WO2022138656A1 - ニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法 - Google Patents

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WO2022138656A1
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nicotinamide mononucleotide
reaction
fructobacillus
buffer solution
cells
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悠司 時本
孝治 西川
秀聡 井戸垣
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株式会社大阪ソーダ
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a nicotinamide mononucleotide, which comprises a nicotinamide mononucleotide enrichment reaction step in which a microorganism capable of producing nicotinamide mononucleotide is reacted in a solution having a pH of 4 to 10 (for example, a buffer solution or the like).
  • Non-Patent Documents 1 and 2 In recent years, aging and aging-related diseases have been shown to be closely associated with decreased levels of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD + ) and decreased activity of the NAD + -dependent deacetylase sirtuin (NAD +).
  • activation of sirtuins is thought to explain many of the effects of calorie restriction on life extension or health promotion (Non-Patent Document 2).
  • NAD + has long been known as a coenzyme for redox reactions, but in recent years, it has also become known to play a role as a substrate for polyADP-ribose polymerase, CD38 / CD157, sirtuin, etc. (Non-Patent Document 1). ). In particular, the decomposition reaction of NAD + to nicotinamide by sirtuins promotes the lysine residue deacetylation reaction by sirtuins coupled with it, and is involved in various life phenomena related to health and longevity (non-patented). Documents 1 and 2).
  • NAMPT nicotinamide phosphoribosyltransferase
  • nicotinamide mononucleotides can be obtained from yeasts that have a dietary experience, such as torula yeast (Patent Document 1), and E. coli, B. coli. B. subtilis, C.I. Glutamicum, A. glutamicum. A. baylyi, and R. It has been reported that nicotinamide riboside can be obtained from a genetically modified bacterium selected from the group consisting of R. europha (Patent Document 2).
  • a method for producing a nicotinamide mononucleotide a method for producing a ⁇ -nicotinamide mononucleotide including a step of reacting with ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide as a substrate using a metabolic composition of a microorganism belonging to the genus Aspergillus (Patent Document). 3) is known. More specifically, ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide contained in cultured yeast is enzymatically reacted to produce nicotinamide mononucleotide.
  • the patented method requires the use of an enzyme in the reaction, and there remains a concern about safety when the produced nicotinamide mononucleotide is edible. In addition, the amount of nicotinamide mononucleotide produced is not sufficient.
  • an object of the present invention is to provide a method for producing nicotinamide mononucleotide with high production efficiency.
  • the present inventor reacts a microorganism having a nicotinamide mononucleotide-producing ability in a reaction solution having a pH of 4.0 to 10.0 (for example, a reaction solution whose pH is adjusted with a buffer solution).
  • a reaction solution having a pH of 4.0 to 10.0 for example, a reaction solution whose pH is adjusted with a buffer solution.
  • the present invention has been completed by further studies based on this finding.
  • Item 1 A method for producing a nicotinamide mononucleotide, which comprises a nicotinamide mononucleotide enrichment reaction step in which a microorganism capable of producing nicotinamide mononucleotide is reacted in a reaction solution having a pH of 4 to 10.
  • Item 2. The production method according to Item 1, wherein the microorganism having a nicotinamide mononucleotide-producing ability is a lactic acid bacterium.
  • Item 3 A method for producing a nicotinamide mononucleotide, which comprises a nicotinamide mononucleotide enrichment reaction step in which a microorganism capable of producing nicotinamide mononucleotide is reacted in a reaction solution having a pH of 4 to 10.
  • the reaction solution having a pH of 4 to 10 contains a buffer solution selected from the group consisting of an acetate buffer solution, a phosphate buffer solution, a borate buffer solution, a carbon dioxide buffer solution, a Tris buffer solution, a HEPES buffer solution, and a MES buffer solution.
  • a buffer solution selected from the group consisting of an acetate buffer solution, a phosphate buffer solution, a borate buffer solution, a carbon dioxide buffer solution, a Tris buffer solution, a HEPES buffer solution, and a MES buffer solution.
  • the object by reacting a microorganism capable of producing nicotinamide mononucleotide in a reaction solution having a pH of 4 to 10, the object can be easily and efficiently under very mild conditions even under normal temperature and pressure.
  • the nicotinamide mononucleotide to be obtained can be obtained at a high concentration.
  • the present invention comprises a nicotinamide mononucleotide enrichment reaction step in which a microorganism capable of producing nicotinamide mononucleotide is reacted in a reaction solution having a pH of 4 to 10 (for example, a reaction solution whose pH is adjusted with a buffer solution). It is a method for producing a mononucleotide.
  • Microorganisms capable of producing nicotinamide mononucleotides are not particularly limited, and examples thereof include yeast and lactic acid bacteria.
  • Edible yeast can be used as yeast.
  • yeast belonging to the genus Saccharomyces, the genus Kluyveromyces, the genus Candida, the genus Pichia and the like can be mentioned, and among them, Candida utilis of the genus Candida is preferable. More specifically, Candida utilis IAM4264, Candida utilis ATCC9950, Candida utilis ATCC9550, Candida utilis IAM4233, Candida utilis AHU3259 and the like can be exemplified.
  • lactic acid bacteria examples include lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus, Pediococcus, Melissoccus, Escoccus, and Melissoccoccus. Trichococcus, Lactococcus, Carnobacterium, Vagococcus, Tetragenococcus, Tetragenococcus, Atopococcus, Atopococcus, Atopobium , Abiotrophia, Desemzia, Paralactobacillus, Granulicatella, Alkalibacterium, Olsenella, Olsen Genus Marinilibacillus, Genus Atopostipes, Genus Lactovum, Genus Pilibacter, Genus Fructobacillus, Genus Fructobacillus, Genus Lacticibicum
  • the genus Bifidobacterium and the like can be exemplified, and the genus Fluctobacillus is preferable.
  • Fructobacillus As the genus Fructobacillus, Fructobacillus dulionis, Fructobacillus tropaeoil, and Fructobacillus, preferably from Fructobaclus Examples include Fluctobacillus tropaeoil and Fluctobacillus fructosus.
  • ⁇ Fructobacillus durionis RD011727 ⁇ ( ⁇ NITE BP-02764) ⁇ Fructobacillus tropaeoil RD012353 ⁇ ( ⁇ NITE BP-02765) ⁇ Fructobacillus tropaeoil RD012354 ⁇ ( ⁇ NITE BP-02766) ⁇ Fructobacillus fructosus NBRC3516 ⁇ Fructobacillus durionis NBRC113239 ⁇ Fructobacillus durionis RD011727 ⁇ ( ⁇ NITE BP-02764) ⁇ Fructobacillus tropaeoil RD012353 ⁇ ( ⁇ NITE BP-02765) ⁇ Fructobacillus tropaeoil RD012354 ⁇ ( ⁇ NITE BP -02766), and Fluctobacillus fructosus NBRC3516 strain.
  • one of the above-mentioned microorganisms capable of producing nicotinamide mononucleotide can be used alone or in combination of two or more.
  • the cells of the microorganism separately cultivated in the culturing step can be used.
