CN101415342A

CN101415342A - 饮食用组合物

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Publication number: CN101415342A
Application number: CNA2007800123207A
Authority: CN
Inventors: 把田雅彦; 高桥志达
Original assignee: Nippon Paper Chemicals Co Ltd
Current assignee: Miyarisan Pharmaceutical Co Ltd; Nippon Paper Industries Co Ltd
Priority date: 2006-03-31
Filing date: 2007-03-30
Publication date: 2009-04-22
Anticipated expiration: 2027-03-30
Also published as: CA2647551A1; EP2005841A4; EP2005841A1; CN101415342B; JPWO2007114378A1; US20090280098A1; WO2007114378A1; KR20080109795A

Abstract

本发明的课题在于提供饮食用组合物，该组合物中含有产生丁酸且整肠作用优异的丁酸菌和作为丁酸菌的基质并助长丁酸产生的纤维寡糖，该组合物可以提高肠内的丁酸产生量，而且改善肠内环境、防御感染症的功能等优异。即，本发明提供：含有丁酸菌和纤维寡糖的、具有改善肠内环境的功能和/或防御感染症的功能的饮食用组合物；上述丁酸菌为丁酸梭菌的上述饮食用组合物；含有丁酸菌和纤维寡糖的、具有改善肠内环境的功能和/或防御感染症的功能的饲料；以及含有丁酸菌和纤维寡糖的、具有改善肠内环境的功能和/或防御感染症的功能的食品。

Description

饮食用组合物

技术领域

本发明涉及包含丁酸菌和纤维寡糖(cello-oligosaccharide)的饮食用组合物(用于饮料或食品的组合物)。更详细而言，涉及含有产生丁酸且整肠作用优异的丁酸菌和作为丁酸菌的基质并助长丁酸产生的纤维寡糖、提高肠内的丁酸产生量、改善肠内环境、防御感染症功能等优异的饮食用组合物及其用途。

背景技术

肠道除了具有消化、吸收维持生命所必需的营养素的作用以外，还具有保护身体以防有害细菌或病毒、异物等外敌入侵的作用(肠道免疫功能)，是维持健康非常重要的器官。近年来通过有关生理功能的研究，解明以肠内菌群为首的肠内环境的改善与预防疾病(预防消化系统疾病、降低致癌危险度等)、健康的维持增进密切相关。已知肠道中常驻100种以上、100兆个细菌，大致分为双歧杆菌、乳酸菌等有益菌和产气荚膜杆菌、拟杆菌(Bacteroides)、大肠杆菌等腐败菌。作为促进有益菌增殖并具有抑制腐败菌作用的调节肠内细菌的原料，各种益生菌(probiotics)(通过改善肠内菌群的平衡而对宿主动物发挥有益作用的活菌剂)和益生元(prebiotics)(使肠内有益菌增殖的因子：寡糖、食物纤维等)已经上市。

作为使原来生存在体内的双歧杆菌等有益菌显著增殖的物质有益生元，使用各种寡糖或食物纤维等。寡糖的例子有：果寡糖、异麦芽寡糖、半乳寡糖、木寡糖、甜菜寡糖等难消化性寡糖。难消化性寡糖不被胃和小肠分解而到达大肠，被大肠内的肠内细菌利用，生成乙酸、丙酸、丁酸、乳酸等短链脂肪酸。这些短链脂肪酸具有增加消化道血流粘膜血液量、使消化道粘膜上皮细胞增殖、抑制胆固醇合成等生理活性。

即使在短链脂肪酸中，当乳酸过剩蓄积时，也会引起粘膜障碍，对大肠上皮细胞的新陈代谢产生不良影响。另一方面，大部分丁酸在进入全身的能量库之前被大肠上皮细胞摄取，使新陈代谢活跃。另外，丁酸也具有修复DNA和预防大肠癌的效果。并且，乙酸、丙酸、丁酸除了参与由于肠内pH降低而引起的有害菌的增殖抑制外，还被用作能源，并且具有促进肠蠕动的作用。

寡糖中，代表性的益生元—果寡糖是果糖与蔗糖经1，4-键连接而成的寡糖。果寡糖被肠内的有益细菌、特别是双歧杆菌选择性地利用，由于为难消化性，因此可谓是非常有助于肠内菌群的改善。但果寡糖的稳定性不充分，特别是在酸性溶液中长期保存时转化成葡萄糖、果糖、蔗糖，存在其生理活性也降低的问题。至于其他寡糖，也具有同样的缺点。另外，虽然双歧杆菌的增殖使甲基吲哚、吲哚等腐败物质减少，但由双歧杆菌生成的短链脂肪酸主要是乳酸和乙酸，当大肠内的菌群显著偏向于双歧杆菌时，丁酸浓度下降。从上述背景考虑，希望开发被丁酸菌选择性利用的寡糖。

然而，仅使用益生元时，当肠内菌群的平衡偏向于腐败菌时存在效果非常小的问题。因此，为有效增加肠内有益菌而混合有具益生菌功能的活菌剂和具益生元功能的寡糖的协同物质已经商品化。

