KR20230124883A - 니코틴아미드 모노뉴클레오티드의 제조 방법 - Google Patents

니코틴아미드 모노뉴클레오티드의 제조 방법 Download PDF

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가부시키가이샤 오사카소다
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Abstract

본 발명은 니코틴아미드 모노뉴클레오티드의 제조 방법에 관한 것이다. 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 생산능을 갖는 미생물을 pH 4 ~ 10의 용액에서 반응시키는 공정을 포함하는, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드의 제조 방법을 제공한다.

Description

니코틴아미드 모노뉴클레오티드의 제조 방법
본 발명은, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 생산능을 갖는 미생물을 pH 4 내지 10의 용액(예를 들어, 완충액 등) 중에서 반응시키는 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 부화(富化, enrichment) 반응 공정을 포함하는, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드의 제조 방법에 관한 것이다.
최근, 노화 및 노화 관련 질환은 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(nicotinamide adenine dinucleotide: NAD+) 양 저하 및 NAD+ 의존성 탈아세틸화효소 시르투인의 활성 저하와 밀접한 관련이 있는 것으로 나타나고 있다(비특허문헌 1, 2). 또한, 시르투인의 활성화는 칼로리 제한에 있어서의 수명 연장 또는 건강 증진과 관련된 효과의 많은 부분을 설명해주는 것으로 생각되고 있다(비특허문헌 2).
NAD+는, 옛부터 산화 환원 반응의 조효소로서 알려져 있는 한편, 최근에는, 폴리 ADP-리보스 폴리메라아제, CD38/CD157, 시르투인의 기질 등으로서의 역할도 알려지게 되었다(비특허문헌 1). 특히, 시르투인에 의한 NAD+로부터 니코틴아미드로의 분해 반응은, 그와 공액하는 시르투인에 의한 리신 잔기 탈아세틸화 반응을 촉진함으로써, 건강 및 장수와 관련된 다양한 생명 현상에 관여하고 있다(비특허문헌 1, 2). 노화에 따라 NAD+ 양 및 시르투인 활성은 저화되는 한편, 니코틴아미드로부터 NAD+를 재합성하는 속도제한효소 니코틴아미드 포스포리보실트랜스퍼라제(NAMPT)의 효소 반응 산물, 구체적으로는 니코틴아미드 모노뉴클레오티드(nicotinamide mononucleotide: NMN) 및 니코틴아미드 리보사이드(nicotinamide riboside: NR)와 같은 NAD+ 중간 대사 산물의 보충은 시르투인을 효과적으로 재활성화하는 것(비특허문헌 1)으로 알려져 있으며, 또한 시르투인의 활성화를 통해 광범위한 항산화 작용을 발현하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드는 칼로리 제한에 있어서의 수명 연장 및 건강 증진 등과 관련된 많은 생체 현상에 기여하는 것으로 알려져 있다.
따라서, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드를 효율적으로 생산하는 방법이 요망되고 있다. 지금까지, 토룰라 효모 등의 식경험(食經驗)이 있는 효모로부터 니코틴아미드 모노뉴클레오티드를 취득할 수 있는 것(특허문헌 1), 및, 대장균(E. coli), B. 서브틸리스(B. subtilis), C. 글루타미쿰(C. glutamicum), A. 바이리(A. Baylyi), 및 R. 오이트로파(R. eutropha)로 이루어지는 군에서 선택되는 세균의 유전 수식 세균으로부터 니코틴아미드 리보시드를 취득할 수 있는 것(특허문헌 2)이 보고되어 있다.
또한, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드의 제조 방법으로서, β-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드를 기질로 하여 아스페르길루스(Aspergillus)속에 속하는 미생물의 대사 조성물을 이용하여 반응시키는 공정을 포함하는 β-니코틴아미드 모노뉴클레오티드의 제조 방법(특허문헌 3)이 알려져 있다. 보다 구체적으로는, 배양된 효모 중에 함유되는 β-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드를 효소 반응에 의해 니코틴아미드 모노뉴클레오티드를 생성시키고 있다. 특허의 방법에서는 반응에 효소를 이용하는 것을 필수로 하고 있어, 생성된 니코틴아미드 모노뉴클레오티드를 식용으로 할 때에 안전성의 관점에서도 우려가 존재한다. 또한, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드의 생산량도 충분하다고는 말할 수 없다.
특허문헌 1: 국제공개 제2017/200050호 특허문헌 2: 국제공개 제2017/083858호 특허문헌 3: 국제공개 제2019/181961호
비특허문헌 1: Imai, S. & Guarente, L. (2014) Trends Cell Biol., 24, 464-471. 비특허문헌 2: Guarente, L. (2013) Genes Dev., 27, 2072-2085.