  • the medium used for culturing microorganisms can be used without particular limitation as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, and minerals.
  • Examples of carbon sources include carbohydrates and carbohydrate materials.
  • carbohydrates include saccharides (monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides), polysaccharides, and sugar alcohols.
  • Examples of the sugar include lactose, sucrose, glucose, starch, xylitol, dextrose and the like.
  • the sugar material may be any organic composition containing sugar, for example, milk and its processed products (skimmed milk powder, whey, milk powder, condensed milk, etc.), soymilk and its processed products (soymilk hydrolyzate, etc.), Examples include foods such as grains, fruits and vegetables.
  • Milk includes those derived from any mammal such as cows, goats, sheep, buffaloes, camels, llamas, donkeys, yaks, horses, reindeer and the like.
  • the carbohydrate may be isolated or contained in the carbohydrate material.
  • fructose sucrose
  • sugar may be in the form contained in fruit (sugar material).
  • These carbon sources may be used alone or in combination of two or more.
  • the concentration of the carbon source in the medium is not particularly limited and may be appropriately set according to the type of medium, the culture method, etc., but for example, 0.5 to 15 w / w%, preferably 1 to 10 w / w%. More preferably, 1.5 to 8.5 w / w% can be mentioned.
  • any inorganic nitrogen source or organic nitrogen source can be used.
  • proteins such as yeast extract (beer yeast, etc.), meat extract, casein, etc .
  • protein hydrolysates such as peptone (proase peptone, etc.), peptides such as peptides; Examples include nitrogen salts.
  • These nitrogen sources may be used alone or in combination of two or more.
  • the concentration of the nitrogen source in the medium is not particularly limited and may be appropriately set according to the type of medium, the culture method, etc., but in the case of a protein, for example, 0.3 to 4 w / w%, preferably 0.5. 3 w / w%, more preferably 1-2 w / w%; in the case of peptides, for example 0.1-2 w / w%, preferably 0.3-1.8 w / w%, more preferably.
  • 0.5 to 1.5 w / w% in the case of nitrogen-containing salts, for example, 0.03 to 1.5 w / w%, preferably 0.05 to 1 w / w%, more preferably 0.1 to 0.1 to 0.5 w / w% is mentioned.
  • Examples of minerals include manganese (manganese sulfate, etc.), zinc, iron, sodium (sodium acetate, etc.), potassium (dipotassium hydrogensulfate, potassium phosphate, etc.), magnesium (magnesium sulfate, etc.), calcium, and phosphorus (phosphate). Potassium, etc.), sulfur (manganesium sulfate, potassium hydrogensulfate, magnesium sulfate, etc.), trace elements, etc. may be mentioned. These minerals may be used alone or in combination of two or more. Among these minerals, manganese, sodium, magnesium and potassium are preferable.
  • the concentration of minerals in the medium is not particularly limited and may be appropriately set according to the type of medium, the culture method, etc., but in the case of manganese, for example, 0.001 to 0.01 w / w%, preferably 0. 003 to 0.008 w / w%; for sodium, for example 0.05 to 1.5 w / w%, preferably 0.1 to 1 w / w%; for magnesium, for example 0.001. Approximately 0.02 w / w%, preferably 0.005 to 0.015 w / w%; in the case of potassium, for example, 0.05 to 1 w / w%, preferably 0.1 to 0.5 w / w%. Can be mentioned.
  • the medium includes vitamins (vitamin B group, etc.), surfactants (nonionic surfactants (Tween, etc.), anionic surfactants (SDS, etc.), antibacterial agents (tricrosan, etc.), antibiotics. It may contain other components such as a substance (monesin, etc.). These other components may be used alone or in combination of a plurality of types. Among these other components. , Preferably a surfactant, more preferably a nonionic surfactant.
  • the concentration of other components in the medium is not particularly limited and may be appropriately set according to the type of other components, the type of medium, the culture method, etc., but when a surfactant is contained, the concentration of the surfactant Examples thereof include 0.01 to 0.5 w / w%, preferably 0.05 to 0.3 w / w%.
  • Culture conditions such as culture temperature and pH can be applied without particular limitation, and may be set according to the microorganism to be used.
  • the culture temperature is preferably 21 to 37 ° C, preferably 25 to 34 ° C
  • the pH is preferably 3.0 to 8.0, particularly preferably 3.5 to 7.0.
  • the culture format may be batch culture, fed-batch culture, or continuous culture, but the latter is industrially preferable.
  • the conditions such as stirring and aeration during culturing are not particularly limited, and a general method may be used.
  • the microorganisms obtained by culturing can be filtered as they are or using filter paper, centrifugation, decantation, screw press, roller press, rotary drum screen, belt screen, vibration screen, multi-plate vibration filter, vacuum dehydration, pressure dehydration. , Belt press, centrifugal concentration dehydration, multiple disc dehydration, etc., and the cells are recovered from the culture solution, or the recovered cells are washed and used for the nicotine amide mononucleotide enrichment reaction. Can be done.
  • the cells recovered from the culture solution more preferably the cells recovered and washed from the culture solution, can be used for the nicotinamide mononucleotide enrichment reaction.
  • the content of nicotinamide mononucleotide in the microorganism can be improved.
  • a reaction solution containing a nicotinamide mononucleotide-producing microorganism and an appropriate reaction liquid and adjusted to pH 4 to 10 is prepared.
  • the reaction solution By maintaining the reaction solution at an appropriate temperature, the reaction enriching the nicotinamide mononucleotide is promoted.
  • the pH of the reaction solution means the pH at the temperature applied during the nicotinamide mononucleotide enrichment reaction.
  • the pH of the reaction solution in the nicotinamide mononucleotide enrichment reaction step is preferably 4.8 to 9.2, more preferably 5.8 to 9.2, and even more preferably 6.8 to 9.2, 6. 8 to 8.2, or 7.8 to 9.2 can be mentioned.
  • the pH of the reaction solution in the nicotinamide mononucleotide enrichment reaction step is preferably 4.8 to 2. 9.2, more preferably 5.8 to 8.2, still more preferably 6.8 to 8.2, and even more preferably 7.8 to 8.2.
  • the pH of the reaction solution in the nicotinamide mononucleotide enrichment reaction step is preferably 5.8 to 8. 2, more preferably 5.8 to 8.2, still more preferably 6.8 to 8.2.
  • the pH of the reaction solution in the nicotinamide mononucleotide enrichment reaction step is preferably 4.8 to 9.2, more preferably 5. 8 to 9.2, more preferably 6.8 to 9.2, even more preferably 7.8 to 9.2, and even more preferably 7.8 to 8.2.
  • the reaction liquid can be used without particular limitation as long as the pH of the reaction liquid can be adjusted within the above range.
  • the reaction liquid includes a medium used for culturing a microorganism having a nicotinamide mononucleotide-producing ability.
  • the reaction liquid is water (a pH adjuster is used during the reaction). Includes adjusting to the optimum pH range), buffers, organic solvents, and mixtures of two or more of these.
  • buffer solution examples include acetate buffer solution, phosphate buffer solution, borate buffer solution, carbon dioxide buffer solution, citric acid buffer solution, Tris buffer solution, HEEPS buffer solution, and MES buffer solution, and these buffers can be exemplified.
