JP6712598B2 - 酪酸産生菌 - Google Patents
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Description
炎症性腸疾患患者では健常人と比較して酢酸、酪酸といった短鎖脂肪酸の量が低下することが知られており、そのような疾病の患者に対して、酢酸非存在でも酪酸を産生する菌を投与することは、腸内での酪酸の有益作用を考慮すると有用である。
また、ギ酸は、腐食性を有するほか、チトクロムcオキシダーゼを阻害しうるミトコンドリア毒素としても知られており(特許文献1)、ギ酸を産生する菌を摂取することは好ましくない。
〔1〕酢酸非存在の培地において、酪酸を産生し、かつギ酸を産生しない、Clostridium leptum subgroupに属する酪酸産生菌。
〔2〕菌数1.0×106 cellsを酢酸非存在のYCG培地2mLに接種し、37℃で72時間嫌気培養した際の酪酸産生量が、10mM以上であり、かつギ酸産生量が1mM未満である〔1〕記載の酪酸産生菌。
〔3〕下記の(1)及び(2)の性質を有する〔1〕又は〔2〕記載の酪酸産生菌。
(1)16S rRNAの塩基配列と配列番号3及び/又は配列番号4との相同性が99%以上
(2)近縁種であるEubacterium desmolans ATCC 43058T及びButyricicoccus pullicaecorum 25−3TとのDNAの相同性が20%以下
〔4〕NITE BP−02106として寄託されたButyricicoccus sp.YIT 12787、NITE BP−02095として寄託されたButyricicoccus sp. YIT 12788又はそれらの変異株である〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載の酪酸産生菌。
〔5〕〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載の酪酸産生菌を含有することを特徴とする酪酸産生増強剤。
〔6〕〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載の酪酸産生菌を含有する飲食品、医薬又は飼料用組成物。
〔7〕〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載の酪酸産生菌の飲食品、医薬又は飼料用組成物製造のための使用。
前述のように、従来のC.leptum subgroupに属する酪酸産生菌は、酢酸非存在で酪酸を産生することができないか、又は酪酸とともにギ酸を産生する菌であり、本発明の酪酸産生菌は新しい特性を有する新菌種である。
ここで、酢酸非存在とは、酢酸が存在しないか、存在する場合でも1mM以下の微量しか存在しないことを意味する。また、ギ酸を産生しないとは、ギ酸を全く産生しないか、産生する場合でも1mM未満であることを意味する。
ここで菌は、菌数1.0×109 cells/mLの菌株凍結保存液を融解して1μL程度使用することが好ましい。また、菌株凍結保存液は、菌体を10質量%スキムミルク培地又は20質量%グリセロール添加ミューラーヒントン培地に懸濁した溶液が好ましい。
培養液中の酪酸、ギ酸等の有機酸濃度の測定は、有機酸濃度が測定可能な方法であれば特に限定されないが、例えば有機酸分析用HPLCシステムで測定することができる。
YIT 12787及びYIT 12788は、〒292−0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8 122号室 独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに2015年8月20日及び2015年7月31日にそれぞれ寄託した。
(1)16S rRNAの塩基配列と配列番号3及び/又は配列番号4との相同性が99%以上。
(2)近縁種であるEubacterium desmolans ATCC 43058T及びButyricicoccus pullicaecorum 25-3TとのDNAの相同性が20%以下。
(2)グラム陽性球菌
(3)胞子を形成しない
(4)運動性なし
(5)カタラーゼ陰性
(6)硫化水素陰性
(7)G+C含量が53.9%(YIT 12787)、54.1%(YIT 12788)
(8)下記の糖発酵性状を有する
グルコース:+
乳糖:−
サッカロース:−
マルトース:−
サリシン:−
キシロース:−
アラビノース:−
ゼラチン加水分解:−
エスクリン加水分解:−
グリセロール:−
セロビオース:−
マンノース:−
メレチトース:−
ラフィノース:−
ラムノース:−
トレハロース:−
(9)下記の酵素活性性状を有する
アルカリフォスファターゼ:+
エステラーゼ(C4):−
エステラーゼリパーゼ(C8):−
リパーゼ(C14):−
ロイシンアリルアミダーゼ:+
バリンアリルアミダーゼ:−
シスチンアリルアミダーゼ:−
トリプシン:−
α−キモトリプシン:−
酸性フォスファターゼ:+
ナフトール−AS−BI−フォスフォヒドロラーゼ:−
α−ガラクトシダーゼ:−
β−ガラクトシダーゼ:−
β−グルクロニダーゼ:−
