WO2018034047A1 - 乳酸菌、該乳酸菌由来の血糖低下剤、糖尿病治療薬、及び飲食品 - Google Patents

乳酸菌、該乳酸菌由来の血糖低下剤、糖尿病治療薬、及び飲食品 Download PDF

Info

Publication number
WO2018034047A1
WO2018034047A1 PCT/JP2017/022052 JP2017022052W WO2018034047A1 WO 2018034047 A1 WO2018034047 A1 WO 2018034047A1 JP 2017022052 W JP2017022052 W JP 2017022052W WO 2018034047 A1 WO2018034047 A1 WO 2018034047A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
lactic acid
acid bacteria
product
acid bacterium
sucrose
Prior art date
Application number
PCT/JP2017/022052
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
関水　和久
靖彦 松本
Original Assignee
株式会社ゲノム創薬研究所
国立大学法人東京大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社ゲノム創薬研究所, 国立大学法人東京大学 filed Critical 株式会社ゲノム創薬研究所
Priority to JP2018534279A priority Critical patent/JP7054111B2/ja
Publication of WO2018034047A1 publication Critical patent/WO2018034047A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/99—Enzyme inactivation by chemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to a novel lactic acid bacterium, an ⁇ -glycosidase inhibitor and a blood glucose-lowering agent containing the live bacterium, killed bacterium or treated product of the novel lactic acid bacterium as active ingredients, and a prophylactic and therapeutic drug for diabetes and food and drink containing the blood glucose-lowering agent About.
  • Sucrose is one of the main sweeteners added to various foods. Sucrose is broken down into glucose and fructose by ⁇ -glycosidase in the intestine, and they are absorbed from the intestine, leading to an increase in blood glucose level. Acarbose and voglibose, which are inhibitors of ⁇ -glycosidase, have an effect of inhibiting an increase in postprandial blood glucose level and are used as a therapeutic drug for diabetes. Therefore, a food containing a substance having an inhibitory effect on ⁇ -glycosidase is expected to suppress an increase in postprandial blood glucose due to excessive consumption of sucrose.
  • Lactic acid bacteria are gram-positive bacteria that grow on MRS agar and produce lactic acid. Certain lactic acid bacteria grow in milk and are used to make yogurt. Acarbose, which is an ⁇ -glycosidase inhibitor, is produced by a Gram-positive bacterium, Actinoplanes sp. SE50 / 110 (Non-patent Document 1). It has also been reported that when Lactobacillus rhamnosus, which is a kind of lactic acid bacteria, is administered to mice fed with sucrose, an increase in blood glucose concentration after 1 hour is suppressed (Non-Patent Document 2). Furthermore, it has also been reported that heat-treated cell fractions of certain lactic acid bacteria have ⁇ -glycosidase inhibitory activity (Non-patent Document 3).
  • mice and rats have been used for evaluating lactic acid bacteria that suppress postprandial hyperglycemia.
  • problems with not only costs but also animal welfare have been pointed out for subjecting many mammals to experiments.
  • An object of the present invention is to provide a novel lactic acid bacterium having a high blood glucose lowering effect, and further, a blood glucose lowering agent comprising the lactic acid bacterium or a killed or treated product of the lactic acid bacterium as an active ingredient, the lactic acid bacterium or the lactic acid bacterium It is in providing the food / beverage products containing the hypoglycemic agent originating in. It is another object of the present invention to provide a preventive / therapeutic agent for diabetes comprising a substance derived from a novel lactic acid bacterium as an active ingredient.
  • the present inventors have found a method for searching for a substance having ⁇ -glycosidase inhibitory activity using silkworms.
  • Silkworms can raise a large number of individuals in a smaller space than mammals such as mice, and since ethical problems are small, by using an evaluation system using silkworms, hyperglycemia caused by sucrose feeding It has been found that a functional lactic acid bacterium having an effect of suppressing the odor can be searched.
  • the present inventors have identified an lactic acid bacterium that suppresses hyperglycemia caused by sucrose feeding, using an in-vivo evaluation method using silkworms.
  • Yogurt produced using the lactic acid strain showed an effect of suppressing an increase in blood glucose level in a human sucrose tolerance test.
  • this lactic acid bacteria showed the effect which suppresses postprandial hyperglycemia and reduces the onset of diabetes.
  • lactic acid bacteria 0831-07 new lactic acid strains belonging to the genus Enterococcus
  • lactic acid bacteria # new lactic acid strains belonging to the genus Enterococcus
  • the present invention relates to a lactic acid bacterium belonging to the genus Enterococcus whose accession number is NITE BP-02309 in the Patent Microorganism Deposit Center (NPMD) of the National Institute of Technology and Evaluation (NITE), or its natural or
  • NPMD Patent Microorganism Deposit Center
  • NITE National Institute of Technology and Evaluation
  • the present invention provides an artificially mutated lactic acid bacterium having a blood glucose lowering effect.
  • the present invention provides an isolated or purified lactic acid bacterium.
  • the present invention also provides the lactic acid bacterium described above, which has an ⁇ -glycosidase inhibitory activity and is used for the purpose of suppressing an increase in blood sugar due to sucrose intake.
  • the present invention is an ⁇ -glycosidase inhibitor comprising as an active ingredient the lactic acid bacterium, killed lactic acid bacterium or a processed product of the lactic acid bacterium,
  • the treated product of the lactic acid bacterium is selected from the group consisting of a culture, a concentrate, a paste, a dried product, a liquefied product, a diluted product, a crushed product, a sterilized processed product, and an extract from the culture product.
  • the present invention provides an ⁇ -glycosidase inhibitor characterized by being at least one processed product.
  • the present invention is a blood glucose lowering agent comprising the lactic acid bacterium, a killed bacterium of the lactic acid bacterium, or a processed product of the lactic acid bacterium as an active ingredient
  • the processed product of lactic acid bacteria is a culture product of lactic acid bacteria; concentrate; paste product; spray-dried product, freeze-dried product, vacuum-dried product, drum-dried product, etc .; liquefied product; dilution product; And providing a hypoglycemic agent which is at least one processed product selected from the group consisting of extracts from the culture.
  • the present invention also provides a preventive / therapeutic agent for diabetes characterized by containing the above-mentioned hypoglycemic agent as an active ingredient.
  • this invention provides the food / beverage products containing the said lactic acid bacteria or the said blood glucose lowering agent.
  • a novel lactic acid bacterium having an extremely high blood glucose lowering effect can be provided.
  • a novel lactic acid bacterium having an action of suppressing an increase in blood sugar due to sucrose intake is possible to provide.
  • the present invention also provides a novel hypoglycemic agent having an extremely high blood glucose-lowering effect, comprising the lactic acid bacterium, killed lactic acid bacterium, or processed product of lactic acid bacterium as an active ingredient, and contains the lactic acid bacterium or the hypoglycemic agent. It is possible to provide a food or drink excellent in blood glucose lowering action.
  • preventive / therapeutic agent for diabetes containing the blood glucose lowering agent as an active ingredient, and the preventive / therapeutic agent for diabetes can prevent or treat diabetes by oral administration.
  • the lactic acid bacteria of the present invention can be used not only for the production of general foods and drinks, health foods, drugs, fermented foods and drinks, probiotics, etc., but also for the prevention and treatment of diseases by suppressing the increase in blood sugar. .
  • fermented foods and drinks it is particularly suitable for use as fermented milk, lactic acid bacteria beverages, yogurt, pickles, lactic acid bacteria starters for the production of pickles.
  • lactic acid bacteria starters for the production of pickles.
  • it since it is resistant to acid, it has the feature that it reaches the small intestine without being decomposed in the stomach.
  • (A) It is a figure which shows the experimental scheme of the sugar transfer evaluation system in the silkworm intestinal tract in invitro.
  • (B) It is a graph which shows the inhibitory effect of the sucrose transport by the acarbose from the intestine inside the extraction intestine to the intestine outside.
  • 3 is a graph showing the inhibitory effect of sucrose transport from the isolated intestinal tract to the outside of the intestinal tract by addition of lactic acid bacteria (# Ef-1 strain).
  • (A) It is a graph which shows the inhibitory effect of the glucose level rise in the extra-intestinal fluid of a silkworm by addition of lactic acid bacteria (# Ef-1 strain).
  • (B) It is a graph which shows the inhibitory effect of the glucose level rise in the extra-intestinal fluid of a silkworm by the addition amount of lactic acid bacteria (# Ef-1 strain).
  • (C) It is a graph which shows the inhibitory effect of the glucose level rise in the extra-intestinal fluid of a silkworm by the addition of the heat processing microbial cell of lactic acid bacteria (# Ef-1 strain).
  • (D) It is a graph which shows the inhibitory effect of the glucose level rise in the extraintestinal fluid of a silkworm by the addition amount of the heat processing microbial cell of lactic acid bacteria (# Ef-1 strain
  • (A) It is a graph which shows the inhibitory effect of the glucose level rise in the extraintestinal fluid of a silkworm by addition of live bacteria of lactic acid bacteria (# Ef-1 strain).
  • (B) It is a graph which shows the inhibitory effect of the glucose level rise in the extraintestinal fluid of a silkworm by the addition of the heat-treated microbial cell of lactic acid bacteria (# Ef-1 strain).
  • (A) It is a graph showing the ⁇ -glycosidase activity inhibitory effect of the silkworm intestinal tract by the addition of lactic acid bacteria (# Ef-1 strain).
  • (B) A graph showing the inhibitory effect of ⁇ -glycosidase activity in rat intestine by the addition of lactic acid bacteria (# Ef-1 strain).
  • A A graph showing the results of measurement of fluorescence uptake in Caco-2 cells to which live bacteria of lactic acid bacteria (# Ef-1 strain) were added.
  • B A graph showing the results of measurement of fluorescence uptake in Caco-2 cells by adding live bacteria of lactic acid bacteria (# Ef-1 strain) and heat-treated cell fraction.
  • C Schematic diagram showing the effect of suppressing postprandial hyperglycemia by lactic acid bacteria (# Ef-1 strain). It is a schematic diagram showing a schedule of sucrose tolerance test in humans by feeding lactic acid bacteria (# Ef-1 strain).
  • the present invention relates to a lactic acid bacterium belonging to the genus Enterococcus whose accession number is NITE BP-02309 at the Patent Microorganism Deposit Center (NPMD) of the National Institute for Product Evaluation and Technology (NITE), or a natural or artificial thereof It is a lactic acid bacterium that has been mutated to have a blood glucose lowering effect.
  • NPMD Patent Microorganism Deposit Center
  • NITE National Institute for Product Evaluation and Technology
  • lactic acid bacterium 0831-07 belonging to the genus Enterococcus
  • Lactic acid bacteria 0831-07 of the present invention were isolated for the first time using centipede (Chilopod) as a separation source.
  • Physiological properties Physiological and chemical taxonomic properties of lactic acid bacteria 0831-07 of the present invention are as follows. (1) Catalase:- (2) Acid phosphatase: + (3) Alkaline phosphatase: + (4) Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase: + (5) Esterase (C4): + (6) ⁇ -Galactosidase:- (7) Esterase lipase (C8): + (8) ⁇ -galactosidase:- (9) Lipase (C14):- (10) ⁇ -glucuronidase:- (11) Leucine allylamidase: + (12) ⁇ -Glucosidase: + (13) Valine allylamidase:- (14) ⁇ -glucosidase:- (15) Cystine allylamidase:- (16) N-acetyl- ⁇ -glucosaminidase:- (17) Trypsin:- (18) ⁇ -Mannosidas
  • Molecular biological analysis results The analysis results of lactic acid bacteria 0831-07 regarding 16S rDNA used as an index of molecular biological systematic classification are as shown in the attached sequence listing. That is, from the genomic DNA of lactic acid bacteria 0831-07, the base sequence of the 16S rDNA region was amplified by PCR and analyzed by a sequencer. As a result, a base sequence corresponding to almost the entire length of 16S rDNA was found.
  • the base sequence of the 16S rDNA region of lactic acid bacteria 0831-07 was homologous to the base sequence of Enterococcus faecalis V583 strain (registration number: NR_074637.1) belonging to the genus Enterococcus Lactic acid bacteria 0831-07 belong to Enterococcus faecalis because it showed 99% of the sexual activity.
  • the lactic acid bacteria 0831-07 of the present invention are lactic acid strains different from the above strains because they do not completely match.
  • lactic acid bacterium 0831-07 of the present invention is a novel microorganism belonging to the genus Enterococcus.
  • intensive examination it was determined that lactic acid bacteria 0831-07 was an isolated novel microbial strain.
  • Lactic acid bacterium 0831-07 is a deposit of patent microorganisms from the National Institute of Technology and Evaluation (hereinafter, abbreviated as “NITE”), Room 2-5-8, Kazusa-Kamashita, Kisarazu City, Chiba Prefecture. This is a microorganism deposited domestically at the Center (NPMD) and deposited under the deposit number: NITE P-02309 (deposit date: July 26, 2016).
  • NITE National Institute of Technology and Evaluation
  • Lactic acid bacteria 0831-07 then submitted the original deposit application to the patent microorganisms deposit center (NPMD) of 2-5-8 Kazusa-Kamashita, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Room 122, NITE Apply for transfer from domestic deposit (original deposit date: July 26, 2016) to deposit under the Budapest Treaty (transfer date (international deposit date: May 16, 2017)) As a result of receiving an application for transfer to a deposit based on the Budapest Treaty (international deposit), it has received the deposit number “NITE BP-02309”.
  • NPMD patent microorganisms deposit center
  • lactic acid bacteria 0831-07 may not be within the range of the physiological properties shown above. Needless to say, such “mutation” includes both natural and artificial mutations.
  • the culture method of lactic acid bacteria 0831-07 may be performed according to a general culture method performed for microorganisms of the genus Enterococcus.
  • the culture is preferably performed under anaerobic conditions.
  • Examples of the carbon source in the medium include D-ribose, D-galactose, D-glucose, D-fructose, D-mannose, D-mannitol, N-acetylglucosamine, amygdalin, arbutin, esculin, salicin, D-cellobiose Organic carbon compounds such as D-maltose, sucrose, D-trehalose, gentiobiose, molasses, starch syrup, and fats and oils are used, and nitrogen sources include meat extract, casein, peptone, yeast extract, dry yeast, germ, soybean Organic / inorganic nitrogen compounds such as powder, urea, amino acids and ammonium salts can be used.
  • inorganic salts such as sodium salt, potassium salt, calcium salt, magnesium salt, phosphate, iron salt, copper salt, zinc salt, cobalt salt and the like are appropriately added as necessary.
  • a growth promoting substance such as biotin, vitamin B1, cystine, methyl oleate, lard oil or the like in terms of increasing the production amount of the target product.
  • antifoamers such as a silicone oil and surfactant.
  • the prepared medium for example, an MRS medium, a GAM medium or the like is preferably used.
  • the culture condition may be performed according to the general culture conditions performed for Enterococcus microorganisms as described above. If it is a liquid culture method, stationary culture is desirable. If it is a small scale, you may use the stationary culture method by the glass bottle with a lid
  • the culture temperature is preferably maintained between 25 ° C. and 43 ° C., more preferably 30 ° C. to 42 ° C.
  • the culture pH is preferably performed in the vicinity of 7.
  • the culture period is a factor that varies depending on the composition of the medium used, the culture temperature, and the like. In the case of lactic acid bacteria 0831-07, a sufficient amount of the target product is preferably secured in 12 to 72 hours, more preferably in 24 to 48 hours. can do. It is also preferable to pick up a colony obtained by culturing and form a single colony on the medium again.
  • the novel lactic acid bacterium 0831-07 of the present invention is preferably a lactic acid bacterium that has an ⁇ -glycosidase inhibitory activity and is used for the purpose of suppressing an increase in blood sugar due to sucrose intake.
  • the novel lactic acid bacterium 0831-07 of the present invention has an ⁇ -glucosidase inhibitory activity as the lactic acid bacterium itself or as a lactic acid bacterium naturally or artificially mutated in the lactic acid bacterium.
  • “Lactic acid bacteria 0831-07 or naturally or artificially mutated lactic acid bacteria”, “dead bacteria of the lactic acid bacteria”, and “processed products of the lactic acid bacteria” all have ⁇ -glucosidase inhibitory activity.
  • the “processed product of lactic acid bacteria” includes a culture product, a concentrate, a paste product, a dried product, a liquefied product, a diluted product, a crushed product, a sterilized processed product, and an extract from the culture product.
  • the at least 1 processed material chosen from a group is mentioned.
  • examples of the “dried product” include spray-dried products, freeze-dried products, vacuum-dried products, and drum-dried products.
  • the lactic acid bacterium of the present invention (lactic acid bacterium 0831-07 or a lactic acid bacterium naturally or artificially mutated thereof), a dead bacterium of the lactic acid bacterium, or a processed product of the lactic acid bacterium is used as an active ingredient.
