WO2021070829A1 - ニコチンアミドリボシドを産生する乳酸菌、並びにニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドを産生する乳酸菌 - Google Patents

ニコチンアミドリボシドを産生する乳酸菌、並びにニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドを産生する乳酸菌 Download PDF

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lactic acid
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吉田　信行
西川　孝治
井戸垣　秀聡
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国立大学法人静岡大学
株式会社大阪ソーダ
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Definitions

  • the present invention relates to a lactic acid bacterium that produces nicotinamide riboside, and a lactic acid bacterium that produces nicotinamide mononucleotide and nicotinamide riboside.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 In recent years, aging and aging-related diseases have been shown to be closely associated with decreased levels of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD + ) and decreased activity of the NAD + -dependent deacetylase sirtuin (NAD +).
  • activation of sirtuins is thought to explain many of the effects of calorie restriction on life extension or health promotion (Non-Patent Document 2).
  • NAD + has long been known as a coenzyme for redox reactions, but in recent years, it has also been known to play a role as a substrate for poly-ADP ribose polymerase, CD38 / CD157, sirtuin, etc. (Non-Patent Document 1). ). In particular, the decomposition reaction of NAD + to nicotinamide by sirtuins promotes the lysine residue deacetylation reaction by sirtuins that are coupled to it, and is involved in various life phenomena related to health and longevity (non-patented). Documents 1 and 2).
  • NAMPT nicotinamide phosphoribosyl transferase
  • Nicotinamide mononucleotides can be obtained from yeasts with eating experience such as torula yeast (Patent Document 1), and E. coli, B. coli, B. coli. B. subtilis, C.I. Glutamicum, A. glutamicum. A. bylyi, and R. It has been reported that nicotinamide riboside can be obtained from a genetically modified bacterium of a bacterium selected from the group consisting of R. europha (Patent Document 2).
  • an object of the present invention is to provide a microorganism having a high production efficiency of nicotinamide riboside, and a microorganism capable of producing both nicotinamide mononucleotide and nicotinamide riboside.
  • Item 1 A method for producing nicotinamide riboside, which comprises a step of culturing a lactic acid bacterium belonging to the genus Fructobacillus to prepare a culture containing nicotinamide riboside.
  • Item 2. Item 2. The production method according to Item 1, wherein the culture is carried out in a medium containing no fructose.
  • Item 3. The lactic acid bacteria are Fluctobacillus dulionis RD011272 strain (deposit number NITE-P02764), Fluctobacillus tropaeoil RD012353 strain (deposit number NITE P-02765), Fluctobacillus group Item 2.
  • Item 1 or 2 which is selected from the above.
  • Item 3. The production method according to Item 1 or 2, wherein the lactic acid bacterium is the Fructobacillus tropaeoil RD012353 strain (deposit number NITE P-02765) and / or the Fructobacillus fructosus NBRC3516 strain.
  • Item 5. Contains a culture containing a nicotinamide riboside obtained from a lactic acid bacterium belonging to the genus Fructobacillus, a supernatant isolated from the culture, and / or a nicotinamide riboside isolated from the supernatant. , Nicotinamide riboside enhancer.
  • the lactic acid bacteria are Fluctobacillus dulionis RD011272 strain (deposit number NITE-P02764), Fluctobacillus tropaeoil RD012353 strain (deposit number NITE P-02765), Fluctobacillus group Item 5.
  • the strengthening agent according to Item 5 which is selected from the above.
  • Item 7. Item 5.
  • the strengthening agent according to Item 5, wherein the lactic acid bacterium is the Fructobacillus tropaeoil RD012353 strain (deposit number NITE P-02765) and / or the Fructobacillus fructosus NBRC3516 strain.
  • a food or drink, cosmetic or pharmaceutical product containing the nicotinamide riboside enhancer according to any one of Items 5 to 7.
  • Item 9. Fructobacillus dulionis RD011272 strain (deposit number NITE-P02764), Fructobacillus tropaeoil RD012353 strain (deposit number NITE P-02765), Fructobacillus tropaeu , A lactic acid bacterium that produces nicotinamide riboside.
  • Item 10 A method for producing nicotinamide mononucleotide and nicotinamide riboside, which comprises a step of culturing a lactic acid bacterium belonging to the genus Fructobacillus.
  • Item 10 The production method according to Item 10, wherein the culture is carried out in a medium containing fructose.
  • the lactic acid bacteria are Fluctobacillus dulionis RD011272 strain (deposit number NITE-P02764), Fluctobacillus tropaeoil RD012353 strain (deposit number NITE P-02765), Fluctobacillus group Item 10.
  • Item 13 Item 10.
  • Item 14 A culture containing nicotinamide mononucleotide and nicotinamide riboside obtained from a lactic acid bacterium belonging to the genus Fructobacillus, a cell isolated from the culture, a crushed product of the cell, and / or the crushed product.
  • the lactic acid bacteria are Fluctobacillus dulionis RD011272 strain (deposit number NITE-P02764), Fluctobacillus tropaeoil RD012353 strain (deposit number NITE P-02765), Fluctobacillus group Item 4.
  • the strengthening agent according to Item 14 which is more selected.
  • Item 17 A food or drink, cosmetic or pharmaceutical product containing the nicotinamide mononucleotide and the nicotinamide riboside enhancer according to any one of Items 14 to 16.
  • Fructobacillus dulionis RD011272 strain (deposit number NITE-P02764), Fructobacillus tropaeoil RD012353 strain (deposit number NITE P-02765), Fructobacillus strain Nucleotide , Nicotinamide mononucleotide and nicotinamide riboside-producing lactic acid bacteria.
  • Item 19 Nicotin of a culture containing nicotinamide riboside obtained from a lactic acid bacterium belonging to the genus Fructobacillus, a supernatant isolated from the culture, and / or a nicotinamide riboside isolated from the supernatant.
  • amide riboside enhancers Use for the production of amide riboside enhancers.
  • Item 20 A culture containing nicotinamide mononucleotide and nicotinamide riboside obtained from a lactic acid bacterium belonging to the genus Fructobacillus, a cell isolated from the culture, a crushed product of the cell, and / or the crushed product.
  • lactic acid bacteria belonging to the genus Fluctobacillus are provided as microorganisms having high production efficiency of nicotinamide riboside and microorganisms capable of producing both nicotinamide mononucleotide and nicotinamide riboside. .. Therefore, a culture containing nicotinamide riboside or a culture containing nicotinamide mononucleotide and nicotinamide riboside, respectively, obtained from a lactic acid bacterium belonging to the genus Fructobacillus enhances nicotinamide riboside. It can be used as a food additive or a food additive that enhances nicotinamide mononucleotide and nicotinamide riboside.
  • the method for producing nicotinamide riboside of the present invention is characterized by comprising a step of culturing a lactic acid bacterium belonging to the genus Fluctobacillus and preparing a culture containing nicotinamide riboside. And.
  • the method for producing the nicotinamide riboside of the present invention will be described in detail.
  • Lactic acid bacteria used in the production method of the present invention are not particularly limited as long as they are lactic acid bacteria belonging to the genus Fructobacillus. Lactic acid bacteria belonging to the genus Fructobacillus produce nicotinamide riboside.
  • Examples of preferred lactic acid bacteria include Fluctobacillus dulionis, Fluctobacillus tropaeoil, and Fluctobacillus fructosus, preferably Fluctobacillus fructos from Fluctobacillus fructos. (Fructobacillus tropaeoil) and Fructobacillus fructosus.
  • Examples of preferred lactic acid bacteria, Fructobacillus durionis RD011727 strain, Fructobacillus tropaeoil RD012353 strain, Fructobacillus tropaeoil RD012354 strain, Fructobacillus fructosus NBRC3516 strain, and Fructobacillus durionis NBRC113239 strain can be mentioned, more preferably, Fructobacillus durionis RD011727 strain, Fructobacillus tropaeoil RD012353 strain , Fluctobacillus tropaeoil RD012354 strain, and Fluctobacillus fructosus NBRC3516 strain.
