WO2007114378A1

WO2007114378A1 - 飲食用組成物

Info

Publication number: WO2007114378A1
Application number: PCT/JP2007/057234
Authority: WO
Inventors: Masahiko Tabata; Motomichi Takahashi
Original assignee: Nippon Paper Chemicals Co., Ltd.; Miyarisan Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2006-03-31
Filing date: 2007-03-30
Publication date: 2007-10-11
Also published as: EP2005841A4; JPWO2007114378A1; KR20080109795A; CA2647551A1; CN101415342B; EP2005841A1; US20090280098A1; CN101415342A

Abstract

　本発明は、酪酸を産生して整腸作用に優れる酪酸菌と、酪酸菌の基質となり酪酸産生を助長するセロオリゴ糖を含有し、腸内における酪酸産生量を向上させ、腸内環境改善、感染症防御機能等に優れた飲食用組成物を提供することを課題とする。　すなわち、本発明は、酪酸菌とセロオリゴ糖を含有する腸内環境改善機能および／または感染症防御機能を有する飲食用組成物、前記酪酸菌が、クロストリジウム・ブチリカムである前記飲食用組成物、酪酸菌とセロオリゴ糖を含有する腸内環境改善機能および／または感染症防御機能を有する飼料、および酪酸菌とセロオリゴ糖を含有する腸内環境改善機能および／または感染症防御機能を有する食品を提供する。

Description

明細書

飲食用組成物

技術分野

[0001] 本発明は、酪酸菌とセ口オリゴ糖を含む飲食用組成物に関する。更に詳しくは、酪酸を産生して整腸作用に優れる酪酸菌と、酪酸菌の基質となり酪酸産生を助長するセロオリゴ糖を含有し、腸内における酪酸産生量を向上させ、腸内環境改善、感染症防御機能等に優れた飲食用組成物、及びその用途に関する。

背景技術

[0002] 腸管は生命維持に必要な栄養素を消化，吸収する役割のほか、有害細菌やウィルス、異物といった外敵から身を守る役割 (腸管免疫機能)も有しており、健康維持に非常に重要な器官である。近年の生理機能に関する研究により、腸内フローラ (菌叢）をはじめとする腸内環境の改善が、疾病予防 (消化器疾患予防、発ガンリスク低減等 )、健康の維持増進に大きく関与する事が解明されている。腸管には 100種類以上 · 100兆個の細菌が常在していることが知られており、ビフィズス菌、乳酸菌などの有用菌と、ウエルシュ菌、パクテロイデス菌、大腸菌などの腐敗菌に大別されている。有用菌増殖を促進し腐敗菌抑制作用を有する腸内細菌を整える素材としては、各種プ口バイオテイクス (腸内フローラのバランスを改善することにより宿主動物に有益に働く生菌剤)ゃプレバイオテイクス (腸内にぉ、て有用菌を増殖させる因子：オリゴ糖、食物繊維等)が上市されている。

[0003] 体内に本来生息するビフィズス菌等の有用菌を有意に増殖させる物質としてプレバィォテイクスがあり、各種オリゴ糖ゃ食物繊維等が用いられている。オリゴ糖としては、フラタトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、ガラタトオリゴ糖、キシロオリゴ糖、ビートオリゴ糖といった難消化性のオリゴ糖が挙げられる。難消化性オリゴ糖は、胃や小腸で分解されずに大腸に達し、大腸内の腸内細菌に資化され、酢酸、プロピオン酸、酪酸、乳酸等の短鎖脂肪酸が生成する。これら短鎖脂肪酸は、消化管血流粘膜血液量の増大、消化管粘膜上皮細胞の増殖、コレステロール合成の抑制等の生理活性を有する [0004] 短鎖脂肪酸の中でも乳酸が過剰に蓄積すると、粘膜障害を起こし大腸上皮細胞の新陳代謝に悪影響を及ぼす。一方、酪酸は、大部分は全身のエネルギープールに入る前に大腸上皮細胞に取り込まれ、新陳代謝を活発化させる。又、酪酸には DNA 修復や大腸ガン予防効果もある。更に、酢酸、プロピオン酸、酪酸は、腸内 pHの低下による有害菌の増殖抑制に関与するほか、エネルギー源として利用され、更に腸蠕動運動をも促進する働きがある。

[0005] オリゴ糖のうち、代表的なプレバイオテイクスであるフラタトオリゴ糖はシユークロースにフラクトースが 1, 4—結合したものである。フラタトオリゴ糖は、腸内の有用細菌、特にビフィズス菌に選択的に資化され、難消化性であるため、腸内菌叢改善に大きく寄与すると言われてきた。しかしながらフラタトオリゴ糖は安定性が十分ではなぐ特に酸性溶液中で長時間保存するとグルコース、フラクトース、シユークロースに変化し、その生理活性も低下してしまうという問題があった。他のオリゴ糖についても、同様な欠点を有している。また、ビフィズス菌の増殖は、スカトール、インドール等の腐敗物質を減少させるが、ビフィズス菌力生成される短鎖脂肪酸は乳酸と酢酸が主であり、大腸内の菌叢が大きくビフィズス菌に偏ると酪酸濃度は低下してしまう。この様な背景から、酪酸菌に選択的に資化されるオリゴ糖が望まれていた。

[0006] ところで、プレバイオテイクスのみでは、腸内菌叢のバランスが腐敗菌に偏っている場合には、効果が非常に少ないという問題がある。このため、腸内の有用菌を効果的に増やすため、プロバイオテイクス機能を有する生菌剤とプレノィォテイクス機能を有するオリゴ糖を配合したシンバイオテイクスなるものも商品化されている。

