JP5965875B2 - D−アミノ酸の製造方法 - Google Patents
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Description
D−アミノ酸が有する皮膚に対する効能としては、他にも、D−グルタミン酸が、経口投与により、シワ形成を軽減させることが知られている(特許文献3)。
離のアミノ酸の味は、L体とD体とでは大きく異なることが知られているが、L体と同様にD体も風味改良剤として使用し得る(特許文献5)。そして、チーズ、ヨーグルト、黒酢又は日本酒等の発酵食品には、D−アミノ酸が豊富に含まれており、発酵食品の旨みの一役を担っていると考えられている。
[1] ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)に属する微生物を培地で培養する工程、及び、
前記培養後の培養物中に分泌されたD−アミノ酸と微生物とを分離し、かつ、D−アミノ酸を含む画分を培養物から回収する工程、
を含む、D−アミノ酸の製造方法。
[2]前記ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)に属する微生物が、MCC1848株(受託番号:NITE BP−01671)またはJCM1120株である、[1]に記載の方法。
[3]前記D−アミノ酸を含む画分の培養物からの回収を、培養物から微生物を除去した後に行う、[1]または[2]に記載の方法。
[4]前記D−アミノ酸を含む画分において微生物から分泌されたアミノ酸が、以下の(1)の関係式を満たすものである、[1]〜[3]のいずれかに記載の製造方法。
[D−アミノ酸分泌量]/([D−アミノ酸分泌量]+[L−アミノ酸分泌量])≧0.5 ・・・・・・(1)
[5]前記(1)の関係式を満たすD−アミノ酸が、D−アスパラギン、D−アスパラギン酸、D−グルタミン酸、およびD−アラニンからなる群より選択される一または複数のD−アミノ酸である、[1]〜[4]のいずれか一に記載の製造方法。
[6]前記ラクトバチルス・ヘルベティカスが、MCC1848株(受託番号:NITE
BP−01671)であり、かつ、前記D−アミノ酸が、D−アスパラギン酸、D−グルタミン酸、およびD−アラニンからなる群より選択される一または複数のD−アミノ酸である、[1]〜[5]のいずれかに記載の製造方法。
[7]前記ラクトバチルス・ヘルベティカスが、JCM1120株であり、かつ、前記D−アミノ酸が、D−アスパラギンである、[1]〜[5]のいずれかに記載の製造方法。[8][1]〜[7]のいずれかに記載の製造方法により製造されるD−アミノ酸を含む画分、及び医薬的に許容される賦形剤を含む、医薬。
[9]単離されたラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)MCC1848株(受託番号:NITE BP−01671)。
[10][9]に記載の株を含有する培養物を含む、組成物。
[11]前記培養物は、D−アミノ酸を含む、[10]に記載の組成物。
また、好ましい態様では、[D−アミノ酸分泌量]/([D−アミノ酸分泌量]+[L−アミノ酸分泌量])の比率が高い株を使用することにより、高効率でD−アミノ酸を製造する方法が提供される。
さらに、本発明において使用されるラクトバチルス・ヘルベティカスに属する微生物は、長い食経験のある乳酸菌である。そのため、D−アミノ酸を含む画分から乳酸菌を分離除去しなくても、食品等の組成物に配合することができる。
たとえば、乳酸菌は、腸内細菌の生育に大きな影響を与え、腸内環境を良好に保つ作用を有することが知られている。この乳酸菌は、人の腸内に、いわゆる善玉菌として生息し、腸内環境を維持している。腸内環境を整えることによって、免疫力が向上し、様々な病気に罹りにくくなったり、病状が改善されたりすることが期待されている。このことから、整腸作用や、免疫増強作用、及び発癌抑制作用等を有することが知られている。このため、乳酸菌は健康増進、又は疾患の予防若しくは治療を目的として、飲食品、医薬品等に広く利用されてきた。
その中でも、ラクトバチルス・ヘルベティカス JCM1120株(JCM1120Tと表記されることがある。Tは標準株であることを表す。)又はラクトバチルス・ヘルベティカス MCC1848株を使用することが好ましい。
ラクトバチルス・ヘルベティカス JCM1120株は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室(JCM)より入手することができる。
ラクトバチルス・ヘルベティカスMCC1848株は、2013年7月29日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(〒292−0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8 122号室)に、ブダペスト条約に基づき国際寄託されている(受託番号:NITE BP−01671)。
たとえば、[D−アミノ酸分泌量]/([D−アミノ酸分泌量]+[L−アミノ酸分泌量])の式により算出される値が、0.5以上、好ましくは0.8以上、より好ましくは1.0となる株を使用することにより、高効率にD−アミノ酸を製造することが可能となる。上記式に適用するアミノ酸分泌量は、式中の分母における分泌量の単位と、式中の分子における分泌量の単位とが同じであれば、どのような単位で表される値であってもよい。