在日本特开2003-93019号公报(专利文献1)中，有人公开了含有双歧杆菌作为益生菌、含有木寡糖作为益生元的经口摄取用组合物，提供了小型、保存性优异的经口摄取用组合物。在日本特开2005-34135号公报(专利文献2)中，有人还公开了包含益生菌、益生元、生机食物(biogenics)中的1种或2种以上的提高食品有效成分的机体内利用效率的功能增强组合物。另外，在日本特开2004-357505号公报(专利文献3)中，有人公开了含有啤酒酵母、活菌剂、寡糖、茶提取物的用于预防、轻减犬的胃肠疾病的添加剂。但在上述现有技术中，主要着眼于双歧杆菌增殖因子，还不存在着眼于丁酸生成的产品，不能十分满足改善肠内环境的需要。

另外，在日本特开平7-145号公报(专利文献4)中，有人公开了包含丁酸菌和葡甘露聚糖的丁酸菌组合物。丁酸菌虽然利用葡甘露聚糖，但丁酸的产生量对改善肠内环境并不充分。

专利文献1：日本特开2003-93019号公报

专利文献2：日本特开2005-34135号公报

专利文献3：日本特开2004-357505号公报

专利文献4：日本特开平7-145号公报

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的课题在于提供可以显著改善肠内环境的饮食用组合物。

解决课题的方法

本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现：即使在多种活菌剂中，通过将产生丁酸且整肠作用优异的丁酸菌和纤维寡糖组合，纤维寡糖成为丁酸菌的基质，在肠内可以显著提高丁酸菌的丁酸产生。而且同时发现：可以实现有效增加肠内的有益菌、减少腐败物质的量等肠内环境的改善。本发明人等基于上述知识，完成了本发明，作为具体化的方案，提供下述发明。

〔1〕饮食用组合物，该组合物含有丁酸菌和纤维寡糖，并具有改善肠内环境的功能和/或防御感染症的功能。

〔2〕〔1〕的饮食用组合物，其中丁酸菌为丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)。

〔3〕饲料，该饲料含有丁酸菌和纤维寡糖，并具有改善肠内环境的功能和/或防御感染症的功能。

〔4〕食品，该食品含有丁酸菌和纤维寡糖，并具有改善肠内环境的功能和/或防御感染症的功能。

〔5〕丁酸菌和纤维寡糖在作为具有改善肠内环境的功能和/或防御感染症的功能的饮食用组合物中的应用。

〔6〕丁酸菌和纤维寡糖在作为具有改善肠内环境的功能和/或防御感染症的功能的饲料或食品中的应用。

发明效果

本发明的饮食用组合物，纤维寡糖不仅成为丁酸菌的基质，其在肠内还可以显著提高丁酸菌的丁酸产生能。并且，不仅使腐败菌减少、使有益菌增加，还可以减少腐败物质等，改善肠内环境。因此，将本发明的饮食用组合物给予人或动物时，可以增加大肠部位的丁酸菌、提高丁酸含量，可以将大肠上皮细胞维持在健全的状态。其结果，对各种感染症的防御功能提高，还与大肠癌或大肠疾病的预防相关，可以维持、增进健康。另外，将本发明的饮食用组合物供给畜产用动物时，疾病率降低、增体重效果优异，因此可以缩短出栏天数，可以降低成本，在经济上也有优点。

附图简述

图1是显示实施例3中的断奶30天后的仔猪的粪便中菌群的图。

图2是显示实施例3中的断奶30天后的仔猪的粪便中甲基吲哚(SKT)量的图。

图3是显示实施例3中的断奶30天后的仔猪的粪便中有机酸组成的图。

图4是显示实施例3中的断奶30天后的仔猪的粪便中氨量的图。

图5是显示实施例3中的断奶时和断奶30天后的仔猪的血清中氨量的图。

图6是显示实施例4中的初生雏鸡(18日龄、42日龄)的盲肠内容物中的有机酸组成的图。

实施发明的最佳方式

本发明的饮食用组合物含有丁酸菌和纤维寡糖。即，本发明的饮食用组合物含有丁酸菌作为益生菌、含有纤维寡糖作为益生元，具有在肠内、特别是在大肠中提高丁酸浓度、维持健全状态的效果。即，本发明的饮食用组合物具有在机体内发挥改善肠内环境的功能和防御感染症的功能这两种功能、或者至少发挥一种功能。

本发明的饮食用组合物的第一有效成分为丁酸菌。作为益生菌，通常使用双歧杆菌(Bifidobacterium sp.)、乳酸菌(Lactobacillus sp.)等。幼儿的肠内菌群中双歧杆菌等有益菌占优势，但随着年龄的增加有益菌减少、腐败菌的比例增加。因此，为了抑制腐败菌或增加有益菌，双歧杆菌或乳酸菌等多种活菌剂被用作益生菌。但双歧杆菌或乳酸菌即使经口摄取，对胃液或胆汁等酸也不具耐性，活着达到肠内的不过微乎其微。另外，即使一部分固定，但若中止摄取则存在着肠内菌群恢复为腐败菌优势的菌群的问题。相对于此，本发明中使用的丁酸菌在需氧下形成芽胞，经口给予后在胃内暴露在蛋白消化液胃蛋白酶和胃酸形成的低pH环境中，作为芽胞而具抵抗性的丁酸菌在不死亡的情况下通过此处，达到十二指肠。此处pH上升至中性附近，食物被各种消化液消化形成营养丰富的环境后，丁酸菌得到发芽增殖的机会。即使经口摄取，也不会被胃液或胆汁消化，保持胞子状态到达大肠，可以在大肠内发芽增殖产生丁酸。

