TW201713774A - 含有β-菸鹼醯胺單核苷酸的酵母萃取物及其製造方法 - Google Patents

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Abstract

本發明之課題為：從有食用經驗之安全之酵母獲得含有β-菸鹼醯胺單核苷酸(β-nicotinamide mononucleotide)(β-NMN)之酵母萃取物，獲得來自酵母之β-NMN組成物。 本案發明者們發現藉由以特定溫度、pH從酵母萃取出酵母萃取物，可獲得含有β-NMN之酵母萃取物。此外，藉由從含有β-NMN之酵母萃取物或酵母萃取液純化β-NMN，可獲得含有來自酵母之β-NMN之組成物。

Description

含有β-菸鹼醯胺單核苷酸的酵母萃取物及其製造方法
本發明係提供使用高蛋白假絲酵母(Candida utilis)，藉由培養、萃取步驟來獲得食品規格之含有β-菸鹼醯胺單核苷酸(β-nicotinamide mononucleotide)(β-NMN)之酵母萃取物的製造方法。
β-菸鹼醯胺單核苷酸(β-NMN)係為活體內之補救合成途徑(salvage pathway)之核心物質的菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)之代謝中間產物。藉由投予β-NMN伴隨著NAD增加，展示以Sirt 1為代表之「長壽蛋白(Sirtuin)基因(長壽基因)」的活性化獲致之抗老化(anti-aging)的效果。近年來，作為關於β-NMN的功能，有「對於晝夜時鐘(circadian clock)的參與(非專利文獻1)」、「改善脂質或糖代謝之異常(非專利文獻2)」、「改善老化所影響之粒線體之功能(非專利文獻3)」、「從缺血-再灌注之情況中保護心臟(非專利文獻4)」、「抑制老化所導致之神經幹細胞的減少(非專利文獻5)」、「抑制表觀遺傳抑制所導致之糖尿病性白蛋白尿(非專利文獻6)」等報告。如此，β-NMN係藉由觸發長壽蛋白(Sirtuin)活性可使糖代謝、糖尿病或神經退化性疾病、心臟疾病等與老化現象相關之各種活體現象受到抑制，最後與壽命延長有所關連。
此外，酵母係使用於各種食品等，圓酵母(Candida utilis)係被美國食品藥物管理局(FAD)評價為高營養功能性及有來自食用經驗的安全性的食用酵母。因此，多年以來被有效地應用於醫藥品、營養補充品、調味料等 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1] 國際公開WO2014/146044 [專利文獻2] 中國專利公報第101601679 B [專利文獻3] 美國專利公開第2011-0123510 A1 [專利文獻4] 美國專利第7737158號 [非專利文獻]
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[發明所欲解決之課題] 目前β-NMN並沒有以食品規格販賣，僅有販售作為研究用途之合成品。因此，本發明之課題為從有食用經驗之酵母獲得含有β-NMN之酵母萃取物、獲得來自酵母之β-NMN組成物。 [解決課題之手段]
本案發明者們發現藉由特定之方法從酵母萃取出酵母萃取物，可獲得含有β-NMN之酵母萃取物，而完成了本發明。 具體而言為： (1) 一種酵母萃取物，含有β-菸鹼醯胺單核苷酸； (2) 一種酵母萃取物，含有β-菸鹼醯胺單核苷酸0.1重量%以上； (3) 一種組成物，含有來自酵母之β-菸鹼醯胺單核苷酸； (4) 一種含有β-菸鹼醯胺單核苷酸之酵母萃取物的製造方法，係從培養之酵母菌體於pH7.5~11.0、萃取溫度50~70℃進行萃取而得。 [發明之效果]
根據本發明，可簡便地從有食用經驗之酵母萃取物取得β-菸鹼醯胺單核苷酸。特別是圓酵母係有長久時間之食用經驗的酵母，從其取得之酵母萃取物安全性高。如此之含有β-菸鹼醯胺單核苷酸之酵母萃取物可作為醫藥品、營養補充品、機能性食品等來攝取。