  • preferred lactic acid bacteria include Fluctobacillus fructosus and Fluctobacillus tropaeoil RD012353 strains. More preferably, Fructobacillus tropaeoil RD012353 strain and Fructobacillus fluctosus NBRC3516 strain are mentioned, and particularly preferably, Fructobacillus tropaeoil RD012353 strain is mentioned.
  • the Fluctobacillus dulionis RD01172 strain was issued to the National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Depositary Center (NPMD) (Room 122, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan) on August 21, 2018. It has been deposited domestically as NITE-P02764.
  • NPMD National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Depositary Center
  • Fructobacillus tropaeoil RD012353 strain was sent to the Patent Microorganisms Depositary Center (NPMD) (Room 122, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan) on August 21, 2018. It has been deposited in Japan as NITE P-02765.
  • NPMD Patent Microorganisms Depositary Center
  • the Fluctobacillus RD012354 strain was sent to the Patent Microorganisms Depositary Center (NPMD) (Room 122, Kazusakamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan) on August 21, 2018. It has been deposited in Japan as NITE P-02766.
  • NPMD Patent Microorganisms Depositary Center
  • fructobacillus lactic acid bacteria strains one species may be used alone, or a plurality of species may be used in combination.
  • the medium used for culturing lactic acid bacteria may be appropriately selected.
  • the medium include those used for expansion culture (preculture medium) and those used for production culture (main culture medium).
  • the main culture medium can be prepared based on the medium used as the pre-culture medium and further containing additives. Regarding the properties of the medium, it is preferably a liquid medium, but it may be an agar medium.
  • the medium generally contains a nitrogen source, minerals and the like in addition to the carbon source.
  • Examples of carbon sources include sugars and sugar materials.
  • Examples of carbohydrates include sugars (monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides), polysaccharides, and sugar alcohols.
  • Examples of the sugar include lactose, sucrose, glucose, starch, xylitol, dextrose and the like.
  • the sugar material may be an organic composition containing sugar, for example, milk and its processed products (skimmed milk powder, whey, milk powder, condensed milk, etc.), soymilk and its processed products (soymilk hydrolyzate, etc.), Examples include foods such as grains, fruits and vegetables.
  • Milk includes those derived from any mammal such as cows, goats, sheep, buffaloes, camels, llamas, donkeys, yaks, horses and reindeer.
  • the sugar may be isolated or contained in the sugar material.
  • the fructose (sugar) may be in the form contained in the fruit (sugar material).
  • One of these carbon sources may be used alone, or a plurality of types may be used in combination. Among these carbon sources, glucose is preferably mentioned.
  • the medium does not contain fructose.
  • the concentration of the carbon source in the medium is not particularly limited and may be appropriately set according to the type of medium, the culture method, etc., but for example, 0.5 to 4 w / w%, preferably 1 to 3 w / w%. More preferably, 1.5 to 2.5 w / w% can be mentioned.
  • any inorganic nitrogen source or organic nitrogen source can be used.
  • proteins such as yeast extract (brewer's yeast, etc.), meat extract, casein; protein hydrolysates such as peptone (protease peptone, etc.), peptides such as peptides; containing ammonium salts (ammonium citrate, etc.), nitrates, etc.
  • nitrogen salts include nitrogen salts.
  • One of these nitrogen sources may be used alone, or a plurality of types may be used in combination.
  • the concentration of the nitrogen source in the medium is not particularly limited and may be appropriately set according to the type of medium, the culture method, etc., but in the case of protein, for example, 0.3 to 4 w / w%, preferably 0.5. 3 w / w%, more preferably 1-2 w / w%; in the case of peptides, for example 0.1-2 w / w%, preferably 0.3-1.8 w / w%, more preferably. 0.5 to 1.5 w / w%; in the case of nitrogen-containing salts, for example 0.03 to 1.5 w / w%, preferably 0.05 to 1 w / w%, more preferably 0.1 to 0.1 to 0.5 w / w% can be mentioned.
  • Examples of minerals include manganese (manganesium sulfate, etc.), zinc, iron, sodium (sodium acetate, etc.), potassium (dipotassium hydrogensulfate, potassium phosphate, etc.), magnesium (magnesium sulfate, etc.), calcium, phosphorus (phosphate, etc.). (Potassium, etc.), sulfur (manganese sulfate, potassium hydrogen sulfate, magnesium sulfate, etc.), trace elements, etc. can be mentioned. These minerals may be used alone or in combination of two or more. Among these minerals, manganese, sodium, magnesium and potassium are preferable.
  • the concentration of minerals in the medium is not particularly limited and may be appropriately set according to the type of medium, the culture method, etc., but in the case of manganese, for example, 0.001 to 0.01 w / w%, preferably 0. 003 to 0.008 w / w%; for sodium, for example 0.05 to 1.5 w / w%, preferably 0.1 to 1 w / w%; for magnesium, for example 0.001. To 0.02 w / w%, preferably 0.005 to 0.015 w / w%; in the case of potassium, for example 0.05 to 1 w / w%, preferably 0.1 to 0.5 w / w%. Can be mentioned.
  • the medium includes vitamins (vitamin B group, etc.), surfactants (nonionic surfactants (Tween, etc.), anionic surfactants (SDS, etc.), etc.), antibacterial agents (triclosan, etc.). , Antibiotics (monesin, etc.) and other components may be included. These other components may be used alone or in combination of two or more. Among these other components, a surfactant is preferable, and a nonionic surfactant is more preferable.
  • the concentration of other components in the medium is not particularly limited and may be appropriately set according to the type of other components, the type of medium, the culture method, etc., but when a surfactant is contained, the concentration of the surfactant Examples thereof include 0.01 to 0.5 w / w%, preferably 0.05 to 0.3 w / w%.
  • a medium component approved as a food additive is selected from the above components. ..
  • the method for culturing lactic acid bacteria of the genus Fructobacillus in the production method of the present invention is not particularly limited as long as the growth conditions of the lactic acid bacteria of the genus Fructobacillus can prepare a culture containing nicotinamide riboside.
  • the culture temperature may be an optimum temperature of the lactic acid bacterium belonging to the genus Bacillus to be cultured, for example, 26 to 40 ° C, preferably 27 to 38 ° C, more preferably 28 to 36 ° C, and further preferably 29 to 34. °C is mentioned.
  • the culturing time may be appropriately set according to the type of lactic acid bacterium belonging to the genus Bacillus to be actually cultivated, and examples thereof include 4 to 48 hours, preferably 8 to 36 hours, and more preferably 12 to 24 hours.
  • the culture solution may be stirred during the culture of lactic acid bacteria in order to produce more nicotinamide riboside.
  • the above-mentioned culture is carried out as a production culture (main culture) for a certain period of time, and before that, a small amount (for example, 1/6 to 1/4 of the main culture medium in terms of volume) is used.
  • Expansion culture can be performed (preculture) at.
  • the culture conditions for the pre-culture may be appropriately set according to the type of lactic acid bacteria of the genus Fructobacillus, and the above-mentioned conditions can be adopted.
  • the culture obtained in the pre-culture may be inoculated into the main culture medium so that the OD660 is, for example, 0.01 to 0.04, preferably 0.01 to 0.03. it can.
  • a culture containing the nicotinamide riboside obtained as described above is prepared.
  • the culture may contain other Fructovacillus lactic acid bacteria metabolites co-produced in the culture.
  • the culture containing the prepared nicotinamide riboside includes a form in which the prepared culture is used as it is, a form in which the supernatant is separated from the culture, and a form in which the supernatant is used as the nicotinamide riboside.
  • the separation method include a centrifugal separation method and a membrane filtration method.
  • the isolation method include various chromatography techniques such as ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, reverse phase chromatography, and high performance liquid chromatography, salting out, and solvent precipitation.