α−グルコシダーゼ:−
β−グルコシダーゼ:−
N−アセチル−β−グルコサミニダーゼ:−
α−マンノシダーゼ:−
α−フコシダーゼ:−
出願人が保有するサンプルライブラリーより2種(A、B)のサンプルを選択し、YCFA−M培地(ムチンを0.5%添加したYCFA(酢酸20mM、プロピオン酸5mM)培地)1mLに各サンプルの10倍希釈液を10μL接種し、37℃、8時間嫌気培養後、4,000G、5分間遠心後の上清10μLを新しいYCFA−M培地2mLに接種した。この操作を7回繰り返し、培養後の菌液を10-6まで10倍段階希釈した後、10-4〜10-6の各希釈液を1%グルコース添加変法GAM寒天培地に塗抹し、37℃、2〜3日間嫌気培養した。培養後のコロニーを形態別に分類し、形態ごとに8割以上のコロニー数を釣菌し、1%グルコース添加GAMブロスを用いて増菌した。3回の単コロニー分離を行った後、−80℃に保存した。
その結果、2菌株を単離し、それぞれ菌株A及び菌株Bと仮称した。
(1)既知菌株との酪酸及びギ酸産生能の比較
菌株A及び菌株Bについて、酢酸非存在の培地におけるC. leptum subgroupに属する菌を含む既知の酪酸産生菌18菌株(表1)との酪酸産生量の比較を行った。
菌株A、菌株B及び既知の酪酸産生菌18菌株の凍結保存液(菌体を10%スキムミルク培地又は20%グリセロール添加ミューラーヒントン培地に懸濁した溶液)(菌数:1.0×109 cells/mL)を融解し、その1μL(菌数:1.0×106 cells)を酢酸非存在のYCG(yeast extract-casitone glucose)培地(当該培地にはギ酸、酢酸、酪酸等の有機酸は存在せず、0.0mMである)2mLに接種し、37℃で72時間嫌気培養した後、上清に1%濃度になるよう過塩素酸を添加し、一晩4℃に静置した。遠心後の上清を0.45μmのフィルターでろ過し、ろ液中の有機酸量を後述する有機酸分析用HPLCシステムを用いて測定した。なお、標準物質にはコハク酸、蟻酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、イソ酪酸ナトリウム、n−酪酸ナトリウム、イソ吉草酸ナトリウム、n−吉草酸ナトリウム及び乳酸リチウムの計9種類(全て関東化学株式会社製のHPLCグレード)の混合水溶液を用い、2点(0.01及び0.2μmol/10μL)絶対検量線法で定量した。
分析機器:2695アライアンスシステム、反応ポンプ、432電気伝導度測定器、カラム温度コントロールシステム(以上Waters)
カラム:有機酸分析用カラムShodex KC−811(昭和電工)
溶離液:15mM過塩素酸+7%アセトニトリル
pH調整剤:15mM過塩素酸+7%アセトニトリル+60mMトリスヒドロキシメチルアミノメタン
カラム温度:42℃
セル温度:45℃
流速:1mL/min
また、酪酸を10mM以上産生する既知の2菌株については、腐食性や毒性があり、生体内で産生されるのが好ましくないギ酸を1mM以上産生した。一方、菌株A及び菌株Bは、酢酸非存在の培地ではギ酸の産生量が1mM未満であり、ギ酸を産生しなかった。
菌株A及び菌株BをM2GSC(ギ酸0.9mM、酢酸0.9mM、イソ吉草酸2.3mM)、M2GSC+SCFA(ギ酸0.6mM、酢酸20mM、プロピオン酸6mM、イソ吉草酸1.8mM)及びYCFA(酢酸20mM、プロピオン酸5mM)の各培地2mLに対して、5×107cellsの菌数を接種し、それぞれ1週間、37℃で培養後(培養後の菌数;5×109cells/mL)、実施例2の(1)記載の有機酸分析方法を用いて培養液中の酪酸濃度を測定した。
菌株A及び菌株Bについて、ビーズフェノール法によりDNAを抽出した。すなわち、菌株A及び菌株Bの菌液200μLを1.0mLのPBSに懸濁し、15,000rpmで遠心分離後上清を捨てるという操作を3回繰り返した。得られたペレットをまず450μLのExtraction Buffer(100mM Tris−HCl、40mM EDTA、pH9.0)と50μLの10%SDSに浮遊し、0.3gのガラスビーズ(直径0.1mm)と500μLのTE飽和フェノールを加えてFastPrep FP120(パワーレベル5.0)により30秒間激しく振とうした。15,000rpmで10分間遠心した後、イソプロパノール沈殿を行って、得られたDNAを1,000μLのTEバッファーに溶解した。得られたDNA溶液を精製水で10倍希釈し、鋳型DNA溶液とした。
鋳型DNA溶液に対して、表3に示す8F及び15Rプライマーを用いて、95℃5分で反応後、95℃30秒、55℃30秒、72℃1分30秒を1サイクルとして、35サイクルのPCR反応を行い、その後72℃5分反応を行った。PCR産物をHigh Pure PCR Product Purification Kit(Roche)を用いて精製し、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequence Kit(Applied Biosystems)によるシークエンス反応に供した。得られた配列は日本DNAデータバンク(DDBJ)のBLAST検索に供し、既知菌種の配列データベースと照合した。さらに、Clustal Wを用いた近隣結合(NJ)法で分離株の配列を系統解析し、Tree-Viewプログラムを用いて系統樹を作成した。