本发明中使用的丁酸菌只要是生成丁酸的菌即可，可以是任何菌种。其中优选梭菌属，特别优选丁酸梭菌种。并且如下所述，丁酸梭菌的优选菌株的代表性例子有：丁酸梭菌MIYAIRI(ミヤイリ)株。丁酸梭菌呈偏性厌氧性的芽胞形成性。该菌株于1933年由千叶医科大学卫生学教室(现千叶大学医学部)宫入近治博士从人肠道内取得，作为对腐败菌具有强拮抗作用的丁酸菌进行了报道。本菌株对腐败菌为首的各种消化道病原体具有拮抗作用，通过与双歧杆菌或乳杆菌等所有肠内有益菌共生而发挥整肠效果。还有报道称，本菌株为芽胞形成细菌，因此其在制剂中的稳定性和对胃酸的抵抗性比乳酸菌群高。

作为本发明中使用的丁酸菌，具体例子有：乳酸菌·ブランクラム、丁酸梭菌NIP1006、丁酸梭菌NIP1015、丁酸梭菌NIP1017、丁酸梭菌MIYAIRI 588(Clostridium butyricum MIYAIRI 588)，其中特别优选丁酸产生能高的丁酸梭菌MIYAIRI 588(FERM BP-2789)。丁酸梭菌MIYAIRI 588于1981年(昭和56年)5月1日保藏在通商产业省工业技术院微生物工业技术研究所(日本国茨城县筑波市东1丁目1番3号(邮政编码305))[现在改称为独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(邮政编码305-8566日本国茨城县筑波市东1-1-1中央第6)]，其保藏号为FERM BP-2789(由昭和47年5月16日寄托的微工研菌寄第-P 1467号移管)。

在本发明的饮食用组合物中，丁酸菌可以使用市售的活菌剂、例如ミヤリサン片(ミヤリサン(株)制)等，将丁酸菌在适当的培养基中进行液体培养后，可以分离菌体直接使用，也可以进行干燥以干燥菌体的形式使用。使用市售的活菌剂时，考虑所含丁酸菌的纯度或含量等，调整混合量使含有下述菌数。

在本发明的饮食用组合物中，使用纤维寡糖作为第2有效成分。与果寡糖等相比，纤维寡糖被肠内的丁酸菌特别选择性地利用，对丁酸菌的增殖效果大，因此与丁酸的生成量增加有关。另外，纤维寡糖在酸性下的稳定性也高。因此，在本发明的饮食用组合物中，纤维寡糖作为益生元而有效发挥作用。

在本发明中，纤维寡糖是2糖以上葡萄糖经β-1，4键连接而成的寡糖。纤维寡糖通常是各种聚合度的寡糖的混合物，可被纯化成单一或特定范围的聚合度的寡糖。在本发明中，上述寡糖中优选富含葡萄糖聚合度为2～6的纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖、纤维六糖中的至少一种；特别优选富含纤维二糖、纤维三糖和纤维四糖中的至少一种；进一步优选富含纤维二糖和纤维三糖中的至少一种。具体而言，葡萄糖聚合度为2～6的纤维寡糖的含有率为50％(重量)以上、特别是80％(重量)以上，其中优选为90％(重量)以上。而且，纤维二糖的含有率为70％(重量)以上，优选85％(重量)以上，更优选90％％(重量)以上，进一步优选95％(重量)以上。尚需说明的是，虽然对纤维寡糖的立体异构没有特别说明，但通常多为D异构体。

本发明中使用的纤维寡糖可以按照公知的方法进行制造。例如，作为化学方法，已知有将纤维素用发烟盐酸-浓硫酸进行酸水解后，利用碳柱等分级分取纤维寡糖的方法(Miller，G.L，Methods inCarbohydrate Chemistry III(Academic Press)，134(1963))等。

作为酶法，已知有：使属于纤维弧菌属(Cellvibrio)属的微生物所产生的纤维素酶与非结晶纤维素作用，通过组合超滤反应器来解除产物阻害，生成纤维寡糖的方法(参照日本特开平1-256394号公报)；使选择性地除去了纤维素酶中的β-葡糖苷酶的纤维素酶与纤维素作用来制造纤维寡糖的方法(参照日本特开平5-115293号公报)；在以湿润状态的未漂白亚硫酸纸浆为原料并使其与纤维素酶作用的系统中组合超滤装置，制作包含纤维二糖的纤维寡糖的方法(参照特公平8-2312号公报)等。

还已知以下方法：利用糖质加磷酸分解酶(纤维糊精磷酸化酶)的逆反应，以葡萄糖1磷酸作为葡萄糖供体，在纤维二糖的存在下制造纤维寡糖的制造方法(Journal of Fermentation and Bioengineering，77卷，3号，239-242(1994))。

作为本发明的饮食品组合物中的纤维寡糖，除了使用利用上述任一种方法制造的寡糖外，还可以使用市售的寡糖(CMS Chemicals社等)。在本发明中，优选以下方法：使用纤维素酶将纤维素分解成纤维寡糖，经过晶析步骤等提高葡萄糖聚合度为2～4的纤维寡糖的纯度的方法。