  • One type can be used alone from the liquid, or a plurality of types can be used in combination.
  • KHC 8 H 4 O 4 -NaOH (pH 4.0), CH 3 COOH-CH 3 COONa (pH 4.0), MES-NaOH (pH 5.0), CH 3 COOH-CH 3 COONa ( pH 5.0), KH 2 PO 4 -K 2 HPO4 (pH 6.0), MES-NaOH (pH 6.0), KH 2 PO 4 -K 2 HPO 4 (pH 7.0), PIPES-NaOH (pH 7.0) ), HEPES-NaOH (pH 8.0), H 3 BO 4 -NaOH (pH 8.0), CHES-NaOH (pH 9.0), H 3 BO 4 -NaOH (pH 9.0), H 2 CO 3 -NaHCO 3 (pH 10.0), CHES-NaOH (pH 10.0) can be exemplified.
  • organic solvent examples include aromatic compounds such as benzene and benzonitrile, ketones such as acetone, acetylacetone and methyl ethyl ketone, fatty acid esters such as ethyl acetate, butyl acetate, ethyl butyrate and ethyl formate, diethyl ether, dipropyl ether and dipropyl ether.
  • aromatic compounds such as benzene and benzonitrile
  • ketones such as acetone, acetylacetone and methyl ethyl ketone
  • fatty acid esters such as ethyl acetate, butyl acetate, ethyl butyrate and ethyl formate
  • diethyl ether dipropyl ether and dipropyl ether.
  • Ethers such as butyl ether, tetrahydrofuran, 1,4-dioxane, halogenated hydrocarbons such as dichloromethane, chloroform, dichloroethane, 1,2-propanediol, 1,2-butanediol, 1,3-butanediol, 1, 4-butanediol, 2,3-butanediol, 1,2-hexanediol, 1,6-hexanediol, 1,2-pentanediol, 1,5-pentanediol, 2-methyl-2,4-pentanediol , 3-Methyl-1,5-pentanediol and other diols, alcohols with linear or branched alkyl having 1 to 7 carbon atoms, cyclohexanol, 3-methoxy-3-methyl-1-butanol, 3-methoxy- Alcohols such as 1-butanol can be exe
  • the pH adjusting agent one that can be appropriately adjusted to the optimum pH during the reaction may be appropriately selected.
  • an inorganic acid such as hydrochloric acid, an organic acid such as citric acid, sodium hydroxide, potassium hydroxide and the like may be selected.
  • examples thereof include inorganic bases such as hydroxides and organic bases such as organic amines, and one of these compounds can be used alone or in combination of two or more.
  • the reaction temperature in the nicotinamide mononucleotide enrichment reaction step of the present invention is, for example, 10 to 55 ° C, preferably 15 to 45 ° C, more preferably 20 to 37 ° C, still more preferably 20 to 35 ° C.
  • the reaction time is, for example, 0.1 to 48 hours, preferably 1 to 24 hours, and more preferably 3 to 20 hours.
  • the nicotinamide mononucleotide enrichment reaction can be carried out by suspending a microorganism capable of producing nicotinamide mononucleotide in the above reaction liquid and allowing it to stand, stirring or shaking.
  • the nicotinamide mononucleotide-containing microorganisms obtained by the nicotinamide mononucleotide enrichment reaction can be dried as they are by freeze-drying, shelf-drying, spray-drying, etc. to form bacterial cell powder, which can be used as an additive to foods. It can be formulated as an active ingredient in cosmetics or pharmaceuticals.
  • the microorganism containing the nicotinamide mononucleotide obtained by the nicotinamide mononucleotide enrichment reaction can be recovered by solid-liquid separation from the buffer solution by a centrifugation method, a membrane filtration method or the like.
  • the recovered cells can be dried as they are by shelf drying, freeze-drying, or the like to obtain cell powder, which can be blended as an additive to foods or an active ingredient of cosmetics or pharmaceuticals.
  • Test Example 1 Culture of Fructobacillus tropaeoil RD012353 strain
  • Fructobacillus tropaeoil RD012353 strain (deposit number NITE BP-02765), which is a lactic acid bacterium belonging to the genus Fructobacillus having a nicotinamide mononucleotide-producing ability, was used in a culture medium manufactured by Difco. ) Inoculated into 3 ml and expanded and cultured at 30 ° C. for 24 hours. The obtained culture broth was inoculated into 100 ml of MRS medium (main culture medium) so that the OD660 was 0.02, and the cells were shake-cultured at 30 ° C. for 12 hours.
  • MRS medium main culture medium
  • the obtained culture broth was subjected to centrifugation and the cells were collected.
  • the recovered cells were washed with 100 ml of a 0.85 w / w% KCl aqueous solution.
  • the washed cells were subjected to centrifugation again and the cells were collected.
  • Nicotinamide mononucleotide enrichment reaction step (NMN enrichment reaction)
  • the cells recovered in [1-1] above were suspended in 20 ml of the following reaction liquid to prepare a reaction solution, which was then subjected to an NMN enrichment reaction in which the cells were allowed to stand at 25 ° C. for 8 hours.
  • the pH of the reaction solution during the NMN enrichment reaction is as shown in Table 1.
  • the reaction liquid used in the NMN enrichment reaction is shown below.
  • the reaction liquids having a pH of 3.0 and pH 11.0 were used for comparison.
  • Comparative Example 1 0.1 M citric acid buffer (pH 3.0)
  • Example 1 0.1 M acetate buffer (pH 4.0)
  • Example 2 0.1 M acetate buffer (pH 5.0)
  • Example 3 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0)
  • Example 4 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0)
  • Example 6 0.1 M borate buffer (pH 9.0)
  • Example 7 0.1 M carbonate buffer (pH 10.0)
  • Comparative Example 2 0.1 M phosphate buffer (pH 11.0)
  • the cells were collected by centrifugation.
  • the recovered cells were washed with 100 ml of a 0.85 w / w% KCl aqueous solution.
  • the washed cells were subjected to centrifugation again and the cells were collected.
  • nicotinamide mononucleotide (NMN) amount The cells recovered in [1-1] above and the cells recovered in [1-2] above are suspended in 20 ml of ion-exchanged water, and glass beads are used. Was added in equal amounts, and then the cells were crushed with a bead crusher. The crushed cells were separated by centrifugation, and the supernatant (crushed cell extract) was collected. The recovered supernatant was analyzed by HPLC analysis under the following analytical conditions, and the amount of nicotinamide mononucleotide (NMN) produced in the recovered cells was measured. Relative value of NMN production in the cells recovered in [1-2] above, when the NMN production in the cells recovered in [1-1] above (not undergoing NMN enrichment reaction) is 100. Was derived. The results are shown in Table 1.
  • the productivity of NMN can be significantly improved by reacting the cells after the culture in a solution of pH 4 to pH 10.
