기 추출물의 추출 용매는 양성자성 극성 용매 또는 비양성자성 극성 및 비극성 용매일 수 있다. 상기 양성자성 극성 용매는 물, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 또는 뷰탄올일 수 있다. 상기 비양성자성 극성 용매는 디클로로메탄, 테트라히드로퓨란, 에틸아세테이트, 아세토니트릴, 디메틸포름아미드, 디메틸설폭시드, 아세톤, 2-뷰탄온, 또는 헥사메틸포스포르아미드일 수 있다. 상기 비극성 용매는 펜탄, 헥산, 클로로포름, 또는 디에틸에테르일 수 있다. 상기 비극성 용매는 벤젠이 제외된다. 상기 용매는 C1-C6의 알콜, C3-C10의 에스테르, 예를 들면, C3-C10의 아세테이트, C3-C10의 케톤, C1-C6의 비치환 또는 할로겐화 탄화수소, C2-C10 고리 에테르, 이들의 혼합물 또는 상기 용매 중 하나 이상과 물의 혼합물일 수 있다. 상기 용매는 에탄올, 프로판올, 아세토니트릴, 에틸아세테이트, 아세톤, 2-뷰탄온, 클로로포름, 디클로로메탄, 헥산, 이들의 혼합물, 또는 상기 용매 중 하나 이상과 물의 혼합물인 것일 수 있다. 상기 탄화수소는 알칸, 알켄, 또는 알킨일 수 있다.
상기 추출물은 물; 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 뷰탄올(buthanol) 등의 C1 내지 C4의 저급 알코올; 글리세린 (glycerine), 부틸렌글리콜 (butylene glycol), 프로필렌글리콜 (propylene glycol) 등의 다가 알코올; 및 메틸아세테이트(methyl acetate), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 아세톤(acetone), 벤젠(bezene), 헥산(hexane), 디에틸에테르(diethyl ether), 디클로로메탄(dichloromethane) 등의 탄화수소계 용매로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 용매로 추출한 것일 수 있다.
상기 추출물은 감압고온 추출, 열탕 추출, 환류 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 상온 추출, 초음파 추출, 증기 추출 및 분획 추출로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 방법으로 추출한 것일 수 있다.
상기 추출은 60 ℃내지 100 ℃에서 실시될 수 있고, 바람직하게는 65 ℃ 내지 95 ℃에서 실시될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 70 ℃ 내지 90℃에서 실시될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 추출은 4시간 내지 72시간 동안 실시될 수 있고, 바람직하게는 4시간 내지 24시간 동안 실시될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 4시간 내지 16시간 동안 실시될 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다.
본 명세서에서의 용어 "분획물"은 여러 다양한 구성 성분들을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 성분 그룹을 분리하기 위하여 분획을 수행하여 얻어진 결과물을 의미한다.
상기 분획물을 얻는 분획 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 분획 방법의 비제한적인 예로는, 다양한 용매를 처리하여 수행하는 분획법, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 수행하는 한외여과 분획법, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)를 수행하는 크로마토그래피 분획법, 및 이들의 조합 등이 있다.
상기 분획물을 얻는 데 사용되는 분획 용매의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 분획 용매는 물; 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 뷰탄올(buthanol) 등의 C1 내지 C4의 저급 알코올; 글리세린 (glycerine), 부틸렌글리콜 (butylene glycol), 프로필렌글리콜 (propylene glycol) 등의 다가 알코올; 및 메틸아세테이트(methyl acetate), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 아세톤(acetone), 벤젠(bezene), 헥산(hexane), 디에틸에테르(diethyl ether), 디클로로메탄(dichloromethane) 등의 탄화수소계 용매로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 용매를 포함하는 것일 수 있다.
상기 1차 녹용 추출물은 녹용 원료에 중량 대비 5 내지 20배수의 정제수를 가하여 추출하는 것일 수 있으며, 구체적으로 5 내지 20배수, 5 내지 18배수, 5 내지 15배수, 5 내지 13배수, 5 내지 10배수, 5 내지 8배수, 7 내지 20배수, 7 내지 18배수, 7 내지 15배수, 7 내지 13배수, 7 내지 10배수, 7 내지 8배수, 8 내지 20배수, 8 내지 18배수, 8 내지 15배수, 8 내지 13배수 또는 8 내지 10배수의 정제수를 가하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 1차 녹용 추출물은 60 내지 100 ℃ 추출하는 것일 수 있으며, 구체적으로 60 내지 100 ℃, 60 내지 95 ℃, 60 내지 90 ℃ 65 내지 100 ℃, 65 내지 95 ℃, 65 내지 90 ℃, 70 내지 100 ℃, 70 내지 95 ℃, 70 내지 90 ℃, 75 내지 100 ℃, 75 내지 95 ℃, 75 내지 90 ℃, 80 내지 100 ℃, 80 내지 95 ℃, 80 내지 90 ℃, 85 내지 100 ℃, 85 내지 95 ℃ 또는 85 내지 90 ℃ 조건으로 추출하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구현예에 있어서, 1차 녹용 추출물은 예를 들어 다음과 같은 방법으로 수득하였다: 녹용(Cervus elaphus Linne, 뿔) 원료에 중량 대비 8배수의 정제수를 가하고, 87±2℃에서 4시간동안 1 내지 3회 추출하여 추출물을 수득하였다. 또한, 각 추출에서 얻어진 추출물들을 혼합한 추출액을 냉각하여 원심분리한다. 원심분리액은 회전감압농축기(BUCHI, R-220)를 이용하여 55℃에서 농축하고, 동결건조(OPERON, FDT-12012)하여 녹용 추출분말을 수득하였다.
일 구현예에 있어서, 상기 1) 단계는 해동, 절편, 살균 및/또는 숙성된 생녹용에 유산균을 접종하여 발효시키는 단계; 발효된 생녹용을 동결건조시켜 동결건조 발효 녹용을 제조하는 단계; 및 상기 동결건조 발효 녹용을 추출하고 및/또는 농축하여 1차 녹용 추출물(농축물)을 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 상기 접종된 유산균은 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 사케이, 락토바실러스 플란타룸 일 수 있으며, 구체적으로 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus) JLFR LR04 (수탁번호: KACC92399P), 락토바실러스 사케이 (Lactobacillus sakei) JLFR LS07 (수탁번호: KACC92398P) 및 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) LP20B49 (수탁번호: KACC92397P)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법은 2) 상기 1차 추출 잔여물을 유산균으로 발효하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서의 용어 "발효"는 미생물이 자신이 가지고 있는 효소를 이용하여 유기물을 분해시키는 과정 중 부패 반응이 아닌 것을 의미한다.　발효　반응과 부패 반응은 비슷한 과정에 의해 진행되지만, 분해 결과 유용한 물질이 만들어지면　발효라고 하고 악취가 나거나 유해한 물질이 만들어지면 부패라고 한다. "발효물"은 상기　발효를 통해 생산되는 모든 물질을 의미한다. 상기 발효물은 발효액, 상기 발효액의 희석액 또는 농축액, 상기 발효액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물, 이를 분획한 분획물 등을 포함할 수 있다.
상기 방법은, 녹용 원료 및 발효 방법에 따라 적합한 균주를 선택하는 것을 포함하는 것일 수 있다. 따라서, 상기 방법에서 발효를 위해 사용되는 유산균은 녹용 원료 및 발효 방법에 따라 선택된 균주일 수 있다.
상기 균주 선택 기준은 녹용 품질(등급, 부위, 석회화 정도), 녹용 가공상태(건녹용, 동결건조녹용, 마이크로웨이브건조녹용, 녹용 농축액, 추출 후 잔여물, 녹용분말, 추출 후 분말 등) 및 녹용 발효방법(원물, 액상, 고상) 등으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
상기 유산균은 전통식품(된장, 간장, 청국장 또는 고추장 등), 김치 또는 유아의 분변에서 분리된 것일 수 있다.
상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus), 바실러스(Bacillus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 스트렙토코커스 (Streptococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 페디오코커스 (Pediococcus) 및 락토코커스(Lactococcus) 속으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
상기 유산균은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus　plantarum), 락토바실러스 람노서스(L.　rhamnosus), 락토바실러스 애시도필루스(L. acidophilus), 락토바실러스 카세이(L.　casei), 락토바실러스 사케이(L.　sakei), 락토바실러스 브레비스 (L.　brevis), 락토바실러스 퍼멘텀(L. fermentum), 락토바실러스 불가리쿠스(L.　bulgaricus), 락토바실러스 델브루에키 아종 락티스(L. delbruekii　subsp.　lactis), 락토바실러스 가세리 (L.　gasseri), 락토바실러스 헬베티쿠스(L.　helveticus), 락토바실러스 살리바리우스(L.　salivarius), 락토바실러스 루테리(L.　reuteri), 락토바실러스 크리스파투스(L.　crispatus), 락토바실러스 존소니(L. johnsonii)와 같은 락토바실러스 속의 유산균, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실러스 속의 유산균, 또는 비피도박테리움 브레베 (Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 롱굼(B.　longum), 비피도박테리움 인판티스(B.　infantis), 비피도박테리움 아돌레스센티스 (B.　adolescentis), 비피도박테리움 비피둠 (B. bifidum), 비피도박테리움 카테눌라툼 (B.　catenulatum), 비피도박테리움 슈도카테눌라툼(B. pseudocatenulatum), 비피도박테리움 앙굴라툼(B. angulatum), 비피도박테리움 갈리쿰(B.　gallicum), 비피도박테리움 락티스(B.　lactis), 비피도박테리움 아니말리스(B. animalis)와 같은 비피도박테리움 속의 유산균 등으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로, 상기 유산균은 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 사케이 및 락토바실러스 브레비스로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
상기 유산균은 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus) JLFR LR04 (수탁번호: KACC92399P), 락토바실러스 사케이 (Lactobacillus sakei) JLFR LS07 (수탁번호: KACC92398P) 및 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) LP20B49 (수탁번호: KACC92397P)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
상기 발효 조건은 일반적인 유산균 발효와 동일할 수 있으며, 구체적으로 25 내지 40 ℃에서 12 내지 120시간동안 수행될 수 있고, 구체적으로, 12 내지 120시간, 12 내지 108시간, 12 내지 96시간, 12 내지 84시간, 12 내지 72시간, 12 내지 60시간, 12 내지 48시간, 24 내지 120시간, 24 내지 108시간, 24 내지 96시간, 24 내지 84시간, 24 내지 72시간, 24 내지 60시간, 24 내지 48시간, 36 내지 120시간, 36 내지 108시간, 36 내지 96시간, 36 내지 84시간, 36 내지 72시간, 36 내지 60시간 또는 36 내지 48시간동안 수행될 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 2) 단계는 추출 잔여물을 효소 처리하는 단계를 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로, 상기 2) 단계는 상기 1차 추출 잔여물을 효소 처리한 후 유산균으로 발효하는 것일 수 있다.
상기 효소 처리는 Alcalase, Flavourzyme, Neutrase, protamex 및 papain, lipopan로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 효소를 처리하는 것일 수 있으며, 상기 선택된 효소들을 동시에 또는 순차적으로 처리하는 것일 수 있다.
상기 2) 단계는 고상 발효를 수행하는 것일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 2) 단계는 1차 추출 잔여물을 열풍 건조시키는 단계; 건조된 추출 잔여물을 멸균시키는 단계; 및 멸균된 추출 잔여물에 유산균을 접종하여 고상 발효시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 2) 단계는 1차 추출 잔여물을 약 1 내지 2일동안 열풍 건조(약 45℃) 시키는 단계; 건조된 추출 잔여물을 약 121℃ 조건에서 10-20분동안 멸균시키는 단계; 및 멸균된 추출 잔여물에 유산균을 접종하여 약 2 내지 5일동안 고상 발효시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 유산균은 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 람노서스 및 락토바실러스 사케이 중 선택된 하나 이상일 수 있으며, 구체적으로, 상기 유산균은 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus) JLFR LR04 (수탁번호: KACC92399P), 락토바실러스 사케이 (Lactobacillus sakei) JLFR LS07 (수탁번호: KACC92398P) 및 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) LP20B49 (수탁번호: KACC92397P)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
상기 열풍 건조된 추출 잔여물의 수분 함량은 10% 이내일 수 있으며, 구체적으로, 10% 이하, 8% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하 또는 3% 이하일 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 열풍 건조된 추출 잔여물의 수분 함량은 0.1% 내지 10%, 0.1% 내지 8%, 0.1% 내지 6%, 0.1% 내지 5%, 0.1% 내지 4%, 0.1% 내지 3%, 0.5% 내지 10%, 0.5% 내지 8%, 0.5% 내지 6%, 0.5% 내지 5%, 0.5% 내지 4%, 0.5% 내지 3%, 1% 내지 10%, 1% 내지 8%, 1% 내지 6%, 1% 내지 5%, 1% 내지 4%, 1% 내지 3%, 2% 내지 10%, 2% 내지 8%, 2% 내지 6%, 2% 내지 5%, 2% 내지 4% 또는 2% 내지 3%일 수 있다.
