JP2020162584A

JP2020162584A - 腸内環境改善組成物

Info

Publication number: JP2020162584A
Application number: JP2020016353A
Authority: JP
Inventors: 明日香盤若; Asuka Hannya; 潤坪田; Jun Tsubota; 建吾佐々木; Kengo Sasaki; 大介佐々木; Daisuke Sasaki; 近藤　昭彦; Akihiko Kondo; 昭彦近藤
Original assignee: Kobe University NUC; Osaka Gas Co Ltd
Current assignee: Kobe University NUC; Osaka Gas Co Ltd
Priority date: 2019-03-29
Filing date: 2020-02-03
Publication date: 2020-10-08

Abstract

【課題】腸内環境を改善する新規かつ簡便な腸内環境改善組成物を提供する。【解決手段】３−ヒドロキシ酪酸を有効成分として含有し、腸内環境を改善する腸内環境改善組成物。【選択図】図１

Description

本発明は、腸内環境を改善する腸内環境改善組成物に関する。

腸内環境を整えることは疾病予防・健康維持において重要である。特許文献１には、「腸内に生息する有用菌に選択的に働き、増殖を促進したりその活性を高めることによって宿主の健康に有利に作用する物質」であるプレバイオティクスの成分として、オリゴ糖、食物繊維、Ｂ．Ｇ．Ｓ（ビフィズス菌産生刺激物質）などの難消化性食品成分が該当することが記載してある。

特許文献２には、プロバイオティックスとは、腸内フローラの制御を通して、宿主に有益な影響をもたらす微生物及び物質であることが記載してある。

プレバイオティクスやプロバイオティックスの具体例として、例えば非特許文献１には、糖の発酵により産生する酢酸などの有機酸が腸内ｐＨを低下させることにより一部の有害菌（悪玉菌）の生育を抑制することが記載してあり、非特許文献２には、腸内細菌が産生する酪酸が体内に取り込まれて炎症やアレルギー等を抑える免疫細胞を増やすことなどが記載してある。また、非特許文献３には、有害菌がアンモニアなどの有害物質をつくり、腸をアルカリ性にすることが記載してある。

特開２０１６−２９０６５号公報特開２００２−１９３８１７号公報

「乳酸菌の生理機能とその要因」、日本調理科学会誌Ｖｏｌ．４６，Ｎｏ．２，１２９〜１３３（２０１３）インターネット＜ＵＲＬ：https://www.keio.ac.jp/ja/press_release/2013/kr7a4300000cq4cd-att/131112_2.pdf＞インターネット＜ＵＲＬ：http://city-hospital-shiogama.jp/data/eiyodayori/30-9-10-eiyodayori.pdf＞

上述したように、腸内におけるｐＨ値や種々の有機酸の濃度等、複数の因子が腸内環境に影響を与えている。そのため、このような複数の因子の値を変動させて腸内環境を改善できる簡便な組成物があれば望ましい。

従って、本発明の目的は、腸内環境を改善する新規かつ簡便な腸内環境改善組成物を提供することにある。

上記目的を達成するための本発明に係る腸内環境改善組成物の特徴構成は、３−ヒドロキシ酪酸を有効成分として含有した点にある。

３−ヒドロキシ酪酸やその塩（以下３ＨＢと称する、また、３ＨＢと称する場合、特にその単量体を指すものとする）は、もともと人の体内に存在する物質であるため生体親和性が高く、例えば糖質に代わるエネルギー源や健康食品として期待されているものである。

本発明の腸内環境改善組成物は、所定濃度の３ＨＢを有効成分として含有させるだけでよいため、簡便な組成物とすることができる。

後述の実施例において、腸内環境を模した培養系に所定濃度の３ＨＢを添加することで、アンモニア濃度の減少、ｐＨ値の減少、酢酸および酪酸濃度の増加傾向が認められている。

