KR20160138056A - 부티르산 산생균 및 그 이용 - Google Patents
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Abstract
새로운 부티르산 산생균의 제공.
균주의 동결 보존액 (균체를 10 ％ (w/v) 스킴 밀크-2 ％ 글루탐산나트륨 용액에 현탁시킨 용액) (균수 : 2.0 ∼ 5.5 × 1010 세포/㎖) 을 융해시키고, 그 일부를 33 mM 의 아세트산나트륨 및 0.5 (w/v) ％ 의 글루코오스를 첨가한 PY 액체 배지 (PYGA 배지) 4 ㎖ 에 1 ％ 접종하고, 37 ℃ 에서 24 시간 혐기 배양한 후, PYGA 배지에 배양액을 1 ％ 접종하고, 37 ℃ 에서 24 시간 혐기 배양한 후, 배양액의 일부를 33 mM 의 아세트산나트륨 및 0.5 (w/v) ％ 의 L-소르보오스를 함유하는 PY 배지에 1 ％ 접종하고, 37 ℃ 에서 24 시간 혐기 배양한 후, 배양액 중의 부티르산 농도를 측정할 때의 부티르산 산생량이, 아네로스티페스 하드루스 (유박테리움 하드룸) 의 기준주인 YIT 10092T (DSM 3119T) 와 비교하여 1.5 배 이상인 A. hadrus 에 속하는 부티르산 산생균.
균주의 동결 보존액 (균체를 10 ％ (w/v) 스킴 밀크-2 ％ 글루탐산나트륨 용액에 현탁시킨 용액) (균수 : 2.0 ∼ 5.5 × 1010 세포/㎖) 을 융해시키고, 그 일부를 33 mM 의 아세트산나트륨 및 0.5 (w/v) ％ 의 글루코오스를 첨가한 PY 액체 배지 (PYGA 배지) 4 ㎖ 에 1 ％ 접종하고, 37 ℃ 에서 24 시간 혐기 배양한 후, PYGA 배지에 배양액을 1 ％ 접종하고, 37 ℃ 에서 24 시간 혐기 배양한 후, 배양액의 일부를 33 mM 의 아세트산나트륨 및 0.5 (w/v) ％ 의 L-소르보오스를 함유하는 PY 배지에 1 ％ 접종하고, 37 ℃ 에서 24 시간 혐기 배양한 후, 배양액 중의 부티르산 농도를 측정할 때의 부티르산 산생량이, 아네로스티페스 하드루스 (유박테리움 하드룸) 의 기준주인 YIT 10092T (DSM 3119T) 와 비교하여 1.5 배 이상인 A. hadrus 에 속하는 부티르산 산생균.
Description
본 발명은, 새로운 부티르산 산생균 및 이것을 함유하는 음식품, 의약 또는 사료 조성물에 관한 것이다.
아세트산, 프로피온산, 부티르산 등의 단사슬 지방산은, 하부 소화관에 있어서 주로 음식물 유래의 난소화성 당질이 장내 세균에 의해 발효를 받아 산생된다. 단사슬 지방산은 대장 점막 상피 세포의 주요한 에너지원으로서 이용될 뿐만 아니라, 많은 생리 작용을 나타낸다. 특히 부티르산은, 상피 세포의 증식 촉진 작용, 항염증 작용, 장관의 운동 항진 작용 등 다채로운 생리 활성을 나타내는 것으로 생각되고 있다 (비특허문헌 1 및 비특허문헌 2). 또, 부티르산이 대장암이나 궤양성 대장염의 예방에 중요한 것이 시사되어 있다 (특허문헌 1). 최근에는, 하부 소화관으로부터의 소화관 호르몬의 분비를 촉진시키는 것 (비특허문헌 3), 경구 투여로 말초 조직에서의 에너지 소비를 항진시켜 비만을 억제함과 함께 인슐린 저항성을 개선하는 것 (비특허문헌 4) 등이 보고되어 있다.
장내의 부티르산 농도 상승 촉진제로서, 어느 종류의 락토바실루스속, 비피도박테리움속 세균이 알려져 있다 (특허문헌 1). 또, 부티르산을 산생하는 세균으로는 아네로스티페스 (Anaerostipes) 에 속하는 세균, 특히, 아네로스티페스 하드루스 (Anaerostipes hadrus) (유박테리움 하드룸 (Eubacterium hadrum)) (이하, A. hadrus) DSM 3119T, 부티레이트-생성 세균 SSC/2, 부티레이트-생성 세균 SS2/1 등이 알려져 있다 (비특허문헌 5, 비특허문헌 6 및 비특허문헌 7).
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그러나, 상기 균주의 부티르산 산생량은 충분하지 않아, 보다 부티르산 산생능이 높은 균이 요망되었다.
따라서, 본 발명의 과제는, 부티르산 산생능이 높은 새로운 부티르산 산생균 및 그 균을 함유하는 음식품, 의약 또는 사료 조성물을 제공하는 것에 있다.
그래서 본 발명자는, 출원인이 보유하는 샘플 라이브러리에 난소화성 당류를 첨가하여 배양하면 부티르산의 산생량이 증대되는 것을 알아내고, 또한 난소화성 당류로서 L-소르보오스 및 D-자일리톨을 사용하여 상기 라이브러리를 배양하여 스크리닝한 결과, L-소르보오스를 기질로 하였을 때에 A. hadrus 의 기준주인 YIT 10092T (DSM 3119T) 와 비교하여 1.5 배 이상의 부티르산 산생능을 갖는 새로운 부티르산 산생균을 알아냈다. 또, 당해 부티르산 산생균과 난소화성 당류를 함유하는 조성물을 인간을 포함하는 동물에게 투여하면, 장내의 부티르산 산생균이 증가하여, 장내에서 부티르산의 산생을 증강시키는 것도 알아내어, 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은, 이하의 [1] ∼ [5] 를 제공하는 것이다.
[1] 균주의 동결 보존액 (균체를 10 ％ (w/v) 스킴 밀크-2 ％ 글루탐산나트륨 용액에 현탁시킨 용액) (균수 : 2.0 ∼ 5.5 × 1010 세포/㎖) 을 융해시키고, 그 일부를 33 mM 의 아세트산나트륨 및 0.5 (w/v) ％ 의 글루코오스를 첨가한 PY 액체 배지 (PYGA 배지) 4 ㎖ 에 1 ％ 접종하고, 37 ℃ 에서 24 시간 혐기 배양한 후, PYGA 배지에 배양액을 1 ％ 접종하고, 37 ℃ 에서 24 시간 혐기 배양한 후, 배양액의 일부를 33 mM 의 아세트산나트륨 및 0.5 (w/v) ％ 의 L-소르보오스를 함유하는 PY 배지에 1 ％ 접종하고, 37 ℃ 에서 24 시간 혐기 배양한 후, 배양액 중의 부티르산 농도를 측정할 때의 부티르산 산생량이, 아네로스티페스 하드루스 (Anaerostipes hadrus) (유박테리움 하드룸 (Eubacterium hadrum)) 의 기준주인 아네로스티페스 하드루스 (유박테리움 하드룸) YIT 10092T (DSM 3119T) 와 비교하여 1.5 배 이상인 아네로스티페스 하드루스 (유박테리움 하드룸) 에 속하는 부티르산 산생균.