  • Test Example 2 Culture of Fructobacillus dulionis RD101727 strain
  • Fructobacillus dulionis RD011727 strain (deposit number NITEBP-02746), which is a lactic acid bacterium belonging to the genus Fructobacillus having a nicotinamide mononucleotide-producing ability, is used as a medium (preculture medium) manufactured by Difco.
  • the cells were inoculated into 3 ml and expanded and cultured at 30 ° C. for 24 hours.
  • the obtained culture broth was inoculated into 100 ml of MRS medium (main culture medium) so that the OD660 was 0.02, and the cells were shake-cultured at 30 ° C. for 12 hours.
  • the obtained culture broth was subjected to centrifugation and the cells were collected.
  • the recovered cells were washed with 100 ml of a 0.85 w / w% KCl aqueous solution.
  • the washed cells were subjected to centrifugation again and the cells were collected.
  • Nicotinamide mononucleotide enrichment reaction step (NMN enrichment reaction) NMN in the same manner as in Test Example 1 [1-2], except that the cells recovered in [2-1] above and the reaction liquid used in Examples 1 to 7 of Test Example 1 were used. An enrichment reaction was carried out. The pH of the reaction solution during the NMN enrichment reaction is about the same as that of the reaction liquid, as shown in Table 2.
  • NMN nicotinamide mononucleotide Test Example 1 except that the cells recovered in [2-1] above and the cells recovered in [2-2] above were used. The amount of NMN was measured in the same manner as in [1-3]. Relative value of NMN production in the cells recovered in [2-2] above, when the NMN production in the cells recovered in [2-1] above (not undergoing NMN enrichment reaction) is 100. Was derived. The results are shown in Table 2.
  • the productivity of NMN can be significantly improved by reacting the cells after the culture in a solution of pH 4 to pH 10.
  • Test Example 3 Culture of Fructobacillus FBRC3516 strain
  • Fructobacillus fluctosus NBRC3516 strain which is a lactic acid bacterium belonging to the genus Fructobacillus having nicotinamide mononucleotide-producing ability, was inoculated into 3 ml of MRS medium (preculture medium) manufactured by Difco. The cells were expanded and cultured at room temperature for 24 hours. The obtained culture broth was inoculated into 100 ml of MRS medium (main culture medium) so that the OD660 was 0.02, and the cells were shake-cultured at 30 ° C. for 12 hours. The obtained culture broth was subjected to centrifugation and the cells were collected.
  • MRS medium main culture medium
  • Nicotinamide mononucleotide enrichment reaction step (NMN enrichment reaction) NMN in the same manner as in Test Example 1 [1-2], except that the cells recovered in [3-1] and the reaction liquid used in Examples 1 to 6 of Test Example 1 were used. An enrichment reaction was carried out. The pH of the reaction solution during the NMN enrichment reaction is about the same as that of the reaction liquid, as shown in Table 3.
  • NMN nicotinamide mononucleotide Test Example 1 except that the cells recovered in [3-1] above and the cells recovered in [3-2] above were used. The amount of NMN was measured in the same manner as in [1-3]. Relative value of NMN production in the cells recovered in [3-2] above, when the NMN production in the cells recovered in [3-1] above (not undergoing NMN enrichment reaction) is 100. Was derived. The results are shown in Table 3.
  • the productivity of NMN can be significantly improved by reacting the cells after the culture in a solution of pH 4 to pH 10.
  • Test Example 4 The reaction liquid used for the NMN enrichment reaction was changed to the buffer solution described below (the pH of the reaction solution during the NMN enrichment reaction is about the same as that of the reaction liquid, as shown in Table 4. The same operation as in Test Examples 1 to 3 was performed except for ()), and the relative value of the NMN production amount was derived. The results are shown in Table 4.
  • the reaction solution (buffer solution) used for the NMN enrichment reaction is shown below. Examples 21, 24, 27: 0.1 M MES buffer (pH 5.0) Examples 22, 25, 28: 0.1 M HEPES buffer (pH 7.0) Examples 23, 26, 29: 0.1 M Tris buffer (pH 9.0).
  • Test Example 5 The reaction liquid used for the NMN enrichment reaction was reacted using ion-exchanged water and a 24 wt% NaOH aqueous solution while adjusting the pH during the reaction to 7 (reaction liquid during the NMN enrichment reaction).
  • the pH of NMN was as shown in Table 5), and the same operation as in Test Example 3 was carried out to derive a relative value of NMN production. The results are shown in Table 5.

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Abstract

本発明は、ニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法に関するものである。ニコチンアミドモノヌクレオチド生産能を有する微生物をｐＨ４～１０の溶液中で反応させる工程を含む、ニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法を提供する。

Description

ニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法
　本発明は、ニコチンアミドモノヌクレオチド生産能を有する微生物をｐＨ４～１０の溶液（例えば、緩衝液等）中で反応させるニコチンアミドモノヌクレオチド富化反応工程を含む、ニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法に関する。
　近年、老化および老化関連疾患は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ　ａｄｅｎｉｎｅ　ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ＮＡＤ+）量低下及びＮＡＤ+依存性脱アセチル化酵素サーチュインの活性低下と密接な関わりを持つことが示されている（非特許文献１、２）。また、サーチュインの活性化は、カロリー制限における寿命延長又は健康増進に関わる効果の多くを説明すると考えられている（非特許文献２）。
　ＮＡＤ+は、古くから酸化還元反応の補酵素として知られている一方、近年では、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ、ＣＤ３８／ＣＤ１５７、サーチュインの基質等としての役割も知られるようになった（非特許文献１）。特に、サーチュインによるＮＡＤ+からニコチンアミドへの分解反応は、それと共役するサーチュインによるリシン残基脱アセチル化反応を促進することで、健康、長寿に関わるさまざまな生命現象に関与している（非特許文献１、２）。老化に伴いＮＡＤ+量およびサーチュイン活性は低下する一方で、ニコチンアミドからＮＡＤ+を再合成する律速酵素ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）の酵素反応産物、具体的には、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ＮＭＮ）及びニコチンアミドリボシド（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ　ｒｉｂｏｓｉｄｅ：ＮＲ）といったＮＡＤ+中間代謝産物の補充は、サーチュインを効果的に再活性化する（非特許文献１）ことが知られており、更に、サーチュインの活性化を介して幅広い抗酸化作用を発現することが知られている。このため、ニコチンアミドモノヌクレオチドは、カロリー制限における寿命延長及び健康増進等に関わる多くの生体現象に寄与することが知られている。
　従って、ニコチンアミドモノヌクレオチドを効率的に生産する方法が望まれている。これまで、トルラ酵母等の食経験のある酵母からニコチンアミドモノヌクレオチドが取得できること（特許文献１）、及び、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、Ａ．バイリイ（Ａ．ｂａｙｌｙｉ）、及びＲ．オイトロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）からなる群から選択される細菌の遺伝修飾細菌からニコチンアミドリボシドを取得できること（特許文献２）が報告されている。
　また、ニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法として、β―ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを基質として、Aspergillus 属に属する微生物の代謝組成物を用いて反応させる工程含むβ―ニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法（特許文献３）が知られている。より具体的には、培養した酵母中に含まれるβ―ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを酵素反応により、ニコチンアミドモノヌクレオチドを生成させている。特許の方法では、反応に酵素を用いることを必須としており、生成したニコチンアミドモノヌクレオチドを食用とする際に、安全性の観点も懸念が残る。また、ニコチンアミドモノヌクレオチドの生産量も十分なものとは言えない。
国際公開第２０１７／２０００５０号 国際公開第２０１７／０８３８５８号 国際公開第２０１９／１８１９６１号
Imai, S. & Guarente, L. (2014) Trends Cell Biol., 24, 464-471. Guarente, L. (2013) Genes Dev., 27, 2072-2085.