并且，纤维寡糖不仅作为丁酸菌的基质，此外还具有特有的生理作用。例如关于其对脂质代谢的影响，有报道称：将大鼠用添加有纤维二糖的高蔗糖食物饲养4周时，与对照组相比体脂肪率下降、总胆固醇或中性脂肪也降低(渡边隆司，Cellulose Commun.，5，91(1998))。还有报道称：通过对肉食鸡或产蛋鸡给予添加了纤维二糖的饲料，脂肪酸合成酶活性得到抑制，脂肪酸分解酶活性上升(石田蓝子、村上齐、山崎诚、大塚诚、真许胜弘、本间秀弥、金井幸雄、高田良三，日本畜产学会第103次大会讲演要旨集，52(2004)；石田蓝子、大塚诚、胜俣昌也、高田良三、金井幸雄，日本畜产学会第104回大会讲演要旨集，69(2005))。如上所述，认为纤维二糖不仅作为丁酸菌的基质，对丁酸的生成发挥效果，而且其本身也对机体内的脂质代谢产生有利影响，有助于预防生活方式病。推测在本发明的饮食品组合物中，还一并发挥上述纤维二糖所特有的优异的生理作用。

另外，本发明人等确认：在各种肠内细菌中，作为丁酸菌的梭菌属的细菌能够良好地利用纤维寡糖，特别是丁酸梭菌，其在可以良好地利用纤维寡糖的同时，丁酸产生能也高。

实际上，为了观察在人粪便中添加纤维寡糖时，丁酸菌是否选择性地增殖，制备粪便悬浮液，向其中添加玉米淀粉或纤维寡糖，接种、培养丁酸菌，结果确认：与对照的玉米淀粉添加液相比，纤维寡糖添加液的pH显著降低，丁酸菌增殖。

并且，对自由摄取纤维寡糖3天的大鼠给予丁酸菌，研究其肠道内容物中的丁酸菌的菌数时，确认纤维寡糖摄取大鼠比非摄取大鼠的肠内丁酸菌的菌数多。

上述实验结果暗示：在消化道内纤维寡糖不被常驻的肠内细菌利用，而仅被结合使用的丁酸菌选择性地利用，象本发明这样混合有纤维寡糖和丁酸菌的组合物可以增加其菌数。

在本发明的饮食用组合物中，丁酸菌和纤维寡糖的混合量，当用于医疗时，可以根据患者的年龄、疾病的症状而适当增减；当用于功能性食品、用于动物时，可以根据各自的目的而适宜增减。

对丁酸菌的量没有特别限定，典型的是，以菌数计每天1×10⁵～1×10¹⁰CFU(菌落形成单位)的范围；优选为1×10⁶～1×10⁸CFU的范围。只要以该给予量为标准，根据给予量与每天给予次数的关系来适当调整本发明的饮食用组合物中的丁酸菌的量即可。

另一方面，纤维寡糖的混合量可以为成为丁酸菌的基质、作为益生元助长整肠作用所必需的量的范围，但必需还考虑到若过剩摄取纤维寡糖则有可能引起软便。纤维寡糖的1日最大摄取量优选为每Kg体重0.36g左右。通常，在本发明的饮食用组合物中，可以含有0.1～50％(重量)的纤维寡糖，优选为1.0～30％(重量)。

本发明的饮食用组合物的给予方法为：作为药品时，优选1日1次～3次、饭后服用，但也可适当服用；用于功能性食品、用于动物时，可以1日1次～数次、自由摄取。

本发明的饮食用组合物的制造例如可以按照以下方法来进行。

将利用公知的CS培养基(参照日本特开昭59-187784号公报)培养的丁酸菌通过离心进行固液分离，将所得菌糊干燥，向得到的干燥菌粉末中添加纤维寡糖，使用混合机混合至均匀。接下来进行真空干燥。真空干燥的条件例如具体可以为：使用棚式真空干燥机在50℃、10mmHg下干燥5小时。将所得干燥物用粉碎机粉碎，得到该组合物。如此操作，可以得到乳白色、均质细粒状、几乎无味无臭的组合物。

本发明的饮食用组合物可以适用于包括人在内的所有动物。另外，可以没有限制地用于幼年期至高龄期的所有年龄的动物，同时对健康状态、体格等也没有特别限定。作为除人以外的动物，除大鼠、小鼠、兔等实验动物外，还包括：猪、牛、绵羊、山羊、马等家畜；鸡、鸭、鹑、火鸡等家禽；狗、猫等宠物等。

对本发明的饮食用组合物的给予方法没有特别限定，可以将丁酸菌和纤维寡糖混合制成片剂、小块(tablet)等经口给予；也可以制成粉状或颗粒状，添加在饮食物中给予。还可以将丁酸菌和纤维寡糖的各自粉末分别制成制剂，制成在添加或给予时同时利用的形式。