[2] 아네로스티페스 하드루스 (유박테리움 하드룸) YIT 12354 (NITE BP-01831) 또는 아네로스티페스 하드루스 (유박테리움 하드룸) YIT 12355 (NITE BP-01832) 인 [1] 에 기재된 부티르산 산생균.
[3] 난소화성 당류와 [1] 또는 [2] 에 기재된 부티르산 산생균을 함유하는 음식품, 의약 또는 사료 조성물.
[4] 난소화성 당류가, 이소말트, 이소말툴로오스, D-갈락티톨, D-자일리톨, D-소르비톨, L-소르보오스, 말티톨, D-만니톨, 락티톨 및 갈락토올리고당에서 선택되는 1 종 이상인 [3] 에 기재된 조성물.
[5] [3] 또는 [4] 에 기재된 조성물을 함유하는 부티르산 산생 증강제.
본 발명의 부티르산 산생균을 난소화성 당류와 함께 인간을 포함하는 동물에게 투여하면, 장내의 부티르산 산생균이 증가하고, 그 결과, 장내에서 부티르산 산생이 증강된다. 장내의 부티르산량이 증가하면, 전술한 바와 같이 부티르산에 기초한 다양한 생리 작용이 증강된다.
도 1 은 각종 난소화성 당류를 상기 라이브러리에서 선택된 5 종 (A ∼ E) 의 샘플에 첨가하였을 때의 부티르산 산생량을 나타낸다.
도 2 는 16S rRNA 유전자 배열을 기초로 한 분리주의 계통 해석 결과를 나타낸다. 분리주 2 주 (YIT 12354 및 YIT 12355) 를 굵은 글씨로 나타냈다. 계통수는 근린 접합법으로 작성하고, Bootstrap 값이 50 ％ 이상 (1,000 회 반복) 인 지점에 숫자를 기재하였다. 스케일 바는 그 좌위 (座位) 에서, 0.01 회의 염기 치환이 일어난 것을 나타낸다.
도 3 은 난소화성 당류를 기질로 한 배지에서 부티르산 산생균을 배양하였을 때의 부티르산 산생량을 나타낸다.
도 4 는 난소화성 당류를 기질로 한 배지에서 부티르산 산생균을 배양하였을 때의 총 단사슬 지방산에서 차지하는 부티르산의 비율을 나타낸다.
도 5 는 마우스 분변 중에 난소화성 당류 및 A. hadrus YIT 12355 를 첨가하였을 때의 부티르산 농도를 나타낸다.
도 6 은 마우스 분변 중에 난소화성 당류 및 A. hadrus YIT 12355 를 첨가하였을 때의 총 단사슬 지방산에서 차지하는 부티르산의 비율을 나타낸다.
도 7 은 마우스에 난소화성 당류 및 A. hadrus YIT 12355 를 투여한 후의 맹장 내용물 중의 세균 유래 16S rRNA 유전자의 DGGE 프로파일을 나타낸다.
도 8 은 마우스 분변 배양계에 있어서의 말티톨 및 A. hadrus YIT 12355 의 병용 효과를 나타낸다.
도 2 는 16S rRNA 유전자 배열을 기초로 한 분리주의 계통 해석 결과를 나타낸다. 분리주 2 주 (YIT 12354 및 YIT 12355) 를 굵은 글씨로 나타냈다. 계통수는 근린 접합법으로 작성하고, Bootstrap 값이 50 ％ 이상 (1,000 회 반복) 인 지점에 숫자를 기재하였다. 스케일 바는 그 좌위 (座位) 에서, 0.01 회의 염기 치환이 일어난 것을 나타낸다.
도 3 은 난소화성 당류를 기질로 한 배지에서 부티르산 산생균을 배양하였을 때의 부티르산 산생량을 나타낸다.
도 4 는 난소화성 당류를 기질로 한 배지에서 부티르산 산생균을 배양하였을 때의 총 단사슬 지방산에서 차지하는 부티르산의 비율을 나타낸다.
도 5 는 마우스 분변 중에 난소화성 당류 및 A. hadrus YIT 12355 를 첨가하였을 때의 부티르산 농도를 나타낸다.
도 6 은 마우스 분변 중에 난소화성 당류 및 A. hadrus YIT 12355 를 첨가하였을 때의 총 단사슬 지방산에서 차지하는 부티르산의 비율을 나타낸다.
도 7 은 마우스에 난소화성 당류 및 A. hadrus YIT 12355 를 투여한 후의 맹장 내용물 중의 세균 유래 16S rRNA 유전자의 DGGE 프로파일을 나타낸다.
도 8 은 마우스 분변 배양계에 있어서의 말티톨 및 A. hadrus YIT 12355 의 병용 효과를 나타낸다.
본 발명의 부티르산 산생균은, A. hadrus (유박테리움 하드룸) 에 속하고, L-소르보오스를 기질로 하였을 때의 부티르산 산생량이 A. hadrus (유박테리움 하드룸) 의 기준주인 A. hadrus (유박테리움 하드룸) YIT 10092T 와 비교하여 1.5 배 이상인 균이다. 또, L-소르보오스를 기질로 하였을 때의 부티르산 산생량은, YIT 10092T 의 1.5 ∼ 2.5 배인 것이 바람직하고, 1.5 ∼ 2.0 배인 것이 보다 바람직하고, 1.5 ∼ 1.7 배인 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명의 부티르산 산생균은, A. hadrus YIT 10092T 와 달리, D-자일리톨을 기질로 하여 부티르산을 산생할 수 있다.
여기서, L-소르보오스 또는 D-자일리톨을 기질로 하였을 때의 부티르산 산생량이란, 당류로서 L-소르보오스 또는 D-자일리톨만을 첨가한 배지에서 배양하였을 때의 부티르산 산생량이다. 또한, 배지 조성 및 배양 조건은, 통상적인 부티르산 산생균의 배양에 적합한 조건이면 되는데, 예를 들어 균주의 동결 보존액 (균체를 10 ％ (w/v) 스킴 밀크-2 ％ 글루탐산나트륨 용액에 현탁시킨 용액) (균수 : 2.0 ∼ 5.5 × 1010 세포/㎖) 을 융해시키고, 그 일부를 33 mM 의 아세트산나트륨 및 0.5 (w/v) ％ 의 글루코오스를 첨가한 PY (peptone-yeast extract) 액체 배지 (PYGA 배지) 4 ㎖ 에 1 ％ 접종하고, 37 ℃ 에서 24 시간 혐기 배양한 후, 배양액을 PYGA 배지에 1 ％ 접종하고, 37 ℃ 에서 24 시간 혐기 배양한 후, 배양액의 일부를 33 mM 의 아세트산나트륨 및 0.5 (w/v) ％ 의 L-소르보오스 또는 D-자일리톨을 함유하는 PY 배지에 1 ％ 접종하고, 37 ℃ 에서 24 시간 혐기 배양한 후, 배양액 중의 부티르산 농도를 측정하면 된다.
또한, 배양 후의 균수를 확인하기 위해, PYGA 배지 및/또는 33 mM 의 아세트산나트륨 및 0.5 (w/v) ％ 의 L-소르보오스 또는 D-자일리톨을 함유하는 PY 배지에서의 배양 후에 탁도 (OD660) 를 측정하는 것이 바람직하다.