16S rRNAシークエンス解析及び系統解析の結果、菌株Aは1,495 bp(配列番号3)、菌株Bは1,500 bp(配列番号4)であった。また、両菌株はお互いに99%以上の相同性を有していた。
系統解析の結果、菌株A及び菌株Bは、C. leptum subgroupに属し、既知菌種であるEubacterium desmolans ATCC 43058T 及びButyricicoccus pullicaecorum 25−3T と近縁であると考えられた。また、菌株AとEubacterium desmolans ATCC 43058Tとの相同性は94.9%、Butyricicoccus pullicaecorum 25−3Tとの相同性は96.3%であった。菌株BとEubacterium desmolans ATCC 43058Tとの相同性は95.0%、Butyricicoccus pullicaecorum 25−3Tとの相同性は96.3%であった。
同菌種であれば16S rRNAの相同性は99%以上となるが、菌株A及び菌株Bは、既知菌種との相同性が99%未満であるため、C. leptum subgroupに属する新菌種であると考えられた。菌株AをButyricicoccus sp. YIT 12787、菌株BをButyricicoccus sp. YIT 12788と命名し、さらに新菌種に属するこれら菌株の性質を確認した。
(1)糖発酵性状試験
アピケンキ(シスメックス・ビオメリュー)を用い、添付説明書に従って実施した。使用菌株は、YIT 12787、YIT 12788のほか、近縁種であるEubacterium desmolans ATCC 43058T(E.desmolans)及びButyricicoccus pullicaecorum 25−3T (B.pullicaecorum)を用いた。結果判定は、菌液接種30時間後に目視により行った。
糖発酵性状試験の結果を表4に示す。YIT 12787及びYIT 12788はグルコース資化性が陽性であった。E.desmolansでは、すべて陰性であった。B.pullicaecorumでは、グルコース、サッカロース、サリシン及びキシロースの資化性、エスクリンの加水分解が陽性であった。
アピザイム(シスメックス・ビオメリュー)を用い、添付説明書に従って実施した。使用菌株は、YIT 12787、YIT 12788のほか、近縁種であるE.desmolans及びB.pullicaecorumを用いた。結果判定は、菌液接種5時間後に色調の変化を目視により5段階で評価した。
酵素活性試験の結果を表5に示す。表中の数値が3以上を陽性反応とした。YIT 12787及びYIT 12788はアルカリフォスファターゼ、ロイシンアリルアミダーゼ及び酸性フォスファターゼ活性が陽性であった。E.desmolansでは、エステラーゼ(C4)及び酸性フォスファターゼ活性が、B.pullicaecorumでは、アルカリフォスファターゼ、エステラーゼ(C4)、ロイシンアリルアミダーゼ及び酸性フォスファターゼ活性が陽性であった。
YCFAG培地(YCFAに1%グルコースを添加した培地、YIT 12787、YIT 12788及びB.pullicaecorumの培養に使用)又は1%イノシトール添加GAM培地(E.desmolansの培養に使用)に、1×109cells/mLの各菌株液を培地量に対して1/1000量接種し、13〜18時間培養し、対数増殖期の菌体1〜2gを回収し、直ちに終濃度1%のパラホルムアルデヒド-PBS溶液で2日間固定した。固定後の菌体を5mM EDTA溶液で3回洗浄した後、6mLの同溶液に再懸濁し、600U/mLアクロモペプチダーゼ及び50mg/mLリゾチームをそれぞれ1mLずつ添加して37℃、2時間溶菌した。溶菌後の試料にSDS溶液を0.6mLを加えて60℃で10−30分処理した。さらに10mg/mL プロテイナーゼKを150μL加えて65℃、6時間処理を行った後、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(25:24:1)を20mL加えて、30分間振とうした。8,000G、15分間遠心後の上清を回収し、クロロホルム/イソアミルアルコール(24:1)を16mL加え、30分間振とう後、8,000G、15分間遠心して上清を回収した。クロロホルム/イソアミルアルコール処理を再度行い、回収した上清からエタノール処理により粗DNAを得た。粗DNAをTEバッファー適量に溶解し、RNase溶液(80℃、5分間加熱処理した1mg/mLのRNaseA 1mLにRNaseT1 4μLを加えたもの)をDNA溶液量に対して1/20量加え、37℃、1時間処理を行い、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(25:24:1)及びクロロホルム/イソアミルアルコール(24:1)処理による除蛋白後、エタノール処理を行い、精製DNA溶液を調製した。調製したDNAサンプルについて、260nmと280nmの吸光度の確認、及びQuant−iT PicoGreen dsDNA Assay Kit(Life Technologies)を用いた濃度測定を行った。上記のDNAサンプルについて、TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep LS Kit(Illumina)及びDNA Shearing システム M220(Covaris)を用い、Illuminaより提供されたプロトコルに従ってシーケンスライブラリの調製を行った。調製したシーケンスライブラリを、次世代シーケンサーMiSeq(Illumina)による250bp×2のペアエンドシーケンスに供試し、塩基配列の解読を行い、得られた塩基配列の結果を基にGC%を算出した。