　ニコチンアミドモノヌクレオチドを産生するこれまでの微生物学的方法では、依然として生産効率に改善の余地がある。
　そこで、本発明は、ニコチンアミドモノヌクレオチドの産生効率の高い製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者は鋭意検討の結果、ニコチンアミドモノヌクレオチド生産能を有する微生物をｐＨ４．０～１０．０の反応液（例えば、緩衝液でｐＨを調整した反応液等）中で反応させることで、ニコチンアミドモノヌクレオチドの産生量が増加することを見出した。本発明は、この知見に基づいてさらに検討を重ねることにより完成したものである。
項１．　ニコチンアミドモノヌクレオチド生産能を有する微生物を、ｐＨ４～１０の反応液中で反応させるニコチンアミドモノヌクレオチド富化反応工程を含む、ニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法。
項２．　ニコチンアミドモノヌクレオチド生産能を有する微生物が、乳酸菌である項１に記載の製造方法。
項３．　ｐＨ４～１０の反応液が、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液からなる群より選択される緩衝液を含む、項１または２に記載の製造方法。
項４．　乳酸菌が、フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属である項１～３のいずれかに記載の製造方法。
項５．　乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ０２７６４）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２７６５）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５４株（寄託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２７６６）、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株からなる群より選ばれる、項１～４のいずれかに記載の製造方法。
　本発明によれば、ニコチンアミドモノヌクレオチド生産能を有する微生物をｐＨ４～１０の反応液中で反応させることで、非常に温和な条件下、常温常圧下であっても、容易にかつ効率よく目的とするニコチンアミドモノヌクレオチドを高濃度で得ることができる。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明はニコチンアミドモノヌクレオチド生産能を有する微生物をｐＨ４～１０の反応液（例えば、緩衝液でｐＨを調整した反応液等）中で反応させるニコチンアミドモノヌクレオチド富化反応工程を含む、ニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法である。
ニコチンアミドモノヌクレオチド生産能を有する微生物
　本発明に用いるニコチンアミドモノヌクレオチド生産能を有する微生物としては、特に限定されないが、酵母、乳酸菌等を例示することができる。
　酵母として食用酵母が使用できる。例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に属する酵母、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｐｉｃｈｉａ属等が挙げられ、中でも、Ｃａｎｄｉｄａ属のＣａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓが好ましい。より具体的には、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ ＩＡＭ４２６４、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ９９５０、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ９５５０、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ ＩＡＭ４２３３、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓＡＨＵ３２５９等を例示することができる。
　乳酸菌としては、例えば、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属、メリソコッカス（Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、トリココッカス（Ｔｒｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、カルノバクテリウム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バゴコッカス（Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ）属、テトラゲノコッカス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、アトポビウム（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ）属、ワイセラ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）属、オエノコッカス（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、アビオトロフィア（Ａｂｉｏｔｒｏｐｈｉａ）属、デスメジア（Ｄｅｓｅｍｚｉａ）属、パララクトバチルス（Ｐａｒａｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、グラヌリカテラ（Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ）属、アルカリバクテリウム（Ａｌｋａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、オルセネラ（Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ）属、イソバキュラム（Ｉｓｏｂａｃｕｌｕｍ）属、マリニラクチバチルス（Ｍａｒｉｎｉｌａｃｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アトポスタイペス（Ａｔｏｐｏｓｔｉｐｅｓ）属、ラクトバム（Ｌａｃｔｏｖｕｍ）属、ピリバクター（Ｐｉｌｉｂａｃｔｅｒ）属、フルクトバチルス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクチシゲミウム（Ｌａｃｔｉｃｉｇｅｍｉｕｍ）属、ババリコッカス（Ｂａｖａｒｉｉｃｏｃｃｕｓ）属、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属等を例示することができ、フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属が好ましい。
　中でも、フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属としては、フルクトバシラス・ドゥリオニス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ）、フルクトバシラス・トロパエオイル（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ）、及びフルクトバシラス・フルクトサス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ）が挙げられ、より好ましくは、フルクトバシラス・トロパエオイル（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ）、及びフルクトバシラス・フルクトサス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ）が挙げられる。