니코틴아미드 모노뉴클레오티드를 생산하는 종래의 미생물학적 방법은 여전히 생산 효율에 대한 개선의 여지가 있다.
따라서, 본 발명은 니코틴아미드 모노뉴클레오티드의 생산 효율이 높은 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자는 예의검토를 한 결과, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 생산능을 갖는 미생물을 pH 4.0 내지 10.0의 반응액(예를 들어, 완충액으로 pH를 조정한 반응액 등) 중에서 반응시킴으로써, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드의 생산량이 증가되는 것을 발견했다. 본 발명은, 이 지견에 기초하여 추가적인 검토를 거듭함으로써 완성된 것이다.
항 1. 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 생산능을 갖는 미생물을 pH 4 내지 10의 반응액 중에서 반응시키는 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 부화 반응 공정을 포함하는, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드의 제조 방법.
항 2. 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 생산능을 갖는 미생물이 유산균인, 항 1에 기재된 제조 방법.
항 3. pH 4 내지 10의 반응액이 아세트산 완충액, 인산 완충액, 붕산 완충액, 탄산 완충액, 트리스 완충액, HEPES 완충액, MES 완충액으로 이루어지는 군에서 선택되는 완충액을 포함하는, 항 1 또는 2에 기재된 제조 방법.
항 4. 유산균이 프룩토바실러스(Fructobacillus)속인 항 1 내지 3 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
항 5. 유산균이, 프룩토바실러스 두리오니스(Fructobacillus durionis) RD011727 주(기탁 번호 NITE BP02764), 프룩토바실러스 트로파에오일(Fructobacillus tropaeoil) RD012353 주(기탁 번호 NITE BP-02765), 프룩토바실러스 트로파에오일(Fructobacillus tropaeoil) RD012354 주(기탁 번호 NITE BP-02766), 및 프룩토바실러스 프룩토서스(Fructobacillus fructosus) NBRC3516 주로 이루어지는 군에서 선택되는, 항 1 내지 항 4 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법.
본 발명에 의하면, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 생산능을 갖는 미생물을 pH 4 내지 10의 반응액 중에서 반응시킴으로써, 매우 온화한 조건하 및 상온 상압하에서도 용이하면서 효율적으로 목적하는 니코틴아미드 모노뉴클레오티드를 고농도로 얻을 수 있다.
이하에서는, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 생산능을 갖는 미생물을 pH 4 내지 10의 반응액(예를 들어, 완충액으로 pH를 조정한 반응액 등) 중에서 반응시키는 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 부화 반응 공정을 포함하는, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드의 제조 방법이다.
니코틴아미드 모노뉴클레오티드 생산능을 갖는 미생물
본 발명에 이용하는 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 생산능을 갖는 미생물로서는, 특별히 한정되지 않지만, 효모, 유산균 등을 예시할 수 있다.
효모로서 식용 효모를 사용할 수 있다. 예를 들어, 사카로마이세스(Saccharomyces)속에 속하는 효모, 클루이베로미세스(Kluyveromyces)속, 칸디다(Candida)속, 피키아(Pichia)속 등을 들 수 있으며, 그 중에서도 칸디다(Candida)속의 칸디다 유틸리스(Candida utilis)가 바람직하다. 보다 구체적으로는, Candida utilis IAM4264, Candida utilis ATCC9950, Candida utilis ATCC9550, Candida utilis IAM4233, Candida utilis AHU3259 등을 예시할 수 있다.
유산균으로서는, 예를 들어, 락토바실러스(Lactobacillus)속, 류코노스톡(Leuconostoc)속, 스트렙토코커스(Streptococcus)속, 페디오코커스(Pediococcus)속, 멜리소코커스(Melissococcus)속, 엔테로코커스(Enterococcus)속, 트리코코커스(Trichococcus)속, 락토코커스(Lactococcus)속, 카르노박테륨(Carnobacterium)속, 바고코커스(Vagococcus)속, 테트라제노코커스(Tetragenococcus)속, 아토포비움(Atopobium)속, 와이셀라(Weissella)속, 오에노코커스(Oenococcus)속, 아비오트로피아(Abiotrophia)속, 데스메디아(Desemzia)속, 파랄락토바실루스(Paralactobacillus)속, 그래뉼리케텔라(Granulicatella)속, 알칼리박테리움(Alkalibacterium)속, 올세넬라(Olsenella)속, 이소바큘럼(Isobaculum)속, 마리닐락티바실루스(Marinilactibacillus)속, 아토포스타이페스(Atopostipes)속, 락토붐(Lactovum)속, 필리박터(Pilibacter)속, 프룩토바실러스(Fructobacillus)속, 락티시게미움(Lacticigemium)속, 바바리코커스(Bavariicoccus)속, 비피더박게리움(Bifidobacterium) 속 등을 예시 할 수 있고, 프룩토바실러스 (Fructobacillus) 속이 바람직하다.