[0007] 特開 2003— 93019号公報（特許文献 1)においては、プロノくィォテイクスとしてビフィズス菌を、プレバイオテイクスとしてキシロオリゴ糖を含有する経口摂取用組成物が開示されており、コンパクトで保存性に優れた経口摂取用組成物を提供している。又、特開 2005— 34135号公報（特許文献 2)においては、プロノくィォテイクス、プレバィォテイクス、バイオジェ-タスから 1種又は 2種以上を含む食品有効成分の生体内利用効率を向上させる機能増強組成物が開示されている。又、特開 2004— 35750 5号公報 (特許文献 3)においては、ビール酵母、生菌剤、オリゴ糖、茶抽出物を含有する犬の胃腸疾患予防'軽減用サプリメントが開示されている。しかしながら、これらの先行技術においては、ビフィズス菌増殖因子に主眼が置かれており、酪酸の生成に着目したものは無ぐ腸内環境改善について十分満足のいくものではない。

[0008] また、特開平 7— 145号公報 (特許文献 4)には、酪酸菌とダルコマンナンカゝらなる酪酸菌組成物が開示されている。酪酸菌はダルコマンナンを資化するものの、酪酸の産生量は腸内環境を改善するには十分ではなかった。

[0009] 特許文献 1 :特開 2003— 93019号公報

特許文献 2：特開 2005— 34135号公報

特許文献 3：特開 2004— 357505号公報

特許文献 4:特開平 7— 145号公報

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0010] 本発明は、腸内環境を顕著に改善することができる飲食用組成物を提供することを課題とする。

課題を解決するための手段

[0011] 本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、数ある生菌剤の中でも酪酸を産生して整腸作用に優れる酪酸菌と、セロオリゴ糖を組み合わせることにより、セ口オリゴ糖が酪酸菌の基質となり、腸内において酪酸菌の酪酸産生を著しく高めることができることを見出した。そして同時に、腸内の有用菌を効果的に増やし、腐敗物質の量を減少するなど腸内環境の改善を実現できることを見出した。本発明者らは係る知見に基づき本発明を完成するに至り、具現ィ匕した態様として下記発明を提供するものである。

[0012] 〔1〕酪酸菌とセ口オリゴ糖を含有する腸内環境改善機能および Zまたは感染症防御機能を有する飲食用組成物。

〔2〕酪酸菌が、クロストリジゥム 'ブチリカムである〔1〕に記載の飲食用組成物。〔3〕酪酸菌とセ口オリゴ糖を含有する腸内環境改善機能および Zまたは感染症防御機能を有する飼料。

〔4〕酪酸菌とセ口オリゴ糖を含有する腸内環境改善機能および Zまたは感染症防御機能を有する食品。〔5〕酪酸菌およびセロオリゴ糖の、腸内環境改善機能および Zまたは感染症防御機能を有する飲食用組成物としての利用。

〔6〕酪酸菌およびセロオリゴ糖の、腸内環境改善機能および Zまたは感染症防御機能を有する飼料または食品としての利用。

発明の効果

[0013] 本発明の飲食用組成物は、セロオリゴ糖が酪酸菌の基質となるだけでなぐ腸内において酪酸菌の酪酸産生能を著しく高めることができる。更に、腐敗菌を減少させて有用菌を増加させるだけでなぐ腐敗物質を減少させるなど腸内環境を向上させることもできる。よって、本発明の飲食用組成物を人や動物に給与すれば、大腸部位での酪酸菌を増カロさせ酪酸含量を高めることが出来、大腸上皮細胞を健全な状態に維持することが出来る。その結果、各種感染症に対する防御能が高まり、大腸癌ゃ大腸疾患の予防にもつながり、健康を維持 ·増進をする事が出来る。また、畜産用動物に供与した場合は、疾病率が低下し、増体重効果に優れるため出荷日数を短縮する事が出来、コスト低減に繋げる事が可能で経済的にもメリットがある。

図面の簡単な説明

[0014] [図 1]図 1は、実施例 3における離乳 30日後の子ブタの糞便中フローラを示すグラフである。

[図 2]図 2は、実施例 3における離乳 30日後の子ブタの糞便中スカトール (SKT)量を示すグラフである。

[図 3]図 3は、実施例 3における離乳 30日後の子ブタの糞便中有機酸組成を示すグラフである。

[図 4]図 4は、実施例 3における離乳 30日後の子ブタの糞便中のアンモニア量を示すグラフである。

[図 5]図 5は、実施例 3における離乳時および離乳 30日後の子ブタの血清中のアンモ-ァ量を示すグラフである。

[図 6]図 6は、実施例 4における-ヮトリ初生ヒナ（18日令、 42日令）の盲腸内容物中の有機酸組成を示すグラフである。

発明を実施するための最良の形態 [0015] 本発明の飲食用組成物は、酪酸菌とセ口オリゴ糖を含有する。すなわち、本発明の飲食用組成物は、プロノくィォテイクスとして酪酸菌を、プレバイオテイクスとしてセロォリゴ糖を含有するものであり、腸内、特に大腸において酪酸濃度を高め健全な状態を維持する効果を有する。すなわち、本発明の飲食用組成物は、生体内で腸内環境改善機能と感染症防御機能の両方、或いは少なくとも一方を発揮するものである。

[0016] 本発明の飲食用組成物の有効成分の第一は、酪酸菌である。一般に、プロバイオテイクスとしては、ビフィズス菌（Bifidobacterium sp. )、乳酸菌（Lactobacillus s p. )等が用いられている。乳幼児の腸内菌叢はビフィズス菌等の有用菌が優勢であるが、加齢と共に有用菌が減少し腐敗菌の割合が増加する。このため腐敗菌の抑制や有用菌の増加を目的に、ビフィズス菌ゃ乳酸菌など多くの種類の生菌剤がプロバィォテイクスとして用いられている。し力しながら、ビフィズス菌ゃ乳酸菌は、経口摂取しても、胃液や胆汁などの酸に耐性がなぐ生きたまま腸まで届くのはごくわずかに過ぎない。又、一部定着したとしても摂取を中止すれば、腸内菌叢はまた腐敗菌優勢のフローラに戻ってしまうといった問題もある。これに対し、本発明において用いる酪酸菌は、好気下では芽胞を形成し、経口的に投与された後、胃内において、蛋白消化液ペプシンと胃酸による低 pH環境とに暴露される力芽胞として抵抗性のある酪酸菌は死滅することなくここを通過し、十二指腸に到達する。そこで pH中性付近まで上昇し、食物は各種の消化液により消化され、栄養に富んだ環境が作られた後、酪酸菌は発芽増殖の機会を得る。経口摂取しても、胃液や胆汁で消化されることもなく、胞子状態のまま大腸に届き、大腸内で発芽増殖して酪酸を産生することができる。