배양액 중의 부티르산 농도의 측정은, 부티르산 농도가 측정 가능한 방법이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 이온 배제 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC) 로 측정할 수 있다.
또, 본 발명의 부티르산 산생균은, 단사슬 지방산의 종류를 많이 함유하는 배지 (예를 들어, 아세트산, 프로피온산, 이소부틸산, 이소발레르산, 발레르산을 함유하는 YCFA 배지) 가 아닌, 단사슬 지방산으로서 아세트산 (또는 그 염) 만을 함유하는 배지에서도 부티르산을 산생할 수 있는 성질을 갖는다.
본 발명의 부티르산 산생균의 구체예로는, A. hadrus (유박테리움 하드룸) YIT 12354 (NITE BP-01831) (이하, YIT 12354), A. hadrus (유박테리움 하드룸) YIT 12355 (NITE BP-01832) (이하, YIT 12355) 를 들 수 있다.
본 발명의 부티르산 산생균은, 예를 들어 난소화성 당류를 유일한 당원으로서 첨가한 액체 배지에 상기 라이브러리의 일부, 자연계로부터 수집해 온 미생물 등을 접종하여 배양한 후, 배양액을 평판 배지에 파종하고, 생육된 콜로니를 조균 (釣菌) 하여 부티르산 산생 능력을 측정함으로써 상기 라이브러리 등으로부터 단리할 수 있다. 보다 구체적으로는, 난소화성 당류를 유일한 당원으로서 첨가한 액체 배지에 상기 라이브러리나 자연계로부터 수집해 온 미생물 등의 희석액을 접종하여 배양하고, 한편으로는 난소화성 당류를 첨가하지 않은 액체 배지에 접종하여 배양한다. 배양 후, 난소화성 당류를 유일한 당원으로서 첨가한 한천 평판 배지에 각 배양액의 일부를 파종하고, 생육된 콜로니를 관찰한다. 난소화성 당류를 첨가한 액체 배지로부터 얻어진 콜로니를, 난소화성 당류를 첨가하지 않은 액체 배지로부터 얻어진 콜로니와 비교하여, 형태가 분명하게 상이한 것을 조균한다. 조균한 균주를, PY 배지에 33 mM 의 아세트산나트륨을 첨가한 PYA 액체 배지에 L-소르보오스 등의 난소화성 당류를 유일한 당원으로서 첨가한 액체 배지에서 혐기 배양하고, 배양액 중의 부티르산 농도를 측정하면 된다. 여기서, 난소화성 당류의 첨가 농도는 0.1 ∼ 5.0 (w/v) ％ 가 바람직하고, 또한 0.2 ∼ 1.0 (w/v) ％ 가 보다 바람직하고, 0.4 ∼ 0.6 (w/v) ％ 가 더욱 바람직하다. 또, 배양은 30 ∼ 40 ℃ 에서 12 ∼ 48 시간의 혐기 배양을 실시하는 것이 바람직하고, 37 ℃ 에서 24 시간의 혐기 배양이 더욱 바람직하다.
본 발명의 부티르산 산생균은, 폭넓은 종류의 당질을 이용할 수 있지만, 다른 균이 이용하기 어려운 L-소르보오스, D-자일리톨 등의 난소화성 당류를 기질로 하여 배양한 경우에 있어서도 부티르산을 산생하는 능력을 갖는다. 또, 후기 실시예와 같이 16S rRNA 유전자 배열을 기초로 계통 해석을 실시한 결과, A. hadrus 로 분류된다. 기준주 A. hadrus YIT 10092T 와 생화학적 성상을 비교한 결과, 효소 활성이나 당 자화성에 차이가 있는 점에서 기준주와 상이하여, 신균주로 동정하였다. YIT 12354 및 YIT 12355 를 독립 행정 법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 생물 기탁 센터 ((우) 292-0818 일본 치바현 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8 120 호실) 에 각각 수탁 번호 NITE BP-01831 및 NITE BP-01832 로서 2014년 03월 19일에 기탁하였다.
본 발명의 부티르산 산생균은, 안전성의 점에서 문제가 없고, 난소화성 당류를 기질로 하여 부티르산을 산생하는 능력을 갖는다. 따라서, 본 발명의 부티르산 산생균 및 난소화성 당류를 함유하는 조성물은, 음식품, 의약 또는 사료용 조성물로서 유용하다. 당해 조성물은, 인간을 포함하는 동물의 장내에서 부티르산을 산생하는 점에서 부티르산 산생 증강제로서 유용하다. 부티르산은, 전술한 바와 같이, 대장 점막 상피 세포의 에너지원으로서 이용될 뿐만 아니라, 상피 세포의 증식 촉진 작용, 항염증 작용, 장관의 운동 항진 작용을 갖고, 또 대장암이나 궤양성 대장염의 예방 치료, 에너지 대사 조절 작용을 갖는 점에서, 본 발명의 조성물은, 이들 생리 활성을 갖는 의약, 음식품, 사료로서 특히 유용하다.
난소화성 당류로는, L-소르보오스, D-자일로오스, 이소말툴로오스, 락툴로오스, D-트레할로오스 등의 단당, 이당 ; 이소말트, D-갈락티톨, D-자일리톨, D-소르비톨, 말티톨, D-만니톨, 에리트리톨, 락티톨 등의 당알코올 ; 갈락토올리고당, 프룩토올리고당, 유과올리고당, 이소말토올리고당, 대두올리고당, 니게로올리고당, 겐티오올리고당, 펙틴올리고당, 시클로덱스트린 등의 올리고당 ; 발아 보리 ; 이눌린 ; 난소화성 덱스트린 ; 레지스턴트 스타치 등을 들 수 있다. 이 중, 본 발명의 부티르산 산생균이 자화할 수 있는 난소화성 당류, 특히 이소말트, 이소말툴로오스, D-갈락티톨, D-자일리톨, D-소르비톨, L-소르보오스, 말티톨, D-만니톨, 락티톨, 갈락토올리고당에서 선택되는 1 종 이상이 바람직하다.
본 발명의 조성물 중에는, 부티르산 산생균을 생균으로서 104 cfu ∼ 1014 cfu 함유하는 것이 바람직하다. 또 난소화성 당류는, 0.01 (w/v) ％ ∼ 90 (w/v) ％, 바람직하게는 0.05 (w/v) ％ ∼ 50 (w/v) ％ 함유하는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물은, 음식품, 의약 또는 사료의 각각에 적합한 형태로 할 수 있다. 의약으로 하는 경우에는, 예를 들어, 고체 또는 액체의 의약용 무독성 담체와 혼합하여, 관용의 의약품 제제의 형태로 할 수 있다. 이와 같은 제제로는, 예를 들어, 정제, 과립제, 산제, 캡슐제 등의 고형제, 용액제, 현탁제, 유제 등의 액제, 동결 건조 제제 등을 들 수 있다. 이들 제제는 제제 상의 상투 수단에 의해 조제할 수 있다. 상기 의약용 무독성 담체로는, 예를 들어, 글루코오스, 젖당, 자당, 전분, 만니톨, 덱스트린, 지방산 글리세리드, 폴리에틸렌글리콜, 하이드록시에틸 전분, 에틸렌글리콜, 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르, 아미노산, 젤라틴, 알부민, 물, 생리 식염수 등을 들 수 있다. 또, 필요에 따라, 안정화제, 습윤제, 유화제, 결합제, 등장화제, 부형제 등의 관용의 첨가제를 적절히 첨가할 수도 있다.