상기 방법은, 3) 상기 2) 단계의 발효물로부터 2차 추출하여 2차 녹용 추출물을 수득하는 단계를 포함한다.
상기 방법에 있어서, 상기 3) 단계는 1차 추출 잔여물을 발효시킨 발효물로부터 추출물 또는 농축물을 수득하는 단계일 수 있으며, 상기 단계에서 수득한 추출물은 2차 녹용 추출물(농축물)이라고 명명할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 3) 단계는 상기 발효물에 용매로서 물을 사용하여 추출하는 단계; 및 상기 추출물을 농축하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 2차 녹용 추출물은 녹용 원료에 중량 대비 5 내지 30배수의 정제수를 가하여 추출하는 것일 수 있으며, 구체적으로 5 내지 30배수, 5 내지 25배수, 5 내지 20배수, 10 내지 30배수, 10 내지 25배수, 10 내지 20배수, 15 내지 30배수, 15 내지 25배수, 20 내지 30배수 또는 20 내지 25배수의 정제수를 가하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 2차 녹용 추출물은 30 내지 60 ℃추출하는 것일 수 있으며, 구체적으로 30 내지 60 ℃, 30 내지 55 ℃, 30 내지 50 ℃, 30 내지 45 ℃, 35 내지 60 ℃, 35 내지 55 ℃, 35 내지 50 ℃, 35 내지 45 ℃, 40 내지 60 ℃, 40 내지 55 ℃, 40 내지 50 ℃ 또는 40 내지 45 ℃ 조건으로 추출하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 3) 단계는 상기 발효물에 용매로서 약 20배수의 물을 사용하여 약 45 ℃ 조건으로 약 3시간동안 추출하는 단계; 및 상기 추출물을 약 4.5 brix 이상으로 농축하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법은, 4) 상기 1차 녹용 추출물 및 2차 녹용 추출물을 포함하는 혼합물을 유산균으로 발효하는 단계를 포함한다.
상기 4) 단계는 상기 1) 단계에서 수득한 1차 녹용 추출물(농축물) 및 상기 3) 단계에서 수득한 2차 녹용 추출물(농축물)을 포함하는 혼합물을 발효시켜 발효물을 수득하는 것일 수 있다.
상기 혼합물은 1차 녹용 추출물 및 2차 녹용 추출물을 1:9 내지 9:1의 부피비로 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 혼합물의 1차 녹용 추출물:2차 녹용 추출물의 부피비는 1:9 내지 9:1, 1:9 내지 8:2, 1:9 내지 7:3, 1:9 내지 6:4, 2:8 내지 9:1, 2:8 내지 8:2, 2:8 내지 7:3, 2:8 내지 6:4, 3:7 내지 9:1, 3:7 내지 8:2, 3:7 내지 7:3, 3:7 내지 6:4, 4:6 내지 9:1, 4:6 내지 8:2, 4:6 내지 7:3 또는 4:6 내지 6:4일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 4) 단계는 상기 1차 녹용 추출물(농축물) 및 상기 2차 녹용 추출물(농축물)을 혼합하는 단계; 상기 혼합물에 유산균을 접종하여 약 5일동안 액상 발효시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 유산균은 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 람노서스 및 락토바실러스 사케이 중 선택된 하나 이상일 수 있으며, 구체적으로, 상기 유산균은 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus) JLFR LR04 (수탁번호: KACC92399P), 락토바실러스 사케이 (Lactobacillus sakei) JLFR LS07 (수탁번호: KACC92398P) 및 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) LP20B49 (수탁번호: KACC92397P)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 유산균은 락토바실러스 람노서스 및 락토바실러스 사케이 중 선택된 하나 이상일 수 있으며, 구체적으로, 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus) JLFR LR04 (수탁번호: KACC92399P) 및 락토바실러스 사케이 (Lactobacillus sakei) JLFR LS07 (수탁번호: KACC92398P) 중 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 방법은 5) 상기 발효물을 추출하거나, 농축하거나 및/또는 분말화하여 그 결과물을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법으로 제조된 녹용 발효 추출물은 시알산, 우론산, GABA 및 GAG 중 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법으로 제조된 녹용 발효 추출물은 발효하지 않은 녹용 추출물 또는 상기 방법으로 제조되지 않은 녹용 발효 추출물에 비해 시알산, 우론산, GABA 및 GAG 중 하나 이상의 함량이 증가된 것일 수 있고, 구체적으로 5% 이상, 8% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 99% 이상, 100% 이상 또는 150% 이상 증가된 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 5% 내지 200%, 5% 내지 150%, 5% 내지 100%, 5% 내지 90%, 5% 내지 80%, 5% 내지 70%, 5% 내지 60%, 5% 내지 50%, 5% 내지 40%, 5% 내지 30%, 5% 내지 20%, 5% 내지 10%, 10% 내지 200%, 10% 내지 150%, 10% 내지 100%, 10% 내지 90%, 10% 내지 80%, 10% 내지 70%, 10% 내지 60%, 10% 내지 50%, 10% 내지 40%, 10% 내지 30%, 10% 내지 20%, 30% 내지 200%, 30% 내지 150%, 30% 내지 100%, 30% 내지 90%, 30% 내지 80%, 30% 내지 70%, 30% 내지 60%, 30% 내지 50%, 30% 내지 40%, 50% 내지 200%, 50% 내지 150%, 50% 내지 100%, 50% 내지 90%, 50% 내지 80%, 50% 내지 70%, 50% 내지 60%, 60% 내지 200%, 60% 내지 150%, 60% 내지 100%, 60% 내지 90%, 60% 내지 80%, 또는 60% 내지 70% 증가된 것일 수 있다.
상기 방법으로 제조된 녹용 발효 추출물은 락트산(D-Lactic acid), 프롤린(L-Proline), 메발론산 락톤 (Mevalonic lactone), 석산산(Butanedioic acid), 글루타르산(Pentanedioic acid), 글리신(Glycine), 만니톨(D-Mannitol), 프로판산(Propanoic acid), 페닐알라닌(Phenylalanine) 및 아미노말론산(Aminomalonic acid)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법으로 제조된 녹용 발효 추출물은 발효하지 않은 녹용 추출물 또는 상기 방법으로 제조되지 않은 녹용 발효 추출물에 비해 락트산(D-Lactic acid), 프롤린(L-Proline), 메발론산 락톤 (Mevalonic lactone), 석산산(Butanedioic acid), 글루타르산(Pentanedioic acid), 글리신(Glycine), 만니톨(D-Mannitol), 프로판산(Propanoic acid), 페닐알라닌(Phenylalanine) 및 아미노말론산(Aminomalonic acid)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 함량이 증가된 것일 수 있고, 구체적으로 5% 이상, 8% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 99% 이상, 100% 이상 또는 150% 이상 증가된 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 5% 내지 200%, 5% 내지 150%, 5% 내지 100%, 5% 내지 90%, 5% 내지 80%, 5% 내지 70%, 5% 내지 60%, 5% 내지 50%, 5% 내지 40%, 5% 내지 30%, 5% 내지 20%, 5% 내지 10%, 10% 내지 200%, 10% 내지 150%, 10% 내지 100%, 10% 내지 90%, 10% 내지 80%, 10% 내지 70%, 10% 내지 60%, 10% 내지 50%, 10% 내지 40%, 10% 내지 30%, 10% 내지 20%, 30% 내지 200%, 30% 내지 150%, 30% 내지 100%, 30% 내지 90%, 30% 내지 80%, 30% 내지 70%, 30% 내지 60%, 30% 내지 50%, 30% 내지 40%, 50% 내지 200%, 50% 내지 150%, 50% 내지 100%, 50% 내지 90%, 50% 내지 80%, 50% 내지 70%, 50% 내지 60%, 60% 내지 200%, 60% 내지 150%, 60% 내지 100%, 60% 내지 90%, 60% 내지 80%, 또는 60% 내지 70% 증가된 것일 수 있다.
상기 방법으로 제조된 녹용 발효 추출물은 발효하지 않은 녹용 추출물 또는 상기 방법으로 제조되지 않은 녹용 발효 추출물에 비해 갈락토오스(d-Galactose), 만노스(Mannose) 및 타가토오스[D-(-)-Tagatose]으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 함량이 감소된 것일 수 있고, 구체적으로 5% 이상, 8% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 99% 이상, 100% 이상 또는 150% 이상 증가된 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 5% 내지 200%, 5% 내지 150%, 5% 내지 100%, 5% 내지 90%, 5% 내지 80%, 5% 내지 70%, 5% 내지 60%, 5% 내지 50%, 5% 내지 40%, 5% 내지 30%, 5% 내지 20%, 5% 내지 10%, 10% 내지 200%, 10% 내지 150%, 10% 내지 100%, 10% 내지 90%, 10% 내지 80%, 10% 내지 70%, 10% 내지 60%, 10% 내지 50%, 10% 내지 40%, 10% 내지 30%, 10% 내지 20%, 30% 내지 200%, 30% 내지 150%, 30% 내지 100%, 30% 내지 90%, 30% 내지 80%, 30% 내지 70%, 30% 내지 60%, 30% 내지 50%, 30% 내지 40%, 50% 내지 200%, 50% 내지 150%, 50% 내지 100%, 50% 내지 90%, 50% 내지 80%, 50% 내지 70%, 50% 내지 60%, 60% 내지 200%, 60% 내지 150%, 60% 내지 100%, 60% 내지 90%, 60% 내지 80%, 또는 60% 내지 70% 감소된 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서 각 단계별 생성물을 수득하는 것은 당업계에서 공지된 방법 또는 기술로 회수/정제하는 것일 수 있다.
다른 양상은 상기 방법으로 제조된, 녹용 발효 추출물을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 추출물에도 공히 적용된다.
상기 녹용 발효 추출물은 발효하지 않은 녹용 추출물 또는 상기 방법으로 제조되지 않은 녹용 발효 추출물에 비해 GABA 및 시알산 중 하나 이상의 함량이 증가된 것일 수 있고, 구체적으로 5% 이상, 8% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 99% 이상, 100% 이상 또는 150% 이상 증가된 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 5% 내지 200%, 5% 내지 150%, 5% 내지 100%, 5% 내지 90%, 5% 내지 80%, 5% 내지 70%, 5% 내지 60%, 5% 내지 50%, 5% 내지 40%, 5% 내지 30%, 5% 내지 20%, 5% 내지 10%, 10% 내지 200%, 10% 내지 150%, 10% 내지 100%, 10% 내지 90%, 10% 내지 80%, 10% 내지 70%, 10% 내지 60%, 10% 내지 50%, 10% 내지 40%, 10% 내지 30%, 10% 내지 20%, 30% 내지 200%, 30% 내지 150%, 30% 내지 100%, 30% 내지 90%, 30% 내지 80%, 30% 내지 70%, 30% 내지 60%, 30% 내지 50%, 30% 내지 40%, 50% 내지 200%, 50% 내지 150%, 50% 내지 100%, 50% 내지 90%, 50% 내지 80%, 50% 내지 70%, 50% 내지 60%, 60% 내지 200%, 60% 내지 150%, 60% 내지 100%, 60% 내지 90%, 60% 내지 80%, 또는 60% 내지 70% 증가된 것일 수 있다.