[0017] 本発明で用いる酪酸菌は、酪酸を生成する菌であればいかなる菌種でも良い。中でもクロストリジゥム属が好ましぐとりわけブチリカム種が好ましい。更にクロストリジゥム ·ブチリカムの好ましヽ菌株の代表的なものとしては、後述のようにクロストリジゥム · ブチリカム MIYAIRI (ミヤイリ）株を挙げることができる。クロストリジゥム 'ブチリカムは、偏性嫌気性の芽胞形成性である。この菌株は、 1933年に千葉医科大学衛生学教室 (現 ·千葉大学医学部)宫入近治博士により、ヒト腸管内より、腐敗菌に対して強い拮抗作用がある酪酸菌として報告された。本菌株は腐敗菌をはじめとした種々の消化管病原体に対して拮抗作用を有し、 Bifidobacteriaや Lactobacillus等の!/、わゆる腸内有用菌と共生することにより、整腸効果を発揮する。また、本菌株は芽胞形成細菌であることから、製剤中における安定性および胃酸に対する抵抗性が乳酸菌群と比較し高、ことが報告されて、る。

[0018] 本発明において用いられる酪酸菌としては、具体的には、ラクトバチルス 'ブランクラム、クロストリジゥム.ブチリカム NIP1006、クロストリジゥム.ブチリカム NIP1015、クロストリジゥム ·ブチリカム NIP1017、クロストリジゥム ·ブチリカム ·ミヤイリ 588力挙げられ、中でも特に酪酸産生能が高、クロストリジゥム ·ブチリカム ·ミヤイリ 588 (FERM

BP— 2789)が好ましい。クロストリジゥム 'ブチリカム'ミヤイリ 588は、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号 (郵便番号 305) )〔現在、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒 3 05 - 8566 日本国茨城県つくば巿東 1 - 1 - 1 中央第 6)に改称されてヽる。〕に、 1981年（昭和 56年） 5月 1日付で受託されており、その受託番号は、 FERM BP— 2789である（昭和 47年 5月 16日に寄託された微ェ研菌寄第— P 1467号より移管

) o

[0019] 本発明の飲食用組成物においては、酪酸菌は、市販の生菌剤、例えばミヤリサン錠 (ミヤリサン (株)製)などを用いても良、し、酪酸菌を適当な培地で液体培養した後、菌体を分離しそのまま用いても良いし、乾燥して乾燥菌体として用いても良い。巿販の生菌剤を用いる場合は、含まれる酪酸菌の純度や含有量などを考慮し、下記の菌数が含まれるよう配合量を調整する。

[0020] 本発明の飲食用組成物においては、有効成分の第 2としてセロオリゴ糖を用いる。

セロオリゴ糖は、フラタトオリゴ糖などに比べ、腸内の酪酸菌に特に選択的に資化され、酪酸菌の増殖に対し効果が大きいので、酪酸の生成量増加につながる。また、酸性下での安定性も高い。従って、本発明の飲食用組成物においてプレバイオティタスとして有効に作用する。

[0021] 本発明において、セロオリゴ糖は、グルコースが 2糖以上 β— 1, 4結合したオリゴ糖である。セロオリゴ糖は通常様々な重合度のオリゴ糖の混合物であるが、単一或いは特定の範囲の重合度のもののみに精製されたものであってもよい。前記オリゴ糖の中でも、本発明においては、グルコース重合度が 2〜6のセロビオース、セロトリオース、セロテトロース、セロペンタオース、セ口へキサオースのうちの少なくとも 1種を豊富に含むことが好ましぐ特にセロビオース、セロトリオース、およびセロテトロースのうちの少なくとも 1種を豊富に含むことが好ましぐさらに、セロビオースおよびセロトリオースのうちの少なくとも 1種を豊富に含むことが好ましい。具体的には、グルコース重合度力^〜 6のセロオリゴ糖の含有率力 50重量％以上、特に 80重量％以上、中でも 90 重量％以上であることが好ましい。そして更に、セロビオースの含有率が 70重量％以上、好ましくは 85重量％以上、より好ましくは 90%重量％以上、さらに好ましくは 95 重量％以上であることが望ましい。尚、セロオリゴ糖の立体異性については特に問わないが、一般に D体であることが多い。

[0022] 本発明で用いられるセロオリゴ糖は、公知の方法で製造することができる。例えば、化学的方法としては、発煙塩酸濃硫酸によりセルロースを酸加水分解後、カーボンカラム等によりセロオリゴ糖を分画分取する方法（Miller, G. L, Methods in C arbohydrate Chemistry III (Academic Press) , 134 (1963) )等力知られている。

[0023] 酵素的な方法としては、アモルファスなセルロースにセルビブリオ（Cellvibrio)属に属する微生物が生産するセルラーゼを作用させ、限外濾過反応器を組み合わせることにより生成物阻害を解除してセロオリゴ糖を生成させる方法 (特開平 1— 256394 号公報参照）、セルラーゼ中の j8—ダルコシダーゼを選択的に除去したセルラーゼをセルロースに作用させて、セロオリゴ糖を製造する方法 (特開平 5— 115293号公報参照）、湿潤状態の未晒しサルファイトパルプを原料にセルラーゼを作用させる系で限外濾過装置を組み合わせ、セロビオースを含むセロオリゴ糖を作る方法 (特公平 8— 2312号公報参照）等が知られている。

又、糖質加リン酸分解酵素（セロデキストリンホスホリラーゼ)の逆反応を利用し、グルコース 1リン酸をグルコース供与体として、セロビオースの存在下でセロオリゴ糖を製造する製法 ¾知られている (Journal of Fermentation and Bioengineering , vol. 77, No. 3, 239— 242 (1994) )。