即ち、アンモニア濃度の減少、ｐＨ値の減少および酢酸濃度が増加すれば、腸内のアルカリ性を酸性側に改善して有害菌の生育を抑制することができ、有用菌の増殖を相対的に促進させることが期待できる。また、酪酸濃度が増加すれば免疫細胞が増加することとなり、免疫機能を調整して各種疾患の抑制・予防効果が期待できる。このように本発明の腸内環境改善組成物を摂取することで複数の因子の値を変動させ、容易に健康状態の維持又は改善を図ることが期待される。

本発明に係る腸内環境改善組成物の更なる特徴構成は、前記３−ヒドロキシ酪酸を０．０１〜１０重量体積％含有した点にある。

本構成のように３−ヒドロキシ酪酸の濃度を上記の範囲にすれば、腸内環境において、アンモニア濃度の減少、ｐＨ値の減少、酢酸および酪酸濃度の増加といった効果を、コストが嵩むことなく確実に得ることができる。

本発明に係る腸内環境改善組成物の更なる特徴構成は、さらに添加剤を含有した点にある。

本構成によれば、様々な添加剤を含有することで、種々の態様で医薬品・食品・飼料等として供することができる。

本発明に係る腸内環境改善組成物の更なる特徴構成は、経口摂取される態様とした点にある。

本構成によれば、例えば錠剤や液剤等に製剤して医薬組成物又は機能性食品として、手軽に摂取することができる。

サンプル１〜９（３ＨＢＮａ濃度０．５重量体積％）のアンモニア濃度の増減率をそれぞれ示したグラフである。サンプル１〜９（３ＨＢＮａ濃度０．５重量体積％）のｐＨ変動値をそれぞれ示したグラフである。サンプル１〜９（３ＨＢＮａ濃度０．５重量体積％）の酪酸濃度の増減率をそれぞれ示したグラフである。サンプル１〜９（３ＨＢＮａ濃度０．５重量体積％）の酢酸濃度の増減率をそれぞれ示したグラフである。サンプル１，２において３ＨＢＮａ濃度を０．２，０．５，０．７２重量体積％とした場合のアンモニア濃度の増減率をそれぞれ示したグラフである。サンプル１，２において３ＨＢＮａ濃度を０．２，０．５，０．７２重量体積％とした場合のｐＨ変動値をそれぞれ示したグラフである。サンプル１１〜１４の３ＨＢの消費速度と細胞内グルタミン酸濃度との関係を示したグラフである。

以下、本発明の実施形態を図面に基づいて説明する。
本発明の腸内環境改善組成物は、３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）を有効成分として含有している。

本明細書における「腸内環境改善組成物」とは、摂取することで腸内の環境を改善することができる組成物のことをいうものとする。本明細書における「腸内環境改善」とは、腸内における例えばアンモニア濃度の減少、ｐＨ値の減少、酢酸濃度の増加および酪酸濃度の増加のうち少なくとも何れかに起因して、腸内環境が改善されることをいうものとする。

３ＨＢは、例えば３ＨＢ生産性のハロモナス菌を添加した発酵プロセスを行い、得られた発酵液からハロモナス菌を分離除去し、精製することにより得られる。発酵プロセスは、果汁等の糖質栄養源を含有する原料液に、３ＨＢ生産性のハロモナス菌をそのまま添加し、好気発酵、微好気発酵を順に行うプロセスとして実施することができる（特開２０１３−０８１４０３号公報）。これにより、糖質が３ＨＢに変換され、発酵液中に生産されることになる。生産された３ＨＢは、常法にて、膜分離等による分離精製を経たのち、純粋な３ＨＢとして用いられる。

本発明の腸内環境改善組成物において、３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）の含有濃度は０．０１〜１０重量体積％とするのがよく、好ましくは０．１７〜０．５９重量体積％（３ＨＢＮａ濃度換算：０．２〜０．７２重量体積％）とするのがよい。

３ＨＢの含有濃度を上記の範囲とすれば、腸内環境において、アンモニア濃度の減少、ｐＨ値の減少、酢酸および酪酸濃度の増加といった効果を、コストが嵩むことなく確実に得ることができる。３ＨＢの含有濃度を０．０１重量体積％未満とすれば、当該効果は期待でき難くなる。また、３ＨＢの含有濃度を１０重量体積％を超える濃度とすれば、腸内環境改善組成物のコストが嵩むため、好ましくない。