  • -A glucosidase inhibitor wherein the treated product of lactic acid bacteria is extracted from culture, concentrate, pasted product, dried product, liquefied product, diluted product, crushed product, sterilized processed product, and cultured product of lactic acid bacterium
  • An ⁇ -glucosidase inhibitor characterized by being at least one processed product selected from the group consisting of products.
  • the ⁇ -glucosidase inhibitor of the present invention can contain the lactic acid bacterium of the present invention, a dead bacterium of the lactic acid bacterium, or a processed product of the lactic acid bacterium in various states.
  • the state containing a suspension, lactic acid bacteria, a culture supernatant, a culture medium component, etc. are mentioned.
  • lactic acid bacteria viable cells, wet bacteria, dry bacteria and the like can be used as appropriate.
  • the killed bacteria which performed sterilization ie, a heat sterilization process, a radiation sterilization process, a crushing process, etc. may be sufficient.
  • the content of lactic acid bacteria, killed bacteria of the lactic acid bacteria, and processed products of the lactic acid bacteria, which are active ingredients in the ⁇ -glucosidase inhibitor of the present invention, with respect to the entire ⁇ -glucosidase inhibitor is not particularly limited, although it can be selected as appropriate, when the whole hypoglycemic agent is taken as 100 parts by mass, it is contained in 0.001 to 100 parts by mass as “total amount of lactic acid bacteria, killed bacteria of the lactic acid bacteria, and processed product of the lactic acid bacteria” It is preferably contained in an amount of 0.01 to 99 parts by mass, particularly preferably 0.1 to 95 parts by mass, and still more preferably 1 to 90 parts by mass.
  • any one of the active ingredients may be used alone, or two or more of them may be used in combination.
  • the content ratio of each active ingredient in the ⁇ -glucosidase inhibitor is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the ⁇ -glucosidase inhibitor of the present invention contains the lactic acid bacterium, the killed bacterium of the lactic acid bacterium, or the processed product of the lactic acid bacterium as an active ingredient, and can contain “other ingredients” in addition to these active ingredients. .
  • the “other component” in the ⁇ -glucosidase inhibitor is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose within a range not impairing the effects of the present invention.
  • pharmaceutically acceptable And a carrier that can be used. There is no restriction
  • carrier For example, it selects suitably according to the dosage form etc. which are mentioned later. Further, the content of “other components” in the ⁇ -glucosidase inhibitor is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the novel lactic acid bacterium 0831-07 of the present invention has a blood glucose lowering effect as the lactic acid bacterium itself or as a lactic acid bacterium naturally or artificially mutated in the lactic acid bacterium.
  • “Lactic acid bacteria 0831-07 or naturally or artificially mutated lactic acid bacteria”, “dead bacteria of the lactic acid bacteria”, and “processed products of the lactic acid bacteria” all have a blood glucose lowering effect.
  • the “processed product of lactic acid bacteria” includes a culture product, a concentrate, a paste product, a dried product, a liquefied product, a diluted product, a crushed product, a sterilized processed product, and an extract from the culture product.
  • the at least 1 processed material chosen from a group is mentioned.
  • examples of the “dried product” include spray-dried products, freeze-dried products, vacuum-dried products, and drum-dried products.
  • the lactic acid bacterium of the present invention (lactic acid bacterium 0831-07 or a lactic acid bacterium naturally or artificially mutated thereof), a dead bacterium of the lactic acid bacterium, or a processed product of the lactic acid bacterium is used as an active ingredient.
  • the processed product of the lactic acid bacterium is a lactic acid bacteria culture, concentrate, pasted product, dried product, liquefied product, diluted product, crushed product, sterilized processed product, and extract from the cultured product.
  • a hypoglycemic agent characterized by being at least one processed product selected from the group consisting of:
  • the hypoglycemic agent of the present invention can contain the lactic acid bacteria of the present invention, killed bacteria of the lactic acid bacteria, or processed products of the lactic acid bacteria in various states.
  • the state containing a suspension, lactic acid bacteria, a culture supernatant, a culture medium component, etc. are mentioned.
  • lactic acid bacteria viable cells, wet bacteria, dry bacteria and the like can be used as appropriate.
  • the killed bacteria which performed sterilization ie, a heat sterilization process, a radiation sterilization process, a crushing process, etc. may be sufficient.
  • the content of the lactic acid bacteria, killed bacteria of the lactic acid bacteria, and processed products of the lactic acid bacteria, which are active ingredients in the hypoglycemic agent of the present invention, with respect to the entire hypoglycemic agent is not particularly limited and should be appropriately selected according to the purpose. However, when the whole hypoglycemic agent is 100 parts by mass, it may be contained in an amount of 0.001 to 100 parts by mass as “total amount of lactic acid bacteria, killed bacteria of the lactic acid bacteria, and processed product of the lactic acid bacteria”.
  • the content is preferably 0.01 to 99 parts by mass, particularly preferably 0.1 to 95 parts by mass, and still more preferably 1 to 90 parts by mass.
  • any one of the active ingredients may be used alone, or two or more of them may be used in combination.
  • the hypoglycemic agent of the present invention contains the lactic acid bacterium, the killed bacterium of the lactic acid bacterium, or the processed product of the lactic acid bacterium as an active ingredient, and can contain “other ingredients” in addition to these active ingredients.
  • the “other components” in the blood glucose lowering agent are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose within a range not impairing the effects of the present invention.
  • pharmaceutically acceptable. Examples include carriers. There is no restriction
  • the content of “other components” in the hypoglycemic agent is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the aforementioned lactic acid bacteria of the present invention, killed bacteria of the lactic acid bacteria, and processed products of the lactic acid bacteria are useful as antidiabetic and therapeutic agents because of having or having a blood glucose lowering action, and particularly as antidiabetic and therapeutic agents for oral administration. Useful. Therefore, another aspect of the present invention is a diabetes preventive / therapeutic agent comprising the above-mentioned hypoglycemic agent as an active ingredient.
  • the lactic acid bacteria of the present invention and the blood sugar-lowering agent of the present invention derived from the lactic acid bacteria can be blended in foods and drinks having standards such as pharmaceuticals, quasi drugs, general foods and drinks, health foods, and powdered milk. Regardless of their form, they can be applied to various pharmaceuticals, foods and drinks, and the like.
  • foods and drinks manufactured using the above-described process of fermenting using the lactic acid bacteria of the present invention, and in particular, fermented milk is easy to exhibit the normal effects of lactic acid bacteria and the effects specific to the present invention. preferable.
  • the dosage form of the ⁇ -glucosidase inhibitor, the hypoglycemic agent and the diabetes preventive / therapeutic agent of the present invention is not particularly limited, and can be appropriately selected according to, for example, a desired administration method as described later.
  • oral solid preparations tablettes, coated tablets, granules, powders, hard capsules, soft capsules, etc.
  • oral liquids internal solutions, syrups, elixirs, etc.
  • injections solvents, suspensions
  • ointments patches, gels, creams, powders for external use, sprays, inhalation sprays and the like.
  • oral solid preparation examples include, for example, excipients and further additives such as binders, disintegrants, lubricants, colorants, flavoring and flavoring agents as necessary, in addition to the active ingredients. Can be manufactured.
  • excipient examples include lactose, sucrose, sodium chloride, glucose, starch, calcium carbonate, kaolin, microcrystalline cellulose, silicic acid and the like.
  • binder examples include water, ethanol, propanol, simple syrup, glucose solution, starch solution, gelatin solution, carboxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropyl starch, methylcellulose, ethylcellulose, shellac, calcium phosphate, polyvinylpyrrolidone and the like. It is done.
  • disintegrant examples include dry starch, sodium alginate, agar powder, sodium hydrogen carbonate, calcium carbonate, sodium lauryl sulfate, stearic acid monoglyceride, and lactose.
  • Examples of the lubricant include purified talc, stearate, borax, polyethylene glycol and the like.
  • Examples of the colorant include titanium oxide and iron oxide.
  • Examples of the flavoring / flavoring agent include sucrose, orange peel, citric acid, tartaric acid and the like.
  • the oral liquid preparation can be produced by a conventional method, for example, by adding additives such as a taste-masking / flavoring agent, a buffering agent and a stabilizer to the active ingredient.
  • Examples of the flavoring / flavoring agent include sucrose, orange peel, citric acid, tartaric acid and the like.
  • Examples of the buffer include sodium citrate.
  • Examples of the stabilizer include tragacanth, gum arabic, and gelatin.
  • a pH adjuster, a buffer, a stabilizer, a tonicity agent, a local anesthetic, etc. are added to the active ingredient, and subcutaneous, intramuscular, intravenous use are performed by a conventional method.
  • Etc. can be manufactured.
  • the pH adjuster and the buffer include sodium citrate, sodium acetate, sodium phosphate and the like.
  • the stabilizer include sodium pyrosulfite, EDTA, thioglycolic acid, thiolactic acid, and the like.
  • the isotonic agent include sodium chloride and glucose.
  • the local anesthetic include procaine hydrochloride and lidocaine hydrochloride.
  • a known base, stabilizer, wetting agent, preservative and the like may be blended with the active ingredient and mixed by a conventional method.
  • the base include liquid paraffin, white petrolatum, white beeswax, octyldodecyl alcohol, paraffin and the like.
  • the preservative include methyl paraoxybenzoate, ethyl paraoxybenzoate, propyl paraoxybenzoate, and the like.
  • a cream, gel, paste or the like as the ointment can be applied to a known support by a conventional method.
  • the support include woven fabric, nonwoven fabric, soft vinyl chloride, polyethylene, polypropylene, polyurethane and other films made of cotton, suf, and chemical fibers, and foam sheets.
  • the ⁇ -glucosidase inhibitor, the hypoglycemic agent and the diabetes preventive / therapeutic agent of the present invention can be suitably used for, for example, an individual who needs a decrease in blood glucose, an individual who wants to obtain acquired immunity against bacteria, and the like. Specifically, for example, by administering to an individual who needs to maintain health or recover from fatigue; an individual who needs prevention or treatment of cancer or lifestyle-related diseases; an individual infected with bacteria, fungi, viruses, etc. Can be used.
  • mice and rats mice and rats
  • monkeys horses
  • cows, pigs domestic animals
  • Cats such as cats and dogs; and the like.
  • the administration method of the ⁇ -glucosidase inhibitor, the hypoglycemic agent or the diabetes preventive / therapeutic agent is not particularly limited, and can be appropriately selected according to, for example, the above-mentioned dosage form. Examples thereof include internal administration, injection into blood, and infusion into the intestine. Of these, oral administration is preferable because it is simple and exhibits the above-mentioned effects.
  • the dose of the ⁇ -glucosidase inhibitor, the hypoglycemic agent or the diabetes preventive / therapeutic agent is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the age, weight, desired degree of effect, etc. of the individual to be administered.
  • the daily dose to an adult is preferably 1 mg to 30 g, more preferably 10 mg to 10 g, and particularly preferably 100 mg to 3 g as the amount of the active ingredient.
  • the content of the diabetes preventive / therapeutic drug is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose and the form (type) of the food or drink.
  • the content is preferably 0.001 to 100 parts by mass, more preferably 0.01 to 100 parts by mass, and particularly preferably 0.1 to 100 parts by mass.
  • Any one of the above may be used alone, or two or more may be used in combination.
  • the food / beverage products of this invention have a hypoglycemic effect.
  • the food / beverage products of the present invention can further contain “other components” in addition to the lactic acid bacteria and blood sugar lowering agent of the present invention described above.
  • the “other components” are not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose within a range not impairing the effects of the present invention. Examples thereof include various food materials. Further, the content of “other components” is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the food and drink of the present invention includes drinks and foods taken by humans.
  • the food and drink of the present invention also includes beverages for consumption by livestock, poultry, pets and the like.
  • the lactic acid bacteria of the present invention can be used for production of general foods and drinks, health foods, drugs, fermented foods and drinks, probiotics, and the like.
  • fermented foods and drinks it is particularly suitable for use as fermented milk, lactic acid bacteria beverages, yogurt, pickles, lactic acid bacteria starters for the production of pickles.
  • confectionery such as jelly, a candy, chocolate, a biscuit, a gummy; Green tea, tea, coffee, a soft drink, etc.
  • Preference drinks
  • Dairy products such as fermented milk, yogurt, ice cream and lacto ice
  • Vegetable and fruit drinks processed vegetables and fruits such as jams
  • Liquid foods such as soups
  • Grain processed products such as breads and noodles
  • dairy products such as yogurt and fermented milk are preferred.
  • a manufacturing method of these food / beverage products For example, according to the manufacturing method of various normal food / beverage products, it can manufacture suitably.
  • the food and drink may be manufactured as oral solid preparations such as tablets, granules and capsules, or oral liquid preparations such as internal use liquid preparations and syrup preparations.
  • the method for producing the oral solid preparation and oral liquid preparation is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
  • the preparation can be produced in accordance with the method for producing the oral solid preparation or oral liquid preparation described above. it can.
  • the food / beverage products of the present invention are particularly useful as functional foods, health foods and the like for the purpose of activating a hypoglycemic mechanism and preventing diabetes.
  • the production method can be carried out by methods well known to those skilled in the art. If it is an expert, the process which mixes the (dead) microbial cell or processed material of this invention with other components, a shaping
  • the lactic acid bacteria of this invention when using the lactic acid bacteria of this invention for manufacture of various fermented milk, it can manufacture using a method well-known to those skilled in the art.
  • food and drink manufactured using the process of adding the required amount of lactic acid bacteria of the present invention as dead bacteria to fermented milk and food and drink manufactured using the process of fermenting using the lactic acid bacteria of the present invention as a lactic acid bacteria starter Can be mentioned.
  • it can carry out on the conditions similar to the culture conditions of the lactic acid bacteria of this invention, etc.
  • Lactic acid bacteria 0831-07 used in the examples was isolated from centipede (Chilopod). Lactic acid bacteria 0831-07 belonging to Enterococcus faecalis is a patent microorganism deposit center (NPMD) of the National Institute for Product Evaluation and Technology (NITE) (Room 2-5-8 Kazusa Kamashichi, Kisarazu City, Chiba Prefecture) (Accession number: NITE P-02309, date of deposit July 26, 2016).
  • NITE National Institute for Product Evaluation and Technology
  • Lactic acid bacteria 0831-07 then submitted the original deposit application to the patent microorganisms deposit center (NPMD) of 2-5-8 Kazusa-Kamashita, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Room 122, NITE Apply for transfer from domestic deposit (original deposit date: July 26, 2016) to deposit under the Budapest Treaty (transfer date (international deposit date: May 16, 2017)) As a result of receiving an application for transfer to a deposit based on the Budapest Treaty (international deposit), it has received the deposit number “NITE BP-02309”.
  • NPMD patent microorganisms deposit center
  • Silkworm fertilized eggs (Hybrids, Yo ⁇ Tsukuba, Ne) were purchased from Ehime Yoro Co., Ltd. The hatched larvae were given artificial feed silk mate 2S (Nippon Nosan Kogyo Co., Ltd.) at room temperature and grown to 5th instar larvae. As the rearing container, a square type No. 2 petri dish (Eiken Equipment) was used from the egg to the second instar larva, and the disposable plastic food pack (Food Pack FD Oduka, Chuo Chemical Co., Ltd.) was used thereafter. The breeding temperature was 27 ° C. Unless otherwise stated, larvae on the 1st day of 5th instar fasted after 4th inning sleep were used in the experiments.