　より好ましい乳酸菌の例としては、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２７６４）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２７６５）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５４株（寄託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２７６６）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ　ＮＢＲＣ３５１６株、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＮＢＲＣ１１３２３９株が挙げられ、更に好ましくは、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２７６４）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２７６５）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５４株（寄託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２７６６）、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ　ＮＢＲＣ３５１６株が挙げられる。
　本発明においては、上記のニコチンアミドモノヌクレオチド生産能を有する微生物から１種を単独で、又は複数種を組み合わせて用いることができる。
　本発明に用いるニコチンアミドモノヌクレオチド生産能を有する微生物は、別途培養工程で培養した微生物の菌体を用いることができる。
　微生物を培養する際の培地には、炭素源、窒素源、ミネラルを含むものであれば、特に制限なく用いることができる。
　炭素源としては、糖質及び糖質材料が挙げられる。糖質としては、糖類（単糖、二糖、オリゴ糖）、多糖類、及び糖アルコールが挙げられる。糖質としては、乳糖、ショ糖、グルコース、デンプン、キシリトール、デキストロース等が挙げられる。糖質材料は、糖質を含む有機組成物であればよく、例えば、乳及びその加工品（脱脂粉乳、ホエイ、ミルクパウダー、練乳等）、豆乳及びその加工品（豆乳加水分解物等）、穀類、果実、野菜等の食品が挙げられる。乳としては、ウシ、ヤギ、ヒツジ、水牛、ラクダ、ラマ、ロバ、ヤク、ウマ、トナカイ等の任意の哺乳動物に由来するものが挙げられる。なお糖質は、単離されたものであってもよいし、糖質材料に含まれているものであってもよい。例えば、フルクトース（糖質）は、果実（糖質材料）に含まれる形態のものを用いてもよい。これらの炭素源は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。
　培地中の炭素源の濃度については特に限定されず、培地の種類や培養方式等に応じて適宜設定すればよいが、例えば０．５～１５ｗ／ｗ％、好ましくは１～１０ｗ／ｗ％、より好ましくは１．５～８．５ｗ／ｗ％が挙げられる。
　窒素源としては、任意の無機窒素源又は有機窒素源を使用することができる。例えば、酵母エキス（ビール酵母等）、肉エキス、カゼイン等のタンパク質；ペプトン（プロテアーゼペプトン等）等のタンパク質加水分解物、ペプチド等のペプチド類；アンモニウム塩（クエン酸アンモニウム等）、硝酸塩等の含窒素塩等が挙げられる。これらの窒素源は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。
　培地中の窒素源の濃度については特に限定されず、培地の種類や培養方式等に応じて適宜設定すればよいが、タンパク質の場合、例えば０．３～４ｗ／ｗ％、好ましくは０．５～３ｗ／ｗ％、より好ましくは１～２ｗ／ｗ％が挙げられ；ペプチド類の場合、例えば０．１～２ｗ／ｗ％、好ましくは０．３～１．８ｗ／ｗ％、より好ましくは０．５～１．５ｗ／ｗ％が挙げられ；含窒素塩の場合、例えば０．０３～１．５ｗ／ｗ％、好ましくは０．０５～１ｗ／ｗ％、より好ましくは０．１～０．５ｗ／ｗ％が挙げられる。
　ミネラルとしては、例えば、マンガン（硫酸マンガン等）、亜鉛、鉄、ナトリウム（酢酸ナトリウム等）、カリウム（硫酸水素二カリウム、リン酸カリウム等）、マグネシウム（硫酸マグネシウム等）、カルシウム、リン（リン酸カリウム等）、硫黄（硫酸マンガン、硫酸水素カリウム、硫酸マグネシウム等）、微量元素等が挙げられる。これらのミネラルは、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。これらのミネラルの中でも、好ましくは、マンガン、ナトリウム、マグネシウム、カリウムが挙げられる。
　培地中のミネラルの濃度については特に限定されず、培地の種類や培養方式等に応じて適宜設定すればよいが、マンガンの場合、例えば０．００１～０．０１ｗ／ｗ％、好ましくは０．００３～０．００８ｗ／ｗ％が挙げられ；ナトリウムの場合、例えば０．０５～１．５ｗ／ｗ％、好ましくは０．１～１ｗ／ｗ％が挙げられ；マグネシウムの場合、例えば０．００１～０．０２ｗ／ｗ％、好ましくは０．００５～０．０１５ｗ／ｗ％が挙げられ；カリウムの場合、例えば０．０５～１ｗ／ｗ％、好ましくは０．１～０．５ｗ／ｗ％が挙げられる。
　培地は、上記成分以外に、ビタミン（ビタミンＢ群等）、界面活性剤（非イオン性界面活剤（Ｔｗｅｅｎ等）、陰イオン性界面活性剤（ＳＤＳ等）、抗菌剤（トリクロサン等）、抗生物質（モネシン等）等の他の成分を含んでもよい。これらの他の成分は、１種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。これらの他の成分の中でも、好ましくは界面活性剤、より好ましくは非イオン性界面活性剤が挙げられる。
　培地中の他の成分の濃度については特に限定されず、他の成分の種類、培地の種類、培養方式等に応じて適宜設定すればよいが、界面活性剤を含む場合、界面活性剤の濃度として、例えば０．０１～０．５ｗ／ｗ％、好ましくは０．０５～０．３ｗ／ｗ％が挙げられる。
  培養温度やｐＨ等の培養条件は、特に制限なく適用でき、使用する微生物に合わせて設定すれば良い。一般的には、培養温度は２１～３７℃、好ましくは２５～３４℃が良く、ｐＨは３．０～８．０、特に３．５～７．０が好ましい。
  培養形式としては、バッチ培養、流加培養、あるいは連続培養のいずれでも良いが、工業的には後者が望ましい。培養時の撹拌、通気等の条件は特に制限なく、一般的な方法でよい。
　培養によって得られた微生物は、そのまま、あるいはろ紙を用いたろ過、遠心分離、デカンテーション、スクリュープレス、ローラープレス、ロータリードラムスクリーン、ベルトスクリーン、振動スクリーン、多重板振動フィルター、真空脱水、加圧脱水、ベルトプレス、遠心濃縮脱水、多重円板脱水等によって固液分離を行い、培養液から菌体を回収し、又はさらに回収した菌体を洗浄したものをニコチンアミドモノヌクレオチド富化反応に用いることができる。好ましくは、培養液から回収した菌体、より好ましくは培養液から回収し且つ洗浄した菌体を、ニコチンアミドモノヌクレオチド富化反応に用いることができる。
　培養工程で得られたニコチンアミドモノヌクレオチド生産能を有する微生物をニコチンアミドモノヌクレオチド富化反応工程に用いることで、微生物中のニコチンアミドモノヌクレオチド含有量を向上させることができる。
　ニコチンアミドモノヌクレオチド富化反応工程では、具体的には、ニコチンアミドモノヌクレオチド生産能を有する微生物と、適当な反応用液体とを含み、且つｐＨ４～１０に調整された反応液を調整し、当該反応液を適当な温度で維持することで、ニコチンアミドモノヌクレオチドを富化する反応を進行させる。なお、本発明において、反応液のｐＨは、ニコチンアミドモノヌクレオチド富化反応時に供される温度でのｐＨを意味する。
　ニコチンアミドモノヌクレオチド富化反応工程における反応液のｐＨとしては、好ましくは４．８～９．２、より好ましくは５．８～９．２、さらに好ましくは６．８～９．２、６．８～８．２、又は７．８～９．２が挙げられる。
　また、ニコチンアミドモノヌクレオチド生産能を有する微生物としてＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２７６５）を用いる場合、ニコチンアミドモノヌクレオチド富化反応工程における反応液のｐＨとしては、好ましくは４．８～９．２、より好ましくは５．８～８．２、さらに好ましくは６．８～８．２、一層好ましくは７．８～８．２が挙げられる。
　ニコチンアミドモノヌクレオチド生産能を有する微生物としてＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２７６４）を用いる場合、ニコチンアミドモノヌクレオチド富化反応工程における反応液のｐＨとしては、好ましくは５．８～８．２、より好ましくは５．８～８．２、さらに好ましくは６．８～８．２が挙げられる。