상기 녹용 발효 추출물은 발효하지 않은 녹용 추출물 또는 상기 방법으로 제조되지 않은 녹용 발효 추출물에 비해 락트산(D-Lactic acid), 프롤린(L-Proline), 메발론산 락톤 (Mevalonic lactone), 석산산(Butanedioic acid), 글루타르산(Pentanedioic acid), 글리신(Glycine), 만니톨(D-Mannitol), 프로판산(Propanoic acid), 페닐알라닌(Phenylalanine) 및 아미노말론산(Aminomalonic acid)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 함량이 증가된 것일 수 있고, 구체적으로 5% 이상, 8% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 99% 이상, 100% 이상 또는 150% 이상 증가된 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 5% 내지 200%, 5% 내지 150%, 5% 내지 100%, 5% 내지 90%, 5% 내지 80%, 5% 내지 70%, 5% 내지 60%, 5% 내지 50%, 5% 내지 40%, 5% 내지 30%, 5% 내지 20%, 5% 내지 10%, 10% 내지 200%, 10% 내지 150%, 10% 내지 100%, 10% 내지 90%, 10% 내지 80%, 10% 내지 70%, 10% 내지 60%, 10% 내지 50%, 10% 내지 40%, 10% 내지 30%, 10% 내지 20%, 30% 내지 200%, 30% 내지 150%, 30% 내지 100%, 30% 내지 90%, 30% 내지 80%, 30% 내지 70%, 30% 내지 60%, 30% 내지 50%, 30% 내지 40%, 50% 내지 200%, 50% 내지 150%, 50% 내지 100%, 50% 내지 90%, 50% 내지 80%, 50% 내지 70%, 50% 내지 60%, 60% 내지 200%, 60% 내지 150%, 60% 내지 100%, 60% 내지 90%, 60% 내지 80%, 또는 60% 내지 70% 증가된 것일 수 있다.
상기 녹용 발효 추출물은 발효하지 않은 녹용 추출물 또는 상기 방법으로 제조되지 않은 녹용 발효 추출물에 비해 갈락토오스(d-Galactose), 만노스(Mannose) 및 타가토오스[D-(-)-Tagatose]으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 함량이 감소된 것일 수 있고, 구체적으로 5% 이상, 8% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 99% 이상, 100% 이상 또는 150% 이상 증가된 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 5% 내지 200%, 5% 내지 150%, 5% 내지 100%, 5% 내지 90%, 5% 내지 80%, 5% 내지 70%, 5% 내지 60%, 5% 내지 50%, 5% 내지 40%, 5% 내지 30%, 5% 내지 20%, 5% 내지 10%, 10% 내지 200%, 10% 내지 150%, 10% 내지 100%, 10% 내지 90%, 10% 내지 80%, 10% 내지 70%, 10% 내지 60%, 10% 내지 50%, 10% 내지 40%, 10% 내지 30%, 10% 내지 20%, 30% 내지 200%, 30% 내지 150%, 30% 내지 100%, 30% 내지 90%, 30% 내지 80%, 30% 내지 70%, 30% 내지 60%, 30% 내지 50%, 30% 내지 40%, 50% 내지 200%, 50% 내지 150%, 50% 내지 100%, 50% 내지 90%, 50% 내지 80%, 50% 내지 70%, 50% 내지 60%, 60% 내지 200%, 60% 내지 150%, 60% 내지 100%, 60% 내지 90%, 60% 내지 80%, 또는 60% 내지 70% 감소된 것일 수 있다.
상기 녹용 발효 추출물은 면역 증강, 피부 개선, 뇌 기능개선, 정신 안정, 간 기능 개선, 신장 기능 활성, 비만 예방 또는 개선, 혈압 강하, 항노화 및 항균으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 효과를 나타내는 것일 수 있다. 따라서, 상기 녹용 발효 추출물을 포함하는 조성물은 면역 증강, 피부 개선, 뇌 기능개선, 정신 안정, 간 기능 개선, 신장 기능 활성, 비만 예방 또는 개선, 혈압 강하, 항노화 및 항균으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 용도를 갖는 것일 수 있다.
또 다른 양상은 녹용 발효 추출물을 포함하는, 항노화용 조성물을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 조성물에도 공히 적용된다.
상기 녹용 발효 추출물은 본 발명의 녹용 발효 추출물 제조방법으로 제조된 것일 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "항노화"는 피부 노화를 방지하거나 억제하는 모든 작용을 의미할 수 있다. 피부 노화는 시간의 흐름에 따른 내인성 노화 및 외부 환경에 의한 외인성 노화를 포함한다. 상기 피부 노화는 피부 주름, 잡티, 기미 등을 포함할 수 있다. 상기 피부 주름은 피부가 쇠하여 생긴 잔주름일 수 있다. 상기 피부 주름은 광노화, 연령, 얼굴 표정, 수분 부족, 또는 이들의 조합에 의한 것일 수 있다. 상기 광노화는 자외선(UVA, UVB, 및 UVC 포함) 노출에 의한 피부 노화일 수 있다. 용어 "피부 주름 개선"은 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화시키는 것일 수 있다.
상기 조성물은 약학적 조성물일 수 있다.
상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다. 여기서 "약학적으로 허용되는"의 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다. 상기 약학적 조성물에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 락토스, 덱스트로스, 말토 덱스트린, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 글리세롤, 에탄올, 전분, 아카시아 고무, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 또는 광물유 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제제화하여 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제제화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물을 제제화할 경우, 일반적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 또는 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 추가하여 조제될 수 있다.
상기 약학 조성물이 경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이때 약학적으로 허용되는 적합한 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 덱스트로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨 등의 당류, 옥수수 전분, 감자 전분, 밀 전분 등의 전분류, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 맥아, 젤라틴, 탈크, 폴리올, 식물성유 등을 들 수 있다. 제제화활 경우 필요에 따라 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 및/또는 부형제를 포함하여 제제화할 수 있다.
상기 약학 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화활 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 들 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 경피 투여제로 제제화할 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태로 제제화될 수 있다. 비강 흡입제의 경우 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 등의 적합한 추진제를 사용하여 에어로졸 스프레이 형태로 제제화될 수 있으며, 좌제로 제제화할 경우 그 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 폴리에틸렌글리콜류, 카카오지, 라우린지, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류, 소르비탄 지방산 에스테르류 등이 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 상기 용어 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 약학 조성물은 단독으로 투여하거나 공지된 치료 효과를 나타내는 것으로 알려진 성분과 병용하여 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
상기 약학 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 성인 1인당 약 0.1ng 내지 약 1,000 mg/kg, 바람직하게는 1 ng 내지 약 100 mg/kg로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량 또는 투여횟수는 어떠한 면으로든 본원의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 이때, 조성물은 액제, 산제, 에어로졸, 주사제, 수액제(링겔), 캡슐제, 환제, 정제, 좌제 또는 패치의 형태로 제형화되어 투여할 수 있다. 상기 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다.
상기 약학 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경피패치투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등의 경로를 통해 투여 될 수 있다. 다만, 경구 투여 시에는 제형화되지 않은 형태로도 투여할 수 있고, 위산에 의하여 상기 약학 조성물의 유효성분이 변성 또는 분해될 수 있기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화된 형태 또는 경구용 패치형태로 구강내에 투여할 수도 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
상기 조성물은 식품 조성물일 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강 기능 식품 및 건강 식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
상기 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 상기 식품 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고 휴대성이 뛰어나므로, 본 발명의 식품 조성물은 골 관련 질환의 개선의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
상기 식품 조성물은 건강기능식품 조성물일 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다.
상기 건강 식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강 보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강 식품, 건강 보조 식품의 용어는 혼용될 수 있다. 구체적으로, 상기 건강 기능 식품은 조성물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품 소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.
상기 식품 조성물은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 개선 효능에 대하여 높은 효과를 기대할 수 있으므로, 매우 유용하게 사용될 수 있다.
상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 식품 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신 (niacin), 비오틴 (biotin), 폴레이트 (folate), 판토텐산 (panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 방부제 (소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제 (표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제 (부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제 (타르색소 등), 발색제 (아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제 (아황산나트륨), 조미료 (MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료 (둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료 (바닐린, 락톤류 등), 팽창제 (명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물 (food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
상기 식품 조성물은 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 식품 조성물은 식품 또는 음료에 대하여 50 중량부 이하, 구체적으로 20 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 함량을 포함할 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품 조성물의 일 예로 건강음료 조성물로 사용될 수 있으며, 이 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강음료 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 구체적으로 약 0.02 ~ 0.03 g이 될 수 있다.
상기 외에 건강음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강음료 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
상기 식품 조성물은 항노화의 개선 또는 예방 효과를 나타낼 수 있다면 본 발명의 추출물을 다양한 중량%로 포함할 수 있으며, 구체적으로 상기 추출물을 식품 조성물의 총 중량 대비 0.00001 내지 100 중량% 또는 0.01 내지 80 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물은 사료 조성물일 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미할 수 있다.
상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
상기 사료 조성물은 제제에 따라 비만 및 지질 관련 대사성 질환 개선 또는 예방을 위해 첨가 가능한 공지의 첨가물을 더 포함할 수 있다. 상기 사료 조성물은 고농축액, 분말 또는 과립 형태일 수 있다. 상기 사료 조성물은 동물의 식이 요구를 충족시키는데 통상적으로 사용되는 임의의 단백질-함유 유기 곡분을 더 포함할 수 있다. 상기 사료 조성물은 동물 사료에 침지, 분무, 또는 혼합으로 첨가하여 사용될 수 있다.
상기 사료 조성물은 영양소 보충 및 체중감소 예방, 사료 내 섬유소의 소화 이용성 증진, 유질 개선, 번식장애 예방 및 수태율 향상, 하절기 고온 스트레스 예방 등 다양한 효과를 나타내는 물질을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어 탄산수소나트륨, 벤토나이트(bentonite), 산화마그네슘, 복합광물질 등의 광물질제제, 아연, 구리, 코발트, 셀레늄 등의 미량 광물질인 미네랄제제, 케로틴, 비타민 E, 비타민 A, D, E, 니코틴산, 비타민 B 복합체 등의 비타민제, 메티오닌, 리이산 등의 보호아미노산제, 지방산 칼슘염 등의 보호지방산제, 생균제(유산균제), 효모배양물, 곰팡이 발효물 등의 생균, 효모제 등이 추가로 포함될 수 있다.
상기 사료 조성물은 포유류, 가금류를 포함하는 다수의 동물 식이 즉, 사료 및 음용수에 적용할 수 있다.
상기 사료 조성물은 사료에 첨가되는 물질 (즉, 사료 첨가제), 사료 원료 또는 개체에 급여되는 사료 자체를 모두 포함하는 것일 수 있다.
상기 조성물은 화장료 조성물일 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형은 통상적인 화장료의 제형이라면 제한되지 않지만, 예컨대 유연화장수, 수렴화장수 또는 영양화장수 등의 스킨, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이 크림, 아이 에센스, 클렌징크림, 클렌징 폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일 또는 바디에센스일 수 있다.
상기 화장료 조성물은 화장료의 제형 또는 사용 목적에 맞게 임의로 선정한 물질을 첨가할 수 있으며, 예를 들어 보존제, 안정화제, 계면활성제, 용해제, 보습제, 에몰리언트제, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, pH 조정제, 유기 및 무기 안료, 향료, 냉감제 또는 제한제 등을 더 포함할 수 있다. 상기 추가 성분의 배합량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 당업자가 용이하게 선정 가능하다.
상기 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 젤인 경우, 담체 성분으로서 예를 들어 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등을 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우, 담체 성분으로서 예를 들어 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더를 포함할 수 있고, 특히, 스프레이인 경우, 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우, 담체 성분으로서 예를 들어 용매, 용해화제 또는 유탁화제를 포함할 수 있고, 예를 들어, 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르를 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우, 담체 성분으로서 예를 들어 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등을 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우, 담체 성분으로서 예를 들어 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등을 포함할 수 있다.
또 다른 양상은 녹용 발효 추출물을 포함하는, 항균 조성물을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 조성물에도 공히 적용된다.
상기 조성물은 약학적 조성물, 화장료 조성물, 식품 조성물 또는 사료 조성물일 수 있다.
상기 녹용 발효 추출물은 본 발명의 녹용 발효 추출물 제조방법으로 제조된 것일 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "항균 조성물"은 약제 형태로 개체에 제공되어 균을 사멸시킬 수 있는 제제를 의미하며, 방부제, 살균제, 항생제 및 항균제를 총칭하는 것일 수 있다.
상기 항균 조성물은 병원성 균주를 사멸시키는 것으로서, 구체적으로 상기 병원성 균주는 살모넬라 (Salmonella) 균주, 대장균(Escherichia coli), 리스테리아 모노키토게네스 (Listeria monocytogenes), 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus), 파스투렐라 물토시다 (Pasteurellamultocida), 마이코플라지므 히오뉴모니아 (Mycoplasmahyopneumoniae) 및 보르데텔라 브론키셉티카 (Bordetella bronchiseptica)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 살모넬라 균주는 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella Typhimurium), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella Choleraesuis), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis), 살모네랄 갈리나륨(Salmonella Gallinarum), 살모넬라 타이피(Salmonella Typhi) 및 살모넬라 플로럼(Salmonella Pullorum)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상으로 포함하는 것일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 항균 조성물은 리스테리아 모노키토게네스 (Listeria monocytogenes), 대장균(Escherichia coli) 및 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella Typhimurium) 중 하나 이상을 증식을 억제하거나 사멸시키는 것일 수 있다.