그 중에서도, 프룩토바실러스(Fructobacillus)속으로서는, 프룩토바실러스· 두리오니스(Fructobacillus durionis), 프룩토바실러스 트로파에오일(Fructobacillus tropaeoil), 및 프룩토바실러스 프룩토서스(Fructobacillus fructosus)를 들 수 있으며, 보다 바람직하게는, 프룩토바실러스 트로파에오일(Fructobacillus tropaeoil), 및 프룩토바실러스 프룩토서스(Fructobacillus fructosus)를 들 수 있다.
보다 바람직한 유산균의 예로서는, 프룩토바실러스 두리오니스(Fructobacillus durionis) RD011727 주(기탁 번호 NITE BP-02764), 프룩토바실러스 트로파에오일(Fructobacillus tropaeoil) RD012353 주(기탁 번호 NITE BP-02765), 프룩토바실러스 트로파에오일(Fructobacillus tropaeoil) RD012354 주(기탁 번호 NITE BP-02766), 프룩토바실러스 프룩토서스(Fructobacillus fructosus) NBRC3516 주, 및 프룩토바실러스 두리오니스(Fructobacillus durionis) NBRC113239 주를 들 수 있고, 더욱 바람직하게는, 프룩토바실러스 두리오니스(Fructobacillus durionis) RD011727 주(기탁 번호 NITE BP-02764), 프룩토바실러스 트로파에오일(Fructobacillus tropaeoil) RD012353 주(기탁 번호 NITE BP-02765), 프룩토바실러스 트로파에오일(Fructobacillus tropaeoil) RD012354 주(기탁 번호 NITE BP-02766), 및 프룩토바실러스 프룩토서스(Fructobacillus fructosus) NBRC3516 주를 들 수 있다.
본 발명에 있어서는, 상기 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 생산능을 갖는 미생물로부터 1종을 단독으로, 또는 복수종을 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명에 이용하는 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 생산능을 갖는 미생물은, 별도 배양 공정에서 배양한 미생물의 균체를 이용할 수 있다.
미생물을 배양할 때의 배지에는, 탄소원, 질소원, 미네랄을 포함하는 것이면, 특별히 제한없이 사용할 수 있다.
탄소원으로서는 당질 및 당질 재료를 들 수 있다. 당질로서는 당류(단당, 이당, 올리고당), 다당류 및 당 알코올을 들 수 있다. 당질로서는 유당, 자당, 글루코오스, 전분, 자일리톨, 덱스트로스 등을 들 수 있다. 당질 재료는, 당질을 포함하는 유기 조성물이면 되고, 예를 들면, 유(乳) 및 그 가공품(탈지 분유, 훼이(whey), 밀크 파우더, 연유 등), 두유 및 그 가공품(두유 가수분해물 등), 곡류, 과일, 야채 등의 식품을 들 수 있다. 유(乳)로서는 소, 염소, 양, 물소, 낙타, 라마, 당나귀, 야크, 말, 순록과 같은 임의의 포유 동물에서 유래하는 것들을 들 수 있다. 또한, 당질은 단리된 것이어도 되고, 당질 재료에 포함되어 있는 것이어도 된다. 예를 들어, 프룩토오스(당질)는 과일(당질 재료)에 포함되는 형태의 것을 이용해도 된다. 이들 탄소원은, 1종을 단독으로 이용해도 되고, 복수종을 조합하여 이용해도 된다.
배지 중의 탄소원의 농도에 대해서는 특별히 한정되지 않고, 배지의 종류나 배양 방식 등에 따라 적절히 설정하면 되지만, 예를 들면 0.5 ∼ 15w/w%, 바람직하게는 1 ∼ 10w/w%, 보다 바람직하게는 1.5 ~ 8.5w/w%를 들 수 있다.
질소원으로서는, 임의의 무기 질소원 또는 유기 질소원을 사용할 수 있다. 예를 들면, 효모 엑기스(맥주 효모 등), 고기 엑기스, 카제인 등의 단백질; 펩톤(프로테아제 펩톤 등) 등의 단백질 가수분해물, 펩티드 등의 펩티드류; 암모늄염(시트르산 암모늄 등), 질산염 등의 질소 함유 염 등을 들 수 있다. 이들 질소원은, 1종을 단독으로 이용해도 되고, 복수종을 조합하여 이용해도 된다.