将本发明的饮食用组合物例如用作药品时，其剂型可以是将各成分的粉末无需制成制剂而直接使用，还可以制成散剂、颗粒剂、细粒剂、片剂、糖衣片剂、胶囊剂、小块(tablet)、肠溶衣剂等制剂。稀释剂中使用普通药品制剂中使用的赋形剂、粘合剂、崩解剂等，除此之外，还可以添加着色剂、矫味剂、稳定化剂、保存剂、润滑剂等。

将本发明的饮食用组合物用作食品时，各成分的粉末可以无需制成制剂而直接使用，还可以添加其他食物纤维、寡糖、谷物类、维生素类等，进一步添加香料、着色剂、矫味剂等，形成加工成适于食用的形式。还可以作为食品添加剂添加混合在其他食品中使用。

作为动物用饲料，可以将丁酸菌和纤维寡糖无需制成制剂而以粉末状态进行混合使用，但与用于食品时一样可以添加各种赋形剂、添加剂。形状可以直接是粉状，也可以制成剂型后使用。还可以和作为饲料成分的玉米粉、豆饼、大麦粉、裸麦粉、大豆粉、米糠、脱脂米糠、稻皮、马铃薯粉、甘蔗粉、豆腐渣、淀粉、酵母、鱼粉等混合使用。

实施例

以下，通过实施例来详细说明本发明，但本发明并不受限于此。

[丁酸的测定方法]

在150mg盲肠内容物中添加350μL蒸馏水，用ポリトロン^R(キネマチカ社制)进行匀浆(Lebel 30，30秒，4℃)后，在通过离心(15,000rpm、15分钟、4℃)得到的0.5mL上清中添加0.5mL氯仿。该上清用Vortex^R混合器搅拌1分钟后离心(15,000rpm、15分钟、4℃)，所得上层用MILLIPORE^R(MILLIPORE社制)进行滤器过滤，将10μL添加到HPLC中。

“HPLC条件”

溶液转运系统：岛津LC-10AD(岛津制作所制)

柱：Shim-packSCR-102(H)

检测器：CDD-10A

流动相：5mM对甲苯磺酸

反应相：20mM Bis-Tris(含有5mM的对甲苯磺酸、100mM的EDTA)

温度：45℃

[实施例1]

在给水中混合5％(重量)的纤维寡糖(96％(重量)的纤维二糖、2％(重量)的葡萄糖、2％(重量)的纤维三糖)，对自由摄取3天上述食物的ICR系小鼠(体重约30g)按每只1.0×10⁸个经口给予丁酸梭菌MIYAIRI 588(FERM BP-2789)。给予3小时、6小时后宰杀动物，摘出全部消化道，在厌氧性手套箱内使用GAM平板培养基测定其内容物中的丁酸梭菌MIYAIRI 588的活菌数。需要说明的是，对作为对照的未摄取纤维寡糖的系统也进行同样的操作。结果见表1。

[表1]菌数的变化

经过时间	纤维寡糖未摄取区(个体数：6)	纤维寡糖摄取区(个体数：6)
经过时间	纤维寡糖未摄取区(个体数：6)	纤维寡糖摄取区(个体数：6)	3小时	2.1×10³	3.1×10⁴
6小时	3.8×10³	1.2×10⁴	3小时	2.1×10³	3.1×10⁴

由表1可知：在摄取纤维寡糖的动物中观察到比对照多的菌数。特别是给予3小时后相对于对照的菌数的增加率多。

[实施例2]

使用Wistar系雄性大鼠(7周龄)，用以玉米淀粉作为碳水化合物源的标准饲料(参照表2的对照)预饲养7天，使其适应实验环境，选出无异常的个体，1组8只供给实验。使用表2记载的组成的饲料，按照纤维寡糖(96％(重量)的纤维二糖、2％(重量)的葡萄糖、2％(重量)的纤维三糖)单独给予区(9％(重量))、丁酸菌和纤维寡糖结合使用给予区(9％(重量)的纤维寡糖+0.03％(重量)、0.1％(重量)或0.3％(重量)的丁酸菌粉末)进行试验。丁酸菌使用丁酸梭菌MIYAIRI 588(FERMBP-2789)。丁酸菌粉末中丁酸菌的菌数为4.1×10¹⁰CFU/g。空白为给予标准饲料(参照表2的对照)的区。自由摄取饲料，饲养14天后宰杀，利用HPLC测定盲肠内容物的丁酸含量。另外，有关丁酸菌粉末的摄取，除混饵使之自由摄取外，还设定1日1次胃内强制给予丁酸菌粉末(给予量为6.2×10⁹ CFU/200g体重)的区。强制给予区在饵中添加9％(重量)的纤维寡糖。各区的盲肠内容物的丁酸含量的结果见表3。

(表2的脚注)

*维生素混合物/矿物混合物根据AIN-76组成(Journal of Nutrition107，1340(1977))来制备。

由本实施例的结果判明：通过将纤维寡糖和丁酸菌结合使用，在丁酸产生上可见协同效果，并且通过将丁酸菌给予法由混饵变为胃内强制给予，进一步提高了协同效果。特别是与参考例的结果一并考察时，与增加纤维寡糖的添加量时相比，增加丁酸菌添加量的本实施例中丁酸含量飞跃增加，因此判明：通过将纤维寡糖和丁酸菌结合使用，发挥了协同效果，可以飞跃性提高肠内的丁酸含量。

[参考例1]