또 다른 양상은 녹용 발효 추출물을 포함하는, 면역 증강용 조성물을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 조성물에도 공히 적용된다.
상기 조성물은 약학적 조성물, 화장료 조성물, 식품 조성물 또는 사료 조성물일 수 있다.
상기 녹용 발효 추출물은 본 발명의 녹용 발효 추출물 제조방법으로 제조된 것일 수 있다.
본 명세에서의 용어 "면역 증강"이란 사전적 의미 외에 면역 조절 효과를 포함하는 것으로서, 면역 조절 인자의 활성을 높여 면역 체계의 활성을 높이고 신생 혈관 생성 억제, 병원균에 대한 생육 억제력 증가 등으로 면역 관련 질병을 예방하는 효과를 내는 것을 의미한다. 또한, 특히 비장 등에 존재하는 대식세포의 활성을 높여 외부 병원균에 대한 방어, 사멸세포 제거 및 면역매개체의 분비 등의 효과를 내는 것으로 정의할 수 있다. 상기 면역 기능 증진의 기능성을 확인할 수 있는 바이오 마커로는 NK 세포, 사이토카인, 탐식능, NO, iNOS, COX-2, 보체계, 림프구 아집단 비율, 면역글로블린, 세포 생존율, 비장세포 증식, 비장, 흉선 등의 조직 무게 등을 들 수 있다.
상기 녹용 발효 추출물을 포함하는 조성물은 면역 증강 관련 인자 또는 사이토카인의 발현 수준 또는 활성을 증진시키는 것일 수 있으며, 구체적으로, 인터류킨-6(IL-6), 인터류킨-10(IL-10), TNF-α, iNOS 및 IFN-γ로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 발현 수준 또는 활성을 증진시키는 것일 수 있다.
또 다른 양상은 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus) JLFR LR04 (수탁번호: KACC92399P), 락토바실러스 사케이 (Lactobacillus sakei) JLFR LS07 (수탁번호: KACC92398P) 및 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) LP20B49 (수탁번호: KACC92397P)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 균주; 상기 균주의 배양물; 상기 균주 또는 배양액의 농축물; 및 이들의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는, 녹용 발효용 조성물을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 조성물에도 공히 적용된다.
본 명세서에서의 용어 "배양물"은 배지에서 일정 기간 동안 배양하여 수득한 균주, 그의 대사물 또는 여분의 영양분 등을 포함하는 배지를 말하며, 균주를 배양한 후 균주를 제거한 배양액을 포함한다.
상기 균주의 배양물은 미생물 배양에 사용되는 배지 중에서 선택될 수 있으며, 당업자가 목적에 따라 용이하게 변경하여 사용할 수 있다. 상기 배양물은 상기 미생물 배양 배지에 본 발명의 균주를 접종하고, 당업계에 공지된 미생물 배양 방법(예를 들어, 정치배양, 교반배양)에 따라 제조할 수 있다.
상기 균주 또는 배양액의 농축물 및 이들의 건조물은 당업계에 공지된 미생물 또는 배양액의 농축 또는 건조 방법에 따라 용이하게 제조될 수 있으며, 상기 균주, 균주의 배양물, 균주 또는 배양액의 농축물 및 이들의 건조물은 상기 조성물에 1 내지 15중량%로 함유될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 조성물은 생녹용, 건조 녹용, 녹용 추출물 또는 녹용 추출 잔여물을 발효시키기 위한 것일 수 있다.
또 다른 양상은 녹용을 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus) JLFR LR04 (수탁번호: KACC92399P), 락토바실러스 사케이 (Lactobacillus sakei) JLFR LS07 (수탁번호: KACC92398P) 및 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) LP20B49 (수탁번호: KACC92397P)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 균주; 상기 균주의 배양물; 상기 균주 또는 배양액의 농축물; 및 이들의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는, 녹용 발효용 조성물로 발효하는 단계를 포함하는, 녹용 발효물 또는 녹용 발효 추출물 제조방법을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 방법에도 공히 적용된다.
상기 녹용은 생녹용, 건조 녹용, 녹용 추출물 및 녹용 추출 잔여물 중 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
또 다른 양상은 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus) JLFR LR04 (수탁번호: KACC92399P), 락토바실러스 사케이 (Lactobacillus sakei) JLFR LS07 (수탁번호: KACC92398P) 및 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) LP20B49 (수탁번호: KACC92397P)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 균주; 상기 균주의 배양물; 상기 균주 또는 배양액의 농축물; 및 이들의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는, 녹용 발효용 조성물로 발효시킨 녹용 발효물 또는 녹용 발효 추출물을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 발효물 또는 추출물에도 공히 적용된다.
상기 녹용은 생녹용, 건조 녹용, 녹용 추출물 및 녹용 추출 잔여물 중 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 발효 녹용 추출물 제조방법은 기존의 발효 녹용 또는 이의 추출물보다 유용성 성분을 높게 보유하고 있는 바, 기능성 발효 녹용을 효과적으로 제조할 수 있다.
도 1은 제3차 발효녹용 제조 기술로서, 제3차 발효녹용 7단계 제조 공정도를 나타낸다.
도 2는 제3차 발효녹용 제조 기술로서, 2차 고상 발표 및 3차 액상 발효 공정도를 나타낸다.
도 3은 건조 녹용의 불용화 해결을 위한 3차 발효 시스템을 나타낸다.
도 4는 3차 발효를 통한 항균 항노화 기능성 프로바이오틱스 기능 강화에 대한 모식도를 나타낸다.
도 5는 급속동결 녹용, 일반동결 녹용 및 발효 동결건조 녹용의 건조 후 슬라이스 절단면 구조를 나타낸다.
도 6은 17개 후보 균주의 C.elegans 수명 연장 효능 평가 결과를 나타낸다.
도 7은 17개 후보 균주를 이용한 발효물의 1~3일차 pH 변화를 나타낸다.
도 8은 17개 후보 균주를 이용한 발효물의 1~3일차 산도 변화를 나타낸다.
도 9는 17개 후보 균주를 이용한 발효물의 1~3일차 접종균의 생균수(colony forming unit/g)를 나타낸다.
도 10은 17개 후보 균주를 이용한 발효물의 1~3일차 총 GABA 함량을 나타낸다.
도 11은 17개 후보 균주를 이용한 발효물의 1~3일차 총 시알산 함량을 나타낸다.
도 12는 17개 후보 균주를 이용한 발효물의 1~3일차 GAG 함량을 나타낸다.
도 13은 17개 후보 균주를 이용한 발효물의 1~3일차 우론산(uronic acid) 함량을 나타낸다.
도 14는 17개 후보 균주를 이용한 발효물의 2일차 GABA 함량 및 시알산 함량을 나타낸다.
도 15는 17개 후보 균주로부터 선발된 최종 균주를 나타낸다.
도 16은 선발된 균주를 이용한 발효물의 2일차 GABA 및 시알산 함량 비교 결과를 나타낸다.
도 17은 선발된 균주를 이용한 발효물에 대한 GC-MS 분석을 통한 대사체 주성분 분석 결과를 나타낸다.
도 18은 리스테리아 모노키토게네스에 대한 항균력 비교 결과를 나타낸다.
도 19는 대장균 O157:H7의 감염에 따른 항균력 비교 결과를 나타낸다.
도 20은 살모넬라 티피뮤리움 SL 1344의 감염에 따른 항균력 비교 결과를 나타낸다.
도 21은 녹용 발효 추출물 처리에 대한 생존율 측정 결과를 나타낸다.
도 22는 녹용 혼합 발효물의 마우스 경구투여 실험 과정을 나타낸다.
도 23은 녹용 발효물 경구투여 및 면역억제제 투여 후 비장세포에서의 바이오마커 mRNA 발현 수준을 나타낸다.
도 24는 고상 발효 조건에 따른 pH 및 생균수를 나타낸다.
도 25는 액상 발효 조건에 따른 생균수를 나타낸다.
도 26은 액상 발효 조건에 따른 pH를 나타낸다.
도 27은 액상 발효 조건에 따른 시알산 함량을 나타낸다.
도 28은 액상 발효 조건에 따른 우론산 함량을 나타낸다.
도 29는 액상 발효 조건에 따른 GABA 함량을 나타낸다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 녹용 추출물 또는 추출 잔여물의 발효/처리 방법
1-1: 녹용 추출물의 액상 발효 방법
녹용 추출물을 유산균으로 발효시키기 위해, 2% 녹용 추출물을 포함하는 최소 프리바이오틱 배지 (minimal prebiotic medium)를 하기와 같이 제조하였으며, 121 ℃, 15분간 고압멸균 후, 초음파 처리(Sonication)하여 배지 속 녹용을 분쇄하였다:
최소 프리바이오틱 배지 1L 기준 - 녹용 1차 추출액 20g, 5g 펩톤(peptone), 2.5g 아세트산 나트륨(sodium acetate), 1M 황산마그네슘 칠수화물(magnesium sulfate heptahydrate) 0.5mL, 1M 황산망간 사수화물(manganese sulfate tetrahydrate) 0.5mL, 5 mL 트윈 80(tween 80), 1g 구연산 이암모늄(diammonium citrate), 1g 인산 이칼륨(dipotassium phosphate), 20g 글루코스(glucose), 및 1g L 글루탐산(L-glutamic acid).
상기 녹용 추출물은 예를 들어 다음과 같은 방법으로 수득하였다: 녹용(Cervus elaphus Linne, 뿔) 2 kg에 중량 대비 8배수의 정제수를 가하고, 87±2 ℃에서 4시간동안 1 내지 3회 추출하고, 각 추출에서 얻어진 추출물들을 혼합한 추출액을 냉각하여 원심분리한다. 원심분리액은 회전감압농축기(BUCHI, R-220)를 이용하여 55 ℃에서 농축하고, 동결건조(OPERON, FDT-12012)하여 녹용 추출분말 280g을 수득하였다.
상기 배지를 45mL씩 50mL 튜브에 분취하였으며, 각각의 튜브에 실험균을 1%씩 접종하였다 (>104 colony-forming unit [CFU]/mL).
접종 후, 37 ℃에서 24시간, 48시간, 72시간, 96시간 및 120시간동안 정치배양하여, 1일 내지 5일차 유산균 발효 배양물 획득하였으며, 이를 원심분리하여 상등액을 0.2μm syringe 필터로 여과한 후 시료로 사용하였다.
1-2: 추출 잔여물의 고상 발효 방법
추출 후 잔여물의 고상 발효를 위해, 하기와 같이 최소 프리바이오틱 배지를 제조한 후, 121 ℃, 15분간 고압멸균하였다:
최소 프리바이오틱 배지 1L 기준 - 5g 펩톤(peptone), 2.5g 아세트산 나트륨(sodium acetate), 1M 황산마그네슘 칠수화물(magnesium sulfate heptahydrate) 0.5mL, 1M 황산망간 사수화물(manganese sulfate tetrahydrate) 0.5mL, 5 mL 트윈 80(tween 80), 1g 구연산 이암모늄(diammonium citrate), 1g 인산 이칼륨(dipotassium phosphate), 20g 글루코스(glucose), 및 1g L 글루탐산(L-glutamic acid).
접종할 유산균을 배양한 MRS Broth를 원심분리한 후, 상등액을 제거하고 남은 펠렛에 최소 프리바이오틱 배지를 첨가하였다.
다음으로, 추출 후 잔여물 100g을 병에 담아 고압멸균을 수행한 후, 유산균이 첨가된 최소 프리바이오틱 배지 10ml을 접종하였으며 (10% 접종), 37 ℃에서 120시간동안 정치배양하였다.
이 후, 배양물을 원심분리하여 상등액 획득 후, pH가 7로 맞추고 증류수를 이용하여 최종 부피를 10ml로 맞춘 후 시료로 사용하였다.
1-3: 추출 잔여물의 효소 처리 방법
추출 후 잔여물 5g, 10g에 각각 단일효소 처리와 복합 효소 처리를 30분 처리 또는 60분처리로 조건을 다르게 하여 추출하였다.
단일 효소 처리는 Alcalase, Flavourzyme, Neutrase, protamex, papain, lipopan를 1% 첨가하고, 50 ℃에서 100rpm으로 30분과 60분간 각각 쉐이킹 인큐베이터를 이용하여 반응시켰다.
복합 효소처리는 단일 효소 Alcalase, Flavourzyme, Neutrase, protamex, papain를 추출 후 잔여물 5g, 10g에 1%를 첨가하여 30분간 50 ℃에서 100rpm으로 쉐이킹 인큐베이터를 이용하여 반응시킨 후, Lipopan을 1% 첨가 후 30분간 50 ℃에서 100rpm으로 쉐이킹 인큐베이터를 이용하여 반응시켰다.