또, 음식품으로 하는 경우에는, 고형상, 액상 등의 어느 형태로 할 수도 있다. 음식품으로 하는 경우에는, 그대로 또는 다양한 영양 성분과 함께 함유시키면 된다. 구체적으로는, 음식품으로서 사용 가능한 첨가제를 적절히 사용하고, 관용의 수단을 사용하여 식용에 적합한 형태, 즉, 과립상, 입상, 정제, 캡슐, 페이스트 등으로 성형하면 된다. 음식품의 종류로는, 예를 들어, 햄, 소세지 등의 식육 가공 식품, 가마보코, 치쿠와 등의 수산 가공 식품, 빵, 과자, 버터, 분유 등의 식품이나, 물, 과즙, 우유, 청량 음료, 차 음료 등의 음료를 들 수 있다. 또 사료로 하는 경우에도 동일하다.
본 발명의 조성물은, 인간을 포함하는 동물에게 투여하는 경우, 장내에서 부티르산을 산생시키는 점에서, 경구적으로 투여하는 것이 바람직하고, 그 투여량은 1 일당 부티르산 산생균으로서 생균수로 1.0 × 104 cfu 이상이 바람직하고, 또한 1.0 × 108 cfu ∼ 1.0 × 1012 cfu 가 보다 바람직하다.
실시예
다음으로 실시예를 들어 본 발명을 상세하게 설명한다.
실시예 1 (부티르산 산생균의 분리)
(1) 샘플 라이브러리의 배양에 의한 각종 난소화성 당류의 부티르산 산생 촉진 효과
출원인이 보유하는 샘플 라이브러리로부터 5 종 (A ∼ E) 의 샘플을 선택하여, 글로브 박스 내에 반입하고, 각 샘플 20 g 을 필터가 형성된 호모게나이즈 백 PYXON-30 (엘멕스사 제조) 으로 옮겼다. 거기에 각 샘플의 9 배량의 혐기 치환이 완료된 0.1 M 인산나트륨 완충액 (pH 6.8) 을 첨가하여 10 배 희석시킨 후, 필터 여과하여 잔류물을 제거하여 샘플 희석액을 조제하였다. 샘플 희석액 9.5 ㎖ 에 발아 보리 (GBF), L-아라비노오스, D-갈락티톨, 갈락토올리고당, D-자일리톨, D-자일로오스, D-소르비톨, L-소르보오스, 말티톨, D-만니톨, 프룩토올리고당의 각 당류의 10 (w/v) ％ 용액을 0.5 ㎖ (당류의 최종 농도 0.5 (w/v) ％) 첨가하고, 37 ℃ 에서 24 시간 혐기 배양하였다.
그 결과를 도 1 에 나타낸다. 도 1 로부터, 5 종 (A ∼ E) 의 샘플에 난소화성 당류를 첨가하여 배양하면, 부티르산 산생량이 증가하고, 상기 라이브러리 중에 부티르산 산생균이 존재하는 것을 확인하였다.
(2) YIT 12354 및 YIT 12355 의 분리
상기 샘플 2 종 (C 및 E) 을 글로브 박스 내에 반입하였다. 각 샘플을 충분히 균질화한 후, 일부를 필터가 형성된 호모게나이즈 백 PYXON-30 (엘멕스사 제조) 으로 옮겼다. 거기에 각 샘플의 9 배량의 혐기 치환이 완료된 0.1 M 인산 Na 버퍼 (pH 6.8) 를 첨가하여 호모게나이즈하고, 잔류물을 제거하였다. 샘플 희석액의 일부를 PY (표 1), 0.5 (w/v) ％ L-소르보오스 첨가 PY (PYS), 및 0.5 (w/v) ％ D-자일리톨 첨가 PY (PYX) 액체 배지에 0.5 ％ 접종하고, 37 ℃ 하에서 24 시간 혐기 배양하였다. 배양 후, 배양액을 혐기 치환시킨 PBS 로 106-7 배 희석시키고, PY, PYS, 및 PYX 한천 평판 배지에 파종하고, 37 ℃ 에서 72 시간 혐기 배양하였다. PYS 및 PYX 평판 배지에 생육된 콜로니 중, PY 평판 배지 상의 그것과 비교하여 형태가 상이한 콜로니를 조균하고, PYS 및 PYX 액체 배지에 접종하여 37 ℃ 에서 24 시간 혐기 배양하였다. 이들 분리주 중, 배양액 중에 부티르산을 산생한 주를 선발하였다. 그 결과, 분리주 2 주 (YIT 12354 및 YIT 12355) 를 선발하였다.
실시예 2 (YIT 12354 및 YIT 12355 의 특징 1)
(1) 부티르산 산생량
1) 각종 균주에 의한 L-소르보오스 및 D-자일리톨로부터의 부티르산의 산생
각 균주의 동결 보존액 (균체를 10 ％ (w/v) 스킴 밀크-2 ％ 글루탐산나트륨 용액에 현탁시킨 용액) (균수 : 2.0 ∼ 5.5 × 1010 세포/㎖) 을 융해시키고, 그 일부를 33 mM 의 아세트산나트륨 및 0.5 (w/v) ％ 의 글루코오스를 첨가한 PY 액체 배지 (PYGA 배지) 4 ㎖ 에 1 ％ 접종하고, 37 ℃ 에서 24 시간 혐기 배양하였다. 배양 후, 배양액의 일부를 새로운 PYGA 배지에 1 ％ 접종하고, 37 ℃ 에서 24 시간 혐기 배양하였다. 배양 후, 배양액의 탁도 (OD660) 를 측정하였다. 그 후, 배양액의 일부를, PY 배지에 0.5 (w/v) ％ 의 L-소르보오스 또는 D-자일리톨과 33 mM 의 아세트산나트륨을 함유하는 배지 (L-소르보오스를 함유하는 배지 : PYSA, D-자일리톨을 함유하는 배지 : PYXA) 에 1 ％ 접종하고, 37 ℃ 에서 24 시간 혐기 배양한 후, 탁도 (OD660) 를 측정하였다.
배양 종료 후의 배양액 중의 유기산 농도는 이온 배제 HPLC 로 정량하였다. 이 때, 아세트산나트륨은 첨가하였지만 L-소르보오스 또는 D-자일리톨은 첨가하지 않은 PY 배지 (PYA 배지) 에서 배양한 것을 블랭크로 하였다.
(HPLC 분석 조건)
용리액 : 15 mM 과염소산-7 ％ 아세토니트릴
pH 조정제 : 15 mM 과염소산-60 mM 트리스하이드록시메틸아미노메탄-7 ％ 아세토니트릴
분리 칼럼 : 유기산 분석용 칼럼 RSpak KC-811 × 2 (쇼와 전공사 제조)
칼럼 온도 : 42 ℃
주입 시료량 : 10 ㎕
유속 : 1.0 ㎖/min
분석 시간 : 35 분
검출기 : Waters432 전기 전도도 검출기
셀 온도 : 45 ℃
또한, 부티르산 산생량은 (수학식 1) 에 따라 산출하였다.