  • Lactic acid bacteria were cultured on an MRS agar medium containing 0.5% calcium carbonate under anaerobic conditions. A zona pellucida was formed around the colonies on the MRS agar medium, and Gram-positive bacteria were determined to be lactic acid bacteria. Species were identified for the isolated lactic acid bacteria by sequencing the gene encoding rRNA. Growth of lactic acid bacteria in a liquid medium was performed under static conditions at 30 ° C. for 1 to 3 days.
  • Glucose Metabolism Test of Lactic Acid Bacteria The sugar metabolic ability of lactic acid bacteria 0831-07 was measured using Api 50 CH kit (Sysmex). A colony of lactic acid bacteria 0831-07 strain was suspended in suspension medium (Sysmex Corporation) and prepared to have a McFarland turbidity of 2. 150 ⁇ L of the prepared bacterial solution sample was added to an Api plate (Sysmex Corporation) and cultured at 30 ° C. for 48 hours. After culture, the metabolic capacity for various sugars was determined by observing the reacted color.
  • Silkworm body fluid was collected by cutting the first abdominal limb with scissors.
  • the glucose concentration in silkworm blood was quantified with a glucometer (Accu-Chek, Roche).
  • the sucrose tolerance test with or without yogurt was conducted with a gap of 2 days or more.
  • the implementation time of sucrose load in each subject was set to be the same.
  • the sample was collected from the fingertip of the subject's hand using a puncture device.
  • the blood glucose level of the subject was measured 15 minutes before sucrose loading.
  • Yogurt was ingested 10 minutes before sucrose loading. 200 mL was consumed within 2 minutes.
  • 150 mL of 50% (w / v) aqueous sucrose solution was drunk (the entire amount was consumed within 1 minute).
  • Blood glucose levels were measured at 15, 30, 45, 60, 90, and 120 minutes after sucrose loading.
  • the blood glucose level was measured using a simple blood glucose meter (Accuchek Aviva (Roche)). The clinical trial was approved by the Ethics Review Committee of the Tokyo Heart Center, Osaki Hospital.
  • Example 1 ⁇ Identification of Lactic Acid Bacteria that Suppresses Glucose Concentration in Silkworms by Feeding Sucrose>
  • Previous studies have shown that lactic acid bacteria with ⁇ -glycosidase inhibitory activity in silkworms suppress the increase in glucose concentration in body fluids due to sucrose intake (International Application No. PCT / JP2016 / 079218, Matsumoto Y et al ., Sci Rep., 2016). Accordingly, the inventors searched for lactic acid bacteria that significantly inhibit the increase in the glucose concentration in the body fluid of silkworms by feeding sucrose from the lactic acid bacteria library (Table 1) held by the inventors.
  • Enterococcus faecalis 0831-07 Entererococcus faecalis # Ef-1
  • Enterococcus faecalis 0831-07 may be abbreviated as “lactic acid bacterium 0831-07” or “lactic acid bacterium # Ef-1”.
  • the silkworms at the age of 5 days were fed with a diet in which 10% by mass of sucrose diet plus lactic acid bacteria 0831-07 (0-50% by mass with respect to the total diet) was added for 1 hour. Thereafter, the body fluid of the silkworm was collected, and the glucose concentration in the body fluid was measured.
  • the lactic acid bacterium 0831-07 (lactic acid bacterium # Ef-1) strain markedly suppressed the “increase in the blood sugar level of silkworms due to the feeding of 10 mass% sucrose diet”.
  • the inhibitory effect by the lactic acid bacteria 0831-07 strain was also observed on the increase in the glucose concentration in the body fluid when glucose was fed.
  • the lactic acid bacteria 0831-07 strain was able to grow on a medium containing glucose or fructose.
  • “-” Indicates a lactic acid bacterium 0831-07 (# Ef-1) strain that has not been heat-treated, and “Heat-killed” indicates a lactic acid bacterium 0831-07 strain that has been heat-treated by autoclaving.
  • the heat-treated cell fraction of the lactic acid bacterium 0831-07 strain suppressed the increase in the glucose concentration in the body fluid of the silkworm due to the feeding of the sucrose diet, as in the case of the untreated live bacterium (FIG. 4). ). Therefore, it was suggested that the effect of suppressing the increase in blood glucose by sucrose feeding of the lactic acid bacteria 0831-07 strain was due to the inhibition of silkworm intestinal ⁇ -glycosidase by the heat-resistant component by the lactic acid bacteria 0831-07 strain.
  • Example 2 ⁇ Inhibitory effect of lactic acid bacteria 0831-07 on the increase in blood glucose level caused by human sucrose feeding>
  • yogurt was produced from milk using lactic acid bacteria 0831-07 strain.
  • the subject was subjected to a sucrose (sucrose) load test by the crossover method when the yogurt was not taken and when the yogurt was taken.
  • the subjects in the yogurt intake group ingested 200 mL of yogurt 10 minutes before the sucrose load. Thereafter, 150 mL of a 50% (w / v) sucrose aqueous solution was drunk for both subjects in the yogurt non-intake group and the yogurt intake group.
  • the blood glucose level was measured at 15, 30, 45, 60, 90, and 120 minutes after sucrose loading.
  • the subjects fed the yogurt produced using the lactic acid bacteria 0831-07 had a lower blood glucose level at 45 minutes after sucrose loading compared to the non-fed group (FIG. 5). Therefore, it was suggested that the bacterial cell component of the lactic acid bacteria 0831-07 strain has an effect of suppressing an increase in blood glucose level due to sucrose (sucrose) intake in humans.
  • Example 3 Manufacture of hypoglycemic agent and diabetes preventive and therapeutic agent> ⁇ Tablet >> The cultured lactic acid bacteria 0831-07 were sterilized at 121 ° C. for 20 minutes and concentrated. The concentrated lactic acid bacteria 0831-07 culture solution 20.0 mg, lactose 40 mg, starch 20 mg, and low-substituted hydroxypropylcellulose 5 mg were uniformly mixed, and then the mixture was prepared by a wet process using a hydroxypropylmethylcellulose 8 mass% aqueous solution as a binder. Granules for tableting were produced by the granulation method. To this, 0.5 mg to 1 mg of magnesium stearate necessary for providing lubricity was added, and then tableted using a tableting machine to obtain tablets.
  • ⁇ Liquid 10.0 mg of the concentrated culture solution of lactic acid bacteria 0831-07 was dissolved in 10 mL of a 2% by mass 2-hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin aqueous solution to prepare an injection solution.
  • Example 4 ⁇ Inhibitory effect of increase in glucose concentration in silkworm body fluid by feeding sucrose-containing food by addition of lactic acid bacteria killed bacteria> Heat-killed # Ef-1 fraction of lactic acid bacterium 0831-07 (# Ef-1) strain or autoclaved lactic acid bacterium 0831-07 (# Ef-1) strain in a feed containing 10% by mass of sucrose was added to silkworms on the first day of age 5 for 1 hour. The silkworm body fluid was collected and the glucose concentration in the body fluid was measured. The result is shown in FIG.
  • the vertical axis indicates the glucose concentration (mg / dL).
  • No bacteria on the horizontal axis shows the results when 10 mass% sucrose diet containing no lactic acid bacteria 0831-07 (# Ef-1) strain was given to silkworms.
  • “Viable # Ef-1 content” indicates the content of the lactic acid bacterium 0831-07 strain that has not been heat-treated, and “Heat-killed # Ef-1 content” indicates the content of the heat-treated lactic acid bacterium 0831-07.
  • *** is P ⁇ 0.001, ** is p ⁇ 0.01, and error bars indicate standard errors (SEM).
  • N 11-14 per group.
  • the heat-treated cell fraction of the lactic acid bacterium 0831-07 (# Ef-1) strain or the autoclaved lactic acid bacterium 0831-07 (# Ef-1) strain (Heat-killed # Ef-1) ) was added to a silkworm on the first day of age 5 for 1 hour.
  • the body fluid of the silkworm was collected, the glucose concentration in the body fluid was measured, and a significant difference test was performed using Student's t-test. The result is shown in FIG.
  • the vertical axis indicates the glucose concentration (mg / dL).
  • No bacteria on the horizontal axis shows the results when 10 mass% glucose feed (Glucose diet) not containing lactic acid bacteria 0831-07 (# Ef-1) strain was given to silkworms.
  • the lactic acid bacterium 0831-07 strain not subjected to heat treatment suppressed an increase in the glucose concentration in the silkworm body fluid due to the feeding of the glucose-containing food.
  • the heat-treated cells of the lactic acid bacteria 0831-07 strain were not found to have an activity to suppress the increase in glucose concentration in the silkworm body fluid after glucose feeding.
  • sucrose is known to be broken down into glucose and fructose by ⁇ -glycosidase in the intestine and absorbed from the intestine.
  • an experimental system was constructed to analyze the process of sucrose in the intestinal tract of silkworm being degraded by ⁇ -glycosidase and the glucose moving outside the intestine. The intestinal tract of a 5th day old silkworm was removed and tied with a thread so that the solution could be put into it. A sucrose solution was added into the silkworm intestine and tied with a thread so that the solution did not leak. Then, it was incubated in PBS, and glucose transported outside the intestine was quantified. “Experiment scheme of sugar transfer evaluation system in silkworm intestine in vitro” is shown in FIG. 7a.
  • sucrose solution in a silkworm intestine or a sample obtained by adding acarbose (40 mg / mL) to a sucrose solution was placed in the silkworm intestine and incubated at 27 ° C. Concentration was measured. The result is shown in FIG. In FIG. 7b, the vertical axis indicates the glucose concentration (mg / dL). The horizontal axis indicates the incubation time (minutes).
  • Example 6 Mechanism analysis of postprandial hyperglycemia suppression after sucrose consumption by lactic acid bacteria 0831-07> Using the experimental scheme constructed in Example 5, a sucrose solution in a silkworm intestine, or a sample obtained by adding lactic acid bacteria 0831-07 strain (250 mg (wet weight) / mL) to a sucrose solution was placed in the silkworm intestine. Incubation was performed at 0 ° C., and the glucose concentration of the extra-intestinal fluid was measured over time. The result is shown in FIG. In FIG. 8a, the vertical axis indicates the glucose concentration (mg / dL). The horizontal axis indicates the incubation time (minutes).
  • sucrose solution in a silkworm intestinal tract or a sample obtained by adding lactic acid bacteria 0831-07 strain (31 mg, 63 mg, 125 mg, 250 mg (wet weight) / mL) to a sucrose solution is placed in the silkworm intestinal tract and incubated at 27 ° C.
  • the glucose concentration in the extraintestinal fluid 60 minutes later was measured.
  • the result is shown in FIG.
  • the vertical axis indicates the glucose concentration (mg / dL).
  • the horizontal axis indicates the amount (mg / mL) of lactic acid bacteria 0831-07 (# Ef-1) strain.
  • N 3 to 5 per group.
  • sucrose solution in the intestinal tract of silkworm, or heat-treated bacterial fraction of lactic acid bacteria 0831-07 strain autoclaved in sucrose solution (Heat-killed # Ef-1) (31 mg, 63 mg, 125 mg, 250 mg (wet weight) / mL) was added to the silkworm intestinal tract, incubated at 27 ° C., and the glucose concentration of the extra-intestinal fluid 60 minutes later was measured.
  • the result is shown in FIG. In FIG. 8d, the vertical axis indicates the glucose concentration (mg / dL).
  • FIG. 9a a glucose solution in the intestinal tract of a silkworm, or a sample obtained by adding lactic acid bacteria 0831-07 strain (250 mg (wet weight) / mL) to a glucose solution is placed in the intestinal tract of a silkworm and incubated at 27 ° C. The glucose concentration of the external liquid was measured. The result is shown in FIG. 9a.
  • the vertical axis indicates the glucose concentration (mg / dL).
  • the horizontal axis indicates the incubation time (minutes).
  • Heat-killed # Ef-1 250 mg (wet weight) / mL
  • a lactic acid bacterium 0831-07 strain that was autoclaved
  • Example 7 ⁇ Inhibition of silkworm or rat intestinal ⁇ -glycosidase activity by lactic acid bacteria 0831-07>
  • ⁇ -Glycosidase was measured in the same manner as in Example 2. A normal diet was given to silkworms on the first day of 5 years of age for one day.
  • ⁇ -glycosidase activity was measured by adding a cell disruption fraction obtained by disrupting the intestinal tract of the silkworm by ultrasonic treatment and a heat-treated cell fraction (Heat-killed # Ef-1) of lactic acid bacteria 0831-07.
  • the vertical axis indicates the concentration (nmol) of “Produced pNP”.
  • a higher concentration (nmol) of “Produced pNP” indicates higher ⁇ -glycosidase activity.
  • the horizontal axis indicates the amount (mg / mL) of heat-treated cell fraction (Heat-killed # Ef-1) of lactic acid bacteria 0831-07.
  • the heat-treated fraction of the lactic acid bacterium 0831-07 also inhibited ⁇ -glycosidase activity in rat intestinal crushed fluid in a dose-dependent manner. Therefore, the heat-treated fraction of lactic acid bacteria 0831-07 inhibits ⁇ -glycosidase activity in the intestinal tracts of silkworms and mammals, and sucrose in the intestinal tract is decomposed into glucose and fructose, and they are transferred outside the intestine. It was suggested to be inhibited.
  • Example 8 ⁇ Inhibitory effect on glucose uptake by lactic acid bacteria 0831-07> Caco-2 cells are cultured cells derived from the human intestine, and a method for quantifying glucose uptake of these cells has been established (Yamabe N., et al., Am J Physiol. Endocrinol. Metab., 2015). . Using this method, the inhibitory effect on glucose uptake of Caco-2 cells by lactic acid bacteria 0831-07 was verified.
  • FIG. 11C A schematic diagram showing the postprandial hyperglycemia inhibitory effect of lactic acid bacteria 0831-07 strain is shown in FIG. 11C.
  • “Lumen” is “lumen”
  • “Degradation” is “degradation”
  • “Transport” is “transport”
  • “Outside of intestine” is “extraintestinal”
  • “Sucrose” is “sucrose”
  • “Glucose” “Represents“ glucose ”,“ Fructose ”represents“ fructose ”, and“ E. faecalis (# Ef-1) ”represents“ lactic acid bacteria 0831-07 ”.
  • Example 9 ⁇ Inhibitory effect of lactic acid bacteria 0831-07 strain on increase in blood glucose level due to human sucrose intake> It was examined whether lactic acid bacteria 0831-07 strain has an effect of suppressing an increase in blood glucose level after sucrose intake in humans.
  • a sucrose tolerance test was carried out on 14 healthy people in a live cell suspension intake group, a heat treated cell suspension intake group, and a non-intake group. The subject took 50 mL of the sample suspended in physiological saline 15 minutes before sucrose loading. Thereafter, the subject drank 150 mL of a 50% (w / v) aqueous sucrose solution. The blood glucose levels of the subjects at 0, 15, 30, 45, 60, 90, and 120 minutes after sucrose loading were compared between the groups.
  • FIG. 12A shows the experimental schedule of this example.
  • the sucrose tolerance test in the heat-treated bacterial cell suspension intake group was performed. Seven days later, a sucrose tolerance test was conducted in the non-ingestion group. Furthermore, the sucrose tolerance test in the viable cell suspension ingestion group was carried out 7 days later.
  • FIG. 12B shows the blood glucose levels in the group ingesting viable cell suspension (Viable # Ef-1), heat-treated cell suspension ingestion group (Heat-treated # Ef-1), and non-ingestion group (Control). It is the graph which showed the value for every time after sucrose load.
  • FIG. 12C shows the results of a sucrose load test in a viable cell suspension intake group (Viable # Ef-1), a heat treated cell suspension intake group (Heat-treated # Ef-1), and a non-intake group (Control). Indicates.
  • the vertical axis represents blood glucose level
  • yogurt prepared from lactic acid bacteria 0831-07 (lactic acid bacteria # Ef-1) strain using a silkworm evaluation system suppresses postprandial hyperglycemia due to human sucrose consumption. Therefore, the lactic acid bacterium 0831-07 obtained in this example is a functional lactic acid bacterium that suppresses an increase in blood glucose level due to ingestion of sucrose (sucrose). Yogurt produced using the lactic acid bacteria is expected to make the diet of obese and diabetic patients and their reserve humans more effective.
  • the lactic acid bacterium 0831-07 strain was found to have an activity of inhibiting the intestinal ⁇ -glycosidase and an activity of inhibiting the transport of glucose from the inside of the intestine to the outside of the intestine. It was suggested that these activities possessed by the bacterium led to suppression of an increase in blood sugar level of silkworms fed with sucrose.
  • the heat-treated cells of the lactic acid bacterium 0831-07 strain retained the activity of suppressing postprandial hyperglycemia due to sucrose consumption by silkworms.
  • This fraction inhibited ⁇ -glycosidase activity, an enzyme that degrades sucrose in the silkworm intestine, but did not inhibit intestinal glucose transport. Therefore, it was suggested that inhibition of ⁇ -glycosidase activity was the main factor in the effect of lactic acid bacteria 0831-07 strain to suppress the increase in blood sugar of silkworms ingested with sucrose.
  • novel lactic acid bacteria and the processed product of the present invention have an action of suppressing postprandial hyperglycemia due to sucrose intake, and further have an effect of preventing and treating diabetes. Therefore, it is possible to provide a drug or food / beverage product containing a hypoglycemic agent using the lactic acid bacteria of the present invention, and it can be widely used in the pharmaceutical industry, the food industry and the like.
  • SEQ ID NO: 1 is the base sequence corresponding to almost the entire length of 16S rDNA of an unknown strain belonging to the genus Enterococcus.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)