　ニコチンアミドモノヌクレオチド生産能を有する微生物としてＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株）を用いる場合、ニコチンアミドモノヌクレオチド富化反応工程における反応液のｐＨとしては、好ましくは４．８～９．２、より好ましくは５．８～９．２、さらに好ましくは６．８～９．２、一層好ましくは７．８～９．２、より一層好ましくは７．８～８．２が挙げられる。
　上記反応用液体としては、反応液のｐＨを上記範囲内に調整できる限りにおいて特に制限なく用いることができる。例えば、培養によって得られた微生物をそのままニコチンアミドモノヌクレオチド富化反応に用いる場合は、上記反応用液体としては、ニコチンアミドモノヌクレオチド生産能を有する微生物の培養に用いられた培地が挙げられる。培養によって得られた微生物を培養液から回収し、より好ましくはさらに洗浄した後にニコチンアミドモノヌクレオチド富化反応に用いる場合は、上記反応用液体としては、水（反応中にｐＨ調整剤を用い、至適なｐＨ範囲に調整することを含む）、緩衝液、有機溶剤、及びこれらの２種以上の混合液等が挙げられる。
　緩衝液としては、例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ衝液、ＭＥＳ緩衝液を例示することができ、これらの緩衝液から１種を単独で、又は複数種を組み合わせて用いることができる。
　より具体的には、ＫＨＣ8Ｈ4Ｏ4－ＮａＯＨ (ｐＨ４．０)、ＣＨ3ＣＯＯＨ－ＣＨ3ＣＯＯＮａ（ｐＨ４.０）、ＭＥＳ－ＮａＯＨ (ｐＨ５．０)、ＣＨ3ＣＯＯＨ－ＣＨ3ＣＯＯＮａ（ｐＨ５.０）、ＫＨ2ＰＯ4－Ｋ2ＨＰＯ４（ｐＨ６．０）、ＭＥＳ－ＮａＯＨ(ｐＨ６．０)、 ＫＨ2ＰＯ4－Ｋ2ＨＰＯ4（ｐＨ７．０）、ＰＩＰＥＳ－ＮａＯＨ (ｐＨ７．０) 、ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ(ｐＨ８．０)、Ｈ3ＢＯ4－ＮａＯＨ（ｐＨ８.０）、ＣＨＥＳ－ＮａＯＨ(ｐＨ９．０)、Ｈ3ＢＯ4－ＮａＯＨ（ｐＨ９.０）、Ｈ2ＣＯ3－ＮａＨＣＯ3（ｐＨ１０.０）、ＣＨＥＳ－ＮａＯＨ(ｐＨ１０．０)を例示することができる。中でも、ＣＨ3ＣＯＯＨ－ＣＨ3ＣＯＯＮａ、ＫＨ2ＰＯ4－Ｋ2ＨＰＯ4、Ｈ3ＢＯ4－ＮａＯＨが好ましく、ＫＨ2ＰＯ4－Ｋ2ＨＰＯ4がより好ましい。
　有機溶剤としては、ベンゼン、ベンゾニトリル等の芳香族化合物、アセトン、アセチルアセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、酢酸エチル、酢酸ブチル、酪酸エチル、蟻酸エチル等の脂肪酸エステル類、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジブチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４-ジオキサン等のエーテル類、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、１，２-プロパンジオール、１，２-ブタンジオール、１，３-ブタンジオール、１，４-ブタンジオール、２，３-ブタンジオール、１，２-ヘキサンジオール、１，６-ヘキサンジオール、１，２-ペンタンジオール、１，５-ペンタンジオール、２-メチル-２，４-ペンタンジオール、３-メチル-１，５-ペンタンジオール等のジオール類、炭素数１～７の直鎖又は分岐アルキルを有するアルコール、シクロヘキサノール、３-メトキシ-３-メチル-１-ブタノール、３-メトキシ-１-ブタノール等のアルコール類を例示することができ、これらの有機溶剤から１種を単独で、又は複数種を組み合わせて用いることができる。
　ｐＨ調整剤としては、反応中に至適ｐＨに調整することのできるものを適宜選択すればよいが、例えば、塩酸等の無機酸、クエン酸等の有機酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の水酸化物等の無機塩基、有機アミン等の有機塩基が挙げられ、これらの化合物から１種を単独で、又は複数種を組み合わせて用いることができる。
　本発明のニコチンアミドモノヌクレオチド富化反応工程における反応温度は、例えば１０～５５℃、好ましくは１５～４５℃、より好ましくは２０～３７℃、さらに好ましくは２０～３５℃である。反応時間は、例えば０．１～４８時間、好ましくは１～２４時間、より好ましくは３～２０時間である。
　ニコチンアミドモノヌクレオチド富化反応は、ニコチンアミドモノヌクレオチド生産能を有する微生物を上記の反応用液体に懸濁し、静置、攪拌または振盪することで行うことができる。
　ニコチンアミドモノヌクレオチド富化反応によって得られたニコチンアミドモノヌクレオチドを含む微生物は、そのまま凍結乾燥、棚乾燥、スプレードライ等により乾燥することで、菌体粉末とすることで、食品への添加物若しくは化粧品又は医薬品の有効成分として配合することができる。
また、ニコチンアミドモノヌクレオチド富化反応によって得られたニコチンアミドモノヌクレオチドを含む微生物は、遠心分離法、膜ろ過法等によって、緩衝液と固液分離して回収することもできる。回収された菌体は、そのまま棚乾燥や凍結乾燥等により乾燥することで、菌体粉末とすることで、食品への添加物若しくは化粧品又は医薬品の有効成分として配合することができる。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。
試験例１
［１－１］Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株の培養
　ニコチンアミドモノヌクレオチド生産能を有するフルクトバシラス属乳酸菌であるＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２７６５）を、Ｄｉｆｃｏ社製のＭＲＳ培地（前培養培地）３ｍｌに植菌し、３０℃で２４時間、静置で拡大培養した。得られた培養液をＯＤ６６０が０.０２となるように、ＭＲＳ培地（本培養培地）１００ｍｌに植菌し、３０℃で１２時間、振とう培養した。
　得られた培養液を遠心分離に供して菌体を回収した。回収した菌体を１００ｍｌの０.８５ｗ／ｗ％ＫＣｌ水溶液で洗浄した。洗浄した菌体を再度遠心分離に供し、菌体を回収した。
［１－２］ニコチンアミドモノヌクレオチド富化反応工程（ＮＭＮ富化反応）
　上記［１－１］で回収した菌体をそれぞれ２０ｍｌの下記反応用液体中に懸濁して反応液を調製し、２５℃で８時間静置するＮＭＮ富化反応に付した。ＮＭＮ富化反応中の反応液のｐＨは、表１に示す通りである。
　ＮＭＮ富化反応で用いた反応用液体を以下に示す。なお、ｐＨが３．０及びｐＨ１１．０の反応用液体は比較用に用いた。
・比較例１：０．１Ｍクエン酸緩衝液(ｐＨ３．０)
・実施例１：０．１Ｍ酢酸緩衝液(ｐＨ４．０)
・実施例２：０．１Ｍ酢酸緩衝液(ｐＨ５．０)
・実施例３：０．１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ６．０)
・実施例４：０．１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ７．０)
・実施例５：０．１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ８．０)
・実施例６：０．１Ｍホウ酸緩衝液(ｐＨ９．０)
・実施例７：０．１Ｍ炭酸緩衝液(ｐＨ１０．０)
・比較例２：０．１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ１１．０)
　反応終了後、遠心分離にて菌体を回収した。回収した菌体を１００ｍｌの０.８５ｗ／ｗ％ＫＣｌ水溶液で洗浄した。洗浄した菌体を再度遠心分離に供し、菌体を回収した。
［１－３］ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）量測定
　上記［１－１］で回収した菌体と、上記［１－２］で回収した菌体を２０ｍｌのイオン交換水に懸濁し、ガラスビーズを等量添加した後、ビーズ破砕機にて菌体を破砕した。破砕した菌体を遠心分離にて分離し、上清（菌体破砕抽出液）を回収した。
　回収した上清を下記分析条件のＨＰＬＣ分析で分析し、回収菌体中のニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）生産量を測定した。上記［１－１］で回収した菌体（ＮＭＮ富化反応を行っていない）におけるＮＭＮ生産量を１００とした場合の、上記［１－２］で回収した菌体におけるＮＭＮ生産量の相対値を導出した。結果を表１に示す。