결과를 표 3 에 나타낸다.
표 3 으로부터, 분리주 2 주의 L-소르보오스 첨가시의 부티르산 산생량은 모두 기준주의 1.5 배 이상을 나타냈다. 또, 기준주는 D-자일리톨을 자화하여 부티르산을 산생할 수 없는 한편, 분리주 2 주는 D-자일리톨을 기질로 한 경우에 부티르산을 산생하였다.
2) 아세트산염 및 락트산염을 첨가한 배지에서 배양하였을 때의 부티르산 산생량
상기 1) 에 기재한 조건과 동일 조건에서 PYGA 액체 배지에서 배양한 균액의 일부를, 33 mM 의 아세트산나트륨을 함유하는 PYA 배지에 추가로 40 mM 의 락트산나트륨을 첨가한 배지에 1 ％ 접종하고, 37 ℃ 에서 24 시간 혐기 배양하였다. 배양 종료 후의 배양액 중의 유기산 농도를 이온 배제 HPLC 로 분석하였다. 분석 조건은 상기 1) 과 동일한 조건에서 실시하였다. 또한, 부티르산 산생량은 (수학식 2) 에 따라 산출하였다.
결과를 표 4 에 나타낸다.
비특허문헌 6 에는, YCFA (33 mM 아세트산 ＋ 9 mM 프로피온산 ＋ 1.2 mM 이소부틸산 ＋ 1.0 mM 이소발레르산 ＋ 1.0 mM 발레르산) 배지에 35 mM 의 락트산염을 첨가한 배지에서 37 ℃, 24 시간 배양하였을 때의 이미 알려진 부티르산 산생균 SS2/1 및 SSC/2 의 부티르산 산생량이 각각 12.98 mM, 13.49 mM 이었던 것이 기재되어 있다.
본 발명의 부티르산 산생균은, YCFA 와 같은 단사슬 지방산의 종류를 많이 함유하는 배지가 아닌, 단사슬 지방산으로서 아세트산 (또는 그 염) 만을 함유하는 배지에서도 부티르산을 산생할 수 있는 성질을 갖는 것이 밝혀졌다. 또, 부티르산 산생량 자체도 SS2/1 및 SSC/2 에 비해 높았다.
(2) 16SrRNA 유전자 배열을 기초로 한 분리주의 계통 해석 결과
각 균주의 배양액으로부터 비즈 페놀법에 의해 DNA 를 추출하고, 16SrDNA 의 전체 길이를 PCR 로 증폭시킨 후, 배열의 거의 전체 길이를 시퀀스하였다. 얻어진 배열은 일본 DNA 데이터 뱅크 (DDBJ) 의 FASTA 검색에 제공하여, 이미 알려진 균종의 배열 데이터베이스와 대조하였다. 또한, Clustal X 를 사용한 근린 결합 (NJ) 법으로 분리주의 배열을 계통 해석하고, Tree-View 프로그램을 사용하여 계통수를 작성하였다.
결과를 도 2 에 나타낸다.
YIT 12354 및 YIT 12355 의 16SrRNA 유전자 배열 (약 1,450 bp) 을 기초로 계통 해석을 실시한 결과, 모두 클로스트리디움 (Clostridial) 클러스터 XIVa 중의 아네로스티페스 속의 서브클러스터에 위치하고, 또한 A. hadrus (＝ 유박테리움 하드룸) 의 기준주인 A. hadrus YIT 10092T 의 배열과 각각 99.7 ％ 및 99.8 ％ 의 상동성을 나타냈다. 이 결과로부터, YIT 12354 및 YIT 12355 는 모두 A. hadrus 로 분류되는 것을 알 수 있었다.
(3) 각종 균주의 생화학 성상의 비교
각종 균주의 생화학 성상 검사에는, 시판되는 아피 ZYM, 라피드 ID32A 아피, 및 아피켄키 20A (시스멕스·비오메리으 (주)) 를 사용하였다. 검사 방법은 제품 매뉴얼에 따랐다.
결과를 표 5 에 나타낸다.
표 5 로부터, 이들 3 균주는 유사한 성질을 나타내지만, 동일한 성질이 아니라, 서로 주 레벨에서 상이한 것을 알 수 있었다. 또한, 3 균주는 모두 그람 양성의 간균이었다.
이들 결과로부터, YIT 12354 및 YIT 12355 는 신규 균주로 판정되어, 독립 행정 법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 생물 기탁 센터에 각각 수탁 번호 NITE BP-01831 및 NITE BP-01832 로서 기탁하였다.
실시예 3 (YIT 12354 및 YIT 12355 의 특징 2)
a) 난소화성 당류
난소화성 당류로서, 갈락토올리고당 (GOS), 말티톨, D-만니톨, 락티톨, 이소말트, 이소말툴로오스, L-소르보오스, D-소르비톨을 사용하였다. 또한, GOS 이외에는 시약 그레이드의 것을 사용하였다. GOS 는 시판되는 올리고메이트 55N (야쿠르트 약품 공업) 으로부터, 활성탄 칼럼을 사용하여 단당 및 젖당 획분 (상부 소화관에서 소화 흡수되는 획분) 을 제거한 것을 사용하였다. 구체적으로는, 정제수로 팽윤시킨 활성탄 (와코 순약사 제조) 을 채운 칼럼에, 정제수로 희석시킨 당액을 첨가하고, 2 ％ 에탄올 용액으로 칼럼을 세정한 후, 50 ％ 에탄올 용액으로 난소화성 획분을 용출시키고, 용출액을 감압 건조시켜 얻은 GOS 당액을 사용하였다.
b) 사용 균주
대표적인 인간 장내 부티르산 산생균인 A. hadrus 의 기준주인 A. hadrus YIT 10092T (DSM 3119T) 및 분리주 2 주를 사용하였다.
c) 부티르산 산생 능력의 평가
상기 균주를 0.5 ％ D-글루코오스를 첨가한 33 mM 의 아세트산나트륨을 함유하는 PYA 배지 (PYGA 배지) 에서 37 ℃ 24 시간 혐기 배양하였다. 배양액의 일부를, 0.5 (w/v) ％ 의 각 난소화성 당류를 함유하는 PYA 배지 (시험 배지) 에 1 ％ 접종하고, 37 ℃ 24 시간 혐기 배양하였다. 배양 종료 후, 배양액 중의 유기산 농도를 이온 배제 HPLC 로 분석하였다. 분석 조건은 상기 실시예 2 와 동일한 조건에서 실시하였다. 유기산 농도의 정량 후, 각 난소화성 당류로부터의 부티르산 산생량 및 총 단사슬 지방산에서 차지하는 부티르산의 비율을 이하의 식에 따라 산출하였다.
결과를 도 3 및 도 4 에 나타낸다. 도 3 및 도 4 로부터, YIT 12354 및 YIT 12355 는, 기준주 YIT 10092T 와 비교하여 많은 난소화성 당류를 자화할 수 있고, 또한, 부티르산 산생량도 많은 것을 알 수 있다. 또, 분리주 2 주의 L-소르보오스 첨가시의 부티르산 산생량은 모두 기준주의 1.5 배 이상을 나타내고 있다. 또한, 총 단사슬 지방산에서 차지하는 부티르산의 비율도, 기준주 YIT 10092T 와 비교하여 부티르산의 비율이 높은 것을 알 수 있다.