[0024] 本発明の飲食品組成物におけるセロオリゴ糖としては、上記のいずれかの方法により製造されたもののほ力、巿販のもの（CMS Chemicals社等)も用いることができる。本発明においては、セルロースをセルラーゼを用いてセロオリゴ糖に分解し、晶析工程などを経てグルコース重合度が 2〜4のセロオリゴ糖の純度を高める方法が好適である。

[0025] さらに、セロオリゴ糖は、酪酸菌の基質になるだけでなぐその他にも特有の生理作用を有する。例えば、脂質代謝への影響については、セロビオースを添加した高蔗糖食でラットを 4週間飼育したところ、対照群と比べて体脂肪率が低下し、総コレステロールや中性脂肪も低下することが報告されている（渡辺隆司， Cellulose Comm un. , 5, 91 (1998) )。また、ブロイラーや産卵鶏にセロビオースを添カ卩した飼料を与えることにより、脂肪酸合成酵素活性が抑制され、脂肪酸分解酵素活性が上昇することが報告されている (石田藍子、村上斉、山崎誠、大塚誠、眞許勝弘、本間秀彌、金井幸雄、高田良三、日本畜産学会第 103回大会講演要旨集， 52 (2004)、石田藍子、大塚誠、勝俣昌也、高田良三、金井幸雄、日本畜産学会第 104回大会講演要旨集， 69 (2005) )。このように、セロビオースは、酪酸菌の基質となり、酪酸の生成に効果を発揮するのみでなぐそれ自体も生体内の脂質代謝に好影響を及ぼし、生活習慣病予防に役立つと考えられている。本発明の飲食品組成物においてもこれらのセロビオース特有の優れた生理作用もあわせて発揮されるものと推測される。

[0026] また、本発明者らは、各種腸内細菌のうち、酪酸菌であるクロストリジゥム属の細菌が良好にセロオリゴ糖を資化できること、特に、クロストリジゥム 'ブチリカムは良好にセ口オリゴ糖を資化できるとともに酪酸産生能も高いことを確認した。

[0027] 実際に人糞便中において、セロオリゴ糖を添加した場合に選択的に酪酸菌が増殖するかどうか観察するために、糞便懸濁液を調製し、これにコーンスターチもしくはセ口オリゴ糖を添加し酪酸菌を接種、培養した結果、セロオリゴ糖添加液は、対照のコーンスターチ添加液と比較して、 ρΗは顕著に低下し、酪酸菌が増殖していることが観察された。

さらに、セロオリゴ糖を 3日間自由に摂取させたラットに酪酸菌を投与し、その腸管内容物中の酪酸菌の菌数を調べたところ、セロオリゴ糖摂取ラットの方が非摂取ラットよりも腸内の酪酸菌の菌数の多いことが確認された。

[0028] これらの実験結果は、消化管内においてセロオリゴ糖が常在腸内細菌により資化されず、併用した酪酸菌のみに選択的に資化されることを示唆するものであり、本発明のようにセロオリゴ糖と酪酸菌とを配合した組成物は、その菌数増大をもたらすといえる。

[0029] 本発明の飲食用組成物における酪酸菌及びセロオリゴ糖の配合量は、医療用であれば患者の年齢、疾患の症状に応じて、また、機能性食品用、動物用はそれぞれ目的に応じて、適宜、増減が可能である。

酪酸菌の量については、特別の制限はないが、典型的には、菌数として一日当たり 1 X 10⁵〜1 X 10^1QCFU (コロニー形成単位）の範囲であり、好ましくは 1 X 10⁶〜1 X 10⁸CFUの範囲が適当である。この投与量を目安に、一日の投与回数との関係で、本発明の飲食用組成物中の酪酸菌の量を適宜調整すればよい。

[0030] 一方、セロオリゴ糖の配合量は、酪酸菌の基質となり、プレバイオテイクスとして整腸作用を助長するために必要な量の範囲とすることができる力セロオリゴ糖を過剰に摂取すると軟便を引き起こす可能性があることも考慮して定める必要がある。セロオリゴ糖の 1日の最大摂取量は、体重 lKgに対し、 0. 36g程度とした方が好ましい。通常、本発明の飲食用組成物においては、セロオリゴ糖は 0. 1〜50重量％含有させることができ、好ましくは 1. 0〜30重量％が適当である。

本発明の飲食用組成物の投与方法は、医薬品では 1日、 1回〜 3回食後に服用することが好ましいが、適宜服用することも可能である。機能性食品用、動物用では、 1 日 1回〜数回自由に摂取して良!、。

[0031] 本発明の飲食用組成物の製造は、例えば以下のような方法で行うことができる。

公知の CS培地 (特開昭 59— 187784号公報参照）によって培養した酪酸菌を、遠心分離により固液分離し得た菌ペーストを乾燥し得た乾燥菌末に、セロオリゴ糖を添加し、練合機で均一になるまで練合する。次に真空乾燥を行う。真空乾燥の条件は、具体的には例えば、棚式真空乾燥機により 50°C下、 5時間、 lOmmHgとすることができる。得られた乾燥物は粉砕機により粉砕して該組成物を得た。このようにして、乳白色で均質な細粒状でほとんど無味無臭の組成物を得ることができる。

[0032] 本発明の飲食用組成物は、人を含めて全ての動物に適用する事が出来る。また、幼若期から高齢期まで全ての年齢の動物に制限無く用いることが出来ると共に、健康状態、体格などについても特に制限はない。ヒト以外の動物としては、ラット、マウス、ゥサギ等の実験動物のほか、ブタ、ゥシ、ヒッジ、ャギ、ゥマ等の家畜、 -ヮトリ、ァヒル、ゥズラ、シチメンチヨウ等の家禽、ィヌ、ネコ等の愛玩動物などを挙げることができる。

本発明の飲食用組成物の投与方法は特に限定されないが、酪酸菌とセ口オリゴ糖を混合し、錠剤、タブレット等にして経口投与しても良いし、粉状又は顆粒状にして飲食物に添加して投与しても良い。また、酪酸菌とセ口オリゴ糖を個別の粉末その他の製剤として、添加または投与時には同時に利用する形としても良い。