  • Nicotinamide riboside enhancer food and drink, cosmetics or pharmaceuticals
  • the nicotinamide riboside can be suitably used as a nicotinamide riboside enhancer to be blended as an additive to foods for the purpose of fortifying nicotinamide riboside or as an active ingredient of cosmetics or pharmaceuticals.
  • Nicotinamide riboside enhancer is a substance required for cells to utilize energy by nicotinamide riboside taken into the body by ingesting, taking or applying it in foods and drinks, cosmetics or pharmaceuticals. There are various useful effects by being converted to certain nicotinamide adenine dinucleotides.
  • the nicotinamide riboside enhancer may contain other metabolites of the genus Bacillus lactic acid bacteria in addition to nicotinamide riboside.
  • the nicotinamide riboside enhancer can be used as an enhancer of at least one of the other Fructobacillus lactic acid bacteria metabolites in addition to the nicotinamide riboside.
  • nicotinamide riboside By adding a nicotinamide riboside enhancer to food and drink, nicotinamide riboside can be efficiently ingested by eating and drinking. As a result, health effects (calorie restriction, anti-aging, health promotion, etc.) due to ingestion of nicotinamide riboside can be expected.
  • the food and drink includes not only food and drink for humans but also feed for animals.
  • Foods and drinks are not particularly limited, and for example, beverages are not particularly limited, but are, for example, fermented milk (drink yogurt, etc.), lactic acid bacteria beverages, dairy beverages (coffee milk, fruit milk, etc.), and tea-based beverages (green tea). , Tea and Karyu tea, etc.), Fruit / vegetable beverages (beverages containing fruit juices such as oranges, apples, grapes, vegetable juices such as tomatoes, carrots), alcoholic beverages (beer, sparkling liquor, wine, etc.), carbonated beverages, Beverages such as soft drinks and water-based beverages; and foods such as fermented milk (set type yogurt, soft yogurt, etc.), confectionery, instant foods, processed foods such as seasonings, etc. may be mentioned.
  • fermented milk lactic acid bacteria beverages
  • dairy beverages coffee milk, fruit milk, etc.
  • tea-based beverages green tea.
  • Tea and Karyu tea, etc. Fruit / vegetable beverages (beverages containing fruit juices such as oranges, apples, grapes, vegetable juice
  • Functional foods can also be mentioned as foods and drinks.
  • Functional foods mean foods having a certain degree of functionality with respect to the living body, for example, foods for specified health use (including conditional foods [foods for specified health use]), foods with functional health such as nutritionally functional foods, and functions. Examples include sex-labeled foods, special-purpose foods, nutritional supplements, health supplements, supplements (for example, various dosage forms such as tablets, coated tablets, sugar-coated tablets, capsules and liquids) and beauty foods (for example, diet foods). ..
  • the functional food may be a special-purpose food such as a food for the sick, a milk powder for pregnant women / lactating women, a prepared milk powder for infants, a food for the elderly, and a food for nursing care.
  • nicotinamide riboside enhancer into cosmetics, pharmacological effects (prevention of aging, etc.) by nicotinamide riboside can be expected by application.
  • cosmetics basic cosmetics such as lotion, milky lotion, cream, essence, gel, pack, sheet mask, lip cream; skin wash such as face wash, makeup remover (including cleansing agent), keratin remover, body shampoo, etc.
  • nicotinamide riboside enhancer by adding the nicotinamide riboside enhancer to a pharmaceutical product, nicotinamide riboside can be taken orally or transdermally as an active ingredient by taking or applying it.
  • the pharmacological effect of ingestion of nicotinamide riboside treatment or prevention of Cockayne syndrome and age-related diseases, treatment or prevention of oxidative damage to the skin, etc.
  • Examples of pharmaceuticals include oral preparations and external preparations (including quasi-drugs). Dosage forms of oral preparations include tablets, coated tablets, sugar-coated tablets, capsules and liquid preparations, and dosage forms of external preparations include liquid preparations (including lotions, sprays, aerosols, and emulsions) and foams. Examples include agents, ointments, creams, gels, patches and the like.
  • Mammals are preferably applied to foods and drinks, cosmetics or pharmaceuticals containing a nicotine amide riboside enhancer, for example, primates such as humans, chimpanzees and gorillas; dogs, cats, rabbits, cows, horses, etc. Pets or livestock such as pigs, goats, sheep and donkeys; experimental animals such as mice, rats, hamsters and monkeys.
  • nicotinamide is cultivated under conditions under which a culture containing nicotinamide mononucleotide and nicotinamide riboside can be prepared under the growth conditions of fructobacillus lactic acid bacteria. Co-produces amide mononucleotide and nicotinamide riboside. This prepares a culture containing nicotinamide mononucleotide and nicotinamide riboside.
  • lactic acid bacteria used in the method for producing nicotinamide mononucleotide and nicotinamide riboside are as described in "1. Method for producing nicotinamide riboside" above.
  • examples of preferable lactic acid bacteria include Fluctobacillus dulionis, Fluctobacillus tropaeoil, and Fluctobacillus fructo.
  • Examples of more preferable lactic acid bacteria include Fluctobacillus dulionis RD011272 strain, Fluctobacillus tropaeoil RD012353 strain, Fluctobacillus tropaeoil RD012354 strain, Fluctobacillus strain RD012354 strain, Fluctobacillus strain RD012354, and Fluctobacillus
  • the amount of nicotinamide mononucleotide is increased (that is, the ratio of nicotinamide mononucleotide to nicotinamide riboside is higher).
  • the lactic acid bacteria are preferably Fluctobacillus dulionis, Fluctobacillus fructosus, and Fluctobacillus trapaeoil RD012353. Dulionis), Fructobacillus fructosus, and more preferably Fluctobacillus dulionis RD01172, and Fructobacillus fructosus NBRC3516 strain.
  • the lactic acid bacterium is preferably fructobacillus tropae oil ( Fructobacillus tropaeoil), preferably the Fructobacillus tropaeoil RD012353 strain.
  • the medium used in the method for producing nicotinamide mononucleotide and nicotinamide riboside is as described in "1. Method for producing nicotinamide riboside" above, except that it is preferable that fructose is further contained as a carbon source. Is.
  • the concentration of fructose in the medium is not particularly limited and may be appropriately set according to the type of medium, the culture method, etc., but for example, 0.5 to 4 w / w%, preferably 1 to 3.5 w / w%. , More preferably 1.5 to 2.5 w / w%.
  • lactic acid bacteria belonging to the genus Fructose Bacillus accumulate nicotinamide riboside and nicotinamide riboside in the cells.
  • the culture method and the like used in the method for producing nicotinamide mononucleotide and nicotinamide riboside are also as described in "1. Method for producing nicotinamide riboside" above. This produces both nicotinamide mononucleotides and nicotinamide ribosides.
  • the use form of the culture containing both the prepared nicotinamide mononucleotide and nicotinamide riboside the form of using the prepared culture as it is, the form of separating the bacterial cells from the culture, and the bacterium. Examples thereof include a form in which the body is crushed and used, and a form in which nicotinamide riboside is isolated and used.
  • Examples of the separation method include a centrifugal separation method and a membrane filtration method.
  • Examples of the cell crushing method include a bead crushing method.
  • Examples of the isolation method include various chromatography techniques such as ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, reverse phase chromatography, and high performance liquid chromatography, salting out, and solvent precipitation.
  • Nicotinamide mononucleotide and nicotinamide riboside enhancer food and drink, cosmetics or pharmaceuticals
  • nicotinamide mononucleotide and a nicotinamide riboside enhancer can be blended as an additive to the above-mentioned food or as an active ingredient of cosmetics or pharmaceuticals.
  • Nicotinamide mononucleotide and nicotinamide riboside enhancer are added to foods and drinks, cosmetics or pharmaceuticals, and when ingested, taken or applied, nicotinamide mononucleotide and nicotinamide riboside taken into the body are released into cells.
  • Various useful effects can be achieved by converting to nicotinamide adenine dinucleotide, which is a substance necessary for utilizing energy.