また、当該培地として、乳牛、水牛、羊、山羊、ラクダ、インド牛、ヤク牛、馬、ロバ、トナカイ等の各種乳および乳製品や、ぬか床、野菜類、魚介類、米類等の食品も使用可能である。
D−アミノ酸を含む画分の性状は特に制限されず、液体であってもよく、凍結乾燥等によって得られる粉体であってもよい。
MCC1848株は、L−アミノ酸と比較したD−アミノ酸の分泌比率の高さに加えて、分泌するD−アミノ酸の種類の豊富さの点で好ましい。
菌学」、臨床検査18、1163〜1172ページ)を用いて、28種類の糖について試験を行った。MCC1848株の糖発酵性は、国際的な細菌分類の大網である前記バージェイズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジーに記載されているラクトバチルス・ヘルベティカスに特徴的な糖発酵性と一致し、標準株であるJCM1120株の糖発酵性とも酷似している。これらのことから、MCC1848株は、ヘルベティカスに属すると考えられる。参考として、標準株の糖発酵性と、バージェイズ・マニュアルの記載を一部抜粋し、表1に示す。
アミノ酸は、D−アミノ酸が有する生理作用を期待するのみならず、矯味等の様々な目的で、医薬、医薬部外品、皮膚外用剤、化粧料、飲食品、食品添加剤及び飼料等の組成物に配合することができる。当該組成物に配合されるD−アミノ酸とは、単離精製したD−アミノ酸、D−アミノ酸を含む画分のいずれであってもよい。
また、D−アミノ酸又は培養物は、他の医薬、医薬部外品又は皮膚外用剤と併用されてもよい。併用する医薬、医薬部外品又は皮膚外用剤は、D−アミノ酸または培養物を含む製剤中に、有効成分の一つとして含有させてもよいし、製剤中には含有させずに別個の製剤として組み合わせて商品化してもよい。
ル等、着色剤としては医薬品に添加することが許容されている赤色2号、黄色4号、及び青色1号等を例示することができる。
スケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、米菓子、豆菓子、デザート菓子、ゼリー、その他の菓子などの菓子類;炭酸飲料、天然果汁、果汁飲料、果汁入り清涼飲料、果肉飲料、果粒入り果実飲料、野菜系飲料、豆乳、豆乳飲料、コーヒー飲料、お茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、スポーツ飲料、栄養飲料、アルコール飲料、その他の嗜好飲料等の嗜好飲料類、ベビーフード、ふりかけ、お茶潰けのり等のその他の市販食品等;育児用調製粉乳;経腸栄養食;機能性食品(特定保健用食品、栄養機能食品)等が挙げられる。
飼料の形態としては特に制限されず、例えば、トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦、マイロ等の穀類;大豆油粕、ナタネ油粕、ヤシ油粕、アマニ油粕等の植物性油粕類;フスマ、麦糠、米糠、脱脂米糠等の糠類;コーングルテンミール、コーンジャムミール等の製造粕類;魚粉、脱脂粉乳、ホエイ、イエローグリース、タロー等の動物性飼料類;トルラ酵母、ビール酵母等の酵母類;第三リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の鉱物質飼料;油脂類;単体アミノ酸;糖類等を配合することにより製造できる。飼料の形態としては、例えば、ペットフード、家畜飼料、養魚飼料等が挙げられる。
ラクトバチルス・ヘルベティカスに属する微生物として、ラクトバチルス・ヘルベティカスJCM1120株(JCMより入手)、及びラクトバチルス・ヘルベティカスMCC1848株を、それぞれMRS(de Man Rogasa Sharpe)培地(Difco(登録商標)製品、日本ベクトン・ディッキンソン社より入手)3 mL で、嫌気的に37℃で一晩(16時間)培養した。培地は0.22μmフィルターにてろ過して乳酸菌を除去し、得られた培養上清を冷蔵にて保存した。
使用したHPLCシステム(NANOSPACE SI-2 シリーズ, 資生堂, 日本)の構成を以下に示す。
3010型脱気装置、
3201型ポンプ 2台、
3033型オートサンプラー、
3004型カラムオーブン、
3013型蛍光検出器 2台、
3012型カラム選択ユニット、マルチループユニット(9ループ、1ループは長さ 750
mm x 内径 0.5 mm、ループ当たり150 μL容量)、1入力-10出力バルブ(C5-2340 EMTD, Valco Instruments、米国)。
データ処理プログラムのEzChrom Elite Clientは、検出器の反応をモニタリングするのに使用し、カラム選択ユニットとマルチループユニットは、KSAAバルブ制御システム(資生堂)を用いて制御した。
Asnの移動相には、5 mMクエン酸加・メタノール/アセトニトリル混合液(25:75混合液)を、流速200 μL毎分で使用した。
Glu、Aspの移動相には、2.5 mM クエン酸加・メタノール/アセトニトリル混合液(25:75混合液)を、流速200 μL毎分で使用した。
また、Alaの移動相には5 mMクエン酸加・メタノール/アセトニトリル混合液(50:50混合液)を流速200 μL毎分で使用した。