Abstract

本発明の乳酸菌は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）における受託番号がＮＩＴＥ　ＢＰ－０２３０９であるエンテロコッカス（Enterococcus）属に属する乳酸菌である。本発明の乳酸菌は、α－グリコシダーゼ阻害活性を有することでスクロース摂取による血糖上昇を抑制する。また、本発明のα－グリコシダーゼ阻害剤及び血糖低下剤は、該乳酸菌、該乳酸菌の死菌又は該乳酸菌の処理物を有効成分とすることを特徴とする。

Description

乳酸菌、該乳酸菌由来の血糖低下剤、糖尿病治療薬、及び飲食品
　本発明は、新規乳酸菌、該新規乳酸菌の生菌、死菌若しくは処理物を有効成分とするα－グリコシダーゼ阻害剤及び血糖低下剤、並びに、該血糖低下剤を含有する糖尿病予防治療薬及び飲食品に関する。
　現在、過剰なカロリー摂取による肥満やその後に発症する糖尿病等の生活習慣病の発症が問題となっている。日頃から血糖値が上昇しないように注意することは、生活習慣病の発症を抑制する上で大変重要であるとされている。生活習慣病の予防のためには、食事療法や運動療法が効果的とされている。食事療法においては、食後の血糖値の上昇が起こらないように摂取カロリーが制限される。
　しかし、そのような食事療法を継続することは、患者にとって困難である場合が少なくないので、血糖値の上昇を抑制する物質を含む食品の開発が継続的な食事療法を実施する上で有効であると考えられる。
　スクロースは、様々な食品中に添加される主要な甘味料の１つである。スクロースは、腸管内でα－グリコシダーゼによりグルコースとフルクトースに分解され、それらが腸管から吸収され、血糖値の上昇を導く。α－グリコシダーゼの阻害剤であるアカルボースやボグリボースは、食後血糖値の上昇を阻害する効果があり、糖尿病治療薬として利用されている。よって、α－グリコシダーゼの阻害効果を有する物質を含む食品は、スクロースの過剰な摂食による食後血糖の上昇を抑制すると期待される。
　乳酸菌は、ＭＲＳ寒天培地で生育し、乳酸を産生するグラム陽性の細菌である。ある種の乳酸菌は、牛乳中で増殖し、ヨーグルトの製造に利用される。α－グリコシダーゼ阻害剤であるアカルボースは、Actinoplanes sp. SE50/110というグラム陽性細菌が生産する（非特許文献１）。また、乳酸菌の一種であるLactobacillus rhamnosusを、スクロースを摂食させたマウスに投与すると、１時間後における血中のグルコース濃度の上昇が抑えられることが報告されている（非特許文献２）。更に、ある種の乳酸菌の熱処理菌体画分にα－グリコシダーゼ阻害活性があることも報告されている（非特許文献３）。
　また、従来、食後高血糖を抑制する乳酸菌の評価には、マウスやラットなどの哺乳動物が用いられてきた。しかし、多数の哺乳動物を実験に供することに対しては、コストばかりでなく動物愛護の観点からの問題が指摘されている。
Schwientek P et al., BMC Genomics, 2012 Honda K et al., J. Clin. Biochem. Nutr., 2012 Panwar H et al., Eur J Nutr, 2014
　本発明の課題は、高い血糖低下作用を有する新規な乳酸菌を提供することであり、更に、該乳酸菌又は該乳酸菌の死菌若しくは処理物を有効成分とする血糖低下剤や、該乳酸菌又は該乳酸菌に由来する血糖低下剤を含有する飲食品を提供することにある。
　また、新規な乳酸菌に由来する物質を有効成分とする糖尿病予防治療薬を提供することにある。
　本発明者らは、カイコを用いてα－グリコシダーゼ阻害活性を有する物質の探索法を見出した。カイコは、マウスなどの哺乳動物に比べ狭いスペースで多数の個体を飼育することが可能であり、倫理的な問題が小さいので、カイコを用いた評価系を用いることにより、スクロース摂食による高血糖を抑制する効果を有する機能性乳酸菌を探索できることを見出した。
　また、本発明者らは、カイコを用いたin vivo評価方法を用いて、スクロースの摂食による高血糖を抑制する乳酸菌を同定した。該乳酸菌株を用いて製造したヨーグルトは、ヒトのスクロース負荷試験において、血糖値の上昇を抑制する効果を示した。また、上記カイコの評価方法を用いて評価した結果、該乳酸菌は食後高血糖を抑制し、糖尿病の発症を低減させる効果を示すことを見出した。
　更に、上記の血糖低下作用を有する乳酸菌は、その性状の分析や１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列等の解析結果、エンテロコッカス（Enterococcus）属に属する新規乳酸菌株（以下、「乳酸菌０８３１－０７」又は「乳酸菌＃Ｅｆ－１」と略記する場合がある）であることも判明し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）における受託番号がＮＩＴＥ　ＢＰ－０２３０９であるエンテロコッカス（Enterococcus）属に属する乳酸菌、又は、その自然的若しくは人工的に変異した乳酸菌であって血糖低下作用を有する乳酸菌を提供するものである。
　更に、上記乳酸菌の単離又は精製された乳酸菌を提供するものである。
　また、本発明は、前記乳酸菌であって、α－グリコシダーゼ阻害活性を有することでスクロース摂取による血糖上昇を抑制する用途に用いられる乳酸菌を提供するものである。
　また、本発明は、前記乳酸菌、該乳酸菌の死菌又は該乳酸菌の処理物を有効成分とするα－グリコシダーゼ阻害剤であって、
　該乳酸菌の処理物は、該乳酸菌の、培養物、濃縮物、ペースト化物、乾燥物、液状化物、希釈物、破砕物、殺菌加工物、及び、培養物からの抽出物よりなる群から選ばれる少なくとも１つの処理物であることを特徴とするα－グリコシダーゼ阻害剤を提供するものである。
　また、本発明は、前記の乳酸菌、該乳酸菌の死菌、又は、該乳酸菌の処理物を有効成分とする血糖低下剤であって、
　上記乳酸菌の処理物は、乳酸菌の培養物；濃縮物；ペースト化物；噴霧乾燥物、凍結乾燥物、真空乾燥物、ドラム乾燥物等の乾燥物；液状化物；希釈物；破砕物；殺菌加工物；及び；該培養物からの抽出物よりなる群から選ばれる少なくとも１つの処理物であることを特徴とする血糖低下剤を提供するものである。
　また、本発明は、前記血糖低下剤を有効成分として含有することを特徴とする糖尿病予防治療薬を提供するものである。
　また、本発明は、前記の乳酸菌、又は前記の血糖低下剤を含有する飲食品を提供するものである。
　本発明によれば、極めて高い血糖低下作用を有する新規の乳酸菌を提供することができる。特に、スクロース摂取による血糖上昇を抑制する作用を有する新規の乳酸菌を提供することができる。
　また、該新規の乳酸菌、該乳酸菌の死菌、又は、該乳酸菌の処理物を有効成分とする極めて高い血糖低下作用を有する新規の血糖低下剤を提供し、該乳酸菌又は該血糖低下剤を含有する（に由来する）血糖低下作用に優れた飲食品を提供することができる。
　更に、本発明によれば、前記血糖低下剤を有効成分として含有する糖尿病予防治療薬を提供することができ、該糖尿病予防治療薬は、経口投与で糖尿病を予防又は治療することができる。
　本発明の乳酸菌は、一般飲食品、健康食品、薬剤、醗酵飲食品、プロバイオティクスの生産等に利用できるばかりでなく、血糖上昇を抑制することによる病気の予防・治療への利用がなされる。醗酵飲食品としては、醗酵乳、乳酸菌飲料、ヨーグルト、漬物、漬物製造用乳酸菌スターター等としての用途に特に好適である。また、酸に強いので、胃で分解されず小腸にまで届くという特徴もある。
乳酸菌の添加による、スクロース含有餌の給餌によるカイコの体液中のグルコース濃度の上昇の阻害効果を示すグラフである。 乳酸菌＃Ｅｆ－１株の添加による、スクロース含有餌の給餌によるカイコの体液中のグルコース濃度の上昇の阻害効果を示すグラフである。 乳酸菌＃Ｅｆ－１株の添加による、スクロース又はグルコース含有餌の給餌によるカイコの体液中のグルコース濃度の上昇の阻害効果を示すグラフである。 乳酸菌＃Ｅｆ－１株の熱処理菌体の添加による、スクロース含有餌の給餌によるカイコの体液中のグルコース濃度の上昇の阻害効果を示すグラフである。 乳酸菌＃Ｅｆ－１株で作製したヨーグルトの摂食によるスクロース負荷試験における、ヒトのグルコース濃度の上昇の阻害効果を示すグラフである。 乳酸菌（＃Ｅｆ－１株）の死菌添加による、スクロース含有餌（ａ）又はグルコース含有餌（ｂ）の給餌によるカイコの体液中のグルコース濃度の上昇の阻害効果を示すグラフである。 （ａ）in vitroでのカイコ腸管における糖移行評価系の実験スキームを示す図である。（ｂ）アカルボースによる、摘出腸管内から腸管外へのスクロース輸送の阻害効果を示すグラフである。 乳酸菌（＃Ｅｆ－１株）の添加による、摘出腸管内から腸管外へのスクロース輸送の阻害効果を示すグラフである。（ａ）乳酸菌（＃Ｅｆ－１株）添加による、カイコの腸管外液中のグルコース濃度上昇の阻害効果を示すグラフである。（ｂ）乳酸菌（＃Ｅｆ－１株）添加量による、カイコの腸管外液中のグルコース濃度上昇の阻害効果を示すグラフである。（ｃ）乳酸菌（＃Ｅｆ－１株）の熱処理菌体の添加による、カイコの腸管外液中のグルコース濃度上昇の阻害効果を示すグラフである。（ｄ）乳酸菌（＃Ｅｆ－１株）の熱処理菌体の添加量による、カイコの腸管外液中のグルコース濃度上昇の阻害効果を示すグラフである。 乳酸菌（＃Ｅｆ－１株）の生菌添加による、グルコース輸送の阻害効果を示すグラフである。（ａ）乳酸菌（＃Ｅｆ－１株）の生菌添加による、カイコの腸管外液中のグルコース濃度上昇の阻害効果を示すグラフである。（ｂ）乳酸菌（＃Ｅｆ－１株）の熱処理菌体の添加による、カイコの腸管外液中のグルコース濃度上昇の阻害効果を示すグラフである。 （ａ）乳酸菌（＃Ｅｆ－１株）の添加による、カイコ腸管のα－グリコシダーゼ活性阻害効果を示すグラフである。（ｂ）乳酸菌（＃Ｅｆ－１株）の添加による、ラット腸管のα－グリコシダーゼ活性阻害効果を示すグラフである。 （ａ）乳酸菌（＃Ｅｆ－１株）の生菌を加えた、Ｃａｃｏ－２細胞における蛍光の取り込みを測定した結果を示すグラフである。（ｂ）乳酸菌（＃Ｅｆ－１株）の生菌と熱処理菌体画分を加えてＣａｃｏ－２細胞における蛍光の取り込みを測定した結果を示すグラフである。（ｃ）乳酸菌（＃Ｅｆ－１株）による食後高血糖抑制効果を示す模式図である。 乳酸菌(＃Ｅｆ－１株)の摂食によるヒトでのショ糖負荷試験のスケジュールを示す模式図である。 生菌懸濁液摂取群、熱処理菌体懸濁液摂取群、非摂取群における血糖値をショ糖負荷後の時間ごとに示したグラフである。 生菌懸濁液摂取群、熱処理菌体懸濁液摂取群、非摂取群におけるショ糖付加試験の結果を示すグラフである。
　以下、本発明について説明するが、本発明は、以下の具体的態様に限定されるものではなく、技術的思想の範囲内で任意に変形することができる。
＜乳酸菌＞
　本発明は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）における受託番号がＮＩＴＥ　ＢＰ－０２３０９であるエンテロコッカス（Enterococcus）属に属する乳酸菌、又は、その自然的若しくは人工的に変異した乳酸菌であって血糖低下作用を有する乳酸菌である。
　以下、このエンテロコッカス（Enterococcus）属に属する新規乳酸菌株エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）0831-07（以下、「乳酸菌０８３１－０７」と略記する場合がある）について詳述する。
　本発明の乳酸菌０８３１－０７は、ムカデ（Chilopod）を分離源として初めて分離された。
　グラム染色結果：陽性
　菌体の形状：球形
　好気／嫌気：嫌気
　乳酸生成能：あり
　生理学的性質：本発明の乳酸菌０８３１－０７の生理学的、化学分類学的性質は以下の通りである。
（１）カタラーゼ：－
（２）酸性フォスファターゼ：＋
（３）アルカリフォスファターゼ：＋
（４）ナフトール－ＡＳ－ＢＩ－フォスフォヒドロラーゼ：＋
（５）エステラーゼ（Ｃ４）：＋
（６）α－ガラクトシダーゼ：－
（７）エステラーゼリパーゼ（Ｃ８）：＋
（８）β－ガラクトシダーゼ：－
（９）リパーゼ（Ｃ１４）：－
（１０）β－グルクロニダーゼ：－
（１１）ロイシンアリルアミダーゼ：＋
（１２）α－グルコシダーゼ：＋
（１３）バリンアリルアミダーゼ：－
（１４）β－グルコシダーゼ：－
（１５）シスチンアリルアミダーゼ：－
（１６）Ｎ－アセチル－β－グルコサミニダーゼ：－
（１７）トリプシン：－
（１８）α－マンノシダーゼ：－
（１９）α－キモトリプシン：＋
（２０）α－フコシダーゼ：－
（２１）下記の糖類等からの酸及びガスの生成能
グリセロール（Glycerol）：＋
エリトリトール（Erythritol）：－
Ｄ－アラビノース（D-Arabinose）：－
Ｌ－アラビノース（L-Arabinose）：－
Ｄ－リボース（D-Ribose）：＋
Ｄ－キシロース（D-Xylose）：－
Ｌ－キシロース（L-Xylose）：－
Ｄ－アドニトール（D-Adonitol）：－
β－メチル－Ｄ－キシロピラノサイド（β-Methyl-D-xylopyranoside）：－
Ｄ－ガラクトース（D-Galactose）：＋
Ｄ－グルコース（D-Glucose）：＋
Ｄ－フルクトース（D-Fructose）：＋
Ｄ－マンノース（D-Mannose）：＋
Ｌ－ソルボース（L-Sorbose）：－
Ｌ－ラムノース（L-Rhamnose）：－
ズルシトール（Dulcitol）：－
イノシトール（Inositol）：＋
Ｄ－マンニトール（D-Mannitol）：＋
Ｄ－ソルビトール（Sorbitol）：＋
α－メチル－Ｄ－マンノピラノサイド（α-Methyl-D-mannopyranoside）：－
α－メチル－Ｄ－グルコピラノサイド（α-Methyl-D-glucopyranoside）：－
Ｎ－アセチルグルコサミン（N-Acetyl glucosamine）：＋
アミグダリン（Amygdalin）：＋
アルブチン（Arbutin）：＋
エスクリンクエン酸第二鉄（Esculin ferric citrate）：＋
サリシン（Salicin）：＋
Ｄ－セロビオース（D-Cellobiose）：＋
Ｄ－マルトース（D-Maltose）：＋
Ｄ－ラクトース（Lactose）：－
Ｄ－メリビオース（D-Melibiose)：＋
Ｄ－スクロース（D-Sucrose）：＋
Ｄ－トレハロース（D-Trehalose）：＋
インスリン（Insulin）：－
Ｄ－メレジトース（D-Melezitose）：＋
Ｄ－ラフィノース（D-Raffinose）：－
スターチ（Starch）：－
グリコーゲン（Glycogen）：－
キシリトール（Xylitol）：－
ゲンチオビオース（Gentiobiose）：＋
Ｄ－ツラノース（D-Turanose）：＋
Ｄ－リキソース（D-Lyxose）：－
Ｄ－タガトース（D-Tagatose）：＋
Ｄ－フコース（D-Fucose）：－
Ｌ－フコース（L-Fucose）：－
Ｄ－アラビトール（D-Arabitol）：－
Ｌ－アラビトール（L-Arabitol）：－
グルコネート（Gluconate）：＋
２－ケト－グルコネート（2-Keto-gluconate）：－
５－ケト－グルコネート（5-Keto-gluconate）：－
　分子生物学的解析結果：分子生物学的な系統分類の指標として用いられている１６ＳｒＤＮＡに関する乳酸菌０８３１－０７の解析結果は、添付した配列表の通りである。
　すなわち、乳酸菌０８３１－０７のゲノムＤＮＡから、ＰＣＲにより、１６ＳｒＤＮＡ領域の塩基配列を増幅し、シーケンサーによる解析を行った結果、１６ＳｒＤＮＡのほぼ全長に当たる塩基配列が見出された。
　この塩基配列をＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ解析で相同性検索を行ったところ、乳酸菌０８３１－０７の１６ＳｒＤＮＡ領域の塩基配列は、エンテロコッカス属であるEnterococcus faecalis V583株の塩基配列（登録番号：NR_074637.1）と相同性９９％を示したので、乳酸菌０８３１－０７は、Enterococcus faecalisに属するものである。
　しかしながら、１６ＳｒＤＮＡ領域だけを比較したときですら完全には一致していないので、本発明の乳酸菌０８３１－０７は、上記の株とは異なる乳酸菌株である。
　前記の乳酸菌０８３１－０７の生理学的・化学分類学的性質を、バージース・マニュアル・オブ・システマティックバクテリオロジー（Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology，vol.3 1989）による分類及びその他の文献の記載内容に照らし合わせ、更に、上記１６ＳｒＤＮＡ解析の結果を考慮して判断した結果、本発明の「乳酸菌０８３１－０７」は、エンテロコッカス（Enterococcus）属に属する新規の微生物である。
　また、乳酸菌０８３１－０７の１６ＳｒＤＮＡ領域の塩基配列に一致する１６ＳｒＤＮＡ領域の塩基配列を有する微生物が存在しないこと、エンテロコッカス属に属する既知の株等と比べて高い血糖低下作用を示すこと等を含め総合的に検討した結果、乳酸菌０８３１－０７は単離された新規な微生物株であると判断した。
　乳酸菌０８３１－０７は、千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室、独立行政法人製品評価技術基盤機構（Natural Institute of Technology and Evaluation；以下、「ＮＩＴＥ」と略記する）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に国内寄託され、受託番号：ＮＩＴＥ　Ｐ－０２３０９（寄託日：２０１６年７月２６日）として受託された微生物である。
　乳酸菌０８３１－０７は、その後、千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、原寄託申請書を提出して、国内寄託（原寄託日：２０１６年７月２６日）から、ブタペスト条約に基づく寄託への移管申請を行い（移管日（国際寄託日）：２０１７年５月１６日）、生存が証明され、ブタペスト条約に基づく寄託（国際寄託）への移管申請が受領された結果、受託番号「ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２３０９」を受けているものである。