이 후, 95 ℃ 수조에서 10분간 효소 불활성화를 시킨 후 거름망을 이용해 추출 후 잔여물을 걸러준 후 원심분리 후 상등액을 시료로 사용하였다.
실시예 2: 예쁜 꼬마선충 (Caenorhabditis elegans) 장수(longevity) 어세이
균주의 항노화 활성 평가를 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
먼저, 실험 균주의 경우 하룻밤동안(overnight) 배양하고 원심분리 (6,000×g, 20 min)하여, 균주 펠렛만 회수한 후 M9 버퍼로 5회 세척하였다. 최종적으로, 5배 농축균액을 제조한 후 35-mm 직경의 선충 성장 배지 (nematode growth medium, NGM) 한천 플레이트에 도말한 후, 상온에서 1시간동안 건조시켜 수명연장 플레이트를 제작하였으며, 4℃에서 보관하였다. 상기 수명연장 플레이트에서 락토바실러스 람노서스 GG(Lactobacillus rhamnosus GG, LGG) 및 대장균 OP50(Escherichia coli OP50, OP50)을 대조군으로 사용했다.
예쁜 꼬마선충 fer-15;fem-1 돌연변이체는 알칼리성 차아염소산염 용액을 사용하여 동기화되었으며, L4에서 성인으로 성장시킨 예쁜 꼬마선충을 백금 와이어를 사용하여 실험 균주 또는 대조군 균주로 제작한 수명연장 플레이트에 옮긴 후, 25℃에서 3주간 매일 생존율을 측정하였다. 예쁜 꼬마선충은 매일 새로운 플레이트로 옮겼다.
일반적으로 백금 와이어를 이용하여 조심스럽게 터치한 후 반응을 나타내면 살아있는 것으로 평가하였으며, 실험은 3회 반복으로 수행되었고, 이를 토대로 생존율을 결정하였다.
실시예 3: 산도, pH 및 균주 성장율(bacterial growth) 분석
3-1: 산도 및 pH 분석
각 배양액(1mL)의 산도는 1% 페놀프탈레인 10μL를 첨가한 다음, 종말점에 도달할 때까지 0.1N NaOH를 첨가하여 측정했다. 첨가된 0.1N NaOH의 양(mL)은 변환되어 젖산 함량(%)으로 표시되었다. 배양 pH는 pH 측정기(S20 SevenEasy pH meter, Mettler-Toledo, Columbus, OH, USA)를 사용하여 발효 중에 측정하였다. 배양물의 pH 및 산도는 각 발효 기간(24, 48, 72, 96, 120시간) 전후에 측정되었다.
3-2: 박테리아 농도(생균수) 분석
박테리아 농도는 CFU 계수 방법을 사용하여 평가하였다. 구체적으로, 균주 배양액 100μL를 0.1% 펩톤수로 연속 희석시킨 후, MRS(deMan, Rogosa, and Sharpe) 한천 플레이트에 10μL씩 떨어뜨린 후, 37 ℃, 48시간 배양한 뒤 형성된 콜로니수를 계수하여 생균수를 측정하였다.
실시예 4: 총 질소량, 아미노산 및 단백질 양 분석
4-1: 총 질소량 분석
배양물 샘플을 25배 희석시킨 후, 5mL의 0.2% HCl, 20mL 증류수, 10mL 과황산칼륨(potassium persulfate) (3% alkalinity, pH 9.7)을 넣고 잘 섞어주었다.
이 후, 120 ℃에서 30분간 오토클레이브하고, 상온에서 냉각시킨 후, 5 mL의 0.06% HCl을 넣은 후 잘 섞어준 후, 220 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 질산칼륨을 이용하여 미리 작성한 검량선을 이용하여 질소의 양을 결정하였다.
4-2: 총 아미노산 분석
50μL 배양물, 2mL 증류수, 1mL 아세트산-아세트산 나트륨 (acetic acid-sodium acetate) 버퍼 용액 (pH 6.0) 및 1mL의 2% 닌히드린(ninhydrin) 용액을 잘 섞은 후, 100 ℃에서 15분간 반응시킨 후, 상온에서 냉각시켰다.
이후, 10 mL의 50% 에탄올 용액을 넣고 잘 섞은 후, 220 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 아르기닌을 이용하여 미리 작성한 검량선을 이용하여 아미노산의 양을 결정하였다.
4-3: 단백질양 분석
단백질 양의 분석은 브래드포드 어세이(Bradford assay)를 이용하여 수행하였다.
구체적으로, 96-웰 플레이트에 1/2로 희석한 배양물 10μL와 브래드포드 염료(bradford dye)를 1차 증류수로 1:5로 희석한 후, 와트만 종이(whatman paper)로 거른 브래드포드 염료 용액 200μL를 5분 동안 반응시킨 후 595nm에서 흡광도를 측정하였다. BSA(Bovine serum albumin)로 작성한 표준곡선으로부터 함량을 계산하였다.
실시예 5: GABA (γ-aminobutyric acid; 감마-아미노뷰티르산) 분석
GABA 분석을 위해 배양물 3 mL과 0.5M 탄산수소나트륨(NaHCO3) 1.5 mL, 및 0.715 mg/ml의 1-플루오로-2,4-디니트로벤젠 (1-fluoro-2,4-dinitrobenzene) 0.5 mL을 잘 섞은 후, 60 ℃에서 1시간 반응시켰다.
상온에서 냉각시킨 후, 0.22 μm 주사기 필터 (PTFE, Advantec, Dublin, CA, USA)를 이용하여 필터링하였다. 상기 여과된 용액에서의 GABA는 Shimazhu 20A series HPLC로 분석하였다.
칼럼은 Symmetry C18 column (5μm, 3.9 x 150 mm, Waters, Milford, MA, USA)을 이용하였으며, 오븐 온도는 30 ℃로 유지하는 조건으로 이동상(Mobile phase) 2종, ammonium acetate aqueous solution과 아세토니트릴(acetonitrile)을 85:15 (v/v) 비율로 등용매(isocratic) 조건으로 20분간 용출을 실시하였다. Injection volume은 10 μL이고, 파장은 360 nm를 이용하여 분석하였다.
실시예 6: 시알산(Sialic aicd) 분석
먼저, 시료 중에 시알산을 추출하기 위해, 각 샘플 0.1mL에 0.2N H2SO4 용액 0.1mL를 가하여 85 ℃에서 1시간 동안 가수분해시킨 후, 20μL 과옥소산염 용액(periodate solution) (0.25M NaIO4 in 9M H3PO4)을 첨가하여 상온에서 20분간 반응시켰다.
다음으로, 0.1mL 아비산염 시약 (arsenite reagent) (10% NaAsO2 in 0.1N H2SO4 with 0.5M Na2SO4) 용액을 첨가하여 과량의 과옥소산염을 환원시킨 후, 0.25mL TBA(thiobarbituric acid) 용액(0.6% TBA in 0.5M Na2SO4)을 첨가하고, 85 ℃에서 15분간 발색시킨 후, 상온에서 냉각시켰다.
마지막으로, 1mL의 사이클로헥사논(cyclohexanone)을 첨가한 후 원심분리(900g, 7min)를 진행하고, 상등액을 96-웰 플레이트에 옮겨 549nm에서 흡광도를 측정하였다 (Synergy HTX multi-mode plate reader, BioTek,Winooski, VT, USA). 시알산 함량은 N-아세틸뉴라민산(N-acetyl neuraminic acid)에 대한 표준 곡선과 비교하여 계산되었다.
실시예 7: 항산화 효능 평가
7-1: DPPH 라디칼 소거 기능 평가
EP 튜브에 시료 500μL와 메탄올에 용해시킨 1mM의 DPPH 용액 1mL을 암실에서 30분간 반응시킨 후 96-웰 플레이트에 100μL씩 옮겨 517nm에서 흡광도를 측정하였다.
L-아스코르브산 (L-ascorbic acid)를 이용하여 표준곡선을 작성하였고, DPPH 라디칼 소거능(%)은 X 100 으로 계산하였다.
7-2: ABTS 라디칼 소거 기능 평가
7.4 mM의 ABTS 용액과 2.6 mM 과황산칼륨(potassium persulfate)를 잘 섞어준 후, 실온 또는 암실에서 24시간동안 반응을 하여 라디칼을 형성시켰다.
ABTS 용액을 732nm의 파장에서 흡광도가 0.7 수준이 되도록 PBS(phosphate buffered saline, pH7.4)로 희석하였다. 추출물 50 uL와 ABTS 용액 950 uL를 잘 현탁한 후 실온, 암실에서 10분간 반응하였다. 732nm 파장에서 흡광도를 측정해주어 소거능을 %로 계산하였다(DPPH 공식과 비슷함).
실시예 8: 우론산(Uronic acid) 분석
100배 희석한 시료를 EP 튜브에 100μL씩 담고 사붕산 나트륨(sodium tetraborate)를 25mM의 농도로 황산(Sulfuric acid)에 녹인 용액을 400μL 첨가해 준 후 100 ℃에서 10분간 가열하고 실온으로 식혀주었다.
시료가 실온이 되면 완전한 에탄올(absolute ethanol)에 0.125% 카바졸(carbazole)을 녹인 용액을 100μL 넣어주고 다시 100 ℃에서 10분간 가열해 반응시켜 준 후 실온으로 충분히 식힌 후 96-웰 플레이트로 100μL씩 옮겨 550nm에서 흡광도를 측정하였다. 우론산의 함량은 D-글루쿠론산(D-glucuronic acid)으로 작성한 표준곡선으로부터 함량을 계산하였다.
실시예 9: 글리코사미노글리칸(Glycosaminoglycan, GAG) 분석
글리코사미노글리칸은 디메틸메틸렌 블루(Dimethylmethylene blue) 어세이에 의해 측정하였다.
DMMB 용액은 1L 기준으로 DMMB 16mg, 글라이신 3.04g, NaCl 1.6g, 0.1M 아세트산 95mL을 넣고 pH 3으로 맞춰준 후 0.45μm 주사기 필터로 필터링 한 후 사용 직전에 와트만 필터(whatman filter)로 거른 후 사용하였다.
다음으로, 96-웰 플레이트에서 시료 20μL에 DMMB 제제 200μL를 넣어준 후 5초간 쉐이킹후 525nm에서 흡광도를 측정하였다.
실시예 10: 트리신(Tricine) SDS PAGE
저분자 단백질 및 펩타이드를 확인하기 위한 시료를 2X 트리신 샘플 버퍼 와 1:1로 혼합한 후 85 ℃에서 2분간 가열해 단백질을 변성시킨 후, 각 샘플을 16.5% 폴리아크릴아마이드 젤(polyacrylamide gel)의 웰에 50 ug 씩 로딩한 후 트리신 SDS PAGE 버퍼를 넣고 80V로 전기영동하였다.
유리판에서 겔을 분리하여 쿠마시블루(coomassie blue)로 1시간 염색 후 methanol:acetic acid:water (1:1:8)를 이용해 24시간 탈색한 후 밴드를 확인하였다.
실시예 11: 단쇄지방산(SCFA, short chain fatty acid) 분석
발효물을 증류수로 희석하여 호모게나이저로 30초간 균질화하고 원심분리(13,000 rpm, 10분)한 후 상등액을 여과하여 사용하였다. 시료 추출물은 0.2 μm 막 필터로 여과하여 HPLC Ultimate 3,000(Thermo Dionex, Beverly, MA, USA)로 분석하였다.
HPLC의 조건은 다음과 같이 컬럼은 Aminex-87H column(300Х10mm, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 이동상은 0.01 N H2SO4 로 0.5 mL/min의 속도로 이동시켰다. Detecter는 RI(ERC, RefractoMAX520, Japan)으로 검출 파장은 210 nm로 설정하며 injection volume은 10 μL임. SCFA 분석을 위한 standard는 VOAs mixture(AccuStandard FAMQ-004 10mM)을 사용하였다.
실시예 12: 대사체 (Metabolite) 분석
발효액 상등액은 7,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 채취한 후 0.2 μm 셀룰로오스 아세테이트 주사기 필터(cellulose acetate syringe filters)를 사용하여 여과하였다. 이 후, 각 샘플을 차가운 메탄올과 혼합한 뒤 얼음 위에서 1분간 볼텍싱 한 뒤, 4 ℃에서 10,000rpm으로 10분간 원심분리하였다. 상등액은 0.2μm PVDF(polyvinylidene fluoride) 시린지 필터(Whatman, Maidstone, England)를 사용해 여과한 후 완전히 진공 건조시켰다.