[0033] 本発明の飲食用組成物を例えば、医薬品として用いる場合の剤型は、このまま各成分の粉末を製剤化せずに用いることができるが、散剤、顆粒剤、細粒剤、錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、タブレット、ェンテリックコーティング剤等に製剤化してもよい。希釈剤には、一般の医薬品製剤に使用される賦形剤、結合剤、崩壊剤等が用いられ、これに加えて着色剤、矯味剤、安定化剤、保存剤、滑沢剤等を添加しても良い。

[0034] 本発明の飲食用組成物を食品として用いる場合は、このまま各成分の粉末を製剤化せずに用いることができるが、他の食物繊維、オリゴ糖、穀物類、ビタミン類等をカロえ、さらに、フレーバー、着色剤、矯味剤等を加え、食に適した形態に形成加工することも可能である。また、食品添加物として、他の食品に添加混合して用いることもできる。

[0035] 動物用飼料としては、酪酸菌とセ口オリゴ糖を製剤化せずに粉末の状態で混合して用いてもよいが、食品用とする場合と同様に各種賦形剤、添加剤を加えてもよい。また形状も粉状のままでも良いし、剤型としても用いても良い。また、飼料成分である、とうもろこし粉、大豆かす、大麦粉、裸麦粉、大豆粉、米ぬか、脱脂米ぬか、もみがら、ばれいしよ粉、力んしょ粉、豆腐かす、デンプン、酵母、魚粉等と混合し用いることもできる。

実施例

[0036] 以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

[0037] [酪酸の測定方法] 盲腸内容物 150mgに蒸留水 350 Lを添加してポリトロン ^R (キネマチ力社製)でホモジナイズ (Lebel 30, 30sec, 4°C)後、遠心分離（15, OOOrpm' 15min、 4°C)により得られた上清 0. 5mLにクロ口ホルム 0. 5mLを添カ卩した。その上清を、 Vortex^ キサ一にて 1分攪拌後、遠心分離（15, 000rpm' 15min、 4°C)し、得られた上層をミリポア ^R(ミリポア社製)でフィルターろ過し、 10 μ Lを HPLCにチャージした。

[0038] 「HPLC条件」

溶液搬出システム：島津 LC— 10AD (島津製作所製）

カラム： Shim— packSCR— 102 (H)

検出器: CDD— 10A

移動相： 5mM p― toluenesulf onic acid

反応相： 20mM Bis-Tris (5mM p— toluenesulf onic acid, lOOmM EDT A含有）

温度：45°C

[0039] [実施例 1]

給水にセロオリゴ糖 (セロビオース 96重量⁰ /₀、グルコース 2重量⁰ /₀、セロトリオース 2 重量％)を 5重量％混和し、これを 3日間自由に摂取させた ICR系マウス（体重約 30g )に、クロストリジゥム 'ブチリカム'ミヤイリ 588 (FERM BP— 2789)を一頭当り 1. 0 X 10⁸個、経口投与した。投与 3時間、 6時間後に動物を屠殺に処し、全消化管を摘出し、嫌気性グローブボックス内において、その内容物中のクロストリジゥム 'ブチリ力ム 'ミヤイリ 588の生菌数を GAM平板培地を用い測定した。なお、対照としてセロオリゴ糖を摂取させて、な、系につ、ても同様の操作を行った。結果を表 1に示す。

[0040] [表 1] 表 1 菌数の変化

セロオリゴ糖非摂取区セロオリゴ糖摂取区経過時間 (個体数： 6) (個体数： 6)

3時間 2.1 10³ 3.1 X 10⁴

6時間 3.8 X 10³ 1 .2 10⁴ [0041] 表 1から分力るように、セロオリゴ糖を摂取させた動物において、対照よりも多くの菌が観察された。特に投与 3時間後の対照に対する菌数の増加率が多力つた。

[0042] [実施例 2]

Wistar系雄性ラット（7週齢)を用い、 7日間コーンスターチを炭水化物源とする標準飼料 (表 2の対照参照)で予備飼育して実験環境に馴化させ、異常のな!、個体を選別し、 1群 8匹として実験に供した。表 2記載の組成の飼料を用い、セロオリゴ糖 (セロビオース 96重量％、グルコース 2重量％、セロトリオース 2重量％)単独投与区（9 重量％)、酪酸菌とセ口オリゴ糖併用投与区 (セロオリゴ糖 9重量％ +酪酸菌粉体 0. 03重量％、 0. 1重量％、 0. 3重量％)にて、試験を行った。酪酸菌は、クロストリジゥム 'ブチリカム MIYAIRI 588 (FERM BP— 2789)を用いた。酪酸菌粉体中の酪酸菌の菌数は 4. l X 10^1QCFU/gである。ブランクは標準飼料 (表 2の対照参照）を与えた区とした。飼料は自由摂取とし、 14日間飼育した後に屠殺し、盲腸内容物の酪酸含量を HPLCにて測定した。又、酪酸菌粉体の摂取に関しては混餌して自由摂取させる以外に、酪酸菌粉体を 1日 1回胃内に強制投与 (投与量は、 6. 2 X 10⁹C FUZ体重 200g)した区も設定した。強制投与区は、餌にセロオリゴ糖を 9重量％添カロした。それぞれの区の盲腸内容物の酪酸含有量の結果を表 3に示す。

[0043] [表 2]

表 2 飼料組成（表中の数字は、飼料 1 Kg中の各組成物の含有量 (g))

[0044] (表 2の脚注）

* ビタミン混合物'ミネラル混合物は AIN— 76組成 (Journal of Nutrition 107

, 1340 (1977) )に準じて調製。

[0045] [表 3]