その結果、菌体DNAのGC含量は、YIT 12787が53.9%、YIT 12788が54.1%、近縁種のE.desmolansが54.3%、B.pullicaecorumが54.0%であった。
YIT 12787及びYIT 12788と、近縁種であるE.desmolans及びB.pullicaecorumとの、DNA-DNA相同性を確認するために、実施例4の(3)の方法で得たDNAサンプルをマイクロプレートに固定し、フォトビオチンで標識したDNAとのハイブリダイゼーション反応を行い、反応後の蛍光強度の数値から、各菌株間のDNA−DNA相同性を算出した。
結果を表6に示す。YIT 12787とYIT 12788間の相同性は67.3−70.9%であり、同一菌種(亜種を含む)であることが示された。一方、YIT 12787及びYIT 12788と近縁種であるE.desmolans及びB.pullicaecorumとのDNAの相同性は、いずれも20%未満であり、別菌種であることが示された。よって、DNA−DNA相同性の結果からもYIT 12787及びYIT 12788が新菌種であることが示された。
YIT 12787及びYIT 12788は、以下の共通の生化学的性状を有する。
(i)偏性嫌気性
(ii)グラム陽性球菌
(iii)胞子を形成しない
(iv)運動性なし
(v)カタラーゼ陰性
(vi)硫化水素陰性
出願人が保有するサンプルライブラリーより1種(C)のサンプルを選択し、実施例1に記載の方法で菌株Cを単離した。
菌株Cの16S rRNAシークエンス解析を実施例3の方法で行ったところ、菌株CとYIT 12787とは99.1%、菌株CとYIT 12788とは99.3%の16S rRNAの相同性を有しており、ともに99%以上であった。
また、菌株CのE.desmolans及びB.pullicaecorumとのDNA-DNA相同性を実施例4の(4)の方法で測定したところ、菌株CとE.desmolansとの相同性は8.8〜18.9%であり、菌株CとB.pullicaecorumとの相同性は10.6〜15.5%であった。よって、菌株CとE.desmolans及びB.pullicaecorumとのDNA-DNA相同性はともに20%以下であった。
よって、YIT 12787及びYIT 12788の16S rRNAとの相同性が99%以上であり、また、E.desmolans及びB.pullicaecorumとのDNAの相同性が20%未満である菌株Cは、菌数1.0×106cellsを酢酸非存在のYCG培地2mLに接種し、37℃で72時間嫌気培養した際の酪酸産生量が10mM以上であり、かつギ酸産生量が1mM未満である、C.leptum subgroupに属する酪酸産生菌であることが分かった。
下記表7の処方で各種成分を混合して造粒・乾燥・整粒した後に、打錠して錠剤を製造した。
Claims (7)
- NITE BP−02106として寄託されたButyricicoccus sp. YIT 12787、NITE BP−02095として寄託されたButyricicoccus sp. YIT 12788又はそれらの変異株である酪酸産生菌。
- 酢酸非存在の培地において、酪酸を産生し、かつギ酸を産生しない、Clostridium leptum subgroupに属する請求項1記載の酪酸産生菌。
- 菌数1.0×10 6 cellsを酢酸非存在のYCG培地2mLに接種し、37℃で72時間嫌気培養した際の酪酸産生量が、10mM以上であり、かつギ酸産生量が1mM未満である請求項1又は2記載の酪酸産生菌。
- 下記の(1)及び(2)の性質を有する請求項1〜3のいずれか1項記載の酪酸産生菌。
(1)16S rRNAの塩基配列と配列番号3及び/又は配列番号4との相同性が99%以上
(2)近縁種であるEubacterium desmolans ATCC 43058 T 及びButyricicoccus pullicaecorum 25−3 T とのDNAの相同性が20%以下 - 請求項1〜4のいずれか1項記載の酪酸産生菌を含有することを特徴とする酪酸産生増強剤。
- 請求項1〜4のいずれか1項記載の酪酸産生菌を含有する飲食品、医薬又は飼料用組成物。
- 請求項1〜4のいずれか1項記載の酪酸産生菌の飲食品、医薬又は飼料用組成物製造のための使用。
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