（ＭＲＳ培地組成）
　２ｗ／ｗ％　グルコース
　１ｗ／ｗ％　プロテアーゼペプトン
　１ｗ／ｗ％　牛肉エキス
　０．５ｗ／ｗ％　酵母エキス
　０．２ｗ／ｗ％　クエン酸アンモニウム
　０．１ｗ／ｗ％　Ｔｗｅｅｎ８０
　０．５ｗ／ｗ％　酢酸ナトリウム
　０．０１ｗ／ｗ％　硫酸マグネシウム
　０．００５ｗ／ｗ％　硫酸マンガン
　０．２ｗ／ｗ％　リン酸水素二カリウム
（ＨＰＬＣ分析条件）
　カラム：ＤａｉｓｏＰａｋ　ＳＰ-１００-５-ＯＤＳ-Ｐ（４.６×１５０ｍｍ）×２本
　カラム温度：２５℃
　溶離液    ：７５ｍＭ リン酸アンモニウム水溶液（ｐＨ６.０）
　流速      ：０.６ｍｌ/ｍｉｎ
　検出器    ：ＵＶ検出器（２６０ｎｍ）
　検出時間  ：１５.１分
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示すように、培養終了後の菌体をｐＨ４からｐＨ１０の溶液中で反応することにより、ＮＭＮの生産性を著しく向上させることができる。
試験例２
［２－１］Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＲＤ０１１７２７株の培養
　ニコチンアミドモノヌクレオチド生産能を有するフルクトバシラス属乳酸菌であるＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥＢＰ－０２７６４）を、Ｄｉｆｃｏ社製のＭＲＳ培地（前培養培地）３ｍｌに植菌し、３０℃で２４時間、静置で拡大培養した。得られた培養液をＯＤ６６０が０.０２となるように、ＭＲＳ培地（本培養培地）１００ｍｌに植菌し、３０℃で１２時間、振とう培養した。
　得られた培養液を遠心分離に供して菌体を回収した。回収した菌体を１００ｍｌの０.８５ｗ／ｗ％ＫＣｌ水溶液で洗浄した。洗浄した菌体を再度遠心分離に供し、菌体を回収した。
［２－２］ニコチンアミドモノヌクレオチド富化反応工程（ＮＭＮ富化反応）
　上記［２－１］で回収した菌体と、試験例１の実施例１～７で用いた反応用液体とを用いたことを除き、試験例１の［１－２］と同様にしてＮＭＮ富化反応を行った。ＮＭＮ富化反応中の反応液のｐＨは、反応用液体と同程度であり、表２に示す通りである。
［２－３］ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）量測定
　上記［２－１］で回収した菌体と、上記［２－２］で回収した菌体を用いたことを除いて、試験例１の［１－３］と同様にしてＮＭＮ量を測定した。上記［２－１］で回収した菌体（ＮＭＮ富化反応を行っていない）におけるＮＭＮ生産量を１００とした場合の、上記［２－２］で回収した菌体におけるＮＭＮ生産量の相対値を導出した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示すように、培養終了後の菌体をｐＨ４からｐＨ１０の溶液中で反応することにより、ＮＭＮの生産性を著しく向上させることができる。
試験例３
［３－１］Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ　ＮＢＲＣ３５１６株の培養
　ニコチンアミドモノヌクレオチド生産能を有するフルクトバシラス属乳酸菌であるＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ　ＮＢＲＣ３５１６株を、Ｄｉｆｃｏ社製のＭＲＳ培地（前培養培地）３ｍｌに植菌し、３０℃で２４時間、静置で拡大培養した。得られた培養液をＯＤ６６０が０.０２となるように、ＭＲＳ培地（本培養培地）１００ｍｌに植菌し、３０℃で１２時間、振とう培養した。
　得られた培養液を遠心分離に供して菌体を回収した。
［３－２］ニコチンアミドモノヌクレオチド富化反応工程（ＮＭＮ富化反応）
　上記［３－１］で回収した菌体と、試験例１の実施例１～６で用いた反応用液体とを用いたことを除き、試験例１の［１－２］と同様にしてＮＭＮ富化反応を行った。ＮＭＮ富化反応中の反応液のｐＨは、反応用液体と同程度であり、表３に示す通りである。
［３－３］ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）量測定
　上記［３－１］で回収した菌体と、上記［３－２］で回収した菌体を用いたことを除いて、試験例１の［１－３］と同様にしてＮＭＮ量を測定した。上記［３－１］で回収した菌体（ＮＭＮ富化反応を行っていない）におけるＮＭＮ生産量を１００とした場合の、上記［３－２］で回収した菌体におけるＮＭＮ生産量の相対値を導出した。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示すように、培養終了後の菌体をｐＨ４からｐＨ１０の溶液中で反応することにより、ＮＭＮの生産性を著しく向上させることができる。
試験例４
　ＮＭＮ富化反応に用いた反応用液体を、下記に記載した緩衝液に変更した（ＮＭＮ富化反応中の反応液のｐＨは、反応用液体と同程度であり、表４に示す通りである。）以外は、試験例１～３と同様の操作を行い、ＮＭＮ生産量の相対値を導出した。結果を表４に示す。
ＮＭＮ富化反応に用いた反応液（緩衝液）を以下に示す。
・実施例２１，２４，２７：０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液(ｐＨ５．０)
・実施例２２，２５，２８：０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液(ｐＨ７．０)
・実施例２３，２６，２９：０．１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液(ｐＨ９．０)
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４に示すように、培養終了後の菌体をｐＨ４からｐＨ１０の溶液中で反応することにより、緩衝液の種類に因らずＮＭＮの生産性を著しく向上させることができる。
試験例５
　ＮＭＮ富化反応に用いた反応用液体を、イオン交換水を用い、２４重量％ＮａＯＨ水溶液を用いて、反応中のｐＨを７に調整しながら反応を行った（ＮＭＮ富化反応中の反応液のｐＨは、表５に示す通りである。）以外は、試験例３と同様の操作を行い、ＮＭＮ生産量の相対値を導出した。結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005

Claims (5)

  1. 　ニコチンアミドモノヌクレオチド生産能を有する微生物を、ｐＨ４～１０の反応液中で反応させるニコチンアミドモノヌクレオチド富化反応工程を含む、ニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法。
  2. 　ニコチンアミドモノヌクレオチド生産能を有する微生物が、乳酸菌である請求項１に記載の製造方法。
  3. 　ｐＨ４～１０の反応液が、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液からなる群より選択される緩衝液を含む、請求項１または２に記載の製造方法。
  4. 　乳酸菌が、フルクトバシラス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属である請求項１～３のいずれかに記載の製造方法。
  5. 　乳酸菌が、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｕｒｉｏｎｉｓ　ＲＤ０１１７２７株（寄託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２７６４）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５３株（寄託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２７６５）、Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐａｅｏｉｌ　ＲＤ０１２３５４株（寄託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２７６６）、及びＦｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ ＮＢＲＣ３５１６株からなる群より選ばれる、請求項１～４のいずれかに記載の製造方法。
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