本発明の腸内環境改善組成物は、そのまま経口摂取してもよいし、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤（粉剤）、コーティング剤、糖衣剤、乳剤、液剤、シロップ剤などに製剤して経口摂取してもよい。

本発明の腸内環境改善組成物は、３ＨＢを有効成分として含有する医薬組成物又は機能性食品として供するのが好ましい。特に機能性食品の態様であれば、日常的に経口摂取できるため、手軽に腸内環境を改善することができると考えられる。

当該機能性食品とは、例えば特定保健用食品（体の生理学的機能などに影響を与える保健機能成分を含み、特定の効能が認められる食品）、栄養機能食品（栄養成分の補給・補完のために利用する食品）、健康補助食品、栄養補助食品などの態様で供されるものを指す。当該機能性食品に含まれる本発明の腸内環境改善組成物の割合は、当業者が適宜設定すればよい。

本発明の腸内環境改善組成物は、製剤の際には、医薬上、薬理的に許容される添加剤と混合してもよい。医薬上許容される様々な添加剤を含有することで、種々の態様で医薬品・食品・飼料等として供することができる。

当該添加剤としては、例えば、乳糖・白糖・ブドウ糖・ソルビトール等の賦形剤、デンプン・ゼラチン・等の結合剤、ステアリン酸・硬化油・ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、バレイショデンプン等の崩壊剤、ラウリル硫酸ナトリウム等の湿潤剤、ポリエチレングリコール等の安定剤、ラウリル硫酸ナトリウム・ソルビタンモノ脂肪酸エステル等の界面活性剤、ベンジルアルコール・パラオキシ安息香酸エチル・安息香酸等の保存剤、ステビア・アスパルテーム等の甘味料、コハク酸、リンゴ酸等の酸味剤、植物油・動物油脂等の各種油脂、ロイヤルゼリー・人参等の生薬、グルタミン・システイン・ロイシン・アルギニン等のアミノ酸、エチレングリコール・ポリエチレングリコール等の多価アルコール、寒天・ゼラチン・キサンタンガム・澱粉・デキストリン等の天然高分子、ビタミンＣ・ビタミンＢ群等のビタミン、カルシウム・マグネシウム・亜鉛・鉄等のミネラル、マンナン・ペクチン・ヘミセルロース等の食物繊維、ｐＨ調製剤、酸化防止剤、呈味成分、芳香剤、着色料、等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

ヒトの腸内には細菌が常在し、腸内細菌叢を構成している。腸内細菌叢の状態は、宿主の年齢、疾病、微生物感染、ストレス、栄養成分、薬物投与等種々の要因により変動し、腸内細菌叢が悪化して、有害菌（悪玉菌）が有用菌（善玉菌）よりも優勢となると、宿主の健康に悪い影響を及ぼす原因となる。

本発明の腸内環境改善組成物は、腸内環境において、アンモニア濃度の減少、ｐＨ値の減少、酢酸および酪酸濃度の増加等が期待できる。

即ち、アンモニア濃度の減少、ｐＨ値の減少および酢酸濃度が増加すれば、腸内のアルカリ性を酸性側に改善して有害菌（クロストリジウム属細菌や大腸菌など）の生育を抑制することができ、有用菌（ビフィズス菌などのビフィドバクテリウム属細菌、ラクトバチルス属細菌など）の増殖を相対的に促進させることが期待できる。また、酪酸濃度が増加すれば免疫細胞（制御性Ｔ細胞など）が増加することとなり、免疫機能を調整して各種疾患の抑制・予防効果が期待できる。
腸内においては、酢酸などの有機酸の増加によりｐＨが減少し、その結果有害菌の生育が抑制され、アンモニア濃度が減少すると考えられる。

このように本発明の腸内環境改善組成物を摂取することで、容易に健康状態の維持又は改善を図ることが期待される。

即ち、本発明の腸内環境改善組成物を、投与対象であるヒトや動物に摂取させることで、腸内環境を改善することができる。

本発明の腸内環境改善組成物の摂取量は、投与対象であるヒトや動物の年齢、体重、摂取経路、摂取回数等により異なり、上記の濃度範囲内で種々の量を設定することができる。また、本発明の腸内環境改善組成物は、他の医薬、治療又は予防法等と併用してもよい。