  • the nicotinamide mononucleotide and nicotinamide riboside enhancer may contain other lactic acid bacterium metabolites of the genus Fructobacillus in addition to nicotinamide mononucleotide and nicotinamide riboside.
  • the nicotinamide mononucleotide and the nicotinamide riboside enhancer can be used as the enhancer of the other Fructovacillus lactic acid bacterium metabolite in addition to the nicotinamide mononucleotide and the nicotinamide riboside.
  • nicotinamide mononucleotide and nicotinamide riboside By blending nicotinamide mononucleotide and nicotinamide riboside enhancer into food and drink, nicotinamide mononucleotide and nicotinamide riboside can be efficiently ingested by eating and drinking.
  • nicotinamide mononucleotide and nicotinamide riboside enhancer are as described in "2. Nicotinamide riboside enhancer; food and drink, cosmetics or pharmaceuticals" above.
  • the pharmacological effect of nicotinamide riboside prevention of aging, etc.
  • the pharmacological effect of nicotinamide mononucleotide intracellular nicotinamide
  • Increased mononucleotide, prevention of aging, etc. can be expected.
  • Cosmetics containing nicotinamide mononucleotide and nicotinamide riboside enhancer are as described in "2. Nicotinamide riboside enhancer; food and drink, cosmetics or pharmaceuticals" above.
  • the nicotinamide mononucleotide and the nicotinamide riboside enhancer of the food in the pharmaceutical product can be taken orally or transdermally as active ingredients by taking or applying. ..
  • the pharmacological effect of ingestion of nicotinamide mononucleotide treatment or prevention of age-related diseases, etc.
  • the pharmacological effect of ingestion of nicotinamide riboside treatment or prevention of cocaine syndrome and age-related diseases, etc., and skin oxidation
  • Treatment or prevention of injury, etc. can be expected.
  • the dosage form and application target of the drug containing the nicotinamide mononucleotide and the nicotinamide riboside enhancer are as described in "2. Nicotinamide riboside enhancer; food and drink, cosmetics or pharmaceuticals" above.
  • Example 1 Production of nicotine amide riboside using lactic acid bacteria of the genus Fructobacillus Fluctobacillus cultures RD011272 strain (deposit number NITE-P02764), Fluctobacillus tropaeoil RD012353 strain (deposit number NITE P-0265 P-02766) and Fluctobacillus fructosus NBRC3516 strains were independently inoculated into 3 ml of MRS medium (preculture medium) manufactured by Difco, and expanded and cultured at 30 ° C. for 24 hours. The obtained culture broth was inoculated into 15 ml of MRS medium (main culture medium) so that the OD660 was 0.02, and produced and cultured at 30 ° C.
  • MRS medium preculture medium
  • main culture medium main culture medium
  • Nicotinamide mononucleotide (NMN) and nicotinamide riboside (NR) were quantified for each of the recovered culture supernatant and the recovered cells.
  • nicotinamide mononucleotide and nicotinamide riboside are subjected to fluorescent derivatization treatment, analyzed under HPLC conditions described later, and the amount of nicotinamide mononucleotide and nicotinamide riboside produced in the supernatant (culture). The amount of production per liquid; mg / L) was measured. The results are shown in Table 1. In Table 1, n. d. Indicates that it was not detected.
  • the recovered cells were washed with 10 ml of a 0.85 w / w% KCl aqueous solution. The washed cells were subjected to centrifugation again and the cells were collected. The recovered cells were suspended in 0.5 ml of 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0), an equal amount of 0.1 mm zirconia beads were added, and then the cells were crushed with a bead crusher. The crushed cells were separated by centrifugation, and the supernatant (crushed cell extract) was collected.
  • NR nicotinamide riboside
  • Example 2 Production of nicotinamide mononucleotide and nicotinamide riboside using lactic acid bacteria of the genus Fructobacillus Culturing and culturing in the same manner as in Example 1 except that 2 w / w% of fructose was added to the main culture medium. The supernatant and cells were collected, and nicotinamide mononucleotide and nicotinamide riboside were quantified. The results are shown in Table 2.
  • nicotinamide mononucleotide (NMN) and nicotinamide mononucleotide (NMN) and nicotinamide riboside were both nicotinamide mononucleotide (NMN) and nicotinamide riboside from the Fluctobacillus tropaeoil RD012353 strain and the Fluctobacillus tropaeoil RD012354 strain, particularly from the Fluctobacillus tropaeoil RD012353 strain.
  • nicotinamide mononucleotide (NMN) and nicotinamide riboside (NR) are both produced together with nicotinamide mononucleotide (NMN) and nicotinamide riboside (NR). It was confirmed that it was produced so that the ratio of NMN) was particularly high.

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Abstract

本発明の目的は、ニコチンアミドリボシドの産生効率が高い微生物、並びにニコチンリボモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの産生効率の両方を産生できる微生物を提供することである。フルクトバシラス属に属する乳酸菌を培養することによって、ニコチンリボモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドを製造することができる。

Description

ニコチンアミドリボシドを産生する乳酸菌、並びにニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドを産生する乳酸菌
　本発明は、ニコチンアミドリボシドを産生する乳酸菌、並びにニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドを産生する乳酸菌に関する。
　近年、老化および老化関連疾患は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ　ａｄｅｎｉｎｅ　ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ＮＡＤ+）量低下及びＮＡＤ+依存性脱アセチル化酵素サーチュインの活性低下と密接な関わりを持つことが示されている（非特許文献１、２）。また、サーチュインの活性化は、カロリー制限における寿命延長又は健康増進に関わる効果の多くを説明すると考えられている（非特許文献２）。
　ＮＡＤ+は、古くから酸化還元反応の補酵素として知られている一方、近年では、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ、ＣＤ３８／ＣＤ１５７、サーチュインの基質等としての役割も知られるようになった（非特許文献１）。特に、サーチュインによるＮＡＤ+からニコチンアミドへの分解反応は、それと共役するサーチュインによるリシン残基脱アセチル化反応を促進することで、健康、長寿に関わるさまざまな生命現象に関与している（非特許文献１、２）。老化に伴いＮＡＤ+量およびサーチュイン活性は低下する一方で、ニコチンアミドからＮＡＤ+を再合成する律速酵素ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）の酵素反応産物、具体的には、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ＮＭＮ）及びニコチンアミドリボシド（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ　ｒｉｂｏｓｉｄｅ：ＮＲ）といったＮＡＤ+中間代謝産物の補充は、サーチュインを効果的に再活性化する（非特許文献１）ことが知られており、更に、サーチュインの活性化を介して幅広い抗酸化作用を発現することが知られている。このため、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドは、カロリー制限における寿命延長及び健康増進等に関わる多くの生体現象に寄与することが知られている。
　従って、ニコチンアミドモノヌクレオチド又はニコチンアミドリボシドを効率的に生産する方法が望まれている。これまで、トルラ酵母等の食経験のある酵母からニコチンアミドモノヌクレオチドが取得できること（特許文献１）、及び、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）、及びＲ．オイトロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）からなる群から選択される細菌の遺伝修飾細菌からニコチンアミドリボシドを取得できること（特許文献２）が報告されている。
国際公開第２０１７／２０００５０号 国際公開第２０１７／０８３８５８号
Imai, S. & Guarente, L. (2014) Trends Cell Biol., 24, 464-471. Guarente, L. (2013) Genes Dev., 27, 2072-2085.