　細菌の一般的な性状として、その菌株としての性質は変異し易いため、乳酸菌０８３１－０７は、先に示した生理学的性状の範囲内に留まらない可能性も有している。また、かかる「変異」には、自然的な変異と人工的な変異の両方を含むことは言うまでもない。
　以下に、乳酸菌０８３１－０７の培養方法について記載する。乳酸菌０８３１－０７の培養方法は、エンテロコッカス属の微生物に対して行われる一般的な培養方法に準じて行えばよい。
　培養は嫌気条件下で行うことが好ましい。培地中の炭素源としては、例えば、Ｄ－リボース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－グルコース、Ｄ－フルクトース、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、Ｎ－アセチルグルコサミン、アミグダリン、アルブチン、エスクリン、サリシン、Ｄ－セロビオース、Ｄ－マルトース、シュクロース、Ｄ－トレハロース、ゲンチオビオース、糖蜜、水飴、油脂類等の有機炭素化合物が用いられ、窒素源としては、肉エキス、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、胚芽、大豆粉、尿素、アミノ酸、アンモニウム塩等の有機・無機窒素化合物を用いることができる。
　また、塩類は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩、鉄塩、銅塩、亜鉛塩、コバルト塩等の無機塩類を必要に応じて適宜添加する。更に、ビオチン、ビタミンＢ１、シスチン、オレイン酸メチル、ラード油等の生育促進物質を添加することが、目的物の産生量を増加させる点で好ましい。
　また、シリコン油、界面活性剤等の消泡剤を添加してもよい。調製済みの培地としては、例えば、ＭＲＳ培地、ＧＡＭ培地等を用いることが好ましい。
　培養条件は、先に記したようにエンテロコッカス属の微生物に対して行われる一般的な培養条件に準じて行えばよい。液体培養法であれば静置培養が望ましい。小規模であれば蓋付きガラス瓶による静置培養法を用いてもよい。
　培養温度は、２５℃～４３℃間に保つことが好ましく、３０℃～４２℃で行うことがより好ましい。培養ｐＨは７付近で行うことが好ましい。培養期間は、用いた培地組成、培養温度等により変動するファクターであるが、乳酸菌０８３１－０７の場合、好ましくは１２～７２時間、より好ましくは２４～４８時間で充分な量の目的物を確保することができる。
　培養して得られたコロニーをピックアップし、再度培地上でシングルコロニー形成を行うことも好ましい。
　本発明の新規乳酸菌０８３１－０７は、α－グリコシダーゼ阻害活性を有することでスクロース摂取による血糖上昇を抑制する用途に用いられる乳酸菌であることが好ましい。
＜α－グルコシダーゼ阻害剤＞
　本発明の新規乳酸菌０８３１－０７は、該乳酸菌自身として、また、該乳酸菌の自然的若しくは人工的に変異した乳酸菌として、α－グルコシダーゼ阻害活性を有する。
　「乳酸菌０８３１－０７又はその自然的若しくは人工的に変異した乳酸菌」、「該乳酸菌の死菌」、「該乳酸菌の処理物」は、何れもα－グルコシダーゼ阻害活性を有する。
　ここで、「乳酸菌の処理物」としては、乳酸菌の、培養物、濃縮物、ペースト化物、乾燥物、液状化物、希釈物、破砕物、殺菌加工物、及び、培養物からの抽出物よりなる群から選ばれる少なくとも１つの処理物が挙げられる。ここで、「乾燥物」としては、噴霧乾燥物、凍結乾燥物、真空乾燥物、ドラム乾燥物等が挙げられる。
　本発明の別の態様は、「前記した本発明の乳酸菌（乳酸菌０８３１－０７又はその自然的若しくは人工的に変異した乳酸菌）、該乳酸菌の死菌又は該乳酸菌の処理物を有効成分とするα－グルコシダーゼ阻害剤であって、該乳酸菌の処理物は、乳酸菌の、培養物、濃縮物、ペースト化物、乾燥物、液状化物、希釈物、破砕物、殺菌加工物、及び、培養物からの抽出物よりなる群から選ばれる少なくとも１つの処理物であることを特徴とするα－グルコシダーゼ阻害剤」である。
　本発明のα－グルコシダーゼ阻害剤は、前記の本発明の乳酸菌、該乳酸菌の死菌又は該乳酸菌の処理物を種々の状態で含むことができる。例えば、懸濁液、乳酸菌体、培養上清液、培地成分を含む状態等が挙げられる。
　乳酸菌としては、生菌体、湿潤菌、乾燥菌等が適宜使用可能である。また、殺菌、すなわち、加熱殺菌処理、放射線殺菌処理、破砕処理等を施した死菌であってもよい。
　本発明のα－グルコシダーゼ阻害剤中の有効成分である、乳酸菌、該乳酸菌の死菌、該乳酸菌の処理物の、α－グルコシダーゼ阻害剤全体に対する含有量は、特に制限がなく、目的に応じて適宜選択することができるが、血糖低下剤全体を１００質量部としたときに、「乳酸菌、該乳酸菌の死菌、該乳酸菌の処理物の合計量」として、０．００１～１００質量部で含有されることが好ましく、より好ましくは０．０１～９９質量部、特に好ましくは０．１～９５質量部、更に好ましくは１～９０質量部で含有される。
　また、前記有効成分は、何れか１種を単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。２種以上を併用する場合の、前記α－グルコシダーゼ阻害剤中の各々の有効成分の含有比については、特に制限はなく目的に応じて適宜選択することができる。
　本発明のα－グルコシダーゼ阻害剤は、前記乳酸菌、前記乳酸菌の死菌又は前記乳酸菌の処理物を有効成分として含有するが、それら有効成分に加えて、「その他の成分」を含有することができる。
　前記α－グルコシダーゼ阻害剤における、上記「その他の成分」としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薬学的に許容され得る担体等が挙げられる。
　かかる担体としては、特に制限はなく、例えば、後述する剤型等に応じて適宜選択される。また、α－グルコシダーゼ阻害剤中の「その他の成分」の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
＜血糖低下剤＞
　本発明の新規乳酸菌０８３１－０７は、該乳酸菌自身として、また、該乳酸菌の自然的若しくは人工的に変異した乳酸菌として、血糖低下作用を有する。
　「乳酸菌０８３１－０７又はその自然的若しくは人工的に変異した乳酸菌」、「該乳酸菌の死菌」、「該乳酸菌の処理物」は、何れも血糖低下作用を有する。
　ここで、「乳酸菌の処理物」としては、乳酸菌の、培養物、濃縮物、ペースト化物、乾燥物、液状化物、希釈物、破砕物、殺菌加工物、及び、培養物からの抽出物よりなる群から選ばれる少なくとも１つの処理物が挙げられる。ここで、「乾燥物」としては、噴霧乾燥物、凍結乾燥物、真空乾燥物、ドラム乾燥物等が挙げられる。
　本発明の別の態様は、「前記した本発明の乳酸菌（乳酸菌０８３１－０７又はその自然的若しくは人工的に変異した乳酸菌）、該乳酸菌の死菌又は該乳酸菌の処理物を有効成分とする血糖低下剤であって、該乳酸菌の処理物は、乳酸菌の、培養物、濃縮物、ペースト化物、乾燥物、液状化物、希釈物、破砕物、殺菌加工物、及び、培養物からの抽出物よりなる群から選ばれる少なくとも１つの処理物であることを特徴とする血糖低下剤」である。
　本発明の血糖低下剤は、前記の本発明の乳酸菌、該乳酸菌の死菌又は該乳酸菌の処理物を種々の状態で含むことができる。例えば、懸濁液、乳酸菌体、培養上清液、培地成分を含む状態等が挙げられる。
　乳酸菌としては、生菌体、湿潤菌、乾燥菌等が適宜使用可能である。また、殺菌、すなわち、加熱殺菌処理、放射線殺菌処理、破砕処理等を施した死菌であってもよい。
　本発明の血糖低下剤中の有効成分である、乳酸菌、該乳酸菌の死菌、該乳酸菌の処理物の、血糖低下剤全体に対する含有量は、特に制限がなく、目的に応じて適宜選択することができるが、血糖低下剤全体を１００質量部としたときに、「乳酸菌、該乳酸菌の死菌、該乳酸菌の処理物の合計量」として、０．００１～１００質量部で含有されることが好ましく、より好ましくは０．０１～９９質量部、特に好ましくは０．１～９５質量部、更に好ましくは１～９０質量部で含有される。
　また、前記有効成分は、何れか１種を単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。２種以上を併用する場合の、前記血糖低下剤中の各々の有効成分の含有比については、特に制限はなく目的に応じて適宜選択することができる。
　本発明の血糖低下剤は、前記乳酸菌、前記乳酸菌の死菌又は前記乳酸菌の処理物を有効成分として含有するが、それら有効成分に加えて、「その他の成分」を含有することができる。
　前記血糖低下剤における、上記「その他の成分」としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薬学的に許容され得る担体等が挙げられる。
　かかる担体としては、特に制限はなく、例えば、後述する剤型等に応じて適宜選択される。また、血糖低下剤中の「その他の成分」の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
＜糖尿病予防治療薬＞
　前記した本発明の乳酸菌、該乳酸菌の死菌、該乳酸菌の処理物は、血糖低下作用を有すると共に又は有するが故に糖尿病予防治療薬として有用であり、特に、経口投与用の糖尿病予防治療薬として有用である。
　従って、本発明の他の態様は、前記の血糖低下剤を有効成分として含有することを特徴とする糖尿病予防治療薬である。
＜医薬品；飲食品；健康食品等＞
　本発明の乳酸菌や該乳酸菌に由来する本発明の血糖低下剤は、医薬品、医薬部外品、一般飲食品、健康食品、粉ミルク等の規格を有する飲食品等に配合することが可能であり、それらの形態によらず様々な医薬品、飲食品等に応用できる。
　中でも、前記した本発明の乳酸菌を用いて醗酵する工程を用いて製造された飲食品、更にその中でも醗酵乳は、乳酸菌の通常の効果や、本発明に特有の前記効果を発揮し易いために好ましい。
　本発明のα－グルコシダーゼ阻害剤、血糖低下剤や糖尿病予防治療薬の剤型としては、特に制限はなく、例えば、後述するような所望の投与方法に応じて適宜選択することができる。
　具体的には、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、ハードカプセル剤、ソフトカプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）、注射剤（溶剤、懸濁剤等）、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散布剤等が挙げられる。
　前記経口固形剤としては、例えば、前記有効成分に、賦形剤、更には必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
　該賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸等が挙げられる。
　前記結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。
　該崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等が挙げられる。
　該滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール等が挙げられる。
　該着色剤としては、例えば、酸化チタン、酸化鉄等が挙げられる。
　前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。
　前記経口液剤としては、例えば、前記有効成分に、矯味・矯臭剤、緩衝剤、安定化剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
　該矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチン等が挙げられる。
　前記注射剤としては、例えば、前記有効成分に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用等の注射剤を製造することができる。
　該ｐＨ調節剤及び該緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等が挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸等が挙げられる。前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖等が挙げられる。前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等が挙げられる。
　前記軟膏剤としては、例えば、前記有効成分に、公知の基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等を配合し、常法により混合し、製造することができる。
　該基剤としては、例えば、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィン等が挙げられる。前記保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等が挙げられる。
　前記貼付剤としては、例えば、公知の支持体に前記軟膏剤としてのクリーム剤、ゲル剤、ペースト剤等を、常法により塗布し、製造することができる。前記支持体としては、例えば、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布、軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン等のフィルム、発泡体シート等が挙げられる。
　本発明のα－グルコシダーゼ阻害剤、血糖低下剤や糖尿病予防治療薬は、例えば、血糖低下を必要とする個体、細菌等に対してあたかも獲得免疫を得ようとする個体等に好適に使用できる。
　具体的には、例えば、健康維持や疲労回復を必要とする個体；癌や生活習慣病の予防や治療を必要とする個体；細菌、真菌、ウイルス等に感染した個体；等に投与することにより使用することができる。
　本発明のα－グルコシダーゼ阻害剤、血糖低下剤や糖尿病予防治療薬の投与対象動物としては、特に制限はないが、例えば、ヒト；マウス、ラット等の実験動物；サル；ウマ；ウシ、ブタ、ヤギ、ニワトリ等の家畜；ネコ、イヌ等のペット；等が挙げられる。
　また、前記α－グルコシダーゼ阻害剤、血糖低下剤又は前記糖尿病予防治療薬の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記した剤型等に応じ、適宜選択することができ、経口投与、腹腔内投与、血液中への注射、腸内への注入等が挙げられる。中でも、経口投与が、簡便で前記効果を発揮する点から好ましい。
　前記α－グルコシダーゼ阻害剤、血糖低下剤又は前記糖尿病予防治療薬の投与量としては、特に制限はなく、投与対象である個体の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば、成人への１日の投与量は、有効成分の量として、１ｍｇ～３０ｇが好ましく、１０ｍｇ～１０ｇがより好ましく、１００ｍｇ～３ｇが特に好ましい。
　また、投与時期としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、予防的に投与されてもよいし、治療的に投与されてもよい。
　本発明の前記乳酸菌、該乳酸菌の死菌若しくは処理物、又は血糖低下剤を含有する飲食品（以下、「本発明の飲食品」と略記する場合がある）中の、乳酸菌、血糖低下剤又は糖尿病予防治療薬の含有量は、特に制限がなく、目的や飲食品の態様（種類）に応じて、適宜選択することができるが、飲食品全体を１００質量部としたときに、上記の合計量で、０．００１～１００質量部で含有することが好ましく、より好ましくは０．０１～１００質量部、特に好ましくは０．１～１００質量部の含量である。
　また、上記の何れか１種を単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。２種以上を併用する場合の、前記飲食品中の各々の物質の含有量比には、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　本発明の飲食品は、血糖低下作用を有する。
　本発明の飲食品は、前記した本発明の乳酸菌や血糖低下剤に加えて、更に、「その他の成分」を含有することができる。
　上記「その他の成分」としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で目的に応じて適宜選択することができ、例えば、各種食品原料等が挙げられる。また、「その他の成分」の含有量は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　本発明の飲食品には、ヒトが摂取する飲み物や食品が含まれる。また、本発明の飲食品には、家畜、家禽類、ペット等が摂取するための飲料も含まれる。
　本発明の乳酸菌は、一般飲食品、健康食品、薬剤、醗酵飲食品、プロバイオティクスの生産等に利用できる。醗酵飲食品としては、醗酵乳、乳酸菌飲料、ヨーグルト、漬物、漬物製造用乳酸菌スターター等としての用途に特に好適である。
　前記飲食品の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ゼリー、キャンディー、チョコレート、ビスケット、グミ等の菓子類；緑茶、紅茶、コーヒー、清涼飲料等の嗜好飲料；醗酵乳、ヨーグルト、アイスクリーム、ラクトアイス等の乳製品；野菜飲料、果実飲料、ジャム類等の野菜・果実加工品；スープ等の液体食品；パン類、麺類等の穀物加工品；各種調味料；等が挙げられる。中でも、ヨーグルト、醗酵乳等の乳製品が好ましい。
　これらの飲食品の製造方法としては、特に制限はなく、例えば、通常の各種飲食品の製造方法に応じて、適宜製造することができる。
　また、前記飲食品は、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤等の経口固形剤や、内服液剤、シロップ剤等の経口液剤として製造されたものであってもよい。前記経口固形剤、経口液剤の製造方法は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記した薬剤の経口固形剤、経口液剤の製造方法にならい、製造することができる。