本発明の腸内環境改善組成物は、もともと人の体内に存在する物質である３ＨＢを有効成分として含有するため、安全性が高く、かつ抵抗感なく経口摂取することができる。

また、有効成分として含まれる３ＨＢは安定した化合物であり、食品などの加工処理に適しているため、種々の食品に添加して継続的に摂取することができる。

〔実施例１〕
腸内環境を模した培養方法（特開２０１８−１９８５６０号公報）を利用し、所定濃度の３ＨＢを培養系に添加することで、３ＨＢが腸内環境にどのような影響を与えるかを調べる実験を行った。尚、３ＨＢは、ｐＨ調整にＮａＯＨを用いて３ＨＢＮａ（３−ヒドロキシ酪酸ナトリウム）塩として回収したものを使用した。

１０人の健常者（成人男性６名、成人女性４名）の糞便試料を用いて、（ａ）蒸留水を添加（コントロール）或いは（ｂ）０．５重量体積％３ＨＢＮａ（３ＨＢ濃度換算：０．４１重量体積％）を添加、の２条件において、上記の培養方法を用いて３０時間の嫌気条件で培養を実施した。培養の詳細は以下の通りとした。

マルチチャンネル培養器（ＢｉｏＪｒ．８；エイブル株式会社製）を用いるヒト大腸を模した１回バッチ式培養装置を作製した。当該装置は、複数の並列した独立の容器を備え、各容器に、１００ｍＬのオートクレーブ（１１５℃にて１５分間）した岐阜大学処方嫌気性培地（ＧＡＭ培地［Ｃｏｄｅ０５４２２］；日水製薬株式会社製）を収容した。
当該培地の培養開始時のｐＨは６．５に調整した。

前記培地に０．５重量体積％３ＨＢＮａを添加した培地を作製して、上記と同様に培養開始時にｐＨを６．５に調整した。３７℃にて１時間、０．２μｍＰＴＦＥ膜（ポール・コーポレーション製）を通して濾過滅菌した窒素および二酸化炭素混合ガス（Ｎ_２：ＣＯ_２＝８０：２０）を曝気（１５ｍＬ／分）することにより、培養容器の嫌気性条件を構築した。

接種物の調製のため、各糞便試料（サンプル１〜１０）を、１％のＬ−アスコルビン酸（和光純薬工業株式会社製）を添加した０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５，ＮａＨ_２ＰＯ_４および０．１ＭＮａ_２ＨＰＯ_４の２：１混合物からなる）２ｍＬ中に懸濁した。１００μＬの上記糞便懸濁液を各培地含有容器内に接種して、嫌気培養を開始した。培養の間、培地に濾過滅菌した混合ガスを曝気することにより、嫌気性条件を維持した。

培養開始時および３０時間後に培養液の一部を回収した。また、培養開始時および３０時間後のｐＨデータを採取した。培養３０時間後に回収した試料（培養液）については３ＨＢＮａの定量に使用した。尚、糞便試料および培養液は、測定に供するまで−２０℃下に保管した。

３ＨＢＮａ量は、回収した培養液を使用して高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により常法に従って測定した。

表１に、各サンプルにおける培養３０時間後の３ＨＢＮａを定量し、その消費率を算出した結果を示した。

この結果、サンプル１〜９について、１．８〜１００％の消費率であった。サンプル１０は消費率０％であり３ＨＢＮａを全く消費しないと認められた。そのため、サンプル１０を除外したサンプル１〜９について、以下の実験に供した。

〔実施例２〕
サンプル１〜９における培養３０時間後のそれぞれのアンモニア濃度を測定した。アンモニア濃度は、培養３０時間後に回収した培養液を使用し、アンモニア試薬ＡｍＶｅｒＨＲＴＮＴ（東亜ディーケーケー株式会社）およびＤＲＢ２００リアクター（ＨＡＣＨ製）により常法に従って測定した。３ＨＢＮａを添加しないコントロールのサンプルについても同様にアンモニア濃度を測定した。