表 3 酪酸含有量

[0046] 本実施例の結果から、セロオリゴ糖と酪酸菌を併用することで酪酸産生に相乗効果がみられ、更に酪酸菌投与法を混餌力胃内強制投与にすることで更に相乗効果が高まることが判明した。特に、参考例の結果と併せて考察すると、セロオリゴ糖の添カロ量を増加させた場合よりも、酪酸菌の添加量を増加させる本実施例の方が酪酸含量が飛躍的に増カロしたことから、セロオリゴ糖と酪酸菌を併用することにより、相乗効果が発揮され、腸内の酪酸含量を飛躍的に高めることができることが明らかとなった。

[0047] [参考例 1]

宫入菌 (酪酸菌）のセロオリゴ糖資化性にっ、て他の腸内細菌と比較した。供試菌株は、宫入菌（Clostridium butyricum MIYAIRI 588 (FERM BP 2789) )、枯草菌（Bacillus subtilis JCM 2499)、ビフィズス菌（Bifidobacte rium adolescentis JCM1275)、乳酸菌（Lactobacillus casei JCM1134)の 4菌株とした。

[0048] 供試培地は、下記の基礎培地にセロオリゴ糖 (セロビオース 96重量％、グルコース 2重量⁰ /₀、セロトリオース 2重量⁰ /₀)を 1重量⁰ /₀添カ卩し pH7. 0に調整したもの（PYC培地）を用いた。

[0049] (基礎培地） PY培地

Pepton 0. 5g

frypticase 0. 5g

Yeast extract 1. Og

Salts solution 4. Oml

Distilled water 100. Oml

Hemin solution 1. Oml

Vitamin K 0. 02ml

1

Cysteine HC1— H O 0. 05g

2

[0050] 前培養した各菌株を、初発菌数が約 10⁵CFUZmlとなるように PYC培地に接種した。対照として PY培地に接種した。宫入菌、ビフィズス菌、乳酸菌は嫌気培養し、枯草菌は好気培養と嫌気培養をした。培養温度は 37°Cとした。尚、各菌の前培養については、以下の通りである。宫入菌は、 GAM brothに接種後、 37°Cで 6時間培養した。枯草菌、ビフィズス菌、乳酸菌は、 GAM brothに接種後、 37°Cで 16時間培し 7こ。

[0051] セロオリゴ糖を代謝したときに産生される有機酸の産生量によって各菌株の資化性を比較した。培養開始力 0, 6, 12, 24, 48時間後にサンプルを採取し HPLCによつて有機酸を測定した。 PYC培地中の有機酸カゝら同じ培養時間の PY培地中の有機酸を引いたものを算出し、有機酸の産生量とした。表 4に、それぞれ培養開始から一定時間（6時間、 12時間、 24時間、 48時間）後の各細菌による有機酸産生量 (m M)を示した。

[0052] [表 4]

姻遛酬墾体 s

[0053] 表 4から明らかなように、宫入菌は他の細菌に比べ、早い時間から有機酸の産生が認められ産生量も多かった。また酪酸を産生したのは宫入菌だけであった。

[0054] [実施例 3]

ブタに対する本発明品の有効性を下記の項目について検討し評価した。まず、対照区と、本発明品を投与した本発明品投与区 (MGC区)とから、母ブタを各 3腹ずつ、群飼で試験を行った。各母ブタから出生した子ブタのうち各 10頭についてサンプルを採取した。

[0055] 出産日の近い母ブタが揃い次第試験を開始した。試験期間は出産前力離乳後 3

0日までとし、サンプル採取日は離乳後と試験最終日（離乳 30日後）とした。投与する飼料の組成はブタの成長に合わせ次のように調整した。

[0056] (投与する飼料）

a) .授乳期子ブタ；基本飼料 (ミルク）に本発明品 0. 5重量％添加したものを離乳まで給餌。

b) .離乳後子ブタ；基本飼料に本発明品 0. 2重量％添加したものを約 30日間給餌。

c) .母ブタ；基本飼料に本発明品 0. 2重量％添加したものを給餌。

(本発明品）

.組成二

酪酸菌末 10重量％

セロオリゴ糖 20重量％

デンプン 20重量％

ブドウ糖 20重量％

ケィ酸ァノレミ-ゥム 20重量⁰ /₀

炭酸カルシウム 10重量⁰ /₀

'セロオリゴ糖は、セロビオース 96重量⁰ /₀、グルコース 2重量⁰ /₀、セロトリオース 2重量 %のものを用いた。

•酪酸菌末は、宫入菌（Clostridium butyricum MIYAIRI588 (FERM BP— 2789) )の生菌体 (芽胞）が本発明品あたり 10⁷個以上含まれるような割合とした。

[0057] 対照区のブタ（母ブタおよび子ブタ）は基本飼料に何も添加しな!ヽまま投与して飼育した。尚、基本飼料は、抗生剤 (アビラマイシン、硫酸コリスチン、クェン酸モランテル)配合市販飼料とした。市販飼料とは、子ブタの場合、以下の配合飼料を意味する [0058] (配合飼料）

•授乳期：「マル中印ほ乳期子豚育成用配合飼料プライマー I」（中部飼料株式会社製）

•授乳〜離乳期：「マル中印ほ乳期子豚育成用配合飼料プロ II」（中部飼料株式会社製）

•離乳後：「マル中印ほ乳期子豚育成用配合飼料ゥルカム II」（中部飼料株式会社製）

[0059] 離乳 30日後の MGC区および対照区の子ブタの糞便を対象として、糞便中フローラと、糞便中の有機酸およびスカトール（SKT)の量と、糞便中および血清中のアンモニァ量とを測定した。

[0060] 〔糞便中フローラ〕

糞便中の、 '呂'入菌 (Clostridium butyricum)、ウエルシュ菌 (C. perfringens 、腸内細菌科（Enterobacteriaceae)、腸球菌、乳酸菌の菌数を、以下のようにして測定した。