　本発明の飲食品は、血糖低下機構の活性化や糖尿病の予防等を目的とした、機能性食品、健康食品等として、特に有用である。
　本発明の乳酸菌、該死菌若しくは処理物等を飲食品の製造に使用する場合、製造方法は当業者に周知の方法によって行うことができる。当業者であれば、本発明の乳酸菌の（死）菌体又は処理物を他の成分と混合する工程、成形工程、殺菌工程、醗酵工程、焼成工程、乾燥工程、冷却工程、造粒工程、包装工程等を適宜組み合わせ、目的の飲食品を作ることが可能である。
　また、本発明の乳酸菌を各種醗酵乳の製造に使用する場合、当業者に周知の方法を用いて製造することができる。例えば、本発明の乳酸菌を醗酵乳に死菌として所要量添加する工程を用いて製造された飲食品や、乳酸菌スターターとして本発明の乳酸菌を用いて醗酵する工程を用いて製造された飲食品が挙げられる。
　乳酸菌スターターとして本発明の乳酸菌を用いて醗酵を行う場合、本発明の乳酸菌の培養条件と同様の条件等で行うことができる。
　以下、実施例及び検討例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例等の具体的範囲に限定されるものではない。「％」は、特に断りのない限り「質量％」を示す。
＜材料と方法＞
＜＜寄託＞＞
　上述のとおり、実施例において使用する「乳酸菌０８３１－０７」はムカデ（Chilopod）から分離されたものである。
　エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）に属する乳酸菌０８３１－０７は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に寄託されている（受託番号：ＮＩＴＥ　Ｐ－０２３０９、寄託日２０１６年７月２６日）。
　乳酸菌０８３１－０７は、その後、千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に、原寄託申請書を提出して、国内寄託（原寄託日：２０１６年７月２６日）から、ブタペスト条約に基づく寄託への移管申請を行い（移管日（国際寄託日）：２０１７年５月１６日）、生存が証明され、ブタペスト条約に基づく寄託（国際寄託）への移管申請が受領された結果、受託番号「ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２３０９」を受けているものである。
＜＜カイコの種類、飼育条件及び注射条件＞＞
　カイコの受精卵（交雑種ふ・よう×つくば・ね）は愛媛養蚕株式会社から購入した。孵化した幼虫は室温で人工飼料シルクメイト２Ｓ（日本農産工業株式会社）を与えて５齢幼虫まで育てた。飼育容器は卵から２齢幼虫までを角型２号シャーレ（栄研器材）、それ以降をディスポーザブルのプラスチック製フードパック（フードパックＦＤ 大深、中央化学株式会社）を用いた。飼育温度は２７℃とした。特に記載しない限り、実験には４齢眠以後絶食させた５齢１日目の幼虫を用いた。
＜＜乳酸菌の培養＞＞
　乳酸菌は、０．５％の炭酸カルシウムを含むＭＲＳ寒天培地で、嫌気条件下で培養した。ＭＲＳ寒天培培地上のコロニーの周辺に透明帯を形成し、グラム陽性の菌を乳酸菌と判定した。分離された乳酸菌に対して、ｒＲＮＡをコードする遺伝子のシークエンスにより種の同定を行った。乳酸菌の液体培地での増殖は、１～３日間、３０℃にて静置条件で行った。
＜＜乳酸菌の糖代謝能試験＞＞
　乳酸菌０８３１－０７株の糖代謝能は、Api 50 CHキット（シスメックス社）を用いて測定した。乳酸菌０８３１－０７株のコロニーをサスペンジョンメディウム（シスメックス社）で懸濁し、マクファーランド濁度２になるように調製した。Apiプレート（シスメックス社）に調整した菌液サンプルを１５０μＬ加え、３０℃で４８時間培養した。培養後に各種糖に対する代謝能を、反応した色を観察して判定した。
＜＜血糖値の定量法＞＞
　カイコの体液は第一腹肢をはさみで切り、採取した。カイコ血液中のグルコース濃度はグルコメーター（Accu-Chek, Roche）により定量した。
＜＜ヨーグルトの製造＞＞
　ＭＲＳ寒天培地上で増殖させた、乳酸菌０８３１－０７株の菌体０．１ｇをエーゼでかき取り、５ｍＬの０．９％ＮａＣｌに懸濁した。菌の懸濁液５ｍＬを、牛乳（明治おいしい牛乳、カートンボックス）１Ｌに加え、攪拌した。４３℃にて、２０時間培養した。ゲル化を確認後、４℃で保存した。保存期間は３週間以内とした。
＜＜ヒトを用いた臨床試験＞＞
　被験者に非摂取時とヨーグルト摂取時で、５０％（ｗ／ｖ）ショ糖水溶液を用いた糖負荷試験を行い、それぞれの血糖値の推移データを収集した。被験者１０名を２群に分け、無作為に非盲検２群２期クロスオーバー法で実施した。被験者を選んだ基準等は以下の通りである。
＜＜＜ヒト臨床試験における健常人の選択基準＞＞＞
　以下の基準をすべて満たす者を対象とした。
（１）同意取得時の年齢が２０歳以上６０歳未満の者
（２）健康な成人男女
（３）試験の参加に先立ち、試験製品および試験に関して十分な説明を受け、被験者本人の自由意志による文書同意が得られた者
＜＜＜除外基準＞＞＞
　以下に抵触する者は、試験に組み入れないこととした。
（１）糖尿病と医師から診断され、現在治療中である者
（２）乳製品に対してアレルギーを有する者
（３）血糖に影響を及ぼす可能性がある医薬品や健康食品を服用している者
（４）慢性疾患を有し、医薬品を常用している者
（５）胃や腸を切除されている者
（６）その他、試験責任（分担）者が当該試験の被験者として不適当と判断した者
＜＜＜制限事項＞＞＞
（１）検査前日の夕食は１９～２３時に済ませ、以降は検査終了まで絶食とする。飲水（水のみ）は可。
（２）検査前日の過剰なアルコールの摂取は禁止とする。
（３）糖負荷１時間前から検査終了までは飲水禁止とする。
（４）検査当日は、起床～検査終了までの間、禁煙とする。
（５）検査中は運動禁止とする。デイルームまたはベッド上にて安静にして過ごす。
　ヨーグルト有無のショ糖負荷試験を２日間以上の間を空けて実施した。各被験者でのショ糖負荷の実施時刻は、同―となるようにした。被験者の手の指先より、穿刺器具を用いて採取した。ショ糖負荷１５分前に、被験者の血糖値を測定した。ヨーグルトの摂取は、ショ糖負荷１０分前に行った。２００ｍＬを２分以内に摂取させた。その後、５０％（ｗ／ｖ）ショ糖水溶液１５０ｍＬを飲用させた（１分以内に全量を摂取させた）。ショ糖負荷後の１５、３０、４５、６０、９０、１２０分において、血糖値を測定した。血糖値は、簡易血糖測定器（アキュチェックアビバ（Ｒｏｃｈｅ））を用いて測定した。本臨床試験の実施にあたっては、大崎病院東京ハートセンターの倫理審査委員会による承認を受けた。
＜＜統計学的解析＞＞
　数値データは、平均±標準誤差（mean ± standard error of the mean（ＳＥＭ））で表示した。有意差はスチューデントのｔ検定（Student's t-test）を用いて評価した。
実施例１
＜スクロース摂食によるカイコの体液中グルコース濃度の上昇を抑制する乳酸菌の同定＞
　これまでの研究により、カイコにおいて、α－グリコシダーゼ阻害活性を有する乳酸菌が、ショ糖摂取による体液中のグルコース濃度上昇を抑えることがわかっている（国際出願番号PCT/JP2016/079218、Matsumoto Y et al., Sci Rep., 2016）。
　そこで、発明者らが保有する乳酸菌ライブラリー（表１）の中からスクロースの摂食によるカイコの体液中グルコース濃度の上昇を著しく阻害する乳酸菌を探索した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　５齢１日目のカイコに、１０％スクロース餌に表１の各種乳酸菌（餌全体に対して２５％）を加えた餌を１時間与えた。その後カイコの体液を回収し、体液中のグルコース濃度を測定し、スチューデントのｔ検定（Student's t-test）を用いて有意差検定を行った。結果を図１に示す。
　図１中、縦軸はグルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）を示す。横軸の「Control」は、乳酸菌を含有しない、１０％スクロース餌をカイコに与えたときの結果を示す。＊ はＰ＜０．０５であり、 エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を示す。１群当たりｎ＝３で行った。
　図１の結果、Enterococcus faecalis 0831-07 (Enterococcus faecalis #Ef-1)株が、１０％スクロース餌の摂食によるカイコの血糖値の上昇を顕著に抑制した。
　本明細書や図面等においては、Enterococcus faecalis 0831-07を、「乳酸菌０８３１－０７」又は「乳酸菌＃Ｅｆ－１」と略記する場合がある。
　次に、５齢１日目のカイコに、１０質量％スクロース餌に乳酸菌０８３１－０７株（餌全体に対して０～５０質量％）を加えた餌を１時間与えた。その後カイコの体液を回収し、体液中のグルコース濃度を測定した。結果を図２に示す。
　図２中、縦軸はグルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）、横軸は乳酸菌０８３１－０７株の含有量（質量％）を示す。＊＊はＰ＜０．０１であり、エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を示す。１群当たりｎ＝５で行った。
　図２の結果、乳酸菌０８３１－０７株による血糖上昇の抑制効果は、餌に加える菌体量依存的であった。
　次に、５齢１日目のカイコに、１０質量％スクロース餌、又は、「１０質量％グルコース餌に乳酸菌０８３１－０７株（餌全体に対して２５質量％）を加えた餌」を１時間与えた。カイコの体液を回収し、体液中のグルコース濃度を測定した。スチューデントのｔ検定（Student's t-test）を用いて有意差検定を行った。結果を図３に示す。
　図３中、縦軸はグルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）を示す。横軸の「+Sucrose」は１０質量％スクロース餌、「+Glucose」は１０質量％グルコース餌を示す。＊＊＊はＰ＜０．００１であり、エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を示す。１群当たりｎ＝７で行った。
　図３の結果、乳酸菌０８３１－０７（乳酸菌＃Ｅｆ－１）株は、「１０質量％スクロース餌の摂食によるカイコの血糖値の上昇」を顕著に抑制した。
　なお、グルコースを摂食させた場合の体液中のグルコース濃度の上昇に対しても、乳酸菌０８３１－０７株による抑制効果が認められた。
　また、乳酸菌０８３１－０７株は、グルコース又はフルクトースが入った培地で増殖可能であった。
　次に、５齢１日目のカイコに、１０質量％スクロース餌に、「乳酸菌０８３１－０７株（餌全体に対して２５質量％）」又は「オートクレーブ処理により熱処理された乳酸菌０８３１－０７株（餌全体に対して２５質量％）」を加えた餌を１時間与えた。その後、カイコの体液を回収し、体液中のグルコース濃度を測定した。スチューデントのｔ検定（Student's t-test）を用いて有意差検定を行った。結果を図４に示す。
　図４中、縦軸はグルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）を示す。横軸の「Control」は、乳酸菌を含有しない、１０質量％スクロース餌をカイコに与えたときの結果を示す。「－」は、熱処理を行っていない乳酸菌０８３１－０７（＃Ｅｆ－１）株、「Heat-killed」は、オートクレーブ処理により熱処理された乳酸菌０８３１－０７株を示す。
　図４の結果、乳酸菌０８３１－０７株の熱処理菌体画分は、未処理の生菌の場合と同様に、スクロース餌の摂食によるカイコの体液中のグルコース濃度の上昇を抑制した（図４）。
　よって、乳酸菌０８３１－０７株のスクロース摂食餌による血糖上昇の抑制効果は、乳酸菌０８３１－０７株による熱処理耐性成分によるカイコ腸管のα－グリコシダーゼの阻害によることを示唆した。
実施例２
＜ヒトのスクロース摂食による血糖値の上昇に対する乳酸菌０８３１－０７株の阻害効果＞
　次に、乳酸菌０８３１－０７株がヒトにおける食後高血糖を抑制するかを検証するため、乳酸菌０８３１－０７株を用いて牛乳からヨーグルトを製造した。
　被験者に対して該ヨーグルト非摂取時とヨーグルト摂取時でのクロスオーバー法で、スクロース（ショ糖）負荷試験を実施した。
　ヨーグルト摂取群の被験者は、ショ糖負荷１０分前に、ヨーグルト２００ｍＬを摂取した。その後、ヨーグルト非摂取群とヨーグルト摂取群の被験者共、５０％（ｗ／ｖ）ショ糖水溶液１５０ｍＬを飲用した。ショ糖負荷後、１５、３０、４５、６０、９０、１２０分において血糖値を測定した。血糖値は、指先から微量の血液を採取し、簡易血糖測定器を用いて測定した。スチューデントのｔ検定（Student's t-test）を用いて有意差検定を行った。結果を図５に示す。
　図５中、縦軸はグルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）を示す。横軸は、スクロース摂取（負荷）後の経過時間（分）を示す。＊ はＰ＜０．０５であり、 エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を示す。１群当たりｎ＝１０で行った。
　図５の結果、乳酸菌０８３１－０７株を用いて製造したヨーグルトを摂食した被験者は、非摂食群と比較して、スクロース負荷後４５分における血糖値が低かった（図５）。
　よって、乳酸菌０８３１－０７株の菌体成分がヒトにおけるスクロース（ショ糖）摂取による血糖値の上昇を抑制する効果を有することを示唆した。
実施例３
＜血糖低下剤及び糖尿病予防治療薬の製造＞
＜＜錠剤＞＞
　培養した乳酸菌０８３１－０７を、１２１℃、２０分で滅菌処理後、濃縮した。該濃縮させた乳酸菌０８３１－０７の培養液２０．０ｍｇ、ラクトース４０ｍｇ、デンプン２０ｍｇ、及び、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース５ｍｇを均一に混合した後、ヒドロキシプロピルメチルセルロース８質量％水溶液を結合剤として湿式造粒法で打錠用顆粒を製造した。これに、滑沢性を与えるのに必要なステアリン酸マグネシウムを０．５ｍｇ～１ｍｇ加えてから打錠機を用いて打錠し錠剤とした。
＜＜液剤＞＞
　上記濃縮させた乳酸菌０８３１－０７の培養液１０．０ｍｇを、２質量％の２－ヒドロキシプロピル－β－サイクロデキストリン水溶液１０ｍＬに溶解し注射用液剤とした。
実施例４
＜乳酸菌死菌添加による、スクロース含有餌の給餌によるカイコ体液中のグルコース濃度上昇の阻害効果＞
　１０質量％スクロース含有餌に、乳酸菌０８３１－０７（＃Ｅｆ－１）株又はオートクレーブ処理された乳酸菌０８３１－０７（＃Ｅｆ－１）株の熱処理菌体画分（Heat-killed #Ef-1）を餌全体に対して６．３、１２．５、２５質量％になるように加えた餌を、５齢１日目のカイコに１時間与えた。該カイコの体液を回収し、体液中のグルコース濃度を測定した。結果を図６ａに示す。
　図６ａ中、縦軸はグルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）を示す。横軸の「No bacteria」は乳酸菌０８３１－０７（＃Ｅｆ－１）株を含有しない、１０質量％スクロース含有餌（Sucrose diet）をカイコに与えたときの結果を示す。「Viable #Ef-1 content」は熱処理を行っていない乳酸菌０８３１－０７株の含有量、「Heat-killed #Ef-1 content」は熱処理された乳酸菌０８３１－０７株の含有量を示す。
　＊＊＊はＰ＜０．００１、＊＊はｐ＜０．０１であり、エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を示す。１群当たりｎ＝１１～１４で行った。
　図６ａの結果、乳酸菌０８３１－０７株による血糖上昇の抑制効果は、餌に加える菌体量に依存して増強することが分かった。また、乳酸菌０８３１－０７株の熱処理菌体画分も用量依存的に、スクロース含有餌の摂食によるカイコ体液中のグルコース濃度上昇を抑制した。
　次に、１０質量％グルコース餌に乳酸菌０８３１－０７（＃Ｅｆ－１）株又はオートクレーブ処理された乳酸菌０８３１－０７（＃Ｅｆ－１）株の熱処理菌体画分(Heat-killed #Ef-1)を餌全体に対して２５質量％になるように加えた餌を、５齢１日目のカイコに１時間与えた。該カイコの体液を回収し、体液中のグルコース濃度を測定し、スチューデントのｔ検定を用いて有意差検定を行った。結果を図６ｂに示す。
　図６ｂ中、縦軸はグルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）を示す。横軸の「No bacteria」は乳酸菌０８３１－０７（＃Ｅｆ－１）株を含有しない、１０質量％グルコース餌（Glucose diet）をカイコに与えたときの結果を示す。「Viable」は熱処理を行っていない乳酸菌０８３１－０７株を加えた１０質量％グルコース餌、「Heat-killed」は熱処理された乳酸菌０８３１－０７株を加えた１０質量％グルコース餌をカイコに与えたときの結果を示す。
　＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１であり、エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を示す。１群当たりｎ＝６～７で行った。
　図６ｂの結果、熱処理を行っていない乳酸菌０８３１－０７株は、グルコース含有餌の摂食によるカイコ体液中のグルコース濃度上昇を抑制した。一方、乳酸菌０８３１－０７株の熱処理菌体には、グルコース摂食後のカイコ体液中のグルコース濃度上昇を抑制する活性は見出されなかった。
　以上の結果は、乳酸菌０８３１－０７（＃Ｅｆ－１）株の生菌が、スクロース及びグルコース摂取後のカイコ体液中のグルコース濃度上昇を抑制すること、並びに乳酸菌０８３１－０７（＃Ｅｆ－１）株の熱処理菌体には、スクロース摂取後のカイコの体液中のグルコース濃度の上昇を抑制する活性が残っていることが示唆された。