배지 중의 질소원의 농도에 대해서는 특별히 한정되지 않고, 배지의 종류나 배양 방식 등에 따라 적절히 설정하면 되지만, 단백질의 경우, 예를 들면 0.3 ∼ 4w/w%, 바람직하게는 0.5 ~ 3w/w%, 보다 바람직하게는 1 ~ 2w/w%를 들 수 있고; 펩티드류의 경우, 예를 들면 0.1 ~ 2w/w%, 바람직하게는 0.3 ~ 1.8w/w%, 보다 바람직하게는 0.5 ~ 1.5w/w%를 들 수 있고; 질소 함유 염의 경우, 예를 들면 0.03 ~ 1.5w/w%, 바람직하게는 0.05 ~ 1w/w%, 보다 바람직하게는 0.1 ~ 0.5w/w%를 들 수 있다.
미네랄로서는, 예를 들면, 망간(황산망간 등), 아연, 철, 나트륨(아세트산나트륨 등), 칼륨(황산수소이칼륨, 인산칼륨 등), 마그네슘(황산마그네슘 등), 칼슘, 인(인산 칼륨 등), 유황(황산망간, 황산수소칼륨, 황산마그네슘 등), 미량 원소 등을 들 수 있다. 이들 미네랄은 1종을 단독으로 사용해도 되고, 복수종을 조합하여 이용해도 된다. 이들 미네랄 중에서도, 바람직하게는 망간, 나트륨, 마그네슘, 칼륨을 들 수 있다.
배지 중의 미네랄의 농도에 대해서는 특별히 한정되지 않고, 배지의 종류나 배양 방식 등에 따라 적절히 설정하면 되지만, 망간의 경우, 예를 들면 0.001 ∼ 0.01w/w%, 바람직하게는 0.003 ~ 0.008w/w%를 들 수 있고; 나트륨의 경우, 예를 들면 0.05 ~ 1.5w/w%, 바람직하게는 0.1 ~ 1w/w%를 들 수 있고; 마그네슘의 경우, 예를 들면 0.001 ~ 0.02w/w%, 바람직하게는 0.005 ~ 0.015w/w%를 들 수 있고; 칼륨의 경우, 예를 들면 0.05 ~ 1w/w%, 바람직하게는 0.1 ~ 0.5w/w%를 들 수 있다.
배지는 상기 성분 이외에 비타민(비타민 B군 등), 계면활성제(비이온성 계면활성제(Tween 등), 음이온성 계면활성제(SDS 등) 등), 항균제(트리클로산 등), 항생 물질(모네신 등) 등의 다른 성분을 포함해도 된다. 이들 다른 성분은, 1종을 단독으로 이용해도 되고, 복수종을 조합하여 이용해도 된다. 이들 다른 성분 중에서도, 바람직하게는 계면활성제, 보다 바람직하게는 비이온성 계면활성제를 들 수 있다.
배지 중의 다른 성분의 농도에 대해서는 특별히 한정되지 않고, 다른 성분의 종류, 배지의 종류, 배양 방식 등에 따라 적절히 설정하면 되지만, 계면활성제를 포함하는 경우, 계면활성제의 농도 예를 들면, 0.01 ~ 0.5w/w%, 바람직하게는 0.05 ~ 0.3w/w%를 들 수 있다.
배양 온도나 pH 등의 배양 조건은, 특별히 제한 없이 적용할 수 있고, 사용하는 미생물에 맞추어 설정하면 된다. 일반적으로는 배양 온도는 21 ~ 37℃, 바람직하게는 25 ~ 34℃가 좋고, pH는 3.0 ~ 8.0, 특히 3.5 ~ 7.0이 바람직하다.
배양 형식으로서는, 배치 배양, 유가 배양, 또는 연속 배양 중 어느 것이어도 되지만, 공업적으로는 후자가 바람직하다. 배양시의 교반, 환기 등의 조건은 특별히 제한되지 않고, 일반적인 방법이면 된다.
배양에 의해 얻어진 미생물은 그대로 또는 여과지를 이용한 여과, 원심분리, 디캔테이션, 스크류 프레스, 롤러 프레스, 로터리 드램 스크린, 벨트 스크린, 진동 스크린, 다중판 진동 필터, 진공 탈수, 가압 탈수, 벨트 프레스, 원심 농축 탈수, 다중 원판 탈수 등에 의해 고액분리를 행하고, 배양액으로부터 균체를 회수하거나, 또는 추가로 회수한 균체를 세정한 것을 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 부화 반응에 이용할 수 있다. 바람직하게는, 배양액으로부터 회수한 균체, 보다 바람직하게는 배양액으로부터 회수하고, 또한, 세정한 균체를, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 부화 반응에 이용할 수 있다.
배양 공정에서 얻어진 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 생산능을 갖는 미생물을 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 부화 반응 공정에 이용함으로써, 미생물 중의 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 함유량을 향상시킬 수 있다.