有关宫入菌(丁酸菌)的纤维寡糖利用性，与其他肠内细菌进行比较。

供试菌株为宫入菌(丁酸梭菌MIYAIRI 588(FERM BP-2789)，Clostridium butyricum MIYAIRI 588)、枯草菌(枯草芽孢杆菌JCM2499，Bacillus subtilis JCM 2499)、双歧杆菌(青春双岐杆菌JCM1275，Bifidobacterium adolescentis JCM1275)、乳酸菌(干酪乳杆菌JCM1 134，Lactobacillus casei JCM1134)四种菌株。

供试培养基使用在下述基础培养基中添加1％(重量)纤维寡糖(96％(重量)的纤维二糖、2％(重量)的葡萄糖、2％(重量)的纤维三糖)、并调整至pH7.0的培养基(PYC培养基)。

(基础培养基)PY培养基

蛋白胨 0.5g

胰酶解酪蛋白 0.5g

酵母提取物 1.0g

盐溶液 4.0ml

蒸馏水 100.0ml

氯高铁血红素溶液 1.0ml

维生素K₁ 0.02ml

半胱氨酸HCl-H₂O 0.05g

将进行了前培养的各菌株接种在PYC培养基中，使初始菌数为约10⁵CFU/ml。作为对照，将上述菌株接种在PY培养基中。宫入菌、双歧杆菌、乳酸菌进行厌氧培养，枯草菌进行需氧培养和厌氧培养。培养温度为37℃。尚需说明的是，各菌的前培养如下。宫入菌接种在GAM肉汤培养基(GAM broth)中后在37℃下培养6小时。枯草菌、双歧杆菌、乳酸菌接种在GAM肉汤培养基中后在37℃下培养16小时。

通过代谢纤维寡糖时所产生的有机酸的产生量来比较各菌株的利用性。从开始培养起0、6、12、24、48小时后采取样品，利用HPLC测定有机酸。算出从PYC培养基中的有机酸减去相同培养时间的PY培养基中的有机酸的值，作为有机酸的产生量。表4中显示出从各培养开始起一定时间(6小时、12小时、24小时、48小时)后的各细菌的有机酸产生量(mM)。

由表4可知：与其他细菌相比，宫入菌从较早的时间起就确认到有机酸的产生，产生量也多。另外，产生丁酸的细菌只有宫入菌。

[实施例3]

就下述项目来研究评价本发明品对猪的有效性。

首先，从对照区和给予了本发明品的本发明品给予区(MGC区)群养各3腹母猪进行试验。在各母猪产出的仔猪中，对10头进行取样。

集合出产日附近的母猪开始以下试验。试验期间为出产前起断奶后30天，取样日为断奶后和试验最终日(断奶30天后)。给予的饲料组成根据猪的成长如下调整。

(给予的饲料)

a)授乳期仔猪；给予在基本饲料(牛奶)中添加了0.5％(重量)本发明品的饲料直至断奶。

b)断奶后仔猪；给予在基本饲料中添加了0.2％(重量)本发明品的饲料约30天。

c)母猪；给予在基本饲料中添加了0.2％(重量)本发明品的饲料。(本发明品)

·组成：

丁酸菌粉末 10％(重量)

纤维寡糖 20％(重量)

淀粉 20％(重量)

葡萄糖 20％(重量)

硅酸铝 20％(重量)

碳酸钙 10％(重量)

·纤维寡糖使用含96％(重量)的纤维二糖、2％(重量)的葡萄糖、2％(重量)的纤维三糖的寡糖。

·丁酸菌粉末为每1g本发明品中含有10⁷个以上的宫入菌(丁酸梭菌MIYAIRI 588(FERM BP-2789))的活菌体(芽胞)的比例。

对于对照区的猪(母猪和仔猪)，在基本饲料中未添加任何物质直接给予、饲养。尚需说明的是，基本饲料为混合有抗生素(阿维霉素、硫酸粘杆菌素、枸橼酸莫仑太尔)的市售饲料。当为仔猪时，市售饲料是指以下混合饲料。

(混合饲料)

·授乳期：“圆圈中印哺乳期仔猪育成用混合饲料primer I”(中部饲料株式会社制)

·授乳～断奶期：“圆圈中印哺乳期仔猪育成用混合饲料pro II”(中部饲料株式会社制)

·断奶后：“圆圈中印哺乳期仔猪育成用混合饲料welcome II”(中部饲料株式会社制)

以断奶30天后的MGC区和对照区的仔猪的粪便为对象，测定粪便中菌群和粪便中的有机酸和甲基吲哚(SKT)的量以及粪便中和血清中的氨量。

〔粪便中菌群〕

如下测定粪便中的宫入菌(丁酸梭菌，Clostridium butyricum)、产气荚膜杆菌(C.perfringens)、肠内细菌科(肠杆菌科，Enterobacteriaceae)、肠球菌、乳酸菌的菌数。