実施例５
＜in vitroでのカイコの腸管における糖移行評価系の実験スキームの構築＞
　次に、乳酸菌０８３１－０７株がスクロース摂食後のカイコの血糖上昇を抑制する機構について、解明を試みた。哺乳動物においてスクロースは、腸管内でα－グリコシダーゼによりグルコースとフルクトースに分解され、腸管から吸収されることが知られている。まず、カイコの腸管内のスクロースがα－グリコシダーゼにより分解されてグルコースが腸管外に移行する過程を解析するための実験系の構築を行った。
　５齢１日目のカイコの腸管を摘出し、糸で縛って溶液を入れられる状態にした。該カイコの腸管内にスクロース溶液を加えてその溶液が漏れないように糸で縛った。そして、ＰＢＳ中でインキュベーションし、腸管外に輸送されたグルコースを定量した。
　「in vitroでのカイコの腸管における糖移行評価系の実験スキーム」を図７ａに示す。
　上記実験スキームを用いて、カイコの腸管内にスクロース溶液、又はスクロース溶液にアカルボース（４０ｍｇ／ｍＬ）を加えたサンプルをカイコの腸管に入れ、２７℃でインキュベーションし、経時的に腸管外液のグルコース濃度を測定した。結果を図７ｂに示す。
　図７ｂ中、縦軸はグルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）を示す。横軸はインキュベート時間（分）を示す。
　図７ｂの結果、腸管外液中のグルコース濃度は、時間依存に上昇することがわかった（図７ｂ中、黒丸）。また、該腸管外液中のグルコース濃度の上昇は、α－グリコシダーゼ阻害剤であるアカルボースを加えることにより抑制された（図７ｂ中、白丸）。この結果から、カイコの腸管内において、スクロースがα－グリコシダーゼによりグルコースとフルクトースに分解され、さらに腸管外に輸送されることが示唆された。
実施例６
＜乳酸菌０８３１－０７株による、スクロース摂食後の食後高血糖抑制のメカニズム解析＞
　実施例５で構築した実験スキームを用いて、カイコの腸管内にスクロース溶液、又はスクロース溶液に乳酸菌０８３１－０７株（２５０ｍｇ（湿重量）／ｍＬ）を加えたサンプルをカイコの腸管に入れ、２７℃でインキュベーションし、経時的に腸管外液のグルコース濃度を測定した。結果を図８ａに示す。
　図８ａ中、縦軸はグルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）を示す。横軸はインキュベート時間（分）を示す。
　また、カイコの腸管内にスクロース溶液、又はスクロース溶液に乳酸菌０８３１－０７株（３１ｍｇ、６３ｍｇ、１２５ｍｇ、２５０ｍｇ（湿重量）／ｍＬ）を加えたサンプルをカイコの腸管に入れ、２７℃でインキュベーションし、６０分後の腸管外液のグルコース濃度を測定した。結果を図８ｂに示す。
　図８ｂ中、縦軸はグルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）を示す。横軸は乳酸菌０８３１－０７（＃Ｅｆ－１）株の量（ｍｇ／ｍＬ）を示す。＊はＰ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１であり、エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を示す。１群当たりｎ＝３～５で行った。
　図８ａ及びｂの結果、カイコの腸管内のスクロース溶液中に乳酸菌０８３１－０７株の生菌を添加すると、腸管外液中のグルコース濃度の上昇は抑制された。また、該抑制効果は、菌体量に依存して増強することが分かった（図８ｂ）。
　次に、カイコの腸管内にスクロース溶液、又はスクロース溶液にオートクレーブ処理した乳酸菌０８３１－０７株の熱処理菌体画分（Heat-killed #Ef-1）（２５０ｍｇ（湿重量）／ｍＬ）を加えたサンプルをカイコの腸管に入れ、２７℃でインキュベーションし、経時的に腸管外液のグルコース濃度を測定した。結果を図８ｃに示す。
　図８ｃ中、縦軸はグルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）を示す。横軸はインキュベート時間（分）を示す。
　また、カイコの腸管内にスクロース溶液、又はスクロース溶液にオートクレーブ処理した乳酸菌０８３１－０７株の熱処理菌体画分（Heat-killed #Ef-1）（３１ｍｇ、６３ｍｇ、１２５ｍｇ、２５０ｍｇ（湿重量）／ｍＬ）を加えたサンプルをカイコの腸管に入れ、２７℃でインキュベーションし、６０分後の腸管外液のグルコース濃度を測定した。結果を図８ｄに示す。
　図８ｄ中、縦軸はグルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）を示す。横軸はオートクレーブ処理した乳酸菌０８３１－０７株の熱処理菌体画分（Heat-killed #Ef-1）の量（ｍｇ／ｍＬ）を示す。＊＊はｐ＜０．０１であり、エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を示す。１群当たりｎ＝３～５で行った。
　図８ｃ及びｄの結果、乳酸菌０８３１－０７株の熱処理菌体画分を添加しても腸管外液中のグルコース濃度の上昇は抑制された。また、該抑制効果は、菌体量に依存して増強することが分かった（図８ｄ）。
　これらの結果から、乳酸菌０８３１－０７株の熱耐性因子は、カイコの腸管内のスクロースが分解されて得られた分子（グルコース）が腸管外に移行する過程を阻害することが示唆された。
　次に、カイコの腸管内にグルコース溶液、又はグルコース溶液に乳酸菌０８３１－０７株（２５０ｍｇ（湿重量）／ｍＬ）を加えたサンプルをカイコの腸管に入れ、２７℃でインキュベーションし、経時的に腸管外液のグルコース濃度を測定した。結果を図９ａに示す。
　図９ａ中、縦軸はグルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）を示す。横軸はインキュベート時間（分）を示す。
　図９ａの結果、カイコの腸管内にグルコース溶液を封入した場合にも時間経過に伴うグルコースの腸管外への透過が見られた。
　また、カイコの腸管内にグルコース溶液、又はグルコース溶液にオートクレーブ処理した乳酸菌０８３１－０７株の熱処理菌体画分（Heat-killed #Ef-1）（２５０ｍｇ（湿重量）／ｍＬ）を加えたサンプルをカイコの腸管に入れ、２７℃でインキュベーションし、経時的に腸管外液のグルコース濃度を測定した。結果を図９ｂに示す。
　図９ｂ中、縦軸はグルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）を示す。横軸の「No bacteria」は乳酸菌０８３１－０７（＃Ｅｆ－１）株を含有しない、グルコース溶液の結果を示す。「Viable」は熱処理を行っていない乳酸菌０８３１－０７株を加えたグルコース溶液、「Heat-killed」は熱処理された乳酸菌０８３１－０７株を加えたグルコース溶液の結果を示す。＊はｐ＜０．０５であり、エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を示す。１群当たりｎ＝３～４で行った。
　乳酸菌０８３１－０７株の生菌を腸管内に添加すると、腸管外液中のグルコース濃度の上昇が抑制されることが分かった（図９ａ及びｂ）。一方、乳酸菌０８３１－０７株の熱処理菌体画分を添加した場合には、腸管外液中のグルコース濃度の上昇は抑制されなかった（図９ｂ）。
　これらの結果から、乳酸菌０８３１－０７株の熱感受性因子が、カイコの腸管内から腸管外へのグルコース輸送を阻害することが示唆された。
実施例７
＜乳酸菌０８３１－０７株による、カイコ又はラットの腸管のα－グリコシダーゼ活性の阻害＞
　次に、乳酸菌０８３１－０７株の熱処理画分がカイコ腸管のα－グリコシダーゼ活性を阻害するかを検討した。α－グリコシダーゼの測定は実施例２と同様に行った。
　５齢１日目のカイコに通常餌を１日与えた。該カイコの腸管を超音波処理により破砕された細胞破砕画分と乳酸菌０８３１－０７株の熱処理菌体画分（Heat-killed #Ef-1）を加えてα－グリコシダーゼ活性を測定した。結果を図１０ａに示す。
　図１０ａ中、縦軸は「Produced pNP」の濃度（ｎｍｏｌ）を示す。「Produced pNP」の濃度（ｎｍｏｌ）が高い程、α－グリコシダーゼ活性が高いことを示す。横軸は、乳酸菌０８３１－０７株の熱処理菌体画分（Heat-killed #Ef-1）の量（ｍｇ／ｍＬ）を示す。
　図１０ａの結果、カイコ腸管の細胞破砕画分には、α－グリコシダーゼ活性が認められ、乳酸菌０８３１－０７株の熱処理画分は、この活性を用量依存的に阻害することがわかった。
　次に、ラット腸管アセトン抽出画分と乳酸菌０８３１－０７株の熱処理菌体画分（Heat-killed #Ef-1）を加えてα－グリコシダーゼ活性を測定し、スチューデントのｔ検定を用いて有意差検定を行った。結果を図１０ｂに示す。
　図１０ｂ中、縦軸は「Produced pNP」の濃度（ｎｍｏｌ）を示す。「Produced pNP」の濃度（ｎｍｏｌ）が高い程、α－グリコシダーゼ活性が高いことを示す。横軸は、乳酸菌０８３１－０７株の熱処理菌体画分（Heat-killed #Ef-1）の量（ｍｇ／ｍＬ）を示す。＊＊＊はｐ＜０．００１であり、エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を示す。１群当たりｎ＝３で行った。
　図１０ｂの結果、乳酸菌０８３１－０７株の熱処理画分は、ラットの腸管破砕液中のα－グリコシダーゼ活性も用量依存的に阻害した。したがって、乳酸菌０８３１－０７株の熱処理画分が、カイコ及び哺乳動物の腸管内のα－グリコシダーゼ活性を阻害し、腸管内のスクロースがグルコースとフルクトースに分解され、それらが腸管外に移行する過程を阻害されることが示唆された。
実施例８
＜乳酸菌０８３１－０７株によるグルコース取り込みに対する阻害効果＞
　Ｃａｃｏ－２細胞は、ヒトの腸管由来の培養細胞であり、この細胞のグルコース取り込みを定量する方法が確立されている（Yamabe N., et al., Am J Physiol. Endocrinol. Metab., 2015）。該方法を用いて、乳酸菌０８３１－０７株によるＣａｃｏ－２細胞のグルコース取り込みに対する阻害効果を検証した。
　まず、Ｃａｃｏ－２細胞における２－ＮＢＤＧ（2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]-D-glucose）の取り込み系において、乳酸菌０８３１－０７株の生菌を加えて、Ｃａｃｏ－２細胞における傾向の取り込みを測定し、スチューデントのｔ検定を用いて有意差検定を行った。結果を図１１Ａに示す。
　図１１Ａ中、縦軸はグルコース取り込み量を示し、対照（乳酸菌０８３１－０７株の量が０％）を１００％としたときの割合を示す。横軸は乳酸菌０８３１－０７株の量（ｍｇ／ｍｌ）を示す。＊＊＊はｐ＜０．００１であり、エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を示す。１群当たりｎ＝３で行った。
　図１１Ａの結果、乳酸菌０８３１－０７株は、Ｃａｃｏ－２細胞のグルコース取り込みを阻害していることが分かった。
　次に、Ｃａｃｏ－２細胞における２－ＮＢＤＧ（2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]-D-glucose）の取り込み系において、乳酸菌０８３１－０７株の生菌と熱処理（Heat-treated）菌体画分を加えて、Ｃａｃｏ－２細胞における傾向の取り込みを測定し、スチューデントのｔ検定を用いて有意差検定を行った。結果を図１１Ｂに示す。
　図１１Ｂ中、横軸の「No bacteria」は乳酸菌０８３１－０７（＃Ｅｆ－１）株を含有しないときの結果を示す。「Viable」は熱処理を行っていない乳酸菌０８３１－０７株、「Heat-treated」は熱処理された乳酸菌０８３１－０７株の結果を示す。＊はＰ＜０．０５であり、エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を示す。１群当たりｎ＝３で行った。
　図１１Ｂの結果、乳酸菌０８３１－０７株におけるＣａｃｏ－２細胞のグルコース取り込み阻害活性は、菌体の熱処理により低下することが分かった。
　以上の結果から、乳酸菌０８３１－０７株由来の熱感受性成分は、Ｃａｃｏ－２細胞のグルコース取り込みを阻害することが示唆された。乳酸菌０８３１－０７株による食後高血糖抑制効果を示す模式図を図１１Ｃに示す。
　図１１Ｃ中、"Lumen"は「内腔」、"Degradation"は「分解」、"Transport"は「輸送」、"Outside of intestine"は「腸管外」、"Sucrose"は「スクロース」、"Glucose"は「グルコース」、"Fructose"は「フルクトース」、"E. faecalis (#Ef-1)"は「乳酸菌０８３１－０７」を示す。
実施例９
＜乳酸菌０８３１－０７株による、ヒトのショ糖摂取による血糖値の上昇に対する抑制効果＞
　乳酸菌０８３１－０７株がヒトでのショ糖摂取後の血糖値の上昇を抑制する効果があるかを検討した。健常人１４人に対して、生菌懸濁液摂取群、熱処理菌体懸濁液摂取群、非摂取群において、ショ糖負荷試験を実施した。被験者は、ショ糖負荷１５分前に、生理食塩水で懸濁したサンプル５０ｍLを摂取した。その後、被験者は、５０％（ｗ／ｖ）ショ糖水溶液１５０ｍLを飲用した。
　ショ糖負荷後、０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０分における被験者の血糖値を各群間で比較した。血糖値は、指先から微量の血液を採取し、簡易血糖測定器を用いて測定した。
　図１２Ａは本実施例の実験スケジュールを示す。まず、熱処理菌体懸濁液摂取群におけるショ糖負荷試験を実施した。その７日後に非摂取群におけるショ糖負荷試験を実施した。更にその７日後に生菌懸濁液摂取群におけるショ糖負荷試験を実施した。
　図１２Ｂは、被験者個々についての、生菌懸濁液摂取群（Viable #Ef-1）、熱処理菌体懸濁液摂取群（Heat-treated #Ef-1）、非摂取群（Control）における血糖値をショ糖負荷後の時間ごとに示したグラフである。縦軸は血糖値（ｍｇ／ｄＬ）を示す。＊はｐ＜０．０５であり、１群当たりｎ＝１４である。
　図１２Ｃは、生菌懸濁液摂取群（Viable #Ef-1）、熱処理菌体懸濁液摂取群（Heat-treated #Ef-1）、非摂取群（Control）におけるショ糖負荷試験の結果を示す。縦軸は血糖値、横軸はスクロース摂取後の時間（分）を示す。＊はｐ＜０．０５であり、エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を示す。１群当たりｎ＝１４で行った。
　図１２Ｂ及びＣの結果、ショ糖負荷後４５、６０分において乳酸菌０８３１－０７株の生菌懸濁液摂取群の方が非摂食群と比べて血糖値が低いという結果を得た。一方、熱処理菌体懸濁液摂取群と非摂食群におけるショ糖負荷後の血糖値に差はなかった。
　以上の結果から、乳酸菌０８３１－０７株がヒトにおけるショ糖摂取後の血糖値の上昇に対して抑制作用を有すること、並びに血糖上昇抑制因子が熱感受性であることが示された。
＜実施例のまとめ＞
　上記実施例より、カイコの評価系を用いて乳酸菌０８３１－０７（乳酸菌＃Ｅｆ－１）株から作成したヨーグルトが、ヒトのスクロースの摂食による食後高血糖を抑制することを示した。したがって、本実施例で得られた乳酸菌０８３１－０７株は、スクロース（ショ糖）摂取による血糖値の上昇を抑制する機能性乳酸菌である。該乳酸菌を用いて作製されたヨーグルトは、肥満や糖尿病患者やそれらの予備軍のヒトの食事療法をより効果的にすると期待される。
　食品の有効性の評価をするためには、動物個体を用いた評価が必要である。従来、実験動物として用いられてきたマウスやラット等の哺乳動物は、多数の個体を用いるスクリーニングの実施に高いコストがかかる。これに対してカイコは、大きな飼育スペースを必要とせず、多数の個体を低いコストで飼育可能である。更に動物愛護の観点から、哺乳動物を用いた実験は、国際原則である３Ｒ、すなわちReplacement（代替法の開発）、Reduction（動物数の削減）、Refinement（動物の苦痛の削減）に従って実験を行わなければならない（Russell et al., 1959）。
　カイコを代替動物として利用することは、３Ｒの中のRelative Replacementの考えと合致する。カイコを機能性食品の探索段階で使用すれば、犠牲にする哺乳動物の数を減少させ、コストや動物愛護の観点からの問題を解決できると考えられる。
　また、乳酸菌０８３１－０７株には、カイコ腸管のα－グリコシダーゼを阻害する活性、及び腸管内から腸管外へのグルコースの輸送を阻害する活性が見出された。該菌が有するこれらの活性が、スクロースを摂食したカイコの血糖値の上昇の抑制をもたらすと示唆された。
　また、乳酸菌０８３１－０７株の熱処理菌体は、カイコのスクロース摂食による食後高血糖を抑制する活性を保持していた。この画分はカイコ腸管のスクロースを分解する酵素であるα－グリコシダーゼ活性を阻害したが、腸管のグルコース輸送は阻害しなかった。したがって、乳酸菌０８３１－０７株の、スクロースを摂取したカイコの血糖上昇を抑える効果は、α－グリコシダーゼ活性の阻害が主な要因であると示唆された。
　本発明の新規乳酸菌や該処理物は、スクロースの摂食による食後高血糖を抑制する作用を有し、更には、糖尿病予防治療効果もある。よって、本発明の乳酸菌を利用した、血糖低下剤を含有する薬剤や飲食品を提供することができ、医薬品業界、食品業界等で広く利用可能である。
　本願は、２０１６年８月１６日に出願した日本の特許出願である特願２０１６－１５９５５５に基づくものであり、それらの出願の全ての内容はここに引用し、本願発明の明細書の開示として取り込まれるものである。
　ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２３０９
　配列番号１は、エンテロコッカス（Enterococcus）属に属する未知の菌株の、１６Ｓ ｒＤＮＡのほぼ全長にあたる塩基配列である。