실시예 4 (마우스 분변 중에 각 난소화성 당류 및 YIT 12355 를 첨가하였을 때의 부티르산 및 총 단사슬 지방산에 대한 부티르산의 비율)
마우스의 분변 0.8 g 을 PBS 로 12.5 배 희석시키고, 각종 난소화성 당류 (락티톨, 말티톨, D-만니톨, D-소르비톨, L-소르보오스, D-자일리톨) 를 0.5 ％, PYGA 배지에서 전 (前) 배양한 YIT 12355 를 1.0 ％ 첨가한 후, 37 ℃ 에서 24 시간 혐기 배양하였다. 또, 각종 난소화성 당류를 첨가하지 않은 배지도 동일하게 배양하였다. 배양 종료 후, 배양액 중의 유기산 농도를 이온 배제 HPLC 로 분석하였다. 분석 조건은 상기 실시예 2 와 동일한 조건에서 실시하였다. 유기산 농도의 정량 후, (수학식 3) 과 동일한 식에 따라 부티르산 산생량과 부티르산의 비율을 산출하였다.
그 결과를 도 5 및 도 6 에 나타낸다. 도 5 및 도 6 에 나타내는 바와 같이, 난소화성 당류의 단독 첨가시 및 본 발명의 부티르산 산생균 단독 첨가시에 비해, 부티르산 산생균과 난소화성 당류를 조합함으로써 부티르산 산생이 크게 항진된다. 또, 총 단사슬 지방산에 대한 부티르산의 비율도 동일하게, 난소화성 당류의 단독 첨가시 및 본 발명의 부티르산 산생균의 단독 첨가시에 비해, 이것들을 조합함으로써 크게 높아진다.
실시예 5 (난소화성 당류를 섭취시킨 마우스로의 YIT 12355 의 반복 경구 투여 시험)
1) 시험 설계
전체의 시험 스케줄을 표 6 에 나타냈다. 마우스는 1 주일 F2 사료 (후나바시팜사 제조) 로 순화 사육한 후, 각 군의 평균 체중이 거의 동등해지도록 6 군으로 나눴다. 그 후, 1 주일 대조식 (표 7) 을 투여하고, 난소화성 소재를 함유하는 정제 사료로 전환하여 2 주일 투여하였다. YIT 12355 의 생균 현탁액은 2 회/주, 합계 4 회 경구 존데 투여하였다. 시험 최종일에 해부하고, 맹장 및 결장 내용물을 회수하여 유기산 농도를 조사하였다. 또, 장관 내용물 중의 YIT 12355 의 균수를 정량 PCR 법으로 측정함과 함께, 장내 균총 전체의 변화를 PCR-DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) 법을 사용하여 조사하였다.
＜시험계＞
사용 동물 : 마우스 C57BL/6J (4 주령 : 니혼 클레아)
시험 기간 : 3 주일
사용한 난소화성 당류 : 락티톨, 말티톨
난소화성 당류의 투여량 : 5 ％ (w/w)
투여 균주 : YIT 12355
균 투여량 : 생균 투여량 3.9 ∼ 6.9 × 108 cfu/마우스 (생식 현탁액의 존데 투여). 사균을 포함한 총 균수에서는, 3.6 ∼ 4.6 × 109 cfu/마우스.
군 구성 : 6 군 (5 마리/군)
-／- 군, 대조
AH/- 군, YIT 12355 단독 투여
-／LAC 군, 락티톨 단독 투여
-／MAL 군, 말티톨 단독 투여
AH/LAC 군, YIT 12355 및 락티톨 공 (共) 투여
AH/MAL 군, YIT 12355 및 말티톨 공투여
사료 조성 : AIN-93G 를 베이스로 하는 정제 사료 (표 7)
측정 항목 : 맹장내 균총 해석 (정량 PCR 법에 의한 투여균의 균수 측정, DAPI 카운트법에 의한 총 균수 측정, PCR-DGGE 법에 의한 균총 변화 관찰)
2) 투여균 (YIT 12355) 의 조제 및 균수 측정
YIT 12355 는, PYGA 배지에 의해 37 ℃ 에서 24 시간 배양한 후, 원심 펠릿을 10 ％ 스킴 밀크-2 ％ 글루탐산나트륨 용액에 현탁시켜, -80 ℃ 에서 동결시킨 것을 동결 보존 스톡으로 하였다. YIT 12355 의 투여 균액의 조제는, 이 동결 보존 스톡을 사용하여 이하와 같이 실시하였다.
YIT 12355 의 동결 보존 스톡액을 융해시키고, 4 ㎖ 의 PYGA 배지에 1 ％ 접종하고, 37 ℃ 에서 24 시간 혐기 배양하였다. 배양액의 일부를 동일한 조성의 배지 56 ㎖ 에 1 ％ 접종하고, 37 ℃ 에서 24 시간 혐기 배양하였다. 균액을 4 ℃ 하에서, 10,000 rpm 으로 10 분간 원심한 후, 상청을 제거하였다. 미리 혐기 치환시켜 둔 차가운 생리 식염수 30 ㎖ 를 첨가하여 펠릿을 재현탁시키고, 원심하여 상청을 제거하였다. 펠릿을 6 ㎖ 의 차가운 생리 식염수로 재현탁시켜 투여 균액으로 하였다. 또한, 균체의 현탁은 글로브 박스 내에서 실시하였다.
균액을 혐기 치환시킨 생리 식염수로 단계 희석시키고, PYGA 평판 배지에 파종하여 37 ℃ 에서 24 시간 혐기 배양한 후, 콜로니를 카운트하여 생균수를 산출하였다. 총 균수는, 균액의 일부를 4 ％ 파라포름알데히드/PBS 용액으로 고정시킨 후, DAPI 카운트법에 의해 측정하였다.
3) 장관 내용물의 채취
피험 사료의 투여 2 주째에 마우스를 디에틸에테르로 마취시키고, 경추 탈구로 안락사시켰다. 개복하여 맹장 조직 및 결장 조직을 적출하여, 내용물을 회수하였다. 맹장 및 결장 내용물은 PBS 에 의해 10 배 희석시켜, DNA 의 추출에 제공하였다.