本發明中作為酵母可使用食用酵母。可舉例如屬於酵母菌屬(Saccharomyces)之酵母、克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)之酵母、假絲酵母菌屬(Candida)之酵母、畢赤酵母菌屬(Pichia)之酵母等，其中宜為假絲酵母菌屬(Candida)之酵母，高蛋白假絲酵母(Candida utilis)。更具體而言有高蛋白假絲酵母ATCC 9950、高蛋白假絲酵母ATCC 9550、高蛋白假絲酵母IAM 4233、高蛋白假絲酵母IAM 4264、高蛋白假絲酵母AHU 3259等。若使用含有麩胱甘肽之酵母，可提高β-菸鹼醯胺單核苷酸之含量更為理想。
培養酵母時的培養基中，就碳源而言使用葡萄糖、乙酸、乙醇、甘油、糖蜜、亞硫酸紙漿廢液等、就氮源而言使用尿素、氨、硫酸銨、氯化銨、硝酸鹽等。就磷酸、鉀、鎂源也可添加過磷酸鈣、磷酸銨、氯化鉀、氫氧化鉀、硫酸鎂、氯化鎂等通常之工業用原料，其他還可添加鋅、銅、錳、鐵離子等無機鹽。此外，雖然即使不使用維生素、胺基酸、核酸相關物質等也可進行培養，但亦可添加此等物質。也可添加玉米漿、酪蛋白、酵母萃取物、肉精、蛋白腖等有機物。
培養溫度或pH等培養條件係沒有特別之限制，配合使用之酵母菌株來設定培養條件即可。一般而言，培養溫度為21~37℃，宜為25~34℃，pH為3.0~8.0，尤其宜為3.5~7.0。
就本發明之培養形式而言，可為批式培養或連續培養之任一者，於工業方面宜為後者。培養時之攪拌、通氣等條件係沒有特別之限制，可為一般的方法。
於菌體培養後進行本發明之萃取物的萃取。藉由將菌體培養後之濕潤酵母菌體懸浮於蒸餾水中並重複進行離心分離來進行清洗之後，進行酵母萃取物之萃取。 萃取法因應使用之酵母菌體的種類適當調整即可，但為了提高β-NMN之含量，藉由自消化法、鹼萃取法、溫水萃取法、或此等之組合來進行。 使用了高蛋白假絲酵母時的方法，係以使菌體濃度以乾燥重量換算會成為7~10%，宜為8~9%的方式，將菌體再懸浮於蒸餾水。於該菌體懸浮液進行萃取物萃取時，因應需求進行pH調整。為了取得含有β-NMN之酵母萃取物，係將萃取時之pH調整為7.5~11.0，宜為8.0~10.0，更宜為9.0~10.0。pH調整係可為公知方法。
萃取溫度為50~70℃，宜為55~65℃。溫度調整係只要萃取液成為上述之溫度即可，沒有特別之限制，可利用公知方法。
萃取時間係進行5分鐘以上即可。萃取中期望進行攪拌。攪拌速度等係適當調整即可，沒有特別之限制。此外，若萃取時間設為40~50分鐘，因為可提高β-NMN之含量故更為理想。
藉由從如此培養而得之酵母萃取出酵母萃取物，可獲得β-NMN之含量相對於酵母萃取物中固體部分，為0.01重量%以上、0.1重量%以上或0.5重量%以上之酵母萃取物。其中，於本發明中β-NMN含量之定量係根據實施例中記載之HPLC之測定條件進行測定。
萃取出酵母萃取物之後，以離心分離將酵母殘渣分離，濃縮後藉由冷凍乾燥或熱風乾燥可獲得含有β-NMN之酵母萃取物。 另外，藉由從含有β-NMN之酵母萃取物純化β-NMN，可獲得含有來自酵母之β-NMN之組成物。此外，從前段之酵母萃取物純化β-NMN，也可獲得含有來自酵母之β-NMN之組成物。 純化法係可利用使用了離子交換樹脂等之一般可採用之純化法。
本發明之酵母萃取物或含有來自酵母之β-NMN之組成物的攝取方法沒有特別之限制，可藉由經口投予、靜脈內、腹腔內或皮下注射等非經口投予來給予。具體而言，可為錠劑、粉劑、顆粒劑、丸劑、懸浮劑、乳劑、浸劑、煎劑、膠囊劑、糖漿劑、液劑、酏劑、浸膏劑、酊劑、流浸膏劑等口服劑、或注射劑、點滴劑、乳膏劑、栓劑等非口服劑之任一者。
酵母萃取物係不僅作為醫藥品，也可作為食品來攝取，亦可作為機能性食品、營養輔助食品、營養補充品等來攝取。