니코틴아미드 모노뉴클레오티드 부화 반응 공정에서는, 구체적으로는, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 생산능을 갖는 미생물과, 적절한 반응용 액체를 포함하고, 또한, pH 4 내지 10으로 조정된 반응액을 조정하고, 당해 반응액을 적당한 온도로 유지시킴으로써, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드를 부화하게 하는 반응을 진행시킨다. 또한, 본 발명에 있어서, 반응액의 pH는, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 부화 반응시에 제공되는 온도에서의 pH를 의미한다.
니코틴아미드 모노뉴클레오티드 부화 반응 공정에 있어서의 반응액의 pH로서는 바람직하게는 4.8 ~ 9.2, 보다 바람직하게는 5.8 ~ 9.2, 더욱 바람직하게는 6.8 ~ 9.2, 6.8 ~ 8.2, 또는 7.8 ~ 9.2를 들 수 있다.
또한, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 생산능을 갖는 미생물로서 프룩토바실러스 트로파에오일(Fructobacillus tropaeoil) RD012353 주(기탁 번호 NITE BP-02765)를 이용하는 경우, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 부화 반응 공정에 있어서의 반응액의 pH로서는 바람직하게는 4.8 ~ 9.2, 보다 바람직하게는 5.8 ~ 8.2, 더욱 바람직하게는 6.8 ~ 8.2, 한층 바람직하게는 7.8 ~ 8.2를 들 수 있다.
니코틴아미드 모노뉴클레오티드 생산능을 갖는 미생물로서 프룩토바실러스 두리오니스(Fructobacillus durionis) RD011727 주(기탁 번호 NITE BP-02764)를 이용하는 경우, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 부화 반응 공정에 있어서의 반응액의 pH로서는 바람직하게는 5.8 ~ 8.2, 더욱 바람직하게는 6.8 ~ 8.2를 들 수 있다.
니코틴아미드 모노뉴클레오티드 생산능을 갖는 미생물로서 프룩토바실러스 프룩토서스(Fructobacillus fructosus) NBRC3516 주를 사용하는 경우, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 부화 반응 공정에 있어서의 반응액의 pH로서는, 바람직하게는 4.8 ~ 9.2, 보다 바람직하게는 5.8 ~ 9.2, 더욱 바람직하게는 6.8 ~ 9.2, 더욱 바람직하게는 7.8 ~ 9.2, 보다 한층 바람직하게는 7.8 ~ 8.2를 들 수 있다.
상기 반응용 액체로서는, 반응액의 pH를 상기 범위 내로 조정할 수 있는 한, 특별히 제한없이 이용할 수 있다. 예를 들면, 배양에 의해 얻어진 미생물을 그대로 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 부화 반응에 이용하는 경우에는, 상기 반응용 액체로서는, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 생산능을 갖는 미생물의 배양에 이용된 배지를 들 수 있다. 배양에 의해 얻어진 미생물을 배양액으로부터 회수하고, 보다 바람직하게는 추가로 세정한 후에 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 부화 반응에 이용하는 경우는, 상기 반응용 액체로서는 물(반응 중에 pH 조정제를 이용하고, 최적의 pH 범위로 조정하는 것을 포함함), 완충액, 유기 용제 및 이들 2종 이상의 혼합액 등을 들 수 있다.
완충액으로서는, 예를 들면, 아세트산 완충액, 인산 완충액, 붕산 완충액, 탄산 완충액, 시트르산 완충액, 트리스 완충액, HEPES 완충액, MES 완충액을 예시할 수 있으며, 이들 완충액으로부터 1종을 단독으로, 또는 복수종을 조합하여 이용할 수 있다.
보다 구체적으로는, KHC8H4O4-NaOH(pH 4.0), CH3COOH-CH3COONa(pH 4.0), MES-NaOH(pH5.0), CH3 COOH-CH3COON pH 5.0), KH2PO4-K2HPO4(pH 6.0), MES-NaOH(pH6.0), KH2PO4-K2HPO4(pH 7.0), PIPES-NaOH(pH 7.0)), HEPES-NaOH(pH 8.0), H3BO4-NaOH(pH 8.0), CHES-NaOH(pH 9.0), H3BO4-NaOH(pH 9.0), H2CO3-NaHCO3(pH 10.0), CHES-NaOH(pH 10.0)를 예시 할 수 있다. 그 중에서도, CH3COOH-CH3COONa, KH2PO4-K2HPO4, H3BO4-NaOH가 바람직하고, KH2PO4-K2HPO4가 보다 바람직하다.