　ニコチンアミドモノヌクレオチド又はニコチンアミドリボシドを産生するこれまでの微生物学的方法では、依然として生産効率に改善の余地がある。
　そこで、本発明は、ニコチンアミドリボシドの産生効率が高い微生物、並びにニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの両方を産生可能な微生物を提供することを目的とする。
　本発明者は鋭意検討の結果、特定の属に属する乳酸菌が、ニコチンアミドリボシドを効率よく産生し、更に、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの両方を生産できることを見出した。本発明は、この知見に基づいてさらに検討を重ねることにより完成したものである。
　即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．　フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌の培養を行い、ニコチンアミドリボシドを含む培養物を調製する工程を含む、ニコチンアミドリボシドの製造方法。
項２．　前記培養を、フルクトースを含まない培地にて行う、項１に記載の製造方法。
項３．　前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ－Ｐ０２７６４）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２７６５）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５４株（寄託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２７６６）、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株からなる群より選ばれる、項１又は２に記載の製造方法。
項４．　前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２７６５）、及び／又はＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株である、項１又は２に記載の製造方法。
項５．　フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌から得られるニコチンアミドリボシドを含む培養物、前記培養物から分離された上清、及び／又は前記上清から単離されたニコチンアミドリボシドを含有する、ニコチンアミドリボシド強化剤。
項６．　前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ－Ｐ０２７６４）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２７６５）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５４株（寄託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２７６６）、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株からなる群より選択される、項５に記載の強化剤。
項７．　前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２７６５）、及び／又はＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株である、項５に記載の強化剤。
項８．　項５～７のいずれかに記載のニコチンアミドリボシド強化剤を含む飲食品、化粧品又は医薬品。
項９．　Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ－Ｐ０２７６４）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２７６５）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５４株（寄託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２７６６）、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株からなる群より選択される、ニコチンアミドリボシドを産生する乳酸菌。
項１０．　フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌の培養を行う工程を含む、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの製造方法。
項１１．　前記培養を、フルクトースを含む培地にて行う、項１０に記載の製造方法。
項１２．　前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ－Ｐ０２７６４）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２７６５）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５４株（寄託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２７６６）、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株からなる群より選ばれる、項１０又は１１に記載の製造方法。
項１３．　前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２７６５）、及び／又はＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株である、項１０又は１１に記載の製造方法。
項１４．　フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌から得られるニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドを含む培養物、前記培養物から分離された菌体、前記菌体の破砕物、及び／又は前記破砕物から単離されたニコチンアミドリボシド及びニコチンアミドリボシドを含有する、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシド強化剤。
項１５．　前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ－Ｐ０２７６４）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２７６５）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５４株（寄託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２７６６）、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株からなる群より選択される、項１４に記載の強化剤。
項１６．　前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ－Ｐ０２７６４）、及び／又はＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株である、項１４に記載の強化剤。
項１７．　項１４～１６のいずれかに記載のニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシド強化剤を含む飲食品、化粧品又は医薬品。
項１８．　Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ－Ｐ０２７６４）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２７６５）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５４株（寄託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２７６６）、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株からなる群より選択される、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドを産生する乳酸菌。
項１９．フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌から得られるニコチンアミドリボシドを含む培養物、前記培養物から分離された上清、及び／又は前記上清から単離されたニコチンアミドリボシドの、ニコチンアミドリボシド強化剤の製造のための使用。
項２０．フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌から得られるニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドを含む培養物、前記培養物から分離された菌体、前記菌体の破砕物、及び／又は前記破砕物から単離されたニコチンアミドリボシド及びニコチンアミドリボシドの、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシド強化剤の製造のための使用。
　本発明によれば、ニコチンアミドリボシドの産生効率が高い微生物、及びニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの両方を産生可能な微生物として、フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌が提供される。従って、フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌から得られる、ニコチンアミドリボシドを含む培養物、又はニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドを含む培養物は、それぞれ、ニコチンアミドリボシドを強化する食品添加物又はニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドを強化する食品添加物に用いることができる。
１．ニコチンアミドリボシドの製造方法
　本発明のニコチンアミドリボシドの製造方法は、フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌を培養し、ニコチンアミドリボシドを含む培養物を調製する工程を含むことを特徴とする。以下、本発明のニコチンアミドリボシドの製造方法について詳述する。
乳酸菌
　本発明の製造方法で用いられる乳酸菌は、フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌であれば特に限定されない。フルクトバシラス属に属する乳酸菌は、ニコチンアミドリボシドを産生する。
　好ましい乳酸菌の例としては、フルコトバシラス・ドゥリオニス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ）、フルクトバシラス・トロパエオイル（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ）、及びフルクトバシラス・フルクトサス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ）が挙げられ、より好ましくは、フルクトバシラス・トロパエオイル（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ）、及びフルクトバシラス・フルクトサス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ）が挙げられる。
　より好ましい乳酸菌の例としては、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＲＤ０１１７２７株、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５４株、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ　ＮＢＲＣ３５１６株、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＮＢＲＣ１１３２３９株が挙げられ、更に好ましくは、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＲＤ０１１７２７株、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５４株、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ　ＮＢＲＣ３５１６株が挙げられる。
　本発明のニコチンアミドリボシドの製造方法においては、ニコチンアミドリボシドをより一層多く産生する観点から、乳酸菌として、好ましくは、フルクトバシラス・フルクトサス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ）及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株が挙げられ、より好ましくは、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ　ＮＢＲＣ３５１６株が挙げられ、特に好ましくは、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株が挙げられる。
　Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＲＤ０１１７２７株は、独立行政法人　製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に、２０１８年８月２１日付で受託番号ＮＩＴＥ－Ｐ０２７６４として国内寄託されている。
　Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株は、独立行政法人　製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に、２０１８年８月２１日付で受託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２７６５として国内寄託されている。
　Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５４株は、独立行政法人　製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に、２０１８年８月２１日付で受託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２７６６として国内寄託されている。
　これらのフルクトバシラス菌乳酸菌株は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。
培地
　フルクトバシラス菌乳酸菌の培養に用いられる培地は適宜選択されればよい。培地としては、拡大培養に用いられるもの（前培養培地）、及び生産培養に用いられるもの（本培養培地）が挙げられる。本培養培地は、前培養培地として用いられる培地を基本として、更に添加物を含有させて調製することができる。培地の性状については、好ましくは液体培地であるが、寒天培地であってもよい。培地は、炭素源の他、一般的には窒素源、ミネラル等を含む。
　炭素源としては、糖質及び糖質材料が挙げられる。糖質としては、糖類（単糖、二糖、オリゴ糖）、多糖類、及び糖アルコールが挙げられる。糖質としては、乳糖、ショ糖、グルコース、デンプン、キシリトール、デキストロース等が挙げられる。糖質材料は、糖質を含む有機組成物であればよく、例えば、乳及びその加工品（脱脂粉乳、ホエイ、ミルクパウダー、練乳等）、豆乳及びその加工品（豆乳加水分解物等）、穀類、果実、野菜等の食品が挙げられる。乳としては、ウシ、ヤギ、ヒツジ、水牛、ラクダ、ラマ、ロバ、ヤク、ウマ、トナカイ等の任意の哺乳動物に由来するものが挙げられる。なお糖質は、単離されたものであってもよいし、糖質材料に含まれているものであってもよい。例えば、フルクトース（糖質）は、果実（糖質材料）に含まれる形態のものを用いてもよい。これらの炭素源は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。これらの炭素源の中でも、好ましくはグルコースが挙げられる。本発明のニコチンアミドリボシドの製造方法においては、培地にはフルクトースを含まないことが好ましい。
　培地中の炭素源の濃度については特に限定されず、培地の種類や培養方式等に応じて適宜設定すればよいが、例えば０．５～４ｗ／ｗ％、好ましくは１～３ｗ／ｗ％、より好ましくは１．５～２．５ｗ／ｗ％が挙げられる。
　窒素源としては、任意の無機窒素源又は有機窒素源を使用することができる。例えば、酵母エキス（ビール酵母等）、肉エキス、カゼイン等のタンパク質；ペプトン（プロテアーゼペプトン等）等のタンパク質加水分解物、ペプチド等のペプチド類；アンモニウム塩（クエン酸アンモニウム等）、硝酸塩等の含窒素塩等が挙げられる。これらの窒素源は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。
　培地中の窒素源の濃度については特に限定されず、培地の種類や培養方式等に応じて適宜設定すればよいが、タンパク質の場合、例えば０．３～４ｗ／ｗ％、好ましくは０．５～３ｗ／ｗ％、より好ましくは１～２ｗ／ｗ％が挙げられ；ペプチド類の場合、例えば０．１～２ｗ／ｗ％、好ましくは０．３～１．８ｗ／ｗ％、より好ましくは０．５～１．５ｗ／ｗ％が挙げられ；含窒素塩の場合、例えば０．０３～１．５ｗ／ｗ％、好ましくは０．０５～１ｗ／ｗ％、より好ましくは０．１～０．５ｗ／ｗ％が挙げられる。
　ミネラルとしては、例えば、マンガン（硫酸マンガン等）、亜鉛、鉄、ナトリウム（酢酸ナトリウム等）、カリウム（硫酸水素二カリウム、リン酸カリウム等）、マグネシウム（硫酸マグネシウム等）、カルシウム、リン（リン酸カリウム等）、硫黄（硫酸マンガン、硫酸水素カリウム、硫酸マグネシウム等）、微量元素等が挙げられる。これらのミネラルは、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。これらのミネラルの中でも、好ましくは、マンガン、ナトリウム、マグネシウム、カリウムが挙げられる。
　培地中のミネラルの濃度については特に限定されず、培地の種類や培養方式等に応じて適宜設定すればよいが、マンガンの場合、例えば０．００１～０．０１ｗ／ｗ％、好ましくは０．００３～０．００８ｗ／ｗ％が挙げられ；ナトリウムの場合、例えば０．０５～１．５ｗ／ｗ％、好ましくは０．１～１ｗ／ｗ％が挙げられ；マグネシウムの場合、例えば０．００１～０．０２ｗ／ｗ％、好ましくは０．００５～０．０１５ｗ／ｗ％が挙げられ；カリウムの場合、例えば０．０５～１ｗ／ｗ％、好ましくは０．１～０．５ｗ／ｗ％が挙げられる。
　培地は、上記成分以外に、ビタミン（ビタミンＢ群など）、界面活性剤（非イオン性界面活剤（Ｔｗｅｅｎ等）、陰イオン性界面活性剤（ＳＤＳ等）等）、抗菌剤（トリクロサン等）、抗生物質（モネシン等）等の他の成分を含んでもよい。これらの他の成分は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。これらの他の成分の中でも、好ましくは界面活性剤、より好ましくは非イオン性界面活性剤が挙げられる。
　培地中の他の成分の濃度については特に限定されず、他の成分の種類、培地の種類、培養方式等に応じて適宜設定すればよいが、界面活性剤を含む場合、界面活性剤の濃度として、例えば０．０１～０．５ｗ／ｗ％、好ましくは０．０５～０．３ｗ／ｗ％が挙げられる。
　また、本発明の製造方法で得られた培養物を食品へのニコチンアミドリボシド強化剤として用いる場合、培地成分は、上記の成分のうち、食品添加物として認可されている成分が選択される。
培養方法
　本発明の製造方法におけるフルクトバシラス属乳酸菌の培養方法としては、フルクトバシラス属乳酸菌の生育条件下、ニコチンアミドリボシドを含む培養物を調製できる条件下であれば特に限定されない。
　培養温度としては、培養対象となるフルクトバシラス属乳酸菌の至適温度であればよく、例えば２６～４０℃、好ましくは２７～３８℃、より好ましくは２８～３６℃、更に好ましくは２９～３４℃が挙げられる。培養時間としては、実際に培養するフルクトバシラス属乳酸菌の種類等に合せて適宜設定すればよく、例えば４～４８時間、好ましくは８～３６時間、より好ましくは１２～２４時間が挙げられる。
　本発明の製造方法においては、フルクトバシラス属乳酸菌の培養中に培養液を攪拌しなくてもよく、そのような条件であっても、ニコチンアミドリボシドを高産生できる。なお、本発明の製造方法では、ニコチンアミドリボシドをより高産生するために、乳酸菌の培養中に培養液を攪拌しても構わない。
　本発明の製造方法においては、好ましくは、上述の培養を一定時間生産培養（本培養）として行い、その前に、少量（例えば体積比で本培養培地の１／６～１／４）の培地で拡大培養を（前培養）行うことができる。前培養の培養条件は、フルクトバシラス属乳酸菌の種類などに合せて適宜設定すればよく、上述の条件を採用することができる。また、本培養においては、前培養で得られた培養物を、ＯＤ６６０が例えば０．０１～０．０４、好ましくは０．０１～０．０３となるように本培養培地に植菌することができる。
　以上のようにして得られるニコチンアミドリボシドを含む培養物が調製される。この培養物には、培養で共産生された他のフルクトバシラス属乳酸菌代謝物が含まれていてもよい。
　調製されたニコチンアミドリボシドを含む培養物の使用形態としては、調製された培養物そのままで使用する形態、当該培養物から上清を分離して使用する形態、及び上清からニコチンアミドリボシドを単離して使用する形態が挙げられる。分離方法としては、例えば遠心分離法、膜ろ過法等が挙げられる。単離法としては、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー技術、塩析、溶媒沈殿等が挙げられる。
２．ニコチンアミドリボシド強化剤；飲食品、化粧品又は医薬品
　以上のようにして得られたニコチンアミドリボシドを含む培養物、当該培養物から分離された上清、及び／又は当該上清から単離されたニコチンアミドリボシドは、ニコチンアミドリボシドの強化を目的とした食品への添加物若しくは化粧品又は医薬品の有効成分として配合される、ニコチンアミドリボシド強化剤として、好適に用いることができる。
　ニコチンアミドリボシド強化剤は、飲食品、化粧品又は医薬品に配合して摂取、服用又は適用させることで、体内に取り込まれたニコチンアミドリボシドが、細胞がエネルギーを利用するために必要な物質であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに変換されることによる様々な有用な効果ができる。
　ニコチンアミドリボシド強化剤は、ニコチンアミドリボシド以外に、他のフルクトバシラス属乳酸菌代謝物が含まれていてよい。この場合、ニコチンアミドリボシド強化剤は、ニコチンアミドリボシドに加えて、当該他のフルクトバシラス属乳酸菌代謝物の少なくともいずれかの強化剤としても用いることができる。
　ニコチンアミドリボシド強化剤を飲食品に配合することで、飲食によってニコチンアミドリボシドを効率的に摂取することができる。これによって、ニコチンアミドリボシド摂取による健康効果（カロリー制限、アンチエイジング、健康増進等）を期待することができる。なお、飲食品には、ヒト用の飲食品だけでなく、動物用の飼料も含む。
　飲食品としては、特に限定されないが、例えば、飲料としては、特に限定されないが、例えば、発酵乳（ドリンクヨーグルト等）、乳酸菌飲料、乳飲料（コーヒー牛乳、フルーツ牛乳等）、茶系飲料（緑茶、紅茶及び烏龍茶等）、果物・野菜系飲料（オレンジ、りんご、ぶどう等の果汁、トマト、ニンジン等の野菜汁を含む飲料）、アルコール性飲料（ビール、発泡酒、ワイン等）、炭酸飲料、清涼飲料、水ベースの飲料等の飲料；及び発酵乳（セットタイプヨーグルト、ソフトヨーグルト等）、菓子、インスタント食品、調味料等の加工食品等の食品が挙げられる。
　また、飲食品としては、機能性食品も挙げられる。機能性食品は、生体に対して一定の機能性を有する食品を意味し、例えば、特定保健用食品（条件付きトクホ［特定保健用食品］を含む）及び栄養機能食品等の保健機能食品、機能性表示食品、特別用途食品、栄養補助食品、健康補助食品、サプリメント（例えば、錠剤、被覆錠、糖衣錠、カプセル及び液剤等の各種剤形のもの）及び美容食品（例えばダイエット食品）等が挙げられる。更に、機能性食品は、病者用食品、妊産婦・授乳婦用粉乳、乳児用調製粉乳、高齢者用食品、介護用食品等の特別用途食品であってもよい。
　また、当該ニコチンアミドリボシド強化剤を化粧品に配合することで、適用によって、ニコチンアミドリボシドによる薬理効果（老化予防等）を期待できる。
　化粧品としては、化粧水、乳液、クリーム、エッセンス、ゲル、パック、シートマスク、リップクリーム等の基礎化粧料；洗顔料、メイク落とし（クレンジング剤を含む）、角質除去剤、ボディーシャンプーなどの皮膚洗浄料；サンスクリーン剤、ボディー用ジェル、ボディー用マッサージ剤、抑汗剤、防臭剤、除毛剤、入浴剤等のボディーケア化粧料；ファンデーション、おしろい、口紅、頬紅、アイシャドー、アイライナー、マスカラ、眉墨等のメークアップ化粧料；マネキュア、ネイルリムーバー等の爪用化粧料；ヘアスタイリング剤、シャンプー、コンディショナー、リンス、育毛剤等の毛髪化粧料；液体歯磨、練歯磨、洗口液、マウススプレー等の口腔用化粧料等が挙げられる。
　更に、当該ニコチンアミドリボシド強化剤を医薬品に配合することで、服用又は適用によってニコチンアミドリボシドを有効成分として経口又は経皮摂取することができる。これによって、ニコチンアミドリボシド摂取による薬理効果（コケイン症候群及び加齢関連疾病等の治療又は予防、並びに皮膚の酸化損傷の治療又は予防等）を期待できる。
　医薬品としては、経口剤及び外用剤（医薬部外品を含む）が挙げられる。経口剤の剤形としては、錠剤、被覆錠、糖衣錠、カプセル及び液剤等が挙げられ、外用剤の剤型としては、液剤（ローション剤、スプレー剤、エアゾール剤、及び乳液剤を含む）、フォーム剤、軟膏剤、クリーム剤、ジェル剤、貼付剤等が挙げられる。
　ニコチンアミドリボシド強化剤を含む飲食品、化粧品又は医薬品の適用対象としては、好ましくは哺乳動物が挙げられ、例えば、ヒト、チンパンジー、ゴリラ等の霊長類；イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ロバ等のペット又は家畜；マウス、ラット、ハムスター、サル等の実験動物が挙げられる。
３．ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの製造方法
　フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌は、ニコチンアミドリボシドと共にニコチンアミドモノヌクレオチドも産生する。従って、本発明は、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの製造方法も提供する。
　ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの製造方法では、フルクトバシラス属乳酸菌の生育条件下、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドを含む培養物を調製できる条件下で培養を行うことで、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドを共産生する。これによって、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドを含む培養物が調製される。
　ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの製造方法において用いられる乳酸菌は、上記「１．ニコチンアミドリボシドの製造方法」において記載した通りである。具体的には、好ましい乳酸菌の例としては、フルコトバシラス・ドゥリオニス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ）、フルクトバシラス・トロパエオイル（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ）、及びフルクトバシラス・フルクトサス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ）が挙げられる。
　より好ましい乳酸菌の例としては、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＲＤ０１１７２７株、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５４株、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ　ＮＢＲＣ３５１６株、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＮＢＲＣ１１３２３９株が挙げられる。
　ただし、本発明のニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの製造方法においては、ニコチンアミドモノヌクレオチドをより多く（つまり、ニコチンアミドリボシドに対してニコチンアミドモノヌクレオチドの比率がより高くなるように）産生する観点から、乳酸菌として、好ましくはフルコトバシラス・ドゥリオニス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ）、及びフルクトバシラス・フルクトサス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ）、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株が挙げられ、より好ましくはフルコトバシラス・ドゥリオニス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ）、フルクトバシラス・フルクトサス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ）が挙げられ、さらに好ましくはＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＲＤ０１１７２７株、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓＮＢＲＣ３５１６株が挙げられる。
　また、本発明のニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの製造方法においては、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの両方をバランス良く産生する観点から、乳酸菌として、好ましくはフルクトバシラス・トロパエオイル（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ）が挙げられ、好ましくはＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株が挙げられる。
　ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの製造方法において用いられる培地は、炭素源として、更にフルクトースを含むことが好ましいことを除いて、上記「１．ニコチンアミドリボシドの製造方法」において記載した通りである。培地中のフルクトースの濃度については特に限定されず、培地の種類や培養方式等に応じて適宜設定すればよいが、例えば０．５～４ｗ／ｗ％、好ましくは１～３．５ｗ／ｗ％、より好ましくは１．５～２．５ｗ／ｗ％が挙げられる。培地中にフルクトースを含むことで、フルクトバシラス属に属する乳酸菌は、ニコチンアミドリボシド及びニコチンアミドリボシドを菌体内に蓄積する。
　ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの製造方法において用いられる培養方法等についても、上記「１．ニコチンアミドリボシドの製造方法」において記載した通りである。これによって、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの両方を産生する。調製されたニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの両方を含む培養物の使用形態としては、調製された培養物そのままで使用する形態、当該培養物から菌体を分離して使用する形態、菌体を破砕して使用する形態、及びニコチンアミドリボシドを単離して使用する形態が挙げられる。分離方法としては、例えば遠心分離法、膜ろ過法等が挙げられる。菌体破砕法としては、ビーズ破砕法等が挙げられる。単離法としては、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー技術、塩析、溶媒沈殿等が挙げられる。
４．ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシド強化剤；飲食品、化粧品又は医薬品
　ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの製造方法により得られるニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドを含む培養物、当該培養物から分離された菌体、当該菌体の破砕物、及び／又は当該破砕物から単離されたニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドは、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの強化を目的とした食品への添加物若しくは化粧品又は医薬品の有効成分として配合される、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシド強化剤として、好適に用いることができる。
　ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシド強化剤は、飲食品、化粧品又は医薬品に配合して摂取、服用又は適用させることで、体内に取り込まれたニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドが、細胞がエネルギーを利用するために必要な物質であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに変換されることによる様々な有用な効果ができる。
　ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシド強化剤は、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシド以外に、他のフルクトバシラス属乳酸菌代謝物が含まれていてよい。この場合、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシド強化剤は、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドに加えて、当該他のフルクトバシラス属乳酸菌代謝物の強化剤としても用いることができる。
　ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシド強化剤を飲食品に配合することで、飲食によってニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドを効率的に摂取することができる。
　ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシド強化剤が配合される飲食品については、上記「２．ニコチンアミドリボシド強化剤；飲食品、化粧品又は医薬品」に記載の通りである。
　また、当該ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシド強化剤を化粧品に配合することで、適用によって、ニコチンアミドリボシドによる薬理効果（老化予防等）及びニコチンアミドモノヌクレオチドによる薬理効果（細胞内ニコチンアミドモノヌクレオチド増加、老化予防等）を期待できる。
　ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシド強化剤が配合される化粧品については、上記「２．ニコチンアミドリボシド強化剤；飲食品、化粧品又は医薬品」に記載の通りである。
　更に、当該食品のニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシド強化剤を医薬品に配合することで、服用又は適用によってニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドを有効成分として経口又は経皮摂取することができる。これによって、ニコチンアミドモノヌクレオチド摂取による薬理効果（加齢関連疾病等の治療又は予防等）及びニコチンアミドリボシド摂取による薬理効果（コケイン症候群及び加齢関連疾病等の治療又は予防、並びに皮膚の酸化損傷の治療又は予防等）を期待できる。
　ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシド強化剤が配合される医薬品の剤型及び適用対象については、上記「２．ニコチンアミドリボシド強化剤；飲食品、化粧品又は医薬品」に記載の通りである。
　以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１　フルクトバシラス属乳酸菌を用いたニコチンアミドリボシドの産生
　Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ－Ｐ０２７６４）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２７６５）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５４株（寄託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２７６６）、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株を、それぞれ独立に、Ｄｉｆｃｏ社製のＭＲＳ培地（前培養培地）３ｍｌに植菌し、３０℃で２４時間、静置で拡大培養した。得られた培養液をＯＤ６６０が０.０２となるように、ＭＲＳ培地（本培養培地）１５ｍｌに植菌し、３０℃で１２時間、静置で生産培養した。得られた培養液を遠心分離に供して上清と菌体とをそれぞれ回収した。回収した培養上清及び回収した菌体それぞれについて、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）及びニコチンアミドリボシド（ＮＲ）の定量を行った。
（ＭＲＳ培地組成）
　　２ｗ／ｗ％　グルコース
　　１ｗ／ｗ％　プロテアーゼペプトン
　　１ｗ／ｗ％　牛肉エキス
　　０．５ｗ／ｗ％　酵母エキス
　　０．２ｗ／ｗ％　クエン酸アンモニウム
　　０．１ｗ／ｗ％　Ｔｗｅｅｎ８０
　　０．５ｗ／ｗ％　酢酸ナトリウム
　　０．０１ｗ／ｗ　％硫酸マグネシウム
　　０．００５ｗ／ｗ％　硫酸マンガン
　　０．２ｗ／ｗ％　リン酸水素二カリウム
（上清中のニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの定量）
　回収した上清１５ｍｌを、同体積の４ｗ／ｗ％炭酸水素ナトリウム溶液と混合し、得られた混合液をＢｏｎｄＥｌｕｔ ＰＢＡカラム（１ｍｌ、アジレント社製）へ通液した。さらに、カラムに３ｍｌの２ｗ／ｗ％炭酸水素ナトリウム溶液を通液して洗浄を行い、次いで、３ｍｌの２ｖ／ｖ％ギ酸溶液を通液し、溶出液を回収した。溶出液２５０μｌに、１５０μｌの１.３Ｍ水酸化カリウム水溶液、及び１００μｌの２０ｗ／ｗ％アセトフェノンを加え、４℃で３０分間反応させた後、４００μｌの９８ｖ／ｖ％ギ酸水溶液を加え、１１０℃で７分間反応させることで、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの蛍光誘導体化処理を行い、後述するＨＰＬＣ条件にて分析し、上清中のニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシド生産量（培養液当たりの生産量；ｍｇ／Ｌ）を測定した。結果を表１に示す。なお、表１中、ｎ．ｄ．は、不検出であったことを示す。