此外，本發明也可與使β-NMN之長壽蛋白(Sirtuin)活性不會低落或使β-NMN之長壽蛋白(Sirtuin)活性增加之其他組成物併用。例如有為賦形劑、稀釋劑之麥芽糖醇(maltitol)、山梨糖醇(sorbitol)、澱粉等。
本發明之攝取量係投予可展現β-NMN之活性的量即可。一般而言，根據攝取者之狀態、投予之組成物的選擇、攝取者之年齡、體重及反應等來決定對於β-NMN之活性所需要之投予量。 [實施例]
以下具體地展示本案發明，但本案發明並非僅限定於此等示例。 (β-菸鹼醯胺單核苷酸之測定法) 藉由HPLC測定 泵：Chromaster 5110(HITACHI)； 除氣機：無； 自動進樣器：Chromaster 5210(HITACHI)； UV-VIS檢測器：Chromaster 5420(HITACHI)； 管柱烘箱：Chromaster 5310(HITACHI)； 流動相：75mM 磷酸二氫銨NH4 H2 PO4 (pH 2.3)(wako)。於抽氣機進行60分鐘脫氣處理； 管柱：以Wakosil-II 5C18 RS(φ4.6 mm X W 30 mm)⇒Wakosil-II 5C18 RS(φ4.6 mm X W 150 mm)⇒Wakosil-II 5C18 RS(φ4.6 mm X W 250 mm)之順序將3個管柱串聯； 管柱烘箱溫度：26℃； 流速：1.0 mL/min(0.0分鐘)⇒1.0 mL/min(7.0分鐘)⇒0.2 mL/min(8.0分鐘)⇒0.2 mL/min(20.0分鐘)⇒1.5 mL/min(21.0分鐘)⇒1.5 mL/min(55.0分鐘)⇒1.0 mL/min(56.0分鐘)⇒1.0 mL/min(60.0分鐘)； 溶析方法：等度(isocratic)； 檢測波長：abs 260nm； 分析時間：60 min； 樣本注入量：5μl； 自動進樣器溫度：2℃； 分析檢體之製備法：將檢體溶液以流動相之75mM NH4 H2 PO4 (pH 2.3)進行10倍稀釋。之後，稀釋溶液藉由裝置於注射器之DISMIC 13CP020AS 0.45μm過濾器(ADVANTEC)過濾掉不溶物質後，供給至HPLC； 標準β-菸鹼醯胺單核苷酸(由Sigma-Aldrich公司取得)， 由圖1所示之檢量線，測定各實施例之β-菸鹼醯胺單核苷酸之濃度。
＜實施例1＞ (酵母的培養) 預先將高蛋白假絲酵母Cs7529株(FERM BP-1656株)在裝有YPD培養基(酵母萃取物1%、聚蛋白腖2%、葡萄糖2%)之錐形瓶中進行種母培養，將其於30L容量之發酵槽中之18L培養基內接種1~2%。培養基組成係使用葡萄糖4%、磷酸一銨0.3%、硫酸銨0.161%、氯化鉀0.137%、硫酸鎂0.08%、硫酸銅1.6ppm、硫酸鐵14ppm、硫酸錳16ppm、硫酸鋅14ppm。培養條件係於pH4.0、培養溫度30℃、通氣量1vvm、攪拌600rpm進行，添加氨來控制pH。經16小時菌體培養後，將培養液回收，藉由離心分離收集菌體，獲得180g之濕潤酵母菌體。 將獲得之酵母菌體懸浮於蒸餾水藉由重複離心分離來進行清洗。以蒸餾水進行再懸浮使其成為乾燥固體部分濃度為82.88g/L。此時pH為5.8。
(酵母萃取液之萃取) (萃取pH之研究) 於上述菌體懸浮液中添加乙酸使乙酸最終濃度成為0.5%(v/v)，並以10N HCl或10N NaOH將pH調整為pH1.0/pH2.0/pH3.0/pH4.0/pH5.0/pH6.0/pH7.0/pH8.0。 將經pH調整之各菌體懸浮液25mL在95℃之水浴下使其溫度到達90℃，邊攪拌邊進行5分鐘之熱水萃取。萃取處理後，將取樣之菌體懸浮液25mL在冰中冷卻，以10000 rpm在4℃下離心分離10分鐘，取得上清液。於沉澱物添加25mL之超純水進行懸浮，再次進行離心分離，取得上清液。 合併最初離心分離取得之上清液及於第2次離心取得之上清液，以超純水混合成為50mL之萃取液。針對該萃取液，藉由上述方法測定β-NMN之濃度。 此外，為了計算出乾燥固體部分中之β-NMN含量，於180℃進行乾熱乾燥60分鐘。 將於各pH之萃取中之酵母萃取物中的β-NMN濃度表示於圖2。 萃取之pH1~8中，越為鹼性側越可成為β-NMN含量高之酵母萃取物。