結果を図１に示した。図１には、３ＨＢＮａを添加しないコントロールのアンモニア濃度を基準とした場合のサンプル１〜９のアンモニア濃度の増減率をそれぞれ示した。この結果、サンプル１〜９のアンモニア濃度の増減率は、コントロールのアンモニア濃度に比べて同等（サンプル１：−０．２％）かそれ以下であり、最も少ないアンモニア濃度の増減率を示したのはサンプル２（約−３０％）であった。アンモニア濃度の増減率の全サンプルの平均は約−１７％であった。

これより、腸内環境を模した実施例１の培養方法によって、３ＨＢＮａを添加することによってアンモニア濃度を減少させることができると判明した。従って、本発明の腸内環境改善組成物（３ＨＢＮａ濃度０．５重量体積％）を摂取した場合に、腸内で発生するアンモニア濃度を減少させることができ、これにより、腸内のアルカリ性を酸性側に改善できることが期待できると認められた。

〔実施例３〕
サンプル１〜９において、培養３０時間後に回収した培養液を使用してそれぞれのｐＨ値を測定した。結果を図２に示した。図２には、３ＨＢＮａを添加しないコントロールのｐＨ値（６．５）を基準とし、各サンプル１〜９のｐＨ値が変動した値をそれぞれ示した。

この結果、サンプル１〜９のｐＨ変動値は−０．０３〜−０．６８であった。最も大きく変動したのはサンプル８（−０．６８）であった。ｐＨ変動値の全サンプルの平均は約−０．２８であった。

これより、腸内環境を模した実施例１の培養方法によって、３ＨＢＮａを添加することによってｐＨ値を減少させることができると判明した。従って、本発明の腸内環境改善組成物（３ＨＢＮａ濃度０．５重量体積％）を摂取した場合に、腸内のｐＨ値を減少させることができ、これにより、腸内のアルカリ性を酸性側に改善できることが期待できると認められた。

〔実施例４〕
サンプル１〜９において、培養３０時間後に回収した培養液を使用してそれぞれの有機酸（短鎖脂肪酸：酪酸、酢酸）の濃度を測定した。これら有機酸の濃度は、３ＨＢＮａの定量と同様に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により常法に従って測定した。

結果を図３，４に示した。図３には、３ＨＢＮａを添加しないコントロールの酪酸濃度を基準とした場合のサンプル１〜９の酪酸濃度の増減率をそれぞれ示した。また、図４には、３ＨＢＮａを添加しないコントロールの酢酸濃度を基準とした場合のサンプル１〜９の酢酸濃度の増減率をそれぞれ示した。

この結果、図３より酪酸濃度は、サンプル３，４，６〜９の６サンプルがコントロールの酪酸濃度より増えており、特にサンプル７〜９では増減率＋５０％以上であった。サンプル１，２においても酪酸濃度の増減率は−６〜−８％程度であった。また、図４より酢酸濃度の増減率は、サンプル１，３，４，６，９の５サンプルがコントロールの酪酸濃度より増えていた。サンプル７，８においても酢酸濃度の増減率は、０〜−３％程度であった。

これより、腸内環境を模した実施例１の培養方法によって、３ＨＢＮａを添加したサンプルは酪酸および酢酸の濃度が増加する傾向があることが判明した。従って、本発明の腸内環境改善組成物（３ＨＢＮａ濃度０．５重量体積％）を摂取した場合に、腸内において有害菌の生育を抑制し、有用菌の増殖を相対的に促進する等、腸内環境を改善できることが期待できると認められた。

〔実施例５〕
サンプル１，２において、上述したように３ＨＢＮａ濃度が０．５重量体積％（３ＨＢ濃度換算：０．４１重量体積％）である場合に加えて、３ＨＢＮａ濃度を０．２重量体積％（３ＨＢ濃度換算：０．１７重量体積％）および０．７２重量体積％（３ＨＢ濃度換算：０．５９重量体積％）とした場合における培養３０時間後のそれぞれのアンモニア濃度を測定した。結果を図５に示した。図５には、３ＨＢＮａを添加しないコントロールのアンモニア濃度を基準とした場合のサンプル１，２のアンモニア濃度の増減率をそれぞれ示した。