4) 장관 내용물 중의 균총 해석
a) 정량 PCR 법에 의한 YIT 12355 의 균수 측정
장관 내용물의 10 배 희석액으로부터 비즈 페놀법에 의해 DNA 를 추출하였다. 즉, 장관 내용물의 희석액 200 ㎕ 에 0.3 g 의 유리 비즈 (직경 0.1 ㎜) 와 300 ㎕ 의 Tris-SDS 용액 (250 ㎖ 의 200 mM Tris-HCl 80 mM EDTA pH 9.0 과 50 ㎖ 의 10 ％ SDS 를 혼합한 용액), 및 500 ㎕ 의 TE 포화 페놀을 첨가하여 FastPrep FP120 (파워 레벨 5.0) 에 의해 30 초간 격렬하게 진탕하였다. 15,000 rpm 으로 5 분간 원심한 후, 400 ㎕ 의 상청에 페놀/클로로포름/이소아밀알코올 (25 : 24 : 1) 용액 400 ㎕ 를 첨가하여 FastPrep FP120 (파워 레벨 4.0) 에 의해 45 초간 진탕하였다. 15,000 rpm 으로 5 분간 원심한 후, 상청 250 ㎕ 에 25 ㎕ 의 3 M 아세트산나트륨 (pH 5.4) 및 250 ㎕ 의 이소프로판올을 첨가하여 혼합하였다. 15,000 rpm 으로 5 분간 원심한 후, 상청을 제거하고, 500 ㎕ 의 70 ％ 에탄올을 첨가하여 다시 15,000 rpm 으로 5 분간 원심하였다. 상청을 제거하고 펠릿을 건조시켜, 1.0 ㎖ 의 TE 버퍼에 용해시켰다. 얻어진 DNA 용액을 정제수로 10 배 희석시켜, 주형 DNA 용액으로 하였다. 정량 PCR 에는, 7500 Real-Time PCR System (Life Technologies 사 제조) 을 사용하였다. 반응액은, 총량을 20 ㎕ 로 하고, 1.0 μM 의 각 프라이머를 함유하는 SYBR Premix Ex Taq II (타카라 바이오 (주)) 와 주형 DNA 용액을 혼합한 후, 정량 PCR 에 제공하였다. 반응 조건은, 95 ℃ 에서 2 분간 가열한 후, 95 ℃ 에서 20 초간, 55 ℃ 에서 20 초간, 72 ℃ 에서 50 초간의 반응을 1 사이클로 하여 이것을 40 사이클 반복하고, 72 ℃ 에서 3 분간 반응시켰다. 또한, 이것에 계속하여 Tm 값 해석을 위해, 60 ℃ 에서 1 분간 반응시킨 후, 0.2 ℃/초의 온도 구배로 95 ℃ 까지 온도를 상승시키고, 이 때의 SYBR Green I 의 형광을 측정하여 증폭 산물의 2 개 사슬이 해리될 때의 온도 (Tm) 를 측정하였다. 정량 PCR 에 사용한 A. hadrus 특이적 프라이머의 배열을 표 8 에 나타냈다. 또한, A. hadrus 의 정량에 사용하는 검량선은, 일정 균수로 조제한 A. hadrus YIT12355 의 균체로부터 추출한 DNA 를 주형에 사용하여 제조하였다.
b) 장내의 총 균수에 대한 YIT 12355 의 점유율의 측정
장관 내용물의 10 배 희석액의 일부를 4 ％ 파라포름알데히드/PBS 용액으로 고정시킨 후, DAPI 카운트법에 의해 총 균수를 측정하였다. 상기 YIT 12355 의 균수를 총 균수로 나누어 점유율 (％) 을 산출하였다.
c) PCR-DGGE 법에 의한 맹장 내용물 중의 균총 해석
상기 4)-a 에서 추출한 DNA 를 군마다 풀하고, 이것을 주형으로 하여 GC 클램프를 부여한 프라이머 (표 9) 에 의해 세균의 16S rRNA 유전자 단편 (V3, V4 영역 포함한다) 을 PCR 에 의해 증폭시켰다. PCR 조건은 50 ㎕ 의 반응액 중에 5 ㎕ 의 10 × ExTaq 완충액, 1 ㎕ 의 BSA (20 ㎎/㎖) 용액, 2 ㎕ 의 2.5 mM dNTP, 1 ㎕ 의 25 p㏖/㎕ 프라이머 용액, 1.25 유닛의 Ex Taq polymerase HS (타카라 바이오사), 0.1 ng 주형 DNA 에서 실시하였다. 온도 조건은 94 ℃ 5 분, (94 ℃ 20 초, 55 ℃ 45 초, 72 ℃ 1 분) × 30 사이클, 72 ℃ 7 분으로 실시하였다. 증폭 산물을 QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN 사 제조) 로 정제한 후, 1 웰 당 200 ng 의 DNA 를 겔에 어플라이하였다. Gradient Former (Bio-Rad 사조) 로 35 - 50 ％ 의 변성제의 농도 구배 (여기서는 100 ％ 변성제란 7 M 의 우레아와 40 ％ 포름아미드의 혼합물) 를 부여한 8 ％ 아크릴아미드 겔 (8 ％ 아크릴아미드/비스 (37 : 5 : 1), 1 × TAE (pH 8.0), 0.1 ％ TEMED, 0.1 ％ 암모늄 퍼술페이트) 을 사용하여 60 ℃, 130 V 로 5 분간 영동한 후, 70 V 로 16 시간 영동하였다. 영동 후, GelRed (Biotium 사) 로 염색하고, UV 램프하에서 밴드를 확인 촬영하였다. 또한, A. hadrus YIT 12355 에서 유래하는 밴드를 특정하기 위해, 본 균주의 순수 배양 균체로부터 추출한 DNA 를 주형으로 PCR 을 실시하여, 영동 샘플로 하였다.
장내의 총 균수 및 YIT 12355 의 균수, 그리고 YIT 12355 의 점유율의 측정 결과를 표 10 에, PCR-DGGE 법에 의한 맹장 내용물 중의 균총 해석 결과를 도 7 에 나타낸다.
표 10 으로부터, YIT 12355 만 또는 난소화성 당류만의 투여에서는, 장내의 A. hadrus 의 균수 및 점유율 모두 큰 변화는 없지만, 본 발명의 부티르산 산생균과 난소화성 당류를 조합하여 투여함으로써, A. hadrus 의 균수 및 점유율이 대폭 상승하는 것을 알 수 있었다.
또, 도 7 로부터, AH/LAC 군 및 AH/MAL 군에서 YIT 12355 에서 유래하는 밴드 (도 7 의 프레임 부분) 가 증가하였기 때문에, 본 발명의 부티르산 산생균과 난소화성 당류를 조합하여 투여함으로써, 장내의 균총 전체의 변화로 관찰하였을 때에도 본 발명의 부티르산 산생균이 특이적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6 (난소화성 당류를 섭취시킨 마우스로의 YIT 12355 의 단회 경구 투여 시험)
1) 시험 설계
표 11 에 군 구성과 시험 스케줄을 나타냈다. 마우스는 1 주일 F2 사료로 순화 사육한 후, 각 군의 평균 체중이 거의 동등해지도록 4 군으로 나눴다. 대조식 (표 12) 을 1 주일 투여한 후, 대조군 (-／- 군) 및 AH/- 군에는 대조식을, -／MAL 군 및 AH/MAL 군에는 말티톨을 함유하는 정제 사료 (MAL 함유식) 를 2 주일 투여하였다. YIT 12355 의 생균 현탁액은 1 주일의 대조식을 투여한 후에 단회 존데 투여하였다. 시험 최종일에 해부하여, 맹장 내용물을 회수하였다. 맹장 내용물은 YIT 12355 의 균수 측정에 제공하였다.