そして、一次元目に設置した蛍光検出器によって、470nmの励起波長によるNBD誘導体化アミノ酸の蛍光を530nmにて検出し、検出したアミノ酸を含む画分(D体とL体の混合物の状態:クロマトグラムの一例を図1に示す)を、カラムスイッチングにより二次元目における光学異性体分離カラムへ導入して分離し、二次元目に設置した蛍光検出器によってD体とL体を定量した(クロマトグラムの一例を図2に示す)。
アミノ酸のD体、L体の定量結果を、それぞれ表2に示す。
分泌量がマイナスの場合は、微生物が分泌したアミノ酸量よりも、微生物により消費されたアミノ酸量の方が多かったことを示す。
分泌量がプラスの場合は、微生物により消費されたアミノ酸量よりも、微生物が分泌し
たアミノ酸量が多かったことを示す。
MCC1848株では、D−アスパラギン酸、D−グルタミン酸及びD−アラニンの分泌比率が0.5以上であり、D−アミノ酸が高効率に分泌されていることが判明した。さらに、高効率に分泌するD−アミノ酸の種類も豊富である。
10%(W/W)還元脱脂粉乳(森永乳業社製)を水に溶解して得た10%(W/W)還元脱脂粉乳培地1000mLを90℃で30分間殺菌し、ラクトバチルス・ヘルベティカスMCC1848株のシードカルチャーを30mL接種し、37℃16時間培養した。
これとは別に、脱脂粉乳、全粉乳、ペクチン、及び蔗糖からなる原料を混合溶解して得られた、乳脂肪0.5%(W/W)、無脂乳固形分8.0%(W/W)、蔗糖5.0%(W/W)、ペクチン0.2%(W/W)からなるベース50Lを、90℃で10分間殺菌し,40℃に冷却した。該殺菌したベースに、前記の通り前培養を行ったラクトバチルス・ヘルベティカスMCC1848株のカルチャー50mLを接種し、3716時間培養して発酵乳を得た。
該発酵乳を直ちに攪拌冷却し、冷却発酵乳を15MPaの圧力で均質化し、200mL容のガラス容器に充填し、密封し、ドリンクヨーグルトを製造した。
このドリンクヨーグルトは、このまま皮膚保湿用飲食品、シワ形成抑制用飲食品、及び美肌用飲食品として使用し得る。
10%(W/W)還元脱脂粉乳培地1000mLを90℃で30分間殺菌し、ラクトバチルス・ヘルベティカスMCC1848株のシードカルチャーを30mL接種し、37℃16時間培養した。
これとは別に、乳脂肪3.0%(W/W)、無脂乳固形分9.0%(W/W)からなる生乳50Lを70℃に加温し、15MPaの圧力で均質化した後、90℃で10分間殺菌
し、40℃に冷却した。該殺菌したベースに、前記の通り前培養を行ったラクトバチルス・ヘルベティカスMCC1848株のカルチャー500mL、及びストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・ブルガリクスの混合カルチャー5mLを接種し、500mL容の樹脂容器に充填し、密封し、37℃7時間培養した後、直ちに冷却して発酵乳を製造した。
この発酵乳は、このまま皮膚保湿用飲食品、シワ形成抑制用飲食品、及び美肌用飲食品として使用し得る。
還元脱脂粉乳培地(13重量%脱脂粉乳、0.5重量%酵母エキス含有)を95℃で30分間殺菌したのち、ラクトバチルス・ヘルベティカスMCC1848株のシードカルチャーを接種し、37℃で16時間培養し、得られた培養物を凍結乾燥してラクトバチルス・ヘルベティカスMCC1848株培養物の粉末製剤を得た。
この粉末製剤は、このまま皮膚保湿剤、シワ形成抑制剤、及び美肌剤として使用し得る。
また、本発明の製造方法において、特定の株を採用することにより、高効率に及び/又は多種類のD−アミノ酸を製造することが可能である。
2 D−アラニンのピークを示す。
3 L−アラニンのピークを示す。
Claims (6)
- ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)MCC1848(受託番号:NITE BP−01671)に属する微生物を培地で培養する工程、及び、
前記培養後の培養物中に分泌された、D−アスパラギン酸、D−グルタミン酸、およびD−アラニンからなる群より選択される一または複数のD−アミノ酸と微生物とを分離し、かつ、当該D−アミノ酸を含む画分を培養物から回収する工程、
を含む、D−アミノ酸の製造方法。 - 前記D−アミノ酸を含む画分の培養物からの回収を、培養物から微生物を除去した後に行う、請求項1に記載の方法。
- 前記D−アミノ酸を含む画分において微生物から分泌されたアミノ酸が、以下の(1)の関係式を満たすものである、請求項1または2に記載の製造方法。
[D−アミノ酸分泌量]/([D−アミノ酸分泌量]+[L−アミノ酸分泌量])≧0.5 ・・・・・・(1) - 単離されたラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)MCC1848(受託番号:NITE BP−01671)。
- ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)MCC1848(受託番号:NITE BP−01671)を含有する培養物を含む、組成物。
- 前記培養物は、D−アミノ酸を含む、請求項5に記載の組成物。
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