（菌体内のニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの定量）
　回収した菌体を１０ｍｌの０.８５ｗ／ｗ％ＫＣｌ水溶液で洗浄した。洗浄した菌体を再度遠心分離に供し、菌体を回収した。回収した菌体を０.５ｍｌの０.１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.０）に懸濁し、０.１ｍｍのジルコニアビーズを等量添加した後、ビーズ破砕機にて菌体を破砕した。破砕した菌体を遠心分離にて分離し、上清（菌体破砕抽出液）を回収した。菌体破砕抽出液２５０μｌに、１５０μｌの１.３Ｍ水酸化カリウム水溶液及び１００μｌの２０ｗ／ｗ％アセトフェノンを加え、４℃で３０分間反応させた後、４００μｌの９８ｖ／ｖ％ギ酸水溶液を加え、１１０℃で７分間反応させることで、コチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの蛍光誘導体化処理を行い、後述するＨＰＬＣ条件にて分析し、回収菌体中のニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシド生産量（菌体当たりの生産量；ｍｇ／乾燥菌体１ｇ当り）を測定した。結果を表１に示す。
（ＨＰＬＣ分析条件）
　　カラム：ＹＭＣ Ｔｒｉａｒｔ Ｃ１８（４.６×１５０ｍｍ）
　　カラム温度：３０℃
　　溶離液Ａ：０.１ｖ／ｖ％ギ酸の水溶液
　　溶離液Ｂ：０.１ｖ／ｖ％ギ酸のアセトニトリル溶液
　　グラジエント条件：０分（溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝９：１（体積比））から１５分（溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝３：７（体積比））へのグラジエント
　　流速：１ｍｌ/ｍｉｎ
　　検出器：蛍光検出器（Ｅｘ：３２０ｎｍ、Ｅｍ：４５８ｎｍ）
　　検出時間：４．３分（ニコチンアミドモノヌクレオチドの場合）５.１分（ニコチンアミドリボシドの場合）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１から明らかなとおり、フルクトースを含まない培地を用いて得られた培養物においては、菌体内からはニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）及びニコチンアミドリボシド（ＮＲ）のいずれも検出されず、上清中からはニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）が検出されなかった一方で、上清中からニコチンアミドリボシド（ＮＲ）の特異的産生が確認できた。また、中でもＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株、特にＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株から、多くのニコチンアミドリボシド（ＮＲ）の産生が確認できた。
実施例２　フルクトバシラス属乳酸菌を用いたニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの産生
　本培養培地に２ｗ／ｗ％のフルクトースを添加したこと以外は実施例１と同様の方法で、培養、培養上清及び菌体の回収、並びにニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの定量を行った。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２から明らかなとおり、フルクトースを含む培地を用いて得られた培養物においては、上清からはニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）及びニコチンアミドリボシド（ＮＲ）のいずれも検出されなかった一方で、菌体内でのニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）及びニコチンアミドリボシド（ＮＲ）の特異的産生が確認できた。また、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５４株、特にＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株からは、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）及びニコチンアミドリボシド（ＮＲ）の両方がバランスよく産生された。一方、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＲＤ０１１７２７株及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株、特にＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＲＤ０１１７２７株からは、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）及びニコチンアミドリボシド（ＮＲ）の両方が産生するとともに、これらのうちニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）の比率がとりわけ高くなるように産生したことが確認できた。

Claims (18)

  1. 　フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌の培養を行い、ニコチンアミドリボシドを含む培養物を調製する工程を含む、ニコチンアミドリボシドの製造方法。
  2. 　前記培養を、フルクトースを含まない培地にて行う、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ－Ｐ０２７６４）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２７６５）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５４株（寄託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２７６６）、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株からなる群より選ばれる、請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 　前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２７６５）、及び／又はＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株である、請求項１又は２に記載の製造方法。
  5. 　フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌から得られるニコチンアミドリボシドを含む培養物、前記培養物から分離された上清、及び／又は前記上清から単離されたニコチンアミドリボシドを含有する、ニコチンアミドリボシド強化剤。
  6. 　前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ－Ｐ０２７６４）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２７６５）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５４株（寄託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２７６６）及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株からなる群より選択される、請求項５に記載の強化剤。
  7. 　前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２７６５）、及び／又はＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株である、請求項５に記載の強化剤。
  8. 　請求項５～７のいずれかに記載のニコチンアミドリボシド強化剤を含む飲食品、化粧品又は医薬品。
  9. 　Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ－Ｐ０２７６４）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２７６５）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５４株（寄託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２７６６）、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株からなる群より選択される、ニコチンアミドリボシドを産生する乳酸菌。
  10. 　フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌の培養を行う工程を含む、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドの製造方法。
  11. 　前記培養を、フルクトースを含む培地にて行う、請求項１０に記載の製造方法。
  12. 　前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ－Ｐ０２７６４）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２７６５）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５４株（寄託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２７６６）、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株からなる群より選ばれる、請求項１０又は１１に記載の製造方法。
  13. 　前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２７６５）、及び／又はＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株である、請求項１０又は１１に記載の製造方法。
  14. 　フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する乳酸菌から得られるニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドを含む培養物、前記培養物から分離された菌体、前記菌体の破砕物、及び／又は前記破砕物から単離されたニコチンアミドリボシド及びニコチンアミドリボシドを含有する、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシド強化剤。
  15. 　前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ－Ｐ０２７６４）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２７６５）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５４株（寄託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２７６６）、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株からなる群より選択される、請求項１４に記載の強化剤。
  16. 　前記乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ－Ｐ０２７６４）、及び／又はＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株である、請求項１４に記載の強化剤。
  17. 　請求項１４～１６のいずれかに記載のニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシド強化剤を含む飲食品、化粧品又は医薬品。
  18. 　Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ－Ｐ０２７６４）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２７６５）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５４株（寄託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２７６６）、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株からなる群より選択される、ニコチンアミドモノヌクレオチド及びニコチンアミドリボシドを産生する乳酸菌。
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