GC-MS(gas chromatography-mass spectrometry) 분석을 위해, 각 시료를 30 μL 메톡시아민 염산염(methoxyamine hydrochlorid) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에 pyridine (20 mg/mL)에 녹여 30 ℃에서 90분간 유도한 후, 각 샘플에 50 μL의 N,O-비스(트리메틸실릴)트리플루오로아세트아미드 [N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide]을 첨가하여 트리메틸릴화 (trimethylsilylated)하였다.
GC-MS 분석은 ISQ LT single quadrupole mass spectrometer(Thermo Fisher Scientific)가 장착된 TraceTM 1310 system (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 수행하였으며, 분리는 DB-5MS 칼럼(60 m Х 0.25 mm, 0.25-um 필름 두께; Agilent, USA)을 사용하여 수행되었다.
오븐 온도는 2분간 50 ℃로 유지하고, 5 ℃/min 속도로 180 ℃로 도달한 후 8분간 유지, 2.5 ℃/min 속도로 325 ℃에 도달한 후 10분간 유지하였다. 시료를 300 ℃에서 주입하여 헬륨(운반가스) 유속을 1.5 mL/min 사용하였고, 분할비는 1:60로 설정하였다.
70 eV의 이온화 전압과 270 ℃의 이온화 온도로 전자 이온화 시스템(electron ionization system)을 활용하여 GC-MS 검출에 사용하였다. 질량 스캔 범위는 30-450(m/z)으로 설정되었고 획득률(acquisition rate)은 5 spectra/s이였다. 검출된 대사물은 NIST Mass Spectral Search Program (버전 2.0; NIST, Gaithersburg, MD, USA)을 이용하여 확인하였다.
실시예 13: 예쁜꼬마선충 사멸(killing) 어세이
L4/젊은 성체의 예쁜꼬마선충을 실험 샘플이 놓여진 NGM 컨디셔닝 플레이트에 놓고, 25℃에서 24시간동안 배양하였다. 선충은 플레이트 당 30개씩 씨딩하였다.
이어서, 생존력 분석을 위해, 실험 샘플로 전처리된 선충을 Salmonella typhi SL 1344, Listeria monocytogenes EDG-e 및 E. coli O157:H7 EDL933 배양 플레이트에 옮켰으며, 25℃에서 배양하였고, 모든 선충이 사멸될 때까지 24시간 간격으로 현미경을 사용하여 검사했다.
실시예 14: In Vivo 평가 방법
14-1: 마우스 비장세포 (splenocyte) 분리
비장 조직은 C57BL/6 마우스(24주 된 암컷, 20-22g)에서 추출하였다. 상기 조직은 10% FBS, 항생제를 포함한 RPMI-1640 배지에서 40 μm 세포 스트레이너(cell strainer) (SH30027, Hyclone, Logan, UT, USA)를 사용하여 분리하였다. 상기 세포는 2000 rpm에서 4 ℃에서 10분 동안 원심분리를 통해 회수되었고, 적혈구(RBC)는 3분 동안 적혈구 용해 버퍼 (A10492-0, GIBCO, Thermo Fisher Scientific)로 제거하였다. 비장세포는 10% FBS 및 항생제를 포함하는 RPMI로 세척하고, 2000rpm에서 10분간 4 ℃에서 원심분리하여 세포를 회수하였으며, hematocytometer를 통해 세포계수를 하였다.
14-2: 마우스 비장세포의 세포독성 및 증식평가
세포 생존 분석은 EZ-Cytox cell viability assay kit (EZ-3000, DoGen, Seoul, Korea)를 사용하여 수행되었다. 먼저, 비장세포를 96-웰 플레이트(약 5x106/mL)에 시딩하고 48시간 동안 시료를 0, 0.1, 0.5, 1mg/mL로 처리하였으며, 동시에 면역억제제인 시클로포스파미드(cyclophosphamide, Cy) 1.6 mg/mL는 시료와 함께 처리하였다. 이후, 각 웰에 EZ-Cytox 시약 10 μL를 첨가하고 1 시간 동안 배양한 후, 샘플의 흡광도를 450nm로 측정하였다. 세포 생존율 값은 아무처리되지 않은 대조군 세포에 대해 정규화되었습니다.
14-3: 면역억제 마우스 모델을 이용한 효능 평가
생후 10주된 암컷 C57BL/6마리(19-20g)를 12/12시간 밝은/어두운 주기로 온도(22 ℃ ± 2 ℃)와 습도(50% ± 5%) 조절 및 자유급식으로 1주간의 적응 후, 무작위로 4개의 집단(n=5)으로 분류하였다: 대조군, 면역억제군 (Cy 100 mg/kg), 미발효녹용 섭취군 (2 mg/20 g), 발효녹용 섭취군 (2 mg/20 g)
녹용섭취군에 해당되는 2개의 그룹은 해당 농도로 28일 동안 경구 투여되었으며, 대조군과 Cy 그룹은 동일한 양의 식염수를 경구 투여하였다.
상기 마우스는 21일차 및 24일차에 총 200μL의 식염수로 현탁한 Cy를 복강주입한 후, 실험종료일에 비장, 혈청을 채취하였다.
14-4: RNA 분리 및 정량적 실시간 PCR(real-time reverse transcription polymerase chain reaction)
총 RNA는 AurumTM Total RNA Mini Kit(Biorad)를 사용하여 비장 조직으로부터 분리하고, iScriptTM cDNA Synthesis Kit (Biorad)를 사용하여 총 RNA의 1μg에서 cDNA를 합성하였다.
다음으로, 하기 표에 기재된 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 표적 유전자 발현을 분석하였으며, 증폭된 산물은 1% 아가로스 겔에 전기 영동을 통해 확인하였다. 정량 PCR은 SYBR® Green Master Mix (BioRad)를 사용하여 StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystem)에서 수행되었고, 임계값은 β-Actin 유전자 발현 수준에 대해 정규화되었다.
유전자 서열(5`-3`) 길이(bp) 서열번호
IL-6 정방향 AGTTGCCTTCTTGGGACTGA 159 1
역방향 TCCACGATTTCCCAGAGAAC 2
IL-10 정방향 GACAACATACTGCTAACCGACTCC 139 3
역방향 GCTCCTTGATTTCTGGGCCATG 4
iNOS 정방향 GCATGGACCAGTATAAGGCAAGCA 222 5
역방향 GCTTCTGGTCGATGTCATGACGAA 6
IFNγ 정방향 TCTGGAGGAACTGGCAAAAG 107 7
역방향 GCTGATGGCCTGATTGTCTT 8
TNF-α 정방향 AGCCCCCAGTCTGTATCCTT 212 9
역방향 CTCCCTTTGCAGAACTCAGG 10
β-Actin 정방향 AGCCATGTACGTAGCCATCC 228 11
역방향 CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA 12
실시예 15: 통계적 분석
통계 분석은 GraphPad Prism(version 9)을 사용하여 수행되었으며, 모든 통계 비교는 Dunnett의 다중 범위 테스트에 따른 일원 분산 분석을 통해 수행되었다. 데이터는 평균값 및 SD로 제시되며. *는 제어 그룹과 비교하여 P < 0.05을 나타내며, #는 P < 0.001을 나타낸다.
실험예 1: 신규한 녹용 발효 추출물 제조 기술
본 발명의 녹용 발효 추출물 제조 방법의 일 예로서 하기와 같이 기술할 수 있다. 다만 하기에 기술한 제조 방법은 구현예 중 하나로서 일부 단계가 변경될 수 있다.
1. 제1차 생녹용 발효 동결건조 녹용 생산을 위한 제조기술 단계
(단계 1) 가축질병 등의 위생 검증
(단계 2) 식품안전성 검사를 마친 원료 녹용(생녹용 원지)에 적합한 균주 선발
(단계 3) 생녹용 원지의 해동, 절편, 살균 및/또는 숙성한 이후 적합한 균주를 접종하여 일정 기간 발효 후 동결건조 녹용을 제조하는 공정
2. 제2차 추출 잔여물 고상 발효 제조 기술
(단계 4) 상기 단계3에서 획득한 발효 동결건조 녹용을 추출화하고, 농축·무균화를 진행하여 무균화된 발효 동결 건조 녹용의 제1차 추출물(농축액)을 생산
(단계 5) 1차 추출 후 녹용 잔여물을 발효 원료로 사용할 수 있도록 농축, 탈수분 및/또는 멸균을 통하여 무균화를 진행하고, 상기 무균화된 원료를 45% 이내의 저수분 상태의 잔여물로 만들거나, 동결전조 분말화하여 제2차 고상발효 원료로 사용한다.
(단계 6) 상기 방법으로 수득한 고상 발효 원료에 적합한 균주를 접종을 통해 고상발효를 수행하여 발효 녹용을 추출한다.
3. 제3차 혼합농축액 액상 발효 제조 기술 단계
(단계 7) 단계 1 내지 3의 공정을 거쳐 생산된 "제1차 발효 동결건조 녹용 추출물(농축액)"과 단계 4 내지 6의 공정을 거쳐 생산된 "제2차 고상발효 녹용 추출물(농축액)"을 다시 혼합하고, 액상발효에 적합한 균주를 접종하여 2일 내지 5일동안 발효한다. 제3차 발효를 마친 발효 녹용은 농축액 또는 액상분말화하여, 다른 기능성 제품의 원료로 사용할 수 있도록 한다.
따라서, 본 발명은 위의 단계1부터 단계7 제조과정 및 제1차 발효(생녹용발효), 제2차 발효(고상발효), 및 제3차 발효(액상발효)에 이르는 제조기술이다 (도 1 및 도 2).
녹용의 추출시 생녹용에 비하여 건조녹용에서 수율이 떨어지는 큰 원인은 워터쿠킹 ⇒ 열건조 ⇒ 온풍건조 ⇒ 건조된 원지의 유통기간 중 외부 충격 ⇒ 소주 및 알콜주입 ⇒ 슬라이스 ⇒ 건조의 과정을 거치면서, 물리 화학적 변화로 인하여 녹용 고유의 유기물질의 불용화가 진행되기 때문이다. 동물성 단백질 및 조직은 65℃ 이상에서 변성되어 불용화가 진행된다. 또한 생녹용의 동결시 완만한 동결로 인하여 공극화 증가로 현상으로 인하여 녹용 고유성분의 불용화 및 생산수율 감소가 진행될 수 있다.
이에, 상기 기술을 적용할 경우, 건조녹용의 불용화로 생녹용에 비하여 20% 이상 수율이 감소되는 부분을 식품공학적, 발효공학적 기술을 활용하여, 생녹용이 가지는 본연의 수율을 회복할 수 있으며(도 3), 항균, 항노화 기능성 프로바이오틱스 발효를 통하여 녹용이 가지고 있는 본연의 기능에 추가되는 기능성 발효 녹용을 제조할 수 있다 (도 4).
실험예 2: 발효 동결 건조 기술에 따른 공극화 수준 평가
상기 실험예 1에서의 단계3과 관련하여, 녹용의 동결시 완만한 동결로 인하여 녹용의 최대 빙결정생성대( -1℃ 내지 -5℃, 빙결율 80%) 통과 시간이 길어짐으로서, 큰 얼음결정과 조직의 물리적 손상에 의한 텍스쳐화(Texturequs) 및 수분 빙결정화로 인하여, 2 내지 5%의 수율 저하와 핵산물질, 유리 아미노산 등의 유용성 정미 성분의 감량이 발생하며, 이로 인한 염류와 금속이온과 유기산 등의 농축으로 인해 공극화 증가 현상이 발생할 수 있으며, 이로 인해 녹용 고유성분의 불용화 및 생산수율 감소가 진행될 수 있다.
이와 관련하여, 도 5에 나타난 바와 같이, 생녹용의 발효 후 동결 건조를 진행할 경우 공극화 현상 등을 최소화할 수 있음을 확인하였는 바, 상기 방법을 이용할 경우 유효성분 함량이 증가된 녹용 발효 추출물을 제조할 수 있다는 장점이 있다.
실험예 3: 녹용 발효에 적합한 균주 선정
녹용 추출물(농축액) 또는 추출 잔여물의 발효에 적합한 균주를 선정하기 위해서, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
3-1: 항노화 기능성 프로바이오틱스 균주 선정
전주대학교와 서울대학교에서 보유한 균주 및 신규 분리한 균주 중 김치와 유아 분변에서 분리한 균주인 Lactobacillus sakei, Lactobacillus brevis, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum를 포함한 유산균주 150개를 대상으로 내산, 내담, 부착능 실험을 수행하였다.