[0061] 対照区および MGC区の離乳 30日後の子ブタカ採取した糞便を輸送培地に入れ懸濁した。希釈液を用いて 100倍段階希釈し各選択培地に塗抹した。菌数測定には、宫入菌には MIM培地、ウエルシュ菌には NN培地、腸内細菌科には DHL培地を用いた。また腸球菌は TATAC培地、乳酸菌は変法 LBS培地を用いた。 DHL培地の場合は 1日、 TATAC培地， TS培地， MIM培地および NN培地の場合は 2日、 BL培地および LBS培地の場合は 3日間培養し、形成したコロニーを計測して菌数 (1 ogCFUZg)を算出した。尚、腸内細菌科細菌のうち大腸菌については、 DHL培地上に形成される淡桃色のコロニー数を菌数としてカウントした。

[0062] さらに腸内細菌のうち、大腸菌毒素産生株の菌数も測定した。大腸菌毒素産生株の検出は、 DHL培地上の大腸菌による毒素産生を VTEC— RPLA (デン力生研 (株 ) )によって行った。

[0063] 実験成績は各試験区を構成する個体の測定値の平均値とその標準偏差で示し、各区間での有意検定は Student's t— test及び Mann— Whitney U— test法により行った。また、各試験区を構成する個体数に対する、それぞれの菌種が検出された個体数の割合を検出率として算出した。

[0064] また、対照区についても離乳 30日後の糞便を対象として同様の測定および検定を行った。 MGC区および対照区における離乳 30日後の糞便中フローラを図 1に示した。

[0065] 図 1に示すように、対照区の 4検体から宫入菌が検出された (対照区 = 2. 3±0. 2 21ogCFU/g vs MGC区 =4. 0±0. 551ogCFU/g)。ウエルシュ菌はどちらの区からも検出されな力つた。腸内細菌科および大腸菌の菌数は MGC区の方が有意に低かった (腸内細菌科；対照区 = 7. 1 ± 1. 38 logCFU/g vs MGC区 =4. 1 ±0. 73 logCFU/g,大腸菌；対照区 = 7. 0± 1. 39 logCFU/g vs MGC区 = 3. 4± 1. 04 logCFU/g)。腸球菌および乳酸菌に差は認められな力つた (腸球菌；対照区 = 2. 6±0. 50 logCFU/g vs MGC区 = 2. 6±0. 35 logCFU ん乳酸菌；対照区 =8. 9±0. 51 logCFU/g vs MGC区 = 9. 0±0. 59 1 ogCFUZg)。又、この時分離した大腸菌は全株において毒素産生は確認されなかつた o

[0066] 〔糞便中 SKT〕

対照区および MGC区の離乳 30日後の糞便を、 0. 03Mリン酸緩衝液 (pH7. 4)で 4倍に希釈後、その 0. 3mlを SKT測定用として別のチューブに分注した。そこに等量のァセトニトリルを添カ卩してよく混合した後、— 20°Cで 15分静置した。 6000rpmで 15分間遠心し、上清を 0. 45 μ 1のフィルター（商品名： Minisart、メーカー名： sarto rius)で濾過後、 HPLCに供試した。 HPLCの条件は以下の通りである。

[0067] (HPLC条件）島津製作所、 LC— 10シリーズ

カフム： phennomenex ODS— C18

カラム温度： 40°C

移動相： 0. 02M酢酸 60vZv%

2—プロパノール 15vZv%

ァセトニトリル 25v/v%

', lml/ mm

検出器:紫外分光光度計 (島津製作所）波長： 280nm

分析時間： 15分

[0068] このようにして糞便 lg中に占める SKT量 ( μ g/g)を測定した。実験成績は各試験区を構成する個体の測定値の平均値とその標準偏差で示し、各区間での有意検定は Student's t— test及び Mann— Whitney U— test法により行った。また、各試験区を構成する個体数に対する、 SKT陽性の個体数の割合を検出率として算出した。測定結果を図 2に示す。

[0069] 図 2から明らかなように、糞便中 SKTは MGC区の方が有意に低力つた (対照区 =

13. 1 ± 5. 76 μ g/g, MGC区 = 7. 3±4. 93 /z gZg)。

[0070] 〔糞便中有機酸〕

離乳 30日後の糞便を 0. 03M リン酸緩衝液 (pH7. 4)で 4倍に希釈後、 6000rp mで 15分間遠心した。上清を 0. 45 _iu Lのフィルター（商品名Minisart、会社名 sart orius)で濾過後、 HPLCに供試した。

[0071] (HPLC条件）島津製作所、 LC— 10シリーズ

カラム： Shin— pack SCR— 102H 2本

カラム温度： 40°C

移動相： 5mM p—トルエンスルホン酸水溶液

抽出相： 5mM p—トルエンスルホン酸水溶液

100 トルエンジァミン四酢酸を含む 20mM Bis— Tris 流速： 0. 8mレ min

検出器:電気伝導度検出器 CDD— 6A (島津製作所）

分析時間: 60分

[0072] 実験成績は各試験区を構成する個体の測定値の平均値とその標準偏差で示し、各区間での有意検定は Student's t— test及び Mann— Whitney U— test法により行った。測定結果を図 3に示す。

[0073] 図 3から明らかなように、 MGC区の方が対照区よりも酢酸、プロピオン酸および酪酸が有意に高かった（酢酸；対照区 = 50. 7± 9. 27mM vs MGC区 = 63. 1 ± 5 . 55mM,プロピオン酸；対照区 = 26. 4±4. 02mM vs MGC区 = 32. 1 ±6. 5 3mM,酪酸；対照区 =8. 6± 3. 03mM vs MGC区 = 13. 1 ±4. 16mM)。このように、糞便中の有機酸のうち酢酸、プロピオン酸、酪酸は MGC区で有意に高かつたことから、セロオリゴと宫入菌を配合した本発明品を摂取することで、シンバイオティタスの効果が発揮されたものと考えられる。

[0074] 〔糞便中のアンモニア〕

各試験区の個体の離乳 30日後の糞便を、生化学試験用チューブに採取し、アンモニァの測定をアンモニアテストヮコ一で行った。実験成績は各試験区を構成する個体の測定値の平均値で示した。測定結果を図 4に示す。