将从对照区和MGC区的断奶30天后的仔猪中采取的粪便放入输送培养基中悬浮。使用稀释液100倍阶段稀释后，涂抹在各选择培养基上。测定菌数时，宫入菌中使用MIM培养基、产气荚膜杆菌中使用NN培养基、肠内细菌科中使用DHL培养基。另外，肠球菌使用TATAC培养基、乳酸菌使用变法LBS培养基。当为DHL培养基时培养1天，当为TATAC培养基、TS培养基、MIM培养基和NN培养基时培养2天，当为BL培养基和LBS培养基时培养3天，计测形成的菌落，算出菌数(logCFU/g)。尚需说明的是，在肠内细菌科细菌中，大肠杆菌以DHL培养基上形成的浅粉色菌落数作为菌数进行计数。

并且在肠内细菌中，还测定大肠杆菌毒素产生株的菌数。在大肠杆菌毒素产生株的检测中，利用VTEC-RPLA(デンカ生研(株))来进行DHL培养基上的大肠杆菌的毒素产生。

实验成绩以构成各试验区的个体的测定值的平均值和其标准偏差表示，各区间的有效检验通过t检验和曼-怀二氏U检验(Mann-Whitney U-test)法来进行。另外，算出各菌种所检测到的个体数相对于构成各试验区的个体数的比例作为检测率。

另外，对于对照区，也以断奶30天后的粪便为对象进行同样的测定和检验。MGC区和对照区中断奶30天后的粪便中菌群见图1。

如图1所示，从对照区的4个检体中检测到宫入菌(对照区＝2.3±0.22logCFU/g，MGC区＝4.0±0.55logCFU/g)。在所有区中均未检测到产气荚膜杆菌。肠内细菌科和大肠杆菌的菌数在MGC区明显低(肠内细菌科：对照区＝7.1±1.38logCFU/g，MGC区＝4.1±0.73logCFU/g；大肠杆菌：对照区＝7.0±1.39logCFU/g，MGC区＝3.4±1.04logCFU/g)。肠球菌和乳酸菌未确认到差别(肠球菌：对照区＝2.6±0.50logCFU/g，MGC区＝2.6±0.35logCFU/g；乳酸菌：对照区＝8.9±0.51logCFU/g，MGC区＝9.0±0.59logCFU/g)。另外，在此时分离的大肠杆菌的所有菌株中均未确认到毒素产生。

〔粪便中SKT〕

将对照区和MGC区的断奶30天后的粪便用0.03M磷酸缓冲液(pH7.4)稀释4倍后，将其中的0.3ml作为SKT测定用样品分别注入到另外的管中。向其中添加等量的乙腈，充分混合后，在-20℃下静置15分钟。以6000rpm的转速离心15分钟，上清用0.45μl的过滤器(商品名：Minisart、制造商名：sartorius)过滤后供给HPLC。HPLC的条件如下。

(HPLC条件)岛津制作所、LC-10系列

柱：phennomenex ODS-C18

柱温：40℃

流动相：0.02M乙酸 60％(v/v)

2-丙醇 15％(v/v)

乙腈 25％(v/v)

流速：1ml/分钟

检测器：紫外分光光度计(岛津制作所)

波长：280nm

分析时间：15分钟

如此操作，测定1g粪便中所含的SKT量(μg/g)。实验成绩以构成各试验区的个体的测定值的平均值和其标准偏差表示，各区间的有效检验通过t检验和曼-怀二氏U检验法来进行。另外，算出SKT阳性的个体数相对于构成各试验区的个体数的比例作为检测率。测定结果见图2。

由图2可知：粪便中SKT在MGC区明显低(对照区＝13.1±5.76μg/g，MGC区＝7.3±4.93μg/g)。

〔粪便中的有机酸〕

将断奶30天后的粪便用0.03M的磷酸缓冲液(pH7.4)稀释4倍后，以6000rpm的转速离心15分钟。上清用0.45μL的过滤器(商品名Minisart、公司名sartorius)过滤后供给HPLC。

(HPLC条件)岛津制作所、LC-10系列

柱：2根Shin-pack SCR-102H

柱温：40℃

流动相：5mM的对甲苯磺酸水溶液

萃取相：5mM的对甲苯磺酸水溶液

含100μM的甲苯二胺四乙酸的20mM的Bis-Tris

流速：0.8ml/分钟

检测器：导电度检测器CDD-6A(岛津制作所)

分析时间：60分钟

实验成绩以构成各试验区的个体的测定值的平均值和其标准偏差表示，各区间的有效检验通过t检验和曼-怀二氏U检验法来进行。测定结果见图3。

如图3所示，MGC区的乙酸、丙酸和丁酸显著高于对照区(乙酸:对照区＝50.7±9.27mM，MGC区＝63.1±5.55mM；丙酸:对照区＝26.4±4.02mM，MGC区＝32.1±6.53mM；丁酸:对照区＝8.6±3.03mM，MGC区＝13.1±4.16mM)。如上所述，粪便中的有机酸中乙酸、丙酸、丁酸在MGC区明显高，因此认为通过摄取混合有纤维寡糖和宫入菌的本发明品，发挥了协同的效果。

〔粪便中的氨〕

采取各试验区的个体的断奶30天后的粪便装人生化学试验用管中，使用ammonia-test Wako进行氨的测定。实验成绩以构成各试验区的个体的测定值的平均值表示。测定结果见图4。