다음으로, 상기 실험을 통과한 균주 중 예쁜꼬마선충(C.elegans) 모델에서 수명 연장에 도움을 줄 수 있는지 평가하였으며(도 6), 그 결과, 수명 연장 향상에 영향을 미치는 17개의 균주를 선발하였다 (표 2).
3-2: 녹용 농축액(추출물)의 유산균 발효에 따른 pH 및 산도 측정
녹용 추출물 2% 첨가한 배지에, 선발된 17종의 락토바실러스 균주 1%를 접종하여 3일 동안 발효하면서 매일 pH 및 산도를 측정하였다.
그 결과, 실험 균주 모두 시간이 지남에 따라 락토바실러스에 의한 발효물의 pH는 낮아지며, 젖산을 기준으로 하는 총 산도(%)는 증가함을 알 수 있다 (도 7 및 도 8). 또한, 실험 균주의 경우, 대체로 시간이 지남에 따라 발효물의 산도가 높아진 것을 알 수 있으며, 선발된 균주 모두 2일 이상 경과된 경우 높은 젖산발효능을 가진 것으로 보였다.
3-3: 녹용 추출물의 발효액 내 생균수 측정
녹용 추출물 2% 첨가한 배지에, 선발된 17종의 락토바실러스 균주 1%를 접종하여 3일 동안 발효하면서 매일 발효물 내 존재하는 접종된 균의 생균수(CFU)를 측정하였다.
도 9는 액상 발효한 녹용 농축액의 균주에 따른 CFU 결과를 나타내었다. 그 결과, LRF20-001을 제외한 16개의 선발 균주들이 녹용 추출물에서 잘 증식함을 보였고, 특히 LRF20-002, 003, 004, 005, 007, 009, MR-45는 1억마리 이상의 높은 생균수를 보였다.
3-4: 녹용 추출물의 발효액 내 감마아미노부티르산 (gamma-aminobutyric acid) 측정
녹용 추출물 2% 첨가한 배지에, 선발된 17종의 락토바실러스 균주 1%를 접종하여 3일 동안 발효하면서, 매일 발효물 내 존재하는 접종된 균에 의한 감마아미노부티르산 (GABA) 생성 수준을 측정하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, LFR20-004 및 LFR20-007의 경우 우수한 GABA 농도를 나타냈으며, MR43, MR 45 및 MR50 또한 우수한 GABA 농도를 나타냈다.
3-5: 녹용 추출물의 발효액 내 시알산(sialic acid, N-acetylneuraminic acid) 측정
녹용 추출물 2% 첨가한 배지에, 선발된 17종의 락토바실러스 균주 1%를 접종하여 3일 동안 발효하면서, 매일 발효물 내 존재하는 접종된 균에 의한 시알산(sialic acid) 생성 수준을 측정하였다. 시알산은 면역에서 매우 중요한 생리적인 작용을 하고있는 물질로써, 녹용의 유효성분 중 시알산의 함량이 중요한 지표가 되지만, 가공과정 중에서 파괴되는 단점을 보완하여, 오히려 균을 접종함으로써 함량을 높이는 발효균 선발이 매우 중요하다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 분석된 총 시알산 함량이 2일차 및 3일차에서 증가되었으며, 특히 LFR20-001균주는 3일차에서 가장 높은 함량을 보이고, 2일차에서 LFR20-004, 006, 007, 008, 009, MR14가 대조군보다 13배 이상의 현저히 증가된 함량을 보이는 것으로 평가되었다. 또한, MR14 및 MR19를 제외한 MR균주들은 다른 균주에 비해 시알산 생성이 다소 미비한 것으로 보여진다.
3-6: 녹용 추출물의 발효액 내 GAG (Glycosaminoglycan) 및 우론산(uronic acid, N-acetylneuraminic acid) 측정
녹용 추출물 2% 첨가한 배지에, 선발된 17종의 락토바실러스 균주 1%를 접종하여 3일 동안 발효하면서, 매일 발효물 내 존재하는 접종된 균에 의한 GAG 및 우론산 생성 수준을 측정하였다.
그 결과, 도 12 및 도 13에 나타낸 바와 같이, GAG의 경우에는 모든 실험 균주에서 약 20% 감소되는 것을 확인하였으며, 우론산의 경우에는 3일째의 발효물에서 현저한 감소의 경향성을 보이는 것으로 확인되었다.
상기 결과를 토대로, 실험 균주에 의한 발효에서 우론산 및 GAG의 약간의 감소를 초래함을 보이고 있는 것을 알 수 있으며, 감소추세를 보았을 때 2일째에 해당하는 발효물에서의 평가지표를 통해 선발해야 함을 보여주고 있다.
3-7: 녹용 추출물의 발효액 내 총 질소 및 단백질, 아미노산 함량 측정
녹용 추출물 2% 첨가한 배지에, 선발된 17종의 락토바실러스 균주 1%를 접종하여 3일 동안 발효하면서, 매일 발효물 내 존재하는 총 질소 및 단백질, 아미노산 함량을 측정하였다.
그 결과, 대체적으로 모든 측정 항목에서 질소, 단백질, 아미노산의 수치가 감소하는 경향을 볼 수가 있으며(표 3), 이는 발효물을 잘 이용하는지 평가하기 위해 사용한 최소 프리바이오틱 배지를 사용함에 따라, 펩톤 등의 질소원을 넣어주지 않은 것에 기인하여, 녹용 추출물을 생장에 필요한 질소원으로 효과적으로 이용한 것으로 보인다. 접종균을 넣지 않은 대조군에 비해 유일하게 총 질소의 수치가 높게 나온 유산균은 MR50로써 매우 특이적인 결과이지만, 단백질 및 아미노산의 수치는 감소한 것으로 확인된다.
균주 전체 질소(N)
(μg/ml)		 단백질 (μg/ml) 아미노산 (mg/ml)
대조군 881.016±30.504 537.000±0.003 4.216±0.072
LFR20-001 222.798±15.882 380.629±0.017 3.291±0.041
LFR20-002 283.474±12.182 345.615±0.020 3.016±0.050
LFR20-003 247.888±3.236 419.414±0.008 3.763±0.100
LFR20-004 306.900±29.207 341.844±0.011 3.482±0.014
LFR20-005 394.585±23.576 306.292±0.007 2.950±0.027
LFR20-006 204.877±18.244 516.376±0.002 3.608±0.023
LFR20-007 720.238±38.258 356.389±0.009 2.945±0.033
LFR20-008 177.355±14.795 478.130±0.013 3.896±0.053
LFR20-009 244.048±9.798 351.002±0.009 3.597±0.040
MR1 322.261±8.140 405.408±0.007 3.103±0.045
MR4 333.781±28.079 322.452±0.008 3.019±0.029
MR5 291.539±10.199 473.282±0.025 2.666±0.014
MR14 285.394±22.301 405.947±0.011 2.912±0.023
MR19 322.901±24.770 412.950±0.017 2.865±0.024
MR43 449.757±40.967 476.514±0.010 3.305±0.080
MR45 462.558±30.657 421.030±0.017 3.640±0.082
MR50 915.323±33.944 444.193±0.004 3.185±0.065
3-8: 발효에 적합한 최종 균주 선발
발효에 적합한 균주를 선발하기 위해, 녹용 추출물의 2일째 발효물을 대상으로 GABA 및 시알산 함량 데이터를 다시 확인하여 비교하였다.
그 결과, 도 14에서 나타낸 바와 같이, 특이적으로 MR43, 45, 50은 가장 많은 GABA 함량을 보이는 반면, 시알산 함량이 LFR 균주보다 못 미침을 확인하였고, 대조군 정도의 수준으로 관찰되기도 하였다.
상기 실험예들의 결과를 토대로 발효에 적합한 균주를 선발하기 위해, 1) C.elegans의 수명연장 효능이 양성대조군인 LGG균의 결과보다 우수하며, 2) 발효물 내 GABA 함량은 상위 6위 이내로서 2배 이상의 증가를 보인 균주, 3) 발효물 내 시알산 함량은 상위 10위 이내로 평가된 균주 중, 4) 2일째 발효물 내 생균수가 1억마리 이상의 활성을 보이는 균주를 벤다이어그램을 활용하여 선발하였다.
그 결과 최종적으로 녹용 추출물(농축액) 또는 추출 잔여물을 효과적으로 발효시킬 수 있는 균주로서 LFR40-004인 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)와 LFR20-007인 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei)가 선발되었다. 또한 추가적으로 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)인 MR50 균주를 선발하였다 (도 15).
한편, 상기 LFR20-004 균주는 'Lactobacillus rhamnosus JLFR LR04 (수탁번호:KACC 92399P, 기탁일자: 2021년11월22일)로 기탁되었고, LFR20-007 균주는 'Lactobacillus sakei JLFR LS07 (수탁번호: KACC 92398P, 기탁일자: 2021년11월22일)로 기탁되었으며, MR 50 균주는 Lactobacillus plantarum LP20B49 (수탁번호: KACC 92397P, 기탁일자: 2021년11월22일)로 기탁되었다.
실험예 4: 녹용 발효물의 GABA 및 시알산 함량 분석
상기 실험예 3에서 선별한 LFR20-004 및 LFR20-007를 동시에 이용하여 발효시킨, 녹용 추출물의 발효물 내 GABA 및 시알산 함량을 분석하였다. 대조군으로서 2% 녹용 추출물을 포함하는 최소 프리바이오틱 배지를 사용하였다.
그 결과, 두 균주를 함께 발효한 녹용 추출물이 발효하지 않은 녹용에 비해 GABA는 약 2.6배 증가하였고, 시알산은 약 2배 증가하였음을 확인하였다(표 4 및 도 16).
GABA (μg/mL) 시알산 (μg/mL)
대조군 (녹용배지) 6.33±2.46 21.77±0.22
LFR20-004 + LFR20-007
혼합 발효물		 16.69±1.37 40.10±2.86
실험예 5: 녹용 발효물의 대사체(metabolite) 분석
상기 실험예 3에서 선별한 LFR20-004 및 LFR20-007를 동시에 이용하여 발효시킨, 녹용 추출물의 발효물 내 대사체 분석을 수행하였다.
그 결과, 클러스터링 분석을 통해 발효하지 않은 녹용과 발효한 녹용 사이에서 대사 산물의 뚜렷한 차이점을 확인하였다 (도 17).
다음으로, 발효 후 증가된 세부적인 대사체들의 함량을 비교해 보았을 때, 발효 후 프로판산(propanoic acid), 및 석신산(butanedioic acid) 등의 유용한 단쇄지방산들이 검출되었고, 아미노산 및 유도체들이 증가되었음 확인되었으며, 특히 대사체중에 D-락트산(D-latic acid)가 젖산발효를 통해 287배 증가 되었음을 확인하였다. 또한 아미노산에서는 글리신 함량이 6배 증가하였다. 글리신 아미노산은 뇌신경계의 기능뿐 아니라 대사성질환의 개선 및 예방에 매우 관련성이 깊은 것으로 보고되어 있다. 또한, 갈락토오스(galatose)와 만노스(mannose)와 같은 단당류 등은 감소되어 검출되었다 (표 5).
PC1 p -value FC
Metabolites increased by fermentation
D-Lactic acid 0.990 <0.001 287.20
L-Proline 0.984 0.005 +
Mevalonic lactone 0.979 0.006 +
Butanedioic acid 0.979 0.007 +
Pentanedioic acid 0.968 0.01 +
Glycine 0.955 0.009 6.091
L-Proline 0.947 0.003 +
D-Mannitol 0.945 0.013 +
Propanoic acid 0.937 0.028 +
Phenylalanine 0.920 0.040 +
Aminomalonic acid 0.907 0.053 +
Metabolites reduced by fermentation
d-Galactose -0.908 0.040 3.712
Mannose -0.928 0.010 1.835
SC553_73mz_15.878min (Unknown) -0.935 <0.001 -
D-(-)-Tagatose -0.971 <0.001 -
d-Galactose -0.983 0.005 1.735
실험예 6: 녹용 발효물의 항균 효능 평가
상기 실험예 3에서 선별한 LFR20-004 및 LFR20-007를 동시에 이용하여 발효시킨, 녹용 추출물의 발효물의 항균 효능을 평가하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 실시예 13에 기재된 예쁜꼬마선충 사멸 어세이를 통해 상기 녹용 추출물의 발효물의 항균 효능을 평가하고자 하였으며, Salmonella typhi SL 1344, Listeria monocytogenes EDG-e 및 E. coli O157:H7 EDL933에 대한 항균 효능을 평가하였다. 대조군으로서, LGG균, 당귀 추출물 및 당귀 발효물을 사용하였다.