この結果、サンプル１のアンモニア濃度の増減率は−０．１％（３ＨＢＮａ濃度０．５重量体積％）〜−１５％（３ＨＢＮａ濃度０．７２重量体積％）であり、サンプル２のアンモニア濃度の増減率は−７％（３ＨＢＮａ濃度０．２重量体積％）〜約−３９％（３ＨＢＮａ濃度０．７２重量体積％）であった。これらサンプルのアンモニア濃度の増減率の平均は約−１６％であった。

これより、腸内環境を模した実施例１の培養方法によって、３ＨＢＮａの濃度を種々変更した場合であってもアンモニア濃度を減少させることができると判明した。特にサンプル２においては３ＨＢＮａ濃度を高く（０．５〜０．７２重量体積％）すれば、効果的にアンモニア濃度を減少させることができると認められた。

〔実施例６〕
サンプル１，２において、上述したように３ＨＢＮａ濃度が０．５重量体積％である場合に加えて、３ＨＢＮａ濃度を０．２重量体積％および０．７２重量体積％とした場合における培養３０時間後のそれぞれのｐＨ値を測定した。結果を図６に示した。図６には、３ＨＢＮａを添加しないコントロールのｐＨ値（６．５）を基準とし、各サンプル１，２のｐＨ値が変動した値をそれぞれ示した。

この結果、サンプル１のｐＨ変動値は−０．１３（３ＨＢＮａ濃度０．２重量体積％）〜−０．５６（３ＨＢＮａ濃度０．７２重量体積％）であり、サンプル２のｐＨ変動値は−０．１３（３ＨＢＮａ濃度０．２重量体積％）〜−０．２８（３ＨＢＮａ濃度０．７２重量体積％）であった。

これより、腸内環境を模した実施例１の培養方法によって、３ＨＢＮａの濃度を種々変更した場合であってもｐＨ値を減少させることができると判明した。特にサンプル１においては３ＨＢＮａ濃度を高く（０．５〜０．７２重量体積％）すれば、効果的にｐＨ値を減少させることができると認められた。

〔実施例７〕
サンプル１において、上述したように３ＨＢＮａ濃度が０．５重量体積％である場合に加えて、３ＨＢＮａ濃度を０．２重量体積％および０．７２重量体積％とした場合における培養３０時間後のそれぞれの酢酸の濃度を測定した。

３ＨＢＮａを添加しないコントロールの酢酸濃度を基準とした場合の酢酸濃度の増減率は、＋４１．７％（３ＨＢＮａ濃度０．２重量体積％）、＋３７．９％（３ＨＢＮａ濃度０．５重量体積％）、＋２１．７％（３ＨＢＮａ濃度０．７２重量体積％）であった（図外）。

同様に、サンプル２において、３ＨＢＮａ濃度を０．２重量体積％とした場合の酢酸濃度の増減率は＋５．４％であった（図外）。

また、サンプル２において、３ＨＢＮａ濃度を０．２重量体積％とした場合における培養３０時間後の酪酸の濃度を測定したところ、酪酸の増減率は＋７．０％であった（図外）。

これより、腸内環境を模した実施例１の培養方法によって、３ＨＢＮａの濃度を種々変更した場合であっても酪酸および酢酸の濃度が増加する傾向があると認められた。

〔実施例８〕
４人の健常者の糞便試料（サンプル１１〜１４）を用いて、０．５重量体積％３ＨＢＮａ（３ＨＢ濃度換算：０．４１重量体積％）を添加し、上記特開２０１８−１９８５６０号公報記載の培養方法を用いて２１時間の嫌気条件で培養を実施した。尚、培養の詳細については実施例１と同様であるため、詳細な説明は省略する。