Claims (9)

  1. 　独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）における受託番号がＮＩＴＥ　ＢＰ－０２３０９であるエンテロコッカス（Enterococcus）属に属する乳酸菌、又は、その自然的若しくは人工的に変異した乳酸菌であって血糖低下作用を有する乳酸菌。
  2. 　請求項１に記載の乳酸菌であって、α－グリコシダーゼ阻害活性を有することでスクロース摂取による血糖上昇を抑制する用途に用いられる乳酸菌。
  3. 　配列表の配列番号１で示される１６ＳｒＤＮＡ領域の塩基配列を有する請求項１又は請求項２に記載の乳酸菌。
  4. 　請求項１ないし請求項３の何れかの乳酸菌、該乳酸菌の死菌又は該乳酸菌の処理物を有効成分とするα－グリコシダーゼ阻害剤であって、
    　該乳酸菌の処理物は、該乳酸菌の、培養物、濃縮物、ペースト化物、乾燥物、液状化物、希釈物、破砕物、殺菌加工物、及び、培養物からの抽出物よりなる群から選ばれる少なくとも１つの処理物であることを特徴とするα－グリコシダーゼ阻害剤。
  5. 　請求項１ないし請求項３の何れかの乳酸菌、該乳酸菌の死菌又は該乳酸菌の処理物を有効成分とする血糖低下剤であって、
    　該乳酸菌の処理物は、該乳酸菌の、培養物、濃縮物、ペースト化物、乾燥物、液状化物、希釈物、破砕物、殺菌加工物、及び、培養物からの抽出物よりなる群から選ばれる少なくとも１つの処理物であることを特徴とする血糖低下剤。
  6. 　請求項５に記載の血糖低下剤を有効成分として含有することを特徴とする糖尿病予防治療薬。
  7. 　請求項１ないし請求項３の何れかの乳酸菌を含有する飲食品。
  8. 　請求項５に記載の血糖低下剤を含有する飲食品。
  9. 　請求項１ないし請求項３の何れかの乳酸菌を用いて醗酵する工程を用いて製造された飲食品。
PCT/JP2017/022052 2016-08-16 2017-06-15 乳酸菌、該乳酸菌由来の血糖低下剤、糖尿病治療薬、及び飲食品 WO2018034047A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018534279A JP7054111B2 (ja) 2016-08-16 2017-06-15 乳酸菌、該乳酸菌由来の血糖低下剤、糖尿病治療薬、及び飲食品

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016-159555 2016-08-16
JP2016159555 2016-08-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018034047A1 true WO2018034047A1 (ja) 2018-02-22

Family

ID=61196619

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2017/022052 WO2018034047A1 (ja) 2016-08-16 2017-06-15 乳酸菌、該乳酸菌由来の血糖低下剤、糖尿病治療薬、及び飲食品

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP7054111B2 (ja)
WO (1) WO2018034047A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020184909A (ja) * 2019-05-13 2020-11-19 学校法人帝京大学 血糖降下剤、及び、該血糖降下剤を含有する飲食品
CN114945677A (zh) * 2019-10-11 2022-08-26 国立大学法人静冈大学 产生烟酰胺核糖的乳酸菌、以及产生烟酰胺单核苷酸及烟酰胺核糖的乳酸菌
JP2022552759A (ja) * 2019-10-24 2022-12-20 ドクター ティージェイ シーオー．，エルティーディー． エンテロコッカス・フェカーリスを有効成分として含有する肥満または肥満から誘導された代謝症候群の予防または治療用の組成物

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH107577A (ja) * 1996-06-17 1998-01-13 Yakult Honsha Co Ltd 血糖降下剤
JP2003116486A (ja) * 2001-08-09 2003-04-22 Meiji Milk Prod Co Ltd 食後の血糖上昇抑制作用を有する食品組成物
JP2009058500A (ja) * 2007-08-06 2009-03-19 Genome Soyaku Kenkyusho:Kk 血糖値を降下させる物質の評価方法、スクリーニング方法及び製造方法
WO2010004916A1 (ja) * 2008-07-08 2010-01-14 株式会社ゲノム創薬研究所 血糖低下剤及びそれを添加してなる糖尿病の予防又は症状改善のための飲食品
WO2012011174A1 (ja) * 2010-07-22 2012-01-26 ビオフェルミン製薬株式会社 脂質代謝改善剤、脂質代謝改善作用増強剤、抗肥満剤及び抗肥満作用増強剤
WO2017061353A1 (ja) * 2015-10-08 2017-04-13 株式会社ゲノム創薬研究所 スクロース摂取による血糖値上昇を抑制する物質の評価方法、スクリーニング方法及び製造方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH107577A (ja) * 1996-06-17 1998-01-13 Yakult Honsha Co Ltd 血糖降下剤
JP2003116486A (ja) * 2001-08-09 2003-04-22 Meiji Milk Prod Co Ltd 食後の血糖上昇抑制作用を有する食品組成物
JP2009058500A (ja) * 2007-08-06 2009-03-19 Genome Soyaku Kenkyusho:Kk 血糖値を降下させる物質の評価方法、スクリーニング方法及び製造方法
WO2010004916A1 (ja) * 2008-07-08 2010-01-14 株式会社ゲノム創薬研究所 血糖低下剤及びそれを添加してなる糖尿病の予防又は症状改善のための飲食品
WO2012011174A1 (ja) * 2010-07-22 2012-01-26 ビオフェルミン製薬株式会社 脂質代謝改善剤、脂質代謝改善作用増強剤、抗肥満剤及び抗肥満作用増強剤
WO2017061353A1 (ja) * 2015-10-08 2017-04-13 株式会社ゲノム創薬研究所 スクロース摂取による血糖値上昇を抑制する物質の評価方法、スクリーニング方法及び製造方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MATSUMOTO, YASUHIKO ET AL.: "An in vivo invertebrate evaluation system for identifying substances that suppress sucrose-induced postprandial hyperglycemia", SCIENTIFIC REPORTS, vol. 6, no. 26354, 19 May 2016 (2016-05-19), pages 1 - 9, XP055468845 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020184909A (ja) * 2019-05-13 2020-11-19 学校法人帝京大学 血糖降下剤、及び、該血糖降下剤を含有する飲食品
CN114945677A (zh) * 2019-10-11 2022-08-26 国立大学法人静冈大学 产生烟酰胺核糖的乳酸菌、以及产生烟酰胺单核苷酸及烟酰胺核糖的乳酸菌
JP2022552759A (ja) * 2019-10-24 2022-12-20 ドクター ティージェイ シーオー．，エルティーディー． エンテロコッカス・フェカーリスを有効成分として含有する肥満または肥満から誘導された代謝症候群の予防または治療用の組成物
JP7481023B2 (ja) 2019-10-24 2024-05-10 ドクター ティージェイ シーオー．，エルティーディー． エンテロコッカス・フェカーリスを有効成分として含有する肥満または肥満から誘導された代謝症候群の予防または治療用の組成物

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2018034047A1 (ja) 2019-06-13
JP7054111B2 (ja) 2022-04-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2609617C (en) Feline probiotic lactobacilli
EP2615163B1 (en) Composition comprising probiotics having aryl hydrocarbon receptor activating potency for use as anti-inflammatory agents
EP2338976B1 (en) Lactic acid bacterium having high oxalic acid decomposition ability
DK2478910T3 (en) ANTI-ADIPOSITY AGENT, ANTI-ADIPOSITA NUTRITION OR DRINK, GLUCOSE TOLERANCE EFFECTIVE AGENT, AND NUTRITION OR DRINK FOR IMPROVING GLUCOSE TOLERANCE
JP6505018B2 (ja) 新規乳酸菌、新規乳酸菌を有効成分とする自然免疫活性化剤、及び新規乳酸菌を含有する飲食品
JP6594911B2 (ja) 乳酸菌、該乳酸菌由来の自然免疫活性化剤、感染症予防治療剤及び飲食品
JP7054111B2 (ja) 乳酸菌、該乳酸菌由来の血糖低下剤、糖尿病治療薬、及び飲食品
JP6793380B2 (ja) スクロース摂取による血糖値上昇を抑制する物質の評価方法、スクリーニング方法及び製造方法
Khan Probiotic microorganisms-identification, metabolic and physiological impact on poultry
US8728461B2 (en) Lactic acid bacterium having high immunoglobulin-A-inducing ability
JP2023033532A (ja) 骨格筋遅筋化用組成物
JP7090288B2 (ja) 新規乳酸菌、新規乳酸菌を有効成分として含有する自然免疫活性化剤、及び新規乳酸菌を含有する飲食品
JP7369976B2 (ja) 乳酸菌、該乳酸菌由来の自然免疫活性化剤、感染症予防・治療薬及び飲食品
JP5868519B2 (ja) ロイテリン産生ラクトバチルス・ブレビス
JP6245583B2 (ja) カテコールアミン認識性を指標に選抜した微生物とカテコールアミン含有組成物
JP6588509B2 (ja) 乳酸菌を有効成分として含有する抗真菌剤
CN116656526B (zh) 一株植物乳植杆菌jf4及其在制备降血糖和降胆固醇食品药品中的应用
JP2020184909A (ja) 血糖降下剤、及び、該血糖降下剤を含有する飲食品

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17841275

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018534279

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 17841275

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1