〔血清中的氨〕

在肠道内由肠内细菌产生的氨中的一部分自肠道吸收进入到血液中。即，血清中的氨量的减少意味着肠道内氨产生菌减少、肠道内的氨量减少，表明肠内环境得到改善。另一方面，血清中的氨量增加意味着肠道内氨产生菌增加、肠道内的氨量增加，表明肠内环境恶化。

这样，以断奶时和断奶30天后的仔猪为对象，如下测定可作为肠内环境的变化指标的血清中的氨量。即，从各个体中采血，将该血液用钨酸钠除去蛋白。采取所得上清装人生化学试验用管中，使用ammonia-test Wako进行氨的测定。实验成绩以构成各试验区的个体的测定值的平均值表示。测定结果见图5。

由图4可知：在MGC区，与对照区相比确认到粪便中的氨浓度减少的倾向。由此表明：利用纤维寡糖和丁酸菌的组合，使肠内环境得到改善，以及粪便的恶臭得到抑制。

另外，由图5可知：在MGC区，与对照区相比在血清中也确认到氨浓度减少的倾向。由此表明：利用纤维寡糖和丁酸菌的组合，肠道内的氨量减少，肠内环境得到改善。

[实施例4]

就下述项目来研究评价本发明品对家禽的有效性。

准备2组肉食鸡的初生雏鸡，每组20000只，作为对照区和本发明品给予区(试验区)。

对试验区的个体给予在市售肉食鸡用饲料(未添加抗生素)中添加了0.2％(重量)本发明品的饲料，上述本发明品中含有两成(20％(重量))的宫入菌(丁酸梭菌MIYAIRI 588(FERM BP-2789))的芽胞、1×10⁸CFU/g、纤维寡糖(96％(重量)的纤维二糖、2％(重量)的葡萄糖、2％(重量)的纤维三糖)。另一方面，对于对照区的个体仅给予市售肉食鸡用饲料(未添加抗生素)(未添加本发明品)。

当各个个体达到18日龄、42日龄时，从各区中随机选出5只宰杀，采取肠道(盲肠)内容物。同时从各区的鸡舍内分别采取5份新鲜便。

〔饲养试验〕

测定各区的个体的体重增加(各区的平均体重)、饲料要求率(增加1kg体重所必需的饲料量)、商品化率(未废弃的个体的比例(％))。结果见表5。

[表5]

	对照	本发明品
	对照	本发明品	平均体重(kg)	2.59	2.75
饲料要求率(％)	2.09	2.07	平均体重(kg)	2.59	2.75
饲料要求率(％)	2.09	2.07	商品化率(％)	92.4	96.8

由表5可知：与对照区相比，使用了本发明品的区的平均体重、饲料要求率、商品化率、废弃率(被废弃的个体的比例)均有所改善。

〔肠道内的有机酸〕

将盲肠内容物用0.03M的磷酸缓冲液(pH7.4)稀释4倍后，以10000rpm的转速离心15分钟。上清用0.45μl的过滤器(商品名Minisart、公司名sartorius)过滤后供给HPLC。HPLC的条件如下。

(HPLC条件)岛津制作所、LC-10系列

柱：2根Shin-pack SCR-102H

柱温：40℃

流动相：5mM的对甲苯磺酸水溶液

萃取相：5mM的对甲苯磺酸水溶液

含100μM的甲苯二胺四乙酸的20mM的Bis-Tris

流速：0.8ml/分钟

检测器：导电度检测器CDD-6A(岛津制作所)

分析时间：60分钟

实验成绩以构成各试验区的个体的测定值的平均值和其标准偏差表示，各区间的有效检验通过t检验和曼-怀二氏U检验法来进行。测定结果见图6。

其结果，由图6可知：盲肠内有机酸中乙酸最多。另外，有关各有机酸的相对于构成各试验区的个体数的检测率，除丙酸和丁酸的检测率为100％外，其他各有机酸的检测率也为100％。在从18日龄、42日龄的个体采取的盲肠内容物中均确认到：试验区的乙酸、丙酸、丁酸的比例较对照区有所增加的倾向，该倾向特别是在乙酸量上明显(18日龄的乙酸量：对照区＝42.8±10.18，试验区＝57.2±7.66μmol/g；42日龄的乙酸量：对照区＝32.4±11.62，试验区＝46.7±3.82μmol/g)。乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸除参与肠内pH降低所引起的有害菌的增殖抑制外，还被用作能源，进一步发挥促进肠蠕动的作用。因此，在本试验中试验区的肠内的上述短链脂肪酸较对照区有所增加，这表明利用纤维寡糖和丁酸菌的组合，使肠内环境得到改善。

Claims

1.饮食用组合物，该组合物含有丁酸菌和纤维寡糖，并具有改善肠内环境的功能和/或防御感染症的功能。

2.权利要求1的饮食用组合物，其中丁酸菌为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)。

3.饲料，该饲料含有丁酸菌和纤维寡糖，并具有改善肠内环境的功能和/或防御感染症的功能。

4.食品，该食品含有丁酸菌和纤维寡糖，并具有改善肠内环境的功能和/或防御感染症的功能。

5.丁酸菌和纤维寡糖在作为具有改善肠内环境的功能和/或防御感染症的功能的饮食用组合物中的应用。

6.丁酸菌和纤维寡糖在作为具有改善肠内环境的功能和/或防御感染症的功能的饲料或食品中的应用。