유기 용제로서는, 벤젠, 벤조니트릴 등의 방향족 화합물, 아세톤, 아세틸아세톤, 메틸에틸케톤 등의 케톤류, 아세트산에틸, 아세트산부틸, 부티르산에틸, 포름산에틸 등의 지방산에스테르류, 디에틸에테르, 디프로필에테르, 디부틸에테르, 테트라히드로푸란, 1,4-디옥산 등의 에테르류, 디클로로메탄, 클로로포름, 디클로로에탄 등의 할로겐화 탄화수소류, 1,2-프로판디올, 1,2-부탄디올, 1,3-부탄디올, 1, 4-부탄디올, 2,3-부탄디올, 1,2-헥산디올, 1,6-헥산디올, 1,2-펜탄디올, 1,5-펜탄디올, 2-메틸-2,4-펜탄디올, 3-메틸-1,5-펜탄디올 등의 디올류, 탄소수 1 ~ 7의 직쇄 또는 분지 알킬을 갖는 알코올, 시클로헥산올, 3-메톡시-3-메틸-1-부탄올, 3-메톡시-1-부탄올 등의 알코올류를 예시할 수 있으며, 이들 유기 용제로부터 1종을 단독으로, 또는 복수종을 조합하여 이용할 수 있다.
pH 조정제로서는, 반응 중에 최적 pH로 조정할 수 있는 것을 적절히 선택하면 되지만, 예를 들면, 염산 등의 무기산, 시트르산 등의 유기산, 수산화나트륨, 수산화칼륨 등의 수산화물 등의 무기 염기, 유기 아민 등의 유기 염기를 들 수 있으며, 이들 화합물로부터 1종을 단독으로, 또는 복수종을 조합하여 이용할 수 있다.
본 발명의 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 부화 반응 공정에 있어서의 반응 온도는, 예를 들면 10 ~ 55℃, 바람직하게는 15 ~ 45℃, 보다 바람직하게는 20 ~ 37℃, 더욱 바람직하게는 20 ~ 35℃이다. 반응 시간은, 예를 들면 0.1 ~ 48시간, 바람직하게는 1 ~ 24시간, 보다 바람직하게는 3 ~ 20시간이다.
니코틴아미드 모노뉴클레오티드 부화 반응은 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 생산능을 갖는 미생물을 상기 반응용 액체에 현탁하고, 정치, 교반 또는 진탕함으로써 행할 수 있다.
니코틴아미드 모노뉴클레오티드 부화 반응에 의해 얻어진 니코틴아미드 모노뉴클레오티드를 포함하는 미생물은, 그대로 동결 건조, 선반 건조, 스프레이 드라이 등에 의해 건조시킴으로써, 균체 분말로 하여, 식품에의 첨가물 혹은 화장품 또는 의약품의 유효 성분으로서 배합할 수 있다.
또한, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 부화 반응에 의해 얻어진 니코틴아미드 모노뉴클레오티드를 포함하는 미생물은, 원심분리법, 막 여과법 등에 의해, 완충액과 고액분리시켜 회수할 수 있다. 회수한 균체는, 그대로 선반 건조나 동결 건조 등에 의해 건조시킴으로써, 균체 분말로 함으로써, 식품에의 첨가물 혹은 화장품 또는 의약품의 유효 성분으로서 배합할 수 있다.
실시예
이하에서는, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
시험예 1
[1-1] 프룩토바실러스 트로파에오일(Fructobacillus tropaeoil) RD012353 주의 배양
니코틴아미드 모노뉴클레오티드 생산능을 갖는 프럭토바실러스속 유산균인 프룩토바실러스 트로파에오일(Fructobacillus tropaeoil) RD012353 주(기탁 번호 NITE BP-02765)를, Difco사제 MRS 배지(전 배양 배지) 3ml에 식균(植菌)하여, 30℃로 24시간, 정치로 확대 배양했다. 얻어진 배양액을 OD660이 0.02가 되도록, MRS 배지(본 배양 배지) 100ml에 식균하여, 30℃로 12시간, 진탕 배양했다.
얻어진 배양액을 원심분리에 제공하여 균체를 회수했다. 회수한 균체를 100ml의 0.85w/w% KCl 수용액으로 세정했다. 세정된 균체를 재차 원심분리에 제공하여 균체를 회수했다.
[1-2] 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 부화 반응 공정(NMN 부화 반응)
상기 [1-1]에서 회수한 균체를 각각 20ml의 하기 반응용 액체 중에 현탁하여 반응액을 조제하고, 25℃에서 8시간 정치하는 NMN 부화 반응에 제공했다. NMN 부화 반응 중의 반응액의 pH는 표 1에 나타낸 바와 같다.
NMN 부화 반응에 이용한 반응용 액체를 이하에 나타낸다. 또한, pH가 3.0 및 pH 11.0인 반응용 액체는 비교용으로 이용했다.