２１時間後の培養液を回収し、回収した培養液について、３ＨＢＮａ量を上記と同様に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により常法に従って測定した。また、各サンプルを更に３時間培養した時点（培養開始後２４時間経過した時点）での培養液を回収し、同様に３ＨＢＮａ量を測定した。各サンプルにおける培養開始後２１時間経過した時点での３ＨＢＮａ量及び２４時間経過した時点での３ＨＢＮａ量を基に、培養開始後２１時間経過した時点における３ＨＢの消費速度を算出した。

また、２１時間後の培養上清から菌体（細胞）を回収した。回収した細胞の重量を６００ｎｍの光学密度（ＯＤ６００）に基づいてサンプル間で同量となるように調整した上で、４−ポリテトラフルオロエチレンメンブレンフィルター（ミリポオ社製、孔径０．４５μｍ、直径４７ｍｍ）を用いてろ過した。

尚、サンプル１１〜１４の乾燥細胞重量は、下記（数１）を用いて推定した。
（数１）
乾燥細胞重量（ｍｇ）＝０．０５８２×ＯＤ６００×細胞懸濁液（μＬ）

ろ過後すぐに、細胞を冷リン酸緩衝生理食塩水（１３７ｍＭＮａＣｌ、８．１０ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、２．６８ｍＭＫＣｌ及び１．４７ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４）で洗浄し、洗浄した細胞を含むメンブレンフィルターを５０ｍＬ遠心管に移して液体窒素で凍結した。

その後、冷メタノール・ジルコニアビーズで細胞壁を破砕した後にクロロホルムでタンパク質を除去することで菌体代謝物を抽出し、抽出物の水相（７００μＬ）を真空乾燥した。尚、乾燥後の抽出物は、分析に供するまで−８０℃で保存した。

乾燥した抽出物を氷上で解凍し、２０ｍｇ／ｍＬのメトキシアミン塩酸塩を含むピリジン１００μＬ中において３０℃で９０分間誘導体化し、その後、Ｎ−メチル−Ｎ−（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（ＧＬサイエンス社製）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。

誘導体化したサンプル（１μＬ）について、ＧＣＭＳＱＰ−２０１０システム（島津製作所製）を使用してガスクロマトグラフ−四重極質量分析（ＧＣ−Ｑ−ＭＳ）を行い、グルタミン酸濃度を定量し、これを細胞内（菌体内）グルタミン酸濃度とした。尚、ＧＣ−Ｑ−ＭＳで使用したカラムは、ＣＰ−ＳＩＬ８ＣＢ−ＭＳ（膜厚０．２５μｍ、内径０．２５ｍｍ、長さ３０ｍ）である。

図７に、各サンプルにおける３ＨＢの消費速度（ｍＭ／ｈ）と細胞内グルタミン酸濃度（μｍｏｌ／ｇ−ｃｅｌｌ（細胞１ｇ当たりのモル量））との関係を示した。同図から分かるように、３ＨＢの消費速度が速くなるほど細胞内グルタミン酸濃度が増加している。このことから、腸内細菌の３ＨＢ利用能と腸内細菌内のグルタミン酸濃度との間には高い相関性があり、３ＨＢを摂取した場合に、３ＨＢ利用能が高いほどグルタミン酸濃度が増加することがわかる。

ここで、腸内細菌中のグルタミン酸濃度が高いほど菌体の増殖が促進することが報告されている（Biotechnol Biofuels, 2019, 12:72）。これらのことから、３ＨＢを摂取することによって腸内細菌内のグルタミン酸濃度が増加して腸内細菌の生育が促進されることにより、３ＨＢを摂取することによる腸内環境改善効果が発現すると推測できる。

本発明の腸内環境改善組成物は、腸内環境を改善するために利用できる。

Claims

３−ヒドロキシ酪酸を有効成分として含有し、腸内環境を改善する腸内環境改善組成物。
前記３−ヒドロキシ酪酸を０．０１〜１０重量体積％含有する請求項１に記載の腸内環境改善組成物。
さらに添加剤を含有する請求項１または２に記載の腸内環境改善組成物。
経口摂取される態様としてある請求項１〜３の何れか一項に記載の腸内環境改善組成物。