＜시험계＞
피험 소재 : 말티톨 (5 ％ 혼이 (混餌) 투여)
투여 균주 : YIT 12355
동물종 : 마우스 C57BL/6J (4 주령 : 니혼 클레아)
군 구성 : 7 마리 × 4 군
-／- 군, 대조
AH/- 군, YIT 12355 단독 투여
-／MAL 군, 말티톨 단독 투여
AH/MAL 군, YIT 12355 및 말티톨 공투여 (표 11 참조)
시험 기간 : 3 주일 (대조식 1 주일 ＋ MAL 함유식 혹은 대조식 2 주일)
균 투여법 : 생균의 생식 현탁액의 단회 존데 투여
사료 조성 : AIN-93G 를 베이스로 하는 정제 고형 사료 (표 12)
측정 항목 : 맹장내 균총 (투여균의 균수 및 점유율)
2) 투여균 (YIT 12355) 의 조제 및 균수 측정
투여균인 YIT 12355 의 생균 현탁액은 상기 실시예 5, 2) 와 동일하게 실시하였다.
3) YIT 12355 의 투여
상기 2) 에서 조제한 균액 (생균수 3.1 × 109 cfu/㎖, 총 균수 1.9 × 1010 세포/㎖) 을 마우스에 0.2 ㎖ (생균수 6.2 × 108 cfu/마우스, 총 균수 3.8 × 109 세포/마우스) 단회 경구 존데 투여하였다. 대조군 및 -/MAL 군에는 균액 대신에 0.2 ㎖ 의 생리 식염수를 투여하였다.
4) 검체 채취
시험 개시 3 주째 (균액 존데 투여 2 주째) 에 솜노펜틸 마취하에서 개복하고 하대정맥으로부터 전체 채혈하여, 안락사시켰다. 그 후, 맹장 내용물을 회수하였다. 맹장 내용물은 PBS 로 10 배 희석시켜, DNA 추출에 제공하였다.
5) 맹장 내용물 중의 YIT 12355 의 균수 측정
5)-1 정량 PCR 법에 의한 YIT 12355 의 균수 측정
장관 내용물의 10 배 희석액으로부터 상기 실시예 5, 4) a) 에 기재된 비즈 페놀법에 의해 DNA 를 추출하였다. 얻어진 DNA 를 주형으로 하여, 상기 실시예 5, 4) a) 에 기재된 균종 특이적 프라이머를 사용한 정량 PCR 법에 의해 YIT 12355 의 균수를 측정하였다.
5)-2 장내의 총 균수에 대한 YIT 12355 의 점유율의 측정
장관 내용물의 10 배 희석액의 일부를 4 ％ 파라포름알데히드/PBS 용액으로 고정시킨 후, DAPI 카운트법에 의해 총 균수를 측정하였다. 상기 YIT 12355 의 균수를 총 균수로 나누어 점유율 (％) 을 산출하였다.
장내의 총 균수 그리고 YIT 12355 의 균수 및 YIT 12355 의 점유율의 측정 결과를 표 13 에 나타낸다. 표 13 으로부터, 단회 투여로 실시한 경우에도 반복 투여와 동일하게, AH 만 또는 난소화성 당류만에서는, 균수, 점유율은 큰 변화는 없지만, 본 발명의 부티르산 산생균과 난소화성 당류를 조합하여 투여함으로써, 균수, 점유율이 대폭 상승한다.
실시예 7 (YIT 12355 의 균수 증가와 부티르산 농도의 대응에 관한 시험)
실시예 6 의 단회 투여 시험에 있어서의 시험 개시 1 주일 후의 마우스 신선 분변 0.8 g 을 샘플 튜브에 채취하고, 저온·혐기 상태를 유지한 채로 글로브 박스 내에 반입하였다. 미리 혐기 치환시킨 PBS 로 희석시키고 (최종 12.5 배 희석), 말티톨 용액 (최종 농도 0.5 ％) 및/또는 YIT 12355 의 배양 균액 (1 ％ 접종) 을 첨가한 후, 37 ℃ 에서 24 시간 혐기 배양하였다. 배양 후의 부티르산 농도는, 전기 전도도 검출기를 사용한 이온 배제 HPLC 를 사용하여 측정하였다.
결과를 도 8 에 나타낸다. 시험관내 (In vitro) 에 있어서, 본 발명의 부티르산 산생균과 난소화성 당류를 병용하면, 균수 증가와 함께, 부티르산 농도가 증가한다.
실시예 5 ∼ 7 의 결과로부터, 난소화성 당류의 단독 첨가에서는, YIT 12355 의 균수는 106 세포/㎖ 미만이고, 부티르산 농도도 증가하지 않았다. 한편, YIT 12355 의 단독 첨가에서는, A. hadrus 의 균수가 증가하고, 그것에 수반하여, 부티르산 농도도 증가하였다. 또한, 난소화성 당류와 YIT 12355 를 조합하면, A. hadrus 의 균수는, YIT 12355 의 단독 첨가시와 비교하여 100 배 정도 증가하고, 균수의 증가에 수반하여 부티르산 농도도 상승하였다. 이로써, 본 발명의 부티르산 산생균과 난소화성 당류를 병용하면, 균수 증가와 함께, 부티르산 농도도 증가하는 것을 알 수 있었다.
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Claims (5)
- 균주의 동결 보존액 (균체를 10 ％ (w/v) 스킴 밀크-2 ％ 글루탐산나트륨 용액에 현탁시킨 용액) (균수 : 2.0 ∼ 5.5 × 1010 세포/㎖) 을 융해시키고, 그 일부를 33 mM 의 아세트산나트륨 및 0.5 (w/v) ％ 의 글루코오스를 첨가한 PY 액체 배지 (PYGA 배지) 4 ㎖ 에 1 ％ 접종하고, 37 ℃ 에서 24 시간 혐기 배양한 후, PYGA 배지에 배양액을 1 ％ 접종하고, 37 ℃ 에서 24 시간 혐기 배양한 후, 배양액의 일부를 33 mM 의 아세트산나트륨 및 0.5 (w/v) ％ 의 L-소르보오스를 함유하는 PY 배지에 1 ％ 접종하고, 37 ℃ 에서 24 시간 혐기 배양한 후, 배양액 중의 부티르산 농도를 측정할 때의 부티르산 산생량이, 아네로스티페스 하드루스 (Anaerostipes hadrus) (유박테리움 하드룸 (Eubacterium hadrum)) 의 기준주인 아네로스티페스 하드루스 (유박테리움 하드룸) YIT 10092T (DSM 3119T) 와 비교하여 1.5 배 이상인 아네로스티페스 하드루스 (유박테리움 하드룸) 에 속하는 부티르산 산생균.
- 제 1 항에 있어서,
아네로스티페스 하드루스 (유박테리움 하드룸) YIT 12354 (NITE BP-01831) 또는 아네로스티페스 하드루스 (유박테리움 하드룸) YIT 12355 (NITE BP-01832) 인 부티르산 산생균. - 난소화성 당류와 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 부티르산 산생균을 함유하는 음식품, 의약 또는 사료 조성물.
- 제 3 항에 있어서,
난소화성 당류가, 이소말트, 이소말툴로오스, D-갈락티톨, D-자일리톨, D-소르비톨, L-소르보오스, 말티톨, D-만니톨, 락티톨 및 갈락토올리고당에서 선택되는 1 종 이상인 조성물. - 제 3 항 또는 제 4 항에 기재된 조성물을 함유하는 부티르산 산생 증강제.
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