＜實施例2＞ (萃取溫度研究) 以與實施例1相同方式來培養酵母，酵母萃取物之萃取pH為8.0，使熱水萃取溫度為60℃、70℃、80℃、90℃以外，以與實施例1相同方式來製造酵母萃取物。 將於各溫度之萃取中之酵母萃取物中的β-NMN濃度表示於圖3。 在萃取溫度為60~90℃中，於60℃、70℃成為β-NMN含量高之酵母萃取物。
＜實施例3＞ (萃取pH、萃取時間之研究) 於實施例1，以10N NaOH將pH調整為pH8.0/pH9.0/pH10.0，熱水萃取之溫度為60℃，將萃取時間設為10分鐘/20分鐘/30分鐘/40分鐘/50分鐘/60分鐘以外，以與實施例1相同方式製造酵母萃取物。 將於各pH、各萃取時間之酵母萃取物中之βNMN濃度表示於圖4。 於萃取溫度60℃中，當萃取為pH9.0，萃取時間為30分鐘以上可獲得β-NMN含量最高之酵母萃取物。
＜實施例4＞ 酵母菌株使用高蛋白假絲酵母36D61(登錄號FERM P-21546)以外，以與實施例1相同方式進行培養並藉由pH9.0、萃取溫度60℃、萃取時間40分鐘來獲得含有β-NMN之酵母萃取物。 若以HPLC測定β-NMN濃度，對於每單位固體部分含有0.65%。
＜實施例5＞ 使用高蛋白假絲酵母IAM 4264，分成4組(樣本1~4)，以與實施例1相同方式進行培養，藉由pH9.0、萃取溫度60℃、萃取時間40分鐘，其他條件與實施例1相同之方式來獲得含有β-NMN之酵母萃取物。β-NMN之含量係如圖5。每單位固體部分，β-NMN濃度為0.50%~0.78%。
＜比較例＞ 測定市面販售之酵母萃取物中之β-NMN之含量。 使用之酵母萃取物係AROMILD™(興人生命科學公司製)、HyperMeast GT(Asahi Group Foods, Ltd.公司製)、Vertex IG20(富士食品工業公司製)、酵母萃取物B2(Oriental Yeast Co., ltd.製)，測定結果酵母萃取物於HPLC皆未檢測出β-NMN。 如此，藉由通常之酵母萃取物萃取法無法獲得含有β-NMN之酵母萃取物。 [產業上利用性]
可從就食用而言為安全之酵母獲得β-菸鹼醯胺單核苷酸，不僅可作為醫藥品，亦可作為為機能性食品、營養輔助食品來攝取，藉由攝取本發明品，可獲得β-菸鹼醯胺單核苷酸所具有之功能性。
無
[圖1] 為於HPLC之β-NMN的檢量線。 [圖2] 實施例1之結果。表示萃取pH與酵母萃取物中β-NMN含量之間關係的圖表。 [圖3] 實施例2之結果。表示萃取溫度與酵母萃取物中β-NMN含量之間關係的圖表。 [圖4] 實施例3之結果。表示萃取時間與酵母萃取物中β-NMN含量之間關係的圖表。 [圖5] 實施例5之結果。表示從高蛋白假絲酵母(Candida utilis)IAM 4264獲得之酵母萃取物中β-NMN含量的圖表。

Claims (4)

  1. 一種酵母萃取物，含有β-菸鹼醯胺單核苷酸(β-nicotinamide mononucleotide)。
  2. 一種酵母萃取物，含有β-菸鹼醯胺單核苷酸0.1重量%以上。
  3. 一種組成物，含有來自酵母之β-菸鹼醯胺單核苷酸。
  4. 一種含有β-菸鹼醯胺單核苷酸之酵母萃取物的製造方法，係從培養之酵母菌體於pH8.0~10.0、萃取溫度50~70℃進行萃取。
TW105122976A 2015-08-06 2016-07-21 含有β-菸鹼醯胺單核苷酸的酵母萃取物及其製造方法 TW201713774A (zh)

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