· 비교예 1: 0.1M 시트르산 완충액(pH 3.0)
· 실시예 1: 0.1M 아세트산 완충액(pH 4.0)
· 실시예 2: 0.1M 아세트산 완충액(pH 5.0)
· 실시예 3: 0.1M 인산 완충액(pH 6.0)
· 실시예 4: 0.1M 인산 완충액 (pH 7.0)
· 실시예 5: 0.1M 인산 완충액 (pH 8.0)
· 실시예 6: 0.1M 붕산 완충액(pH 9.0)
· 실시예 7: 0.1M 탄산 완충액(pH 10.0)
반응 종료 후, 원심분리로 균체를 회수했다. 회수한 균체를 100ml의 0.85w/w% KCl 수용액으로 세정했다. 세정된 균체를 재차 원심분리에 제공하여 균체를 회수했다.
[1-3] 니코틴아미드 모노뉴클레오티드(NMN)량 측정
상기 [1-1]에서 회수한 균체와, 상기 [1-2]에서 회수한 균체를 20ml의 이온 교환수에 현탁하고, 유리 비드를 등량 첨가한 후, 비드 파쇄기로 균체를 파쇄했다. 파쇄된 균체를 원심분리로 분리하고, 상청(균체 파쇄 추출액)을 회수했다.
회수한 상청을 하기 분석 조건의 HPLC 분석으로 분석하고, 회수 균체 중의 니코틴아미드 모노뉴클레오티드(NMN) 생산량을 측정했다. 상기 [1-1]에서 회수한 균체(NMN 부화 반응을 실시하지 않음)에 있어서의 NMN 생산량을 100으로 한 경우의, 상기 [1-2]에서 회수한 균체에 있어서의 NMN 생산량의 상대값을 도출했다. 결과를 표 1에 나타낸다.
(MRS 배지 조성)
2w/w% 글루코오스
1w/w% 프로테아제 펩톤
1w/w% 쇠고기 엑기스
0.5w/w% 효모 엑기스
0.2w/w% 시트르산암모
0.1w/w% Tween80
0.5w/w% 아세트산나트륨
0.01w/w% 황산마그네슘
0.005w/w% 황산망간
0.2w/w% 인산수소이칼륨
(HPLC 분석 조건)
칼럼: DaisoPak SP-100-5-ODS-P(4.6×150mm)×2개
칼럼 온도: 25℃
용리액: 75mM 인산암모늄 수용액(pH6.0)
유속: 0.6ml/min
검출기: UV 검출기(260nm)
검출 시간: 15.1분
표 1에 나타내는 바와 같이, 배양 종료 후의 균체를 pH 4 내지 pH 10의 용액 중에서 반응시킴으로써, NMN의 생산성을 현저하게 향상시킬 수 있다.
시험예 2
[2-1] 프룩토바실러스 두리오니스(Fructobacillus durionis) RD011727 주의 배양
니코틴아미드 모노뉴클레오티드 생산능을 갖는 프럭토바실러스속 유산균인 프룩토바실러스 두리오니스(Fructobacillus durionis) RD011727 주(기탁 번호 NITEBP-02764)를, Difco사제 MRS 배지(전 배양 배지) 3ml에 식균하여, 30℃로 24시간, 정치하여 확대 배양했다. 얻어진 배양액을 OD660이 0.02가 되도록, MRS 배지(본 배양 배지) 100ml에 식균하여, 30℃로 12시간, 진탕 배양했다.
얻어진 배양액을 원심분리에 제공하여 균체를 회수했다. 회수한 균체를 100ml의 0.85w/w% KCl 수용액으로 세정했다. 세정된 균체를 재차 원심분리에 제공하고 균체를 회수했다.
[2-2] 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 부화 반응 공정(NMN 부화 반응)
상기 [2-1]에서 회수한 균체와, 시험예 1의 실시예 1 ~ 7에서 이용한 반응용 액체를 이용한 것을 제외하고, 시험예 1의 [1-2]와 동일하게 하여 NMN 부호 반응을 실시했다. NMN 부화 반응 중의 반응액의 pH는 반응용 액체와 동일한 정도이며, 표 2에 나타내는 바와 같다.
[2-3] 니코틴아미드 모노뉴클레오티드(NMN)량 측정
상기 [2-1]에서 회수한 균체와, 상기 [2-2]에서 회수한 균체를 이용한 것을 제외하고, 시험예 1의 [1-3]과 동일하게 하여 NMN량을 측정했다. 상기 [2-1]에서 회수한 균체(NMN 부화 반응을 실시하지 않음)에 있어서의 NMN 생산량을 100으로 한 경우의, 상기 [2-2]에서 회수한 균체에 있어서의 NMN 생산량의 상대값을 도출했다. 결과를 표 2에 나타낸다.
표 2에 나타내는 바와 같이, 배양 종료 후의 균체를 pH 4 내지 pH 10의 용액 중에서 반응시킴으로써, NMN의 생산성을 현저하게 향상시킬 수 있다.