그 결과, 녹용 추출 발효물의 경우 다른 실험군 및 대조군에 비해 우수한 항균 효능을 나타내는 것을 확인하였다 (도 18 내지 도 20).
실험예 7: 녹용 발효물의 안전성 평가
상기 실험예 3에서 선별한 LFR20-004 및 LFR20-007를 동시에 이용하여 발효시킨, 녹용 추출물의 발효물의 안전성을 평가하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 상기 발효물을 분말 형태로 제조한 후 실험을 수행하였으며, 발효녹용분말을 암수 Sprague-Dawley 랫드에 단회 경구 투여 하였을 때, 발현되는 독성반응을 관찰하고 개략의 치사량을 구하기 위하여 수행하였다. 본 시험은 「동물보호법」법률 제16977호(2020.2.11. 일부개정)에 근거한 한국식품산업클러스터진흥원 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인되어 진행하였다 (승인번호: IACUC-21-008). 암컷과 수컷 5주령 SD 레트를 대상으로 식염수 투여군과 발효물 최대치(건조중량으로써 5g/kg/day)를 경구투여 단회 실시하였고, 2주 동안의 일반증상관찰과 체중등을 측정한 후 부검하였다.
그 결과, 암수 5,000 mg/kg/day 투여군에서 사망례는 관찰되지 않았으며, 일반증상, 체중, 부검, 뇨검사, 혈액학적 검사, 혈액생화학적 검사에서 시험물질 투여에 의한 인정은 관찰되지 않았다. 따라서, 본 시험의 조건 하에서 암수 랫드에 발효녹용분말을 단회 경구 투여한 결과, 개략의 치사량은 암수 모두 시험물질 5,000 mg/kg/day을 상회하는 것으로 판단된다.
실험예 8: 녹용 발효물의 세포 독성 평가
상기 실험예 3에서 선별한 LFR20-004 및 LFR20-007를 동시에 이용하여 발효시킨, 녹용 추출물의 발효물의 세포 독성을 평가하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 노령 마우스 (6개월, C57BL/6, 암컷)에서 분리한 비장세포 (splenocyte, 5x106/ml)를 분주한 후, 시클로포스파미드(Cy, 1.6mg/ml)를 처리하여 면역억제를 유도하였으며, 녹용 추출물 및 발효물 처리에 따른 세포 생존율을 측정하였다. 시클로포스파미드는 항암제로써 면역억제제로 사용되는 약물로도 사용되어 개체 및 면역세포에서 저하를 유도한다.
녹용 추출물 또는 녹용 발효물을 Cy와 함께 처리하여 48시간 후의 세포 생존율을 확인한 결과, 녹용 발효물을 처리한 비장세포의 경우 녹용 추출물을 처리한 경우보다 세포 생존율이 향상된 것을 확인하였다 (도 21).
실험예 9: 녹용 발효물의 면역 유도 효능 분석
상기 실험예 3에서 선별한 LFR20-004 및 LFR20-007를 동시에 이용하여 발효시킨, 녹용 추출물의 발효물의 면역 증진 효과를 평가하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 녹용 발효물의 효능을 평가하기 위한 마우스 동물 모델 in vivo 실험은 도 22와 같이 수행하였다. 구체적으로, 11주령 암컷 마우스(C57BL/6)를 대상으로 녹용 추출물 및 녹용 혼합 발효물을 4주간 매일 경구투여한 후, 시클로포스파미드를 2회 처리한 후(21일째, 24일째), 부검하여 비장세포 및 혈액을 분리하여 면역관련 바이오마커(IL-6, TNF-alpha, IL-10, IFN-gamma 및 iNOS)의 발현 수준을 분석하였다.
그 결과, 면역억제제를 투여한 마우스 군은 대조군보다 낮은 수준의 면역 관련 바이오마커 수준을 나타냈으나, 녹용 추출물을 처리한 실험군에서는 상기 바이오마커의 발현 수준이 어느정도 증가하였으며, 녹용 발효물을 처리한 실험군에서는 면역 관련 바이오마커의 발현 수준이 현저히 증가한 것을 확인하였다 (도 23).
실험예 10: 고상발효 조건 확립
본 발명의 녹용 발효 추출물 제조 방법과 관련하여, 고상 발효시 사용하는 균주에 따른 발효 효율을 평가하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 실시예 1-2에 기재된 방법으로 고상 발효를 진행하였으며, 하기와 같은 균주 또는 균주 조합을 이용하여 발효를 수행하였다:
1. 락토바실러스 플란타룸
2. 락토바실러스 플란타룸 + 바실러스 서브틸리스
3. 락토바실러스 플란타룸 + 사카로마이세스 세레비지애
4. 락토바실러스 플란타룸 + 바실러스 서브틸리스 + 사카로마이세스 세레비지애
고상 발효 수행 결과, 락토바실러스 플란타룸 단일 균주만 이용한 실험군의 경우, 다른 실험군보다 발효시 생균수가 현저히 높은 것을 확인하였다. 또한, 락토바실러스 플란타룸 단일 균주를 이용한 실험군의 경우 발효 시 pH가 점차 감소하는 것을 확인하였다 (도 24).
상기 결과를 토대로, 고상 발효 시 바실러스 서브틸리스 또는 사카로마이세스 세레비지애 균주를 이용하는 것보다 락토바실러스 플란타룸을 이용할 경우 발효 효율이 현저히 증가될 것이라는 것을 알 수 있다.
실험예 11: 액상발효 조건 확립
본 발명의 녹용 발효 추출물 제조 방법과 관련하여, 액상 발효시 사용하는 균주 및 1차 녹용 추출물(농축물) 및 고상 발효 추출물(농축물)의 조합에 따른 발효 효율 및 유효성분 ?t량을 평가하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 실시예 1-1에 기재된 방법으로 액상 발효를 진행하였으며, 하기와 같은 조건으로 발효를 수행하였다:
1. 녹용추출물(농축액) 40ml + 최소 프리바이오틱 배지 59ml + 유산균(LFR40-004) 접종 1ml
2. 녹용추출물(농축액) 50ml + 최소 프리바이오틱 배지 49ml + 유산균(LFR40-004) 접종 1ml
3. 녹용추출물(농축액) 60ml + 최소 프리바이오틱 배지 39ml + 유산균(LFR40-004) 접종 1ml
4. 녹용추출물(농축액) 40ml + 최소 프리바이오틱 배지 59ml + 유산균(LFR40-007) 접종 1ml
5. 녹용추출물(농축액) 50ml + 최소 프리바이오틱 배지 49ml + 유산균(LFR40-007) 접종 1ml
6. 녹용추출물(농축액) 60ml + 최소 프리바이오틱 배지 39ml + 유산균(LFR40-007) 접종 1ml
7. 녹용추출물(농축액) 40ml + 고상발효추출물(농축액) 59ml + 유산균(LFR40-004) 접종 1ml
8. 녹용추출물(농축액) 50ml + 고상발효추출물(농축액) 49ml + 유산균(LFR40-004) 접종 1ml
9. 녹용추출물(농축액) 60ml + 고상발효추출물(농축액) 39ml + 유산균(LFR40-004) 접종 1ml
10. 녹용추출물(농축액) 40ml + 고상발효추출물(농축액) 59ml + 유산균(LFR40-007) 접종 1ml
11. 녹용추출물(농축액) 50ml + 고상발효추출물(농축액) 49ml + 유산균(LFR40-007) 접종 1ml
12. 녹용추출물(농축액) 60ml + 고상발효추출물(농축액) 39ml + 유산균(LFR40-007) 접종 1ml
한편, 상기 실험군 중 1 내지 6의 경우에는 최소 프리바이오틱 배지를 이용하였으며, 7 내지 12의 고상발효추출물에 최소 프리바이오틱 배지의 성분을 혼합하여 이용하였다.
액상 발효 수행 결과, 생균수의 경우 12번 실험군에서 가장 우수한 결과를 나타냈으며 (도 25), 발효시의 pH의 경우 전체적으로 2일에 감소하였으나, 이후 5일차까지는 크게 변화하지 않았다 (도 26).
다음으로, 시알산 함량 분석 결과, 1차 녹용 추출물과 고상발효 추출물을 혼합한 실험군(7 내지 12)의 시알산 함량이 1차 녹용 추출물만으로 발효한 실험군(1 내지 6)보다 높은 것을 확인하였으며, 락토바실러스 사케이인 LFR40-007을 이용할 경우 시알산 함량이 높은 것을 확인하였다 (도 28). 또한, 상기 혼합물 내에 고상발효 추출물 비율이 증가할수록 시알산 함량이 증가하는 것을 확인하였다.
다음으로, GABA 함량 분석 결과, 1차 녹용 추출물과 고상발효 추출물을 혼합한 실험군(7 내지 12)의 GABA 함량이 1차 녹용 추출물만으로 발효한 실험군(1 내지 6)보다 높은 것을 확인하였으며, 락토바실러스 사케이인 LFR40-007을 이용할 경우 GABA 함량이 높은 것을 확인하였다 (도 29). 또한, 상기 혼합물 내에 1차 녹용 추출물 비율이 증가할수록 GABA 함량이 증가하는 것을 확인하였다.
상기 결과를 토대로, 액상 발효 시 사용하는 균주 및 1차 녹용 추출물과 고상발효 추출물의 비율을 조절함으로서 발효 효율 및 유효 성분 함량을 조절할 수 있음을 알 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 특허는 농협중앙회와 식품농림업기술기획평가원(IPET, 한국)의 국내산 발효녹용의 부가가치 향상을 위한 제품화 기술 개발 (연구 과제번호 320111-1, 320111011CG000)의 연구비 지원으로 수행되었다.
본 특허는 과제번호 320111-1의 결과물이며, 서울대학교 김영훈교수, 신한대학교 이명호교수, 전북대학교, 전주대학교 오상남교수, 연세대학교 전보영교수, 전북대학교 황인호교수, 전북바이오융합산업진흥원 정이형팀장, 한국양토양록농협 김용안박사가 공동 연구한 결과 입니다.
농촌진흥청 국립농업과학원 미생물은행(KACC) KACC92397P 20211122 농촌진흥청 국립농업과학원 미생물은행(KACC) KACC92398P 20211122 농촌진흥청 국립농업과학원 미생물은행(KACC) KACC92399P 20211122

Claims (15)

1) 녹용 원료를 1차 추출하여 1차 녹용 추출물을 수득하는 단계;
2) 상기 1차 추출 잔여물을 유산균으로 발효하는 단계;
3) 상기 2) 단계의 발효물로부터 2차 추출하여 2차 녹용 추출물을 수득하는 단계; 및
4) 상기 1차 녹용 추출물 및 2차 녹용 추출물을 포함하는 혼합물을 유산균으로 발효하는 단계
를 포함하는, 녹용 발효 추출물 제조방법으로서,
상기 방법으로 제조된 녹용 발효 추출물은 녹용 추출물에 비해 GABA(γ-aminobutyric acid) 및 시알산의 함량이 증가된 것이고,
상기 유산균은 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus) JLFR LR04 (수탁번호: KACC92399P) 및 락토바실러스 사케이 (Lactobacillus sakei) JLFR LS07 (수탁번호: KACC92398P)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것인, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 녹용 원료는 생녹용, 건조 녹용 또는 발효 녹용인 것인, 방법.
삭제
삭제
청구항 1에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) LP20B49 (수탁번호: KACC92397P)을 추가로 포함하는 것인, 제조방법.
청구항 1에 있어서, 상기 2) 단계는 추출 잔여물을 효소 처리하는 단계를 포함하는 것인, 제조방법.
청구항 1에 있어서, 상기 2) 단계는 고상 발효를 수행하는 것인, 제조방법.
청구항 1에 있어서, 상기 4) 단계의 혼합물은 1차 녹용 추출물 및 2차 녹용 추출물이 1:9 내지 9:1의 비율로 혼합되는 것인, 제조방법.
청구항 1에 있어서, 상기 방법은
5) 상기 발효물을 추출, 농축 또는 분말화하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 제조방법.
삭제
청구항 1, 2 및 5 내지 9 중 어느 한 항의 방법으로 제조된, 녹용 발효 추출물.
청구항 11의 녹용 발효 추출물을 포함하는, 항노화용 조성물.
청구항 11의 녹용 발효 추출물을 포함하는, 항균 조성물.
청구항 11의 녹용 발효 추출물을 포함하는, 면역 증강용 조성물.
삭제
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