[0075] 〔血清中のアンモニア〕

腸管内において腸内細菌により産生されるアンモニアの一部は、腸管力吸収され血液中に取り込まれる。すなわち、血清中のアンモニア量の減少は、腸管内アンモ- ァ産生菌が減少して腸管内のアンモニア量が減少したことを意味し、腸内環境が改善されたことを示す。一方、血清中のアンモニア量の増加は、腸管内アンモニア産生菌が増加して腸管内のアンモニア量が増加したことを意味し、腸内環境が悪ィ匕したことを示す。

このように腸内環境の変化の指標と言える血清中のアンモニア量を、離乳時および離乳 30日後の子ブタを対象として以下のように測定した。すなわち、各個体から採血し、この血液をタングステン酸ナトリウムで除蛋白した。得られる上清を生化学試験用チューブに採取し、アンモニアテストヮコ一でアンモニアの測定を行った。実験成績は各試験区を構成する個体の測定値の平均値で示した。測定結果を図 5に示す。

[0076] 図 4から明らかなように、 MGC区においては対照区と比べて糞便中のアンモニア濃度が減少する傾向が確認できた。このことから、セロオリゴ糖と酪酸菌の組み合わせにより腸内環境が改善されること、および糞便の悪臭が抑制されることが分力つた。また、図 5から明らかなように、 MGC区においては対照区と比べて、血清中においてもアンモニア濃度が減少する傾向が確認できた。このことから、セロオリゴ糖と酪酸菌の組み合わせにより腸管内のアンモニア量が減少し、腸内環境が改善されることが分かった。

[0077] [実施例 4] 家禽に対する本発明品の有効性を下記の項目について検討し評価した。

ブロイラーの初生ヒナを、 20000羽ずつ 2グループ用意し、対照区および本発明品投与区 (試験区)とした。

[0078] 試験区の個体に対しては、市販ブロイラー用飼料 (抗生剤未添加）に、宫入菌 (Clo stridium butyricum MIYAIRI588 (FERM BP— 2789) )の芽胞を 1 X 10⁸C FU/g,セロオリゴ糖（セロビオース 96重量⁰ /₀、グルコース 2重量⁰ /₀、セロトリオース 2 重量％)を 2割（20重量％)含有する本発明品を 0. 2重量％添加したものを投与した。一方、対照区の個体に対しては市販ブロイラー用飼料 (抗生剤未添加）のみ (本発明品無添加)を投与した。

各個体が 18日令， 42日令に達した時点で各区力無作為に 5羽選んで屠殺し、腸管 (盲腸)内容物を採取した。同時に各区の鶏舎内の新鮮便を 5検体ずつ採取した。

[0079] 〔飼養試験〕

各区の個体について増体重 (各区の平均体重）、飼料要求率 (増体 lkgに必要な飼料の量)、商品化率 (廃棄されな力つた個体の割合 (％) )を測定した。結果を表 5 に示す。

[0080] [表 5] 表 5

[0081] 表 5から明らかなように、本発明品を使用した区は、対照区に比べ平均体重、飼料要求率、商品化率、廃棄率 (廃棄された個体の割合)共に全て改善が見られた。

[0082] 〔腸管内有機酸〕

盲腸内容物は 0. 03M リン酸緩衝液 (pH7. 4)で 4倍に希釈後、 lOOOOrpmで 15 分間遠心した。上清を 0. 45 _iu lのフィルター（商品名Minisart、会社名 sartorius) でろ過後、 HPLCに供試した。 HPLCの条件は以下の通りである。

[0083] (HPLC条件）島津製作所、 LC— 10シリーズ

カラム： Shin— pack SCR— 102H 2本

カラム温度： 40°C

移動相： 5mM p—トルエンスルホン酸水溶液

抽出相： 5mM p—トルエンスルホン酸水溶液

検出器:電気伝導度検出器 CDD— 6A (島津製作所）

分析時間: 60分

[0084] 実験成績は各試験区を構成する個体の測定値の平均値とその標準偏差で示し、各区間での有意検定は Student's t— test及び Mann— Whitney U— test法により行った。測定結果を図 6に示す。

[0085] その結果、図 6から明らかなように、盲腸内有機酸は酢酸が最も多力つた。また、各有機酸についての、各試験区を構成する個体数に対する検出率については、プロピオン酸および酪酸の検出率が 100%であったほか、その他の各有機酸の検出率も 1 00%であった。 18日令、 42日令の個体力採取した盲腸内容物においては、いずれも、試験区の酢酸、プロピオン酸、酪酸の割合が対照区のそれよりも増加する傾向が認められ、この傾向は特に酢酸量において顕著であった（18日令の酢酸量;対照区 =42. 8± 10. 18 vs 試験区 = 57. 2± 7. 66 μ mol/g, 42日令の酢酸量；対照区 = 32. 4± 11. 62 vs 試験区 =46. 7± 3. molZg)。酢酸、プロピオン酸、酪酸などの短鎖脂肪酸は、腸内 pHの低下による有害菌の増殖抑制に関与するほか、エネルギー源として利用され、更に腸蠕動運動をも促進する働きがある。従つて、本試験において対照区よりも試験区の方が腸内における前記短鎖脂肪酸が増カロしたことは、セロオリゴ糖と酪酸菌との組み合わせにより、腸内環境が改善されたことを示すものである。

Claims

請求の範囲

[1] 酪酸菌とセ口オリゴ糖を含有する腸内環境改善機能および Zまたは感染症防御機能を有する飲食用組成物。

[2] 酪酸菌が、クロストリジゥム 'ブチリカムである請求項 1に記載の飲食用組成物。

[3] 酪酸菌とセ口オリゴ糖を含有する腸内環境改善機能および Zまたは感染症防御機能を有する飼料。

[4] 酪酸菌とセ口オリゴ糖を含有する腸内環境改善機能および Zまたは感染症防御機能を有する食品。

[5] 酪酸菌およびセロオリゴ糖の、腸内環境改善機能および Zまたは感染症防御機能を有する飲食用組成物としての利用。

[6] 酪酸菌およびセロオリゴ糖の、腸内環境改善機能および Zまたは感染症防御機能を有する飼料または食品としての利用。