시험예 3
[3-1] 프룩토바실러스 프룩토서스(Fructobacillus fructosus) NBRC3516 주의 배양
니코틴아미드 모노뉴클레오티드 생산능을 갖는 프럭토바실러스속 유산균인 프룩토바실러스 프룩토서스(Fructobacillus fructosus) NBRC3516 주를, Difco사제 MRS 배지(전 배양 배지) 3ml에 식균하여, 30℃로 24시간, 정치하여 확대 배양했다. 얻어진 배양액을 OD660이 0.02가 되도록, MRS 배지(본 배양 배지) 100ml에 식균하여, 30℃로 12시간, 진탕 배양했다.
얻어진 배양액을 원심분리하여 균체를 회수했다.
[3-2] 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 부화 반응 공정(NMN 부화 반응)
상기 [3-1]에서 회수한 균체와, 시험예 1의 실시예 1 ~ 6에서 이용한 반응용 액체를 이용한 것을 제외하고, 시험예 1의 [1-2]와 동일하게 하여 NMN 부화 반응을 실시했다. NMN 부화 반응 중의 반응액의 pH는 반응용 액체와 동일한 정도이며, 표 3에 나타내는 바와 같다.
[3-3] 니코틴아미드 모노뉴클레오티드(NMN)량 측정
상기 [3-1]에서 회수한 균체와, 상기 [3-2]에서 회수한 균체를 이용한 것을 제외하고, 시험예 1의 [1-3]과 동일하게 하여 NMN량을 측정했다. 상기 [3-1]에서 회수한 균체(NMN 부화 반응을 실시하지 않음)에 있어서의 NMN 생산량을 100으로 한 경우의, 상기 [3-2]에서 회수한 균체에 있어서의 NMN 생산량의 상대값을 도출했다. 결과를 표 3에 나타낸다.
표 3에 나타내는 바와 같이, 배양 종료 후의 균체를 pH 4 내지 pH 10의 용액 중에서 반응시킴으로써, NMN의 생산성을 현저하게 향상시킬 수 있다.
시험예 4
NMN 부화 반응에 이용한 반응용 액체를, 하기에 기재한 완충액으로 변경(NMN 부화 반응 중의 반응액의 pH는, 반응용 액체와 동일한 정도이며, 표 4에 나타내는 바와 같음)한 이외는, 시험예 1 ∼ 3과 동일한 조작을 행하여, NMN 생산량의 상대값을 도출했다. 결과를 표 4에 나타낸다.
NMN 부화 반응에 이용한 반응액(완충액)을 이하에 나타낸다.
·실시예 21, 24, 27: 0.1M MES 완충액(pH 5.0)
·실시예 22, 25, 28: 0.1M HEPES 완충액(pH 7.0)
·실시예 23, 26, 29: 0.1M Tris 완충액(pH 9.0)
표 4에 나타내는 바와 같이, 배양 종료 후의 균체를 pH 4 내지 pH 10의 용액 중에서 반응시킴으로써, 완충액의 종류에 관계없이 NMN의 생산성을 현저하게 향상시킬 수 있다.
시험예 5
NMN 부화 반응에 이용한 반응용 액체를, 이온 교환수를 사용하고, 24 중량% NaOH 수용액을 사용하여, 반응 중의 pH를 7로 조정하면서 반응을 실시(NMN 부화 반응 중의 반응액의 pH는, 표 5에 나타내는 바와 같음)한 이외는, 시험예 3과 동일한 조작을 행하여, NMN 생산량의 상대값을 도출했다. 결과를 표 5에 나타낸다.

Claims (5)

  1. 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 생산능을 갖는 미생물을 pH 4 내지 10의 반응액 중에서 반응시키는 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 부화 반응 공정을 포함하는, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    니코틴아미드 모노뉴클레오티드 생산능을 갖는 미생물이 유산균인, 제조 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    pH 4 내지 10의 반응액이, 아세트산 완충액, 인산 완충액, 붕산 완충액, 탄산 완충액, 트리스 완충액, HEPES 완충액, 및 MES 완충액으로 이루어지는 군에서 선택되는 완충액을 포함하는, 제조 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    유산균이 프룩토바실러스(Fructobacillus)속인, 제조 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    유산균이, 프룩토바실러스 두리오니스(Fructobacillus durionis) RD011727 주(기탁 번호 NITE BP-02764), 프룩토바실러스 트로파에오일(Fructobacillus tropaeoil) RD012353 주(기탁 번호 NITE BP-02765), 프룩토바실러스 트로파에오일(Fructobacillus tropaeoil) RD012354 주(기탁 번호 NITE BP-02766), 및 프룩토바실러스 프룩토서스(Fructobacillus fructosus) NBRC3516 주로 이루어지는 군에서 선택되는, 제조 방법.
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